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ar

CAPITULO S

GENETERAPIA

Stephen L. Eck y James M Wílsan

Entre los adelantos en biología molecular y celular destaca la identificación de las proteí­
nas que median muchos procesos patológicos; la tecnología de DNA ha permitido el acceso
expedito a los genes que rigen estos fenómenos. El tamaño, la complejidad y la inaccesibilidad
celular de dichas prole/nas hacen que sea casi imposible "introducirlas" o modificarlas por

r
los medios farmacológicos corrientes. La geneterapia supera estas barreras mediante la

.a
introducción selectiva de DNA recombinante en tejidos, de tal forma que es posible sinteti­
zar las proteínas biológicamente activas dentro de las células cuyas funciones se busca

m
modificar. De esta manera, esa introducción de DNA recombinante se ha vuelto una opera­

.co
ción fondamental en todas las estrategias de geneterapia. Se han creado diversos sistemas
para la introducción de DNA en ciclos de la vida viral, encapsulación de liposomas, inyec­
ción directa y elaboración de complejos con proteínas portadoras. Concebida originalmen­

s
te para el tratamiento de defectos hereditarios monogénicos, la genelerapia ha encontrado
aplicación en enfermedades adquiridas como el cáncer y los trastornos cardiovasculares e
co
infecciosos. El capitulo presente ofrece una introducción a los aspectos terapéuticos y las
estrategias actuales que se investigan para la aplicación de la geneterapia a muy diversas
i
ed
enfermedades.
m

CAMPO DE ACCION DE de los trastornos en cuestión se cuenta con tratamientos

es

LA GENETERAPIA basados en la restitución de la proteína defectuosa o fal­

tante (como seria el factor VIII en la hemofilia, transfu­
nt

La transferencia de genes con fines terapéuticos no es un siones en la enfennedad drepanocítíca y adenosindesami­

concepto nuevo (Wolff y Lederberg, 1994). Más de 20 años nasa en el síndrome de inmunodeficiencia combinada
u

antes de que se realizara en seres humanos la primera trans­ grave). Es más, dichos tratamientos sólo tienen eficacia
ferencia génica, Edward Tatum especuló que: "Incluso parcial para aplacar las manifestaciones del trastorno, y
ap

podemos ser un tanto optimistas respecto a las posibilida­ conllevan complicaciones importantes. Casi en ninguna en­
des a largo plazo de una terapia fundamentada en el aisla­ fennedad de origen genético es factible "suministrar" la
w.

miento o diseño, síntesis e introducción de nuevos genes proteína fattante en una forma terapéutica, dada su natura­
en células defectuosas de órganos particulares" (Tatum, loza compleja y frágil, y la necesidad de hacerla llegar a
1966). El tratamiento de enfennedades del ser humano por
ww

un sitio subcelular específico (p. ej., expresión en superfi­

medio de transferencia génica fue concebido originalrqente
como un recurso para tratar padecimientos derivados de
defectos de un solo gen (monogénicos). Las enferme­
dades hereditarias comprenden trastornos de muy diver­
sa índole en los que un gen defectuoso determina que no
se sintetice una proteína particular, o que se elabore. una
anormal. En uno y otro casos) la ausencia de la proteína
normal puede ocasionar muy diversas manifestaciones clí­
nicas, según la función estructural o enzimática que nor­
malmente ejerce dicha proteína en las células. Los cua­
dros en cuestión varían desde leves, que no necesitan
tratamiento (como el daltonismo o ceguera cromática),
hasta enfennedades que pueden ser letales (como hemofi­
lia o fibrosis quística). En ténninos generales, se trata de
enfennedades heterogéneas en las que ha resultado inade­
cuada la fannacoterapia corriente. Sólo para unos cuantos
cie celular, localización en 11sosomas y otras situaciones).
En algunos casos se ha trasplantado todo el órgano afecta­
do (p. ej., médula ósea en la enfermedad drepanocítica, o
hígado en hiperlipidemias), pero esta técnica también ti�­
ne graves limitaciones, es decir, la disponibilidad de órga­
nos por injertar y las consecuencias adve;sas que nacen de
la inmunosupresión necesaria para evitar el rechazo de un
tejido alógeno.
El problema de introducir proteínas complejas podría
evitarse si se suministrara una copia nonnal del gen defec­
tuoso a los tejidos afectados, dado que así podría ser sinte­
tizada dentro de las células, utilizando las vías celulares
normales. El gen defectuoso está en "todas las células de
una persona con el trastorno hereditario, pero sólo unos
cuantos tejidos u órganos expresan en realidad el gen, y
manifiestan daño. Los defectos en genes que funcionan en
83
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84 Sección / Principios generales
houseke­
todas las células del cuerpo (llamados en inglés
eping genes: "amos de llaves") suelen ocasionar anoma­
lías tan graves que queda anulado el desarrollo embriona­
rio. El número limitado de tejidos afectados por casi todos
los trastornos hereditarios simplifica en grado sumo las
exigencias de la geneterapia eficaz, puesto que se necesita
introducir una copia funcional del gen sólo en los tejidos
que en realidad lo requieren. Por tanto, con la geneterapia
se busca corregir por medios genéticos el defecto de sólo
una parte del cuerpo. Dado que este procedimiento fue
ideado para no alterar la estructura genética de los órga­
nos de la reproducción, no evita la transferencia del pro­
blema genético a generaciones ulteriores. Sin embargo, se
le ha concebido como un medio poderoso para aminorar o
revertir las consecuencias metabólicas en el sujeto trata­
do. La mejor manera de dirigir el gen terapéutico hacia un
tejido específico es un tema de extraordinario interés en
todas las aplicaciones de la geneterapia. Aún más, si la
transferencia génica pudiera orientarse a grandes órganos
afectados, podrían evitarse los efectos adversos que deri­
van de la expresión de un gen ectópico en células que no
son el blanco elegido. Como ocurre con otros agentes far­
macéuticos, el suministro citoespecífico tiene la ventaja
de disminuir el volumen eficaz de distribución y la canti­
i co
dad del agente necesario en la transferencia génica. Di­
ed
chos sistemas de dirección específica todavía no están dis­
ponibles en el terreno de los fármacos o del material
genético, pero es razonable esperar que el enorme interés
m
que ha despertado la geneterapia dé por resultado nuevos
es
métodos aplicables a la introducción de DNA y sustancias
fannacéuticas comentes por igual, al interior de la célula.
En los sistemas de suministro o penetración de DNA que
nt
están en fase de estudio se utilizan diversos agentes quí­
micos, fisicos y biológicos.
u
ap
El primer experimento de transferencia génica en seres huma­
nos se hizo en 1989, en estudios de marcación de linfocitos.
Aunque no produjeron beneficio terapéutico, estas investigacio­
w.
nes demostraron que la transferencia génica podia realizarse sin
riesgo s, y también aportaron datos de muchas de las dificultades
ww
técnicas del procedimiento (Rosenberg y col., 1990). Los linfo­
citos resultaron ser células idóneas para los estudios iniciales de
geneterapia, porque pueden aislarse con facilidad y manipularse
ex vivo. De este modo, el "ataque" a un blanco especifico se
logró por extracción fisica y manipulación de las células del re­
ceptor, y no por la creación de un sistema de suministro directo
de kJs genes, hasta la fecha muy dificil de obtener. Los linfoci­
tos también mostraban el atractivo de ser el asiento celular de
varios tcastomos hereditarios y adquiridos (como serían la in­
munodeficicncia combinada grave, la infección por VIH, la en­
fermedad de injerto contra huésped y diversos cánceres). Ade­
más de su fácil aislamiento, cabía esperar que los linfocitos
viviesen largo tiempo después de ser devueltos al receptor y, de
este modo, brindaran beneficio a largo plazo en el caso de tras­
tornos crónicos. Por tanto, la transferencia génica de linfocitos
constituye un modelo importante de geneterapia, :' prosiguen
las investigaciones en este campo para el tratamiento de innu-
merables trastornos. En septiembre de 1990 se probó por prime­
ra vez la geneterapia en seres humanos, como método terapéuti­
co posible. La transferencia ex vivo del gen de la adenosin­
desaminasa (ADA) en los linfocitos de un niño que tenía una
deficiencia letal de esa enzima (hasta ese momento) fue realiza­
da en Estados Unidos por los National Institutes ofHealth (Ander­
son y col., 1990). Los resultados de tal investigación, aunque no
se publicaron en detalle, fueron alentadores y constituyeron el
punto de partida para la creación de muchos tipos nuevos de
geneterapia.
La mayor parte de los estudios de geneterapia que están
en marcha se orientan al tratamiento de trastornos adquiri­
dos como el SIDA, cánceres y enfennedades cardiovascu­
r
lares, en vez de trastornos que resultan de defectos monogé­
.a
nicos (cuadro 5-1), es decir, que provienen de un solo gen.
La aplicación de la geneterapia a cuadros adquiridos ha
m
tenido un ritmo más rápido que las aplicaciones en defec­
tos monogénicos, por varias razones. Entre éstas sobresa­
.co
le la dificultad de lograr la expresión génica a largo plazo
(meses o años), que muy probablemente se necesitará para
tratar las enfennedades genéticas. La disponibilidad de un
s
gran conjunto de candidatos con trastornos adquiridos gra­
ves y que pueden causar la muerte a muy breve plazo (en
particular cáncer y SIDA) brindan una oportunidad clíni­
ca para crear nuevas estrategias de "introducción" de DNA
que puedan aplicarse más tarde a trastornos hereditarios.
A diferencia de las enfennedades hereditarias en que se
ha definido con precisión un defecto genético, en la ma­
yor parte de las aplicaciones de la geneterapia en enfer­
medades adquiridas se conocen con menor precisión las
bases moleculares. En vez de corregir un defecto subya­
cente conocido, el método intentado ha sido añadir nuevas
funciones moleculares capaces de alterar el curso de la
enfennedad o el bloqueo de una función existente, en vez
de corregir una deficiencia subyacente básica.
Consideraciones generales en la geneterapia
Trastornos hereditarios. Para que la inserción de un
nuevo gen tennine por corregir una deficiencia, es indis­
pensable que el producto de dicho gen exista en cantida­
des suficientes para lograr un efecto terapéutico. El grado
de función proteínica necesario para lograr la complemen­
tación del defecto varía enonnemente entre una y otra en­
fermedades genéticas. A menudo, dicho grado se puede
deducir de observaciones clínicas en que se compara la
intensidad de la enfermedad con la magnitud de la defi­
ciencia; así ocurre en las hemofilias, en las que el grado de
las complicaciones hemorrágicas es en general proporcio­
nal a la magnitud de la deficiencia. Tales estimaciones no
se pueden hacer en otros trastornos como la fibrosis quís­
tica, en la que se desconoce el grado de expresión génica
del regulador del transporte de la enfermedad (CFTR) en
las células de las vías respiratorias y de otros epitelios,
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Capítulo 5 Geneterapia 85

