Aplicaciones industriales de la biocatálisis enzimática:
Situación actual y aspectos futuros computacionales para mejorar la eficiencia del diseño de
Resumen: Las enzimas son los catalizadores más competentes,
ofreciendo procesos mucho más competitivos en comparación
con los catalizadores químicos. El número de aplicaciones
industriales de las enzimas ha aumentado en los últimos años,
debido principalmente a los avances en la tecnología de
ingeniería de proteínas y a las necesidades ambientales y
económicas. A continuación, revisamos el progreso reciente en
la biocatálisis enzimática, y discutimos las tendencias y
estrategias que están conduciendo a aplicaciones más amplias
de las enzimas industriales. También se discuten los retos y
oportunidades en el desarrollo de procesos biocatalíticos.
1. Introducción
Las enzimas son los catalizadores más competentes, ofreciendo
procesos mucho más competitivos en comparación con los
catalizadores químicos. Desde que se introdujo la biocatálisis
por primera vez hace casi un siglo, se han comercializado varios
procesos basados en enzimas para producir varios productos
valiosos (Bruggink et al., 1998; Estell et al., 1985; Jensen y Rugh,
1987; Sedlaczek, 1988). Sin embargo, a pesar del gran potencial
de las enzimas, sus aplicaciones industriales se han visto
obstaculizadas principalmente debido a propiedades
indeseables en términos de estabilidad, eficiencia catalítica y
especificidad. Para superar estas deficiencias, se ha intentado
una variedad de enfoques, incluyendo la selección de enzimas
de fuentes naturales, mutaciones aleatorias, inmovilización
(Dincer y Telefoncu, 2007; Elleuche et al., 2014). Durante las
décadas de 1980 y 1990, la ingeniería de enzimas basada en
información estructural permitió la ampliación de sus rangos de
sustratos, permitiendo la síntesis de intermedios inusuales. En
consecuencia, el uso de enzimas se ha ampliado a la fabricación
de productos farmacéuticos intermedios y productos químicos
finos (Griengl et al., 2000; Hills, 2003; Nagasawa et al., 1990).
Aunque las aplicaciones industriales de la biocatálisis se han
expandido a través del diseño racional basado en estructuras, la
falta de conocimiento estructural y mecánico sobre las enzimas
ha limitado el uso generalizado de las mismas.
Desde mediados de la década de 1990, la versión in vitro de la
evolución darwiniana, llamada evolución dirigida, ha hecho una
gran contribución al desarrollo de enzimas con gran potencial
(Bornscheuer et al., 2012). Los ciclos iterativos de mutagénesis
aleatoria, seguidos del cribado de una biblioteca, permitieron
una mejora rápida y extensa de varias propiedades de la
enzima, incluyendo la estabilidad, la especificidad del sustrato y
la enantioselectividad. De este modo, la evolución dirigida ha
hecho notables progresos en las aplicaciones industriales de la
biocatálisis (Kumar y Singh, 2013). Recientemente, la evolución
dirigida tiende a fusionarse con el diseño racional y los métodos
enzimas mediante la creación de bibliotecas más enfocadas e
inteligentes (Bornscheuer et al., 2012). El diseño racional y los
métodos computacionales basados en las relaciones estructura-
función se están volviendo populares en la ingeniería
enzimática. La complejidad estructural de sustancias valiosas
como medicamentos e intermediarios quirales requiere
biocatalizadores con altas especificidades estéreo y
regioeléctricas en el proceso industrial. El conocimiento
acumulado sobre la estructura-función y las relaciones
dinámico-funcionales están permitiendo el diseño de novo de
enzimas con nuevas funciones (Rothlisberger et al., 2008; Siegel
et al.., 2010), ampliando el repertorio de enzimas.
El aumento de los precios del petróleo ha llevado a las
industrias a buscar fuentes alternativas de materias primas,
como las biomasas. Además, la presión pública sobre las
tecnologías verdes debido a cuestiones ambientales ha exigido
firmemente la sustitución de los procesos químicos por
procesos biocatalíticos más limpios, seguros y ecológicos
(Benkovic y Hammes-Schiffer, 2003). En este sentido, la
biocatálisis enzimática ha sustituido rápidamente a los procesos
químicos tradicionales en muchas áreas, y se espera que esta
sustitución se acelere mediante el desarrollo de nuevas
tecnologías en ingeniería enzimática. En esta revisión,
describimos los avances recientes en la biocatálisis enzimática
para aplicaciones industriales, y discutimos las tendencias y
estrategias en la ingeniería de enzimas industriales. Los retos y
oportunidades de la biocatálisis enzimática en También se
discutirá el futuro.
2. Biocatalizadores en biotecnología industrial
2.1. Industria química fina y a granel
Las aplicaciones de las enzimas y la biocatálisis de células
enteras para la producción de diversos tipos de sustancias
químicas y biológicas se han convertido en una tecnología
probada en las industrias química y farmacéutica porque los
procesos basados en enzimas suelen reducir el tiempo de
proceso, el número de pasos de reacción y la cantidad de
residuos (Wohlgemuth, 2010). En particular, las enzimas
proporcionan una forma más potente de producir
enantiomerical compuestos puros principalmente a través de
una alta quimioelectividad, regioselectividad y streoselectividad
(Nestl et al., 2011). Algunos ejemplos que muestra la
contribución de la biocatálisis a los campos de la química fina y
a granel se describen a continuación.
La acrilamida es un producto químico importante para sintetizar
la poliacrilamida utilizada para la recuperación de petróleo, el
tratamiento de aguas residuales, la fabricación de papel, la
formulación de pesticidas, la prevención de la erosión del suelo
y la electroforesis en gel (Asano, 2002; Leonova et al., 2000).
