TRANSCRIPTOMA

- Northern blot

- Aporta información sobre la presencia de un transcrito, su abundancia y su tamaño

- Electroforesis: Se realiza en condiciones desnaturalizantes, Gel: agarosa 0,8-1,4% y
formaldehído 6%, en buffer MOPS (3-(N-morfolino)propano-sulfónico)
- Las muestras deben desnaturalizarse, buffer de carga: MOPS, formamida, formaldehído,
colorante
- Transferencia: por capilaridad o vacío, similar a Southern
- Hibridación: similar a Southern, buffer con más formamida (50%)

- Para comparar diferencias en los niveles de

expresión de un gen es muy importante la
utilización de un control: generalmente un
gen que se exprese constitutivamente:
citoesqueleto (-actina), un gen de ARNr. Las
intensidades de la señal del gen en estudio
deben normalizarse con las del control
 - RT-PCR

- PCR tiempo real

 - ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL

- Obtener información sobre genes que se transcriben únicamente o con mayor intensidad
en una determinada condición respecto a otra. Se busca analizar el transcriptoma completo.
- Estos métodos se basan en la utilización de dos poblaciones de ADNc obtenidas a partir
del ARN de las dos condiciones a ensayar:

Métodos clásicos:

- Hibridación substractiva
- Differential display
- cDNA-AFLP
- ESTs

Métodos basados en genómica:

- Microarreglos
- RNA sequencing
- ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL

- Hibridación substractiva

-Se basa en la eliminación de las moléculas de ADNc que están repetidas en

las dos condiciones a través de un proceso de hibridación; las moléculas
híbridas formadas entre ADNc de las dos condiciones son entonces
eliminadas, el resto (expresadas diferencialmente) se aíslan y estudian
.
- p.ej. Sistema SSH (Supression Substractive hybridization), de
Clontech
- Hibridación substractiva
- ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL

- cDNA-AFLP

- Similar al método de AFLPs pero partiendo del ADNc obtenido a partir de dos
condiciones en lugar de DNA genómico. Los patrones de bandas obtenidos
con ambas condiciones se comparan para detectar bandas presentes sólo en
una condición, indicativo la expresión diferencial de un transcrito.
- ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL

- Differential display

- Consiste en visualizar en un gel el nivel de expresión de los transcritos provenientes

de dos condiciones diferentes y detectar diferencias en la misma.
- Actualmente se utilizan métodos basados en PCR (DD-PCR).
- Esquema:
- Para cada población de RNA se ponen 3 reacciones de síntesis de ADNc,
cada una con un primer oligo-dT anclado: T12A, T12C, T12G
- Finalizada la síntesis de la hebra de ADNc, se añade el primer arbitrario
(10-12 bases) y todos los componentes para una reacción de PCR, con 32P-dCTP
- Se cargan las muestras, previa desnaturalización, en un gel de acrilamida
del 6% desnaturalizante (7 M urea). Autorradiografía
- Cortar las bandas de interés (expresadas diferencialmente), eluir el ADN y
precipitar con acetato de potasio, glicógeno y etanol.
- Reamplificar por PCR usando la combinación adecuada de primer T12M
(M= A, C o G) con arbitrario
- Correr un gel de agarosa con el producto de la PCR. Extraer el fragmento
del gel para subclonarlo, secuenciarlo, etc.
 - Differential display

Para cada condición se tiene un pool de RNA

que se utiliza para síntesis de ADNc y
amplificación con: primer oligo-dT anclado +
primer arbitrario. Se obtiene así un patrón de
bandas amplificadas para cada condición, las
cuales se comparan en un gel de
poliacrilamida para detectar transcritos
expresados diferencialmente.
- ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL

- SAGE: Serial analysis of gene expression

- Se basa en tres principios

- Una secuencia corta, tag (etiqueta), de 10-14 nucleótidos, contiene suficiente

información para identificar de forma única un transcrito.

- Una vez aislados, estos tags pueden unirse para formar largas series de
moléculas de ADN que pueden clonarse y secuenciarse.