Cuadro 5_1.Estudios de geneterapia terapéutica aprobados por el Recombinant DNAAdvisory COlDmittee, de los N.Uo.al Institales of
Health,* de Estados Unidos

Investigador Fecha de
Título del protocolo principal aprobación

Gene Therapy of Patients with Advanced Cancer Using Tumor Infiltration Lymphocytes Transduced with S.A. Rosenberg 7/31/9IJ
the Gene Coding for Tumor Necrosis Factor.
Immunization of Cancer Patients Using Autologous Cancer Cells Modified by Insertion of the Gene for S.A. Rosenberg HYl191
Tumor Necrosis Factor (TNF)
Immunization of Cancer Patients Using Autologous Cancer Cells Modified by Insertion of the Gene for S.A. Rosenberg IOm91
Inlerleukin-2 (IL-2).
Ex vivo Gene Therapy of Familial Hypercholesterolemia. lM. Wilson 1018191
Treatment of Severe Combined Immune Deficiency (SCID) Due to Adenosine Deaminase (ADA) Deficiency R.M. Blaese 2110192

r
with Autologous Lymphocytes Transduced with the Human ADA Gene: An Experimental Study

.a
Immunotherapy of Malignancy by in vivo Gene Transfer into Tumors GJ. Nabel 2110192

m
Gene Transfer for the Treatment of Cancer. S.M. Freeman 2110192
Gene Therapy for the Treatment of Recurrent Glioblastoma Multiforme with in vivo Tumor Transduction K.W. Culver 311192

.co
with the Herpes Simplex-Thymidine Kinase Gene/Ganciclovir System.
A Phase I Study, in Cystic Fibrosis Patients. of the Safety, Toxicity. and Bio!ogical Efficacy of a Single R.G. Crystal 5117/92
Administration of a Replication Deficient, Recombinant Adenovirus Carrying the cDNA ot" the Normal
Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene in the Lung.

s
Phase 1 Study of Cytokine-Gene Modified Autologous Neuroblastoma Cells for Treatment of Relapsedl M.K. Brenner 6/1/92
Refractory Neuroblastoma. co
Gene Therapy for the Treatment of Brain Tumors Using Intra-Tumoral Transduclion with the Thymidine
i E.Oldfield 6/1/92
Kinase Gene and Intravenous Ganciclovir
ed
Immunization wilh HLA-A2 Matched Allogeneic Melanoma Cells Ihal Secrete Interleukin-2 in Patients B. Gansbacher 6/2192
with Metastatic Melanoma.
lmmunization with Interleukin�2 Secreting Allogeneic HLA-A2 Matched Renal Cell Carcinoma Cells in B. Gansbacher 6/2192
m

Patients with Advanced Renal Cell Carcinoma.

es

Clinical Protocol for Modificalion of Oncogene and Tumor Suppressor Gene Expression in Non-Small Cel! l.A. Roth 9/15/92
Lung Cancer (NSCLC).
Gene Therapy of Cancer: A Pilot Study of IL-4 Gene Modified Antitumor Vaccines. M.T. Lotze 9/15/92
nt

Gene Therapy of Cyslic Fibrosis Lung Diseases Using El Deleted Adenoviruses: A Phase 1 Tria!. J.M. Wilson 12/3/92
Cystic Fibrosis Gene Therapy Using an Adenovirus Vector: In vivo Safely and Efficacy in Nasal Epithelium. MJ. Welsh 1214192
u

Phase I Sludy of Non-Replicaling Autologous Tumor Cell Injections Using Cells Prepared With or Without J. Simons 3/1/93
ap

Granulocyle-Macrophage Colony Stimulating Factor Gene Transduction in Patients with Metastati(.; Renal
Cel1 Carcinoma.
Administration of Neomycin Resistance Gene Marked EBV Speófic Cytotoxk T LympyhocYles to Recipients H.E. Heslop 3/2/93
w.

of Mismatched-Related or Phenotypkal1y Similar Unrelated Donor Marrow Grafts.

A Phase 1 Study of Gene Ther.apy of Cystic Fibrosis Utilizing a Replication Deficient Recombinant Adenovirus R.W. Wilmott 3/2/93
ww

Vector 10 Deliver the Human Cystic Fibrosi� Transmembrane Conductance Regulator cDNA to the Airways.
Gene Therapy for Cystk Fibrosis Using El Deleted Adenovirus: A Phase 1 Trial in the Nasal Cavity. R.e. Boucher 3/2193
A Phase 1 Trial of Human Gamma lnterferon-Transduced AUlologous Tumor Cells in Pacierus With H.E Seigler 6/7/93
Disseminated Malignant Melanoma.
Use of Safety-Modified Retroviruses to Introduce Chemotherapy Resistance Sequences into Normal A.B. Deisseroth 6n/93
Hematopoietic Celb for Chemoprotection During the Therapy of Ovarían Cancer: A Pilot Tría!'
Immunotherapy for Cancer by Dire(.;! Gene Transfer into Tumors G.J. Nabel 6m93
Gene Therapy for Gaucher Disease: Ex vivo Gene Transfer and Autologous Transplantation of CD34+ Cells. lA. Barranger 6n/93
Retroviral Mediated Transfer of Ihe (.;DNA for Human Glucocerebrosidase into Hematoroiclic Stem Cells S. Karlsson 6/7/93
of Patients with Gaucher Disease.
A Preliminary Stud)' to Evaluate the Safcty and Bio!ogic Effects of Murine Rclroviral Vector Encoding lE. Galpin 6/7/93
HIV-l Genes [HIV-IT(V)) in Asyml?tomatic Subjects Infected with HIV-l.
A Molecular Genetic Intervention for AlDS-Effects of a Transdominant Negative Form of Rev. G.J. Nabe! 6n/93
Gene Therapy for the Treatment of Recurrent Pediatric Malignant Astrocytomas with in vivo Tumor c. Raffel 6/8/93
Transduction with the Herpes Simplex-Thymidine Kinase Gene.
Human MOR Gene Transfer in Palients with Advanced Cancer. C. Hesdorffer 6/8/93