Tradicionalmente, la acrilamida puede producirse
químicamente oxidando el acrilonitrilo utilizando cobre y ácido
sulfúrico como catalizadores a altas temperaturas
(Padmakumar y Oriel, 1999). Sin embargo, se sabe que ambos
métodos causan varios tipos de contaminación ambiental. El
descubrimiento de la nitrilo hidratasa (EC 4.2.1.84) y su
aplicación en la hidratación de nitrilo ha ofrecido un proceso
novedoso para la producción de acrilamida (Asano et al., 1982;
Nagasawa et al., 2000). Rhodocococcus rhodochrous J1
sobreexpresando nitrilo hidrasa convierte eficientemente el
acrilonitrilo en acrilamida hasta en un 45% (W/W) bajo
condiciones suaves (Esquema 1). Este proceso de
biotransformación produce más de 650.000 t anuales en Japón
(Ogawa y Shimizu, 2002; Groger et al., 2012; Reetz, 2013). Para
aumentar aún más la productividad, Cui et al. han desarrollado
recientemente la nitrilo hidratasa de Pseudomonas putida
NRRL-18668, y han demostrado mejoras en la estabilidad
térmica y la actividad catalítica de 3,5 y 1,5 veces,
respectivamente (Cui et al., 2014). Kang et al. también
reportaron la sobreexpresión de nitrilo hidratasa de
Rhodococcus rhodochrous en Corynebacterium glutamicum, y
las células recombinantes resultaron en un rendimiento de
conversión del 93% y una concentración final de acrilamida del
42,5% en 6 h (Kang et al.., 2014).
El ácido glicólico es un componente químico C2 que ha
encontrado una amplia gama de aplicaciones en cosmética,
industria alimentaria y como precursor de biopolímeros
(Koivistoinen et al., 2013; Panova et al., 2007). El ácido glicólico
puede polimerizarse en ácido poliglicólico (PGA), que tiene una
alta resistencia y tolerancia térmica, así como una baja
permeabilidad a los gases, lo que lo convierte en un material de
envasado ideal para alimentos y otros productos. El mercado de
ácido glicólico en 2011 fue de 93,3 millones de dólares y la
producción total fue de 40 millones de kilogramos. Se espera
que el mercado alcance los 203 millones de dólares en 2018
(Koivistoinen et al., 2013). El método convencional de
producción de ácido glicólico se basaba en la reacción del
formaldehído y el monóxido de carbono a través de una
catálisis ácida a alta presión y temperatura (Panova et al.,
2007). Un método alternativo es el uso de huéspedes
heterólogos que expresan nitrilasa (EC 3.5.5.1.1), lactoaldehido
reductasa (EC 1.1.1.77) y lactoaldehido deshidrogenasa (EC
1.2.1.22) para la hidrólisis del glicolonitrilo y la oxidación del
etilenglicol, seguido de la conversión del ácido glicólico
(Chauhan et al., 2003). Sin embargo, los métodos químicos y de
biotransformación convencionales para el glicólico tienen
ciertos inconvenientes, como la alta impureza. Para la
producción de ácido glicólico de alta pureza, Panova et al.
intentaron una quimio-enzimática proceso que utiliza células de
E. coli que sobreexpresan nitrilasa de Acidovorax facilis 72 W
(Panova et al., 2007). Este proceso quimio-enzimático
comprende la síntesis de glicolonitrilo a partir de formaldehído
y cianuro de hidrógeno utilizando NaOH, seguido de la
conversión de glicolonitrilo en amonio glicolato por nitrilasa a
temperatura ambiente, que se convierte a ácido glicólico por
cromatografía de intercambio iónico (IEC) (esquema 2). Este
permite la productividad de más de 1 kg de ácido glicólico/g
seco peso de la célula. Además, para aumentar aún más la
actividad catalítica de nitrilasa, se intentó una evolución
dirigida, resultando en un aumento de 125 veces (Wu et al.,
2008).
El 1,3-Propanodiol es una sustancia química valiosa como
bloque de construcción química C3, y se polimeriza con
tereftalatos para la síntesis de los tereftalatos de polietileno
utilizados en la fabricación de fibras textiles, películas y
plásticos (Maervoet et al., 2011). El mercado de 1,3-
propanedol es de más de 100 millones de toneladas/año, y está
creciendo rápidamente (Zeng y Biebl, 2002). Actualmente, la
producción de 1,3-propanediol se produce a partir de glicerol
por medio de Saccharomyces cerevisiae y Klebsiella
pneumoniae (Nakamura y Whited, 2003; Sabra et al., 2010). Se
demostró que este proceso de bioconversión da como
resultado un rendimiento máximo de alrededor del 50-60%
(mol/mol), pero que requiere un suministro de coenzima B12
como cofactor para las enzimas implicadas en la biosíntesis de
1,3-propanodiol en el proceso de fermentación microbiana.
Para la producción económica y ecológica de 1,3-propanodiol,
Rieckenberg et al. desarrollaron un nuevo proceso biosintético
utilizando glicerol deshidratasa (EC 4.2.1.30) y oxidoreductasa-
isoenzima (EC 1.1.1.202) (esquema 3) (Rieckenberg et al.,
2014). En este proceso, la glicerol deshidratasa convierte el
glicerol en 3-hidroxipropionaldehído (3-HPA), que se
transforma en 1,3-propanodiol por el propanodiol dependiente
de NADPH oxidoreductasa-isoenzima de E. coli. Curiosamente,
el rendimiento de conversión de glicerol en el producto
objetivo, 1,3-propanodiol, alcanzó casi el 100%.
El 5-hidroximetilfurfural (HMF) se considera un componente
prometedor porque permite diversos procesos sintéticos que
conducen a diversos compuestos químicos como el
dimetilfurano (biocombustible), el 2,5-diformilfurano y el ácido
2,5-furandicarboxílico (monómeros de polímeros), el ácido
levulínico, el ácido adípico, el caprolactama y la caprolactona,
por encima y más allá de muchas otras moléculas, incluidos los
ingredientes farmacéuticos (Rosatella et al., 2011).
