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ISSN:0377-9424 / 2017
www.mag.go.cr/rev agr/index.html www.cia.ucr.ac.cr
Palabras clave: Aislamientos; parasitismo; Rubus sp.; hongos antagonistas; Botrytis cinerea.
Keywords: Isolations; parasitism; Rubus sp.; antagonists fungi; Botrytis cinerea.
RESUMEN ABSTRACT
1 Este estudio fue financiado por el proyecto FEES * Universidad Nacional de Costa Rica. Laboratorio de
2009 “Generación de conocimiento científico y Cultivo de Tejidos y Células. Costa Rica.
tecnológico sobre la biodiversidad de moras criollas ** Universidad Nacional de Costa Rica. Laboratorio de
costarricenses con alto potencial antioxidante”. Fitopatología. Costa Rica.
2 Autor para correspondencia. Correo electrónico:
rafael.orozco.rodriguez@una.cr
8 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
Los aislamientos de Trichoderma spp., que tuvie- carried out in 2013. Trichoderma spp. isolates
ron estadísticamente (p≤0,0001) mayor efecto which had statistically (p≤0.0001) greater effect
sobre B. cinerea fueron BV1 y BC1, los cuales on Botrytis cinerea were BV1 and BC1, showing
dieron menos frutos enfermos. less affected fruits.
Cuadro 1. Localidades en donde se realizó el estudio y principales datos climatológicos, del Instituto Meteorológico Nacional,
2013.
N 09º44’39.9’’
La Luchita El Guarco 1935 4000 19,0 25,4 17
W083º56’15.7’’
N 09º42’01.3’’
Bajo Canet Tarrazú 1840 1169,9 15,9 22,2 19,4
W083º59’49.0’’
N 09º30’35.1’’
División Pérez Zeledón 1869 2147 17 24 20,5
W083º40’39.9’’
N 09º30’27.6’’
División Pérez Zeledón 1958 2147 17 23 20
W083º41’31.4’’
N 09º30’08.3’’
Jardín Pérez Zeledón 1916 3300 16 23 19,5
W083º41’29.4’’
N 09º30’15.3’’
Jardín Pérez Zeledón 1709 3300 16 23 19,5
W083º39’28.4’’
En cada una de las localidades selecciona- medios, recién cuajados y secos, como lo muestra
das se tomaron 10 frutos de mora en 3 diferentes la Figura 1.
Fig. 1. Estados fenológicos de desarrollo del fruto de la mora que se muestrearon para los aislamientos de hongos en la fase
de laboratorio.
b) Lapso de tiempo (días) en el cual las cepas El procedimiento se hizo también con la
de antagonista y fitopatógeno entran en metodología usada por Mata (2005). Las bolsas
contacto. Para medir la velocidad de colo- con el cultivo puro de cada antagonista, debi-
nización del posible antagonista. damente esporuladas, se usaron para preparar
c) Crecimiento radial (CR) de las cepas suspensiones de 1 X 106 conidios por mililitro,
expresado en centímetros (cm) para deter- por medio de un hematocímetro y el sistema de
minar el grado de colonización y creci- conteo y calibración descrito por French y Her-
miento de estas. bert (1982).
Las pruebas de campo se hicieron en La
Para evaluar el efecto antibiótico del anta- Luchita del Guarco, donde se escogieron 10
gonista se midió el porcentaje de inhibición del racimos florales por planta para cada uno de
crecimiento (PIC): Se calculó mediante la fór- los organismos seleccionados, a cada racimo se
mula utilizada por Skidmore y Dickinson (1976), le eliminaron los frutos formados, para dejar
Royse y Ries (1978). solo los recién cuajados y flores en botón. Una
vez listos se les aplicó 10 ml de las respectivas
Diseño experimental in vitro
suspensiones, con un atomizador manual. Para
Se utilizó un diseño completamente al azar realizar estas pruebas se usaron plantas ubicadas
con 4 repeticiones por tratamiento. La unidad en diferentes puntos de la plantación con el fin de
experimental consistió en una caja Petri de 9,0 evitar la contaminación por deriva. Cada racimo
cm de diámetro. Los resultados obtenidos en el se protegió con una redecilla para evitar los daños
experimento (PIC y CR) se analizaron mediante de insectos y aves. Veinte días después, cuando
un análisis de varianza (ANOVA) (p<0,05) y el fruto ya estaba bien desarrollado, se hizo una
comparación de medias de Tukey para determi- segunda aplicación, con los respectivos organis-
nar diferencias significativas entre tratamientos. mos y con la concentración de conidios antes
Se utilizó el programa estadístico SAS 9.1. indicada. Igualmente como testigos se escogieron
10 racimos florales con todo y pedúnculo a los
Pruebas de infección en campo cuales no se les aplicó nada.