• Los protocolos incluidos en este cuadro fueron 'Ios aprobados hasta agosto de 1994. Lo� detalles de estos ensayos clínicos se publicaron en la revista

mensual Human Gene Therapy. (ColltinlÚl)

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86 Sección 1 Principios generales

C uadro 5-1. Estudios de geneterapta terapéutica aprobados por el Recombinant DNAAdvisory Committee, de los National Institutes oC
Healtb,* de Estados Unidos (Continuación)

INVESTIGADOR Fecha de
Título del protocolo PRiNCIPAL aprobación

Gene Therapy for Human Brain Tumors Using Episome·Based Antisense cDNA Transcription of Insulin-Like J. lIan 6/8/93
Growth Factor 1.

Immunization of Malignant Melanoma Patients with Imerleukin 2-5ecreting Melanoma Cells Expressing T.K. Das GUpla 9/10193
Defined Allogent'ic Histocompatibility Antigens.

Retroviral Mediated Transfer of the Human Multi-Drug Resistance Gene (MDR-l) into Hematopoietic Stem J. O'Shaughnessy 9/9/93
Cells During AUlologous Transplantation after Intensive Chemotherapy for Breast Cancer.

Gene Therapy for Recurrent Pediatric Brain Tumoes. L.E. Kun 9/9/93

A Phase 1 Clinical Trial to Evaluate the Safety and Effects in HIV-I Infected Humans of Autologous F. Wong-Staal 9/10193
Lymphocytes Transduced with a Ribozyme that Cleaves HIV-I RNA.

r
GeneticalIy Engineered Autologous Tumor Vaccines Producing Interleukin-2 for the Treatment of J.S. Economou 9/10/93

.a
Metastalic Melanoma.

Intrathecal Gene Therapy for the Treatment of Leptomeningeal Carcinomatosis. E.H. Oldfield 12/2193

m
lnjection of Colon Carcinoma Patients with Autologous Irradiated Tumor Cells and Fibroblasts RE. Sobol 12/2/93
Genetically Modified to Secrete Interleukin-2.

.co
Retrovirus-Mediated Transfer of the cDNA for Human Glucocerebrosidase into Peripheral Blood F. Schuening 12/2/93
Repopulating Cells of Patients with Gaucher's Disea!iC.

An Open Label, Phase VII Clínical Trial to Evaluate the Safety and Biological Activity of HIV-IT (V) R Haubrich 12/3/93

s
(HIV-l I1BenvlRetroviral Vector) in HIV-} Infected Subjects.

M. Sznol 12/3/93
co
A Phase I Trial of B7-Transfected Lethally Irradiated Allogeneic Melanoma Cell Lines lo Induce Cell
Mediated Immunity Against Tumor-Associated Antigens Presented by HLA-Al in Patients with Stage IV
Melanoma.
i
Phase I Study of Immunotherapy of Advanced Colorectal Carcinoma by Direct Gene Transfer into Hepatic J. Rubin 12/3/93
ed
Metastases.

Adoptive Immunotherapy of Melanoma with Activated Lymph Nade Cells Primed in vivo with Autologous A.E. Chang 12/3/93
Tumor Cells Transduced with the IL-4 Gene.
m

Gene Therapy for Cystic Fibrosis Using Cationic Liposome Mediated Gene Transfer: A Phase I Trial of EJ. Sorscher 1213/93
Safely and Efficacy in the Nasal Airway.
es

Adenovirus-Mediated Gene Transfer of CFTR to the Nasal Epithelium and Maxillary Sinus of Palients with M.J. Welsh 1213/93
Cystic Fibrosis.
nt

A Phase 1 Study of Immunization with Gamma Interferon Transduced Neuroblastoma Cells. 1. Rosenblatt 3/3/94

A Phase un Pilot Study of the Safely of the Adoptive Transfer of Syngeneic Gene-Modified Cytotoxic R Walker 3/3/94
u

T-Lymphocyles in HIV-Infected Identical Twins.

ap

Expression of an Exogenously Administered Human Alpha-I-Antitrypsin Gene in the Respiratory Tract of K. Brigham 3/3194
Humans.

Phase 1 Study of Immunotherapy tor Metastatic Renal Cell Carcinoma by Direct Gene Transfer into N. Vogelzang 3/4194
w.

Metastatic Lesions.

Phase 1 Study of Immunotherapy of Malignant Melanoma by Direct Gene Transfer. E. Hersh 3/4/94
ww

Phase I Trial of a Polynucleotide Augmented Anti-Tumor Irnmunization of Human Carcinoembryonic D. Curiel 6/9/94
Antigen in Patients with Metastalic Colorectal Cancee.

Clinica} Trial to Assess the Safety, Feasibility, and Efficacy of Transferring a POlentially Anti-arthritic C.H. Evans 6/9/94
Cylokine Gene to Human Joints with Rheumatoid Arthritis.

Use of Safety-Modified Retroviruses to Introduce Chemotherapy Resistance Sequences into Normal A. Deisseroth 6/9194
Hemalopoietic Cells for Chemoprotection During the Therapy of Breast Cancer: A Pilot Tria!'

Retroviral Mediated Gene Transfer of the Fanconi Anemia Complementation Group C Gene to J.M. Liu 6/9/94
Hematopoietic Progenitors of Group C Patients.

Clinical Protocol for Modification of Tumor Suppressor Gene Expression and Induction of Apoptosis in Non­ J.A. Roth 6/10194
SmalJ Cell Lung Cancer (NSCLC) with an AdenovirusVector Expressing Wildtype p53 and Cisplatin.

Infection of Glioblastoma Patients with Tumor Cells Genetically Modified to Secrete Interleukin-2 (lL-2): R.E. Sobol 6/10/94
A phase 1 Study.

IL-2 Gene Therapy Using Direct Injection of Tumor with Genetically Engineered AutoJogous Fibroblasts. M.r. Lotze 6/10/94

Phase UIl Study of Autologous Human GM-CSF Gene Transduced Prostate Cancer Vaccines in Patients with 1. Simons 8/3/94
Metastatic Prostate Carcinoma.