Tradicionalmente, el HMF se produce mediante la
deshidratación catalizada por ácido de monosacáridos como la
fructosa o la glucosa (Huang et al., 2010). Se informó que el
rendimiento de producción de HMF a partir de fructosa
superior al 70-100% (p/p) puede lograrse utilizando clorhidrato
y Amberlst-15 (Roman-Leshkov et al., 2006; Shimizu et al.,
2009). Sin embargo, la fructosa es menos estable que la
glucosa. Para una producción más económica de HMF, se ha
intentado utilizar directamente glucosa o carbohidratos a base
de glucosa, lo que ha llevado al desarrollo de un proceso para la
producción de HMF a través de una combinación de
isomerización glucosa-fructosa utilizando isomerasa de glucosa
(EC 5.3.1.5) seguida de deshidratación de la fructosa en HMF
por ácido (esquema 4). Este proceso da como resultado una
producción de aproximadamente 63-87% (p/p) (Huang et al.,
2010).
epiclorhidrina con un ee del 99% y un rendimiento del 28,5%, a
partir de 20 mM de un sustrato racémico utilizando hidrolatos
de epóxido recombinante (Lee, 2007). De manera similar, Jin et
al. emplearon hidrolasas de epóxido de Aspergillus nigerto para
hidrolizar epiclorhidrina racémica en la concentración del
sustrato de hasta 153.6 mM, y produjeron (S)-epiclorhidrina
con un rendimiento de 18.5% con ee de 98% en solventes
orgánicos (Jin et al., 2012). Basándose en los resultados, el uso
de disolventes orgánicos pareció resolver el problema de la
inestabilidad y la baja solubilidad de la epiclorhidrina. Sin
embargo, estos procesos no son factibles en la práctica a escala
industrial debido a un bajo rendimiento y valor de ee debido a
la inhibición del sustrato y del producto. En un esfuerzo por
abordar este problema, Jin et al. intentaron una alimentación
intermitente del sustrato en un sistema de dos fases, logrando
un rendimiento del 42,7% de epiclorhidrina (R) y un valor de ee
superior al 99% (Jin et al., 2013). Además, un gran se ha hecho
un gran esfuerzo para aumentar la productividad, la estabilidad
y el rendimiento de la empresa. Enantio selectividad a través de
la ingeniería y el descubrimiento del epóxido hidrolasa
(Karboune et al., 2006; Kotik y Kyslík, 2006; Kotik et al..., 2011;
Reetz et al., 2009).

(R),(S)-Epiclorhidrina es un bloque de construcción quiral para

la síntesis de productos farmacéuticos y agroquímicos (Wu et
al., 2010). La epiclorhidrina se produce generalmente a partir
Las ciclodextrinas son cíclicas α-1,4-glucanos que se utilizan
de cloruro de alilo a través de un proceso de dos pasos,
principalmente como agente mezclador para aumentar la
comenzando con la adición de hipoclorito, que produce 1,3 y
solubilidad de compuestos insolubles en agua y la estabilidad
2,3-diclorhidrina. En el segundo paso, esta mezcla reacciona
química de los ingredientes activos en las industrias
con una base para generar epóxido (Bell et al., 2008). Un
farmacéutica, cosmética, alimentaria y textil (Del Valle, 2004).
método alternativo para producir (R),(S)-epiclorhidrina es
Las ciclodextrinas se producen a partir de almidón o derivados
biotransformar el sustrato de partida, 1,3-dicloro-2-propanol,
del almidón utilizando la ciclodextrina glucosiltransferasa (EC
utilizando la halohidrina deshalogenasa (EC 4.5.1) y los
2.4.1.19) (Bonnet et al., 2010). Aunque las ciclodextrinas
hidroclasos epóxidos (EC 3.3.2.3) (esquema 5). Aunque se
pueden ser producidas fácilmente por las enzimas, este proceso
demostró que este proceso resultaba en una producción
tiene ciertas desventajas como una baja productividad,
eficiente de epiclorhidrina enantio-pura, dio lugar a graves
especificidad y estabilidad (Leemhuis et al., 2010). Takada et al.
problemas. La epiclorhidrina insoluble en agua causó una
identificaron una nueva ciclodextrina glucosiltransferasa de
mezcla de reacción no homogénea, y la epiclorhidrina se
Bacillus clarkii 7364, que se demostró que convertía la fécula de
hidroliza espontáneamente en medios acuosos. Para superar
patata en γ-cyclodextrin, con un rendimiento del 79% (Takada
estas deficiencias, Lee et al. utilizaron disolventes orgánicos
et al., 2003). Sin embargo, el rendimiento total de las
como medio de reacción para la producción de (R)-
cilclodextrinas a partir del almidón fue tan bajo como el 14%.
Como enfoque alternativo para mejorar el rendimiento de la
producción de ciclodextrina, se ha intentado utilizar un sistema
bi-enzimático que comprende la ciclodextrina
glucosiltransferasa y una enzima de ramificación como la
isoamilasa y la pullulanasa (Wang et al., 2013). Durante el
proceso de reacción, primero se agregó una enzima
desramificadora para hidrolizar la amilopectina α-1,6-linkage
que inhibe la reacción de la ciclodextrina glucosiltransferasa
seguida de la adición de ciclodextrina. glicosiltransferasa para
catalizar la ciclización. Duan et al. informaron un proceso
síncrono basado en isoamilasa y α-cyclodextrin
glicosiltransferasa para catalizar la reacción. Esta sincronía
permite un rendimiento de producción del 84,6% (p/p) de
ciclodextrina en 24 h (Duan et al., 2013).
2.2. Industria farmacéutica
Con el paso de las décadas, las sustancias farmacéuticas se han
vuelto cada vez más complejas, y la búsqueda pública y
ambiental de tecnologías verdes ha aumentado. Por lo tanto, la
industria está buscando procesos biocatalíticos de bajo costo,
más seguros y ecológicos como alternativas a la catálisis
química tradicional (Huisman y Collier, 2013; Tomsho et al.,
2012). Recientemente se ha puesto en marcha en Europa el
proyecto Chemical Manufacturing Methods for the 21st
Century (CHEM21), financiado tanto por el gobierno como por
la industria, con un presupuesto de hasta 26,4 millones de
euros (21,2 millones de libras esterlinas) durante cuatro años
(Aldridge, 2013). Las reacciones específicas que pueden ser
reemplazadas por la biocalaysis son en la síntesis de productos
farmacéuticos, incluido el quiral. síntesis de aminas,
hidroxilación estereoscópica y regioespecífica de complejos y
otras reacciones redox (Aldridge, 2013; Lutz et al.., 2009).
Algunos avances recientes en biocatálisis para la industria
farmacéutica se describen a continuación.
Uno de los ejemplos más exitosos en la aplicación práctica de
las enzimas en la industria farmacéutica es el compuesto
antidiabético sitagliptina (Desai, 2011; Savile et al., 2010).
Sitagliptina es un fármaco para la diabetes tipo II que ha sido
comercializado bajo el nombre comercial Januvia por Merck
(Desai, 2011). Los investigadores de Codexis y Merck diseñaron
la transaminasa R-selectiva (R-ATA, ATA-117) de Arthrobacter
sp. para la aminación asimétrica de la prositagliptina cetona.
