Uso de levaduras industriales

Agosto 24, 2010

Dr. Luis C. Damas Buenrostro

GCM
Descripción de Levaduras

• Las levaduras son hongos cuya forma usual

y dominante es unicelular. Hay
aproximadamente 50 géneros con más de
500 especies descritas. Existen normalmente
en la naturaleza en vegetales, animales,
insectos y el suelo. Con pocas excepciones
(algunos géneros de la familia
Cryptococcaceae como Candida,
Cryptococcus, Pityrsosporum) rara vez
producen enfermedades.
 Gema
Vacuola

Membrana

Mitocondrias

Pared celular

Célula madre Cicatriz

Estructura fina de una célula de levadura
Saccharomyces cerevisiae
 FASES DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA
Reproducción de la levadura – Número de Células

60 – 80 mill/ml

0.5 – 10 mill/ml

19 – 23 mill/ml

Fase Lag Fase de Crecimiento Fase Estacionaria Fase de Muerte o

Sedimentación
 Levaduras Industriales
Levadura Tipo de Uso industrial
levadura

Saccharomyces cerevisiae Ascomiceto Panificación, elaboración de bebidas fermentadas (vino,

cerveza, licores, sake, etc.). Producción de etanol.
Elaboración de complementos nutricionales, saborizantes,
vitaminas, extractos, etc.
Candida utilis Ascomiceto Proteina unicelular, producción de alcohol.

Saccharomycopsis fibuligera Ascomiceto Proteina unicelular, glucoamilasa, bioquimicos, alcohol

Yarrowia lipolytica Ascomiceto Proteina unicelular, lipasa, bioquimicos

Candida milleri Ascomiceto Pan acido (sourdough)

Kluyveromyces marxianus Ascomiceto Proteina unicelular, alcohol

Phaffia rhodozyma Basidiomiceto Proteina unicelular para acuacultura

Brettanomyces sp. Deuteromiceto Fermentación cervezas “lámbicas”
Ventajas tecnológicas de
Saccharomyces cerevisiae
1. Tolerancia a concentraciones elevadas de etanol (hasta 18%
vs 1-4 % otras levaduras)
2. Poder acidificante y tolerancia a bajos pH (3 – 4) con la
consecuente supresión de patógenos
3. Inocuidad comprobada en más de 8,000 años de uso (status
GRAS)
4. Separación espontánea natural del producto (floculación) o
fácilmente filtrables o sedimentables
5. Alta productividad, tanto en condiciones aerobicas (hasta 0.54
g de biomasa por gramo de glucosa) como anaerobica (hasta
0.48 g de etanol por gramo de glucosa)
6. Posibilidad de manipulación genética
7. Estabilidad genética
8. Velocidad de generación aceptablemente rápida (1-2 hrs)
 Usos Industriales de S.
cerevisiae

Dirigidos a la producción de biomasa
• Producción de levadura para panadería
• Aditivos alimenticios agrícolas
• Complementos nutricionales
• Extracto de levadura para Microbiología
• Suministro de levadura para uso industrial

Dirigidos a los productos de fermentación

• Elaboración de vino
• Elaboración de licores
• Producción de alcohol industrial
• Elaboración de cerveza
Variedades de uso industrial
de Saccharomyces cerevisiae
• Saccharomyces cerevisiae var.
cerevisiae: levadura de las fermentaciones
“ale”, destilerías, panadería, vinatería,
alcohol industrial, productos nutricionales.
• S. cerevisiae var. uvarum
(carlsbergensis): levadura de las
fermentaciones “lager”.
• S. cerevisiae var. bayanus: levadura de
vinos
• S. cerevisiae var. fermentati (“flor”):
producción de jerez
 Tipos de Levaduras
S. cerevisiae var. uvarum S. cerevisiae var. cerevisiae

Levadura
 Células muertas

• Reacción reducción azul de metileno:

N Oxidado=Azul
+
S N(CH3)2
(CH3)2 N
NADH

NH Reducido=Incoloro

S N(CH3)2
(CH3)2 N
Viabilidad por fluorescencia
Resumen de la producción de compuestos
en Fermentación
Glucosa

Sulfato
Piruvato H2S y SO2
Acidos Acetaldehido
Aminoácidos
Orgánicos Acetil-CoA

Etanol Aminoácidos
Ac. Graso-
CoA Alcoholes
Etanol superiores
Diacetilo
Grasas
VDKs
Acidos
Grasos Esteres

Metabolismo de la levadura: producción del sabor

 Curva de Fermentación
100 16

Células Suspendidas
90 Extracto
14

80
12

70
Células suspendidas X10 6/mL

10
60
No Floculante

50 8

40 Etanol
6

30
4

20

2
10

Floculante
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7

Días
Mecanismo
Molecular
de la
Floculación
 Saccharomyces cerevisiae

Contiene 16 cromosomas de 200 a

2200 Kb.

6183 marcos de lectura abiertos

5800 corresponden a genes que
codificaban para proteínas.