* Los protocolos incluidos en este cuadro fueron los aprobados hasta agosto de 1994. Los detalles de estos ensayos clinicos se publicaron en la revista
mensual Human Gene Therapy
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necesario para lograr beneficios terapéuticos. En dicha
entidad, la gravedad del trastorno guarda relación con el
tipo de defecto genético y no con el nivel de expresión
proteínica. Estos problemas revisten mayor complejidad
en enfermedades en las que la expresión génica debe rea­
lizarse en forma altamente regulada. Un ejemplo es la ta­
lasemia, que nace de defectos en la síntesis de las cadenas
a o f3 de hemoglobina. La producción excesiva de una u
otra cadenas de subunidades por transferencia de un gen
terapéutico no regulado, podría causar tanto daño como la
propia enfermedad.
Trastornos adquiridos. Desde el punto de vista meca­
nístico, la geneterapia en enfennedades adquiridas puede
ser más flexible en términos del DNA insertado, que la de
enfermedades hereditarias. En estas últimas el objetivo de
la intervención es un solo gen defectuoso que causa en
forma típica el trastorno. En cambio, en enfermedades ad­
quiridas un gen defectuoso que contribuye en forma di­
recta al trastorno u otro gen que media un proceso bioquí­
mico sin relación alguna, pudieran ser los blancos o bases
de la intervención. Esta diversidad de métodos para tratar
enfermedades adquiridas se ilustra por las estrategias de
geneterapia que se han propuesto para combatir el SIDA y
i
ed
diversos cánceres. El tratamiento de la infección por VIH
puede basarse en la interrupción de procesos virales que
contribuyen de modo directo a la patogenia del SIDA, 10
m
cual podría lograrse por varios métodos, como la inser­
es
ción de un gen que produce mRNA "contrasentido", RNA
catalítico (ribozimas), y una proteína mutante negativa
dominante.
nt
Vacunación. La vacunación mediada por transferencia
u
génica se ha vuelto un terreno en expansión rápida que
ap
puede aplicarse al tratamiento de enfermedades no infec­
ciosas e jnfecóDsas.
w.
Vacunación contra enfermedades no infecciosas. La gene­
terapia contra enfermedades neoplásicas incluye los intentos de
ww
someter a ingeniería genética una respuesta inmunitaria a las
células tumorales. La idea de utilizar células neoplásicas para
desencadenar una respuesta inm\l.nitaria antitumoral se basa en
las raras observaciones clínicas de regresión espontánea de un
tumor, el hecho de que algunos cánceres son más frecuentes en
huéspedes inmunodeficientes, y la identificación de antígenos
oncorreactivos presentes en tumores distintos. Las estrategias
generales propuestas incluyen la transducción de células neo­
plásicas autólogas (o linfocitos qUe infiltran el tumor), de modo
que secreten una citocina especifica (como sería el factor de
necrosis tumoral, la interleucina-2, la interleucina-4, el ¡oterfe­
rón y y otras); inducir en las células tumorales la expresión de
un antígeno potente de rechazo (como sería la compatibilidad
mayor alogénica o moléculas del complejo de histocompatibili­
dad mayor) e inducir la expresión en las células tumorales, de
moléculas que coestimulen linfocitos (p. ej., B7-1). Algunos de
estos procedimientos han llegado a la etapa de estudio en seres
humanos, pero los dato� de los ensayos de fase I son demasiado
Capítulo 5 Geneterapia 87
escasos como para continuar su eficacia terapéutica (las revi­
siones de este tema se exponen en la publicación de Nabel y
col.. 1994).
Vacunación contra enfermedades infecciosas. Está en inves­
tigación el uso de la transferencia génica para estimular la inmu­
nidad con agentes infecciosos. La inserción de secuencias de
DNA que codifican antígenos clave obtenidos de agentes pato­
lógicos (vacunas elaboradas con subunidades) pennitiría que la
célula sintetizara y presentara dichos antígenos en una forma
que remedase fisiológicamente su presentación durante infec­
ciones, sin los peligros de la exposición real al microorganismo
patógeno. Ello podría tener consecuencias notables en la obten­
ción de una vacuna contra el VIH, un esfuerzo en el que resultan
abominables las posibles repercusiones que en términos de se­
r
guridad tendría una vacuna de virus vivos atenuados.
.a
m
Obstáculos a la geneterapia
.co
Las aplicaciones terapéuticas de la tecnología de transfe�
rencia génica se amplían con cada descubrimiento de un
s
nuevo proceso celular. En la actualidad; la capacidad de
co
los científicos para elaborar terapias que sean eficaces en
seres humanos, a partir de principios científicamente sóli­
dos, está frenada por varios problemas que en cierta ma­
nera son los que se advierten en todas las estrategias de
geneterapia. En un futuro próximo, la geneterapia se limi­
tará a células somáticas (aquéllas que no pertenecen a una
línea germinativa). Un área de enorme interés ha sido la
forma de "precondicionar" a las células en un tejido parti­
cular para el método de inserción de DNA. Una vez que se
ha transferido adecuadamente el gen, adquiere importan­
cia la duración de la. expresión transgénica. Por último, el
propio vector de DNA debe analÍzarse en relación con su
capacidad de producir efectos adversos indeseables (Jolly,
1994).
Inserción de DNA y farmacocinética. La inserción de
DNA exógeno y su procesamiento por células blanco o
"predetenninadas" obligan a la introducción de nuevos
principios fannacocinéticos que rebasen los usados en los
fármacos comunes de uso actual (cap. 1). En la transfe­
rencia génica in vivo es importante tomar en considera­
ción el destíno del propio vector de DNA (volumen de
distribución, velocidad de captación en los tejidos y otros
más), así como las consecuencias de la alteración de la
expresión gé'1ica y.de la función proteínica. Se ha creado
un modelo multicompartamental que describe en forma
cuantitativa los fenómenos comentados (Ledley y Ledley,
1994). Entre los procesos que es importante considerar
están la distribución del vector DNA después de su admi­
nistración in vivo; la fracción del vector captada por la
población de células blanco; el transporte o ,modificacio­
nes del material genético dentro de los organelos celula­
res, la velocidad ce degradación del DNA, la cantidad de
mRNA producido, la estabilidad de este último, la canti-
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88 Sección 1 Principios generales
dad Y la estabilidad de la proteina producida; y la compar­
tamentalización de la proteina, es decir, su localización
dentro de la célula o su migradón secretora una vez pro­
ducida. Es concebible, aunque no se ha realizado, la posi­
bilidad de incorporar cada uno de estos fenómenos en el
diseño del sistema de transferencia génica en una fonna
racional, a fin de adaptar dicha transferencia a las exigen­
cias específicas de la enfennedad que se pretende tratar.
Duración de la expresión del gen transferido. Es de
máxima importancia el tiempo que debe actuar el gen trans­
ferido. En la terapéutica de enfermedades bereditarias será
conveniente contar con una expresión génica estable que
dure muchos años. En cambio, en el caso de enfermeda­
des malignas, la producción duradera de la proteína con
propiedades terapéuticas podría tener consecuencias no­
civas. La expresión génica prolongada no se ha demostra­
do concluyentemente en ninguno de los estudios realiza­
dos en seres humanos, pero guarda estrecha relación con
la escasa duración de la vigilancia y con el diseño experi­
mental. Los vectores que integran el DNA transferido en
el interior de los cromosomas de la célula receptora po­
seen el máximo potencial de expresión a largo plazo. Los
vectores retrovirales y los adenovirales poseen funciones
Problemas éticos
integradoras. Sin embargo, la persistencia del DNA trans­
ed
génico en el DNA de la célula receptora no garantiza la
expresión génica en ella por largo tiempo. La producción
del mRNA pretendido y la proteina puede disminuir por la
m
inactivación del promotor transgénico, a pesar de que per­
sista el ácido desoxirribonuc1eico. En algunas circunstan­
es
cias, la expresión transgénica se puede perder por la des�
aparición de la célula transducida, a causa de procesos
nt
inmunitarios del huésped (Jolly, 1994, ofrece un análi­
sis detallado al respecto).
u
ap
Consecuencias adversas de la expresión génica hete­
róloga. Junto a los factores que limitan la transferencia
y la expresi6n génica, se registra un número creciente de
w.
consecuencias adversas de la transferencia génica logra­
da. Como ocurre con cualquier fármaco nuevo, resulta
ww
imposible conocer estos hechos antes de contar con mayor
experiencia clínica. Sin embargo, es posible prever algu­
nos fenómenos especificos, independientemente del trans­
gén utilizado. Dado que en casi todas las circunstancias la
transferencia génica culminará en la síntesis de una nueva
proteína, hay que considerar la posibilidad de una respuesta
inmunitaria. Una reacción intensa de esta índole podría
inactivar un producto secretado (como se observa en suje­
tos con hemofilia que reciben factor VIII de reposición), u
ocasionar una reacción "autoinmunitaria" a los tejidos
transducidos. En algunas circunstancias el propio vector
de DNA pudiera ser inmunógeno, como se ha demostrado
en el caso de algunos vectores adenovirales. Una respues­
ta inmunitaria a dicho vector podría impedir su nueva ad­
ministración o limitar la duración de su eficacia.
La réplica del vector viral puede ocasionar problemas
patológicos. Se han hecho esfuerzos notables para el di­
seño de vectores virales que no hagan réplica (llamados
incapaces de réplica) en la célula blanco, lo cual se ha
logrado mediante la deleción (eliminación) de genes espe­
cíficos del genoma viral que son necesarios para dicha fun­
ción (MilIer y col., 1993; véanse también las leyendas de
las figuras 5-1 y 5-2). Para producir el virus debe ser cul­
tivado in vitro en una célula diseñada específicamente para
reponer las funciones que se han eliminado de dicha partí­
cula. Por los medios comentados se han producido retro­
virus, adenovirus, virus adenoasociados y virus herpéticos,
todos ellos con defectos para la réplica. Este método no
elimina del todo la capacidad de réplica en todas las cir­
r
cunstancias. El virus puede superar la de1eción de su apa­
.a
rato de réplica a través del empleo de factores no identifi­
m
cados de la célula huésped, o por recombinación en el
individuo con virus en su estado natural o "silvestre". Por
.co
fortuna, durante la escasa experiencia acumulada hasta la
fecha en seres humanos, no se han registrado los proble­
mas anteriores.
s
co
i
Como ocurre con cualquier tecnología nueva, se ha pres­
tado enorme atención a los aspectos éticos de la genete­
rapia. Muchos de ellos son comunes a las nuevas formas
caras de tratamiento médico, y entre ellos están las perso­
nas que tendrán acceso a la terapia y quién será el encar­
gado de sufragarla. La consideración de que esta tecnolo­
gía podría utilizarse en la ingeniería genética de líneas
germinativas, ha generado enorme controversia (Neel,
1993). Otro punto de preocupación es la posibilidad de
utilizar las técnicas de transferencia génica con fines "frí­
volos", como modificaciones estéticas. Los puntos ante­
riores muy probablemente serán objeto de debate ininte­
rrumpido, pero en la actualidad se refieren a hechos muy
poco factibles. Por ejemplo, la transferencia génica en te­
jido de líneas germinativas para evitar el nacimiento de
generaciones futuras de niños afectados obligaría al trata­
miento "profiláctico" de las parejas elegibles para aplicar
tal técnica. El peligro de procrear un niño afectado en la
mayor parte de los casos es de 1:2 (enfermedad autosómi­
ca dominante ) o de 1:4 (enfermedad autosómica recesi­
va) y, dado que el tratamiento conllevará riesgos y no ten­
drá eficacia total, es poco probable que cualquier progenitor
razonable acepte someterse a un procedimiento de este
tipo. Aun cuando la introducción de un nuevo gen se reali­
zara venturosamente en el proceso de fecundación in vi­
tro, es poco factible que el fenotipo corregido persista por
más de una generación. El nuevo gen tendría que ser in­
sertado en el mismo cromosoma (probabilidad en contra
de 23 a l ) o en un punto muy cercano al gen defectuoso
(100 a l en contra), de tal manera que el gen nuevo tendría
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Capítulo 5 Gene/erapia 89