Mediante la aplicación de un enfoque de caminar, modelado y
mutación del sustrato, fueron capaces de superar la limitación
del tamaño del sustrato para la enzima. Una combinación de la
evolución enzimática dirigida y la ingeniería de procesos dio
como resultado una variante que convierte 200 g/L de
prositagliptina cetona en sitagliptina con una pureza enantial
superior al 99,95%, incluso en presencia de 1 M i-PrNH2, con un
50% de DMSO a una temperatura superior a 40 °C (Savile et al.,
2010) (esquema 6). Comparado con el proceso catalizado con
rodio (Rh), el proceso biocatalítico no sólo reduce el desperdicio
total y elimina el requerimiento de un raro metal pesado (Rh),
sino que también aumenta el rendimiento general en un 10% y
la productividad (kg/L por día) en un 53% (Desai, 2011; Ghislieri
y Turner, 2013). La inmovilización del ATA selectivo de
ingeniería (R) permite el mantenimiento de la actividad y
estabilidad de las enzimas en un disolvente orgánico,
simplificando el proceso. y permitir un uso repetitivo de la
enzima (Truppo et al.., 2012). Se ha informado del uso de varios
ATAs selectivos R o S en una síntesis a gran escala de fármacos
potenciales como el niraparib (Chung et al., 2013), un
antagonista de los receptores de orexina (Girardin et al., 2012),
y Inhibidor de la janus quinasa 2 (JAK2) (Frodsham et al., 2013;
Meadows et al.., 2013).
Otro ejemplo de síntesis de amina quiral es el boceprevir (Li et
al., 2012), que es un fármaco clínicamente utilizado para las
infecciones crónicas por hepatitis C bajo el nombre comercial
Victrelis de Merck. En la síntesis de boceprevir, se requiere una
des simetrización eficiente y enantio-pura de un intermedio de
prolina bicíclico. Codexis y Merck han empleado la
monoaminooxidasa (MAO) de Aspergillus niger para la
oxidación amínica asimétrica de la sustancia intermedia
(esquema 7). Aunque la actividad, solubilidad y estabilidad
térmica de la enzima mejoraron lo suficiente para sostener el
proceso de fabricación a través de la ingeniería de proteínas, la
inhibición irreversible del producto siguió siendo un desafío. Sin
embargo, este problema se resolvió con éxito mediante la
captura de un producto de imina mediante la adición de
bisulfito, lo que demuestra la importancia de la ingeniería de
procesos en la aplicación industrial de una biocatálisis. En
comparación con el método de resolución, el proceso
biocatalítico no sólo aumenta el rendimiento del producto en
un 150%, sino que también reduce el uso de materias primas en
un 59,8%, el consumo de agua en un 60,7% y los residuos
totales del proceso (factor E) en un 63,1% (Li et al., 2012).
Aunque el proceso aún no ha sido escalado a escala industrial,
la misma oxidación amínica asimétrica por MAO se utiliza
actualmente en la síntesis de otro fármaco para la infección por
hepatitis C, es decir, el telaprevir (Znabet et al., 2010).
Recientemente, el espectro de sustratos para MAO se ha
expandido para acomodar sustratos amínicos con voluminosos
sustitutos arílicos a través de un diseño racional guiado por la
estructura y enfoques de cribado de alto rendimiento (Ghislieri
et al., 2013). El MAO de ingeniería se aplicó en la síntesis de las
drogas solifenacina y levocetirizina, así como alcaloides
naturales Productos incluyendo coniina, eleagnina, leptaflorina
y harmicina. (Ghislieri et al., 2013).
El Codexis ha desarrollado recientemente un proceso
biocatalítico para la producción de intermediarios para
medicamentos de gran éxito como la atorvastatina, el
montelukast, la duloxetina, la fenilefrina, la ezetimiba y el
crizotinib, basado en la hidroxilación estereoscópica y
regioespecífica mediante el uso de la keto-reductasa (KRED) del
lactobacillus kefir (Huisman y Collier, 2013; Huisman et al.,
2010). El medicamento antiasmático, montelukast, fue
desarrollado y comercializado bajo el nombre comercial
Singulair por Merck (Liang et al., 2009). Un intermedio clave en
la síntesis de montelukast fue reducido asimétricamente
usando clorodiisopinocampheylborane (DIP-Cl). Basado en una
variante de KRED previamente desarrollada que mostraba
actividad para este voluminoso intermediario (Bornscheuer et
al., 2012; Liang et al., 2009), el Codexis se centró en mejorar la
actividad y estabilidad de la enzima para reemplazar al
catalizador químico, DIP-Cl. Combinado con una evolución
dirigida y optimización del proceso, el KRED exhibe una alta
enantioselectividad (N99.9%) y estabilidad incluso en presencia
de ∼70% de solventes orgánicos a 45 °C (Esquema 8). El
proceso biocatalítico se realiza actualmente sobre un sustrato
de escala N200 kg, sustituyendo a un catalizador DIP-Cl
peligroso. El punto más intrigante en la ingeniería de KRED es el
aumento de la estabilidad de las enzimas incluso a altas
concentraciones de disolventes orgánicos y temperaturas.
Debido a la baja solubilidad del sustrato en agua, la alta
concentración de disolvente orgánico y la temperatura son
necesarias. Basándose en la correlación entre la estabilidad
térmica y la tolerancia a los disolventes (Huisman et al., 2010),
los investigadores de Codexis examinaron principalmente
mutantes enzimáticos con una mayor estabilidad térmica,
seguida de un análisis de para mutantes tolerantes a los
disolventes (Huisman et al., 2010).
Otro ejemplo que involucra al KRED es la síntesis de
hidroxinitrilo, que es un intermediario clave para la
atorvastatina, utilizando un proceso multienzimático (Ma et al.,
2010). La atorvastatina es un miembro de la familia de las
estatinas que reduce el colesterol bloqueando la síntesis de
colesterol en el hígado, y actualmente es comercializada por
Pfizer bajo el nombre comercial de Lipitor (Ma et al., 2010).
