Cap II Tema 4 Metodos Diagnostico de Laboratorio Zika Fin

Capitulo II: Aspectos clínicos y de diagnóstico de enfermedad por
virus Zika
Tema 4: Métodos de diagnóstico de Virus Zika en el Perú

(Etapa Analítica)
Blgo. Adolfo I. Marcelo Ñique

Laboratorio Ref. Nacional
Metaxénicas Virales
Instituto Nacional de Salud
Curso Virtual “Vigilancia, Prevención y Control de Enfermedad por Virus Zika”

Contenido:
• Pruebas para diagnostico laboratorial de zika
• Tipos de prueba según días de enfermedad
• Métodos utilizados para el diagnostico de zika
• Aspectos importantes en el diagnostico de zika

Pruebas para diagnostico laboratorial de zika
Los procedimientos de obtención,

conservación y transporte de muestras
biológicas para su procesamiento de la
muestra biológica para zika esta contemplada
en la RM 980-2016/MINSA NTS N° 125-
MINSA/2016/CDC-INS “Normativa Técnica de
Salud para la vigilancia epidemiológica y
diagnostico de laboratorio de dengue,
chikungunya, zika y otras arbovirosis”

Normativa Técnica de Salud para la vigilancia

epidemiológica y diagnostico de Laboratorio de Dengue,
Chikungunya, Zika y otras Arbovirosis
Finalidad
Contribuir a prevenir, controlar la transmisión del dengue, chikungunya, zika y otras arbovirosis y a mitigar el
ingreso de estas enfermedades en escenarios donde no hay transmisión en el Perú.
Objetivo general
Fortalecer las acciones de vigilancia epidemiológica y diagnóstico para la detección temprana de los arbovirus
emergentes y remergentes, así como el monitoreo de brotes y epidemias
Objetivos específicos
• Establecer los procedimientos para la captación de casos, registro, notificación e investigación de los
casos de dengue, chikungunya, zika y otras arbovirosis, sus secuelas y complicaciones en el Sistema
Nacional de Vigilancia Epidemiológica.
• Establecer las estrategias de vigilancia epidemiológica de dengue, chikungunya, zika y otras arbovirosis,
sus secuelas y complicaciones.
• Estandarizar los procedimientos de obtención, conservación y transporte de muestras biológicas para su
procesamiento, así como para el diagnóstico de dengue, chikungunya, zika y otras arbovirosis en el Perú.

Criterios para la Obtención y conservación y transporte de muestra para el
diagnóstico de Dengue, Chikungunya, Zika, Fiebre Amarilla y otros Arbovirus
Cantidad Tiempo de
Metodo de Tiempo de enfermedad para la Muestra Conservación y
Enfermedad Minima Resultado en el
Diagnostico obtención de muestras Biológica Transporte
Requerida Netlab
Suero: Pacientes con tiempo de
Zika enfermedad ≤ 5 días (Periodo Suero 2 mL
Virémico)
Orina: Pacientes con tiempo de

Zika Orina 2 mL
enfermedad 6 a 15 días Estéril
(enviar a T° por
Semen: En caso de sospecha de debajo de +8 °C) 3 días para qRT-PCR
qRT-PCR (detección Zika Semen 2 mL
transmisión sexual
de ARN viral) y
30 días para
aislamiento Viral
LCR: En pacientes con Guillan Barré Aislamiento viral
Zika confirmado, sindrome congénito o LCR 1 mL
sintomas neurológicos.
Tejido: muestra de Higado, cerebro,

Estéril
riñon, placenta, cordón umbilical.
Zika Tejido 1 cm3 (enviar a T° por
Asimismo a casos de abortos o
debajo de +8 °C)
natimuertos sospechosos a Zika
Tejido: muestra de Higado, cerebro,

Enviar en formol 10%
Histopatología e riñon, placenta, cordón umbilical.
Zika Tejido 1 cm3 a temperatura 7 días para IHQ
IHQ Asimismo a casos de abortos o
ambiente
natimuertos sospechosos a Zika
Suero: Pacientes con tiempo de

Zika Suero 2 mL
enfermedad 6 a 15 días Estéril
ELISA (detección de
(enviar a T° por 3 días
IgM e IgG)
LCR: En pacientes con Guillan Barré debajo de +8 °C)
Zika confirmado,sindrome neurológicos o LCR 1 mL
sintomas neurológicos.
RM 982-2016 - NTS 125-MINSA/2016/CDC-INS “Normativa Técnica de Salud para la vigilancia epidemiológica y diagnostico de laboratorio de dengue, chikungunya, zika y otras arbovirosis”

• El requerimiento de pruebas debe estar acompañado de un adecuado conocimiento

de la patología del virus zika.
• Uso de muestras biológicas alternativas, adicionales al suero, como orina, LCR y otros
tejidos.
• Muy importante la “Cadena de Frío”

Consideraciones biológicas del virus zika
 La carga viral del virus zika en suero es baja.

