Buntenkötter et al.

BMC Veterinary Research ( 2017) 13:28

DOI 10.1186 / s12917-017-0955-1

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Acceso abierto

farmacocinética y in vitro eficacia del ácido salicílico

después de la administración oral de ácido acetilsalicílico
en los caballos
Kathrin Buntenkötter 1, Maren Osmers 1, Ina Schenk 2, Wilhelm Schanzer 2, Marc Machnik 2, Michael Düe 3
y Manfred Kietzmann 1 *

Resumen

Fondo: Aunque el ácido acetilsalicílico (ASA) no se utiliza con frecuencia como un agente terapéutico en los caballos, su metabolito SA es de especial interés en la
equitación ya que es un componente natural de muchas plantas utilizadas como alimentación del caballo. Esto llevó al establecimiento de umbrales por las
organizaciones deportivas caballo por SA en la orina y plasma. El objetivo de este estudio fue investigar las concentraciones plasmáticas y en orina de ácido salicílico
(SA) después de la administración oral de tres dosis diferentes individuales (12,5 mg / kg, 25 mg / kg y 50 mg / kg) de ácido acetilsalicílico (ASA) a ocho caballos en
un cross-over diseñado estudio.

resultados: En el grupo de 12,5 mg / kg, las concentraciones de SA en la orina alcanzó su punto máximo 2 h después de la administración oral (2675 μ g / ml); las
concentraciones en plasma alcanzaron un máximo de 1,5 h (17 μ g / ml). En el grupo de 25 mg / kg, se detectaron concentraciones máximas después de 2 h (orina, 2785 μ g /
ml) y 1,5 h (plasma, 23 μ g / ml). En el grupo de 50 mg / kg, se observaron concentraciones máximas después de 5 h (orina, 3915 μ g / ml) y 1,5 h (plasma, 45 μ g / ml). La
vida media en plasma calculada para SA varió entre 5,0 y 5,7 h. La concentración de la orina de SA cayó por debajo del umbral de 750 μ g / ml (establecido por la
Internacional ecuestre Federación FEI y la mayoría de las autoridades de carreras de caballos) entre 7 y 26 h después de la administración de 12,5 y 25 mg / kg de ASA y
entre 24 y 36 h después de la administración de 50 mg / kg ASA. Para ASA, IC 50 fueron 0,50 μ g / ml (COX-1) y 5,14 μ g / ml (COX-2). Para el ácido salicílico, no fue posible
calcular un IC 50 ya sea para la COX debido a la insuficiente inhibición de las dos ciclooxigenasas.

Conclusión: Los umbrales SA establecidos de 750 μ g // orina ml y 6,5 μ plasma g / ml aparece demasiado generoso y están dejando espacio para el mal uso
del compuesto anti-inflamatorio y analgésico ASA en caballos.

palabras clave: ácido acetilsalicílico, ácido salicílico, COX-inhibición, farmacocinética, Caballos

Fondo
El ácido salicílico (SA) es uno de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos
(AINE) más antiguos y se ha utilizado como un agente antipirético y en eventos
reumáticos agudos en los seres humanos durante mucho tiempo [1]. También en
la medicina veterinaria, se ha administrado en casos de enfermedad de las
articulaciones en perros y caballos [2]. El ácido acetilsalicílico (ASA) se sintetizó a
tener los mismos efectos que SA con un mejor perfil de tolerabilidad gástrica y
sistémica [3]. Después de la administración, ASA se convierte rápidamente en SA
[4]. Además, ASA es sensible a
* Correspondencia: manfred.kietzmann@tiho-hannover.de
1 Instituto de Farmacología, Toxicología y Farmacia, Universidad de Medicina Veterinaria de
metanol, calor, cambio de pH y otros factores. Por lo tanto, ASA sí mismo no se puede
detectar con una precisión suficiente, ya que se disocia a SA y ácido acetálica, incluso
durante el almacenamiento de muestras y el análisis LC-MS. A pesar de que ASA no se
utiliza con frecuencia como un agente terapéutico en los caballos, su metabolito SA es
de especial interés en la equitación, ya que es un componente natural de muchas
plantas utilizadas como alimento para caballos, heno de alfalfa o por ejemplo, corteza
de sauce. Por lo tanto, las concentraciones de SA se pueden encontrar en muestras de
sangre y orina de los caballos después del consumo de cualquiera de estas plantas [5].
Esto llevó al establecimiento de umbrales por las organizaciones deportivas caballo por
SA en la orina y plasma para evitar casos de dopaje positivo debido a la ingesta
accidental de piensos, lo que resulta en falso positivo. La Federación Ecuestre
Internacional (FEI) y la mayor parte del