A célula auxiliadora célula de empacado célula productora

í
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plásmido vector plásmido vector

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genes gag, poi, el gen de

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ww

membrana celular

Fig. 5·1. Transferencio x/nica mediada por retrovirus.

A. Estrategia global de la producción de retrovirus. Se obtienen los retrovirus que muestran deficiencia en la réplica y que servi rán de vectores
a partir de una célula auxiliadora que se somete a métodos de ingeniería genética para conferirle funciones virales (ONA) que han sido elimina­
das del virus. Se hace clonación de las secuencias de ONA gag (G), poi (P) y env (E) en plásmidos de ONA que son transferidos (transfección)
a la célula auxiliadora para producir las llamadas "células conglomeradas". Estas últimas son capaces de producir las proteínas gag. pol y de la
cubierta, necesarias para la réplica del retrovirus. Como paso siguiente, se hace transfección a la línea de células conglomemdas, de un plásmido
que contiene DNA proviral recombinante, pero que no presenta los genes gag. poi y env, a fin de crear una célula productora que contiene toda
la maquinaria molecular necesaria para reproducir el retrovirus recombinante que es secretado al medio de cultivo tisular. En el retrovirus se
"empaca" solamente la secuencia proviral recombinante. Dado que el retrovirus recombinante no contiene los genes gag, poI y env, la infección
con estos retrovirus recombinantes con deficiencia en la réplica, no genera viriones adicionales.