 Se sugiere resultados de IgM con muestras pareadas.
 Resultados IgM zika positivos pueden dar reacción cruzada con otros Flavivirus.
 Considerar la fecha de inicio de síntomas para el petitorio de pruebas.
( énfasis en la investigación para determinar si se trata de un caso asintomáticos)
Importante esta
información para
calcular el número de
días de enfermedad.

Tipo de pruebas para diagnostico según días de enfermedad
RT-PCR tiempo real

MUESTRAS AGUDAS
(Suero, LCR, tejidos)

(1 a 5 días)
Tipos de Tejidos:
Aislamiento viral:
A. Placenta (Cara
fetal y materna)
Vero / C6-36 B. Restos
placentarios.
(Suero, LCR, tejidos) C. Sémen.
D. Cerebro, etc.

Tipo de pruebas para diagnostico según días de enfermedad
MUESTRAS PACIENTE
RT-PCR tiempo real

CONVALESCIENTES
(Orina)
(6 a 15 días)
Serología: SOLO EN CASOS:

ELISA IgM, HAI 1. SGB.
(Suero, LCR) 2. RN microcefalia
3. Gestante .
4. Evaluación sero-
conversión

Métodos utilizados para el diagnostico de zika
¿Qué buscamos en un probable caso de infección por zika?:
1. Directa: Búsqueda del material genético del virus, zika (Acido Ribonucleico,
ARN)
1. Indirecta: Búsqueda de algún componente producido como respuesta a la

exposición frente a zika (Inmunoglobulinas M, IgM)

Métodos directos Métodos indirectos

Son aquellos que detectan: Son aquellos que reconocen componentes
humorales (Anticuerpos) producidos por la
1. Presencia de genoma viral e exposición al virus:
identificación de serotipo:
RT-PCR MULTIPLEX en tiempo real
1. Identifica anticuerpos antivirales por
2. Aislamiento en cultivos celulares del técnicas de inmunoensayo
virus Zika: (ELISA IgM ZIKA).
Células C6/36 y Vero
2. Identificación de Anticuerpos totales
por iHA

ACCESIBILIDAD
MÉTODOS DIRECTOS MÉTODOS INDIRECTOS
Aislamiento Detección Serología

iHA
viral de ARN IgM
CONFIANZA
Adaptado de la Guía Técnica OMS/OPS

Pruebas para los métodos de Laboratorio

1. Aislamiento viral
2. RT-PCR tiempo real
3. ELISA IgM zika
4. HAI zika
5. LAMP (en proceso de validación)

1.- Aislamiento viral:

• Técnica de biología celular mediante la cual se obtiene cepas puras a partir de
muestras biológicas como suero, orina, tejidos o fluidos biológicos.
• Existen dos líneas celulares usadas para aislar arbovirus:
1) Línea Vero
2) Línea C6/36
• La línea Vero es mas susceptible a la replicación del virus zika.
• La evidencia de la presencia de un virus es el efecto citopático.
Vero (riñón de mono verde Africano)

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
1.- Aislamiento viral
Identificación viral: IF y RT-PCR rt
IFI ZIKA - POSITIVO RT-PCR rt ZIKA - POSITIVO

(imagen referencial) (imagen referencial)

2.- RT-PCR tiempo real
Definiciones
- ARN : Tipo de acido nucleico, del cual esta constituido el genoma del Virus Zika. Se
caracteriza por ser de cadena única y sensible a la degradación por cambios bruscos de
temperatura.
- Primers: Secuencias de nucleótidos (de 18 a 30 bases) que flanquean una región del
genoma para su amplificación.
- Sonda (Probe): Secuencia de nucleótidos muy específica, unida a una molécula

Fluorescente, el cual al ser estimulado produce color y que es detectado por un equipo
llamado “termociclador de PCR tiempo real”.
- Existen muchas sondas, siendo la mas usada las Sondas Taqman.
- El fluoroforo mas usado es FAM (color verde).
- Termociclador: Equipo de PCR, que en el caso de un tiempo real, tiene un laser de

emisión y un fotodetector de color. El equipo tiene la particularidad de subir y bajar las
temperaturas muy rápidamente.

