Bases moleculares de la señalización de

NF-κB
RESUMEN
Los factores de transcripción de la familia NF-κB (factor nuclear kappa B) son
reguladores maestros de los procesos inmunitarios e inflamatorios en respuesta
a lesiones e infecciones. En el estado latente, los NF-κB son secuestrados en el
citosol por sus proteínas inhibidoras IκB (inhibidor de NF-κB). Tras la
estimulación de receptores inmunes innatos, como los receptores tipo Toll y los
receptores de citoquinas, como los de la superfamilia de receptores de TNF
(factor de necrosis tumoral), una serie de eventos proximales a la membrana
conducen a la activación de la IKK (IκB quinasa).
La fosforilación de IκBs resulta en su degradación proteasomal y la liberación de
NF-κB para la translocación nuclear y la activación de la transcripción de genes.
INTRODUCCIÓN
Han pasado más de 25 años desde que David Baltimore descubrió el primer
miembro de la familia de proteínas nuclear factorkappa B (NF-κB) que se unía
selectivamente al potenciador de la cadena ligera κ en extractos de tumores de
células B (41, 43, 102). Desde entonces, los científicos han iluminado el papel
de las proteínas NF-κB en la orquestación de procesos biológicos complejos en
miles de publicaciones.
La familia de factores de transcripción NF-κB eucarióticos regula la expresión de
una gran variedad de genes que participan en una serie de procesos como las
respuestas inflamatorias e inmunes de la célula, el crecimiento y el desarrollo
celular. Los factores de transcripción NF-κB se activan como respuesta a una
variedad de señales, que incluyen citoquinas, patógenos, lesiones y otras
condiciones estresantes.
La activación de las proteínas NF-κB está estrechamente regulada, y la
activación inadecuada de las vías de señalización de NF-κB se ha relacionado
con la autoinmunidad, la inflamación crónica y varios tipos de cáncer (4, 14, 111).
En las células no estimuladas, NF-κB se une a una proteína inhibidora, IκB. La
unión a IκB enmascara la señal de localización nuclear (NLS) de NF-κB,
secuestra el complejo NF-κB · IκB en el citoplasma, y evita que NF-κB se una al
ADN.
La activación de la señalización de NF-κB es iniciada por estímulos
extracelulares. Estos estímulos son reconocidos por los receptores y se
transmiten a la célula, donde las proteínas de señalización del adaptador inician
una cascada de señalización. Estas cascadas de señalización culminan en la
activación de la quinasa IκB (IKK). IKK fosforila la subunidad IκB inhibidora del
complejo NF-κB · IκB en el citoplasma. Esta fosforilación marca IκB para la
degradación por el proteasoma y libera NF-κB del complejo inhibidor. Las
proteínas NF-κB liberadas se transportan luego al núcleo donde se unen a sus
secuencias objetivo y activan la transcripción del gen. En esta revisión, nos
centramos en los mecanismos moleculares de la señalización de NF-κB desde
la estimulación del receptor hasta la activación de la transcripción de genes
(Figura 1).

Figura 1
Vista simplificada de las vías TLR / IL-1R (izquierda) y TNFR (derecha) que
conducen a la activación de NF-κB. Las interacciones conocidas entre proteínas
están indicadas y discutidas en detalle en el texto. Abreviaturas: IL-1R, receptor
de interleucina-1; NF-κB, factor nuclear κB; TLR, receptor tipo Toll; TNFR,
receptor del factor de necrosis tumoral; p, fosforilación.
FAMILIA NF-κB
Todos los miembros de la familia de proteínas NF-κB, RelA (p65), RelB, c-Rel,
p50 (precursor de p105), p52 (precursor de p100) y Relish, comparten un
dominio altamente conservado de enlace y dimerización de ADN denominado
región de homología de Rel (RHR) que les permite homo o heterodimerizar (4,
14, 27, 28, 39, 73, 108, 111) (Figura 2a). RelA (p65), RelB y c-Rel contienen un
dominio de transactivación C-terminal (TAD) que les permite activar la expresión
del gen objetivo. p50 (precursor de p105), p52 (precursor de p100) y Relish
contienen un largo dominio que contiene repeticiones de anquirina (ARD) en su
extremo C en lugar del dominio TAD y, por lo tanto, no pueden activar la
expresión del gen diana como homodímero.

Figura 2
Estructuras de NF-κB y IκBs. (a) Organizaciones de dominio de miembros
representativos. (b) Modelo de relleno de espacio de la estructura cristalina del
heterocomplejo p50 / p65 unido al ADN. (c) La misma estructura que se muestra
en los diagramas de cinta en dos orientaciones. (d) Modelo de relleno de espacio
de la estructura cristalina del heterocomplejo p50 / p65 unido a IκBα. NLS de p65
se muestra en rojo. (e) La misma estructura que se muestra en los diagramas de
cinta en dos orientaciones. (f) Superposición de p65 en la forma unida a IκBα
(azul) y una forma unida a ADN (naranja).
Abreviaturas: CTD, dominio C-terminal; IκB, inhibidor de NF-κB; NF-κB, factor
nuclear κB; NLS, señal de localización nuclear; NTD,
Dominio N-terminal.
ESTRUCTURAS DE NF-ΚB UNIDOS AL ADN
Las proteínas NF-κB se unen como homo o heterodímero a una secuencia de
ADN de 10 pares de bases identificada por primera vez en el potenciador del gen
de la cadena κ de la inmunoglobulina κ en células B maduras (27, 38, 41, 43, 46,
102). , 107). La primera estructura de un RHR se reveló a partir de la estructura
de un homodímero p50 unido a una secuencia de ADN diana κB idealizada (4,
14, 25, 80, 111). Hasta la fecha, varias otras estructuras de dímeros de NF-κB
unidas al ADN se han resuelto y revelan un modo común de unión y dimerización
del ADN. Las estructuras se asemejan a una mariposa con el dímero proteico
que forma las alas alrededor de un cuerpo cilíndrico de ADN (25, 26, 54, 74, 80)
(Figura 2b). El dominio RHR de la subunidad NF-κB se forma en dos dominios
distintos conectados por un enlazador, el dominio N-terminal (NTD) y el dominio
C-terminal (CTD) (Figura 2c). NF-κB usa ambos dominios RHR para rodear el
ADN objetivo. La región flexible en el extremo C-terminal del RHR contiene el
NLS. El núcleo del NTD y CTD se pliega en una estructura β-sandwich. El CTD
es el único responsable de la dimerización y hace contactos de fosfato con el
ADN. Además de los contactos inespecíficos con el esqueleto de fosfato de
azúcar del ADN, la NTD también reconoce la secuencia de ADN objetivo a través
de la interacción específica con las bases de ADN.
El análisis de las estructuras disponibles ha demostrado la plasticidad en la
secuencia diana de los homo y heterodímeros NF-κB. El heterodímero canónico
NF-κB p50 · p65 reconoce su secuencia diana mediante la unión de p50 a un
medio sitio 5 -GGPyN y la unión de p65 a otro sitio 5 -GGPyN centrado alrededor
de un par de bases A: T. Sin embargo, la flexibilidad en la región enlazadora
corta y la arquitectura modular del RHR permiten que NF-κB reconozca las
variaciones en las secuencias de ADN κB reposicionando el RHR-NTD en el
ADN e interactuando con el esqueleto del ADN.
NF-ΚB UNIDO A IΚB INHIBIDOR
Las proteínas de la familia κB inhibitoria (IκB) sirven como inhibidores y
reguladores de la actividad NF-κB.