B. Expresión del gen de interés en células blanco, después de la inserción de RNA mediada por un retrovirus.
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90 Sección 1 Principios generales
que estar estrechamente vinculado al defectuoso. La alte­
ración de las características nonnales es todavía más difi­
cil, pues se tiene apenas un conocimiento muy elemental
de muchos de los factores que controlan el aspecto fisico,
la personalidad, la inteligencia y la capacidad fisica, y la
contribución genética a cada una de las características men­
cionadas.
TECNOLOGIA DE TRANSFERENCIA
GENICA in vivo
El sistema ideal para la in!r9ducción de DNA deber� in­
cluir una enonne variedad de tamaños de DNA insertado,
que estuviera disponible en una fonna concentrada, se pro­
dujera con facilidad, pudiera dirigirse a tipos específicos
de células, no permitiese la réplica del DNA, lograra la
expresión génica por largo tiempo, fuese atóxico y, tam­
bién, que no fuese inmunógeno. No existe un sistema así,
y tampoco es perfecta ninguna de las tecnologías con que
se cuenta para la transferencia génica in vivo, en lo que
toca a ninguna de la premisas anteriores. En 1995 se utili­
zaron tres sistemas de transferencia génica en geneterapia
humana (vectores retrovirales, adenovirales y tiposomas),
con una experiencia clínica total de unos cuantos cientos
i
ed
de pacientes a nivel mundial. Por consiguiente, los comen­
tarios que exponemos destacarán estrategias más bien con­
ceptuales, y aspectos por refinar, en vez de experiencia
m
clínica real.
es
Vectores virales
nt
El ciclo natural de los virus de mamíferos los convierte en
u
un punto de partida lógico para el diseño de vehículos de
ap
transferencia génica con fines terapéuticos, porque los vi­
rus transfieren y expresan material genético exógeno du­
rante la infección. En términos simples, un virus consiste
w.
en material genético encapsulado en una partícula que
pueda ser captada por la célula "blanco", y que así permi­
ww
te que los genes codificados se expresen dentro del virus.
Para que los vectores virales sean útiles, deben modificar­
se algunas funciones virales. Como mínimo, es importan­
te que el virus se vuelva incapaz de réplica, a fin de evitar
la diseminación incontrolable del gen transferido y que sea
eliminado algún elemento de su propio genoma, para que
se inserte el transgén. Además, otras modificaciones de­
penden del virus específico. Los vectores virales se han
utilizado ampliamente en investigación preclínica y cons­
tituyen la base de muchos de los estudios actuales sobre
geneterapia en seres humanos.
Retrovirus. Los vectores retrovirales han sido los más
utilizados en nuestra experiencia hasta la fecha, y tienen
la posibilidad de expresión a largo plazo a partir de un
transgén integrado en fonna estable. No poseen proteínas
"triviales" ni potencialmente inmunógenas, y no ha sur­
gido antes inmunidad del huésped contra el vector. Sin
embargo, su aplicación se limita a las células en fase de
división. Desde el punto de vista técnico, es posible su pro­
ducción a gran escala, aunque su purificación y concen­
tración pueden ser dificiles, por la inestabilidad del virus.
Se han planteado algunas dudas en cuanto a inocui­
dad, aunque no han sido corroboradas por la experiencia
clínica.
Los retrovirus fueron descritos originalmente en aplicaciones
de transferencia genica en 1981, Y utilizados por primera vez en
seres humanos en 1989 (Rosenberg y col., 1990). Dichas partí­
r
culas están compuestas de un genoma de\RNA que está "empa­
.a
cado" en una cubierta derivada de la membrana de las células
del huésped, y de proteínas virales. Para que el retrovirus efec­
m
túe la expresión génica, se necesita en primer lugar la transcrip­
ción inversa, de modo que su genoma que posee RNA con cor­
.co
dón "positivo" se transforme en DNA de doble cordón integrado
en el DNA de la célula del huésped. El proceso anterior es me­
diado por la inversotranscriptasa y por proteínas de integrasa
s
contenidas en la partícula retroviral. El provirus integrado pue­
co
de así utilizar la maquinaria de la célula del huésped para llevar
a cabo la transcripción de las mRNA virales, y el procesamiento
y traducción ulterior en proteínas virales. El virus completa su
ciclo vital mediante la síntesis de nuevos genomas de RNA con
cordón en dirección positiva, a partir de los provirus integrados.
Una señal de encapsidación (tp) dentro del RNA media la orga­
nización del RNA genómico y la proteína del virus, en partícu­
las que afloran desde la superficie celular.
Diseño del vector retroviral. La organización genómica de los
retrovirus es sencilla, y esta propiedad facilita su manipulación
para usarlos como vectores en geneterapia. El virus de leucemia
murino y sus congéneres son los vectores de esta índole más
utilizados (Miller y colo, 1993). Los vectores retrovirales se ela­
boran a partir de la forma proviral de la partícula. Los genes
gag, poi y env son eliminados a fin de dejar espacio para el gen
o genes de interés terapéutico, y anular las funciones de réplica
del virus (véase una revisión de estrategias en la fig. 5-1). Se
pueden incorporar incluso 8 kb de DNA heterólogo en el vector
retroviral. Todos los mRNA codificados viralmente se eliminan
del retrovirus recombinante, por 10 cual los vectores de esta ín­
dole no producen proteínas virales. Se eliminan así cualesquiera
antígenos posibles codificados por el virus que pudieran desen­
cadenar una reacción inmunitaria a las células transducidas.
Junto con el gen de interés terapéutico se incluyen en el retrovi­
rus recombinante genes que codifican la resistencia a antibióti­
cos, con el fin de seleccionar ex vivo células cultivadas que po­
seen el virus. Dos ejemplos de genes de resistencia a antibióticos
introducidos en los vectores retrovirales que se utilizan en
geneterapia son el gen bacteriano de la 3' -fosfotransferasa de
aminoglucósido, que confiere resistencia a kanamicina, neomi­
cina y geneticina, y el gen de la fosfotransferasa de higromicina
B, que confiere resistencia a dicho antibiótico. La presencia de
un gen de resistencia a antibióticos facilita el aislamiento del
retrovirus recombinante y la medición ulterior del título o núme­
ro de partículas virales. Las secuencias que contienen las fun­
ciones promotora y acrecentadora pueden incluirse con el trans-
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gén para facilitar su expresión eficaz, y en algunas circunstancias
permitir la expresión histoespecífica después de adminis­
tración in vivo. Asimismo, con ese fin pueden utilizarse una y
otra de estas funciones contenidas en la repetición terminal lar­
ga del virus.
Líneas celulares "empacadoras". Una vez que se logra la
deleción de los genes que codifican proteínas estructurales vira­
les y las que median la réplica viral, sólo es posible producir
dichos virus en líneas de células "empacadoras" virales con in­
geniería genética especial, que sean capaces de aportar las pro­
teínas en cuestión (fig. 5-1). La linea celular "empacadora" se
elabora en fonna óptima al insertar de modo estable los genes
virales sometidos a deleci6n (gag, poI y env) en el interior de la
célula, de modo que los genes en cuestión residan en cromoso­
mas diferentes dentro de la célula empacadora. La estrategia
anterior asegura que sea casi imposible la recombinación de di­
chos genes. Al no realizarse dicha recombinación, sería imposi­
ble producir un RNA genómico viral intacto que pudiera ser
empacado en un virus capaz de réplica. La línea de células
de empacado se utiliza para elaborar una línea de células pro­
ductoras del retrovirus que generarán retrovirus con incapaci­
dad de réplica que contengan el gen o genes de interés; para
eIJo, el DNA proviral recombinante se inserta en la línea celular
"empacadora". El DNA proviral recombinante está en la forma
del DNA de plásmido que contiene las secuencias de repetición
i co
ed
terrninal largas que flanquean una pequeña porción del gen gag
que contiene la secuencia de encapsidación y los genes de inte­
rés; se le somete a transfección en la linea de células "empacado­
m
ras", para lo cual se usa cualquier técnica estándar para transfe­
rencia y captación de DNA (electroporación, precipitación de
es
calcio y otras). Se han utilizado algunas versiones de este dise­
ño básico para disminuir la posibilidad de recombinaciones que
pudieran culminar en la producción de un virus con capacidad
nt
de réplica (Jolly, 1994). También se han empleado más modifi­
caciones para alterar la "especificidad" de las células huésped,
u
al virus. Ello depende en gran medida del gen de la cubierta
ap
(env). La cubierta del virus de leucemia murina de Moloney es
ecotrópica, lo cual sugiere que la infección se limita a células de
una especie particular, en este caso las de ratón. Se cuenta con
w.
una cubierta que permite una mayor variedad de infecciones por
empleo del gen env de la cepa 4070A del virus de leucemia
ww
murina; este gen de cubierta tiene especificidad anfotrópica y
puede estimular la infección de células humanas, de ratones o
de otros mamíferos. También se han producido por ingeniería
genética genes env con especificidades que recorren toda la gama
de huéspedes hasta células que no son de mamíferos. Los es­
fuerzos por diseñar nuevos ligandos en la proteína de la cubierta
no han sido del todo eficaces, porque a menudo los virus produ­
cidos son escasos. No obstante, la capacidad de dar una direc­
ción específica al virus mediante el rediseño de su estructura
molecular, es una meta importante y sin duda será objeto de mayor
atención en lo futuro.
Administración clínica de retrovirus. La administración de
retrovirus a seres humanos se ha logrado por transducción ex
vivo de células de pacientes, inyección directa del virus en el
tejido, y administración de las células productoras de retrovirus.
Transferencia génica ex vivo. El método ex vivo ha sido el
más utilizado en estudios en seres humanos. Es dificil, porque
necesita el aislamiento y la conservación de las células del en-
Capítulo 5 Genererapía 91
fermo en cultivo tisular, pero tiene la ventaja de poder cuantifi­
car con facilidad la transferencia génica, de modo que se dirige
hacia una población específica celular. Además, puede obtener­
se una proporción mayor entre el número de partículas virales y
las células blanco, a fin de mejorar la eficiencia de la transduc­