Utilizando enzimas preevolucionadas, Codexis desarrolló un
proceso en dos etapas compuesto de tres etapas enzimáticas
que incluyen la halohidrina deshalogenasa (HHDH), la glucosa
deshidrogenasa (GDH) y el KRED (esquema 9). En este proceso,
KRED está involucrado en el primer paso de la reducción de etil-
4-cloroacetoacetato junto con GDH para la regeneración de
cofactores. Los avances en la tecnología de ingeniería de
proteínas han permitido una síntesis a gran escala de
intermediarios de hidroxinitrilo. Este proceso multienzimático
ha demostrado ser no sólo atractivo desde el punto de vista
medioambiental, sino también económicamente viable en
comparación con un proceso químico tradicional.
Con un número creciente de enzimas disponibles para la
síntesis de compuestos farmacéuticos, también están
aumentando los intentos de desarrollar procesos de "una sola
olla" basados en reacciones en cascada multienzimáticas (Oroz-
Guinea y García-Junceda, 2013; Ricca et al., 2011; Shin et al.,
2013; Simon et al., 2013). Comparado con un proceso químico
tradicional y un proceso de una sola enzima, un proceso de una
sola olla es altamente enantioselectivo y eficiente al evitar la
necesidad de múltiples pasos. Se han reportado muchos tipos
de reacciones en cascada que involucran ATA (Simon et al.,
2013), y la mayoría de ellas están combinadas con enzimas
redox que llevan a cabo un reciclaje de cofactores.
Recientemente, se informó de un proceso en cascada de una
sola olla para la síntesis de pirrolidinas quirales 2,5-disustituidas
con una combinación de variantes existentes de ATA y MAO
(O'Reilly et al., 2014) (Esquema 10A). Otra ventaja de una
reacción de una sola olla con una cascada multienzimática será
el uso de moléculas achirales baratas como materiales de
partida. Un estudio reciente demostró la síntesis de nor-
pseudoefedrina (NPE) y norefedrina (NE) a partir de materiales
simples como benzaldehído y piruvato mediante una
combinación de ATA y acetohidroxiácido sintasa I (AHAS-I) (Sehl
et al., 2013) (Plan 10B). Usando (R) o (S)-ATA, los
estereoisómeros de NPE y NE se sintetizaron con alta
enantiopresión (N99%). Además, el piruvato, que es un
subproducto de la reacción ATA, se recicló en una reacción
AHAS-I como sustrato. Además de una reacción en cascada, la
reacción artificial redes multienzimáticas conectadas a través
del reciclaje de redox han sido (Tauber et al., 2013) (Esquema
10C).
2.3. Industria alimenticia
En la industria alimentaria, la biocatálisis se ha utilizado durante
mucho tiempo para producir materias primas y productos
finales (Fernandes, 2010). Sin embargo, la mayoría de los usos
de la biocatálisis se han centrado en las reacciones hidrolíticas
para el desramado, mejorando la solubilidad y la clarificación.
Con la creciente demanda de aspectos nutricionales, se ha
prestado mucha atención a la funcionalidad de los alimentos
más allá de la función primaria de suministro de nutrientes. Una
tendencia reciente en la industria alimentaria es desarrollar
alimentos funcionales como los prebióticos, los edulcorantes
bajos en calorías y los azúcares raros (Akoh et al., 2008).

Los prebióticos son una sustancia dietética compuesta de

polisacáridos y oligosacáridos no almidonados, incluyendo
inulina, oligosacáridos fructo (FOS), galacto-oligosacáridos
(GOS), lactulosa y oligosacáridos de la leche materna. Sin
embargo, la mayoría de ellos no son bien digeridos por las
enzimas humanas (Figueroa-González et al., 2011), y los
ingredientes que promueven selectivamente el crecimiento de
los microorganismos intestinales aún no han sido dilucidados.
A medida que aumenta la complejidad estructural de los
Según un informe de Global Industry Analysis (GIA), para el año
compuestos farmacéuticos, la demanda de biocatalizadores en
2015, el mercado prebiótico alcanzará casi 225 millones de
la formación de enlaces carbono-carbono, como la aldolasa,
dólares y 1.120 millones de dólares en los EE.UU. y Europa para
también está aumentando (Windle et al., 2014). Las reacciones
el año 2015, respectivamente (Panesar et al., 2013). Con la
de Aldol son útiles porque pueden proporcionar intermediarios
creciente demanda de prebióticos, la industria alimentaria se
clave de productos farmacéuticos a partir de bloques de
ha interesado en el uso de enzimas para altos rendimientos de
construcción simples. Como se ejemplifica en la síntesis de un
producción a bajo costo y utilizando procesos simples.
intermediario clave en las drogas estatinas, (3R,5S)-6-cloro-
2,4,6-trideoxihexapiranosido puede producirse a partir de
moléculas simples como el cloroacetaldehído (CAA) y el
acetaldehído utilizando la ingeniería de la aldolasa de 2-
deoxirribosa-5-fosfato (DERA) (Jennewein et al., 2006)
(esquema 11). La ingeniería de proteínas permite una gama de
sustratos más amplia, así como una mayor estabilidad,
actividad y estereoselectividad de las aldolasas (Althoff et al.,
2012; Baker and Seah, 2011; Cheriyan et al., 2012; Giger et al.,
2013; Zandvoort et al., 2012). En consecuencia, la utilidad
sintética de las aldolasas también aumenta sustancialmente
(Windle et al.., 2014).
