A typical cartoon rendering of the effects of freezing at slow to moderate rates is shown in Figure 5, below.

This scenario is accurate in that it correctly shows that under these conditions, ice forms
first outside of cells, and the ice crystals consist of pure water.[30] Ice begins forming outside of cells rather than inside of them for at least two reasons. First, the concentration of dissolved materials in
the water inside cells is much higher than that present in the water outside of the cells (in the extracellular space). These concentrated materials, primarily salts, such as phosphates and potassium
chloride, exert a small amount of antifreeze activity, depressing the freezing point of the intracellular milieu about a degree Celsius (C) below that of the extracellular fluid.[31, 32]

Squashed frozen cells versus those frozen in cryoprotectant

Principios físico-químicos de la preservación en
frío
La preservación en frío se basa en el hecho de que las reacciones químicas
(metabólicas) ocurren más lentamente a medida que desciende la temperatura.
Según esto, a temperaturas por debajo de -140 ºC toda actividad biológica se
detiene. Sin embargo, también ocurre que antes de llegar a estas temperaturas la
muestra en cuestión es incapaz de resistir el proceso de enfriamiento y muere o
en el caso de las carnes reducen su calidad.

Desde que se iniciaran hace 50 años los primeros experimentos de preservación

en frío se ha avanzado mucho en el conocimiento de los procesos que tienen
lugar cuando se enfría una muestra biológica consistente en un conjunto de
células aisladas en suspensión (así como en tejidos y órganos), sobre todo en
células reproductoras. Esto ha permitido diseñar estrategias de conservación que
consiguen que el frío no resulte particularmente dañino a las estructuras internas
de la célula. En este caso, estas estrategias están basadas en la adición de agentes
protectores (frente al frío) a la vez que en la optimización de las velocidades de
enfriamiento y recalentamiento.

A groso modo, la explicación última de los procesos físico-químicos que tienen

lugar en una célula cuando se enfría se basa en la llamada hipótesis de los dos
factores, desarrollada en 1963 por Peter Mazur [P. Mazur, 1963] y que
esbozaremos seguidamente.

Una célula, a efectos de lo que ahora nos ocupa, es básicamente un pequeño saco
que encierra una disolución de agua y sales. El "material" del que está hecho este
"saco" es lo que se llama una membrana semipermeable, un tejido especial que
sólo deja pasar el agua a través de él, pero no las sales que tiene disueltas, de ahí
su nombre. Por ello, cuando el agua sale o entra en la célula la concentración de
las sales disueltas aumenta o disminuye.

Bastan dos principios físicos para explicar lo que le ocurre a la célula mientras se
enfría: el principio de ósmosis y el principio de descenso del punto de
congelación.

El principio de ósmosis nos dice que cuando tenemos un saco (célula)

semipermeable de este tipo sumergido en otra disolución salina, entonces el agua
empieza a fluir en un sentido tal que tiende a igualar las concentraciones de las
disoluciones. O sea, si sumergimos la célula en una disolución de sales más
concentrada que el interior celular, entonces el agua (y sólo el agua) sale de la
célula; esta, por lo tanto, se encoge y reduce de volumen. Si, por el contrario,
sumergimos la célula en una disolución más diluida que el interior celular,
entonces empezará a entrar agua dentro de la célula intentando diluir también la
disolución salina de su interior; el resultado es que la célula se hincha.

El principio de descenso del punto de congelación nos dice que si tenemos agua
pura y disolvemos sales en ella, entonces el agua no se congelará a 0º C, sino por
debajo de esta temperatura; a una temperatura tanto más baja cuanto más
cantidad de sal hayamos disuelto en ella. Un ejemplo de este fenómeno, por
todos conocidos, es el que se produce cuando evitamos el deterioro del radiador
de nuestro automóvil al añadirle anticongelante.

Cuando tenemos un conjunto de células que queremos conservar en frío,

inicialmente las células se tienen sumergidas dentro de un recipiente que contiene
una solución salina isotónica, es decir, con la misma concentración que el interior
celular. Cuando se empieza a enfriar este preparado, el frío alcanza antes la
solución exterior que el interior celular. Esto trae como consecuencia que se
empiece a formar hielo en el medio extracelular cuando aún no se ha formado
hielo dentro de la célula. A medida que se forma el hielo extracelular el agua
líquida va desapareciendo (¡va convirtiéndose en hielo!). Al disminuir la cantidad
de agua exterior, en base al principio de ósmosis antes enunciado, empezará a
salir agua de la célula para compensar la posible diferencia entre las
concentraciones intra y extracelulares.

