Tinci�n de Gram

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Bacterias Escherichia coli (gram negativas) vistas al microscopio tras ser te�idas
con la tinci�n de Gram.

Bacterias Clostridium perfringens (grampositivas).

Bacterias grampositivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una

enfermedad llamada carbunco, encontrados en una muestra de l�quido cerebroespinal.
Si hubiera una especie de bacteria gram negativa, aparecer�a de color rosa. El
resto son los leucocitos que atacan la infecci�n.

Una tinci�n de Gram en la que se observa un mezclado de Staphylococcus aureus (coco

gram positivo) y Escherichia coli (bacilo gramnegativo).
La tinci�n de Gram o coloraci�n de Gram es un tipo de tinci�n diferencial empleado
en bacteriolog�a para la visualizaci�n de bacterias, sobre todo en muestras
cl�nicas. Debe su nombre al bacteri�logo dan�s Christian Gram (1853-1938), que
desarroll� la t�cnica en 18841. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfolog�a celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximaci�n a
la diferenciaci�n bacteriana, consider�ndose bacterias grampositivas a las que se
visualizan de color morado, y bacterias gramnegativas a las que se visualizan de
color rosa, rojo o grosella.

�ndice
1 Procedimiento
1.1 Explicaci�n
2 Teor�as
3 Bacterias resistentes a la tinci�n de Gram
4 Utilidades
5 Fundamentos de diferenciaci�n de gram positivo y gram negativo
6 Factores que alteran la tinci�n de Gram
7 Bibliograf�a
Procedimiento
Recoger muestras para ubicarlas en el microscopio.
Hacer el extendido con un palillo de madera.
Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces
aproximadamente).
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.
Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra
Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos seg�n la concentraci�n del
reactivo (parte cr�tica de la coloraci�n). (las gram - se decoloran, las gram + no)
Enjuagar con agua.
Tinci�n de contraste agregando safranina o fucsina b�sica y esperar un minuto. Este
tinte dejar� de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.
Lavar levemente con agua.
Para observar al microscopio �ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de
inmersi�n.

Explicaci�n
El cristal violeta (colorante cati�nico) penetra en todas las c�lulas bacterianas
(tanto gram positivas como gram negativas) a trav�s de la pared bacteriana. El
lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de
potasio) y Sl (Siulterio), los cuales est�n presente para solubilizar el yodo, y
act�an de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a
la pared de la c�lula bacteriana. El I2 entra en las c�lulas y forma un complejo
insoluble en soluci�n acuosa con el cristal violeta..

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloraci�n, ya

que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram
positivos no se decoloran, mientras que los gram negativos s� lo hacen.

Para poner de manifiesto las c�lulas gram negativas se utiliza una coloraci�n de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina. Despu�s de la coloraci�n de contraste las c�lulas gram negativas son
rojas, mientras que las gram positivas permanecen violetas.

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la t�cnica. Sirve para hacer

una tinci�n de contraste que pone de manifiesto las bacterias gram negativas. Al
t�rmino del protocolo, las gram positivas se ver�n azul-viol�ceas y las gram
negativas, se ver�n rosas (si no se hizo la tinci�n de contraste) o rojas (si se
us�, por ejemplo, safranina).

Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, a�n despu�s de tratarlos con

un decolorante, y el color no se modifica al a�adir �ste; otros pierden con
facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se
califican de gram positivos, y los que pierden la primera coloraci�n y retienen la
segunda, de gram negativos. Bas�ndonos pues, en la reacci�n gram, podemos
clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-
rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloraci�n gram. Los
representantes m�s usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o
de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto
tetrametil-p-rosanilina.

El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el n�mero de grupos

metilo en la mol�cula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono m�s oscuro es
la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte m�s ligero, la tetrametil-
p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B,
3B, etc., se refieren al n�mero de grupos metilo contenidos. La letra R indica
matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis
grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para te�ir por el
m�todo de Gram.