Tamaño promedio de los genes es
de 1.45 kb, o 483 codones
Expresión Global
Genoma

Transcriptoma

Proteoma
1 2 3 4 5 6 7 Figure 1. PCR products of FLO genes from S. diastaticus strain. Lanes: 1,
8 100-1000 bp ladder; 2, Lg-FLO (312 bp); 3, FLO5 (423 bp); 4, FLO9 (347 bp);
5, FLO8 (920 bp); 6, FLO10 (270 bp); 7, FLO11 (749 bp); 8, FLO1 (596 bp)

# FLO Flocculation
Strain FLO1 FLO5 FLO8 FLO9 FLO10 FLO11 Lg-FLO
Genes (mL)
Baker's + + - - - + - 3 0.0
Lager 790 + - + - - + + 4 2.5
Lager BRY - - + - + + + 4 3.8
Lager J-2036 - - + + + + + 5 3.6
Lager 820 + - + - + + + 5 4.5
Lager KJ8 - - + + + + + 5 5.5
Lager LAW + - + + + + + 6 5.0
S. diastaticus - + + + + + w 6 NA
S. pastorianus + + + - - + - 4 NA
S. willianus - + + + + + - 5 NA

7.0
Flocculation (mL, Helm Test)

6.0
KJ8 LAW
5.0
BRY 820
4.0
J-2036 R2 = 0.75
3.0
790
2.0

1.0
Baker's
0.0
2 3 4 5 6 7
Number of FLO genes
 Marcador

2
100
C FR1**
C FR2
C FR3

992 966
5
C FR4
100 C FR5

998
7 C FR6
101

MFR1**
992

MFR2
966

MFR3
5

descartado
100

MFR4

**NOTA: FR1
MFR5
998
7
101

MFR6
Ctrl (-)
FR1**
Ctrl (-) FR2
Ctrl (-) FR3
Ctrl (-) FR4
Ctrl (-) FR5
1.5% Ctrl (-) FR6
Agarose
Marcador
 Detección de mutaciones por HRM

Extracción
DNA RT

Levadura

qPCR

HRM CP
Microarreglos
Análisis de microarreglos

FLO 5

FLO 11

FLO 1
Herramientas de análisis de microarreglos
-Spot finder: conversión de imagenes .tiff a valores numericos de
intensidad (medido por pixeles).

-GenArise: Determinación de valor Z para detección de genes con

represión/inducción relevante

-FatiGo: Determinación, mediante ontología, de posibles funciones

de los genes seleccionados como relevantes por microarrays.
Expresión global de genes. Análisis Ontológico
Base de datos Saccharomyces Genome Database
 DISEÑO EXPERIMENTAL

2.- Extracción de RNA

1.- Diseñar diferentes

condiciones de
fermentación

3.- Análisis de microarreglos

Genes regulatorios relacionados a floculación

Nombre común Descripción Procesos biológicos Expresión

CLB1 Ciclina B, específica para G2/M Ciclo celular Inducida

CLB2 Ciclina B, específica para G2/M Ciclo celular Inducida
SWE1 Cinasa de especificidad dual, inhibe Cdc28p Ciclo celular Reprimida
BCK2 Supresor de mutaciones de PKC1, su sobreexpresión estimula Estrés osmótico Inducida
transcripción de ciclina B
MSN1 Activador transcripcional involucrado en regulación de Estrés osmótico Inducida
expresión invertasa y glucoamilasa, crecimiento invasivo y
diferenciación pseudohifal (FLO11) y respuesta a estrés
osmótico. Via MAPK
PKC1 Protein cinasa C, con actividad choque hipotónico. Via MAPK Estrés osmótico Reprimida

PTC2 Fosfoprotein fosfatasa tipo 2C, defosforila Hog1p y Cdc28p. Estrés osmótico Inducida
Inactiva vía MAPK al finalizar estrés osmótico
RGD2 GTPasa proteina activadora para Cdc42p y Rho5p. Via Estrés osmótico Inducida
PKC1/MAPK
SLG1/WSC1 Sensor requirido para integridad de pared celular y respuesta a Estrés osmótico Inducida
estrés hipoosmótico, via señalización Ras, PKC1/ MAPK