- La cuantificación del número de veces que un determinado tag está presente en

una condición indica el nivel de expresión del gen correspondiente en esa
condición
- SAGE

- Se cortan con las enzimas NlaIII y

BsmFI las secuencias tag de cada
transcrito de una condición determinada
- Se ligan las secuencias aisladas
formando largas cadenas de ADN que
se secuencian
- La secuencia nos indica el número de
veces que un tag particular está
presente, lo que refleja la abundancia de
ese transcrito en una determinada
condición, permitiendo hacer
comparaciones cuantitativas entre dos o
más condiciones
- Finalmente se identifican los genes a
que corresponden los tags mediante
comparación de la secuencia del tag con
una base de datos que contenga todos
los genes caracterizados de la especie
en cuestión
- SAGE

Obtención de los tags: Se corta con NlaIII, se añaden adaptadores (linkers) para
BsmFI y se corta con esta enzima. BsmFI es del tipo IIs, corta a una distancia de unos
15 pares de bases del sitio de reconocimiento (en el linker), generando fragmentos con
una secuencia de 15 pb (SAGE tag), que se ligan para formar concatémeros.
- ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL

- ESTs: Expressed Sequence Tags

- Más que un método de differential display es una técnica que permite identificar cientos de
transcritos que se están expresando en una célula en un momento y condiciones
determinados: transcriptoma

- Consiste en la obtención de ADNc de la muestra o muestras en estudio, y en la realización

de una única reacción de secuencia que permita identificar mediante búsquedas en bases
de datos los genes a que corresponden cada uno de los clones secuenciados. Se obtiene
así una representación del transcriptoma que puede compararse entre dos condiciones
distintas.
- MICROARREGLOS

- Un arreglo de ADN es una colección de moléculas de ADN (ADNC u oligonucleótidos)

dispuestas sobre un soporte sólido como una matriz de filas y columnas

- Macroarreglos: puntos sobre una membrana de nylon o nitrocelulosa, pequeño

número. Las sondas (ADNc que proviene de dos condiciones) se marcan por
radiactividad. Se detecta la intensidad de la señal en cada punto y se compara la misma
entre las dos condiciones.

- Microarreglos: Habitualmente oligonucleótidos (20-80 nucleótidos), cada uno de ellos

es una secuencia identificativa de un gen. Contienen hasta 40.000-60.000 puntos. El
marcaje de las sondas de ADNc se realiza con fluorescencia: rojo (Cy5) para la
condición problema y verde (Cy3) para la condición de referencia. El detector compara la
intensidad de la fluorescencia e integra el resultado en cada punto, observándose el
resultado final como un punto rojo (genes sobreexpresados en la condición problema),
verde (genes con menor expresión en la condición problema) o amarillo-naranja (genes
con expresión similar en las condiciones problema y de referencia)
Confección del microarreglo

1. Colecciones de Expressed
Sequences Tags (EST)
2. Bibliotecas de ADNc
3. Secuencias genómicas

Procedencia de la información de
secuencia para la elaboración de
los oligonucleótidos o fragmentos
de ADN que se fijarán al arreglo.
 Confección de arreglos

MICROARREGLOS

Siembra 0,25-1 nL/punto

generando puntos de 100-
150 m de diámetro.
Confección de microarreglos
 Hibridación en microarreglos

El experimento tipo consiste en la comparación de los niveles de expresión de

todos los genes de un organismo en dos estados celulares (condiciones).

Proceso

1. Aislar ARNm a partir de una muestra biológica.

2. Convertir el ARNm en ADNc, utilizando una transcriptasa reversa.
3. Marcar el ADNc con nucleótidos fluorescentes (Cy5 y Cy3)
4. Hibridar el ADNc marcado en el microarreglo.
5. Detectar y cuantificar la fluorescencia utilizando un laser scanner confocal.
6. Analizar los resultados.
Síntesis de ADNc
Hibridación en microarreglos
Cy5 = 633 nm Cy3 = 532 nm
1 2

Cy5 Cy3

Expresión de 1 > 2
Expresión de 1 = 2
Expresión de 1 < 2
Microarreglo de levadura
- RNA Sequencing

- Secuenciación del transcriptoma mediante los nuevos métodos de secuenciación

(Next Generation Sequencing)

