CÓDIGO: FO-GAA-XXX

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS VERSIÓN:

PAGINA:
01
PROCESO GESTION DE APOYO A LA ACADEMIA FECHA: 02/09/2016
FORMATO GUÍA DE LABORATORIO VIGENCIA: 2016

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

UNIDAD
PROGRAMA DE ENFERMERIA
ACADEMICA:
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA
UNIDAD
TINCIONES SIMPLES Y COMPUESTAS
TEMATICA:
PRACTICA Nº : 3

OBJETIVOS O PROPOSITOS
OBJETIVOS:
1. Adquirir capacidad por parte del estudiante en el uso y aplicación de las tinciones
simples, tinción de Gram, Ziehl Neelsen, y tinciones para estructuras facultativas.
2. Conocer el fundamento de las tinciones y su importancia clínica.
3. Aprender a realizar frotis de cultivo y muestras biológicas.
4. Describir el procedimiento de uso de un microscopio, partes e instrucciones.

PREINFORME
1. Que es un colorante, como actúa un colorante básico, y uno ácido para la tinción de
bacterias.
2. Investigue el fundamento de la coloración de Gram, Ziehl Neelsen, Tinta china,
Shaeffer Foulton y tinción simple.
3. Cuál es el procedimiento para la toma de muestra de exudado Faríngeo
4. Cuál es la importancia patológica y epidemiológica de las micobacterias?
5. Cuáles son las propiedades de las esporas? Cuales sus funciones?
6. Como está constituida químicamente una espora?
7. Que funciones tiene la capsula bacteriana?
8. Describa lar partes de un microscopio, la forma correcta de uso, y recomendaciones
después de usar.

INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son seres pequeños y su protoplasma posee un índice de refracción
cercano al del agua, por lo que requiere visualización con tinciones biológicas, las
tinciones se preparan en soluciones acuosas y organizas de colorantes que confieren gran
variedad de colores a los microrganismos. Los colorantes sufren combinación química con
el protoplasma de la bacteria; si la célula no está muerta, el proceso de tinción la destruye
por tanto, tal proceso es drástico y puede producir artefactos.
FUNDAMENTO TEORICO
Los colorantes utilizados a menudo son sales. Los colorantes básicos consisten en
cationes teñidos con un anión incoloro (p.ej., cloruro – de azul de metileno+); ocurre lo
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contrario con los colorantes ácidos (p.ej., eosinato– de sodio+). Las células bacterianas
son ricas en ácidos nucleicos y portan cargas negativas en los grupos fosfatos. Esta se
combina con las cargas positivas de los colorantes básicos. Los colorantes acido no tiñen
a las células bacterianas y por tanto pueden utilizarse para teñir el material del fondo a fin
de proporcionar un contraste de color.

Las tinciones simples, se aplican para incrementar el contraste de las células a observar
bajo el microscopio, por medio de un único colorante que, tiñe con la misma tonalidad toda
la célula; de esta forma, se hace visible la morfología y el arreglo de crecimiento de las
mismas. Es aconsejable, utilizar colorante básicos que contengan un cromógeno
(compuesto que da el color), con carga positiva, dado que en la pared celular de las
bacterias existen compuestos con cargas negativas que, atraen y ligan el cromógeno.

Las tinciones compuestas, son aquellas en las cuales se utiliza más de un colorante y
tienen por objetivo, la observación de estructuras específicas de las bacterias. Este tipo de
tinciones, se caracterizan por presentar un colorante principal o primario (básico que tiñe
células cargadas negativamente), un agente mordiente (sales metálicas, solución Yodada
o Lugol, ácido tánico o fenol que, potencia el desarrollo de color), un agente decolorante
(disolventes orgánicos), y un contractor, colorante secundario o de contraste (de distinto
color al utilizado en el primer colorante).

Las micobacterias son bacterias aeróbicas de contornos cilíndricos, que no forman

esporas. No captan fácilmente los colorantes, pero una vez teñidas resisten la
decoloración por acido o alcohol y por esta razón se les llama acido alcohol resistentes.

La baciloscopia - Bk es el método diagnóstico más importante para la tuberculosis –TB,

sobre todo epidemiológicamente, porque el enfermo con baciloscopia de esputo positiva
es la fuente de infección más importante para la comunidad. La Bk es la búsqueda
microscópica de bacilos acido alcohol resistentes a partir de cualquier espécimen clínico
coloreado a través de la tinción de Ziehl- Neelsen.

