Cuantificación y separación de pigmentos vegetales

Introducción

Las plantas son seres vivos que están constituidos por una serie de pigmentos
los cuales brindan a las plantas una de sus principales características que es el
color. La función principal de los pigmentos en las plantas es la fotosíntesis,
normalmente la clorofila tiene una participación muy activa en este proceso ya
que junto con otros pigmentos rojos y amarillos ayudan a captar la mayor
cantidad de energía luminosa posible y como consecuencia la planta puede
almacenar energía eficientemente.
Los pigmentos vegetales, pueden dividirse en dos grandes grupos,
considerando su solubilidad:
a) Solubles en agua: antocianinas y antoxantinas, que se encuentran en el jugo
vacuolar.
b) Solubles en solventes orgánicos: clorofilas "a" y "b" y carotenoides (rojo,
naranja y amarillo), que se encuentran en las granas y tilacoides de los
cloroplastos.

Las clorofilas poseen unas estructura porfirínica, formada por cuatro anillos
pirrólicos con un átomo de magnesio en su centro, un anillo de ciclopentanona
y un éster de fitol unido a uno de los anillos de pirrol que provee a la molécula
de una cola lipófila. La diferencia entre las distintas clorofilas existentes (se
conocen al menos siete) se encuentran en los sustituyentes que se presentan;
así la clorofila "a" (verde azulada) presenta un grupo metilo (-CH3) en el
carbono 3, y la "b" (verde amarillenta) un grupo aldehido (-CHO) en la misma
posición.

Entre otros pigmentos, los carotenoides tienen también un papel importante en

las plantas, normalmente se encuentran los carotenos (anaranjados), cadenas
hidrocarbonadas de unos cuarenta átomos de carbonos, y las xantofilas
(amarillas u ocres), que son derivados oxigenados de estos.
Los pigmentos y distintos componentes de las plantas han sido por siglos
ampliamente estudiados por sus distintas aplicaciones en la vida cotidiana, sin
embargo, separar y cuantificar dichos compuestos ha sido siempre un gran
desafío puesto que existen una infinidad de componentes en las plantas y es
necesario separar los componentes de interés, en esta situación la
cromatografía ha tomado un rol importante por años, ya que es una manera
sencilla de separar componentes y cuantificarlos de una manera muy
específica. Dependiendo del componente de estudio es la manera de
seleccionar el tipo de cromatografía adecuado para la separación y de ser
necesaria la cuantificación.

Objetivo

Determinar la cantidad de clorofila y carotenoides en hojas de Spinacia

oleracea y realizar cromatografía en gis, papel y capa fina.

Materiales Pipeta 10 mL
Vaso de precipitado 100 mL Equipos

Vaso de precipitado 250 mL Centrifugadora

Mortero Balanza analítica

Tubo de ensayo Baño María

Tubo de centrifuga Espectrofotómetro

Placa Petri Reactivos

Gis Acetona

Papel filtro Etanol

Micro pipeta Éter de petróleo

Pipeta Pasteur

Método

En esta práctica se realizó la extracción, cuantificación y separación mediante

dos métodos, los cuales difieren en la composición de los solventes utilizados
para la extracción de pigmentos.

Método A.

Extracción.

Pesar 0.5 g de hojas frescas de espinacas y colocarlas en un mortero, agregar

5mL de una solución al 80% de acetona y posterior a esto, disgregar las hojas.
Cuando la acetona este lo suficientemente verde, se coloca el macerado en un
tubo centrifuga de plástico y se centrifuga a 2000 rpm durante 10 min. Después
de centrifugar se obtiene el sobrenadante verde que contiene los pigmentos.
Ajustar el volumen final a 6 mL con acetona al 80%.

Cromatografía en gis.

Colocar medio centímetro de altura del sobrenadante en una placa Petri.

Sumergir dentro del extracto la base ancha del gis y dejarla entre 3 y 5 minutos.
Una vez pasado ese lapso, retirar el gis y colocarlo en un vaso que contenga
0.5 cm de altura de fase móvil (acetona: éter de petróleo, 1:9) y tapar el vaso.
Dejar el gis en la fase móvil y observar que sucede.

Cromatografía en papel.

Cortar una tira de papel filtro de unos 10 cm X 1.5 cm. Colocar con una pipeta
Pasteur una gota del extracto, a un centímetro del borde, dejarlo secar. Colocar
de nuevo otra gota y dejarla secar. Repetir esto entre 8 y 10 gotas de extracto.
Sumergir la tira de papel en un frasco con la fase móvil (acetona: éter de
petróleo, 1:9) durante 30 minutos en la oscuridad.

Cromatografía en capa fina.

Cortar una tira de placa para realizar capa fina de unos 10 cm X 3 cm. Colocar
con una pipeta Pasteur una gota del extracto, a un centímetro del borde, dejarlo
secar. Colocar de nuevo otra gota y dejarla secar. Sumergir la placa en un
frasco con la fase móvil (acetona: éter de petróleo, 1:9) durante 30 minutos en
la oscuridad.

Método B.

