Enzimas: catalizadores biológicos

Son capaces de aumentar la velocidad de reacciones

químicas.

Son muy eficientes, específicas y no se consumen en la

reacción.

PUEDEN AUMENTAR LA VELOCIDAD DE LA REACCION

MAS DE UN MILLON DE VECES
 Cinética enzimática

Estudia cómo cambia la velocidad de reacción (vo) en

respuesta a la modificación de diferentes factores:

• concentración de ligandos (sustratos, inhibidores y activadores)

• concentración de enzima
• condiciones ambientales (pH, temperatura, fuerza iónica)
 ¿Qué es vo y cómo se determina experimentalmente?

A tiempos muy
cortos (iniciales) las
graficas de [P] vs
tiempo son lineales.
A tiempos mayores
se puede inactivar E,
se da la reacción inversa, se
consume S,
puede haber inactivación por P.
 V = velocidad de formación del producto

CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO POR UNIDAD DE TIEMPO

UTILIZANDO UNA CONCENTRACION DE ENZIMA FIJA PUEDO REALIZAR

CINETICAS VARIANDO LA CONCENTRACION DE SUSTRATO
Y DETERMINAR LAS VELOCIDADES INICIALES O Vo PARA CADA
4
CONCENTRACION DE SUSTRATO.
 Relación observada entre la velocidad inicial (v0)
y la concentración inicial de sustrato ([S]0)

Cada velocidad determinada experimentalmente

Variando la concentración de sustrato
Manteniendo constante la cantidad de enzima

Velocidad
Vo

Concentración de Sustrato
 Los estudios cinéticos proporcionan
información acerca:

DEL MECANISMO DE REACCION

LA ESPECIFICIDAD DE LA ENZIMA

DE CUALES MOLECULAS INHIBEN O

ACTIVAN DICHA ENZIMA
 MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN

Propusieron una ecuación de

velocidad que explica el
comportamiento cinético de
NUMEROSAS ENZIMAS

FORMACIÓN DEL
COMPLEJO
ENZIMA-
SUSTRATO
 Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente
ocurren en dos etapas:
- Formación del complejo ES
- Formación del producto P, liberando el enzima libre E

k1 kcat
E + S ES P+E
k-1

En este esquema, k1, k-1 y kcat son las constantes cinéticas

individuales de cada proceso y también reciben el nombre
de constantes microscópicas de velocidad.

v1 = k1 [E] [S]
v2 = k-1 [ES]
v3 = kcat [ES]

Se asume que la reacción inversa de P+E, a EP y luego a ES se produce tan poco que la podemos ignorar
Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la
concentración del complejo ES es pequeña y prácticamente constante a lo largo de
la reacción.

Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de

su disociación (v2+ v3):
v1 = v2 + v3

k1 kcat
E + S ES P+E
k-1

Además, como [ES] es

constante, la velocidad de
formación de los productos
es constante:

v = v3 = kcat [ES]
 En el estado estacionario [ES] es prácticamente constante:

d[ES]/dt=0

k1 kcat
E + S ES P+E
k-1

Velocidad de disociación de ES = velocidad formación de ES

Velocidad de disociación de ES = (K-1 + Kcat)[ES]

Velocidad de formación de ES =K1[E][S]

(K-1 + Kcat)[ES] - K1 [E][S] = 0

 (K-1 + Kcat)[ES] - K1 [E][S] = 0

Despejamos [ES]

[ES] = k1 [E][S]
(K-1 + Kcat)

Dado que la enzima libre [E] es igual a [Eo]-[ES]

puedo reescribir la ecuación como:

[ES]=( K1 ) ([Eo]-[ES]) [S]

K-1 + Kcat

Reordenando y definiendo la
constante KM como (K-1+Kcat) ES   E0 S 
K1 K M  S 
 k1 kcat
E + S ES P+E
k-1
Tenemos que

ES   E0 S 

K M  S  k2 E0 S 
V0  cat

K M  S 
Recordando que V = Kcat [ES]
Ecuación
de
KM como (K-1+Kcat)
K1 Michaelis-Menten

Para cualquier reacción enzimática, [Eo], kcat y KM son constantes

¿ Qué ocurre cuando [S] >>> Km? cuando [S] >>> Km estamos en Vmax

A altas [S], el enzima se

encuentra saturada por el
sustrato, y la velocidad ya
no depende de [S].

