LABORATORIO BIOLOGÍA I

Práctica 8
PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
(Elaborado por H. Romero-Saltos y M. Navarrete)

1. INTRODUCCIÓN
Un pigmento es una substancia que absorbe y refleja la luz de una manera
característica. La luz es energía, y cuando es absorbida por un pigmento, la energía
cambia de forma. En muchos casos, la energía se pierde a través del movimiento
molecular al azar (entropía), como cuando el chasis de un carro negro absorbe la energía
de la luz solar y se calienta.
En la fotosíntesis, la luz absorbida por los pigmentos vegetales no se pierde. Por
lo contrario, se convierte en energía eléctrica a través de cadenas de transferencia de
electrones (las reacciones de la fotosíntesis dependientes de la luz) y luego en energía
química contenida en los enlaces covalentes a través de una serie de reacciones químicas
(las reacciones de la fotosíntesis independientes de la luz). Sin las plantas y sus pigmentos
que capturan la luz, la vida en la Tierra como la conocemos no existiría.
1.1. Clorofilas, carotenoides, xantófilos y cromatografía de papel.
Las clorofilas, carotenoides y xantófilos tienen diferentes estructuras moleculares
y por tanto diferentes propiedades físicas y químicas. Cada pigmento tiene un cierto grado
de solubilidad a solventes polares (como el alcohol) y solventes no polares (como el
hexano). Debido a estas diferencias físicas, los pigmentos pueden ser separados mediante
un procedimiento conocido como cromatografía de papel.
La cromatografía de papel separa una mezcla de compuestos por adsorción según
las afinidades de estos compuestos a una fase estacionaria (papel, gel u otro material) y
según su solubilidad a una fase móvil (un solvente líquido como hexano).
En esta práctica, se observará cómo las diferentes afinidades y solubilidades de
los diferentes pigmentos fotosintéticos causan que los pigmentos migren a diferentes
velocidades sobre el papel cromatográfico. Estas tasas de migración dependen
principalmente del grado de adsorción al tipo de papel de las moléculas que migran, y de
la composición del solvente que fluye por el papel. El producto final es un cromatograma:
un papel que muestra los componentes separados, e identificables, de una mezcla que era
inicialmente homogénea.

1.2 Separación de pigmentos por solubilidad diferencial

Las clorofilas, los carotenoides y los xantófilos tienen diferentes solubilidades en
diferentes solventes, dependiendo de su polaridad. Las clorofilas tienden a ser más polares
que los carotenoides. En este ejercicio, aprovecharemos los diferentes grados de
solubilidad de los pigmentos, tanto en etanol como en hexano, para separar clorofilas de
carotenoides.

1.3 Espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos

El rango de longitudes de onda que pueden ser absorbidas por un pigmento se
conoce como su espectro de absorción (Figura 1). El rango de longitudes de onda que
hacen posible una reacción fotoquímica específica (como la fotosíntesis) se conoce como
el espectro de acción de la reacción (Figura 2). Si el espectro de acción de una reacción
química dada coincide con el espectro de absorción de algún pigmento(s) presente en el
sitio de la reacción, puede hipotetizarse que dicho pigmento(s) está(n) involucrados en la
reacción.

Figura 1. Espectros de absorción de la clorofila a, la clorofila b y los carotenoides

(tomado del libro “Principles of Biology” 2015).

Figura 2. Espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos comparado con el

espectro de acción de la fotosíntesis (tomado del libro “Principles of Biology” 2015).

1.4 Fluorescencia: captura y emisión de energía lumínica

Cuando una molécula de clorofila absorbe un fotón, uno de sus electrones
orbitantes es disparado (excitado) a un nivel de energía superior. En una membrana
tilacoide viva del cloroplasto, este electrón sería aceptado por una proteína que cumple el
rol de aceptor primario de electrones y enviado a la cadena de fotofosforilación cíclica
o no cíclica, hasta depositar la energía del fotón en la maquinaria celular que empaca
dicha energía en las moléculas de ATP o NADPH.
Las moléculas de clorofila que hemos extraído están suspendidas en una solución
de solvente que NO tiene aceptores primarios de electrones (los pigmentos no están en
las membranas celulares, pues ¡las destruimos!). Sin embargo, los electrones de los
pigmentos pueden ser todavía excitados a un nivel de energía superior cuando absorben
un fotón, aunque no haya un aceptor primario de electrones que los lleven en su viaje
fotosintético (al ciclo de fotofosforilación). Por tanto, en la ausencia de un aceptor
primario de electrones, el electrón excitado cae desde su orbital de alta energía (inestable)
de vuelta a su orbital original (estable). ¿Qué pasa con la energía que fue originalmente
absorbida? Recordemos por la Primera Ley de Termodinámica que la energía no puede
ser creada ni destruida, solo transformada.
Cuando el fotón fue absorbido inicialmente, su energía fue momentáneamente
cambiada de energía lumínica a energía eléctrica (el electrón excitado). Cuando el
electrón excitado regresó a su orbital original estable, transforma nuevamente la energía
extra a energía lumínica. Es decir, ¡otra vez la energía se transforma en un fotón! Debido
a que las transformaciones de energía de este tipo nunca pueden ser 100% eficientes, el
fotón que se emite al volver el electrón de su orbital excitado al orbital original tiene una
energía menor que el fotón que originalmente se absorbió, porque algo de su energía
original ya se perdió en forma de entropía (calor). Por tanto, la energía lumínica que se
observa en el espectro visible es una energía de amplia longitud de onda, es decir, ¿de
qué color? Este fenómeno se conoce como fluorescencia

