De los orígenes a la actualidad

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/docs.php?curso=206
 Técnica
Instrumental

La herramienta analítica
de mayor importancia
Componentes básicos

Horno
Fase Control Introducción
móvil Columna Detección
de flujo de muestra

Registro
y proceso
 PROCESO CROMATOGRAFICO

 La fase móvil fluye a lo largo del lecho

cromatográfico en contacto con la fase
estacionaria.

COLUMNA
º º º ºº º º º º ºº ºº ºº ºº º º ºº º ººº ºº ºº º º º
º ºº º º º º ºº ºº º º ºº º
º º º ººº ºº ºº ºº º º ººº ºº ººº ººº ººº ºº ººº ºº ºººº ººº ºººº ºº ºº ºº º º
FASE MÓVIL
º º º º º º º º ººFASE
º º ºººº ºº º º º º ºº º º ºº ººº º º º º º
º ºº ºº ºº ºº ºº º º º ººº ºº ººMÓVIL
ºº º º º º ººº º º º º º º FASE MÓVIL
º º º º ºº ººº ºº º ºº º ºººº ºººº ºººº ºººº ºº ººº ºººººº ºº ººººº ººº ºººº º ºº º
º º º º º º º º º º ºº º º º º º º ºº º º º º
º º º º ºº ºº º º º º º ºº ºº ºººº ººº ºº º º ºº ºº ºººº ºº ºººº ºº º º º º
COLUMNA
 PROCESO CROMATOGRAFICO

 La fase móvil fluye, arrastrando consigo los

solutos.
 Los solutos se reparten entre ambas fases

Fase Fase
Muestra
estacionaria móvil
 PROCESO CROMATOGRAFICO

 AL ALIMENTAR LA MUESTRA AL
SISTEMA, LOS SOLUTOS SE REPARTEN
ENTRE LAS DOS FASES.

Fase móvil Fase móvil

t0 t0

Fase estacionaria Fase estacionaria

 PROCESO CROMATOGRAFICO

 LAS MOLECULAS DE SOLUTO EN FASE

ESTACIONARIA SE ESTANCAN
 LAS MOLECULAS EN FASE MOVIL
AVANZAN CON ELLA

Fase móvil Fase móvil

t1 t1

Fase estacionaria Fase estacionaria

PROCESO CROMATOGRAFICO

 LA VELOCIDAD DEL SOLUTO VARIA

INVERSAMENTE CON LA AFINIDAD POR
LA FASE ESTACIONARIA.

F. móvil

F. estacionaria
 SEPARACION DE SOLUTOS

 LOS COMPONENTES CON CONSTANTES DE

REPARTO DIFERENTES SE SEPARARÁN.

Fase móvil
t0

Fase estacionaria
 SEPARACION DE SOLUTOS

Fase móvil
t1

Fase estacionaria

Fase móvil
t2

Fase estacionaria

Fase móvil
t3

Fase estacionaria
 Dimensiones de la Columna
 L = Largo de columna (cm, mm)
 dc = diámetro interno (mm, µm)
 df = espesor de película de fase (µm)
 dp = diámetro de partícula (µm)
 Vo = volumen muerto (ml)
 Velocidad y flujo de fase
 Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por
unidad de tiempo, medido a la salida de la columna
y a temperatura ambiente (ml/min)
 Velocidad de fase móvil = u = distancia media
recorrida por la fase movil en una unidad de tiempo
(cm/seg)
 F π r 2φ ⋅ u
=
 Tiempo Muerto (t0)
 El tiempo que tarda en eluir un soluto que no
interacciona con la fase estacionaria.
 El tiempo que se necesita para renovar totalmente
la fase móvil de la columna.
 to = Vo / Fo
 TIEMPO DE RETENCIÓN
 tr = Tiempo transcurrido al momento de eluir el
máximo de concentración del soluto.
 Vr = volumen de retención = volumen de fase móvil
gastado al momento de eluir el máximo de
concentración del soluto.
 Vr = tr Fo
 TIEMPO DE RETENCIÓN
tr
señal

to

tiempo
 Constante de Reparto
 Equilibrio de reparto:
Solutofm ⇐⇒ Solutofe

Soluto fe
K=
Soluto fm

 Cociente de las concentraciones del soluto. Soluto

en la fase estacionaria entre soluto en fase móvil
 Ecuación de la Retención
Vr = Vo + KVe

 El volumen de retención de un soluto es la suma de

las contribuciones del tiempo que estuvo en fase
móvil (Vm) y en fase estacionaria (KVe).

