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Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del IPN. Km 8.5 carr. Yautepec-Jojutla, Colonia
San Isidro, Apartado Postal 24, 62731. Yautepec, Morelos, México. (eagama@ipn.mx).
Resumen Abstract
Las tortillas de maíz azul difieren en sabor y textura de las de Blue maize tortillas differ in taste and texture from white
maíz blanco. Estas diferencias podrían atribuirse a la dureza maize. These differences may be due to grain hardness or
del grano o a la estructura del almidón, la cual está influen- the starch structure, which is influenced by its mechanisms
ciada por los mecanismos de su biosíntesis y repercute en la of biosynthesis and affects the structure of its two main
estructura de sus dos componentes principales. El objetivo components. The aim of this study was to analyze the blue
del presente estudio fue analizar el almidón de maíz azul y and white maize starch in two development stages of the
blanco en dos etapas de desarrollo del grano, para asociar sus grain, to associate its morphological and physicochemical
características morfológicas y fisicoquímicas con la estructu- characteristics with the structure, and the latter with the
ra, y esta última con las enzimas que participan en su biosín- enzymes involved in its biosynthesis. We harvested maize
tesis. El maíz se cosechó a los 20 y 50 d después de la poli- 20 and 50 d after pollination (DAP); and quantified
nización (ddp) y el almidón se cuantificó, y se aisló para ser starch content in the kernel, isolated and characterized
caracterizado. Se extrajeron y separaron por peso molecular it. We extracted and separated the starch biosynthesis
las enzimas de biosíntesis del almidón. El análisis de varianza enzymes according to their molecular weight, and used
fue de una vía con un nivel de significancia de p0.05. El a one-way analysis of variance at a significance level of
maíz azul presentó mayor contenido de almidón. En el es- p0.05. Blue maize had higher starch content. In the
tudio electroforético, los dos maíces presentaron bandas con electrophoretic analysis, the two maize varieties had
peso molecular reportado para ADP glucosa pirofosforilasa, bands of molecular weight reported for ADP glucose
almidón sintasa unida al gránulo y tres isoformas de almidón pyrophosphorylase granule bound synthase starch and
sintasa soluble. Además, se encontraron dos isoformas de la three isoforms of soluble synthase starch. Furthermore,
enzima ramificante del almidón en el maíz azul, que podrían we found two isoforms of the starch branching enzyme
alterar el patrón de ramificación de su amilopectina, produ- in blue maize, which could alter the pattern of branching
ciendo estructuras altamente ramificadas con cadenas cortas, of amylopectin, producing highly branched structures
por lo que la estructura del almidón a los 50 ddp presentó with shorter chains, so that the structure of starch at 50
menor espacio disponible dentro de la estructura granular DAP had less available space within the grain structure
para la síntesis de amilosa, así como cristales pequeños y me- for the synthesis of amylose and small and less perfect
nos perfectos que se desorganizaron a menor temperatura y crystals, which were disorganized at lower temperature
entalpía que los del almidón de maíz blanco. La biosíntesis and enthalpy than those of the white maize starch. The
del almidón de maíz blanco y azul difirió, ya que las iso- white and blue maize starch biosynthesis differed as
formas de la enzimas ramificante en cada uno de los maíces isoforms of branching enzymes in each maize produced
produjeron estructuras diferentes, lo cual repercutió en sus different structures, which affected their physicochemical
propiedades fisicoquímicas. properties.
1
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S
tarch is the main constituent of maize (Zea
Introducción mays L.) and the physicochemical and
functional properties of this polysaccharide
E
l almidón es el principal constituyente del are closely related to its structure. Starch consists of
maíz (Zea mays L.) y las propiedades fisico- two glucose polymers: amylose and amylopectin.
químicas y funcionales de este polisacárido es- These molecules are arranged in concentric rings to
tán estrechamente relacionadas con su estructura. El produce the granular structure. The distribution of
almidón está formado por dos polímeros de glucosa: amylose within the concentric rings of the granules
amilosa y amilopectina. Estas moléculas se organizan differs between the center and periphery as it only
en anillos concéntricos para originar la estructura occupies the available space left by amylopectin after
granular. La distribución de la amilosa dentro de los being synthesized (Tetlow et al., 2004).