Definiciones
- Ct: Valor teórico que corresponde al ciclo de amplificación, en la que una reacción se
hace positiva. Es inversamente proporcional a la carga viral.
ESQUEMA DEL PCR

Esquema del PCR
Ciclos de:
1. Desnaturalización (95oC)
2. Apareamiento (50-65oC)
3. Elongación (60-72oC)

Termociclador es como una

fotocopiadora

• Two-Step (RT y PCR por

separado)
RT-PCR convencional
• One-Step
• Con Sondas Taqman

RT-PCR tiempo real • Con SYBR Green


Principio en la medición de actividad fluorescente en un rt-pcr tiempo real
R= Reporter (FAM, Cy5, HEX, etc.
Observaciones:
1) Cuando la nueva hebra tiene
contacto con la sonda, se
libera el Fluoróforo.
2) Muy rápidamente se libera el
“Quencher” que “silencia el
Fluoróforo.
Resultado: La amplificación de 1
hebra produce un pulso
cuantificable y proporcional al
numero de amplificaciones.

Clinical Chemistry Jan 2000, 46 (1) 24-30;
- Uso de Primers específicos para

la regón PrM-Env del virus zika.
- Uso de sondas taqman (FAM)
INS
- Verificación y Reproducibilidad de la
prueba RT-PCR.
-Protocolos estandarizados y validados.

West Africa
Genotype East Africa Asian
Genotype
1947 Genotype

Africa Este
Africa Oeste
Asiático

Forward Primer Reverse Primer Sonda (Probe) Especific
Z-‐1086 Z-‐1162 Z-‐1107 FAM All Zika

CCGCTGCCCAACACAAG CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT AGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGA strains*
CACTCAA
Z-‐4481 Z-‐4552 ATCCCATAGAGCACCACTCC Z-‐4507FAM Asian

CTGTGGCATGAACCCAATAG CCACGCTCCAGCTGCAAAGG Genotype**
* Emerging Infectious Diseases • Vol. 14, No. 8, August 2008

** Unpublished; more sensitive by 1-‐2 Ct

a.-Extracción de ARN
b.-Preparación de Mix de PCR
c.-RT-PCR tiempo real.

Métodos utilizados para el diagnostico
INSTITUTO de zika DE SALUD
NACIONAL
Consideraciones para Evitar la Contaminación

• Usar áreas de trabajo físicamente separados:
1) Un área dedicada a preparación de master mix
2) Un área de trabajo pre-ampliﬁcación (extracción y adición de ARN)
3) Un área para el análisis post-ampliﬁcacion (análisis de gel, etc)
• Utilizar equipamientos dedicados y separados para las diversas áreas de trabajo;
especialmente pipetas y centrífugas
• Uso de puntas para pipetas con filtro para evitar aerosol

Consideraciones para manejo del ARN

• Uso de material plástico libre de RNasas
• Usar agua libre de RNasa
• Siempre usar GUANTES; incluso los tubos cerrados
• Abrir y cerrar los tubos rápidamente y evitar tocar las partes internas de los tubos
• Preparar los reactivos y manejo de ARN con hielo o bloque frío
• Uso de material plástico libre de Rnasas
• Usar agua libre de Rnasa
• Siempre usar GUANTES; incluso los tubos cerrados
• Abrir y cerrar los tubos rápidamente y evitar tocar las partes internas de los tubos
• Preparar los reactivos y manejo de ARN con hielo o bloque frío

Lisis 1 vol. Muestra + 4 vol. EN CABINA DE

BIOSEGURIDAD
Buffer de lisis
(140 µL + 560 µL).
Unión 4 vol de ETOH (560 µL); añadir a
la columna.
Lavado Lavar con 500 µL

AW1/AW2.
Elución Eluir en AVE o agua libre de

RNAsas.
Métodos utilizados paraINSTITUTO
el diagnostico de zika DE SALUD
NACIONAL

Métodos utilizados paraINSTITUTO
el diagnostico de zika DE SALUD
NACIONAL

NACIONAL
• Controles Negativos
– Controles de extracción Negativos.
• Extraer ARN de algunas muestras de negativas.
– Control sin ARN (NTC)

• Añadir agua a la reacción de amplificación.
• Controles Positivos
– Control de extracción Positivo.
• Extraer ARN de muestras Positivas
– Control Positivo de ARN

• Añadir ARN extraído a la reaccion de amplificación.
– Control Interno de ARN

• ARN diferente al molde se añade para monitorizar las condiciones de
amplificación en cada muestra.