En este punto, la reacción

GRAFICO DE
es de orden cero y la Michaelis-Menten
velocidad es máxima (Vmax).

vo = kcat [Eo][S]
Km + [S]

como la Km es muy baja respecto a [S], la km despreciable, vo = kcat [Eo] [S]

[S]
vo = kcat [Eo]
a Vmax todos los sitios activos están ocupados y no hay
casi moléculas de enzima libre E por lo cual [ES]=[Eo]

Vmax [S]
• por lo tanto v = Kcat [ES] puedo expresarla como vo =
KM + [S]
v = Kcat [Eo] = Vmax
 kcat denominada constante catalítica o número de recambio

cuando la [S] >>> Km

• por lo tanto v = Kcat [ES] puedo expresarla como

v = Kcat [Eo] = Vmax

Útil para reacciones donde entran en juego varias constantes de velocidad ya que
esta constante de velocidad describe el pazo limitante en condiciones de saturación.

Esta constante de denomina constante catalítica kcat o número de recambio.

Es una constante de velocidad de primer orden igual al número de moléculas de S

procesadas por sitio activo dela E en cada segundo cuando todos los sitios
activos están ocupados.
VMAX = kcat [Eo]

kcat=VMAX/[Eo]

Tiene unidades de tiempo-1 y es expresada en s-1

Entonces si sabemos la VMAX y la [Eo] podemos calcular kcat para cada 14

enzima/sustrato
 Kcat (constante catalítica)
número de moléculas de S procesadas por la molécula de E cada segundo

COMPARACION DE Kcat DE DIFERENTES ENZIMAS

 •¿Qué ocurre cuando [S] <<< Km?

Cuando [S] es pequeña, la

velocidad inicial es directamente
proporcional a la concentración de
sustrato, y por tanto, la reacción
es de primer orden.

vo = Vmáx [S]
Km + [S]

como la [S] es muy baja respecto al Km, [S] es despreciable, vo = Vmáx [S]
Km
En este caso vo tiene una dependencia lineal con la [S].
• Qué ocurre cuando vo = ½ Vmáx?

despejando queda que Km = [S]

• Km es la [S] a la cual v = ½ Vmax

Km representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse a la mitad de la
E disponible y producir la mitad de la Vmax
 Km
• Es una constante que tiene unidades de concentración.

Si para una E y S determinados contamos con el valor de km esto nos permitirá:

- conocer la fracción de sitios activos que están ocupados a una [S] dada:

- conocer la concentración celular de [S] aproximada

-conocer la [S] necesaria para una catálisis significativa

 La Km como cociente de constantes de velocidad de la reacción

Km = k-1 + k2
k1
y si k2 <<< k-1 y como la constante de disociación del
complejo ES viene dado por:
Km = k-1 Solo en esta situación
KES = [E][S] = k-1
k1 la km da idea de la afinidad
[ES] k1 17
de la E por el S
 Km = k-1
k1

KM alto = asociación débil entre ES (k1 pequeña) = baja afinidad de E por el sustrato

KM bajo= asociación fuerte entre ES (k1 grande) = alta afinidad de E por el sustrato.
 La constante de especificidad kcat/KM

cuando la [S] <<< Km

vo = kcat [Eo] [S]

Km

La relación kcat/Km es equivalente a la constante de velocidad

para la reacción entre E y S.

-vo depende de [Eo] y [S] por lo tanto es una ecuación de segundo orden y la
constante kcat/Km tiene unidades de Molar-1 segundos-1.

• Es una constante útil para comparar la eficiencia catalítica de diferentes enzimas,

o una enzima respecto a dos sustratos diferentes.

- En las células, las reacciones nunca se encuentran en condiciones de VMAX (pero in

vitro la pueden alcanzar)
- Los sustratos se encuentran generalmente en el orden de concentración μmolar, las
enzimas en el orden de concentración nanomolar.