anillos concéntricos difiere entre el centro y la perife- Amylopectin biosynthesis involves the
ria del gránulo, ya que sólo ocupa los lugares disponi- participation of soluble synthase starch enzymes,
bles que deja la amilopectina después de sintetizarse which bind glucose molecules through links a 1-4,
(Tetlow et al., 2004). producing linear chains with different degree of
La biosíntesis de la amilopectina involucra la polymerization (DP). Starch branching enzymes
participación de las enzimas almidón sintasa solu- (SBE) bind chains of glucans through links a
bles (SSS, por sus siglas en inglés), que unen molé- 1-6, resulting in a branched molecule. Once
culas de glucosa mediante enlaces 1-4, producien- amylopectin is formed, the granule bound synthase
do cadenas lineales con diferente grado de polimeri- starch (GBSS) begins to bind glucose to synthesize
zación (GP). Las enzimas ramificantes del almidón only amylose chains (Baldwin, 2001). Each of
(SBE, por sus siglas en inglés), unen cadenas de glu- these enzymes has isoforms (GBSS I and II, SSS I,
canos mediante enlaces 1-6, originando una mo- II, III and IV; SBE I and II, which in turn may
lécula ramificada. Una vez formada la amilopectina, be type “a” or “b”). They differ in the mechanism
la almidón sintasa unida al gránulo (GBSS, por su of action during starch synthesis, generating
siglas en inglés, granule bound synthase starch) co- structures which differ in linear chains DP, in the
mienza a unir glucosas para sintetizar únicamente density and length of branches; these isoforms may
las cadenas de amilosa (Baldwin, 2001). Cada una be associated or not with the starch granule. For
de estas enzimas presenta isoformas (GBSS I y II; white maize starch (wild, mutant and GM) each of
SSS I, II, III y IV; SBE I y II, que a su vez pueden these enzymes and isoforms has a function in the
ser del tipo “a” o “b”), las cuales difieren en el me- synthesis of the structure at early stages of the grain
canismo de acción durante la síntesis del almidón, development, being related to the structure of the
generando estructuras que difieren en el GP de las starch at ripening (Smith, 2001; Tetlow et al., 2004;
cadenas lineales, en la densidad y en la longitud de Grimaud et al., 2008).
las ramificaciones; estas isoformas pueden o no, es- There are differences between the chemical,
tar asociadas al gránulo del almidón. Para almidón morphological, physicochemical and digestibility-
de maíz blanco (silvestre, mutantes y modificados related characteristics of blue and white maize starch
genéticamente) se conoce la función de cada una de (Hernández-Uribe et al., 2007; Agama-Acevedo
estas enzimas e isoformas en la síntesis de la estruc- et al., 2008; Utrilla-Coello et al., 2009). In this
tura en etapas tempranas del desarrollo del grano regard, Utrilla-Coello et al. (2009) separated the
y su relación con la estructura del almidón en su starch biosynthetic enzymes using two-dimensional
etapa de madurez (Smith, 2001; Tetlow et al., 2004; electrophoresis and analyzed them with MALDI-
Grimaud et al., 2008). TOF; samples showed seven spots at 60 kDa MW
Hay diferencias entre las características quími- with pI between 5 and 6 and were identified as
cas, morfológicas, fisicoquímicas y de digestibilidad GBSS1. The study was conducted on mature grains
del almidón de maíz azul y blanco (Hernández-Uri- (50 d after pollination, dap), when most enzymes
be et al., 2007; Agama-Acevedo et al., 2008; Utrilla- synthesizing starch have disappeared, except GBSS
Coello et al., 2009). Al respecto, Utrilla-Coello et (Prioul et al., 2008). The aim of this study was to
al. (2009) separaron las enzimas biosintéticas del analyze the blue and white maize starch in two
almidón con electroforesis bidimensional y las ana- stages of development of the grain after pollination,
lizaron con MALDI-TOF; las muestras presenta- to associate its morphological and physicochemical
ron siete manchas a PM de 60 kDa con pI entre properties with the structure, and the latter with the
5-6, y se identificaron como GBSS1. Dicho estudio enzymes involved in its biosynthesis.
se realizó en granos maduros (50 d después de la
polinización, ddp), cuando la mayoría de las enzi- Materials and Methods
mas que sintetizan el almidón han desaparecido, a
excepción de la GBSS (Prioul et al., 2008). El obje- Biological material
tivo del presente estudio fue analizar el almidón de
maíz azul y blanco en dos etapas de desarrollo del We used blue and white maize varieties, planted in the
grano después de la polinización, para asociar sus experimental field of Centro de Desarrollo de Productos
características morfológicas y fisicoquímicas con la Bióticos (CEPROBI) (Biotic Product Development Center),
estructura, y esta última con las enzimas que parti- located in Yautepec, Morelos, Mexico, and harvested at 20
cipan en su biosíntesis. and 50 dap. The blue grain is soft; the white grain is hard.
