Determinación del contenido proteico total: determinación de

nitrógeno por el método Kjeldahl.

Objeto de la práctica.

Determinación del contenido en proteínas de una muestra de queso por el método de

Kjeldahl. Se valorarán, junto con las habilidades de los estudiantes para llegar a un
resultado final correcto, desde el punto de vista no sólo de la exactitud, sino también de
la precisión, los conocimientos teóricos, relacionados con la determinación propuesta,
que estudió con anterioridad.

Introducción.

Las proteínas son compuestos altamente polimerizados, que están formados por aminoá-
cidos. También se unen a componentes no proteicos. Las proteínas se encuentran entre
los nutrientes más importantes, junto con los lípidos y los carbohidratos. Además de su
función energética (1 g de proteína proporciona 4,1 Kcal al organismo), dada su natura-
leza nitrogenada, son necesarias para la síntesis de compuestos propios del organismo
implicados en la estructura de las membranas junto con los lípidos, como glicoproteidos
en funciones de lubrificación y como nucleidos que posibilitan la síntesis de las proteí-
nas propias del organismo, así como la formación de los cromosomas y la división celu-
lar.

El valor nutritivo de las numerosas proteínas alimentarias existentes depende de su

digestibilidad, que depende a su vez de la estructura, es decir, de su composición
aminoacídica. El contenido de aminoácidos esenciales (de los aproximadamente 30
aminoácidos 8 son esenciales para el hombre dado que éste no es capaz de sintetizarlos)
determina el valor biológico, es decir, el mayor aprovechamiento fisiológico de una
proteína por parte del organismo. Rige la ley del mínimo, esto es, si la oferta de
aminoácidos esenciales es demasiado limitada, el conjunto del rendimiento de las
reacciones de síntesis dependerá del aminoácido que esté presente en menor cantidad
(aminoácido limitante). Los aminoácidos limitantes más importantes son la lisina
(cereales y patatas) y la metionina (carne y leche).

Se da el nombre de queso al producto fresco o madurado obtenido por separación del

suero, después de la coagulación de la leche natural, parcial o totalmente desnatada. Si
bien la leche puede proceder de diversos animales, corrientemente se usa la de vaca,
oveja o cabra. La caseina de la leche, por acción del cuajo, un enzima que se obtiene del
estómago de las terneras, coagula, a una temperartura alrededor de unos 30 ºC y tras
agitación continua, formando una masa insoluble, más o menos rica en fosfatos
alcalinotérreos, según la acidez del medio. La leche debe de estar a una acidez de 8 a 9
grados Soxhlet (grado Soxhlet número de mililitros de NaOH 0,25 N necesarios para
neutralizar a la fenolftaleína 100 g de leche). La acidez de la leche se debe al ácido
láctico y, en menor medida, al anhídrido carbónico y a las funciones ácidas
albuminoideas. En la leche se encuentran diversas proteínas: fracción caseínica (76-
86%); fracción sérica (14-24%) y fracción anticuerpo

Los métodos para la cuantificación del contenido proteico en alimentos se basan en

distintos principios:
a) Método de Kjeldahl (determinación del contenido en nitrógeno).
b) Métodos espectrofotométricos:
b.1) Reacción química del enlace peptídico y posterior medida en el VIS (p.e.
método de Biuret en el que se forma un compuesto azul con cobre en medio
básico).
b.2) Reacción química de determinados aminoácidos de la proteína y posterior
medida en el VIS (p.e. método de Folin-Ciocalteu –ácido fosfomolíbdico y
fosfovolframico- en el que reacciona fundamentalmente la tirosina).
b.3) Reacción química con colorantes y posterior medida en el VIS (precipitación de
las proteínas y medida del exceso de colorante).
b.4) Medida en el UV (determinación de los aminoácidos aromáticos triptófano,
tirosina y fenilalanina cuyos máximos de absorción se encuentran en torno a
280 nm).
b.5) Medida en el IR cercano (medidas de reflectancia difusa).

En el análisis de alimentos, el método de Kjeldahl es el que ha alcanzado mayor

impotancia. Como consecuencia de su estructura a base de aminoácidos individuales, el
contenido de nitrógeno de las proteínas varía sólo entre unos límites muy estrechos (15
a 18% y como promedio 16%). Para la determinación analítica del contenido en
proteína total o “proteína bruta”, se determina por lo general el contenido de nitrógeno
tras eliminar la materia orgánica con ácido sulfúrico (método de Kjeldahl que data de
1883), calculándose finalmente el contenido de proteína con ayuda de un factor (en
general 6,25). Se asume que el trióxido de azufre que se forma durante el tratamiento a
altas temperaturas se adiciona como ácido de Lewis al grupo NH del enlace peptídico
(base de Lewis) de la proteína, formándose el correspondiente ácido amidosulfónico. El
ácido amidosulfónico es resistente a una posterior oxidación y se transforma en sulfato
amónico por degradación. El sulfato amónico se determina a continuación, tras
liberación del NH3 y destilación, por medio de una valoración ácido-base.