ción. Este método se utilizó para modificar linfocitos (Anderson
y col., 1990; Rosenberg y coL, 1990; Culver y col., 1991) y cé­
lulas hematopoyéticas (Nienhuis y col., 1991) en el tratamiento
de la deficiencia de adenosindesaminasa (Anderson y col., 1990),
en el de la hiperlipidemia (Grossman y col., 1994) (véase la fig.
5-4, más adelante) y para expresar agentes inmunomoduladores
de células neoplásicas (Lotze y col., 1992; Lotze, 1993; Lotze y
coL, 1994). Sin duda, todavía no existen aplicaciones posibles
r
de la transferencia génica ex vivo en enfennedades, dado que,
.a
desde el punto de vista técnico, aún no son factibles la obten­
ción y el cultivo de las células de seres humanos. En tales cir­
m
cunstancias se necesita la introducción directa del virus in vivo.
Transferencia génica in vivo . Los retrovirus se estudian como
.co
posibles agentes para tratar tumores cerebrales que en muchas
circunstancias son relativamente inaccesibles. En este caso pu­
diera ser particulannente provechosa la capacidad inherente de
s
las partículas mencionadas para transducir únicamente células
en división (las tumorales), y dejar indemnes las que no están
dividiéndose (parénquima cerebral nonnal). Es posible la inyec­
ción estereotáctica directa del retrovirus recombinante en el teji­
do en cuestión, pero en términos generales es muy pequeña la
eficiencia de la transferencia génica.
Algunos factores contribuyen a la ineficacia de la transferen­
cia in vivo de genes retrovirales. Las preparaciones con ellos
son relativamente diluidas en comparación con otros vectores,
en fonoa típica con 106 a 108 unidades formadoras de placa, por
mililitro. Es más, el virus transduce sólo células en división, y
dentro del tejido preescogido pudiera estar dividiéndose sólo una
pequeña fracción de células en el intervalo que media entre la
inyección y la eliminación del virus. De este modo, incluso con
un número excesivo de virus se lograria transducción eficaz sólo
en una fracción de células. Para superar estas dificultades,
Oldfield y colaboradores (1993) propusieron administrar direc­
tamente en tumores encefálicos una línea de células productoras
de retrovirus, mediante inyección con guía estereotáctica. Pos­
tularon que la célula productora murina sobreviviría algunos días
dentro del tumor encefálico y que en este periodo secretaria re­
trovirus capaces de transducir el tumor encefálico circundante.
Están en marcha estudios en un número pequeño de pacientes
con empleo de virus que transportan el gen de timidincinasa del
virus herpético; dicho gen vuelve a las células susceptibles de
destrucción por el ganciclovir, un antibiótico que, administrado
por vía sistémica, es metabolizado por la enzima en un producto
citotóxico. Es importante esclarecer algunos puntos trascenden­
tales antes de la aceptación amplia de este método. Todavía no
se ha cuantificado con precisión la capacidad del virus para di­
fundirse desde la célula productora hasta otras tumorales distan�
tes. Si el áreá"'de células tumorales transducidas es pequeña, pu­
dieran no recibir tratamiento las células neoplásicas que están
en cordones microscópicos del encéfalo normal infiltrado por
tumor; no se sabe si una respuesta inmunitaria a la línea celular
productora xenógena impide nuevos tratamientos del tumor re­
sidual; es un aspecto de enorme importancia, porque quizá no
todas las células tumorales estén en fase de división activa du­
rante todo el lapso de secreción viral, de modo que algunas es-
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92 Secó/m 1 Principios generales
caparán a la acción de las células productoras de virus. Se nece­
sitarían tratamientos seriados, como los de la quimioterapia co­
rriente, para lograr la erradicación completa del tumor. Los re­
sultados de los estudios clínicos que están en fase de realización
y los de ulteriores, posiblemente esclarezcan dichos plantea­
mientos.
Seguridad de las estrategias con vectores retrovirales. El
empleo de vectores retrovirales ha planteado dilemas importan­
tes en cuanto a seguridad (inocuidad). Uno de ellos es que, dado
que el virus se integra en los cromosomas de la célula blanco
(una característica atractiva para la expresión a largo plazo), y
que la integración se produce en una forma casi aleatoria, ella
podría ser mutágena. Por ejemplo, surgirán mutaciones no de­
seadas si la inserción del DNA retroviral altera la función de un
gen regulador del crecimiento celular. Los retrovirus con capa­
cidad de réplica tienen potencial tumorigeno, lo cual no ha ocu­
rrido con los vectores incapaces de réplica que se utilizan como
agentes de transferencia de genes; es más, no se ha observado
en paciente alguno que haya recibido geneterapia con retrovi­
rus. No obstante, es escaso el número de enfermos estudiados
hasta la fecha y su vigilancia demasiado breve, para extrapolar
la experiencia clínica acumulada a aspectos de inocuidad a lar­
go plazo.
Es de máxima importancia demostrar que los agentes retro­
virales son incapaces de réplica. Puede surgir capacidad de ré­
plica por varios medios. Como destacamos en párrafos anterio­
res, es muy poco probable la recombinación de los elementos
genéticos del retrovirus insertados en la linea de células "empa­
cadoras". No obstante, la recombinación con otros genomas
retrovirales es positle en teoría. Dentro de las líneas de células
m
murinas utilizadas para crear las líneas celulares "empacadoras"
existen secuencias retrovirales endógenas homólogas. El empleo
es
de líneas de células "empacadoras" provenientes de perros o
seres humanos, que no tienen dichas secuencias, también ha sido
objeto de estudio (Jol1y, 1994). En teoría también es posible la
nt
recombinación con secuencias retrovirales en la célula blanco.
u
Los retrovirus murinos en estado natural o " silvestre", de los
que se derivan los vectores genéticos, no infectan células huma­
ap
nas. Por tal motivo, es poco probable que un virus natural infec­
te la misma célula blanco y ocasione el "rescate" del vector re­
w.
troviral defectuoso. Sin embargo, existen retrovirus endógenos
en todos los tejidos humanos (retrovirus HERV-K) que tienen
escasa homología con los vectores retrovirales. Es remotamente
ww
probable que surja este tipo de recombinación con frecuencia
suficiente para generar resultados adversos de importancia clí­
nica. En el análisis final se necesita corroborar la inocuidad de
estos vectores y otros más, por medio de experiencia clínica di­
recta y, también, comparar su seguridad contra sus beneficios
terapéuticos.
Adenovirus. Se han identificado más de 40 tipos séri­
cos (serotipos) de adenovirus del ser humano, y se han
definido en diversos grados, muchos adenovirus de ani­
males. También se ha descrito en detalle el espectro clíni­
co de las infecciones por dichos microorganismos en seres
humanos (Horwitz, 1990). En huéspedes normales las in­
fecciones de vías respiratorias son frecuentes y, de ma­
nera típica, muestran remisión espontánea. Esporádica­
mente surgen infecciones de vías gastrointestinales y
urinarias, hígado y sistema nervioso central. La mayoría
de los adultos, y tal vez todos, han tenido un contacto pre­
vio con adenovirus, y en su suero se detectarán anticuer­
pos contra dichas partículas si se utilizan métodos sensi­
bles. En Estados Unidos, en forma específica, se aplica a
los reclutas militares una vacuna adenoviral polivalente
para evitar brotes de infección respiratoria (Rubin y Rorke,
1994). A diferencia de los retrovirus, estos virus de mayor
tamaño sin cubierta poseen un genoma con DNA de doble
cordón y muestran réplica independientemente de la divi­
sión de las células del huésped.
Los vectOres adenovirales poseen algunas característi­
cas atractivas que han estimulado su selección para uso
r
clínico; son capaces de transducir una gran gama de teji­
.a
dos humanos, que incluyen epitelio de vías respiratorias y
vasos, músculos cardiaco y estriado; tejido del sistema
m
nervioso central y periférico, hepatocitos, páncreas exo­
crino y muchos tipos tumorales. Pueden obtenerse cifras
.co
extraordinariamente grandes de transferencia génica y ex­
presión transgénica en células en fase de división y en las
que no están en ella. Cabe recurrir a varias vías de admi­
s
nistración como intravenosa, intrabiliar, intraperitoneal,
co
intravesicular, intracraneal e inyección intrarraquídea
y también la introducción directa en el parénquima del
i
órgano "blanco" o preescogido. Hasta la fecha ha sido im­
ed
posible modificar a los adenovirus para obtener una par­
tícula con especificidad tisular. Las vias múltiples de ad­
ministración podrían superar esta deficiencia al brindar
flexibilidad en la orientación citoespecífica basada en lí­
mites anatómicos.
Hasta la fecha los ensayos clínicos con adenovirus se
han limitado a protocolos todavía inacabados de fibrosis
quística, en los que el adenovirus recombinante se adminis­
tra por aerosol en las vías respiratorias. En fecha más re­
ciente han comenzado estudios con la administración di­
recta de vectores adenovirales en el hígado, para combatir
deficiencias genéticas hereditarias y diversos tumores
(Ohno y col., 1994, y Kozarsky y col., 1994, ofrecen dos
ejemplos de estrategias de geneterapia con adenovirus).
La estructura genómica de los adenovirus es más compleja que
la de los retrovirus. El genoma de dichas partículas codifica unas
1 5 proteínas. La infe'cción se produce cuando la proteína "fibri­
lar" que se extiende desde la cápside icosahédrica se liga a un
receptor de la superficie celular. Más tarde, las secuencias de
péptidos en la porción basal pentafásica o de pentones de la base
de la cápside se introduce en los dominios del receptor de integrina
(alP3 o aJ3�) en la superficie celular, lo cual permite la interna­
[¡zación del virus por vías endosómicas, donde comienza el des­
montaje de la partícula viral. El virus evade al endosoma antes
de su fusión con los compartimientos lisosómicos, de modo que
evita ser digerido. El DNA viral puede penetrar en el núcleo de
la célula blanco y comenzar la transcripción del mRNA viral sin
división celular 'concomitante. La integración del DNA viral
en el DNA genómico de la célula huésped puede ocurrir con ni­
veles altos de infección en las células en división, pero es un
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Capítulo 5 Geneterapia 93