We manually removed the pericarp, germ and pedicel from
Materiales y Métodos the maize to obtain the endosperm; we ground part of it and
weighed the resulting paste in portions of 2 g, froze them with
Material biológico liquid nitrogen and stored at 20 °C for the electrophoretic
analysis of proteins. The remaining endosperm dried at 40 °C
Se usaron variedades de maíz azul y blanco sembradas en for 24 h in a convection oven (Riossa, model HS, Mexico). The
el campo experimental del Centro de Desarrollo de Produc- powder obtained was used to isolate starch and carry out its
tos Bióticos (CEPROBI), ubicado en Yautepec, Morelos, Mé- characterization.
xico, y se cosecharon a los 20 y 50 ddp. El grano azul es un
grano suave y el blanco es duro. Del maíz se retiró manual- Starch content and isolation
mente el pericarpio, el pedicelo y el germen, para obtener el in the endosperm
endospermo, parte de este fue molido y la pasta resultante se
pesó en porciones de 2 g, se congeló con nitrógeno líquido y We assessed the starch content by using Goñi et al. technique
almacenó a 20 °C para realizar el análisis electroforético de (1997). We isolated the endosperm starch following the
las proteínas. El resto de endospermo se secó 24 h a 40 °C methodology proposed by Utrilla-Coello et al. (2009).
en una estufa de convección (Riossa, modelo HS, México).
El polvo obtenido se usó para aislar el almidón y realizar su Apparent amylose and size distribution
caracterización. of the starch granules
Contenido y aislamiento del almidón We quantified apparent amylose with the method by Hoover
en el endospermo and Ratnayake (2002), and determined the size distribution of
starch granules by laser diffraction analysis (Malvern Instruments,
El contenido de almidón se cuantificó mediante la técnica model 2000, USA).
de Goñi et al. (1997). Se aisló el almidón del endospermo con la
metodología propuesta por Utrilla-Coello et al. (2009). Thermal properties
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Propiedades térmicas same heating program used for gelatinization (Bello-Pérez et al.,
2005).
Las propiedades de gelatinización se evaluaron con 2.2 mg
de muestra en una charola de aluminio y 7 L de agua desioni- Distribution of the amylopectin chains
zada. Las muestras se calentaron en el calorímetro de barrido
diferencial (TA Instruments, modelo DSC 2010, USA) desde For the chain-length distribution of the amylopectin we used
0 a 130 °C a una velocidad de 10 °C/min, y se usó un reci- high-performance anion-exchange chromatography coupled to
piente vacío como referencia. Las muestras fueron analizadas a pulse amperometric detector (HPAEC-PAD) (Dionex Co.,
por triplicado. Para medir las propiedades de retrogradación, model DX500, USA) and the method of Chávez-Murillo et
las muestras gelatinizadas se almacenaron 7 d a 4 °C. Se aplicó al. (2012). We debranched amylopectin with isoamilsa (59 000
el mismo programa de calentamiento utilizado para gelatiniza- U mL1, HBL, Japan) and the products were automatically
ción (Bello-Pérez et al., 2005). injected to the equipment.
Para obtener la distribución de la longitud de cadenas de la We conducted the protein extraction using the method
amilopectina se usó la cromatografía líquida de alta resolución de proposed by Borén et al. (2004). We weighed 1 g of
intercambio anicónico acoplada a un detector de pulsos anemo- endosperm and homogenized it with 10 mL of extraction
métricos (CLARIA-DPA) (Dionex Co., modelo DX500, USA) y buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA; 1 mM DTT)
el método de Chávez-Murillo et al. (2012). La amilopectina fue and then with washing buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8;
desramificada con isoamilsa (59 000 U mL1, HBL, Japón) y los 10 mM DTT; 2 % SDS). After centrifugation (Hermle Z 383
productos fueron inyectados automáticamente al equipo. K centrifuge, Germany), we added 30 mL of wash buffer to
the residue and boiled for 15 min under constant stirring.
Extracción y purificación de proteínas We froze it (20 °C) for 1 h, then thawed (FRIGIDAIRE
Freezer, model GLFC1325FW, USA) and centrifuged at
La extracción de proteínas se realizó con el método de Borén 13 000g/30 min at 4 °C, and recovered the supernatant. To
et al. (2004). Se pesó 1 g de endospermo y se homogenizó con 10 the supernatant we added an equal volume of a cold solution
mL de regulador de extracción (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM (4 °C) of trichloroacetic acid: acetone (30:70 v/v) to precipitate
EDTA; 1 mM de DTT) y después con regulador de lavado (62.5 proteins.