CH NH
O
C CH +
S
O

O
O

T S
O

CH NH

C CH

La degradación oxidativa acelerada catalíticamente de compuestos orgánicos con ácido

sulfúrico a temperaturas comprendidas entre 360 y 410°C se denomina tratamiento
Kjeldahl. Las transformaciones químicas que tienen lugar son:

C n H m Ol N d = a +b +c + (2n + m / 2 − l − 1,5a + 2,5b)O → nCO2 + (m / 2 − 1,5a − 0,5b) H 2 O + aNH 3 +

+ bHNO3 + c / 2 N 2
La degradación de grupos nitrogenados orgánicos funcionales tiene lugar dependiendo
del compuesto que forme el nitrógeno a través de muchas etapas intermedias a sulfato
amónico, ácido nítrico o nitrógeno elemental. Los grupos funcionales nitrogenados de
moléculas orgánicas y sus correspondientes productos de degradación están
representados en la tabla.

En el tratamiento Kjeldahl de alimentos no se determinan sólo proteínas o aminoácidos

libres, sino también ácidos nucleicos y sales de amonio. También se determina el
nitrógeno ligado de compuestos aromáticos, como pirazina, ciclopentapirazina, pirrol y
oxazol, así como el nitrógeno orgánico ligado de las vitaminas, tales como la B1
(tiamina), la B2 (riboflavina) y la nicotinamida.

No obstante, como por lo general los alimentos sólo contienen cantidades traza de
compuestos aromáticos nitrogenados y de vitaminas, el error así cometido se considera
despreciable. Además, por este método no se determinan el nitrógeno nítrico, el
cianhídrico, el de la hidracina, ni el del grupo azo, por lo cual el método es
particularmente interesante y relativamente específico para la determinación de las
proteínas.

Clasificación1 Grupo funcional Nombre Producto de degradación

A -CONH- Grupo peptídico
-CONH2 Carbámico (amida)
-OCN Oxocianato
-NCO Isooxocianato
-SCN Tiocianato
-NCS Isotiocianato NH3
-CN Nitrilo
-NC Isocianida
-NH2 Amino
=NH Imino
=N- Nitrógeno heterogéneo
sin enlaces N-N

B -NO Nitroso
-NO2 Nitro
-NOOH Isonitro HNO3
-NHOH Hidroxilamino
=NOH Oxima

C -NHNH2 Hidrazina
=N-NH-R Hidrazona
-N=N- Azo N2
=N-N= Azino
-N≡N Diazonio

Fundamento.

1
La relación de productos de degradación de los grupos nitrogenados de los apartados A, B y C
corresponden a los coeficientes a, b y c de la ecuación anterior.
La sustancia a investigar se somete a un tratamiento oxidativo con ácido sulfúrico
concentrado en presencia de un catalizador (sulfato férrico2), un oxidante (peróxido de
hidrógeno) y un elevador del punto de ebullición del sulfúrico (sulfato potásico). Del
sulfato amónico formado se libera el amoníaco por tratamiento alcalino y éste se
transporta con ayuda de una destilación en corriente de vapor a un recipiente con ácido
bórico y se realiza su valoración con una disolución valorada de ácido clorhídrico3. El
contenido de proteína en la muestra se calcula teniendo en cuenta el contenido medio de
nitrógeno en la proteína en cuestión.

Procedimiento.

Aparatos y material.

a) Aparatos.
- Balanza y granatario (sala de balanzas)
- Calefactor/agitador (armarios de los alumnos).
- Estufa (sala del profesor).
- Digestor Kjeldahl (campana extractora).
- Destilador Kjeldahl (campana extractora).
b) Material.
- Matraces Kjeldahl de 250 mL con bandeja (campana extractora).
- Bureta de 50 mL (meseta).
- Matraz aforado de 500 mL (armarios de los alumnos).
- Matraces Erlenmeyer de 250 mL (armarios de los alumnos).
- Probeta (armarios de los alumnos).
- Vidrios de reloj (armarios de los alumnos).
- Varillas de vidrio (armarios de los alumnos).
- Pipetas Pasteur (armarios de los alumnos).
- Desecador (sala del profesor).

Reactivos.

a) Disoluciones.

2
R. Moro, M.L. Bartolomé, J.A. López, Alimentaria, 226 (1991) 55.
3
Alternativamente se puede recoger el amoniaco destilado sobre un volumen conocido de ácido sulfúrico
de concentración también conocida y valorando el exceso de ácido sulfúrico con hidróxido sódico
previamente valorado con un patrón primario (ftalato ácido de potasio).
- Naranja de metilo 0,1% (p/v) (armarios de los alumnos).
- Hidróxido sódico 30% (p/v) (campana extractora).
- Acido bórico 4% (p/v) con indicador mixto (campana extractora).
b) Líquidos.
- Acido sulfúrico (armarios de los alumnos).
- Acido clorhídrico (armarios de los alumnos).
- Peróxido de hidrógeno (armarios de los alumnos).
c) Sólidos.
- Carbonato sódico (estufa).
- Sulfato potásico (armarios de los alumnos).
- Sulfato férrico (armarios de los alumnos).
- Naranja de metilo (armarios del profesor).
- Hidróxido sódico (armarios del profesor).