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Las autoridades de carreras de caballos (por ejemplo en Europa, USA) han
establecido umbrales SA a 750 μ g / ml en orina y 6.5 μ g / mL en el plasma [6].
Estos niveles de umbral se basaron en varios estudios [5, 7, 8], en el que la
concentración media de orina de SA era dependiente de la caballo ' s dieta y el
país de origen. Sin embargo, los umbrales se establecieron sobre una base
estadística arbitraria y no extrapolarse a partir de cualquier concentración en
plasma o la orina irrelevante como propuesto por Toutain y Lassourd [9].
El estudio presentado como objetivo investigar intervalos de tiempo
promedio transcurrido hasta que las concentraciones de plasma y orina caen
por debajo del umbral después de la administración oral de diferentes dosis
de ASA. dosis ASA recomendados para caballos en la literatura varían entre
5 y 100 mg / kg y de dos veces al día a cada otro día [10]. principales
indicaciones son procesos inflamatorios, dolor y fiebre. En este estudio
diseñado cruzado,
ocho caballos recibieron
12,5 mg / kg, 25 mg / kg, y 50 mg / kg de ASA por vía oral una vez al día. Las
muestras de sangre y de orina se analizaron a través de HPLCMS / MS. Además,
para evaluar la eficacia de los salicilatos en COX-1 y la inhibición de la COX-2 en
caballos, la IC 50, es decir, la concentración de fármaco necesaria para inhibir el 50%
de la actividad de la COX in vitro, se determinó para ASA y SA en un ensayo de
sangre entera.
métodos
estudio farmacocinético
animales
El protocolo de estudio en animales fue aprobado por la administración
regional del cuerpo gubernamental (LAVES; Baja Sajonia, Alemania;
33.9-42502-04-11 / 0512). Ocho caballos Standardbred (4 yeguas, 4 castrados,
12,4 ± 3,2 años de edad; 656 ± 95 kg de peso corporal) se utilizaron en este
estudio. Los caballos fueron alojados en establos de Serumwerk Memsen,
WDT, Alemania (dueño de los caballos) con ropa de cama de paja y
participación diaria. Se alimentaron con una dieta libre de contaminación SA
detectable que consta de heno, hierba, remolacha y agua ad libitum. Todos los
caballos estaban sanos sobre la base de un examen clínico antes del estudio.
estudio en animales
Se eligieron tres dosis de ASA: 12,5 mg / kg, 25 mg / kg, y 50 mg / kg de
peso corporal una vez al día. Caballos recibieron dosis orales únicas de
polvo ASA (Pyrinagil®, Veyx, Schwarzenborn, Alemania) mezclado con el
jarabe en 100 jeringas ml. El estudio se realizó en una de 4 vías,
3-tratamiento diseño cruzado con un período de lavado de al menos 2
semanas. Las muestras de sangre fueron extraídas en tubos de heparina de
litio en los siguientes puntos de tiempo: - 24, - 21, - 18 (muestras en blanco),
0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 12,
14, 16, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h después del tratamiento. Se
separó el plasma tras la centrifugación (10 min a 1400 × g) inmediatamente
después de la retirada. Tres muestras de orina en blanco (muestreada
durante emiction espontánea)
Página 2 de 10
se tomaron de cada caballo entre las 24 y 18 h antes del tratamiento. Las
muestras de orina se tomaron a los 2, 5, 7, 12, 24,
36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 192 h después del tratamiento para cada dosis
probada; para 50 mg / kg de ASA, una muestra adicional se tomó después de 216
h. Ambos, las muestras de orina y plasma se almacenaron a - 20 ° C hasta (tiempo
de almacenamiento de 4 semanas) análisis.
Cuantificación de SA en la orina y plasma
Inicialmente, se había previsto para medir ASA y SA en muestras de orina
y plasma. Sin embargo, esto no fue factible como ASA resultó ser sensible
a metanol, calor, cambio de pH y se disoció continuamente para SA,
incluso durante el análisis de LC-MS. ASA no podría por lo tanto ser
detectada con precisión suficiente para que se decidió convertir todo ASA
a SA y para medir salicilatos totales en plasma y la orina mediante el
aumento del pH a 13 - 14. Dado que SA es el principal metabolito de la