El anhídrido de difructosa (DFA) III es un edulcorante no
cariogénico y un disacárido no digerible que promueve la
absorción de calcio magnesio y otros minerales en el intestino
(Haraguchi et al., 2006). El DFA III se produce a partir de la
inulina por la inulina fructotrnasferasa exoactiva (EC 4.2.2.18)
de los ureafacientes de Arthrobacter (esquema 12A). Desde
entonces, se ha identificado la inulina fructotrnasferasa de
Los galacto-oligosacáridos son ingredientes que promueven la
Arthrobacter sp. y otras bacterias (Hang et al., 2011; Kikuchi et
salud y que tienen propiedades prebióticas, pero son azúcares
al., 2009). Sin embargo, el uso industrial del DFAE III se vio
poco digeribles (Rastall, 2013). Además, se han reportado
limitado por una baja estabilidad térmica y una costosa inulina
muchos otros beneficios para la salud, incluyendo una mejora
(Hang et al., 2013). Se ha hecho un gran esfuerzo para aislar la
en la defecación, la estimulación de la absorción de minerales,
inulina fructotrnasferasa termoestable de varios
la prevención del cáncer de colon y la protección contra ciertas
microorganismos y para desarrollar un proceso novedoso
infecciones bacterianas patógenas (Barile y Rastall, 2013). La
utilizando un sustrato barato. Informes recientes han mostrado
producción de galactooligosacáridos se logró a través de una
una nueva inulina fructotrnasferasa Arthrobacter pascens T13-
reacción enzimática de la lactosa con β-galactosidasas de varias
2, Arthrobacter sp. L68- 1, y otras especies de Nonomuraea,
fuentes microbianas, de levaduras y de hongos, lo que condujo
estable hasta 70-80 °C después de 1 h de tratamiento térmico
a la diversidad estructural de los galactooligosacáridos
(Haraguchi et al., 2006; Pudjiraharti et al., 2011). Los
(Rodriguez Colinas et al., 2011; Vera et al., 2012). La estructura
fructooligosacáridos (FOS) como prebióticos pueden
básica de los galactooligosacáridos contiene una espina dorsal
sintetizarse a partir de la sacarosa utilizando
de lactosa (galatosa-glucosa) en el extremo reductor, que se
fructosiltransferasa (EC 2.4.1.19). La inulina tiene un vínculo
expande hasta seis residuos de galactosa (esquema 13). En
fructofuranosídico similar al FOS, que es el sustrato más
general, el rendimiento de producción de galacto-
pequeño para la inulina fructotransferasa. Se intentó utilizar la
oligosacáridos usando β-galactosidase alcanzó alrededor del 30-
sacarosa como sustrato para producir DFA III, lo que resultó en
35% (p/p) (Park y Oh, 2010). Para aumentar el rendimiento de
un rendimiento de alrededor del 10% (p/p). a través de una
la producción, una gran parte del esfuerzo se ha centrado en el
reacción enzimática acoplada como un enfoque novedoso
aislamiento y la aplicación de la galactosidasa termoestable β-
(Esquema 12B) (Hang et al., 2013).
galactosidasa a partir de microorganismos termófilos como
Geobacillus stearothermophilus, Pyrococcus furiosus, S.
solfataricus, T. maritima y Thermus sp. debido a que las
enzimas termoestables conducen a una alta velocidad de
reacción, una menor contaminación y una alta solubilidad de la
lactosa a altas temperaturas (Bruins et al., 2003; Placier et al.,
2009).

Al igual que el GOS, los fructooligosacáridos (FOS) se utilizan

como edulcorantes artificiales y fibra dietética con bajos niveles
calóricos, promoviendo el crecimiento de Bifidobacterias en el
colon humano. Además, tiene un papel importante en la
estimulación de la absorción de calcio y magnesio, y una
disminución de los niveles de colesterol, fosfolípidos y
triglicéridos en el suero humano (Moore et al., 2003; Sanchez et
al., 2010). El FOS se produce a partir de la sacarosa por medio
de enzimas que muestran actividad de transfructosilación. Tales
enzimas son β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26) y Recientemente, un se logró un alto rendimiento de producción
fructosiltransferasa (EC 2.4.1.9), que se originan de hongos y
bacterias (Hang and Woodams, 1996; Silva et al., 2013). La
reacción de FOS por enzimas es una unidad de D-glucosa (G) y
una unidad de fructosa (F) en cada sacarosa (GF) unidas por β (2
→ 1) enlaces glucosídicos (GF + GF → GFn-1 + GFn+1) (esquema
14). Se reportó que el rendimiento de producción de FOS a
escala industrial alcanzó el 55-60% (p/p) basado en la
concentración inicial de sacarosa (Mussatto y Teixeira, 2010).
Un nuevo aumento en el rendimiento demostró ser difícil
porque también se produjo un alto nivel de glucosa durante la
reacción, inhibiendo la actividad de la transfructosilación. Para
resolver este problema, se añadió oxidasa de glucosa adicional
a la mezcla de reacción en un intento de convertir la glucosa en
ácido glucónico, lo que resultó en un rendimiento de
producción de hasta un máximo de 90-98% (p/p) (Lin y Lee,
2008). Como método para eliminar la glucosa en una mezcla de
reacción, glucosa deshidrogenasa y carbonato de calcio se
utilizaron simultáneamente para precipitar el ácido glucónico
(Sheu et al.., 2013).
2.4. Industria cosmética
Una variedad de los ingredientes utilizados en la industria
cosmética se producen a partir de materias primas de origen
petroquímico (Turner, 2012). Recientemente, sin embargo, la
industria cosmética se ha enfrentado a un reto debido a la
creciente demanda de los consumidores de cosméticos
naturales y ecológicos (Ansorge-Schumacher y Thum, 2013). En
consecuencia, la industria cosmética promueve la investigación
básica y los procesos ecológicos que utilizan enzimas para
desarrollar productos cosméticos más eficaces.
La arbutina es el aclarador de la piel más común y se sabe que
inhibe melanogénesis sin causar melano-citoxicidad (Hori et al.,
2004). Como un enfoque enzimático para producir arbutina,
varias enzimas incluyendo α-amilasa, α-glucosidasa,
transglucosidasa, sacarosa fosforilasa y dextransacrasa (Wang
et al., 2006). La mayoría Sin embargo, los procesos enzimáticos
tienen ciertos inconvenientes, tales como un alto nivel de costo
del sustrato y bajo rendimiento de conversión (Seo et al., 2009).
utilizando amilosucrasa (EC 2.4.1.4), que pertenece a la familia
de las glicósidas hidrolásicas 13 que catalizan el síntesis de
glucanos similares a la amilosa a partir de la sacarosa (Seo et al.,
2012). Se demostró que la amilosucrasa de Deinocococcus
geothermalis catalizaba una reacción glicosiltransferasa
utilizando sacarosa e hidroquinona como un donante y un
aceptante, respectivamente. El rendimiento máximo de
conversión de α-arbutin fue superior al 90% en presencia de 0,2
mM ascórbico ácido.
Los ésteres emolientes son oleoquímicos multifuncionales que
se utilizan ampliamente en los productos cosméticos debido a
su propiedad hidratante. Los ésteres emolientes como el
miristato de miristilo se producían convencionalmente
utilizando oxalato de estaño como catalizador a alta
temperatura mediante la transesterificación de aceites
vegetales y alcoholes (Veit, 2004; Paravidino y Hanefeld, 2011).