mM Tris-HCl, pH 6.8; 10 mM DTT; SDS al 2 %). Tras una cen-
trifugación (Centrifuga Hermle Z 383 K, Alemania), al residuo One-dimensional electrophoresis
se adicionaron 30 mL de regulador de lavado y se llevó a ebulli- in polyacrylamide gels (SDS-PAGE)
ción por 15 min con agitación constante. Se congeló (20 °C)
por 1 h, y después se descongeló (Congelador FRIGIDAIRE, Before quantifying proteins by 2 QUANT KIT
modelo GLFC1325FW, USA) y centrifugó a 13 000g/30 min (Amersham Biosciences), we prepared polyacrylamide gels at
a 4 °C y se recuperó el sobrenadante, al cual se adicionó un vo- 8 %, which were loaded with 10 g of protein per sample.
lumen igual de una solución fría (4 °C) de ácido tricloroacético: The electrophoresis was run at 20 mA per gel in a Mini-
acetona (30:70 v/v), para precipitar las proteínas. PROTEAN Tetra system equipment (Copyright 2009
Bio-Rad Laboratories). We revealed proteins with colloidal
Electroforesis unidimensional Coomassie blue.
en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Statistical analysis
Previa cuantificación de proteínas mediante el 2 QUANT
KIT (Amersham Biosciences), se prepararon geles de poliacri- To determine the statistical differences in the physical
lamida al 8 %, en los cuales se cargaron 10 g de proteína por characterization, starch content, amylose, thermal properties,
muestra. La electroforesis se corrió a 20 mA por gel en un equi- and distribution of amylopectin chains of the two maize
po Mini-PROTEAN Tetra system (Copyright 2009 Bio-Rad varieties, we applied a one way analysis of variance (p0.05).
Laboratories). Las proteínas se revelaron con azul de coomassie We used the Tukey test (p0.05) for mean comparison when
coloidal. statistically significant differences were found.
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maíz blanco y azul (20.6 y 22.4 g 100 g1) de al- there is any association between these two molecules
midón) (Cuadro 1), pero la diferencia fue más mar- and whether cessation of starch biosynthesis is due to
cada a los 50 ddp entre el maíz blanco (32.9 g 100 space restriction, and how this affects its structure.
g1 de almidón) y el azul (27.4 g 100 g1 de al-
midón). Además, en el almidón del maíz blanco el Apparent amylose
incremento de amilosa aparente de los 20 a los 50
ddp fue mayor que en azul. Esto muestra que exis- The apparent amylose content 20 DAP showed
ten diferencias en el proceso de biosíntesis de esta significant differences between the white maize
molécula en los dos tipos de maíces. Considerando starch and the blue maize starch (20.6 and 22.4 g
que el maíz blanco es un grano duro y el azul uno 100 g1 of starch) (Table 1), but the difference was
suave, los resultados concuerdan con lo reportado more evident 50 DAP between the white (32.9 g
por Dombrink-Kurtzman y Knutson (1997), quie- 100 g1 of starch) and blue maize (27.4 g 100 g1 of
nes sugieren que en un grano duro el contenido alto starch). Furthermore, in the white maize starch the
de amilosa ocasiona que los gránulos de almidón increase of apparent amylose from 20 to 50 DAP
puedan ser comprimidos fácilmente por su matriz was higher than in the blue one. This shows that
proteica, a diferencia de los granos suaves que tiene there are differences in the process of biosynthesis of
mas amilopectina. Li et al. (2007) observaron que el the molecule in the two types of maize. Considering
contenido de amilosa aumenta paulatinamente con that white maize is a hard grain and blue a soft one,
los ddp encontrándose a los 12 ddp 9.2 g 100 g1 the results obtained match with those reported
de almidón, a los 20 ddp 21.4 g 100 g1 de almidón by Dombrink-Kurtzman and Knutson (1997),
y a los 30 ddp 24 g 100 g1 de almidón, el cual who suggest that in a hard grain the high amylose
permanece sin cambio cuando el maíz llega a su ma- content causes that starch granules can be easily
durez fisiológica a los 45 ddp. Es importante señalar compressed by the protein matrix, unlike soft grains
que el contenido de amilosa también depende de la having more amylopectin. Li et al. (2007) found
variedad, ya que en maíz el intervalo en el conteni- that the amylose content increases gradually with
do de amilosa es 25-35 g 100 g1 de almidón, para DAP reaching 9.2 g 100 g1 of starch at 12 DAP;
almidones normales. La variación de los resultados at 20 dap, 21.4 g 100 g1 of starch; and at 30 DAP,
en este estudio indican que la acumulación de la 24 g 100 g1 of starch, which remains unchanged
amilosa dentro del gránulo del almidón difiere entre when maize reaches physiological maturity at 45
los almidones, esto podría deberse a factores gené- DAP. Importantly amylose content also depends on
ticos de cada grano o a la actividad de la enzima the variety, as in maize the range of amylose content
GBSS, responsable de la biosíntesis de amilosa, así is between 25-35 g 100 g1 of starch for normal
como a la disponibilidad de espacio libre dentro de starches. The variation of the results obtained in
la estructura granular después de sintetizarse la ami- this study indicate that the accumulation of amylose
lopectina, lo cual también involucraría la actividad in the starch granule differs between starches; this
de las enzimas SSS y SBE. could be due to genetic factors of each grain or the
activity of the GBSS, enzyme responsible for the
Distribución de tamaño de partícula biosynthesis of amylose, as well as the availability of
space within the grain structure after amylopectin
La distribución del tamaño de gránulo mos- synthesizes, which would also involve the activity of
tró una distribución unimodal en las etapas de SSS and SBE enzymes.