En todos los casos cuando los frutos mos-
Como resultado de todo el trabajo anterior, traron los primeros indicios de maduración se
se escogieron 3 de los mejores aislamientos, para llevaron al laboratorio de Fitopatología, donde se
hacer las pruebas de campo. Debido a que fue incubaron en cámara húmeda por 10 días a 25ºC
Trichoderma spp., el antagonista más promisorio y se hizo la evaluación definitiva. En ella se esta-
se decidió usar los mejores 3 de este trabajo y 3
bleció el número de frutos sanos, el de los afec-
de los aislamientos más eficientes, obtenidos por
tados por B. cinerea y cantidad de frutos donde
Calvo (2012).
Trichoderma spp., produjo abundantes esporas.
Previo a la prueba, se prepararon los cul-
tivos puros de las cepas seleccionadas, para uti- Diseño experimental en campo
lizarlas en la preparación de matrices en botellas
de vidrio estériles, con arroz como sustrato, según Se utilizó un diseño completamente al azar
lo propuso Mata (2005). Luego, con su contenido con 10 repeticiones por tratamiento. La unidad
se preparó una suspensión madre de conidios con experimental consistió en un racimo de frutos
Tween 80 como dispersante, para cada uno de recién cuajados con sus flores en botón seleccio-
los antagonistas escogidos. De la suspensión se nada de una planta al azar de la plantación. En
tomaron alícuotas de 15 ml para inocular bolsas la escogencia de las plantas se buscó la mayor
de polipropileno, previamente autoclavadas y homogeneidad posible de factores como tamaño,
preparadas con arroz como sustrato. vigor, color y variedad.
Cuadro 2. Géneros de hongos aislados a partir de frutos de mora y número de cepas obtenidas durante el 2012, en las 4 locali-
dades estudiadas y pertenecientes a las provincias de Cartago y San José.
Aspergillus sp. 1 0 0 0 1
Bispora sp. 0 1 0 0 1
Cladosporium sp. 7 1 2 1 11
Colletotrichum sp. 1 0 0 0 1
Curvularia sp. 1 0 0 0 1
Macrophoma sp. 1 0 0 0 1
Paecilomyces sp. 5 2 5 2 14
Pestalotia sp. 0 1 0 1 2
Rhizoctonia sp. 1 0 1 0 2
Trichoderma sp. 0 3 0 6 9
Actinomycete 1 0 0 0 1
Total 18 8 8 10 44
En el Cuadro 2 se destaca la mayor can- Cuadro 3. Géneros aislados y sometidos a pruebas duales
tidad de hongos aislados en La Luchita donde con sus respectivos valores promedio de PIC.
predominaron los géneros Cladosporium sp., y
Paecilomyces sp., mencionados en Arauz 1998 Organismos aislados % PIC*
y Vázquez 2002 como biocontroladores de otros
Actinomycete 20
organismos. Paecilomyces spp., es parásito de
nematodos, especialmente de huevos y quistes; Aspergillus sp. 25
también actúa como entomopatógeno de Bemicia Cladosporium sp. 21
tabaci. El género Cladosporium, por su parte, es
un enemigo natural de las escamas. En el mismo Colletotrichum sp. 28
cuadro también se observa la presencia de Tri- Curvularia sp. 42
choderma spp., en Bajo Canet y Jardín, hongo
Macrophoma sp. 38
que como se discutirá más adelante, posee amplia
acción antagonista. Paecelomyces sp. 44
En la investigación realizada por Calvo Pestalotia sp. 22
(2012) se indica la presencia de Cladosporium
sp., Colletotrichum sp., Pestalotia sp., y Tri- Trichoderma sp. 70
choderma sp., en La Luchita, mientras que en
la presente investigación se obtuvo resultados *PIC: Porcentaje de inhibición del crecimiento.
diferentes, en ese mismo lugar, y no se obtuvo
ningún aislamiento de Trichoderma sp., lo cual
era de esperar, pues en 2 momentos distintos de
muestreo es difícil obtener resultados idénticos,
a menos que un organismo mantenga una alta investigación, puede que tengan cualidades
población de forma sostenida a través del tiempo. antagónicas contra B. cinerea.