Vr − Vo
K=
Ve
 Tiempo de Retención Corregido
tr
tr′
señal

to

tiempo
 Factor de Capacidad
 Cociente de la cantidad de soluto en fase
estacionaria entre la cantidad en fase móvil.

nsolutofe
k′ =
nsolutofm
 FACTOR DE CAPACIDAD
tr
tr′

tr′ tr − to
señal

k′ = =
to to
to

tiempo
 Factor de Capacidad
Ve tr − to
k′ = K =
Vo to

 Medida de la retención del soluto.

 Indica que tan lejos del tiempo muerto eluye este.
Area y Altura del Pico

Area

Altura
tiempo
 Ancho del Pico
señal

Altura
w0.5

½ Altura
wb tiempo

 En mediciones manuales w0.5 es mucho mas preciso

que wb
 PLATO TEORICO
tr

Definición más conocida:

señal

2
 tr 

Altura
N = 16   w0.5
 wb 

½ Altura
tiempo wb
 PLATO TEORICO
tr
Varias fórmulas:
señal

2
 tr 
2
 tr   2
t 
= =   5.545=
  2π  Area 
r
N 16
 wb   w0.5   
 Altura 

Altura
w0.5

½ Altura
tiempo wb
 Altura del Plato Teórico
 H = Altura equivalente a un plato teórico.

L
H=
N
L

H
 Eficiencia Cromatográfica
 H mide la eficiencia de la columna cromatográfica.
 Entre mas pequeño sea H, el sistema es más
eficiente. ( mayor número de platos teóricos por
metro.
 Para una misma longitud se logra mayor poder de
separación con una menor H.
 Separación de Solutos
Señal

tiempo
 tr,2
′
tr,1
′

t´
r ,2
α=
t´
r ,1

to

wb,1 wb,2
 SELECTIVIDAD
K2 k2′ tr ,2 - t0
α= = = ≥1
K1 k1′ tr ,1 - to
 La selectividad muestra las diferencias de afinidad
por los solutos de las fases involucradas.
 Indica el potencial de separación de esos solutos en
el sistema, pero no mide la separación real.
 tr,2
tr,1

Rs =
(tr ,2 − tr ,1 )
1 (w + w )
2 b,1 b,2

wb,1 wb,2
 RESOLUCIÓN
Rs = 0.8

Rs = 1.0

Rs = 1.5

Rs = 2.0
 RESOLUCIÓN
 Tres son los factores que influyen en la resolución
cromatográfica: retención, selectividad y
eficiencia:

 k′  α − 1   N
Rs =  4 
1 + k′   a  
 
retención selectividad eficiencia
 RESOLUCIÓN
Solo controlando la retención ...

... la selectividad ...

... y la eficiencia ...

... se logra una buena separación.

 RESOLUCIÓN Y RETENCIÓN
90%

75%

Rs

0 2 3 4 6 8
k´ 10
RESOLUCIÓN Y SELECTIVIDAD
Rs

Zona de trabajo usual

0 2 4 6 8
α 10
 RESOLUCIÓN Y EFICIENCIA
3.2 x

Rs

1.4 x

0 20,000 40,000 60,000 80,000 10

N1 2N1
N 10 N1
 RESOLUCIÓN Y EFICIENCIA
 A mayor nímero de platos teóricos, mejor
separación.
 La separación mejora apreciablemente solo si el
aumento en N es de varios ordenes de magnitud.
 Los aumentos pequeños no son importantes, p. ej.
duplicar el largo de columna duplica el tiempo de
análisis y solo mejora en 40% la resolución.
 Las mejoras notables solo se logran mejorando las
técnicas cromatográficas.
Tiempo total de análisis y resolución
2 3
2  α  (1 + k′)   H
tt = 16 R s    2   
α − 1  (k′ )  u
 
