ENCB-IPN

5QV1, Sección 3
Práctica: Determinación de Riboflavina por fluorometria

Fundamento:
La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o
espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la
fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz
ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y
provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque
no necesariamente). Una técnica complementaria es la espectrometría de
absorción.
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros.
Su fundamento es la fluorescencia que es la emisión de radiación por electrones
excitados. En el fenómeno de fluorescencia, una molécula absorbe radiación
electromagnética y debido a ello los electrones pasan de un estado basal a otra
fase de excitación.
Objetivos:
 Determinar el efecto del pH sobre el disolvente
 Elegir el mejor disolvente para la riboflavina

Resultados:

Tabla 1. Resultados de Curva de Calibración de riboflavina en diferentes medios

Intensidad de Emisión
Riboflavina
(ppm) CH3COOH
Agua HCl 0.1M NaOH 0.1M
0.9M
0 5 4.98 5 4.98
1 5.91 5.08 5.65 4.99
2 6.74 4.96 6.27 5
3 7.53 5.26 6.88 5.01
4 8.27 5.44 7.4 5.02
5 8.83 5.13 8.01 5.04
10 11.86 5.74 10.16 5.05
50 17.52 6.63 14.09 5.1
pH 5.5 1 4 13
 Curva Tipo de los diferentes disolventes
10

9
f(x) = 0.77x + 5.12
Agua Linear (Agua )
R² = 0.99 HCl Linear (HCl)
8
f(x) = 0.6x + 5.04
R² = 1

Intensidad de Emisión 7

Ácido Acético Linear (Ácido Acético) NaOH Linear (NaOH)

5 f(x) = 0.06x + 4.99
f(x)
R² ==0.39
0.01x + 4.98
R² = 0.98
4
0 1 2 3 4 5 6
Figura 1. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes
Concentración (ppm)
contra la concentración de 0 a 5 ppm.

Curva Tipo de los diferentes disolventes

20

18

16

14

Intensidad de Emisión 12

10

4
0 10 20 30 40 50 60

concentración (ppm)

Agua HCl Ácido Acético NaOH

Figura 2. Curva tipo de emisión de riboflavina donde se incluyen los 4 diferentes disolventes
contra la concentración de 0 a 50 ppm.
Discusión
La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la
absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado
fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones.
En la figura 1 se observa la intensidad de emisión de la riboflavina con diferentes
disolventes. La riboflavina posee un grupo aromático, por lo que la estructura de la
molécula se verá afectada con el pH, siendo el pH alcalino el que afecta más a la
estructura y lo podemos observar en la figura 1, donde el valor de la pendiente para recta
para NaOH es la más baja, esto nos indica que es menos exacto. El agua presenta el
valor más alto de m, nos indica que es el mejor disolvente y que es más exacto.
En la figura 2 se graficaron todas las concentraciones de riboflavina (0-50 ppm). A
concentraciones altas la energía emitida es absorbida por otras molecular por eso se
observa ese comportamiento en la diferentes rectas.
Conclusiones:
 El pH ácido y fuerte no es buen disolvente para la riboflavina
 El mejor disolvente es el agua

Preguntas:
1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima exitación y
de máxima emisión?
Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada
uno presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único.
Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima
emisión o bien los espectros de excitación y emisión.

2. Diga cuáles son las formas coenzimáticas de la riboflavina y cuál es su

papel en el metabolismo molecular.
Dinucleótido de flavina y adenina (FAD), coenzima que transfiere átomos
de hidrógeno; interviene en las oxidorreducciones, para la producción de
energía.
Flavina Mononucleótido (FMN): Requerida en reacciones de óxido-
reducción catalizadas por las deshidrogenasas ligadas a la flavina.
Bibliografía:

Espectroscopia de fluorescencia molecular. [En Línea] [Disponible

en: http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan
%201997/temarios/671111d-archivos/fundamentos/SEMINARIO
%203.PDF]
Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia. Universidad de Alicante. [En
Línea] [Disponible en: http://ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursos-
programados/2011/especifica/microscopia-optica/microscopia-optica-y-laser-
confocal-2a-ed/tema-5.pdf]