ASA, se cuantificaron no hay otros metabolitos tales como el ácido
gentísico o salicilúrico. La cuantificación de la SA se basa parcialmente en
los métodos descritos anteriormente [11] y logradas por una calibración
estándar interno. concentraciones SA se determinaron utilizando el área
del pico cromatográfico de relaciones / concentración y análisis de
regresión lineal para relaciones de área de SI.
Materiales y productos químicos
acetato de amonio, ácido acético glacial, hidróxido de potasio, sodio
dihidrógeno fosfato-monohidrato, di-fosfato de sodio hidrógeno y metanol
(grado analítico) se obtuvieron de Merck (Darmstadt, Alemania);
acetonitrilo (grado HPLC) fue adquirido de VWR (Darmstadt, Alemania).
cartuchos de Oasis ® HLB SPE (60 mg, 3 ml) se adquirieron de Roche
(Mannheim, Alemania). agua desionizada fue de grado Milli-Q. SA y el
patrón interno D 4- SA se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Alemania) y
Toronto Investigación de Sustancias Químicas (North York, Canadá),
respectivamente. Para las curvas de calibración, la orina de los caballos
con concentraciones conocidas de SA, así como plasma de donantes
equino disponible comercialmente reunidas se utiliza (Sera Laboratories
International, West Sussex, Reino Unido).
la preparación de muestras de plasma
Para muestras de plasma, un método de inyección directa publicado por
Thomas et al. [12] fue modificado. a 500 μ L Milli-Qwater y 1 μ g del estándar
interno D4-SA 500 μ se añadieron l de plasma. Las muestras tomadas hasta 6 h
(12,5 y 25 mg / kg) y hasta 8 h después de la administración ASA se diluyeron
1: 5 en Milli-Q-agua antes de la preparación de muestras. Para la precipitación
de proteínas, se añadieron 1,5 ml de acetonitrilo y se mezcló suavemente.
Después de la centrifugación (10 min, 3000 U), 20 μ L de KOH (5 mol / L) se
añadieron al sobrenadante para alcalinizar la muestra a pH 13 - 14 durante 20
min en orden
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para hidrolizar todos ASA a SA. Para hacer que el pH compatible con la
columna de HPLC, la muestra se ajustó a pH 1 - 2 mediante la adición de 20 μ L
HCl (6 mol / L) y se centrifugó de nuevo (10 min, 1400 g). 200 μ alícuotas L se
utilizaron para el análisis de HPLC-MS / MS.
preparación de la muestra de orina
La preparación de la muestra para el análisis cuantitativo de SA se realizó
siguiendo el método descrito por Schenk et al. [11] e incluyó una extracción
en fase sólida. Brevemente, 2 μ se añadieron g de la interna estándar D4-SA
a 100 μ L de orina y 900 μ L de Milli-Q-agua. Las muestras tomadas durante
las primeras 24 h después del tratamiento se diluyeron 1:10 en Milli-Q-agua
(12,5 mg / kg y 25 mg / kg), mientras que las muestras del grupo de 50 mg /
kg se diluyeron 1:50. Para hacer cumplir la hidrólisis de cualquier ASA
restante para SA, el pH se ajustó a 13 - 14 mediante la adición de 40 μ L
KOH (1 mol / l). Después de 20 min un ajuste a pH 7 se logró mediante la
adición de 0,2 ml de tampón fosfato (Na 2 HPO 4 / NaH 2 correos 4, 0,8 mol / l).
Después de la centrifugación (5 min, 500 g), extracción en fase sólida se
realizó con condicionado Oasis® HLB 3 cc (60 mg) cartuchos de extracción
(Waters corp., Milford, MA, EE.UU.). Las muestras fueron luego se
evaporaron a sequedad en un evaporador rotatorio y residuos secos se
disuelven en 200 μ L de acetato de amonio / acetonitrilo (30:20, v / v) para la
inyección de HPLC-MS / MS.
cromatografía Instrumentación-líquido
El sistema de cromatografía líquida comprendía una serie Agilent 1100
LC (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). separación del analito
(muestras de plasma y orina) se logró con una columna Nucleodur
Pyramid (70 x 4 mm, 5 μ m tamaño de partícula) de Macherey-Nagel
(Düren, Alemania). Para muestras de plasma, un Gemini C 6
columna de seguridad de fenilo (4 x 2 mm) se añadió (Phenomenex,
Aschaffenburg, Alemania). El tampón de acetato de amonio comprendida