desarrollo analizadas (Figura 1). El tamaño de par-
tícula de los gránulos de almidón 20 ddp fue 11.9 Particle size distribution
m y 13.4 m en el maíz blanco y azul, aumentan-
do ligeramente a los 50 ddp (13.4 m maíz blanco The granule size distribution was unimodal
y 14.9 m maíz azul). Los gránulos de almidón de in the developmental stages examined (Figure 1).
maíz cubren un intervalo amplio en cuanto al ta- The particle size of the starch granules at 20 DAP
maño de partícula (2-30 m) y está en función de was 11.9 m and 13.4 m in white and blue maize
la terminación de la síntesis del almidón en la etapa detecting a slight increase at 50 DAP (13.4 m in
de crecimiento en la que se encuentre el grano de white maize and 14.9 m in blue maize. Maize starch
maíz, por lo que se ha sugerido que el desarrollo granules cover a wide range in terms of particle size
individual de los gránulos de almidón es paralelo (2-30 m m) depending on the completion of starch
al desarrollo del grano de maíz, considerando que synthesis in the growth stage at which the maize
gránulos pequeños (10 m) son gránulos inma- grain is; therefore, the individual development of
duros que no han alcanzado su tamaño final (Dhital starch granules has been suggested to be parallel to
et al., 2011). En el caso del almidón de maíz blanco the development of the maize kernel, considering
se observó que 20 ddp el área bajo la curva con that small granules (10 m) are immature and have
valores menores de 10 m fue mayor a la observada not reached full size (Dhital et al., 2011). In the case
50 ddp; es decir, hubo una población de gránulos of white maize starch, at 20 DAP, we found that the
pequeños considerable que aumentaron su tamaño area under the curve showing values below 10 m
pero no el número. En el caso del almidón de maíz was greater than that observed at 50 DAP, that is,
azul la población de gránulos pequeños incrementó there is a substantial population of small granules
el número y el tamaño, por lo que el mecanismo that increased in size but not in number. In the case
de biosíntesis del almidón de maíz azul continuó of blue maize starch, the population of small granules
activamente después de los 20 ddp a diferencia del increased in number and size, so the mechanism of
almidón de maíz blanco. biosynthesis of blue maize starch continued active at
20 DAP, unlike the white maize starch.
Distribución de las cadenas de la amilopectina
Distribution of the amylopectin chains
El promedio de la longitud de cadena de la ami-
lopectina fue similar a los 20 y 50 ddp, así como en The average chain length of amylopectin was
las dos variedades de maíz (blanco GP20 y azul similar at 20 and 50 DAP, as well as in the two varieties
GP19) (Cuadro 2). En ambos almidones de maíz, of maize (white DP20 and blue DP19) (Table 2).
predominan cadenas pequeñas (GP24), que ca- In both maize starches small chains (DP24) prevail,
racterizan el arreglo cristalino del tipo A de los almi- characterizing the A-type crystalline arrangement of
dones de cereales. Independientemente de los ddp, cereal starches. Regardless of DAP, blue maize had a
el maíz azul presentó mayor porcentaje de cadenas higher number of chains with DP 6-12 and 13-24,
con GP 6-12 y 13-24, pero menor porcentaje de ca- but lower percentage of chains with DP25 relative
denas con GP25 respecto al maíz blanco. to white maize.
Dhital et al. (2011) separaron los gránulos de al- Dhital et al. (2011) separated the maize starch
midón de maíz en función de su tamaño (9, 13, 26 granules according to their size (9, 13, 26 20 m),
Figura 1. Distribución de tamaño de partícula del almidón de maíz blanco y azul a los 20 y 50 DAP.
Figure 1. Particle size distribution of white and blue maize starch at 20 and 50 DAP.
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Media de dos repeticiones el error estándar. Valores con diferente letra en una columna son estadística-
mente diferentes (p0.05). LC: longitud de cadena promedio; GP: grado de polimerización. ddp: días des-
pués de la polinización Mean of two replicates standard error. Values with different letter in a column
are statistically different (p0.05). LC: mean chain length, DP: degree of polymerization. DAP: days after
pollination.