Los miembros de la familia IκB son las proteínas IκB clásicas (IκBα, IκBβ y IkBε),
las proteínas precursoras NF-κB (p100 y p105), y las IκBs nucleares (IκBζ, Bcl-
3, y IκBNS). Las proteínas IκB contienen un dominio receptor de señal N-terminal
(SRD), un ARD central y una secuencia C-terminal prolina, glutamato, serina y
rica en treonina (PEST) (Figura 2a). IκBα se descubrió por primera vez como un
factor que disocia los complejos de ADN NF-κB · preformados in vitro (1, 23, 27,
28, 39, 73, 108,
132). La transcripción de IκBα demostró estar regulada por NF-κB; por lo tanto,
IκB a su vez regula la activación e inactivación de NF-κB.
Todos los IκBs reconocen NF-κB a través de su ARD. La subfamilia IκB clásica
tiene una preferencia por los dímeros NF-κB que contienen una subunidad p65
o c-Rel, mientras que los IκB nucleares prefieren el homodímero p50 o p52 (40,
85). Las estructuras de NF-κB unidas a IκB han revelado un mecanismo común
de interacción (41, 43, 74). El dímero NF-κB está unido por una molécula de IκB
(Figura 2d).
La estructura de IκB ARD contiene seis repeticiones de anquirina, cada una de
las cuales consta de un bucle β y dos hélices α. IκB se pliega en una estructura
alargada, en forma de barril, con una superficie cóncava y convexa (Figura 2e).
La superficie cóncava de IκB se enfrenta a los dominios de dimerización NF-κB.
En la estructura del complejo heterodímero NF-κB unido a IκB, p50 · p65 · IκBα,
las repeticiones de anquirina 1 y 2 se unen a la NLS de p65; las repeticiones 4 y
6 contactan a la p50 en la interfaz de los dominios de dimerización emparejados;
y las repeticiones 5 y 6 contactan con el dominio de dimerización de p65 (41,
43). En presencia de IκB, la subunidad p65 del heterodímero NF-κB experimenta
un cambio conformacional y adopta una conformación cerrada cuando se
compara con el heterodímero unido al ADN (Figura 2f). El NTD de p65 gira ∼180◦
alrededor de su eje largo y se desplaza en A38 A hacia su dominio de
dimerización. Este ˚ permite la inhibición alostérica de la unión del ADN de NF-
κB. Además, IκB contacta directamente los residuos de unión al ADN de NF-κB;
la repetición de anquirina 6 y los residuos PEST C-terminales de IκB interactúan
con el RHR-NTD e interfieren con la unión del ADN.
En contraste con p50 · p65 · IκBα, la estructura del homodímero p65 NF κB unido
a IκBβ reveló que la región que contiene NLS permanece en gran medida flexible
y que la NTD del p65 RHR no contacta con IκBβ (27, 74). Como resultado, los
elementos cruciales de unión al ADN parecen estar libres para unirse al ADN
incluso en presencia de IκBβ. Estas observaciones están respaldadas por la
distribución subcelular de estos dos complejos. Mientras que el complejo p50 ·
p65 · IκBα se localiza exclusivamente en el citoplasma en las células en reposo
(27, 38, 39, 46, 73, 102, 107, 108), el complejo p65 · p65 · IκBβ se transporta
entre el citoplasma y el núcleo (25, 27, 38, 46, 54, 80, 107).
Aunque los IκB clásicos son bien conocidos, apenas estamos empezando a
arrojar luz sobre el mecanismo molecular de los IκB no clásicos IκBζ, Bcl-3 e
IκBNS. IκBζ se identificó por primera vez como un gen inducido en células
inmunes en respuesta a LPS bacteriano o IL-1 (1, 23, 54, 132), e IκBNS se
expresa durante la selección negativa en células T (23, 40, 85). Bcl-3 es un
protooncogén y a menudo se encuentra que se transloca en las leucemias de
células B (78, 85). Los IκBs nucleares se concentran en el núcleo cuando se
expresan en células (31, 78) y se unen específicamente a los homodímeros p50
de NF-κB (16, 31, 77, 96, 119, 133).
UBIQUITINACIÓN
La ubiquitina es una proteína pequeña que se puede unir a las proteínas objetivo
en un proceso postraduccional. Durante la ubiquitinación, el extremo carboxilo
terminal de la ubiquitina se une covalentemente a una lisina en la proteína diana.
Este proceso requiere varias enzimas: una enzima activadora de ubiquitina E1,
una enzima conjugadora de ubiquitina E2 y una ligasa de ubiquitina E3. Después
de la adición de la primera ubiquitina a una proteína diana, otras moléculas de
ubiquitina pueden unirse a la primera, generando cadenas de poliubiquitina.
La ubiquitina contiene siete residuos de lisina, que pueden servir como puntos
de unión para moléculas de ubiquitina adicionales.
Las cadenas de poliubiquitina clásicas son las cadenas unidas a Lys48, Ub1
(Lys48) -Ub2 (Met1), que se dirigen a las proteínas para su degradación por el
proteasoma (Figura 3a). Las cadenas de poliubiquitina unidas a Lys63 no son
destructivas y, a menudo, se forman en la señalización que desencadena la
activación de NF-κB. En estas cadenas, el Lys63 de ubiquitina se utiliza para unir
a la siguiente molécula de ubiquitina, Ub1 (Lys63) -Ub2 (Met1) (Figura 3b). Esto
da como resultado una conformación diferente de los restos de ubiquitina entre
sí. Además, el extremo N de la ubiquitina se puede utilizar como punto de unión,
Ub1 (Gly76) -Ub2 (Met1) (Figura 3c). Esto da como resultado la formación de un
enlace peptídico canónico entre las moléculas de ubiquitina y se denomina una
cadena de ubiquitina lineal. Las cadenas de poliubiquitina lineal y unida a Lys63
son muy similares en su estructura general y difieren principalmente con respecto
a sus enlaces isopeptídicos.
EL COMPLEJO IKK
Un paso clave en la vía de señalización de NF-κB es la regulación de la
interacción entre NF-κB y el inhibidor de IκB. La mayoría de las vías de
señalización que conducen a la activación de NF-κB convergen en un complejo
de 700–900-kDa que contiene una quinasa IκB específica de serina, denominada
complejo IKK (16, 77, 96, 119, 133). El complejo IKK consta de dos subunidades
catalíticas, IKKα e IKKβ, asociadas como homo (α · α o β · β) o heterodímero (α
· β) unidas estequiométricamente a una subunidad reguladora, NEMO (IKKγ)
(50). El complejo IKK es funcionalmente pleiotrópico y desempeña un papel
importante en muchos procesos biológicos, que incluyen inflamación, autofagia,
señalización de insulina y respuesta al daño del ADN. El complejo es
responsable de la fosforilación de dos residuos de serina en el SRD de IκB (76,
77, 97, 124, 133). La fosforilación de IκB a su vez conduce a la poliubiquitinación
unida a Lys48 (Figura 3) (ver barra lateral, Ubiquitinación), que se dirige a IκB
para la degradación por el proteasoma. La degradación proteosómica de IκB
finalmente libera y activa NF-κB.
Figura 3
Visión general estructural de (a) di-ubiquitina (di-ub) unida a Lys48, (b) unida a
Lys63 y (c) lineal que muestra la conformación global diferente resultante. Lys48,
Lys63 y Met1 se resaltan en rojo. Tenga en cuenta que en las cadenas lineales
di-ub, no se utiliza ningún residuo de lisina para el enlazador.