Se llevó a cabo una reacción de esterificación sin un disolvente
en presencia de cantidades iguales de reactivos a 75 °C
utilizando Novozym 435 lipasa, y un rendimiento en el tiempo
espacial de 6.731 g d-1 L-1 fue logrado para el miristato de
miristilo (Hilterhaus et al., 2008).
2.5. Industria textil
En la industria textil, antes de la transformación en tejido e hilo,
el algodón se somete a diversos procesos, entre los que se
incluyen el refinado, el blanqueo y el teñido, y pulido (Queiroga
et al., 2007). Estos procesos consumen grandes cantidades de
cantidades de energía, agua y recursos, descargando enormes
cantidades de los residuos. Para el desarrollo de procesos más
limpios, el uso de enzimas está creciendo rápidamente.
Ejemplos típicos incluyen la tinción de jeans usando celulasa de
Trichoderma viride, y un proceso de bio-carbonización en el
caso de la lana (Yachmenev et al., 2002). La celulasa y la
proteasa son utilizado en el paso de pulido para el teñido claro,
la mejora del color y la viveza de la superficie, y la resistencia a
las arrugas (Dincer y Telefoncu, 2007; Silva y otros, 2005).
2.6. Industrias de pulpa y papel
En las industrias de la pulpa y el papel, la xilanasa y la ligninasa
se utilizan para mejorar la calidad de la pulpa mediante la
eliminación de la lignina y las hemicelulosas, que son impurezas
típicas (Maijala et al., 2008). En la producción de pasta, la lipasa
también se emplea para degradar la brea en la madera, la
presencia de lo que causa un serio problema en el proceso de
fabricación. El el reciclaje de papel impreso, como el papel de
periódico con celulasa, también fue (Patrick, 2004). En el
proceso de fabricación de papel, la lignina causa un color
oscuro, y la eliminación de la lignina es necesaria para hacer
más brillante papel. El proceso de pulido químico requiere la
adición de una gran cantidad de cantidad de productos
químicos alcalinos y cloro (Fu et al., 2005). El uso de se ha
demostrado que evita el cloro elemental y reduce
significativamente la cantidad de residuos que provocan el
agotamiento de la capa de ozono y la acidificación, así como el
alto consumo de energía.
3. Tendencia y estrategia en ingeniería enzimática para
aplicaciones industriales
Para ampliar aún más el uso industrial de las enzimas, deben
satisfacerse las propiedades catalíticas y biofísicas de las
enzimas, como la eficiencia catalítica, la especificidad del
sustrato y la estabilidad. Aunque sería discutible, la estabilidad
de las enzimas frente al calor y a los disolventes orgánicos se
considera generalmente más crítica debido a los duros procesos
industriales. La termoestabilidad suele estar relacionada con la
tolerancia contra disolventes orgánicos y mutaciones
desestabilizadoras (Huisman et al., 2010; Reetz et al., 2010;
Vazquez-Figueroa et al., 2008), y la mejora de la
termoestabilidad es un requisito previo para las aplicaciones
industriales (Bloom et al., 2006). La tendencia actual en la
termoestabilidad de la ingeniería es combinar el diseño racional
basado en la estructura y los métodos computacionales en
conjunción con la evolución dirigida. La evolución dirigida por el
enfoque disminuye el tamaño de una biblioteca, pero aumenta
la tasa de éxito en comparación con la mutagénesis aleatoria.
Por ejemplo, la evolución dirigida de la lipasa de Bacillus subtilis
guiada por un enfoque de valor de temperatura (B-FIT) resultó
en un aumento de casi 500 veces la vida media de la enzima a
55 °C (Reetz et al., 2006a). B-FIT se dirige a los aminoácidos con
factor de alta temperatura (factor B) en la estructura cristalina,
lo que indica una alta flexibilidad térmica (Reetz et al., 2006a;
Reetz y Carballeira, 2007). La mezcla de ADN a través de
SCHEMA generó de forma efectiva una cellobiohidrolasa
termoestable de clase II (CBH II) mediante el cribado de sólo 48
variantes (Heinzelman et al., 2009). SCHEMA es un método
computacional que estima la interrupción estructural de la
enzima después de la recombinación del ADN (Silberg et al.,
2004). Los extremófilos han sido considerados fuentes útiles de
enzimas industriales con alta estabilidad contra el calor, las
sales y el pH (Elleuche et al., 2014; Illanes et al., 2012;
Kazlauskas y Bornscheuer, 2009). Se descubrió que las enzimas
de los extremófilos tienen una estructura compacta y una serie
de interacciones de carga en comparación con sus contrapartes
mesófilas, y tales como los análisis estructurales y funcionales
de las enzimas extremas han proporcionado un poco de
conocimiento sobre el diseño de enzimas con alta estabilidad.
Incluso aunque la expresión funcional de dichas enzimas sigue
siendo un reto (van den Burg, 2003), pueden utilizarse como
modelos iniciales para la ingeniería de la estabilidad de las
enzimas.
En cuanto a la propiedad catalítica de las enzimas, se ha
aplicado ampliamente la evolución dirigida para aumentar la
actividad catalítica o para alterar las especificidades del sustrato
y del producto (Evran et al., 2012; Kumar y Singh, 2013; Sterner,
2011). La evolución dirigida basada en el mecanismo de
reacción de la fenilalanina amoníaco liasa (PAL) resultó en una
actividad 15 veces mayor y una disminución de la inhibición del
sustrato en comparación con la enzima de tipo silvestre
(Bartsch y Bornscheuer, 2010). La enantioselectividad de la
epoxi hidrolasa se mejoró mediante la evolución dirigida junto
con el CASTing iterativo (Reetz et al., 2006b). CASTing
(Combinatorial Active-site Saturation Testing) demostró ser
eficaz para el diseño sistemático y el cribado de una biblioteca
centrada alrededor del bolsillo de unión de las enzimas (Reetz
et al., 2006b). ProSAR es un método computacional estratégico
que analiza estadísticamente las relaciones secuencia-actividad
de las proteínas (Fox et al., 2007). La evolución dirigida en
conjunto con ProSAR, fue utilizada con éxito en el desarrollo de
la cetoreductasa (KRED) y la R transaminasa selectiva (ATA-117)
para mejorar la actividad catalítica y la enantioselectividad
hacia sustratos de relevancia industrial (Savile et al., 2010; Liang
et al., 2009; Huisman et al., 2010). Para utilizar el sistema de
cribado de alto rendimiento (HTS) con alta sensibilidad y
eficiencia es crucial (Acker y Auld, 2014; Kazlauskas, 2008). En
este sentido, el circuito genético sería uno de los métodos de
selección más importantes. Recientemente, se han desarrollado
varios circuitos genéticos para medir directamente la actividad
de las variantes enzimáticas basándose en los niveles de
expresión de los genes informantes, y que se utilizan
eficazmente para la evolución dirigida de las enzimas (Choi et
al., 2014a, 2014b; Jeong et al., 2012; Kim et al., 2010).