fase móvil (5 mmol / l de acetato de amonio, 0,1% de ácido glacial en agua
MilliQ, pH 3,5; disolvente
A) y acetonitrilo (disolvente B). El siguiente gradiente de fase móvil
programada se utilizó para la separación de analitos: gradiente B 0 - 100% en 7
min, se mantuvo durante 1 min a 100% de B, tiempo de reequilibrado a 0% de
B durante 3 min, tiempo de ejecución 11 min. El caudal de la fase móvil era
800 μ L / min. El tiempo de retención fue de 5,2 min.
espectrometría de masas Instrumentación
Análisis de masas se realizó en un espectrómetro de masas API
triplequadrupole 3200 (AB Sciex, Darmstadt, Alemania), equipado con una
interfaz de ionización por electrospray (ESI). Las muestras se midieron en el
modo de funcionamiento negativo a una temperatura de interfaz 450 ° C con
una tensión de pulverización de iones de - 4500 disociación inducida por
colisión V. con nitrógeno se realizó a una presión de gas de colisión de 2,9 ×
10 - 3 Pa. Se detectaron iones de diagnóstico
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en el modo de monitorización de reacción múltiple (MRM). Los iones de
transición monitorizados para SA eran m / z 137 → - 93; m / z 137 → - sesenta y
cinco; m / z 137 → - 41; m / z 137 → - 75; aquellos para los d 4- SA eran m / z 141 → - 97;
y m / z 141 → - 69. El ion cuantificar para muestras de orina fueron m / z 137 →
- 75 (energía de colisión - 38 eV) y m / z 137 → 65 (energía de colisión - 40
eV) para el plasma, respectivamente. adquisición y análisis de datos se
realizaron con el software Analyst (versión 1.4.2, AB Sciex).
validación del método
El método fue validado de acuerdo con las directrices del Comité Científico
de Enlace de carrera de caballos Europea [13]. parámetros de validación
eran selectividad, recuperación, linealidad, límite de cuantificación, límite de
detección, la estabilidad del analito, la precisión y la exactitud. El rango de
calibración fue de 5 a 250 μ g / ml (muestras de orina) y de 0,3 a 20 μ g / ml
(muestras de plasma).
La recuperación sólo se calculó para la orina, como las concentraciones plasmáticas
se determinaron mediante inyección directa. Para probar la estabilidad, las muestras
de control de calidad se almacenaron bajo las mismas condiciones que las muestras
después de la administración de un mínimo de 4 semanas.
El análisis farmacocinético
Los parámetros farmacocinéticos de SA en plasma se calcularon con
WinNonlin® 5.3 (Pharsight, Mountain View, EE.UU.), utilizando un análisis no
compartimental. Debido a que la concentración de SA en muestras de plasma
de los caballos no tratados fue a continuación de la LLOQ (0,3 μ g / ml), los
valores absolutos fueron utilizados para el cálculo PK. Se obtuvo la siguiente
información: C max, T max, aclaramiento (Cl / F), MRT, constante de velocidad de
eliminación, la vida media λ z y AUC último.
estudio farmacodinámico, la COX-1 ensayo, la COX-2 de ensayo
Materiales y productos químicos
Los compuestos utilizados para el estudio farmacodinámico eran ASA y
SA (todo Aldrich Sigma, Munich, Alemania). Sustancias se diluyeron en
dimetilsulfóxido (DMSO; Merck, Darmstadt, Alemania) en
concentraciones de 0,1 a 1000 mmol / L. (LPS Escherichia coli O111: B4)
utilizado para la COX-2 ensayos se obtuvo de Sigma Aldrich, Munich,
Alemania. Las muestras se analizaron para tromboxano B 2 y la
prostaglandina E 2 concentraciones utilizando inmunoensayos enzimáticos
(Cayman Chemicals, Ann Arbor,
MI, EE.UU.).
Animales y diseño del estudio
De acuerdo con Brideau et al. [ 14] y McCann et al. [15], la inhibición de
COX-1 se cuantificó por cada sustancia ' s capacidad para inhibir la
formación de coágulo inducida por tromboxano B 2 ( TXB 2) el uso de sangre
de seis caballos clínicamente sanos de sangre caliente (cinco yeguas y un
caballo). A
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evaluar COX-2 inhibición, inducida por LPS La prostaglandina E 2 tabla 1 Precisión y exactitud del método analítico, resumen de los
(PGE 2) la producción se midió. resultados para plasma y orina