Tinción de esporas de Schaeffer-Fulton. En este tipo de tinción se utiliza como colorante

primario, el verde de malaquita y uno de contraste (Safranina o Fucsina). Esta técnica
diferencia las endosporas de la célula vegetativa. De acuerdo con ella, se aplica el
colorante primario en solución acuosa y se le hace vaporizar para incrementar la
penetración de los recubrimientos de las endosporas. Las endosporas sometidas
correctamente al método, resistirán la sustitución por el colorante de contraste y a menudo
se podrán observar endosporas verdes dentro de células rojas; de esta forma, se puede
determinar la ubicación intracelular de la misma (terminal, Subterminal o central), para
usarse con fines taxonómicos.
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Tinción negativa. En esta tinción se puede identificar la estructura externa que envuelve a
algunas bacterias como Klebsiella spp., Streptococcus pneumoniae y Clostridium
perfringens. Utiliza como colorante primario tinta china o Nigrosina. La técnica de tinción
negativa incorpora materiales como la tinta china, que se compone de partículas
demasiado grandes para penetrar en la célula; después de haber utilizado el colorante
primario se adiciona el de contraste que, penetra fácilmente a la célula bacteriana. Al
examinar la preparación la cápsula aparecerá como una zona transparente que rodea a la
pared celular (las células no se tiñen), sobre un fondo negro.

MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales y Equipos Cantidad Sustancias y Reactivos Cantidad
Provistas por el laboratorio:
asa curva
gradilla
Kit colorantes de Gram,
Palillos, hisopo, bajalenguas
Ziehl Neelsen, Tinta
Cepas de bacterias Gram (+)
China, Verde malaquita
y Gram (-)
Solución salina estéril
Cepa de Klebsiella sp Por grupo provisto por el
Por grupo de trabajo frasco lavador
Cepa Bacillus subtilis. laboratorio
hipoclorito al 0,5%
Provistos por el estudiante:
Alcohol al 70%
laminas
Solución salina
laminillas
Agua destilada
Papel absorbente
mechera

METODOLOGIA
Durante la práctica el docente, dará instrucciones para que los alumnos tomen
correctamente muestra de faringe y realicen los extendidos de las cepas o cultivos.

Es importante utilizar láminas limpias y en perfecto estado, libre de rayones y de manchas.

Limpie las láminas con agua y jabón, papel y, posteriormente desengrase con alcohol, dejándolo
evaporar; este paso es esencial ya que, la grasa o aceite de los dedos no permiten una buena
elaboración de frotis e interfieren en la tinción. O ser previamente pasadas por la llama del
mechero para eliminar trazas de grasa y no se deben tocar con las yemas de los dedos.
Las láminas se deben identificar de manera con un lápiz de cera o con marcador de tinta
indeleble para evitar confusiones.

 Realizar un frotis directo: El frotis debe ser delgado, translúcido y homogéneo

para que, durante el proceso de tinción, reciba en toda su superficie el mismo tratamiento
con las diferentes sustancias químicas y se debe usar para la preparación la técnica
aséptica.
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Zona de
Identificación
Zona de frotis o
extendido

Si la muestra procede de un cultivo en caldo, tome una o dos alícuotas de las células con
la ayuda de un asa bacteriológica y colóquelas directamente sobre la lámina, extiéndalas
de forma circular y luego extienda longitudinalmente en la placa. Si la muestra procede de
un cultivo sólido, coloque una gota de solución salina fisiológica estéril (nacl 0,85%) sobre
el portaobjetos y extienda con la ayuda del asa bacteriológica estéril, la muestra de las
bacterias.

Las muestras clínicas no deben ser diluidas con agua o con algún otro diluente para la
preparación del frotis y si la muestra contiene mucho material se reduce la cantidad de
muestra o se aumenta la zona del frotis. La preparación se debe secar al aire antes de
fijarla a la llama y al fijarla se debe tener cuidado de no calentar demasiado porque se
alteran las características tintoriales del material contenido en la muestra, igualmente se
debe permitir que la lámina se enfríe antes de hacer la tinción.