Al salir agua de la célula, la sal que estaba disuelta en su interior empezará a

estar más concentrada: tanto más concentrada cuanto más agua salga. Y es aquí
cuando interviene el segundo principio, el principio de descenso del punto de
congelación. Y es que al estar más concentrada la disolución salina intracelular,
la temperatura a la que se formará hielo desciende: será más difícil que el agua de
dentro de la célula se congele y dañe sus estructuras. Así, mientras enfriemos
poco a poco, el proceso continuará indefinidamente: crecerá el hielo extracelular,
saldrá agua de la célula para compensar las concentraciones salinas dentro y
fuera, se concentrará la sal dentro de la célula y descenderá aún más la
temperatura necesaria para que se forme hielo dentro. Por ello, con una velocidad
de enfriamiento suficientemente lenta podemos evitar por completo la formación
del dañino hielo intracelular.

La no formación de hielo mediante este procedimiento no es sinónimo de

supervivencia celular. Y es que aunque no se forme hielo aparecen dos nuevos
factores que perjudican gravemente a la célula. Por una parte está el hecho de que
en cierto instante la concentración de sales dentro de la célula llega a ser tan alta
que resulta muy tóxica. Por otra parte, al salir tanta agua de la célula su volumen
disminuye peligrosamente, produciendo deformaciones estructurales
irreversibles. Estos dos factores son tanto o más perjudiciales que la formación
de hielo intracelular. En la Fig. 1 se muestran de forma esquemática los tipos de
daños según la velocidad de enfriamiento. Por ello, en los protocolos de
preservación de células aisladas hay que enfriar a una velocidad que sea lo
suficientemente lenta como para evitar en lo posible la formación de hielo
intracelular, pero a su vez, lo suficientemente rápida como para no producir una
deshidratación excesiva que conlleve una destrucción irreversible de la estructura
celular. Esto da lugar a que el perfil que aparece cuando representamos el
porcentaje de células que sobreviven a un proceso de preservación en frío frente
a la velocidad de enfriamiento sea típicamente el de una U invertida, tal como se
muestra en la Fig. 2.
Fig. 1. La formación de hielo comienza en el exterior celular (de -2º C a -5º C).
Tras ello, dependiendo de la velocidad de enfriamiento, se pueden producir
distintos resultados. A) Si el proceso de enfriamiento es suficientemente lento,
entonces NO se forma hielo dentro de la célula. Sin embargo las causas de la
muerte celular vienen provocadas por una excesiva deshidratación de esta, que
da lugar a una reducción de su volumen (en algunos casos irreversible). B) Si se
enfría a una velocidad intermedia entonces sí se produce hielo intracelular, ya
que la célula no se deshidrata suficientemente y por tanto el descenso del punto
de congelación no llega a ser el necesario. C) Cuando se enfría a velocidades
muy altas se produce vitrificación.
Figura 2. Supervivencia de los distintos tipos de células en función de la
velocidad de enfriamiento. Se observa el típico comportamiento de U invertida
en todas ellas. Como se explica en el texto, esto es debido a la llamada hipótesis
de los dos factores (toxicidad-sobreenfriamiento) que hacen que sea necesario un
compromiso entre la velocidad de enfriamiento y el grado de deshidratación
celular..

Por último, y como hablamos al principio, hemos de aclarar que aunque la

mayoría de los experimentos se han hecho en el régimen de velocidades de
enfriamiento antes señalado, a veces existe la posibilidad de velocidades de
enfriamiento de decenas de miles de grados por segundo. Estas velocidades tan
altas consiguen la vitrificación, lo que conlleva la no formación de hielo a la vez
que la no deshidratación celular. Aun cuando esta técnica no es en principio
aplicable a un órgano (dada la conductividad térmica finita de este), si que ha
podido ser implementada en unos casos muy concretos, comprobándose la
validez de dicha hipótesis. El ejemplo por antonomasia es el del Saccharomyces
Cerevisiae [F. Dumont et al., 2001]. En la Fig. 3 se muestra cómo a velocidades
de enfriamiento del orden de 50.000 ºC/min se recobra de nuevo un alto
porcentaje de supervivencia celular.
Figura 3. Resultados de la supervivencia de Saccharomyces Cerevisiae en función de las
distintas velocidades de enriamiento. Se observa cómo, para muy altas velocidades es
posible llegar a impedir la formación de hielo mediante vitrificación.