Concentración ( μ g / precisión intradía (%) ( n de precisión entre días Exactitud (%) ( n

ml) = 6 por conc.) (%) ( n = 18 por conc.) = 6 por conc.)

Ensayo in vitro
plasma 1
Para el ensayo de COX-1, se extrajo sangre por punción venosa yugular
4.6 10.3 2.3
en tubos de vacío que no contienen anticoagulante (Greiner Bio-One,
Frickenhausen, Alemania). Inmediatamente después, las alícuotas de 5 4.8 1.1 4.8

sangre (500 μ L) se transfirieron en tubos de polipropileno preparadas con 10 3.1 3.4 1.6

5 μ L de vehículo (DMSO), ASA o SA a concentraciones finales de La orina

10 5.1 13.0 6.3

0,1, 1, 10, 100, o 1000 μ prostituta. Después de mezclar, los tubos se incubaron
50 3.4 4.5 5.1
durante 1 h a 37 ° C para permitir que la sangre se coagule. Las muestras se
200 8.8 3.2 2.2
centrifugaron a 4 ° C y 2.000 × g durante 10 min. Los sobrenadantes se
almacenaron a - 80 ° C hasta el análisis.
análisis estadístico
Para el ensayo de COX-2, plasma fue dibujado en tubos de heparina Los datos se analizaron con un programa de software disponible en el mercado
de litio (Vacutainer, BD, Heidelberg, Alemania). Alícuotas de 500 μ L se (software GraphPad Prism 5.03; GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA,
transfirieron a tubos de polipropileno y se preincuba con 10 μ L LPS EE.UU.) mediante el uso de un análisis de las medidas de una sola
disueltos en tampón fosfato salino (100 μ g / ml). Después de 5 min de wayrepeated de varianza seguido por el de Bonferroni post hoc prueba. Valores
incubación a 37 ° C, ASA o SA se añadieron. Un periodo de incubación de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. La concentración
adicional de 24 h a 37 ° C seguido. Una parte alícuota de la sangre no se que conduce a una inhibición del 50% de la actividad de la COX (IC 50) se calculó
incubó con LPS y se utiliza como control. Las muestras se centrifugaron con WinNonlin® Professional Edition, Versión 5.3, Efecto inhibidor sigmoide
como se describe anteriormente y los sobrenadantes se almacenaron a Imax Modelo (Pharsight, Mountain View, EE.UU.).). El control del vehículo se
utiliza como línea de base (0% de inhibición).

- 80 ° C. Un pre-incubación con un inhibidor de la COX-1 no se incluyó en

el ensayo de COX-2 realizado. Después de la descongelación, las
muestras se diluyeron en tampón EIA (1:10) y se usaron directamente resultados

para los inmunoensayos sin una extracción preliminar. Los Validación del método analítico
inmunoensayos se llevaron a cabo según el fabricante ' s instrucciones Identificación de SA fue asegurada por su tiempo de retención específico y
(Dynatech Lector de microplacas, Dynatech Laboratories, Denkendorf, cuatro transiciones de iones característicos. Como no se disponía de SA orina de
Alemania). caballo libre y plasma, los rastros de SA podrían ser detectados en cada
muestra. Sin embargo, el SA

Figura 1 Los valores medios (± SD) de las concentraciones de SA en el plasma de los caballos después de una dosis oral única de 12,5 mg / kg BW ( n = 8). línea de negro = Valores> Límite inferior de cuantificación. Gray Line = valores <LLOQ. La

línea punteada = LLOQ. La línea de puntos = concentración umbral (FEI)

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Figura 2 Los valores medios (± SD) de las concentraciones de SA en la orina de los caballos después de una dosis oral única de 12,5 mg / kg BW ( n = 8). línea de negro = Valores> Límite inferior de cuantificación. Gray Line = valores <LLOQ. La

línea punteada = LLOQ. La línea de puntos = concentración umbral (FEI)

concentraciones eran en su mayoría por debajo de la LLOQ y podrían ser fácilmente Las concentraciones en plasma y orina de SA después de la administración oral de

discriminadas de las muestras enriquecidas. Las muestras de plasma y orina ASA

sobrecargadas con SA que se habían almacenado en las mismas condiciones que
las muestras después de la administración, el almacenamiento a - 20 ° C durante
cuatro semanas no mostró ninguna diferencia significativa en la degeneración analito
(onetailed T- prueba). La recuperación se calculó en 51% en la orina.
Las curvas de calibración se encontraron lineal en plasma y orina relativa
a los intervalos de concentración especificados. El LLOD se estimó en 1 μ g /
ml para la orina y 0.1 μ g / ml para plasma. El LLOQ se determinó a 5 μ g / ml
para la orina y 0.3 μ g / ml para plasma. Resumen de resultados de
precisión y exactitud se enumeran en la Tabla 1.
12,5 mg / kg de ASA: Las concentraciones plasmáticas máximas (C max) entre
14,5 y 26,9 μ g / ml se midieron
0,5 h a 1,5 h después de la administración de ASA. Sólo en un caballo C máx se
alcanzó ocho horas después del tratamiento. Las concentraciones
plasmáticas disminuyeron por debajo del umbral establecido de 6,5 μ g / mL
entre 6 y 16 h después del tratamiento. Los niveles basales de SA se
midieron de 36 a 48 h después del tratamiento (Fig. 1). En la orina, se
alcanzaron las concentraciones máximas SA entre 2 y 7 h después de la
administración de ASA, con resultados que varían entre 699 y 10.200 μ g / mL.
Valores cayeron por debajo del umbral de 750 μ g / mL entre 7 y 26 h después
de la administración.