Pruebas de antagonismo in vitro para Sin embargo, la metodología usada en este
separar los hongos con potencial antagonista caso, no permite detectar otras propiedades anta-
gónicas como producción de metabolitos secun-
Una vez obtenida la población de orga- darios o parasitismo de hifas que según Baker
nismos antes señalada y con el fin de poder y Cook (1982) se presentan en varios hongos,
seleccionar aquellos hongos con potencial anta- pero para poder evidenciar su efecto se requiere
gonista, se realizaron cultivos duales. Estos del uso de otras metodologías más complejas, no
fueron entre B. cinerea y cada uno de los ais- incluidas en la presente investigación.
lamientos, evaluándose el porcentaje de inhi- En total se obtuvieron 9 aislamientos de
bición de crecimiento (PIC). Los resultados de
Trichoderma spp., con un valor promedio de
esta prueba se indican en el Cuadro 3 donde los
PIC de 70%, por lo que se requirió comprobar su
valores promedio de todos los aislamientos
eficiencia antes de utilizarlos en la siguiente fase
de Trichoderma spp., superaron de forma
clara y contundente a todos los demás, por de estudio. Se procedió a hacer las respectivas
lo que se seleccionaron solo las mejores pruebas, para cada uno de los aislamientos de
cepas de este hongo, descartándose los otros Trichoderma spp. Los resultados de tal procedi-
hongos, dada la baja capacidad antagóni- miento se indican en el Cuadro 4, ubicándose la
ca mostrada con esta prueba. El grupo de mayoría de estos aislamientos en las categorías I
organismos descartados en esta etapa de la y II, según la escala utilizada.
Fig. 3. Crecimiento radial de las cepas de Trichoderma sp., contra B. Cinerea comparadas con el testigo (sólo B. cinerea) en
las pruebas a los 7 días.
en relación con las otras 2 cepas de Trichoderma por Trichoderma sobre los patógenos, mediante
spp. Los tratamientos que mostraron más eficien- la competencia por nutrientes, producción de
cia a nivel de laboratorio contra B. cinerea fueron metabolitos antifúngicos, enzimas hidrolíticas, y
J 21 y J 14, al limitar el crecimiento del patógeno micoparasitismo (Stefanova et al. 1999). La anti-
de una forma más evidente. El resultado obtenido biosis en Trichoderma spp., se efectúa por la pro-
podría atribuirse a la acción combinada ejercida ducción de enzimas hidrolíticas y por metabolitos
secundarios volátiles o no. Además las enzimas la Figura 4 se muestran los valores obtenidos para
hidrolíticas son factores importantes que facilitan Trichoderma sp., sobre B. cinerea. En esta figura
la competencia por sustrato y el ataque directo a se aprecia que no hay diferencias estadísticas
un amplio ámbito de hongos patógenos de plantas entre ellos (p<0,05), a pesar de que el aislamiento
(Jensen y Wolffhechel 1995). proveniente de la localidad de Jardín (J14) presen-
tó valores de PIC, de 81,9%. En este caso algunos
Evaluación del efecto antibiótico de los diversos mecanismos de antibiosis pro-
pios de este género, actuaron por igual en todos
La capacidad antagónica de los aislamien- los casos. Tales mecanismos son según Dubos
tos por antibiosis se expresó por medio del por- (1987), sustancias antibióticas o metabolitos que
centaje de inhibición del crecimiento (% PIC). En inhiben la actividad parasítica de los patógenos.
Fig. 4. Porcentaje de inhibición del crecimiento causado por Trichoderma sp., sobre B. cinerea en pruebas in vitro.
Los metabolitos usualmente involucrados, por Elad 1996). También se atribuye este efecto
según hallazgos de otras investigaciones son: a enzimas que interfieren con el desarrollo del
viridina, trichodermina, glioviridina, gliotoxi- patógeno porque degradan componentes estruc-
na y harzaniolidina (Lumsden et al. 1992). De turales de la pared celular, como las quitinasas,
todas estas micotoxinas la más representativa es exo-y endoglucanasas y proteasas principalmente
trichodermina cuya función inhibe la actividad producidas por T. harzianum (Elad y Kapat 1999,
ribosomal de los patógenos y por lo tanto su Ait-Lahsen et al. 2001).
reproducción (Ghisalberti y Sivasithamparam
Efectividad de Trichoderma spp., en
1991). En investigaciones de laboratorio donde
condiciones de campo
se utilizó Trichoderma sp., como antagonista, se
observaron zonas de inhibición de crecimiento El total de aislamientos de Trichoder-
de B. cinerea, lo cual se atribuye al efecto de ma spp., para las pruebas de campo fueron 7,
los antibioticos sobre los hongos fitopatógenos según se indica en el Cuadro 5. De los mejores
(Seddik et al. 2012, Schirmbock et al. 1994). aislamientos obtenidos en el presente trabajo, se
El efecto inhibitorio del crecimiento de escogieron los aislamientos J 21, J 22, J14 y BC1.