- Permite la obtención de millones de secuencias: gran precisión estadística

- Permite la detección de ARNm con maduración alternativa o transcritos no descritos,

mientras que los microarreglos sólo permiten estudiar transcritos ya conocidos (lo que
se ha depositado en el microarreglo)

-Puede realizarse con especies en las cuales no existe información previa de su

secuencia genómica (si bien los resultados óptimos se consiguen cuando sí está
secuenciado el genoma)
PROTEOMA
 ESTUDIOS CON PROTEÍNAS: SDS-PAGE
SDS-PAGE: Polyacrilamide Gel Electrophoresis. Permite separar proteínas desnaturalizadas
en un gel de poliacrilmida en función de su tamaño.

Se utiliza acrilamida/bis 37:1. La mezcla que se indica es

para un gel con un porcentaje de acrilamida del 12%, si este
porcentaje varía debe recalcularse la cantidad de
acrilamida/bis y de agua destilada a añadir.
Mezcla para gel separador:
Acrilamida/bis 40% 9 ml
Tris-HCl 1,5 M pH 8,5 7.5 ml
Agua destilada 13 ml
10% SDS 300 l
10% APS 100 l
TEMED 15 l
Mezcla para gel concentrante:
Acrilamida/bis 40% 1 ml
Tris-HCl 1M pH 6,8 1.25 ml
Agua destilada 7.6 ml
10% SDS 100 l
10% APS 35 l
TEMED 5 l
 SDS-PAGE

Buffers y soluciones

• Tampón de electroforesis:
25 mM Tris, 192 mM Glicina,
0.1% SDS, pH 8.3

• Tampón de muestra:
0.3 M Tris•HCl, pH 6.8, 5%
SDS, 50% glycerol, Azul de
bromofenol 0.01%, 2--
mercaptoetanol 0,5%

• Solución de teñido:
0.125% Coomassie Brilliant
Blue R-250, 50% Metanol, 10%
Ácido Acético

• Solución de desteñido:
50% Metanol, 10% Ácido
Acético
 SDS-PAGE

Tinción con Coomasie

Solución de teñido:
0.125% Coomassie Brilliant
Blue R-250, 50% Metanol, 10%
Ácido Acético

Tinción con sales de plata

1- Etanol, ácido acético, H2O (30:10:60)

2- Etanol 30%
3- Nitrato de plata 0,1%
4- NaCl, CuSO4, NH4OH, tiosulfato sódico
5- Ácido acético 1%
 PAGE

PAGE: Gel de poliacrilamida nativo, sin SDS

- Cuando se pretende extraer una proteína del gel de forma que conserve su actividad, o
bien cuando se quiere ensayar una actividad enzimática en el propio gel, las proteínas
no deben desnaturalizarse. Para ello se llevan a cabo las siguientes modificaciones:
- No se añade SDS al gel, buffer de muestra ni buffer de electroforesis
- No se añade -mercaptoetanol al buffer de muestra para evitar la reducción
de los puentes disulfuro
- Las muestras no se calientan y la electroforesis se desarrolla a 4ºC
- Para ver actividad en el gel: éste se incuba con el sustrato adecuado hasta
que aparezcan bandas de actividad
Debe tenerse muy en cuenta el pH del gel, ya que las proteína entrarán y se moverán en
el gel sólo si tienen carga neta negativa, y esto depende de su punto isoeléctrico.

- Si se quiere recuperar la actividad de una proteína despues de un SDS-PAGE existen

protocolos para renaturalizar la proteína
Western Blot

Detección de una proteína mediante anticuerpos tras un SDS-PAGE

 Western Blot

Actividad de la enzima
fosfatasa alcalina
conjugada con el anticuepo
secundario
 Western Blot

Reacción cruzada con anticuerpos policlonales

Western Blot

Cuantificación de la proteína tras un Western blot como método de

determinación de la expresión del gen
 Técnicas de Proteómica

Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Isoelectroenfoque:
separación de las
proteínas en función
de su punto
isoeléctrico: pH al cual
la carga neta total de la
proteína es 0

SDS-PAGE:
separación de las
proteínas en función
de su tamaño
 Técnicas de Proteómica

Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Pueden llegar a
detectarse todas las
proteínas que se están
expresando en una
célula
Permite establecer
comparaciones entre
dos condiciones:
sistema de análisis de
expresión diferencial
 Técnicas de Proteómica

Métodos de identificación de las proteínas

Las proteínas separadas en un 2D (o purificadas por cualquier otro método) pueden

analizarse para conocer su masa molecular, huella peptídica y secuencias de péptidos
internos en sistemas de espectrometría de masas; esto permite su identificación.
- Huella peptídica: tras digestión con tripsina se obtiene la masa molecular precisa de todos
los péptidos resultantes, la cual se compara con la masa virtual obtenida de la información
de los genes en la base de datos. Se lleva a cabo con un MALDI-TOF (Matrix-assisted laser
desorption ionization-time of flight)
- Para completar la identificación puede hacerse una microsecuenciación de péptidos
internos con un LC-MS/MS (Liquid chromatography-tandem MS). Se obtienen secuencias
de longitud corta (6-14 aminoácidos) que a menudo presentan ambigüedades.
- Microsecuenciación por Degradación de Edman : Método clásico de secuenciación de
péptidos. Requiere al menos 0,5 g de proteína. Es un método más directo, pueden
obtenerse secuencias de hasta 20-25 aa, mayor fiabilidad.
Técnicas de Proteómica

Huella peptídica
Técnicas de Proteómica

Huella peptídica
Técnicas de Proteómica

Huella peptídica
SECUENCIACIÓN DEL ADN
Método de Sanger o de los didesoxinucleótidos
- Se basa en la utilización de terminadores: moléculas de didesoxinucleótidos que al
incorporarse a la cadena de ADN detienen la reacción de polimerización.
- Una mezcla de los 4 desoxinucleótidos con 1 didesoxinucleótido concreto
ocasionará que la reacción de polimerización se detenga al azar generando moléculas
de diferente tamaño que se separan en un gel de acrilamida
 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DE
NUCLEÓTIDOS
ddATP ddGTP

3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’
5’-A-3’ 5’-AG-3’
5’-AGA-3’ 5’-AGACCTG-3’
5’-AGACCTGCA-3’ 5’-AGACCTGCATTTATAAG-3’
5’-AGACCTGCATTTA-3’ 5’-AGACCTGCATTTATAAGCCG-3’
4 reacciones: ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
5’-AGACCTGCATTTATA-3’
5’-AGACCTGCATTTATAA-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCG-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAG-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3’

ddATP
ddCTP ddTTP
3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’
5’-A-3’
3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’ 3’-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5’
5’-AGAC-3’ 5’-AGA-3’ 5’-AGACCT-3’
5’-AGACC-3’ 5’-AGACCTGCA-3’ 5’-AGACCTGCAT-3’
5’-AGACCTGC-3’ 5’-AGACCTGCATTTA-3’5’-AGACCTGCATT-3’
5’-AGACCTGCATTTATAA-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGC-3’
5’-AGACCTGCATTT-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCC-3’
5’-AGACCTGCATTTAT-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGC-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAGT-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCC-3’
5’-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGC-3’
- Gel de acrilamida con reacciones de secuencia, se visualiza una autorradiografía
generada por la señal del isótopo 35S-dATP
- En la actualidad el proceso se hace de forma automática. Los terminadores llevan
incorporados colorantes fluorescentes de diferente longitud de onda, que permiten
hacer la reacción en un único tubo. Tras un proceso de electroforesis capilar un
detector láser recoge la señal de cada terminador (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)
Secuenciación automática
 Secuenciación primer walking

- Tenemos un fragmento para

Secuenciación shot-gun
secuenciar clonado en un
vector plasmídico. Se lleva a
cabo la primera reacción de
secuencia con un primer
universal. A partir de la
secuencia obtenida se diseña
un segundo primer hacia el
extremo 3’ de la misma para
que haga de iniciador en la
siguiente reacción, y así
sucesivamente hasta completar
el fragmento a secuenciar

5’ 3’
Estrategias de secuenciación en proyectos genoma

Shot-gun Clon a clon de

una genoteca
Algunos sitios web relacionados con proyectos genoma