Comprendidos, al menos cualitativamente, los mecanismos que acompañan el enfriamiento

de una célula, el siguiente reto es intentar aprovechar este conocimiento para diseñar
estrategias de conservación que eviten la formación de hielo, y la toxicidad y las
deformaciones extremas. Las estrategias diseñadas hasta la fecha y que han dado muy buen
resultado en ciertos casos notables (óvulos, esperma, piel, huesos, etc...) se basan en la
adición de crioprotectores (anticongelantes). Su función es doble. Por un lado al ser
añadidos a la célula hacen que la solución interior esté más concentrada y por tanto sea más
difícil de congelar (principio de descenso del punto de congelación). Por otro lado, las sales
intracelulares no estarán tan concentradas, ya que ahora, además de estas, tendremos
anticongelantes disueltos y por tanto las concentraciones salinas no llegan a niveles tan
tóxicos como si estos anticongelantes no estuvieran presentes.

El éxito del proceso de preservación en frío depende de la capacidad para optimizar todos
los parámetros puestos anteriormente de relieve: la velocidad de enfriamiento, la
concentración de crioprotectores, el tipo de crioprotector a utilizar, el tiempo de
almacenamiento, la temperatura última de almacenamiento, la forma de recuperación
(recalentamiento), etc. Y para ello es fundamental explorar ciertos detalles relacionados
tanto con la fisiología celular (permeabilidad al agua, a los crioprotectores, resistencia de la
membrana celular, control del tamaño de sus poros, etc...) como con las propiedades físico-
químicas de los crioprotectores (punto de congelación, viscosidad, toxicidad, etc...) .

En lo tocante a células aisladas, la situación actual es que se ha podido preservar con éxito
un conjunto importante de tipos de celulares, pero aún existen otros muchos en los que por
desconocimiento de parámetros tan importantes como la permeabilidad de la membrana,
por ejemplo, los resultados son aún escasos.

En lo que se refiere a la conservación de tejidos y órganos, los principios de conservación

en frío son los mismos que los aplicables al caso de células aisladas. Sin embargo, desde el
punto de vista técnico aparece una dificultad añadida que hace que esta empresa sea aún
más complicada: el hielo extracelular. El hielo extracelular, del que nos despreocupábamos
en el caso de células aisladas, es ahora el principal problema. En el caso de células aisladas,
cuando los cristales de hielo extracelular van creciendo, van desplazando a las células hacia
los lugares que aún se encuentran libres de hielo. En el caso de un órgano, las células que lo
componen no están libres, de forma que no se pueden reubicar. Así, estos cristales de hielo
hacen las veces de auténticas lanzas que al crecer van rompiendo y des-estructurando todo
el tejido u órgano en cuestión, destruyéndose irremisiblemente.

Por lo dicho en el párrafo anterior, lo conservación de tejidos y órganos en frío requiere

eliminar la formación de hielo extracelular. Podría ingenuamente pensarse que la solución
al problema está en la adición de agentes crioprotectores, tal y como se hace en el caso de
células aisladas. Sin embargo aquí el problema es mucho más complejo, debido sobre todo
a la conductividad térmica finita del órgano. Cuando se calcula la concentración de
crioprotector necesaria para evitar la formación de hielo en el órgano se encuentra que está
entorno a 8 molar, cantidad que resulta prohibitivamente tóxica para el caso de los
crioprotectores convencionales. Pensamos que el problema debe ser atacado por distintos
flancos. Por otro lado hemos de evitar los fuertes gradientes de temperatura cuando se
enfría el órgano, lo que conlleva una perfusión por su sistema vascular. Además habrá que
introducir el crioprotector de forma controlada, ya que este es tanto menos tóxico cuanto
más frío esté el órgano. Para hacer un diseño óptimo de este protocolo resulta fundamental
conocer de antemano el campo de temperaturas que presentará el órgano, ya que de otra
forma la gran cantidad de parámetros experimentales haría imposible optimizar el proceso.
Además, parece lógico que el diseño de crioprotectores de baja toxicidad, gran penetración
y elevada temperatura de vitrificación ayudaría enormemente.

En el resto de esta memoria se desarrolla el proyecto que queremos elaborar.

Revisado: 14/02/2002 .

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