Determinación.

a) Preparación y valoración de una disolución de HCl 0,1 N.

Para preparar medio litro de disolución se mide en una probeta el volumen aproximado
de HCl concentrado necesario para, de acuerdo con los datos de densidad y tanto por
ciento en peso consignados en la etiqueta de la botella, lograr la concentración deseada.
Este volumen se lleva a un matraz aforado de 500 mL y se enrasa con agua destilada.

Como el HCl no es patrón primario, para conocer la concentración exacta se procede a

su valoración con carbonato sódico. El carbonato sódico anhidro es patrón primario
pero debe haber sido secado previamente durante al menos 1 hora a 270-300°C (luego
se mantiene en la estufa a 100°C).

Cuando se vaya a emplear, se coloca el recipiente que contiene el carbonato sódico seco
en un desecador y se espera a que alcance la temperatura ambiente. A continuación se
toman tres muestras, exactamente pesadas por diferencia en la balanza analítica
(trasvasar directamente a erlenmeyers), de aproximadamente 0,1000 g de carbonato
sódico anhidro anotando en la libreta de laboratorio el peso exacto tomado. El
recipiente, con el carbonato sódico seco, se vuelve a depositar en la estufa.

Las muestras tomadas se disuelven con unos 25 mL de agua destilada y se añaden 5

gotas de naranja de metilo 0,1% (p/v). Se homogeniza y carga la bureta con el HCl 0,1
N a valorar y se deja caer, poco a poco, sobre la solución de carbonato sódico hasta
viraje del indicador del amarillo al rojo-naranja. La reacción de valoración es la
siguiente:

Na 2 CO3 + 2 HCl → 2 NaCl + H 2 CO3

El ácido carbónico generado se descompone en CO2 (ácido) por lo que tras el primer
cambio de color se procede a la eliminación del CO2 mediante ebullición durante dos o
tres minutos (el indicador debe volver al color amarillo). Se continúa la valoración hasta
nuevo viraje del indicador (suelen ser suficiente con una o dos gotas más) anotando en
la libreta de laboratorio el volumen total de HCl 0,1N gastado. Se lleva a cabo la
valoración con cada una de las tres muestras de carbonato sódico tomadas. Finalmente
se calcula el factor del HCl 0,1N. Este factor se emplea en todas aquellas valoraciones
en que se utilice esta disolución.

b) Tratamiento de la muestra.

Se anota en la libreta de laboratorio el tipo de producto y/o marca comercial. Sobre un

vidrio de reloj se pesan con exactitud en la balanza analítica tres muestras de
aproximadamente 1,0000 g anotando en la libreta de laboratorio el peso exacto tomado.
Se trasvasan las muestras a los tubos de ataque y se añaden sucesivamente a cada tubo
(en campana extractora):
- Aproximadamente 10,00 g de sulfato potásico y 0,10 g de sulfato férrico pesados
sobre vidrio de reloj en el granatario.
- Aproximadamente 15 mL de ácido sulfúrico y 3 mL de peróxido de hidrógeno
medidos en una probeta.
Siguiendo las instrucciones del profesor, se introducen los tubos en el digestor calentado
a 400°C hasta que el contenido de los tubos esté perfectamente transparente.

c) Destilación.

Una vez destruida la materia orgánica, la muestra se deja enfriar y se coloca en el

destilador. Nuevamente siguiendo las instrucciones del profesor, se añaden, de acuerdo
con el manual del destilador, 115 mL de agua destilada y 100 mL de NaOH 30% (p/v).
Se destilan unos 120-150 mL recogiendo el destilado sobre 30 mL de ácido bórico 4%
(p/v).

d) Valoración.

A continuación se procede a la valoración del amoníaco. Se homogeniza y carga la

bureta con HCl 0,1N. Se va dejando caer la disolución poco a poco sobre la muestra
hasta viraje del indicador mixto que contiene el ácido bórico del azul al incoloro
anotando en la libreta de laboratorio el volumen de HCl 0,1 N gastado.

Cálculos.

Se calcula el contenido de nitrógeno total. Para expresar el contenido en proteínas de la

muestra analizada es necesario multiplicar la cantidad de nitrógeno por un factor de
acuerdo con la tabla siguiente:

Alimentos Factor
Gelatina 5,55
Leche, productos lácteos 6,38
Carne, pescado, huevos 6,25
Frutos secos y semillas oleaginosas 5,4
Verduras, frutas y derivados cereales 6,25
Maíz, leguminosas 6,25

Bibliografía.
- “Análisis de los alimentos”. R. Matissek, F.M. Schnepel y G. Steiner. Ed. Acribia.
- “Lecciones de Bromatología”. F. Moreno Martín y M.C. Torre Boronat. Universidad
de Barcelona.