Botrytis se ha atribuido a algunos compuestos Sin embargo, debido a que cuando el experimento
que pueden impedir la germinación de conidios, estaba establecido en campo, el productor podó
como las tricozianinas A1 y B1 y la gliotoxina severamente las plantas donde se había aplicado
producidas por especies de Trichoderma (Di el aislamiento J14, fue necesario eliminar este
Pietro et al. 1993, Schimbock et al. 1994 citados tratamiento, razón por la cual solo quedaron 6.
Cuadro 5. Lista de aislamientos de Trichoderma spp., utili- Los frutos traídos de campo fueron ana-
zados para las pruebas en campo realizadas en La lizados después de 10 días de estar en cámara
Luchita, Cartago, Costa Rica.
húmeda, lugar en el cual tanto el patógeno como
el antagonista, contaban con las condiciones ópti-
Trichoderma sp. Lugar de procedencia mas para manifestarse. Dado que Trichoderma
BC1 Bajo Canet spp., posee diversos mecanismos por medio de los
cuales reduce el crecimiento de los patógenos. Se
J2.1 Jardín
contabilizaron los frutos aparentemente libres de
J2.2 Jardín crecimiento fungoso y aquellos con crecimiento
J14 Jardín de Trichoderma, en una sola categoría, resultados
que se presentan en la Figura 5. En ella se aprecia
BV1 Buena Vista
que los aislamientos BV1 y BC1 son estadística-
SM 13B San Martín mente diferentes al testigo, por lo que se observa
SM 18 San Martín
un efecto de los aislamientos usados sobre el
crecimiento de Botrytis. Esto sugiere que los
Fig. 5. Sumatoria de los frutos de mora procedentes de campo libres de Botrytis y con crecimiento de Trichoderma, después
de haber sido incubados en cámara húmeda por 10 días.
antagonistas sobrevivieron y actuaron a pesar de que BC1 en las pruebas de laboratorio mantuvo una
haberse expuesto a alta radiación solar y deseca- acción antagónica moderada sobre el patógeno, pero
ción en la superficie de los frutos. Al comparar los en campo fue el que manifestó el mejor desempeño.
2 aislamientos, puede observarse que también son El efecto observado cuando se usó BV1 y
diferentes entre sí, lo cual pone en evidencia que el BC1 podría atribuirse a que estos aislamientos
aislamiento BV1 fue el mejor pues superó al BC1. fueron capaces de colonizar las flores y a su
El aislamiento BV1 era procedente de Buena vez desplazaron a B. cinerea de su habitual sitio
Vista de Pérez Zeledón y el BC1 de Bajo Canet, 2 de infección por competencia y eventualmente
sitios con condiciones ecológicas diferentes; pero también por la producción de enzimas capaces de
a pesar de eso, conservaron sus características degradar las paredes celulares del patógeno, como
antagónicas en la localidad donde se llevó a cabo lo sugiere Chet (1987). La aplicación temprana
el experimento. También es importante destacar sobre flores y frutos recién cuajados que se usó en
este estudio quizá tuvo un efecto similar al indica- aislamientos J22 y SM13B superaron al testigo.
do por varios autores (Dubos et al. 1983, Sutton y En esos casos hubo alguna condición favorable
Perg 1993) en cultivos como vid y fresa. De mane- para el establecimiento del patógeno. Aunque no
ra similar, Trichoderma spp., ha actuado como hay referencias respecto a esto, una posible expli-
antagonista contra patógenos de partes aéreas y cación para este resultado, es que los aislamientos
particularmente de B. cinerea al aplicarse durante de Trichoderma sucumbieran más rápido que los
la floración de manzanos, cerezos, viñedos, toma- otros por efectos ambientales y que el inóculo
te y pepino (O’Nelly et al. 1996, Wilson 1997). natural se viera favorecido por el uso del disper-
En la Figura 6 se observan los frutos infec- sante - adherente (NP-7, ia: alquilanil oliclicoleter
tados solo por B. cinerea y contabilizados a los ®) pues fue lo único diferente usado al momento
10 días de estar en cámara húmeda. Al comparar de la inoculación, mientras que en los testigos la
el testigo con los aislamientos BV1 y BC1, se infección observada fue solo resultado del esta-
observa que la cantidad de frutos infectados es blecimiento natural del patógeno, en ausencia de
estadísticamente inferior al testigo, mientras los ese posible beneficio.
Fig. 6. Frutos de mora procedentes de campo con crecimiento exclusivaente de Botrytis después de 10 días de incubación
en cámara húmeda.
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