Fig. 3 Los valores medios (± SD) de las concentraciones de SA en el plasma de los caballos después de una sola vía oral línea Negro = valores> LLOQ. Gray Line = valores <LLOQ. La línea punteada = LLOQ. La línea de

puntos = concentración umbral de dosis (FEI) de 25,0 mg / kg BW ( n = 8)

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Fig. 4 Los valores medios (± SD) de las concentraciones de SA en la orina de los caballos después de una dosis oral única de 25,0 mg / kg BW ( n = 8). línea de negro = Valores> Límite inferior de cuantificación. Gray Line = valores <LLOQ. La

línea punteada = LLOQ. La línea de puntos = concentración umbral (FEI)

Uno de los caballos no superó el umbral de orina SA en absoluto (Fig. 2).
25 mg / kg de ASA: C máx se alcanzó entre 0,5 y 6 h después de
administrartion (19,1-37,8 μ g / ml), mientras que las concentraciones
plasmáticas caído por debajo del umbral de 6,5 μ g / ml SA entre 12 y 24 h.
Entre 36 y 48 h después de los niveles de tratamiento basales se alcanzaron
en todos los caballos (Fig. 3). Todos los caballos mostraron la mayor
excreción urinaria de SA entre 2 y 5 h después del tratamiento, con valores
1550-7640 μ g / ml SA. Entre 7 y 24 h después de la administración, todos los
caballos presentados niveles SA de orina por debajo del umbral (Fig. 4).
50 mg / kg de ASA: niveles de plasma SA alcanzaron un máximo entre 1 y 6
h después de la administración (35,1-62,7 μ g / ml). Los niveles plasmáticos
cayeron por debajo del umbral en 12 h ( n = 2), 14 h ( n = 1), 24 h ( n = 3) y 36 h ( n
= 2) después de la administración. Los niveles basales se pudieron observar
otra vez entre 36 y 48 h después de la administración (Fig. 5). urinario máximo
concentraciones SA se midieron entre 2 y 7 h (2810 a 9640 μ g / ml). Valores
cayeron por debajo del umbral entre 12 y 36 h (Fig. 6). Un aclaramiento
plasmático (Cl / F) de 82,2 ml ∙ h / kg, lo que resulta en una vida media
calculada de 5,2 h (12,5 mg / kg), 97,1 ml ∙ h / kg, con una vida media de 5,0 h
(25 mg / kg), y 114,0 ml ∙ h /

Fig. 5 Los valores medios (± SD) de las concentraciones de SA en el plasma de los caballos después de una dosis oral única de 50,0 mg / kg BW ( n = 8). línea de negro = Valores> Límite inferior de cuantificación. Gray Line = valores <LLOQ. La

línea punteada = LLOQ. La línea de puntos = concentración umbral (FEI)

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Fig. 6 Los valores medios (± SD) de las concentraciones de SA en la orina de los caballos después de una dosis oral única de 50,0 mg / kg BW ( n = 8). línea de negro = Valores> Límite inferior de cuantificación. Gray Line = valores <LLOQ. La

línea punteada = LLOQ. La línea de puntos = concentración umbral (FEI)

kg con una vida media de 5,7 h (50 mg / kg) se calcularon (Tabla 2). El
MRT varió entre 7,26 y 8,39 h.
estudio farmacodinámico
Con el fin de determinar IC 50 valores, la inhibición de la actividad COX-1 y
COX-2 se representó frente a diferentes concentraciones de ASA (Tabla 3
y Fig. 7). El control del vehículo se usó como la base de referencia (0% de
inhibición). El IC 50 de ASA fue 1,68 μ mol / L (0,50 μ g / ml, la COX-1) y
17.02 μ mol / L (5,14 μ g / ml, COX-2), respectivamente. sin IC 50 podría ser
calculado para SA debido a una insuficiente COX-inhibición (IC 50> 100 μ mol orina (blancos) de los caballos utilizados en el estudio descrito fue de menos
/ L (COX-1) y> 1.000 μ mol / L (Cox-2)).
Discusión
Un método para el análisis cuantitativo de SA en orina de caballo y
plasma ha sido desarrollado y validado. Debido a la inestabilidad
distintivo de ASA durante todo el proceso de almacenamiento de las
muestras, la preparación y el análisis, se decidió para convertir ASA
completamente a SA.
Tabla 2 datos de farmacocinética en plasma SA después de la administración oral de ASA (12.5,
Así, el origen de los valores SA analizados puede ser causada por un
medicamento con SA o ASA que se metaboliza a SA así como por SA como un
componente de alimentación de origen vegetal (heno de alfalfa, corteza de
sauce). Con un LLOD (LLOQ) de
0.1 μ g / ml (0,3 μ g / ml) el plasma el método es suficientemente sensible para detectar
una administración ASA, porque los valores de población medios de SA fueron
reportados a ser de aproximadamente
0.23 μ g / mL. El LLOD (LLOQ) para la orina se determinó que era 1 (5) μ g / ml
que es adecuado teniendo en cuenta el valor de la población promedio más
alta de 27,3 μ g / ml [11]. La concentración de SA en muestras de plasma y
de
0.3 μ g / ml de plasma y entre <5 y 51 μ g orina / mL. De acuerdo con
nuestros datos, ASA inhibe la COX-1 más potentemente que la COX-2,
con IC 50 valores de 1,68 μ mol / L y
17.02 μ mol / L, respectivamente. Este hallazgo es apoyado por el hecho de
que ASA es conocida sólo para inhibir la COX-1 irreversiblemente [16, 17]. El
IC 50 valores calculados para ASA confirman los resultados de otros no equino
donde ASA IC 50
valores de 1,67 a 4,45 μ mol / L para COX-1 y desde
5,34-15,9 μ mol / L para la COX-2 se describe [18 - 21]. Por el contrario,
Vane y Botting [22] calculan una