La facultad de las c�lulas para tomar la coloraci�n gram no es propia de toda

sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As�
vemos que las c�lulas de plantas y animales superiores no conservan la primera
coloraci�n; los mohos se ti�en con cierta irregularidad; los gr�nulos de micelios
propenden retener el colorante. La reacci�n de Gram no es infalible ni constante;
puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz� por otras causas.

Teor�as
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo
microorganismo, si sufre da�o de la pared por una u otra causa, se vuelve gram
negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retenci�n o el escape del
colorante. Una posible teor�a del mecanismo de tinci�n es la siguiente:

El colorante b�sico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca
insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las
paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una
barrera que la laca no puede atravesar. En las c�lulas gram negativas, los l�pidos
de la pared (m�s abundantes que en las c�lulas gram positivas) se disuelven por
este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con
yodo. Algunos autores objetan esta teor�a, pero es indudable la importancia general
de la pared celular.
Varias son las teor�as emitidas para explicar el mecanismo de la tinci�n de Gram.
Stearn (1923) bas� la suya en una combinaci�n qu�mica entre el colorante y las
prote�nas de las bacterias, las prote�nas y amino�cidos son cuerpos anf�teros, esto
es, tienen la facultad de reaccionar con �cidos y con bases, gracias a sus grupos
amino y carboxilo; en soluciones �cidas, reaccionan con los �cidos, y en soluciones
alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reacci�n de
tinci�n de las bacterias obedece en gran parte a su contenido prote�nico; estos
microorganismos se conducen como cuerpos anf�teros, al combinarse con colorantes
�cidos en soluciones �cidas y con los b�sicos en medio alcalino. La combinaci�n con
ambos tipos de colorante no se produce en el �punto isoel�ctrico�. Como los
microorganismos contienen m�s de una prote�na, ese punto no tiene un valor preciso
y definido, sino que constituye m�s bien una gama o escala que comprende dos o tres
unidades de pH. Seg�n Stern y Stearn, los microorganismos gram positivos tienen una
escala isoel�ctrica de pH inferior a la de los microorganismos gram negativos; y, a
base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:

Los microorganismos gram positivos pueden hacerse gram negativos al aumentar la

acidez.
Los microorganismos gram negativos pueden hacerse gram positivos al aumentar la
alcalinidad.
Los microorganismos de reacci�n positiva a los colorantes �cidos pueden hacerse
gram negativos por aumentar la alcalinidad.
Los microorganismos de reacci�n positiva a los colorantes b�sicos pueden hacerse
gram negativos por aumentar la acidez.
En la zona isoel�ctrica caracter�stica de cada especie es muy escasa la tendencia a
retener cualquier colorante.
Parece estar bien demostrado que las prote�nas de las bacterias no son simples,
sino m�s bien una d�bil combinaci�n de sustancias prote�nicas con otras lipoideas o
grasas.
La materia grasa extra�da de los microorganismos gram positivos difiere de la
obtenida de los microorganismos gram negativos, en que la primera contiene una
proporci�n mucho mayor de �cidos no saturados que muestren gran afinidad por los
agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloraci�n
gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada
un car�cter m�s �cido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los
colorantes b�sicos.
El cambio de respuesta a la coloraci�n de Gram con el tiempo es propio, sobre todo,
de los microorganismos d�bilmente gram positivos cultivados en los medios que
contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacci�n se vuelve �cida en el
curso del desarrollo.
Gianni (1952) comprob� que las bacterias gram positivas Bacillus subtilis y
Bacillus anthracis originaban una reacci�n negativa cuando los cultivos databan de
dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia gram positiva debajo de la
pared celular y se invert�a la reacci�n. Otra explicaci�n de la reacci�n de Gram
puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un n�cleo gram
negativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reacci�n gram positiva
depende de que se forme una combinaci�n compleja entre los componentes de la
coloraci�n de Gram y las prote�nas de la pared celular, ser�a de esperar que las
bacterias desintegradas por medios f�sicos retuviesen este tinte, ya que ese
tratamiento no podr�a cambiar el car�cter qu�mico de los materiales de dicha pared.
Por el contrario, los g�rmenes gram positivos desintegrados pierden su capacidad de
retener el colorante primario y no se ti�en