20 m), encontrando que la mayoría de las distri- and found that most of the chain-length distributions
buciones de la longitudes de cadenas fueron idén- were identical in the different granule sizes. But, Jane
ticas en los diferentes tamaños de gránulos. Pero (2007) in maize harvested at 20 and 45 DAP (with
en maíz cosechado a 20 y 45 ddp (con tamaños de approximate granule sizes of 10-16 and 23 m) the
gránulos aproximados de 10-16 y 23 m) las cadenas DP12 chains increased from 16 to 19 %, DP 13-
con GP12 aumentaron de 16 a 19 %, las de GP 13- 24 did not change, DP 25-36 decreased from 15 to
24 no cambiaron, las de GP 25-36 disminuyeron de 13 %, and DP37 decreased in smaller proportion,
15 a 13 % y las de GP37 disminuyeron de 21.1 a from 21.1 to 20.8 % (Jane, 2007).
20.8 % (Jane, 2007). This type of study on starches has led to
Este tipo de estudios en almidones ha derivado certain structural patterns in relation to structure-
ciertos patrones en cuanto estructura-propiedades physicochemical properties; but there are reports on
fisicoquímicas; pero hay reportes en almidones con starches with similar structural features and differing
características estructurales similares y que presen- in their physicochemical characteristics and vice versa
tan diferencias en sus características fisicoquímicas (De la Rosa-Millán et al., 2010; Palma-Rodriguez
y viceversa (De la Rosa-Millan et al., 2010; Palma- et al., 2012). The foregoing suggests that not only
Rodríguez et al., 2012). Lo anterior, hace suponer the lengths of amylopectin chains are responsible
que las longitudes de cadenas de la amilopectina son for these properties, but also the organization and
responsables de estas propiedades y también la orga- distribution of the chains within the concentric rings
nización y distribución de ellas dentro de los anillos forming the granular structure and the interactions
concéntricos, que conforman la estructura granular, they may have with amylose.
y las interacciones que pudieran tener con la amilosa.
Properties of gelatinization and retrogradation
Propiedades de gelatinización y retrogradación
Gelatinization is a phenomenon involving
La gelatinización es un fenómeno que involucra the dissociation of double helices of amylopectin
la disociación de las dobles hélices de la estructura crystalline structure in the presence of water (up
cristalina de la amilopectina en presencia de agua to 70 % based on the dry weight of starch) by the
(arriba del 70 % en base al peso seco de almidón) por effect of temperature. We found higher peak or
efecto de la temperatura. Mayores temperaturas de mean temperatures (TpG73 °C) and gelatinization
pico o promedio (TpG73 °C) y entalpías de gelati- enthalpy (HG10.5 J g1 and 8.2 J g1, white and
nización (HG10.5 J g1 y 8.2 J g1 blanco y azul) blue) at 20 DAP with respect to the 50 DAP (72 °C
a los 20 ddp se encontraron con respecto a las 50 ddp and 69 °C and H 9.7 J g1 and 7 J g1, white
(72 °C y 69 °C y H 9.7 J g1 y 7 J g1, blanco y and blue) (Table 3). There was a greater decrease
azul) (Cuadro 3). Hubo una mayor disminución de in these parameters of 20-50 DAP in blue maize
los valores en estos parámetros de los 20 a 50 ddp starch. The results may be influenced by the increase
en el almidón de maíz azul. Los resultados podrían in amylose content, which causes the decrease of the
estar influenciados por el aumento en el contenido proportion of amylopectin, thus requiring lower
de amilosa, lo cual causa la disminución de la propor- temperature and energy to gelatinize the starch;
ción de amilopectina, ocasionando que se requiera but it was white maize starch the one that further
menor temperatura y energía para gelatinizar el al- increased the proportion of amylose, and its TpG
midón; sin embargo, el almidón de maíz blanco fue and HG were expected to be lower than those of
el que aumentó en mayor medida la proporción de blue maize starch. However, some amylose chains
amilosa, y se esperaría que su TpG y HG fueran me- form double helices with individual amylopectin
nores que las del almidón del maíz azul. Pero algunas chains or are woven between amylopectin molecules,
cadenas de amilosa forman dobles hélices con cade- thereby reinforcing the granular structure (Tako
nas de amilopectina individuales o estan entretejidas and Hizukuri, 2002). The white maize starch did
entre las moléculas de amilopectina, reforzando de not differ in its retrogradation temperature (TpR)
esta manera la estructura granular (Tako e Hizukuri, at 20 to 50 DAP, but did increase in enthalpy
2002). El almidón de maíz blanco no presentó dife- (HR); we observed the opposite in blue maize
rencias en su temperatura de retrogradación (TpR) starch. The process of retrogradation of white maize
de los 20 a los 50 ddp, pero si un aumento en la en- starch forms more perfect crystals and in lesser
talpia (HR), lo contrario ocurrió en el almidón de amount than in the blue maize starch. The percent
maíz azul. El proceso de retrogradación del almidón of retrogradation (%R) indicates the amount of
de maíz blanco forma cristales con mayor perfección structural rearrangement of the starch at a given
y en menor cantidad que el almidón de maíz azul. El time. The %R was greater at 50 DAP regardless of
porcentaje de retrogradación (%R) indica la cantidad the type of maize, but blue maize starch showed
de re-arreglo estructural del almidón en un tiempo high %R at the different DAP analyzed.