25.0, 50.0 mg / kg) a los caballos, media ±

Tabla 3 La inhibición de la COX-1 y COX-2 actividad (%) por ASA y SA; calculado en base a
SD de ocho caballos por tratamiento
ensayos in vitro (media ± SD de experimentos con muestras de sangre de equino de 6
Parámetro Unidades 12,5 mg / kg 25,0 mg / kg 50,0 mg / kg
caballos)
Cmax μ g / ml 19,75 ± 5,22 30,06 ± 7,44 51.66 ± 11.27
Concentración ( μ prostituta) COMO UN SA

Tmáx h 2,0 ± 2,5 2,5 ± 2,3 2,2 ± 1,7

COX I la COX II COX I la COX II

CI / F ml / h / kg 82,2 ± 18,4 97,1 ± 19,9 114,0 ± 31,9 0.1 9.1 ± 3.6 9,8 ± 4,6 19,6 ± 9,5 4,7 ± 2,3

AUC último HX μ g / ml 154,9 ± 31,8 264,9 ± 63,2 457,1 ± 114,8 1.0 30,8 ± 16,0 12,6 ± 8,3 13,0 ± 5,7 15,3 ± 9,3

λZ 1/h 0,145 ± 0,040 0,148 ± 0,041 0,145 ± 0,061 10.0 87,0 ± 11,5 37,9 ± 29,3 22,8 ± 10,0 10,3 ± 3,4

λZT½ h 5,1 ± 1,4 5,0 ± 1,3 5,7 ± 2,8 100,0 93,6 ± 10,3 60,9 ± 23,4 32,2 ± 21,1 - 4,7 ± 3,2