ESTRUCTURA DE LA SUBUNIDAD CATALÍTICA DEL COMPLEJO IKK
Las subunidades catalíticas IKKα e IKKβ comparten un 50% de identidad de
secuencia. La estructura de IKKβ reveló una arquitectura dimérica que contiene
un dominio quinasa N-terminal, seguido de un dominio similar a la ubiquitina
(ULD), y un dominio de andamios / dimerización (SDD), que se asemeja a la
forma de un par
de tijeras (122) (Figura 4a, b). Los dominios de quinasa y ULD forman el "mango"
de las tijeras y la "hoja" está formada por el SDD. Los tres dominios interactúan
mutuamente entre sí. El extremo C-terminal contiene el dominio de enlace NEMO
(Figura 4a).
El ULD se requiere para la actividad catalítica de IKKβ y, junto con el SDD, ayuda
a unir, posicionar y orientar IκBα con respecto a la bolsa catalítica IKKβ. La
dimerización de IKKβ está mediada por el dominio SDD, y se ha demostrado que
IKKβ de longitud completa es un dímero en la solución (122). Sin embargo, en el
dímero IKKβ, los dominios de quinasa no están localizados cerca uno del otro y
son incapaces de promover la trans-autofosforilación trans intradímera. Esto
sugiere un papel para una mayor oligomerización en la activación de IKKβ. De
hecho, IKKβ existe como un dímero de dímeros en
La estructura cristalina observada. En esta conformación, los bucles de
activación de los dominios de quinasa están en una posición lo suficientemente
cerca para activar la quinasa del dímero vecino (26, 74, 122). Esta conformación
puede ser transitoria y estabilizada por los socios de interacción como NEMO y
la red de cadenas de ubiquitina.
La subunidad reguladora NEMO del complejo IKK es principalmente helicoidal y
contiene los dominios helicoidales denominados HLX1, CC1, HLX2 y CC2,
seguidos de un dominio de cremallera de leucina y una región de dedos de zinc
(ZF) C-terminal (27, 28, 39, 73, 76, 97, 98, 108, 124). El dominio de unión a
quinasa (KBD) contiene HLX1 y parte de CC1. No hay una estructura completa
de NEMO; sin embargo, varias estructuras que contienen dominios individuales
han sido resueltas y permiten una vista de un modelo NEMO de bobina flexible
(CC) alargado y flexible (Figura 4c-g).

Figura 4
Estructuras del complejo IKK. (a) Organizaciones de dominio. (b) Estructura
cristalina del dímero IKKβ. (c) Estructura cristalina de IKKβ NBD en complejo con
el dominio de unión a quinasa N-terminal (HLX1) de NEMO. (d) Estructura
cristalina de NEMO HLX2 en complejo con vFLIP. (e) Estructura cristalina de
CC2-LZ de NEMO en complejo con di-Ub lineal. (f) Estructura del dominio NEMO
ZF. (g) Un modelo de dímero NEMO de longitud completa. Abreviaturas: di-ub,
di-ubiquitina; IKK, IκB quinasa; NBD, dominio de unión a NEMO; NEMO, NF-κB
modulador esencial; ZF, dedo de zinc.
EL DOMINIO DE UNIÓN A IKKΒ: RECONOCIMIENTO DE IKKΒ POR NEMO
La estructura cristalina de la KBD en complejo con la región C-terminal de IKKβ
revela un heterotetrámero en el que las moléculas se empaquetan como un haz
paralelo de cuatro hélices (33, 60, 98, 105, 127) (Figura 4c). Las dos moléculas
de NEMO ensamblan un dímero de cabeza a cabeza con cada molécula
formando una hélice α en forma de media luna que interactúa con la otra
molécula de NEMO en los extremos N y C. El dímero NEMO se estabiliza por
interacciones hidrófobas en los extremos N y C, pero deja una abertura en forma
de hendidura entre ellos. El parche de dimerización N-terminal es más extenso
y está reforzado por interacciones electrostáticas adicionales.
Las dos moléculas IKKβ no se contactan entre sí, sino que se asocian con cada
una de las moléculas de NEMO, respectivamente. Aunque la interacción entre la
molécula NEMO y la IKKβ no es extensa en el extremo N, las moléculas IKKβ
están encajadas estrechamente en el dímero NEMO en el extremo C-terminal.
El bolsillo de unión a IKKβ de NEMO interactúa principalmente con tres grandes
cadenas laterales hidrófobas de IKKβ que están orientadas hacia el bolsillo de
unión en NEMO. Esto da como resultado una interacción específica de alta
afinidad entre NEMO y IKKβ.
NEMO y vFlip
Durante la batalla constante entre nuestro sistema inmunológico y los patógenos,
los patógenos invasores han aprendido a manipular los procesos celulares en su
beneficio. Se ha observado que los virus linfogénicos, por ejemplo, aumentan la
supervivencia y la proliferación celular al activar NF-κB (22, 29, 33, 44, 52, 60,
105, 127). Las proteínas FLIP son un grupo de proteínas celulares identificadas
como inhibidores de la apoptosis inducida por el receptor de la muerte (42, 110).
Las proteínas FLIP víricas (vFLIP) son proteínas codificadas por virus que se
utilizan para manipular las células huésped (11). En el caso del virus del sarcoma
de Kaposi, KSHV, el vFLIP se produce en las células infectadas y se ha
demostrado que interactúa con el complejo IKK y lo activa (2, 22, 29, 41-44, 102).
La estructura cristalina de KSHV vFLIP en complejo con su región objetivo en
NEMO se ha resuelto (2, 4, 14, 111). La estructura revela dos moléculas de
vFLIP unidas a la mitad C-terminal del dímero de cabeza a cabeza de la región
NEMO HLX2 (Figura 4d). Los monómeros vFLIP se unen a NEMO de manera
esencialmente idéntica. Están orientados cara a cara pero no interactúan entre
sí. vFLIP consta de dos dominios de efectos de muerte, DED1 y DED2, de los
cuales DED1 es el principal contribuyente a la extensa interfaz compleja. La
interfaz muestra un alto grado de complementariedad estructural y se caracteriza
por dos fisuras verticales en la superficie de vFLIP.
Cada una de las hendiduras interactúa con una molécula del dímero NEMO. Sin
embargo, una de las hendiduras, la hendidura 1, es más extensa y comprende
un bolsillo asimétrico. El compartimento superior de este bolsillo es profundo e
hidrofóbico, mientras que la parte inferior de la hendidura es más abierta y media
las interacciones hidrofílicas.
Curiosamente, la mutación NEMO L227P se encuentra en pacientes con
trastorno genético crónico, displasia ectodérmica anhidrótica con
inmunodeficiencia y se localiza en la región HLX2 de NEMO (2, 14, 26, 41, 43,
74, 102). La mutación L227P por lo tanto puede cambiar la tendencia de
plegamiento helicoidal de NEMO y desestabilizar el dímero NEMO en la célula
(2, 4, 14, 18, 27, 28, 39, 73, 108, 111, 120). Se asume que la estabilización de
la dimerización de NEMO, ya sea por señalización del receptor o por intervención
viral, activa NEMO. Por lo tanto, la estabilización o desestabilización de NEMO
puede ser un punto importante de regulación en la vía de señalización NF-κB.
NEMO Y DI-UBIQUITIN
Aunque NEMO no tiene una actividad catalítica, es esencial para la ruta NF-κB.