Extracción.

Pesar 0.5 g de hojas frescas de espinacas cortando las hojas en segmentos de

aproximadamente 0.5 cm, estos se introducen en un tubo de ensayo con 6 mL
de etanol al 80 % de modo que los trozos de las hojas queden sumergidos
completamente. Incubar durante 20 min en un baño a 80°C para que las
clorofilas salgan al exterior y se disuelvan en el etanol. Al cabo de este tiempo
los segmentos deberán quedar totalmente decolorados y el etanol queda de
color verde.

Cromatografía en gis.

Colocar medio centímetro de altura del sobrenadante en una placa Petri.

Sumergir dentro del extracto la base ancha del gis y dejarla entre 3 y 5 minutos.
Una vez pasado ese lapso, retirar el gis y colocarlo en un vaso que contenga
0.5 cm de altura de fase móvil (etanol 80%) y tapar el vaso. Dejar el gis en la
fase móvil y observar que sucede.

Cromatografía en papel.

Cortar una tira de papel filtro de unos 10 cm X 1.5 cm. Colocar con una pipeta
Pasteur una gota del extracto, a un centímetro del borde, dejarlo secar. Colocar
de nuevo otra gota y dejarla secar. Repetir esto entre 8 y 10 gotas de extracto.
Sumergir la tira de papel en un frasco con la fase móvil (etanol 80%) durante 30
minutos en la oscuridad.

Cromatografía en capa fina.

Cortar una tira de placa para realizar capa fina de unos 10 cm X 3 cm. Colocar
con una pipeta Pasteur una gota del extracto, a un centímetro del borde, dejarlo
secar. Colocar de nuevo otra gota y dejarla secar. Sumergir la placa en un
frasco con la fase móvil (etanol 80%) durante 30 minutos en la oscuridad.

Cuantificación de clorofila y carotenoides.

Para la cuantificación de clorofilas a se miden la absorbancias de los extractos
a 663 nm de longitud de onda. Para realizar el cálculo es necesario aplicar la
siguiente formula:

Clorofila a (mg/g de tejido)= [12.7 (A663) – 2.69(A645)]*V/1000*W

Para la cuantificación de clorofilas b se miden la absorbancias de los extractos

a 645 nm de longitud de onda. Para realizar el cálculo es necesario aplicar la
siguiente formula:

Clorofila b (mg/g de tejido)= [22.9 (A645) – 4.68(A663)]*V/1000*W

Y para calcular las clorofilas totales se utiliza la siguiente formula:

Clorofilas totales (a+b) (mg/g de tejido)= [20.21 (A645)+ 8.02

(A663)]*V/1000*W

A= absorbancia de longitud de onda especifica

V= volumen final de extracto de clorofila en 80% de acetona

W= peso fresco del extracto del tejido

En la estimación de carotenoides se mide la absorbancia de los extractos a una

longitud de onda de 470 nm y se utiliza la siguiente formula:

C x+c = [1000 (A470) – 1.82 (Ca) – 85.02 (Cb)] / 198

C= carotenoides

x+c= xantofilas + caroteno

A= absorbancia en la longitud de onda respectiva

Ca= clorofila a

Cb= clorofila b

Resultados

La extracción de la clorofila se pudo realizar con éxito en ambas técnicas como

se puede apreciar en las fotografías.
En la cuantificación se obtuvieron los siguientes datos:

Método A Método B
W= 0.4991 V= 6mL W= 0.4961g V= 6mL
Longitudes de onda Absorbancias Absorbancias
(nm)
663 0.296 0.672
645 0.161 0.331
470 0.462 0.849

Cálculos para método A:

Clorofila a (mg/g de tejido)= [12.7 (0.296) – 2.69(0.161)]*6/1000*0.4991= 0.039

mg/g de tejido

Clorofila b (mg/g de tejido)= [22.9 (0.161) – 4.68(0.296)]*6/1000*0.4991= 0.027

mg/g de tejido

Clorofilas totales (a+b) (mg/g de tejido)= [20.21 (0.161)+ 8.02

(0.296)]*6/1000*0.4991= 0.0676 mg/g de tejido

Carotenoides = [1000 (0.462) – 1.82 (0.039) – 85.02 (0.027)] / 198= 2.32

Cálculos para método B:

Clorofila a (mg/g de tejido)= [12.7 (0.672) – 2.69(0.331)]*6/1000*0.4961= 0.092

mg/g de tejido

Clorofila b (mg/g de tejido)= [22.9 (0.331) – 4.68(0.672)]*6/1000*0.4961= 0.054

mg/g de tejido

Clorofilas totales (a+b) (mg/g de tejido)= [20.21 (0.331)+ 8.02

(0.672)]*6/1000*0.4961= 0.146 mg/g de tejido

Carotenoides = [1000 (0.849) – 1.82 (0.092) – 85.02 (0.054)] / 198= 4.26

Cromatografía en gis

Método A. Método B.

Comatografía en papel

Método A.
 Método B.

Cromatografía en capa fina

Método A. Método B.

Discusión

Conclusión

Referencias