NACIONAL
• Todos los resultados predictivos de los Controles Positivos, deben tener un Valor
Ct adecuado.
• Los controles negativos deben tener un Ct de valor negativo

• Valor de Ct < 38 se interpreta con Positivo.
• Valor de Ct > 38 < 40 indeterminado.
• Valor de Ct > 40 se interpreta con Negativo.
• Se recomienda hacer interpretación tanto de curvas lineales, como logaritmicas.

Complejo Mab- Antígeno ZIKA
IgM en suero del paciente
Placa con Anti-IgM humana

Microplaca para prueba de ELISA

Anti-IgM humana
IgM humana (suero de paciente)
Antígeno
Conjugado ( peroxidasa)
Substrato (Sistema ABTS)
Reactividad cruzada con otros Flavivirus
DENV FA ZIK ZIK ILH VNO SLE ROC CCN CONCLUSION

-0.169 -0.164 NEG
-0.207
NEG POS 0.534 -0.007 -0.019 -0.030 -0.091 -0.123 ZIKA
NEG POS 1.133 2.247 1.264 0.590 0.825 -0.122 FLAVI/INDETERM
POS POS 1.203 0.429 0.561 0.624 0.841 -0.079 FLAVI/INDETERM

Hemaglutinación
Anticuerpos anti-ZIKA
Antígenos de ZIKV
Anticuerpos no específicos
Hematies de Ganso
Inhibición de la Hemaglutinación
26 00 90 67 73 CHIK VNO 111 17D 45 76 79 D2 75 D1 D3 ZK 91 151

+ + + + + + ≥320 ≥640 ≥640 ≥640 ≥640 ≥1280 ≥1280 ≥1280 ≥640 ≥640 ≥1280 + +
+ + + + + + ≥320 ≥640 ≥640 ≥640 ≥640 ≥1280 ≥1280 ≥1280 ≥640 ≥640 ≥1280 + +
+ + + + + + 20 20 40 80 20 20 20 + 40 20 20 + +
+ + + + + + ≥320 ≥640 ≥640 ≥640 ≥640 ≥1280 ≥1280 640 320 ≥640 ≥1280 + +
+ + + + + + + 20 20 40 20 20 20 + 20 20 + + +
+ + + + + + 80 320 160 ≥640 80 160 320 20 ≥640 320 640 + +
20 20 80 40 + 320 ≥320 ≥640 ≥640 ≥640 ≥640 ≥1280 640 320 ≥640 ≥640 640 + +
+ + + + + + ≥320 ≥640 ≥640 ≥640 ≥640 ≥1280 ≥1280 320 320 ≥640 ≥1280 + +

• RT-LAMP es una técnica de amplificación isotérmica que usa primers muy específicos
• Prueba rápida molecular (30 a 60 min)
• No necesita termociclador de PCR
• Usa una incubadora o un termobloque
• Interpretación de resultado es fácil de realizar
• Materiales liofilizados y almacenados a temperatura ambiente.



Muestra
Extracción ARN
Amplificación LAMP

Aspectos importantes en el diagnostico de zika
• Equipos calibrados
• Proceso lavado
• Tiempo
• Temperatura
• pH
• Humedad

Equipo
Laboratorio de Referencia Nacional de Metaxénicas Virales
Lic. TM. Maria Paquita García

Blgo. Adolfo Marcelo Ñique
Lic.TM. Susy Merino Sarmiento
Blga. Dana Figueroa Romero
Tec. Lab. Yasmine Poclin García
Blga. Betzabe Avila Paucar
Tec.Lab. Karina Huaman Ovalle.
Tec.Lab. Tomas Paredes
Tec.La. Milagros Grados

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Serología: SOLO EN CASOS:

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MÉTODOS DIRECTOS MÉTODOS INDIRECTOS

Aislamiento Detección Serología

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3. ELISA IgM zika

5. LAMP (en proceso de validación)

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1.- Aislamiento viral:

Vero (riñón de mono verde Africano)

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1.- Aislamiento viral

Identificación viral: IF y RT-PCR rt

IFI ZIKA - POSITIVO RT-PCR rt ZIKA - POSITIVO

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- Sonda (Probe): Secuencia de nucleótidos muy específica, unida a una molécula

- Existen muchas sondas, siendo la mas usada las Sondas Taqman.

- El fluoroforo mas usado es FAM (color verde).

- Termociclador: Equipo de PCR, que en el caso de un tiempo real, tiene un laser de

2.- RT-PCR tiempo real

ESQUEMA DEL PCR

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2.- RT-PCR tiempo real

Esquema del PCR

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Termociclador es como una

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2.- RT-PCR tiempo real