El limite superior de kcat/KM es la constante de difusión (109 M-1 s-1)

Comparar valores de eficiencia catalítica o
Kcat/Km

20
21
¿Cómo determino experimentalmente VMAX y KM?
Utilizando [E] fija
puedo realizar varios ensayos cinéticos variando [S]
y determinar vo para cada [S] ensayada.

4 vo
Hyperbl Fit of vo
vo (microM/min)

Equation y = P1*x/(P2 + x)
3
Adj. R-Square 0,9967
Value Standard Error
vo P1 6,78703 0,28758
vo P2 1,2246 0,13189

0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
[S] (mM)

http://src.sfasu.edu/~avk/BTC560/HOW%20TO.htm
 Curva de mejor ajuste a la ecuación de Michaelis-Menten

Fosfatasa silvestre Fosfatasa mutada D126A

PtpA PtpA D126A

evita problemas asociados a las linearizaciones

Referencia donde profundizar

Tommasini, R., Endrenyi, L., Taylor, P. A., Mahuran, D. J., Lowden, J. A. (1985)
A statistical comparison of parameter estimation for the Michaelis-Menten kinetics of
human placental hexosaminidase. Can. J. Biochem. Cell Biol. 63, 225-230.
23
 Vmax kcat Km
(mmol pNP min-1 m (sec-1) (mM)

PtpA silvestre 4.8 1.59 3.4

PtpA D126A 0.1 0.03 4.8

24
Linearización de la ecuación de M-M
Gráfico de dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk
Grafico de Hanes-Wolff
 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

• Una molécula de enzima no tiene por qué actuar siempre a la

misma velocidad. Su actividad puede estar modulada por:
• cambios en el pH
• cambios en la temperatura
• presencia de cofactores
• las concentraciones del sustrato y de los productos finales
• presencia de inhibidores
• modulación alostérica
• modificación covalente

27
29
 INHIBICION COMPETITIVA

Al aumentar la [I] mayor [S] será

necesaria para lograr una velocidad
dada.

Si aumento luyo la [S] puedo revertir la

inhibición y llegar a Vmax

Veré efecto en el Km, aumenta

30
Vmax no se altera, Km aumenta

31
 INHIBICION NO COMPETITIVA

El inhibidor puede unirse a la

enzima libre y también al
complejo ES.

Aunque aumente la [S] no se

logra llegar a valores de Vmax,

El Km no cambia, hay menos

enzima disponible, pero el S se
une con la misma “afinidad” al
sitio activo de la enzima.

32
Km no se alterad, Vmax disminuye

33
Ejemplo de inhibidores
La penicilina, inhibe una transpeptidasa implicada en la síntesis de
péptidogilcano, componente fundamental de la pared celular bacteriana.

34
 MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

• Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones

interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa).

• R es la forma más activa porque se une al sustrato con más

afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio
R <==> T

• Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los

llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a
menudo un modulador positivo.

• Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre

una región del enzima distinta del centro activo son los
activadores alostéricos

35
 Enzimas alostéricas
(del griego allos-otro y stero-tridimensional)

• Tienen dos o mas lugares de unión que interactúan entre si

• Se cree que la mayoría de las proteínas son alostéricas
• La enzima puede existir en una conformación activa e
inactiva

Proteína que cambia de una conformación a otra cuando se une a otra

molécula o cuando es modificada covalentemente, el cambio de
conformación altera la actividad de la proteína

36
LAS ENZIMAS ALOSTERICAS NO OBEDECEN
LA CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN

ENZIMAS MULTIMERICAS,
MAS DE UN SITIO ACTIVO

EFECTO COOPERATIVO:

La unión de la primera molécula

de ligando incrementa la afinidad
de la otra subunidad por la misma
molécula de ligando

37
Las actividades catalíticas están reguladas

para controlar la compleja red de vías

metabólicas

Se requieren elaborados controles para

regular CUANDO y a que VELOCIDAD tiene
lugar cada reacción.

38
 LOS COMPLEJOS MULTIENZIMATICOS
AYUDAN A INCREMENTAR
LA VELOCIDAD
DEL METABOLISMO CELULAR

39
Figure 3-54a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
 40
Figure 3-54b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)