NEMO puede reconocer específicamente las cadenas de poliubiquitina lineales
y ligadas a Lys63 (Figura 3).
Muchas de las proteínas en la cascada de señalización de NF-κB, incluyendo el
propio NEMO y TRAF6, están poliubiquitinadas. La unión de NEMO a la
poliubiquitina es crucial para el reclutamiento de IKK y la posterior activación de
NF-κB (12, 13, 18, 27, 38, 41, 43, 46, 68, 102, 107, 120, 131). Se postuló que las
cadenas de poliubiquitina sirven como un andamio extendido para el
reclutamiento de moléculas de señalización y aumentan la oligomerización más
alta (21).
El análisis de la estructura secundaria y varias estructuras de rayos X mostraron
que, con la excepción de la ZF carboxi-terminal, NEMO es esencialmente una
proteína α-helicoidal alargada. Mientras que la región Nterminal interactúa con
las subunidades IKK catalíticas, la región C-terminal es responsable de la unión
de la cadena de ubiquitina (122).
Se han determinado las estructuras cristalinas de la región NEMO CC2-LZ sola
y en complejo con di-ubiquitina (di-Ub) lineal o ligada a Lys63 (4, 12–14, 25, 68,
80, 111, 131). El NEMO forma un dímero de cabeza a cabeza que abarca ∼110
A (˚ Figura 4e). El dímero observa una simetría pseudo-doble, y cada molécula
del dímero NEMO forma una hélice continua (25, 26, 54, 68, 74, 80). A diferencia
de las proteínas CC clásicas, las dos moléculas de NEMO usan residuos
hidrófobos y porciones alifáticas de residuos cargados para empacar entre sí.
El dímero CC2-LZ de NEMO proporciona una superficie de unión compuesta con
contribuciones de ambas moléculas de NEMO para la ubiquitina. NEMO CC2-LZ
se une preferentemente a di-Ub lineal y tiene una afinidad moderada hacia di-Ub
unida a Lys63. Se encontró que di-Ub unido a Lys48 no se une al NEMO CC2-
LZ. En la unión di-ub lineal, NEMO se une a un parche superficial hidrófobo
conservado y la cola C-terminal de la ubiquitina distal mientras reconoce una
superficie adyacente en la ubiquitina proximal (1, 23, 27, 28, 39, 68, 68, 73, 108
,131, 132). En el caso de la unión di-Ub unida a Lys63, solo una ubiquitina entra
en contacto con cada dímero NEMO, lo que explica la afinidad más baja
observada (5, 40, 85, 131). Por lo tanto, aunque las cadenas de ubiquitina lineal
y unida a Lys63 comparten una arquitectura estructural abierta y extendida (56),
las diferencias sutiles en los enlaces y las conformaciones subyacen a sus
funciones distintas en la activación de NF-κB.
NEMO ZF
El extremo C-terminal de NEMO contiene una ZF que se ha demostrado que se
une a la ubiquitina. Las mutaciones en la ZF se han relacionado con displasia
ectodérmica anhidrótica humana con inmunodeficiencia e incontinencia
pigmentaria (24, 41, 43, 74). Los estudios de resonancia magnética nuclear
revelaron que el NEMO ZF se pliega en un pliegue β-β-α canónico (Figura 4f).
Curiosamente, un mutante que falta el último residuo quelante de zinc (C417F)
retiene la capacidad de unirse al zinc con una afinidad de tipo nativo (13, 41, 43).
Sin embargo, el análisis de la superficie de ZF y los experimentos bioquímicos
identifican dos sitios de interacción de proteínas putativos que se desestabilizan
en el mutante y pueden explicar los defectos de señalización del mutante C417F.
Además, se demostró que el NEMO ZF es un dominio de unión a ubiquitina, que
se une a la ubiquitina con una estequiometría 1: 1 y afinidad submilimolar (12,
27, 74). La interacción entre el NEMO ZF y la ubiquitina se asemeja a las
interacciones resueltas previamente entre los dominios de unión a ubiquitina
helicoidal α y la ubiquitina; la α-hélice anfipática del NEMO ZF se une a un parche
hidrófobo centrado alrededor del residuo Ile44 de la ubiquitina (12, 27, 38, 39,
46, 73, 102, 107, 108).
SEÑALIZACIÓN A TRAVÉS DEL RECEPTOR DE TNF SUPERFAMILIAR
En la vía canónica de NF-κB, las señales proinflamatorias como las citoquinas,
los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y los patrones
moleculares asociados con el peligro activan una cascada de señalización que
conduce a la activación de IKK, que finalmente libera a NF-κB de su complejo
inhibitorio .
Se han dilucidado varias vías de activación inducidas por el receptor de IKK para
la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) y la
superfamilia del receptor tipo Toll / interleuquina-1 (TLR / IL1R).
Las cascadas de señalización activadas por la superfamilia TNFR son diversas
y pueden inducir la vía NF-κB o la apoptosis (3, 5, 25, 27, 38, 46, 54, 80, 107).
El resultado de la señalización está determinado por las proteínas reclutadas
para el dominio intracelular de las TNFR. Tras la trimerización dependiente de
ligando de la TNFR, los factores asociados a la TNFR (TRAF) se reclutan en el
receptor directamente oa través de proteínas adaptadoras (1, 3, 23, 54, 75, 92,
132). Por ejemplo, después de la unión de TNF-α, TNFR1 recluta la proteína
adaptadora TRADD a través de la interacción del dominio de la muerte (DD), que
a su vez recluta TRAF2 (Figura 1).
Las proteínas TRAF contienen un dominio RING N-terminal, seguido de varias
ZF y un CTD que contiene una CC y la región TRAF-C (5, 23, 34, 35, 40, 75, 85,
92) (Figura 5a). La parte C-terminal de las TRAF facilita la trimerización y
participa en interacciones específicas de secuencia con el receptor de TNF y las
proteínas adaptadoras. La región N-terminal de las TRAF media la dimerización
y, en el caso de TRAF6, funciona como una ubiquitina ligasa (E3) para la
poliubiquitinación unida a Lys63 (5, 34, 35, 70, 78, 85, 115, 115, 134). La
diferencia en la simetría de la región N-terminal y la región C-terminal
probablemente da como resultado una dimerización y trimerización alternas, lo
que lleva a una agregación infinita de TRAF (129). Se requiere la formación de
ensamblajes de alto orden para la poliubiquitinación mediada por TRAF6 y la
activación de NF-κB (129).
La región CC del trímero TRAF2 recluta cIAP1 / 2 (5, 7, 31, 34, 35, 70, 78, 115,
134), y los dominios RING de la poliubiquitinación nucleada cIAP1 / 2 de
proteínas diana, incluida la quinasa RIP1, NIK , TRAF2, y cIAP1 / 2 (5, 7, 16, 30,
31, 34, 35, 69, 77, 95, 96, 119, 133). El RIP1 ubiquitinado sirve como plataforma
para el ensamblaje de proteínas posteriores como la quinasa 1 activada por el
factor de crecimiento transformante (TGF) -β (TAK1), la proteína de unión a
TAK1 (TAB) 2 y TAB3, y NEMO, así como otras ligasa de ubiquitina. como el
complejo de ensamblaje de cadena de ubiquitina lineal (7, 16, 30, 69, 77, 95, 96,
119, 129, 133). La unión de NEMO a las cadenas de ubiquitina promueve la
activación de IKK, ya sea por inducción de cambios conformacionales o
colocando IKK en un contexto en el que es susceptible a la fosforilación por las
quinasas en sentido ascendente como TAK1 o trans-autofosforilación.