En la técnica de tinta china el extendido varia, coloque una pequeña gota de tinta china en
uno de los extremos de una lámina, mezcle con una asada del cultivo a examinar. Coloque
otra lamina (lámina extensora) sobre la gota en ángulo de 45º y extienda (como si fuera un
extendido de sangre periférica); no dejar grueso el extendido. Pase el borde de la lámina
extensora por el mechero para desinfectar.

Acciones con todos los extendidos o frotis de muestra o cultivo:

 Dejarlo secar a temperatura ambiente.
 Fijar al calor, flameando 2 o 3 veces controlando la temperatura.
 Colocar la lámina sobre el soporte y realizar técnica de coloración pertinente.

Técnica de tinción de Gram:

 Cubra el frotis con cristal violeta y deje actuar por un minuto.
 Lavar con agua de chorro y escurrir.
 Agregue el lugol de Gram y deje actuar por un minuto.
 Lavar con agua de chorro y escurrir.
 Agregue alcohol etílico o alcohol cetona, deje actuar por un minuto o hasta de
coloración total.
 Lavar con agua de chorro y escurrir; examine el frotis, si quedan zonas violeta,
aplique nuevamente alcohol etílico o alcohol cetona por 30 segundos.
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 Lavar con agua de chorro y escurrir.

 Cubra el frotis con fucsina de Gram o safranina 30 segundos.
 Lavar con agua de chorro y escurrir.
 Limpiar el exceso de colorante por debajo de la lámina.
 Dejar secar a temperatura ambiente.
 Observe en el microscopio la lámina, dibuje lo que observó y realice el estudio
microscópico.

Técnica de tinción de Ziehl- Neelsen:

 Cubra el extendido con fucsina fenicada y calentar durante 10 minutos, sin dejar
secar; retirar calor cuando haya emisión de vapores.
 Lavar con agua de chorro y escurrir.
 Agregue el alcohol ácido y deje actuar por tres minutos, repetir si aún se ve colorante
de fucsina.
 Lavar con agua de chorro y escurrir.
 Agregue Azul de metileno, deje actuar por un minuto.
 Lavar con agua de chorro y escurrir.
 Limpiar el exceso de colorante por debajo de la lámina.
 Dejar secar a temperatura ambiente.
 Observe en el microscopio la lámina, dibuje lo que observó y realice el estudio
microscópico.

Espora – técnica de Shaeffer Foulton

 Realice un frotis a partir de la cepa suministrada

 Cubra el frotis con verde de malaquita y pase el hisopo hasta emisión de vapores
por 5 minutos. Deje enfriar la lámina.
 Lavar con agua de chorro y escurrir.
 Cubra la preparación con fucsina de Gram por un minuto.
 Lavar con agua de chorro y escurrir
 Limpiar el exceso de colorante por debajo de la lámina.
 Dejar secar a temperatura ambiente.
 Observe en el microscopio la lámina, dibuje lo que observo anotando el color que
toma la espora y la bacteria.
Capsula- técnica de tinta china

 Cubra la preparación con fucsina de Gram por un minuto.

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 Lavar con agua de chorro y escurrir.

 Observe en el microscopio la lámina, dibuje lo que observo.

INFORME FINAL
Preguntas guía para el informe:
POST-LABORATORIO:
 Dibuje lo realizado y visto en la practica

 Dibuje y clasifique las bacterias según su morfología, y agrupación, de ejemplos de

cada una de ellas.

 Clínicamente porque es útil la técnica de coloración de Gram?

 Usted como profesional de la salud a quienes recomendaría realizarse la

baciloscopia.
 Diseñe una estrategia de prevención de la TB en el caso de que se presente un
paciente en su comunidad.
 Que manejo se le daría a un niño, para investigar TB pulmonar

BIBLIOGRAFIA

 Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologia medica. Ed. Mc Graw Hill. 25 ed. 2010.
 Llop, Alina., Valdés- Dapena Maria y Suazo Jorge. Microbiología y parasitología
medica. Tomo I, II y III. La Habana. Ed. Ciencias medicas. 2001.
 Lennette, Balows y otros. Manual de microbiología Clínica. Ed. Médica
panamericana.
 www.bact.wisc.eduu/Bact330/Bact330homepage
 www.altillo.com/medicina/microbiologia/bacterias.asp
 www.estafilococo.com.parasito.
www.microbiol,org/vlmicro/index.html