En un intento de explorar el uso de enzimas en reacciones no
naturales, se ha hecho un gran esfuerzo para crear enzimas con
nuevas funciones catalíticas basadas en el diseño racional y
métodos computacionales en conjunción con la evolución sintética eficiente sin la pérdida de los intermediarios,
dirigida (Lee et al., 2009; Park et al., 2006; Song y Tezcan, 2014; reduciendo así la cantidad de enzimas en la reacción. sistema.
Sterner et al., 2008). Al mismo tiempo, los enfoques de Típicamente, la co-localización de las enzimas relevantes en la
modelación computacional, tales como el cálculo de la proximidad de las proteínas utilizando aminoácidos no
perturbación de la energía libre, la simulación de acoplamiento naturales (Seo et al.., 2011). El uso de moléculas de andamiaje
de sustratos, la dinámica molecular (MD) y el cálculo de la para inducir la unión de enzimas, como el ADN, el ARN y las
energía de enlace de hidrógeno, han sido empleados en un proteínas, ha dado lugar a un mayor rendimiento del producto
diseño racional (Krieger et al., 2002; Schwab et al., 2008; (Fu et al., 2014).
Bommarius et al., 2006; Illanes et al., 2012; Kazlauskas y Lutz,
2009; Khare et al., 2012). En particular, las simulaciones MD 4. Conclusiones
pueden predecir residuos inestables útiles para alterar la
En las últimas décadas, los procesos basados en enzimas han
actividad o la termoestabilidad. Por ejemplo, la termostabilidad
sustituido continuamente a los procesos químicos tradicionales
de la xilanasa se mejoró significativamente sin el gasto de la
en muchas áreas, especialmente en la industria química fina y
actividad enzimática mediante la optimización de los residuos
farmacéutica. Debido al desarrollo de nuevas tecnologías en
inestables pronosticados por simulaciones de DM (Bhabha et
ingeniería enzimática, así como a la presión económica y a la
al., 2011; Joo et al., 2011; Lee et al., 2010). Choi et al.
preocupación pública por la contaminación ambiental, esta
reportaron un diseño racional de ornitina decarboxilasa con
sustitución será más acelerada. Por lo tanto, sería una gran
actividad catalítica mejorada usando el acoplamiento de
oportunidad para que los investigadores exploren nuevas
sustrato y simulaciones de DM (Choi et al., 2014a, 2014b).
aplicaciones y tecnologías en ingeniería enzimática. La
Considerando la importancia de la dinámica en las reacciones
tendencia actual de la ingeniería enzimática basada en la
enzimáticas, la simulación MD proporcionará información
evolución dirigida y enfocada junto con los métodos
valiosa sobre la relación flexibilidad-función de las enzimas, que
computacionales continuará e incluso se acelerará. Los
no ha sido posible gracias a las estructuras enzimáticas
algoritmos computacionales para el enfoque sistemático, como
cristalinas. Un nuevo experimento de RMN en conjunto con la
ProSAR, estarán más optimizados para aplicaciones fáciles. Se
mutagénesis ha sido aplicado al estudio de la catálisis
explorarán nuevos algoritmos que analicen la relación
enzimática (Doucet, 2011). Al igual que la DM, este enfoque
secuencia-función para generar bibliotecas más sistemáticas y
permitirá comprender mejor la relación entre flexibilidad y
diversas. Uno de los problemas más difíciles en la ingeniería de
función para comprender el efecto de las redes mundiales de
enzimas es la falta de reglas generales para priorizar las
residuos flexibles sobre la actividad y la estabilidad de las
propiedades de las enzimas a mejorar y seleccionar los métodos
enzimas (Kim et al., 2013; Seo et al., 2014). El objetivo final en
adecuados. Una elección equivocada en un determinado paso
el diseño racional de enzimas industriales es generar enzimas
de ingeniería podría poner en peligro todo un proyecto. La
con nuevas y robustas funciones catalíticas para procesos
acumulación de historias de éxito en ingeniería enzimática
industriales. El diseño de novo de enzimas industriales en esta
proporcionará reglas adecuadas en la elección. Para desafiar el
etapa todavía es difícil de lograr, pero algunos estudios han
diseño racional de la enzima de novo con las propiedades
mostrado éxitos notables con el método de Rosetta
deseadas, el conocimiento mecanicista sobre las relaciones
(Rothlisberger et al., 2008; Siegel et al., 2010). Rosetta es el
estructura-función y dinámica-función debe ser más avanzado
enfoque computacional más avanzado que aplica la mecánica
para mejorar el algoritmo para el diseño de enzimas
cuántica al diseño computacional de enzimas novedosas
computacionales. Con las tecnologías desarrolladas, las enzimas
basadas en el andamiaje existente. (Das y Baker, 2008).
de diseño serán más fáciles de crear e industrialmente aplicado.
El proceso multienzimático ofrece algunas ventajas, como un
fácil control y monitoreo del proceso, una alta velocidad de
reacción, un fácil escalado y subproductos poco tóxicos (Rollin
et al., 2013). Sin embargo, el proceso de multi-enzimas tiene
ciertos obstáculos que aún no han sido superados para su
aplicación industrial, tales como el requerimiento de una gran
cantidad de enzimas y una baja concentración intermedia. Para
mejorar la tasa de reacción y el rendimiento de conversión, se
ha intentado el concepto de canalización del sustrato (Zhang,
2011). La canalización de los intermediarios hacia las enzimas
de la siguiente etapa puede permitir el diseño de una vía