La pared celular de los microorganismos gram positivos y gram negativos es

permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo
de yodo y colorante formado en el interior de la c�lula. Los resultados
experimentales obtenidos con una difusi�n celular exenta de prote�nas, y la escasa
solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen
sustentar la opini�n de que la reacci�n gram positiva consiste esencialmente en la
formaci�n, dentro de la c�lula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y
colorante dif�cil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los
microorganismos gram positivos, a diferencia de la de los gram negativos, ser�a
pr�cticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecer�n
te�idos despu�s de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en
la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminar� sin dificultad
el complejo formado despu�s del tratamiento con yodo.

Ni los grupos sulfhidrilo ni las prote�nas b�sicas han influido espec�ficamente en

el mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la
permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del
complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente
al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el
mecanismo de esa coloraci�n.

Bacterias resistentes a la tinci�n de Gram

Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva se ti�en como gram negativas:

Mycobacterias (est�n encapsuladas).

Mycoplasmas (no tienen pared).
Formas L (p�rdida ocasional de la pared).
Protoplastos y esferoplastos (eliminaci�n total y parcial de la pared,
respectivamente).
Utilidades
En el an�lisis de muestras cl�nicas suele ser un estudio fundamental por cumplir
varias funciones:

Identificaci�n preliminar de la bacteria causal de una infecci�n.

Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos
bacterianos identificados en la tinci�n de Gram se deben de corresponder con
aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor n�mero de
formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos
empleados as� como la atm�sfera de incubaci�n.
A partir de la tinci�n de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los
cocos son de forma esf�rica. Pueden aparecer aislados despu�s de la divisi�n
celular (micrococos), aparecer por pares (diplococos), formar cadenas
(estreptococos), o agruparse de manera irregular (estafilococos).

Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena
(estreptobacilos) o en empalizada.

Tambi�n pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos (si son
de forma r�gida) o espiroquetas (si son blandas y onduladas). Si por el contrario,
poseen forma de �coma� (o curvados) entonces se los designa vibrios.

Fundamentos de diferenciaci�n de gram positivo y gram negativo

Los fundamentos de la t�cnica se basan en las diferencias entre las paredes
celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas

La pared celular de las bacterias gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano, adem�s de dos clases de �cidos teicoicos: anclado en la cara
interna de la pared celular y unido a la membrana plasm�tica, se encuentra el �cido
lipoteicoico, y m�s en la superficie, el �cido teicoico que est� anclado solamente
en el peptidoglicano (tambi�n conocido como mure�na).

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las bacterias gram negativas es

delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasm�tica exterior (de
composici�n distinta a la interna) por medio de lipoprote�nas. Tiene una capa
delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprote�nas. La
membrana exterior est� hecha de prote�na, fosfol�pido y lipopolisac�rido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se ti�en diferencialmente debido a estas

diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el
material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las gram
positivas lo poseen en mucha mayor proporci�n que las gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloraci�n se debe a que la

membrana externa de las bacterias gram negativas es soluble en solventes org�nicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee
es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo
que se form� previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdi�ndose la
coloraci�n azul-viol�cea. Por el contrario, las bacterias gram positivas, al poseer
una pared celular m�s resistente y con mayor proporci�n de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la acci�n del solvente org�nico, sino que este act�a deshidratando
los poros, cerr�ndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloraci�n azul-violeta.

Factores que alteran la tinci�n de Gram

Edad de la bacteria.
Errores del operador.
Uso de antibi�ticos
A pesar de la gran utilidad de la tinci�n de Gram, este m�todo debe ser valorado
con precauci�n, ya que la reacci�n puede variar seg�n la edad de las c�lulas
(cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos
y te�irse como gram negativos) y la t�cnica empleada (al decolorar por un tiempo
muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se ti�an como
gram negativas). Por esta situaci�n, junto a la muestra deben te�irse controles con
bacterias gram positivas (por ejemplo Staphylococcus aureus) y gram negativas (por
ejemplo, Escherichia coli).