STE20 Protein cinasa de la vía MAPK participa en respuesta a Estrés osmótico Reprimida
feromonas, choque osmotico, y falta de nutrientes
HIR1 Regulador de transcripción de histonas, correpresor Factores de transcripción Reprimida
SNF12 Componente SWI/SNF activador global de transcripción, Factores de transcripción Reprimida
respuesta a estrés
ESC1 Establece silenciamiento de cromatina en telómeros uniendose Silenciamiento de genes Inducida
a Sir4p
ESC4 Establece silenciamiento de cromatina, regula transposición Silenciamiento de genes Inducida

HHF1 Histona H4. Interactua con Sir4p para silenciamiento de Silenciamiento de genes Inducida
telomeros
HHF2 Histona H4. Interactua con Sir4p para silenciamiento de Silenciamiento de genes Inducida
telomeros
HHT2 Histona H3. Interactua con Sir4p para silenciamiento de Silenciamiento de genes Inducida
telomeros
HTZ1 Variante de histona H2AZ. Regula extensión de silenciamiento Silenciamiento de genes Inducida

TAF60 Factor transcripcional TFIID y subunidad SAGA, similar a Silenciamiento de genes Inducida
histona H4
 Alta concentración de nutrientes

Eliminación de estrés osmótico Estrés osmótico

MOSTO
SLG1
LgFLO1p SLN1 (1.02)
PTC2 CLB1,2
IRE1 (1.0)
SWE1 CDC28 (1.13)
SNF12 MSN1
Chaperonas BCK2
SIR4 (1.24) RGD2
División HOR2
Lg-FLO1 RNAm
celular RHR2
ESC1 ESC4 PKC1
TAF60 HTZ1 Síntesis de PSA1
HHF1 HHF2 glicerol MNN1
HHT1 HIR1 GMH1
Silenciamiento END3
de genes Remodelación OCH1
Lg-FLO1 Subtelomericos pared celular
GUK1
 DNA
Cbf1
Met4 Met28 Me31 Met32

SO42-
Met14
MUP3 APS KINASE NADPH
Low affinity Met3
Methionine ATP
permease sulfurylase 5'-adenylyl sulfate SO32-
ATP Met16
3 NADPH
3 phospho 5 adenylyl sulfate (PAPS) PAPS REDUCTASE
PPi PAP + NADP+ 3 NADP+
Met5 Met10
Sulfite reductase
adenosine S2-
Sulfuro
790
Met25
820 Met13
Homocysteine synthase
CH3

S-Adenosyl Met6
Homocysteine Homocysteine
metyl-transferase O-acetyl homoserine
Methionine
ATP Met2
MHT1 PPi + Pi Homoserine trans-acetylase

CH3

S-AdenosylMethionine Aspartate Homoserine

(AdoMet)
 Glicolisis PDC1 Piruvato
PDC5 Descarboxilasa ADH4 ADH5 SFA1 ATF2
PDC6 ADH1 ADH2 ADH3 ATF1
Piruvato Acetaldehido Alcohol etílico Acetato de etilo
Acetolactato ILV2 Alcohol Acetil transferasa
sintetasa deshidrogenasa
ILV6
2-acetolactato

Acetohidroxiacido
ILV5
reductoisomerasa

2,3 – Dihidroxi-isovalerato

ILV3 Dihidroxyacido 790

dehidratasa
2- cetoisovalerato
BAT1 BAT 2
L-valina
820
Acetyl- CoA Aminotransferasa
Alfa-isopropilmalato
LEU4 LEU9
sintetasa
2-CoenzymeA
isopropilmalato
Isopropilmalato
isomerasa.
LEU 1 3- isopropilmalato
Beta-IPM- Descarboxilasa
LEU 2 dehidrogenasa ADH4 ADH5 SFA1
ARO10
ADH1 ADH2 ADH3 Acetato de
THI3 Alcohol isoamilico
L-Leucine 2- cetoisocaproato 3 metyl butanol isoamilo
BAT1 BAT 2 ATF1 ATF2
 FLO Flocula-
#Genes
Cepa
FLO
ción(mL) Bmax (fmol/cel) Kd
1 5 8 9 10 11 Lg
820 + - + - + + + 5 4.5 0.06445 1.337
790 + - + - - + + 4 2.5 0.04259 7.262
7754 + + - - - + - 3 0 0.001178 0.6071

820 = 38.82 millones sitios / cel

790 = 25.65 millones sitios / cel
7754 = 0.71 millones sitios / cel