La ubiquitinación de NIK por cIAP1 / 2 conduce a su degradación proteasomal y
la supresión de la vía no canónica NF-κB.
ESTRUCTURA DE TRAF RING-ZF E INTERACCIÓN CON UBC13
TRAF6 es una ubiquitina ligasa E3 crucial para la activación de NF-κB inducida
por TNFR, TLR e IL-1R y vías de señalización AP-1 (50, 121). Se demostró que
la dimerización de TRAF6 es crucial para la actividad de la ligasa E3 in vitro y la
activación de NF-κB in vivo (76, 77, 97, 124, 129, 133). Los mutantes de TRAF6
incapaces de formar dímeros están comprometidos en el ensamblaje de la
cadena de poliubiquitina y la promoción de la fosforilación de IκB (122, 129).
Las estructuras de la región N-terminal de TRAF2 y TRAF6 contienen el dominio
RING y parte de la región ZF y han revelado que ambas proteínas forman
homodímeros (122, 128, 129) (Figura 5b, c). La homodimerización está mediada
por el dominio RING y la región enlazadora adyacente y se ha confirmado en la
solución (122, 128, 129). La estructura de TRAF6 se puede describir como una
formación similar a un palo de golf con las ZF que forman el eje y el dominio
RING que forma el
cabeza del club (76, 97, 98, 124, 128, 129). El dominio RING se pliega en un
pliegue cruzado canónico pero contiene un Asp en lugar de un residuo de
coordinación de zinc más clásico. La interfaz del dímero hidrófobo está formada
por cadenas laterales apiladas aromáticas y alifáticas, que se conservan entre
las proteínas TRAF. Los tres ZF forman el pliegue β-β-α canónico y exhiben
orientaciones conservadas entre sí.
Se demostró que la región N-terminal de TRAF6 funciona como una ubiquitina
ligasa E3 (33, 60, 98, 105, 121, 127). La estructura compleja entre TRAF6 y su
E2 Ubc13 se asemeja a otras estructuras RING · E2. El núcleo del complejo está
formado por interacciones hidrófobas del dominio RING cerca del primer sitio de
unión a zinc, mientras que los residuos N-terminales al dominio RING forman
interacciones cargadas adicionales (Figura 5d). El primer ZF de la región es
necesario para la interacción de TRAF6 con Ubc13, aunque ZF no contacta
directamente con Ubc13. La ZF1 forma una lámina β antiparalela tricelular con
residuos N-terminal al dominio RING, bloqueando así estos residuos en una
conformación adecuada para la unión de Ubc13.
Curiosamente, la superposición de TRAF2 RING-ZF sobre la estructura TRAF6
· Ubc13 revela enfrentamientos estéricos entre TRAF2 y Ubc13 (22, 29, 33, 44,
60, 63, 75, 81, 92, 105, 126–128),
y TRAF2 purificado no logra interactuar con UBC13 en ensayos de cambio de
gel in vitro (128). Los residuos críticos para la unión de Ubc13 en TRAF6 no se
conservan en TRAF2, y las mutaciones de estos residuos en sus contrapartes
de TRAF2 anulan la interacción Ubc13, así como la actividad E3 de TRAF6. Por
lo tanto, TRAF2 requiere interacción con cIAP para inducir la poliubiquitinación
(115, 134).
Figura 5
Estructuras de los TRAFs. (a) Organizaciones de dominio. (b) Estructura
cristalina de los dominios RING y ZF diméricos (ZF1–3) de TRAF6. (c) Estructura
cristalina del dominio DING y ZF dimérico (ZF1) de TRAF2. (d) Estructura
cristalina de TRAF6 RING y dominio ZF (ZF1) en complejo con Ubc13. (e)
Estructura cristalina de TRAF2 CC en complejo con el dominio cIAP2 BIR1. (f, g)
Estructura cristalina del dominio TRAF de TRAF2 en complejo con un péptido
del receptor CD40 en diagramas de relleno de espacio y de cinta,
respectivamente. (h, i) Estructura cristalina del dominio TRAF de TRAF2 en
complejo con el NTD de TRADD en diagramas de relleno de espacio y de cinta,
respectivamente. (j) Un modelo de agregación infinita de proteínas TRAF de
longitud completa mediante alternancia de dimerización y trimerización.
Abreviaturas: CC, bobina enrollada; NTD, dominio N-terminal; TRAF, factor
asociado con el receptor del factor de necrosis tumoral (TNF).
TRAF CC DOMINIO E INTERACCIÓN CON CIAP
TRAF2 y cIAP forman un complejo E3 y son componentes esenciales de las vías
NF-κB canónicas y no canónicas inducidas por TNF-α (70, 71, 115,134). Al unirse
a TNF-α, TNFR1 recluta la proteína adaptadora TRADD, que a su vez recluta
TRAF2 y RIP1. La poliubiquitinación de RIP1 unida a Lys63 es esencial para la
activación de IKK (18) y depende de la unión de TRAF2 a cIAP1 / 2 (115, 134).
El dominio TRAF2-CC forma un homotrímero continuo solo y en complejo con el
dominio BIR1 de cIAP2 (70, 134) (Figura 5e). Sorprendentemente, cada trímero
TRAF-CC interactúa con una sola molécula de cIAP tanto en la estructura
cristalina como en la solución. Tras la unión de cIAP, el trímero TRAF2-CC
experimenta cambios conformacionales sutiles, que dan como resultado un sitio
de unión mejorado al mismo tiempo que prohíbe la unión de otras moléculas de
cIAP a los otros dos sitios de unión potenciales en el trímero TRAF-CC.
A diferencia de TRAF2, el papel de TRAF1 en la activación de NF-κB aún no está
claro. Se ha sugerido que TRAF1 actúe como un regulador tanto negativo como
positivo, posiblemente de una manera dependiente del tipo de célula. Poco se
sabe sobre el mecanismo exacto de regulación. Sin embargo, en presencia de
TRAF1-CC, se forma preferentemente un heterotrímero que consiste en una
molécula de TRAF1-CC y dos moléculas de TRAF2-CC (TRAF1 · [TRAF2] 2)
(134). Curiosamente, el análisis bioquímico de esta interacción mostró que el
heterotrímero TRAF1 · [TRAF2] 2 tiene una afinidad más alta por el cIAP2 que
el homotrímero TRAF2. La inspección del homotrímero TRAF2-CC y las
estructuras del heterotrímero TRAF1 · [TRAF2] 2 revela un alto grado de
similitud. Sin embargo, tras la superposición de las moléculas de cIAP2, se
observa una rotación relativa de ∼9◦ entre los dos trímeros. Además, la
interacción con cIAP2 está mediada principalmente por TRAF1 y muestra una
mayor hidrofobicidad y una mejor complementariedad de formas que la
observada en el homotrímero. Se demostró que TRAF1 rescata un mutante
defectuoso de unión a cIAP2 de TRAF2 y fue capaz de inhibir la degradación
proteosomal inducida por TNFR2 de TRAF2 (17, 134). Por lo tanto, las
diferencias en la afinidad de unión y el modo de cIAP a TRAF1 · [TRAF2] 2 y
TRAF2 trímero proporcionan una primera explicación para estas funciones
reguladoras de TRAF1 en la activación de NF-κB.