MRT h 7,26 ± 2,13 7,81 ± 1,70 8,39 ± 3,67 1000.0 92,7 ± 12,9 75,7 ± 32,7 65,8 ± 28,4 26,8 ± 11,3
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Fig. 7 La inhibición de la COX-1 (línea de color negro) y la COX-2 (línea discontinua) por ASA como resultado de ensayos in vitro realizados con sangre equina; media ± SD de 6 experimentos individuales
ASA IC 50 de 278 μ mol / L para la COX-2. SA no inhibió ya sea la COX
eficacia suficiente para calcular un IC 50 valor para las concentraciones
usadas en este estudio (hasta 1000 μ prostituta). Resultados similares han
sido reportados en otros estudios [18, 19, 21]. Sin embargo, puesto SA tiene
un efecto clínicamente probado [23] que tiene que haber otro modo de
acción. Una acción por medio de NF κ ácido B o gentísico se acaba de
mencionar, pero se ha propuesto ninguna función específica de estos
factores para explicar la actividad anti-inflamatoria de SA [21, 24].
En el control de dopaje el umbral internacional para el SA en plasma es de
6,5 μ g / mL. Esto significa que una confirmación SA sólo podrá ser reportada
como “ positivo ” si la concentración detectada está por encima de este límite.
Una concentración SA por encima de este umbral no puede ser explicado por
SA como un componente de alimentación. La medición de las concentraciones
de SA por debajo del nivel de umbral, no queda claro si la concentración de SA
medido es causada por un ASA o SA medicación o por SA como un
componente de alimentación [5, 11]. El estudio presentado excreción debe
declarar en qué punto se supera este umbral después de un medicamento
terapéutico de ASA. El umbral se superó por 30 min y ocho 8 h después de la
administración oral de 25 y 50 mg / kg de ASA, respectivamente. Veinticuatro
horas después de la administración de
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25 mg / kg y treinta y seis horas después de la administración de 50 mg / kg de
las concentraciones plasmáticas de todos los caballos estaban por debajo del
umbral de nuevo. La dosis inferior de 12,5 mg / kg que se pueden usar debido a
los efectos antitrombóticos de ASA, condujo a “ positivo ” concentraciones durante
12 h después de la administración. Así, el período de detección de una
administración ASA en una muestra de sangre es bastante corto. La detección
de un medicamento ASA es aún más difícil en muestras de orina cuando se
aplica el umbral de orina de 750 μ g / mL. Concentraciones superiores a este nivel
solamente se detectaron durante 24 h después de la 50 mg / kg y durante 12 h
después de la administración de la dosis 25 o 12,5 mg / kg. Después de la
administración de 12,5 mg / kg de un caballo no superar el umbral en absoluto.
Como el período de detección de un medicamento ASA (tiempo de SA por
encima del umbral) es menos de un día en casi todos los caballos de nuestro
estudio, que tiene que ser discutido si su efecto terapéutico puede ser controlado
adecuadamente con las normas existentes.
Broome et al. [4] se describe una rápida disminución de la concentración de ASA
después de administración intravenosa de
20 mg / kg de ASA a los caballos. La concentración de ASA estaba por debajo de
0,1 μ g / ml después de cuatro horas [4]. Comparando las concentraciones de ASA
medidos por Broome et al. (2003)
Buntenkötter et al. BMC Veterinary Research ( 2017) 13:28
con el IC 50 valores calculados en el estudio descrito, se puede concluir que un
efecto inhibidor de COX-1 puede ser alcanzado por un período de
aproximadamente 3 a 4 h. Una inhibición de la COX-2 se debe esperar por sólo
1,5 h. Hay indicios de que los salicilatos se acumulan en el líquido sinovial
después de la administración sistémica, como se ha demostrado in vitro por
Friebe et al. [25] que simula un tratamiento sistémico ASA con 20 mg / kg IV en
la extremidad distal equino perfundido aislado. Extrapolada de concentraciones
de líquido sinovial medidos en vitro, un efecto inhibidor de COX-1 se puede
esperar en la articulación durante aproximadamente 6 a 8 h (COX-1) y 2 h
(COX
2). Los resultados de la in vitro y en vivo estudios [26] indican que, incluso si
los valores de SA en plasma y orina caída por debajo de los umbrales, no se
puede excluir cualquier efecto terapéutico, especialmente desde que los AINE
son generalmente conocidos se acumule en exudado inflamatorio [27].
Conclusión
Los umbrales SA establecidos de 750 μ g // ml de orina y
6.5 μ plasma g / ml aparece demasiado generoso y están dejando espacio para el
mal uso del compuesto anti-inflamatorio y analgésico ASA especialmente para
países en los que la alimentación del caballo no es naturalmente rico en salicilatos.
abreviaturas
COMO UN: Ácido acetilsalicílico; La COX: La ciclooxigenasa; DMSO: sulfóxido de dimetilo; FEI:
Federación Ecuestre Internacional; HPLC-MS / MS: cromatografía líquida de alto rendimiento - espectrometría
de masas; LLOQ: límite inferior de cuantificación; LPS: lipopolisacárido; PGE: La prostaglandina E; SA:
El ácido salicílico; TXB: tromboxano B
Expresiones de gratitud
Los autores desean agradecer a la Federación Alemana de ecuestre (FN, Warendorf,
Alemania) por su apoyo financiero.
Fondos
Federación Alemana de ecuestre (FN, Warendorf, Alemania).
La disponibilidad de datos y materiales
Todos los conjuntos de datos están disponibles en el manuscrito principal. Los datos que apoyan los resultados están
disponibles también a través de: http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ buntenkoetterk_ws12.html.
autores ' contribuciones
Diseño del estudio: MK, MD, KB. Estudio farmacocinético: KB, MF. Estudio in vitro: KB, MF, MK.
Analítica: KB, ES, MM. Preparación del manuscrito: KB, MF, ES, MK. Revisión crítica del manuscrito:
WS, MM, MD. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
El consentimiento para la publicación
No aplica.
ética aprobación
El protocolo de estudio en animales fue aprobado por la administración regional del cuerpo
gubernamental (LAVES; Baja Sajonia, Alemania; 33.9-42502-04-11 / 0512).
datos del autor
1 Instituto de Farmacología, Toxicología y Farmacia, Universidad de Medicina Veterinaria de la Fundación
Hannover, Hannover, Alemania. 2 Instituto de Bioquímica de la Universidad Alemana del Deporte, Colonia,
Alemania. 3 Sassenberg, Alemania.
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Recibido: 21 Septiembre el año 2016 Aceptado: 17 Enero 2017
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