ANÁLISIS MAS RÁPIDOS SI:
 Rs pequeña, como se busca separar : 1.5 ≤ Rs ≤ 2.
 α >> 1.
 k´ chica, para separar : 3 ≤ k´ ≤ 6.
 Se logran altas eficiencias (H pequeño) a
velocidades altas de fase móvil.
Eficiencia Cromatográfica
H = f (ensanchamiento de
la banda)

H =L
N
H = A + B + C ⋅u
u
=
A multicanales B difusión
C = resistencia a la transferencia de masa
Efecto Multicanales y/o
Eddy
A = 2λ d p
Difusión axial

B 2γ Dm
= 
u u

Transferencia de masa en la FM
“movimiento”
 Ensanchamiento de la
banda

 k ′  ta ⋅ u
2

He = 2  
′
 1 + k  De

Transferencia de masa en la FE
Transferencia de masa en fase móvil

Ωd u 2

Cm ⋅ u =
p

Dm
 Transferencia de masa

( − θ + ′ ) pu
2 2
1 k d
H sm =
30 (1 − θ )(1 + k ′ ) yDM
2

Transferencia de masa en la FM
“estancada”
 Ecuación de Van Deemter

 k ′  ta ⋅ u Ωd u (1 − θ + k ′ ) d p2u
2
2γ Dm
2 2

H =2λ d p + + 2  + +
p

 + ′  30 (1 − θ )(1 + k ′ ) yDM
2
u 1 k De Dm

H = A + B + C ⋅u
u
Efecto del diámetro de partícula
Digestión de enolasa.
Efecto del tamaño de partícula
en N y ∆P
Columnas
 Tubo de acero inoxidable, vidrio o capilar de sílice
fundida

 Dimensiones
 Longitud: 25 a 300 mm
 Diámetro: 25 µm a 100 mm
 Tamaño de partícula: 1.7 a 10 µm
Tipos de CL
• Cromatografía de intercambio iónico
• Adsorción: líquido-sólido
• Partición: líquido-líquido
– Cromatografia en fase normal
– Cromatografia en fase inversa
• Cromatografia de exclusión por tamaño
Empaques de UHPLC
 Images of current 1.9um particles
Cromatografía
de fase inversa
 FE
 Sílica químicamente modificada con
grupos no-polares: hidrocarburos
saturados: C18 octadecil, C8 octil, C4
tetrametil, C2 dimetl
 FM
 Mezclas: agua/disolventes orgánicos
H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)
Cromatografía
de fase inversa
 Efecto solvofóbico fuerte:
 Parte apolar de la molécula del soluto es mayor
 % C en la FE es mayor
 Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)
Fase móvil
 Disolventes grado cromatográfico
 Agua de 18 mΩ
 Baja viscosidad
 No vólatil
 Miscibilidad
 Filtrada
 Sin oxígeno disuelto (degasificada)
Fuerza del eluyente
Viscosidad del eluyente
Análisis Isocrático

Fase inversa, 10% CH3CN

Análisis Isocrático

Fase inversa, 80% CH3CN

Análisis Isocrático

Fase inversa, 50% CH3CN

Análisis por gradiente
Gradiente exponencial de acetonitrilo
∂T ∂t
Elución por gradiente
Detectores
 Indice de refracción
 Ultravioleta-Visible
 Fluorescencia
 Electroquímico
 Radioactividad
 Infrarrojo
 Espectrómetro de masas
Proteínas por 2D nano UPLC
Cromatogramas de digestión de E. Coli
Fabricantes de Equipo HPLC
• Agilent Technologies
• Beckman Coulter
• Cecil Instruments
• Dionex Corp
• Hitachi
• PerkinElmer, Inc.
• Shimadzu Scientific Instruments
• Thermo Fisher Scientific
• Varian, Inc.
• Waters Corporation
Columnas para HPLC
• Agilent Technologies
• AkzoNobel
• Beckman Coulter
• Dionex Corp
• Merck KGaA
• Micro-Tech
• Phenomenex
• SGE Analytical Science
• Shimadzu Scientific Instruments
• Shodex
• Sigma-Aldrich
• Thermo Fisher Scientific
• Tosoh Corporation
• Varian, Inc.
• Waters Corporation
• W. R. Grace and Company (Vydac)