determinado. Los %R fueron mayores a los 50 ddp Hyun-Jung and Qian (2009) and Shifeng et al.
independientemente del tipo de maíz, pero el almi- (2009) mention that amylose is primarily responsible
dón de maíz azul presentó altos %R a los diferentes for retrogradation because its linear chains are bonded
ddp analizados. through hydrogen bridges forming a network that
Hyun-Jung y Quian (2009) y Shifeng et al. begins to grow or thicken as storage time passes;
(2009) mencionan que la amilosa es la principal so the greater the amylose content, the higher
responsable de la retrogradación, debido a que sus retrogradation. But Hyun-Jung and Quiag (2009),
Valores en una columna con diferente letra son significativamente diferentes (p0.05). Promedio de tres re-
peticiones error estándar. TpG: temperatura promedio de gelatinización; HG: entalpía de gelatinización;
TpR: temperatura promedio de retrogradación; HR: entalpía de retrogradación; %R: porcentaje de retrogra-
dación; ddp: días después de la polinización Values in a column with different letter are significantly different
(p0.05). Mean of three replicates standard error. TpG: mean gelatinization temperature; HG: enthalpy
of gelatinization; TpR: mean retrogradation temperature; HR: enthalpy of retrogradation; %R: percentage of
retrogradation; DAP: days after pollination.
AGAMA-ACEVEDO et al. 9
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cadenas lineales se unen a través de puentes de hi- rather than associating retrogradation with amylose
drógeno formando una malla que empieza a crecer content, do so with the length of its chains.
o engrosarse conforme transcurre en tiempo de al-
macenamiento, por lo que a mayor contenido de Relationship of biosynthetic enzymes
amilosa mayor retrogradación. Pero Hyun-Jung y with starch characteristics
Quiag (2009) más que asociar la retrogradación al
contenido de amilosa lo asocian con la longitud de The electrophoretic analysis (Figure 2) shows
sus cadenas. bands with molecular weights (MW) reported for
the enzymes that synthesize starch, found in a range
Relación de las enzimas de biosíntesis con las of 50 to 188 kDa (Grimaud et al., 2008, Zhang et al.,
características del almidón 2004; Mu Foster et al., 1996). Both maize varieties
showed a predominant band at 55 kDa, which is the
El análisis electroforético (Figura 2) muestra ban- MW reported for GBSSI. Although this enzyme is
das con pesos moleculares (PM) reportados para las responsible for amylose synthesis, its activity depends
enzimas que sintetizan almidón en un intervalo de upon the formation of the crystal matrix provided
50 a 188 kDa (Grimaud et al., 2008; Zhang et al., by the amylopectin structure, which could cause
2004; Mu Foster et al., 1996). Ambos maíces mos- differences in the content of amylose 50 DAP in
traron una banda predominante a 55 kDa, que es el the two types of maize (Table 1). Other bands were:
PM reportado para GBSSI. Aunque esta enzima es la 64 kDa (SSSI), 72 kDa (SSSIIa), 73 kDa (SBE
responsable de la síntesis de amilosa, su actividad de- IIb), 76 kDa (SBEI), 100 kDa reported as glucose
pende la formación de la matriz cristalina dada por la pyrophosphorylase, and 188 kDa (SSSIII) (Grimaud
estructura de la amilopectina, lo cual pudo ocasionar et al., 2008).