TRAF CTD E INTERACCIONES CON PÉPTIDOS Y TRADD
El TNFR activado recluta adaptadores de señalización a sus dominios
intracelulares. La superfamilia TNFR se puede dividir en dos subgrupos: los
TNFR denominados receptores de la muerte que contienen un DD intracelular y
los TNFR sin un DD. Aquellos sin un DD pueden reclutar directamente a
miembros de la familia TRAF. Los receptores de muerte relacionados con TNFR1
requieren la proteína adaptadora TRADD para reclutar TRAF2. El DD de TRADD
se une al receptor, y el NTD de TRADD facilita la interacción con TRAF2 (92,
93).
Se han resuelto varios complejos entre TRAF2 y los péptidos receptores (63, 75,
81, 92, 126). En general, estos complejos se asemejan a una forma parecida a
una seta con el dominio TRAF2-CC como el tallo y el dominio de sándwich β
como la tapa de la seta (Figura 5f, g). En todas las estructuras del receptor ·
TRAF2, los péptidos del receptor tienen una conformación de la cadena principal
extendida y forman una cadena β.
Esta cadena β extiende el sándwich β de TRAF2 en el borde de la tapa de la
seta. Los motivos de unión a TRAF2 se definen por interacciones específicas de
la cadena lateral entre los péptidos receptores y TRAF2 (75, 92, 126).
La estructura cristalina de la CTD (CC y TRAF-C) de TRAF2 y la NTD de TRADD
(TRADD-N) revelan que la forma de hongo de TRAD2, similar a la seta, está
decorada por tres moléculas de TRADD unidas al lado superior de la tapa de la
seta (93) (Figura 5h, i). Cada una de las moléculas de TRADD interactúa
exclusivamente con el pliegue en sándwich β de una subunidad TRAF2. TRADD-
N se pliega en un sándwich α-β con una hoja β de cuatro cadenas y seis hélices
α (Figura 5h, i). La interfaz está dividida en dos regiones. La Región 1 es en gran
parte hidrófoba y está formada por una protuberancia de superficie en TRAF2 y
una cara superficial expuesta de la lámina β de TRADD. La Región II está
formada por una cresta altamente cargada en TRADD y una depresión superficial
de TRAF2 y presenta una interfaz hidrofílica con muchos enlaces de hidrógeno
y puentes salinos.
El extremo C de TRADD-N se proyecta lejos del complejo TRADD · TRAF2 e
indica una posible ubicación del DD C-terminal de TRADD, que se une
directamente al DD intracelular de TNFR1 cerca de la membrana celular. El
dominio DD de TRADD es también una plataforma central para el reclutamiento
de moléculas de señalización intracelular como FADD para la unión de caspasa-
8 o RIP1 para la activación de NF-κB. En esta conformación, las regiones CC
triméricas sobresalen hacia el centro de la célula, preparadas para interactuar
con proteínas de señalización corriente abajo, como los CIAP. Curiosamente, la
región de unión de TRADD en TRAF2 es similar a la región de superficie ocupada
por los péptidos receptores.
(71, 75, 92, 115, 126) y destaca la naturaleza competitiva del reclutamiento
directo e indirecto de TRAF por parte de la familia TNFR.
TRAF OLIGOMERIZACIÓN DE ORDEN SUPERIOR
Aunque la parte N-terminal de las proteínas TRAF forma dímeros, los CTD
forman trímeros. Esta aparente discrepancia de simetría dentro de la misma
proteína puede rectificarse con una red de oligomerización de orden superior. De
hecho, la agregación espontánea de TRAF6 endógeno se ha observado como
una respuesta a la estimulación del receptor in vivo (129). Además, los
experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia han
demostrado que TRAF6 puede formar oligómeros de orden superior. La
capacidad de oligomerizar puede ser abolida por un mutante incapaz de
dimerización. Tomando en conjunto toda la información estructural disponible, se
propuso un modelo de TRAF6 de longitud completa activada (88, 106, 129)
(Figura 5j). El modelo TRAF6 revela el potencial de una oligomerización infinita
en una red bidimensional a través de las interfaces de dimerización y
trimerización. Esta red de interacciones llevaría a un aumento en la
concentración local de todas las proteínas de señalización asociadas al
proporcionar una plataforma de acoplamiento y promover la autoubiquitinación,
la poliubiquitinación y la señalización descendente.
SEÑALANDO CASCADAS TRIGGADAS POR EL SUPERFAMILIO TLR / IL-
1R
La superfamilia TLR / IL-1R pertenece a los receptores de reconocimiento de
patrones, y cada TLR reconoce un PAMP específico a través de su dominio
extracelular. Los PAMP incluyen lipopolisacáridos de bacterias gramnegativas,
peptidoglicano y ácido lipoteicoico de bacterias grampositivas, ARN indicativos
de la presencia de virus y varias formas de señales de estrés.
Los TLR están relacionados con la subfamilia de receptores de membrana IL-
1R. Comparten un dominio Top / IL-1R (TIR) citoplásmico común y, en
consecuencia, utilizan componentes superpuestos para la señalización
descendente. Los TLR se conservan evolutivamente de Caenorhabditis elegans
a los mamíferos, y hasta la fecha, se han identificado un total de 13 TLR de
mamíferos. Los TLR están compuestos por tres dominios:
una región de repetición rica en leucina extracelular N-terminal (LRR) que
detecta patógenos extracelulares y señales generadas durante la lesión tisular,
un solo dominio transmembrana y un dominio TIR intracelular C-terminal (88,
106, 112) (Figura 6a). Tras la activación inducida por ligando, los TLR y los IL-
1R forman dímeros (62, 112) o alteran su conformación preexistente (45, 49, 62,
67, 90, 130).
INTERACCIONES PROXIMALES DE MEMBRANA
Hasta la fecha, varias estructuras del dominio extracelular de los TLR unidos a
un ligando se han resuelto y revelan una estructura general común (45, 49, 67,
90, 130). Los dominios LRR extracelulares de los TLR diméricos se asemejan a
una forma similar a m con los dos extremos N que se extienden en direcciones
opuestas y los dos extremos C que convergen en la región media. Sin embargo,
cada uno de los diferentes ligandos está unido a distintas superficies en los
dímeros de TLR.
Los receptores de la familia IL-1R contienen tres dominios similares a
inmunoglobulina en su porción extracelular (Figura 6a). Tras la unión inicial a IL-
1R1, se requiere asociación con IL-1RAcP para la unión firme de la citoquina y
la señalización corriente abajo (57, 87, 102). Las estructuras del IL-1R1 · IL-
1RAcP unido a IL-1R y el heterodímero IL-1R1 · IL-1RII revelan una arquitectura
similar y muestran que los dominios de tipo Ig del receptor se acercan en la
dimerización (26, 109, 114, 117).
