Informe N°8

“Verificación Colonias por PCR”

Laboratorio de Genética Molecular

Profesora : Marcela Bravo

Alumna : Karen Esteves
Fecha : 19/11/15
INTRODUCCIÓN

En una transformación bacteriana las células introducen y expresan la información de un ADN exógeno.
Este ADN puede provenir de un ADN recombinante construido in vitro o bien de moléculas de ADN
naturales.
En la transformación bacteriana se requiere que las bacterias se encuentren en un determinado estado
fisiológico, denominado competencia. En este estado competente, las paredes bacterianas se hacen
permeables a macromoléculas como el ADN o en concreto a los plásmidos. En ciertas especies, la
competencia puede producirse de forma natural cuando las condiciones son adversas, con bajos niveles
de nutrientes y de oxígeno (Schaechter M 1993)
Escherichia coli es una especie que en su forma natural no tiene un estado de competencia, se requiere
una manipulación para hacerla competente, la competencia se induce gracias a choques térmicos,
transiciones súbitas entre calor y frío, que afectan la estructura y permeabilidad de la pared celular y de
la membrana. En estado de competencia las paredes celulares son inestables y las células se vuelven
frágiles por lo que deben tratarse con cuidado (Cabello 2007)
Para seleccionar las células transformadas, se siembran en un medio selectivo que contiene ampicilina.
Para este práctico el medio con el que se trabajó fue el medio de cultivo LB (Luria Bertani) es el medio
utilizado por excelencia para el mantenimiento de las cepas de E.coli recombinante en procesos de
microbiología molecular.

La ampicilina es un derivado de la penicilina que inhibe el crecimiento bacteriano al interferir en la

síntesis de las paredes celulares. (Jhon L.Ingraham 1998)
Para verificar que las colonias que crecieron en las placas LB-Ampicilina contienen el plasmidio de
interés se pueden picar directamente las colonias y hacer un PCR con primers específicos del plasmidio
que utilizaremos para transformar las bacterias

OBJETIVO

Verificar que las colonias que crecieron en las placas LB-Ampicilina contengan el plásmido pc DNA 3.1.
MATERIALES

 Buffer PCR 5X
 dNTPs 2.5mM
 MgCl2 25 mM
 Taq Polimerasa
 H2O mili Q
 Primers P0
 Vortex
 Puntas amarillas
 Placas con el experimental 1
 Transiluminador
 Termociclador
 Micropipetas P20,P100
 Agarosa al 1.5%
 Tubos PCR 0.6

PROCEDIMIENTO

1. Se picó colonias utilizando puntas amarillas estériles cerca del mechero y se re suspendió cada

colonia en 10 µl de H2O mili Q en 4 tubos (Esto representa el stock de bacterias)

2. Se preparó una mezcla de PCR utilizando los valores que muestra la tabla 1.

3. Se extrajo 14 µl del mix de PCR por cada tubo y se agregó 2 µl del stock de bacterias, luego se

mezcló con vortex y se hizo un spin para llevar la mezcla al fondo del tubo.

4. Se programó el termociclador con los siguientes parámetros según tabla 2.

5. Se corrió 2 geles al 1.5% para visualizar los fragmentos.

6. Las colonias que resultaron positivas, se dejaron en 5ml de medio líquido LB-ampicilina

(100µg/ml), toda la noche a 37°C con agitación.

Tabla 1.Mix PCR

COMPONENTES VOLUMEN
Buffer PCR 5X 3 µlts
Mezcla Dntps 2.5mM 1.2 µlts
MgCl2 25mM 0.9 µlts
Primers 0.3 µlts
Taq Polimerasa 0.15 µlts
H2O miliQ 8.45 µlts

Tabla 2.Programa del termociclador.

TEMPERATURA TIEMPO PROCESOS

92°C 3 minutos Lisis bacterias
92°C 30 segundos Denaturación
60°C 30 segundos Annealing
72°C 30 segundos Extensión
72°C 30 segundos Extensión Final
4°C α
RESULTADOS

Los productos de PCR se analizarán mediante separación electroforética en gel de agarosa.

FIG 1. GELES DE AGAROSA 1.5%

A B

A. Muestras sin presencia de bandas para ambas muestras.

B. Calle 1: marcador de 1 kpb ("ladder") Calle 2: control negativo Calles 3 a 5: resultado de la PCR
de distintas colonias

A continuación, se muestra el producto PCR esperado. Estos resultados fueron realizados por la
docente a cargo del práctico (Figura 2)

Figura 2. Producto PCR por la docente

M.Bravo.
DISCUSIÓN

La PCR es una técnica ,que permite obtener en corto plazo los resultados esperados. Mediante esta
metodología, de un conjunto de colonias puede determinarse, usando los cebadores del fragmento de
DNA deseado, las que contienen o no el inserto de interés.

La elaboración de la técnica de electroforesis, fue para verificar que las colonias que crecieron en las
placas LB-ampicilina, contengan el plásmido pcDNA 3.1. De esta manera, por ejemplo se observó, para
el gel A, la ausencia de bandas debido a que no hubo obtención de plásmido y por ende el PCR
realizado no funcionó, y al compararlo con el gel B, que esta si presenta bandas que muestra la
obtención del plásmido.

La técnica PCR no funcionó para el gel A se debido a:

1. No hubo buen funcionamiento de la taq polimerasa, debido a que si hubiera funcionado se

observaría alguna banda en la muestra.
2. El DNA plasmidial no estaba íntegro, debido a la poca cantidad obtenida de muestra.
3. Error de micro pipeteo por parte del operador en el práctico y por ello hubo una desnaturación de
la muestra.
BIBLIOGRAFÍA

Cabello, Raúl Romero. Microbiologia y parasitologia humana / Microbiology and Human Parasitology. 3era.
Panamericana, 2007.

Jhon L.Ingraham, Catherine A Ingraham y Harriett Prentiss. Introducción a la microbiología. Barcelona: Reverté
S.A, 1998.

Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Microbiología. Mecanismos de las enfermedades infecciosas.
2da. Buenos Aires: Panamericana, 1993.