diferencias en el contenido de amilosa 50 ddp en los These results indicate that in both maize varieties
dos tipos de maíz (Cuadro 1). Otras bandas fueron: short linear chains are being synthesized with DP
64 kDa (SSSI), 72 kDa (SSSIIa), 73 kDa (SBE IIb), 6-12, as well as intermediate chains with DP 13-24,
76 kDa (SBEI), 100 kDa reportada como glucosa chains with DP greater than 24 (Gao et al., 1998),
pirofosforilasa y 188 kDa (SSSIII) (Grimaud et al., being these the substrate for SBEI and SBEIIb that
2008). link chains with DP higher than 10 and chains with
Estos resultados indican que en ambos maíces DP 3-9 (Guan and Preiss, 1993). This is consistent
se sintetizan cadenas lineales cortas con GP 6-12, with the chain length results of the starches analyzed
cadenas intermedias con GP 13-24, cadenas con (Table 2). The bands found in blue maize with 85
GP mayores a 24 (Gao et al., 1998), siendo éstas MW and 90 kDa correspond to those reported
PM
(kDa) E Blanco Azul
250
Figura 2. SDS-PAGE de proteínas extraídas del
SSSIII
endospermo de maíz blanco y azul. E:
150 marcador de pesos moleculares; PM: peso
molecular. GBSSI: almidón sintasa unida
al granulo, isoforma I; SSS: almidón sin-
Fosforilasa
100 tasa soluble, isoformas I, IIa y III; SBE:
SBEIIa enzima ramificante del almidón, isofor-
mas I, IIa y IIb.
SBEIIb
Figure 2. SDS-PAGE of proteins extracted from
SBEI
75 white and blue maize endosperm.
SBEIIb
SBEIIa E: molecular weight marker; MW:
molecular weight. GBSSI: granule bound
SSSI
synthase starch, isoform I; SSS: soluble
synthase starch, isoforms I, IIa and III;
GBSSI SBE: starch branching enzyme, isoforms
50 I, IIa and IIb.
sustrato para las SBEI y SBEIIb que unen cadenas for SBEIIb (Mu Foster et al., 1996) and SBEIIa
con GP mayor a 10 y cadenas con GP 3-9 (Guan (Grimaud et al., 2008). The difference between these
y Preiss, 1993). Lo anterior concuerda con los re- two enzymes is that the first one transfers shorter
sultados de longitud de cadena de los almidones chains than the second (Mizuno et al., 2001), which
analizados (Cuadro 2). Las bandas encontradas en could cause the blue maize starch amylopectin to
maíz azul con PM de 85 y 90 kDa corresponden a show a higher number of branches than that of white
los reportados para SBEIIb (Mu Foster et al., 1996) maize starch. This reflects in the formation of small
y SBEIIa (Grimaud et al., 2008). La diferencia en- crystals that were disrupted at lower temperatures
tre estas dos enzimas es que la primera transfiere (Table 3), and in less available spaces for the synthesis
cadenas más cortas que la segunda (Mizuno et al., of amylose within the granular structure.
2001), lo cual puede causar que la amilopectina del
almidón de maíz azul presente mayor número de Conclusions
ramificaciones que la del almidón de maíz blanco,
reflejándose en la formación de cristales pequeños The starch and amylose content 20 DAP was
que fueron desorganizados a menor temperatura similar in both maize varieties, but 50 DAP blue
(Cuadro 3), y en espacios menos disponibles para maize accumulated more starch and less amylose
la síntesis de la amilosa dentro de la estructura content than white maize. The population of starch
granular. granules smaller than 10 µm increased in number and
size in blue maize starch. There are two isoforms of
Conclusiones branching enzyme in the blue maize starch, producing
highly branched amylopectin molecules with short
El contenido de almidón y amilosa 20 ddp fue chains, leaving less space available within the grain
similar en ambos maíces, pero 50 ddp el maíz azul structure for amylose synthesis. We gelatinized the
acumuló mayor cantidad de almidón y menor can- blue maize starch at higher temperature and enthalpy
tidad de la cadena de amilosa. La población de grá- than white maize starch. The organization and
nulos de almidón menores a 10 m incrementó en distribution of the amylopectin chains within the
número y tamaño en el almidón de maíz azul. Hay concentric rings forming the granular structure affect
dos isoformas de la enzima ramificante en el almidón the physicochemical properties of starch.
de maíz azul, produciendo moléculas de amilopecti-
na altamente ramificadas con cadenas cortas dejan- —End of the English version—
do menor espacio disponible dentro de la estructura
granular para la síntesis de amilosa. El almidón de pppvPPP
maíz azul gelatinizó a mayor temperatura y entalpía
que el almidón de maíz blanco. La organización y and biochemical characterization of starch granules
distribución de las cadenas de la amilopectina dentro isolated of pigmented maize hybrids. Starch/Stärke 60:
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Borén, M., H. Larsson, A. Falk, and C. Jansson. 2004. The barley
Se agradece el financiamiento otorgado por la SIP-IPN, starch granule proteome linternalized granule polypeptides
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los autores (OLRR y EJG) agradecen la beca otorgada por el Chávez-Murillo, C. E., G. Méndez-Montealvo, Y. J. Wang,
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