2. OBJETIVOS

 Aprender las técnicas de extracción de pigmentos fotosintéticos y su separación

por cromatografía de papel y solubilidad diferencial.
 Examinar el espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos.
 Evidenciar el fenómeno de fluorescencia en los pigmentos fotosintéticos.

3. MATERIALES

 Etanol al 85%  Papel filtro (tiras de papel)

 Hexano  Papel absorbente (toallas de
 Acetona manos)
 1 Pinza  1 Frasco de vidrio con tapa
 1 Gradilla (cámara cromatográfica)
 1 Tubo capilar  2 Vasos de precipitación de
 1 Pipeta Pasteur tamaño mediano (~500ml )
 1 Lámpara de 100  1 Vaso de precipitación de
 3 Tubos de ensayo tamaño pequeño (~100ml)
 1 Placa calefactora  Hojas de plantas verdes y oscuras
4. PROCEDIMIENTOS
4.1 Extracción de pigmentos (clorofilas y carotenoides) de las hojas de una planta
1. En una placa calefactora, hierva agua en un vaso de precipitación (mediano). Si
el agua tarde en hervir, disminuya su cantidad.
2. En otra placa calefactora, caliente 40 ml de etanol al 85% en un vaso de
precipitación (pequeño). No permita que el alcohol hierva.
3. Seleccione algunas hojas sin pecíolos, rómpalas en pedazos (no tan pequeños) y,
con la ayuda de una pinza, remójelas en el agua hirviendo por 15–30 segundos.
Este proceso rompe las membranas de las células, facilitando la extracción de
pigmentos.
4. Seque con papel absorbente el exceso de humedad de las hojas y colóquelas en el
etanol caliente por 5 minutos mientras las agita. El etanol debe adquirir un color
verde oscuro intenso. ¡Los pigmentos fotosintéticos de la hoja han sido extraídos!
5. Retire el vaso de precipitación con la solución de pigmentos extraídos de la placa
calefactora.
6. Vierta parte de la solución de pigmentos extraídos en etanol en un tubo de ensayo
hasta llenarlo hasta la mitad. Tenga cuidado de no verter restos de hojas u otros
residuos.

4.2 Separación de clorofilas, carotenoides y xantófilos por cromatografía de papel

Para esta práctica utilizaremos papel cromatográfico tipo Whatman y hexano +
acetona como solventes no polares. El solvente será preparado previamente y contenido
en una “cámara cromatográfica” sellada herméticamente (frasco de vidrio con tapa). Para
realizar la cromatografía siga los siguientes pasos:
1. Coloque la tira de papel cromatográfico horizontalmente sobre una superficie
limpia. No ensucie el papel cromatográfico; manéjelo sólo por los filos.
2. Con un tubo capilar, tome pequeñas cantidades de la extracción de pigmentos en
etanol y realice una línea delgada en la base del papel, a una distancia desde el
filo del papel que sea superior al nivel del solvente en la cámara cromatográfica
(¿2–4 cm?). Practique primero la técnica sobre un pedazo de papel absorbente.
3. Espere unos minutos hasta que el alcohol de la línea se evapore, y luego repita
este procedimiento varias veces hasta obtener una línea delgada verde oscura.
4. Coloque el frasco de cromatografía en su mesa y NO LO MUEVA. Abra el frasco
y cuidadosamente ubique el papel cromatográfico verticalmente dentro del frasco,
asegurándose que la línea del pigmento quede SOBRE el nivel del solvente, NO
inmerso en él. De ser necesario, doble el filo superior del papel para que quede
sostenido por el filo del frasco.
5. Tape el frasco y observe cómo los pigmentos suben por el papel cromatográfico.
NO MUEVA EL FRASCO. Espere unos minutos y ¡retire el papel ANTES que
el primer pigmento llegue al filo superior del papel! Déjelo secar.
Los carotenoides usualmente viajan con el frente del solvente y deberían formar
una banda amarillenta en la parte superior del cromatograma. Más abajo, los xantófilos
deberían formar una banda amarillenta-anaranjada. La clorofila a debería aparecer luego
formando una banda verde obscura. Finalmente la clorofila b debería formar una banda
verde claro en la parte inferior del cromatograma.
4.3 Separación de pigmentos por solubilidad diferencial
En este ejercicio, aprovecharemos los diferentes grados de solubilidad de los
pigmentos, tanto en etanol como en hexano, para separar clorofilas de carotenoides.
Trabajaremos con el extracto en el tubo de ensayo lleno hasta la mitad (procedimiento
4.1), a continuación:
1. Agregue hexano al tubo de ensayo lleno hasta la mitad con los pigmentos
extraídos en etanol. Llene el tubo casi completamente.
2. Cubra el tubo de ensayo con su dedo pulgar y mezcle bien. Luego, levante su dedo
LENTAMENTE para liberar la presión acumulada por los vapores.
3. Deje reposar el tubo de ensayo por cinco minutos o hasta que se observen dos
capas COMPLETAMENTE separadas (la de etanol y la de hexano).