Los TLR y la familia de receptores de membrana IL-1R comparten un dominio
TIR citoplásmico común y, en consecuencia, utilizan componentes superpuestos
para la señalización descendente (28, 86). Se sugirió que los oligómeros de
orden superior de los receptores pueden ser críticos para el inicio de la señal
intracelular (79, 102). El dominio TIR forma una pequeña lámina β, globular y
paralela, rodeada por hélices α (25, 80, 123) (Figura 6c). Se piensa que tras la
unión del ligando al dominio extracelular, los dominios TIR intracelulares están
muy próximos entre sí y pueden participar en la interacción homotípica. Esto crea
una plataforma desde la cual la oligomerización del adaptador que contiene el
dominio TIR
Las moléculas pueden ser nucleadas (1, 88, 106, 132). Hasta la fecha, se han
identificado cinco moléculas adaptadoras: diferenciación mieloide gen de
respuesta primaria 88 (MyD88), proteína similar a la adaptadora MyD88, IFNβ
inductora de la proteína adaptadora que contiene dominio TIR (TRIF), molécula
adaptadora relacionada con TRIF y α estéril y proteínas que contienen motivos
de armadillo (40, 88). Se conocen varias estructuras de dominios TIR. Sin
embargo, debido a la dificultad de reconstituir oligómeros de dominio TIR
estables, la naturaleza de la oligomerización del dominio TIR sigue siendo difícil
de alcanzar. Y varios modelos propuestos basados en estudios de mutagénesis,
estructuras cristalinas o estudios de acoplamiento aún esperan confirmación (41,
43, 51, 74, 83, 84, 113).
Figura 6
Estructuras del Myddosome y otras interacciones proximales a la membrana en
la vía TLR / IL-1R. (a) Organizaciones de dominio.
(b) Estructura cristalina del complejo DD del Myddosome en dos orientaciones,
mostrando una estructura con 6 moléculas MyD88, 4 IRAK4 y 4 IRAK1 o IRAK2.
(c) Un modelo estructural de los eventos proximales a la membrana en la
señalización TLR. Abreviaturas: DD, dominio de la muerte; IL-1R, receptor de
interleucina 1; IRAK, cinasa asociada al receptor de interleucina 1 (IL-1R);
MyD88, mieloide diferenciación del gen de respuesta primaria 88; TLR, receptor
tipo Toll.
INTERACCIONES OLIGOMÉRICAS DE DD Y ACTIVACIÓN DE IRAK: EL
MYDDOSOME
Se sugirió que los oligómeros de orden superior de los receptores pueden ser
críticos para el inicio de la señal intracelular (79, 102). Tras la unión del ligando
al receptor, los dominios TIR intracelulares están muy próximos entre sí y pueden
participar en la interacción homotípica. Esto crea una plataforma TIR inicial en la
que otras moléculas adaptadoras que contienen el dominio TIR pueden
ensamblarse y oligomerizarse (88, 106, 132).
La principal proteína adaptadora de señalización para la señalización TLR e IL-
1R es MyD88. Además de su dominio TIR, contiene un DD C-terminal (Figura
6a). MyD88 es un miembro de la superfamilia DD, que también incluye pirina,
reclutamiento de caspasas y dominios de efectos de muerte (91).
El pliegue DD contiene seis hélices α antiparalelas dispuestas en un paquete de
llaves griegas (37, 104). El pliegue DD se caracteriza por una homología de
secuencia baja que genera superficies de interacción diversas y específicas.
Dentro de cada subfamilia, los miembros forman interacciones homotípicas
conservadas y facilitan el ensamblaje de complejos de señalización
oligoméricos, que son componentes cruciales de las vías de señalización
inflamatorias y apoptóticas.
En las vías inducidas por TLR e IL-1R, MyD88 se asocia con miembros de la
familia de quinasas asociadas a IL-1 (IRAK). Las proteínas IRAK contienen un
DD N-terminal seguido de un dominio de cinasa Cterminal (Figura 6a). Los DD
de MyD88 y IRAK se ensamblan en un gran complejo oligomérico denominado
Myddosome (79). La estructura de este Myddosome se ha resuelto y revela una
forma de torre que consta de cuatro capas; una capa de IRAK4 se intercala entre
dos capas superiores de MyD88 y una capa inferior de IRAK2 (66) (Figura 6b).
Los DD de MyD88, IRAK4 e IRAK2 se ensamblan en una estructura helicoidal
zurda que se estabiliza por tres tipos de interacciones DD conservadas (20).
Forma de la superficie y complementariedad de la carga entre las capas
adyacentes y el hecho de que el IRAK4 DD es monomérico, mientras que el DD
de MyD88 es propenso a la oligomerización.
En solución, sugiera un orden de montaje secuencial de todo el complejo (66).
Por lo tanto, un mecanismo de montaje jerárquico estricto se puede imaginar
fácilmente. Primero, la unión de un ligando al receptor.
acerca los dominios TIR del receptor intracelular, lo que lleva al reclutamiento de
MyD88. En segundo lugar, el DD de MyD88 oligomeriza y nuclea la unión y
oligomerización de IRAK4. En tercer lugar, después de que cuatro moléculas
IRAK4 hayan ensamblado una capa de Myddosome, las moléculas IRAK2 e
IRAK1 se pueden unir a Myddosome.
Se demostró que IRAK4 fosforila el bucle de activación de IRAK1 y se
autofosforila a sí mismo in vitro (64), mientras que se encontró que MyD88
promueve la fosforilación de IRAK1 y IRAK4 (9).
Esto sugiere que el Myddosome proporciona una plataforma en la que IRAK4
inicia la fosforilación y se propaga en sentido descendente a IRAK1 y IRAK2.
IRAK1 fosforilado y IRAK2 a su vez reclutan TRAF6 a la membrana (10, 94, 125)
(Figura 6c).

ACTIVACIÓN DEL COMPLEJO TAK1

El complejo TAK participa en las vías de señalización inducidas por varias
citoquinas, incluidas TGF-β, TNF-α, IL-1 e incluso LPS (61), y se requiere para
activar IKK. El complejo TAK consta de una quinasa, TAK1 y TAB1, TAB2 y TAB3
(Figura 7a). TAK1 es un miembro de la familia MAPKKK (82). TAK1 requiere
TAB1 para su actividad quinasa (53, 103). La estructura del complejo TAK1 ·
TAB1 muestra que la α-hélice interactiva de TAB1 está unida en una amplia bolsa
en la superficie del lóbulo de la quinasa TAK1 C-terminal (8) (Figura 7b). Esta
estrecha interacción promueve la autofosforilación del lóbulo de activación de la
quinasa TAK1, probablemente a través de un mecanismo alostérico (8, 89, 100).
El complejo TAK1 está regulado por poliubiquitinación unida a Lys63 (116). Se
demostró que los dominios ZF de TAB2 y TAB3 reconocen específicamente las
cadenas de poliubiquitina unidas a Lys63 que están sin anclar o ancladas a
proteínas de sustrato como RIP1, TRAF6 o NEMO; Las mutaciones que impiden
la unión de poliubiquitina anulan la activación del complejo TAK1 o IKK (48, 116).
El análisis de la estructura secundaria muestra una estructura de dominio similar
para TAB2 y TAB3: un dominio de unión a ubiquitina N-terminal (CUE) y una
región CC, seguido de un dominio de unión a TAK1 (TB) y un CTP de terminal
Npl4 ZF (NZF) (48). Las secuencias de los dominios NZF TAB2 y TAB3 son
aproximadamente 80% idénticas, y se han resuelto las estructuras cristalinas de
ambos en complejo con poliubiquitina unida a Lys63 y son prácticamente
idénticas (59, 101). El TAB NZF se pliega en un par de láminas β antiparalelas
seguidas de un bucle largo y se une a ambos restos de ubiquitina
simultáneamente (Figura 7c). TAB no reconoce el enlace isopeptídico unido a
Lys63 pero interactúa con parches hidrófobos centrados alrededor de Ile44 en
los restos de ubiquitina adyacentes. La especificidad para la ubiquitina ligada a
Lys63 se logra mediante restricciones conformacionales. Los sitios de unión a
ubiquitina distal y proximal del TAB NZF están organizados para optimizar la
unión simultánea a los restos de ubiquitina adyacentes en una configuración
específica para las cadenas de ubiquitina unidas a Lys63 (56). Las restricciones
conformacionales impuestas por TAB en el di-Ub enlazado con Lys63 no pueden
ser adoptadas por un enlace lineal (59).