4.4 Espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos

Realizaremos un análisis CUALITATIVO del espectro de absorción de los
pigmentos separados por diferencia en solubilidad, con los solventes etanol y hexano.
Para esto, utilizaremos un instrumento conocido como espectroscopio, considerando las
siguientes instrucciones:
1. En el tubo de ensayo con las fases de hexano y etanol separadas, absorba unos
10–20 ml de la capa superior con la ayuda de una pipeta Pasteur y deposite la
solución en un nuevo tubo de ensayo. Luego haga mismo con la otra fase,
depositándola en otro tubo de ensayo. Tenga cuidado en no mezclar las fases.
DESECHE la porción media “natosa” que separa una fase de la otra.
2. Añada el solvente correspondiente (etanol o hexano, según corresponda) a cada
uno de los tubos de ensayo para diluir la solución.
3. Examine con el espectroscopio la solución contenida en cada uno de los tubos.
Primero observe la luz natural (el arco iris) y luego cubra la apertura del
espectroscopio con el tubo de ensayo que contiene el extracto de pigmentos. ¿Qué
colores desaparecen del espectro? Haga esto para el tubo con la solución de
clorofilas y para el tubo con la solución de carotenoides.

4.5 Fluorescencia: captura y emisión de energía lumínica

Para observar la fluorescencia, acerque el tubo de ensayo con la solución de
clorofilas a una lámpara de 100 W, preferiblemente ubicando la solución en frente de un
fondo negro. Ante tan fuerte irradiación, la solución debería cambiar de un color _____ a
un color _______. ¿No es esto algo increíble? (la intensidad del color ______ va a
depender de la concentración de clorofila en la solución).

5. BIBLIOGRAFÍA
 Nature Publishing Group. 2015. Principles of Biology (live on-line
textbook). http://www.nature.com/principles
6. ANEXO
ACTIVIDAD GRUPAL

Fecha: Paralelo:
Nombres:
1.
2.
3.
4.
5.

Desarrolle:
1.- Respecto a la separación de clorofilas, carotenoides y xantófilos por cromatografía
de papel:
a. Funcionan todos estos pigmentos en los fotosistemas I y II?
b. Cuál es la función de cada pigmento?
c. Qué pigmentos estuvieron presente en su cromatograma?
d. Cuál es el valor Rf para cada pigmento?
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑞𝑢𝑒 𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑣𝑖ó 𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑔𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙í𝑛𝑒𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒
𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑞𝑢𝑒 𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑣𝑖ó 𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙í𝑛𝑒𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑒
e. Por qué los valores Rf son diferentes para cada tipo de pigmento?

2.- Separación de pigmentos por solubilidad diferencial. Considerando la polaridad

de los carotenoides respecto a las clorofilas, el hecho que las clorofilas se “ven” más
verdes que los carotenoides, y la diferente densidad de los solventes utilizados:
a. Cuál es la capa de hexano y qué pigmentos están disueltos en ella?
b. Cuál es la capa de etanol y qué pigmentos están disueltos en ella?
c. Qué importancia puede tener las diferentes polaridades de los pigmentos
para el proceso de la fotosíntesis?

3.- Espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos:

a. Qué implica el sobrelapamiento (o falta de sobrelapamiento) entre el espectro
de absorción de los diferentes pigmentos y el espectro de acción?
b. Por qué sería una ventaja tener varios tipos de pigmentos en vez de sólo uno?
c. Cuál es la relación entre la luz absorbida y la energía disponible para la
fotosíntesis? ¿cuál tipo de pigmentos será más eficiente para llevar a cabo las
reacciones de luz de la fotosíntesis? recuerde que a menor longitud de onda,
la energía contenida en los fotones de luz (o de cualquier radiación
electromagnética) es mayor.

4.- Fluorescencia: captura y emisión de energía lumínica

a. Cuál es el significado de la fluorescencia?
b. Podría ocurrir fluorescencia en plantas vivas? ¿por qué sí o por qué no?