Varios dominios NZF de TAB podrían unirse a largas cadenas de ubiquitina
unidas a Lys63. El reclutamiento de complejos de TAK1 múltiples para el
andamio de poliubiquitinación TRAF6 llevaría los dominios de quinasa de TAK1
cerca uno del otro. Esto promovería la autofosforilación y activación de la quinasa
TAK1, que a su vez puede activar el complejo IKK.
Figura 7
El complejo TAK1 y las deubiquitinasas regulan a la baja la señalización de NF-
κB. (a) Organizaciones de dominio de componentes complejos TAK1. (b)
Estructura cristalina del dominio quinasa TAK1 en complejo con un péptido
activador de TAB1. (c) Estructura cristalina de TAB2 NZF en complejo con di-
ubiquitina unida a Lys63. (d) Organizaciones de dominio de las deubiquitinasas
A20 y CYLD. (e) Estructura cristalina del dominio OTU de A20. (f) Estructura
cristalina del cuarto dominio ZF de A20 en complejo con tres moléculas de
ubiquitina.
(g) Estructura cristalina del dominio USP de CYLD. La caja B es un pequeño
dominio de unión a zinc similar a los dominios RING.
Abreviaturas: NZF, dedo de zinc Npl4; OTU, dominio tumoral ovárico; USP,
proteasa específica de ubiquitina; ZF, dedo de zinc.
REGULACIÓN NEGATIVA POR LAS DEUBIQUITINAS
Las cadenas de poliubiquitina desempeñan un papel crucial en la activación de
la vía NF-κB al proporcionar una plataforma de ensamblaje para moléculas de
señalización. Por lo tanto, la eliminación de las cadenas de poliubiquitina por las
deubiquitinasas (DUB) presenta una forma de terminar la activación de NF-κB.
Al igual que las ligasas E3, los DUB pueden tener especificidad para ciertos tipos
de enlaces de poliubiquitina. La especificidad puede estar mediada por la
selectividad del núcleo catalítico, los dominios de unión a ubiquitina de la DUB o
las proteínas adaptadoras. Se han encontrado varios DUB para regular la ruta
NF-κB. Los DUB A20 (proteína 3 inducida por TNFα), Cezanne, Usp21 y la
hidrolasa carboxilo terminal de ubiquitina CYLD han demostrado ser importantes
para la regulación de retroalimentación negativa de la vía NF-κB. A20, CYLD,
Cezanne y Usp21 difieren en su activación temporal y en la especificidad del
enlace ubiquitina. Sin embargo, los cuatro DUB han sido implicados en la
eliminación de cadenas de ubiquitina de RIP1 en la señalización de TNF.
A20 pertenece a la superfamilia de tumores ováricos de DUB (72). Contiene un
dominio tumoral ovárico N-terminal (OTU) y siete dominios ZF (Figura 7d). A20
es una enzima de edición de ubiquitina (19).
Media la deubiquitinación de la poliubiquitina unida a Lys63, pero también puede
generar cadenas de poliubiquitina unidas a Lys48 a través de la actividad de la
ligasa E3 del cuarto motivo ZF (15, 19, 118). Ambas actividades son necesarias
para la inhibición de NF-κB (32).
También se mostró que el cuarto ZF (ZF4) de A20 se une selectivamente a las
cadenas de ubiquitina unidas a Lys63 (6). Una estructura cristalina de ZF4 unida
a monoubiquitina además de la caracterización en fase de solución reveló un
sitio de unión de tres interfaces para la ubiquitina unida a Lys63.
El dominio OTU de A20 se pliega en forma de cuña (Figura 7e). Se sugirió un
parche de superficie muy conservado y cargado negativamente cerca del sitio
activo de A20 como la región de unión a la ubiquitina (65). El sitio de unión
putativo se ubica en una posición similar a los sitios de unión a ubiquitina de otros
dos DUB, Yuh1 y HAUSP (36, 47). Se demostró que A20 elimina la totalidad de
la cadena de poliubiquitina unida a Lys63 de TRAF6 en un solo paso, por lo que
se desactiva efectivamente la vía NF-κB
(sesenta y cinco). Se sugirió que el dominio ZF recluta las cadenas de
poliubiquitina A20 a Lys63 en complejos de señalización activados. La OTU A20
desmonta las cadenas de poliubiquitina, lo que a su vez podría facilitar la síntesis
de cadenas degradantes de ubiquitina unidas a Lys48 en los sustratos (Figura
7f).
CYLD es un miembro de la familia de la proteasa específica de ubiquitina (USP).
Contiene tres proteínas asociadas al citoesqueleto (CAP): repeticiones
conservadas en glicina en su porción N-terminal y un dominio USP en el extremo
C (Figura 6d). CYLD contiene una secuencia de unión a TRAF2, y se demostró
que la tercera CAP interactúa con una secuencia rica en Pro en NEMO (58, 99).
El dominio USP media el desmontaje de las cadenas de poliubiquitina unidas a
Lys63. A diferencia de otros PSPs, CYLD es capaz de hidrolizar las cadenas de
poliubiquitina internamente, resultando en una inhibición eficiente de la ruta NF-
κB. La estructura del dominio CYLD USP reveló un sitio de unión a ubiquitina
proximal cerca del sitio activo y un conjunto específico de Lys63 de residuos
conservados cerca del centro catalítico, lo que explica la especificidad de Lys63
(Figura 7g).
OBSERVACIONES FINALES
Los estudios estructurales de la señalización de NF-κB han ayudado a ilustrar
los mecanismos moleculares subyacentes en muchos aspectos de las cascadas
de señalización desde el reclutamiento de adaptadores hasta la activación de las
ligasas y quinasas de ubiquitina, que culminan en el control transcripcional de
las respuestas inmunitarias e inflamatorias.
Varios temas centrales están surgiendo de estos estudios. En primer lugar, la
visión convencional de que la transducción de señales está compuesta por
cadenas lineales de eventos se está desafiando porque se forman grandes
conjuntos multiméricos, o señalosomas, en estos procesos de señalización. En
segundo lugar, se han identificado al menos tres tipos de andamios de
multimerización a partir de estos estudios: la oligomerización infinita de alto
orden de TRAF6, la red de cadenas de ubiquitina y el ensamblaje helicoidal en
la superfamilia DD. En tercer lugar, la oligomerización parece ocurrir en todos los
niveles de la cascada de señalización en la que múltiples oligómeros de
señalización se combinan para formar señalosomas gigantes para realizar
múltiples reacciones de manera simultánea y eficiente, como la ubiquitinación y
la fosforilación. La cooperatividad intrínseca en la formación de señalosomas
multiméricos puede predecir una respuesta de umbral digital en la señalización
NF-κB, una propiedad que puede ser bastante general en muchos otros procesos
biológicos.

TRAF: factor de necrosis tumoral (TNF) factor asociado al receptor

TLR: receptor tipo Toll
FNT: factor de necrosis tumoral Ubiquitina ligasa: proteína que en combinación
con una enzima conjugadora de ubiquitina causa la unión de la ubiquitina a una
lisina en una proteína diana a través de un enlace isopeptídico
CIAP: inhibidor celular de la proteína de la apoptosis.