digestión enzim6tica pare linealizar el ONA

A
Ad CMV inserto
0-1 promotor de cONA (en este caso se utilizÓ Nhe O
Ad
m.U. Que codifica CMV
9-16
el gen de
interés

0-1 m.u. 9.0 m.u. 16 m.u.

digestión enzimática del DNA adenoviral (en este caso, Ca. �

CIo I

pli;SI'Tlido que codifica 2.5 m.u. 9.0 m.u. 100 m.u.

16 m.u.

Cotransfección en 'células de la linea 293

flanqueado por células 293 modificadas por ingeniería

para expresar proteínas El

recombinación homóloga intracelular de DNA introducido,

r
y

.a
expresión de E 1 por células 293

unidad de transcripción activada por CMV

m
I I :�p::::¡:
.: :::¡:
, !��r :::JiE:::==ll
0.0 m.u. 9 m. u. 1 6 m.u. 100 m.u.

.co
Adenoviru$ recombinant.e·( -36 kilobases)
•
' células que no poseen la región El del ad en ovi rus
réplica deficiente ó nu la en
•
totalmente capaz de infectar células blanco

s
8 unión a la superficie
celular
i co
ed
m

transcrito'::;:
es

desde el,
•

" a 7 '
nt
pu
.a

com plejo de poro de la cubierta nuclear

w

Fig. 5-2. Transferencia génica mediada por adenovirus.

ww

A. Elaboración de un adenovirus recombinante para modificar células por procedimientos de ingeniería genética. Estrategia para preparar el
adenovirus recombinante (Ad) por recombinación homóloga. Es posible obtener un adenovirus recombinante que codifica un gen de interés al
clonar este último (se señala en azul) dentro de un plásmido; este transgén es flanqueado por una secuencia del promotor (como seria citomega­
lovirus promotor, CMV), y por regiones del genoma del adenovirus (en gris). El ejemplo que se muestra se basa en el adenovirus 5. El DNA de
este adenovirus se divide en 100 unidades de mapa (m. u.; son 360 pares de bases por unidad de mapa). Se hacen deleciones en ONA del
adenovirus para eliminar las regiones E l (l a 9.2 m.u.) y E3 (78.4 a 84.3 m.u.), a fin de descartar la posibilidad de réplica autónoma y contar con
espacio suficiente para insertar el transgén. Entre el DNA del plásmido y el ONA genómico del adenovirus se produce una recombinación
homóloga para generar el virus recombinante. La secuencia transgénica sustituye los genes E l del adenovirus, por lo cual esta partícula no puede
mostrar réplica en células que no sean las preparadas por ingeniería.. de modo que expresen los productos del gen E l , como serían las células de
la línea 293
del riñón de embrión humano, que mostramos.
Después de linealización del plásmido por digestión con una endonucleasa (Nhel en este ejemplo), el plásmido que expresa el transgén es
cotransferido con el DNA del genoma adenoviral al cual se ha eliminado la terminal 5 ' (es decir, digestión con la endonucleasa Cla 1, en Ad de
2.5 m.u.), también para evitar la réplica autónoma del adenovirus hasta que se produce la recombinación homóloga que en este ejemplo surge
dentro de las células de la línea 293.

B. Infección de células blanco mediada por adenovirus. Expresión del gen de interés en la célula blanco después de insertar DNA mediado por
adenovirus. Un adenovirus recombinante se liga a receptores específicos en la superficie de la célula blanco y penetra en ella por endocitosis. Las
proteínas virales estimulan el escape del adenovirus, es decir, que no sea captado por el endosoma antes que éste se fusione con los Iisosomas y
sea destruido por ellos. El ONA del adenovirus se "desempaca" desde las proteínas virales y viaja al núcleo, donde comienza a sintetizar mRNA
nuevo. El DNA codificado por el adenovirus, incluido el transgén, no es integrado en el genoma de la célula huésped (Con autorización de
Greber et al, 1993.)
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94 Sección J Principios generales
hecho relativamente esporádico y no contribuye en grado impor­
tante a la utilidad de estos virus como vectores. La expresión y la
réplica del gen viral se producen en fonna ordenada y son impul­
sadas en gran medida por los genes E 1 A Y E l B en la porción 5 '
del genoma adenoviral. Los dos genes recién mencionados de­
sempeñan funciones de transactivación de transcripción de va­
rios de los genes virales de "corriente abajo" (Horwitz, 1990).
Los genes E l intervienen estrechamente en la réplica de los
adenovirus, de manera que su eliminación incapacita al virus
para esta función o, por lo menos, lo deja muy deteriorado para
ella. Por la complejidad de estos virus, ha sido más dificil elimi­
nar todos los genes adenovirales, como se hace con los vectores
retrovirales. La expresión de proteínas de adenovirus con los
vectores de ese tipo de uso actual culmina en una respuesta in­
munitaria celular y humoral a los vectores adenovirales recom­
binantes. En algunos casos, esto puede limitar la utilidad del
vector, en ténninos de la respuesta inmunitaria del huésped a
células con transducción de adenovirus, y con respecto a la red
de administración del vector.
Diseño de vectores adenovirales para geneterapia. Se cono­
cen varios serotipos de adenovirus, pero los tipos séricos 2 y 5
han sido los más estudiados en la elaboración de vectores. Los
adenovirus vectores pueden prepararse por algunas de las técni­
cas generales enumeradas en la figura 5-2, que incluye los ele­
mentos básicos del diseño de tales vectores en geneterapia. Bett
y colaboradores (1 994) han creado un sistema de vector con el
adenovirus tipo 5, basado en plásmidos bacterianos que contie­
i
ed
nen el genoma adenoviral con deleciones de los genes E l y E3
de dicha partícula. La deleción del gen E l incapacita al virus
para la réplica. Además, toda la región E3, o parte de ella que no
m
es esencial para la función viral, queda suprimida (deleción) para
acomodar el DNA que se inserta en el genoma del adenovirus.
es
Los genes de interés pueden ser clonados en las regiones supri­
midas, y el vector plásmido puede proliferar así en cultivo bac­
nt
teriano. Más adelante se hace transfección del DNA del plásmido
purificado, en la línea 293 de células renales del embrión huma­
no. La línea mencionada ha sido condicionada por ingeniería
u
genética para expresar las proteínas E l , Y así puede trans­
ap
complementar el genoma viral con deficiencia de E l . De esta
manera, el virus se aísla del medio en que están las células 293,
y se purifica por métodos limitan tes de dilución de la placa
w.
(Graham y Prevek, 1991). Otro método consiste en preparar un
plásmido que contenga el gen de interés, flanqueado por secuen­
ww
cias de DNA adenovirales. La transfección de este plásmido en
células 293 en DNA del adenovirus genómico con deleciones
escogidas (como sería E3) pennite que se fonnen partículas de
adenovirus en las que el transgén sustituye a genes E l por re­
combinación homóloga. La estrategia anterior se señala en deta­
lle en la figura 5-2. Cabe recurrir a la clonación directa o a la
recombinación homóloga, para producir un adenovirus incapaz
de réplica, y con deleción del gen E l .
Es posible l a producción de grandes cantidades del sistema
del adenovirus vector condicionado, por ingeniería genética, al
hacer que prolifere el virus recombinante en cultivos de células
293. El virus se aísla al prod lcir lisis de las células mencionadas
infectadas y al purificar el extracto en bruto que resulta de la
lisis por centrifugación de densidad con cloruro de cesio, méto­
do que, además de separar el virus de otras sustancias derivadas
del cultivo hístico, también concentra a éste en cantidades muy
importantes (más de 1013 partículas por mililitro). El virus así
purificado es extraordinariamente estable en muy diversos amor­
tiguadores acuosos, y puede ser congelado por un lapso durade­
ro sin que pierda su actividad.
Duración de la expresión transgénica. Los vectores adeno­
virales tienen como limitación su duración relativamente breve
de expresión transgénica. Varios factores contribuyen a tal si­
tuación, incluida la eliminación de células transducidas por ac­
ción de los linfocitos T citotóxicos y otras células de inflama­
ción (Yang y col., 1994), y la pérdida del DNA episómico por
dilución durante la división de la célula blanco. El primer pro­
blema quizá se resuelva con el diseño de vectores adenovirales
menos inmunógenos. Sin duda, los vectores con mutaciones ter­
mosensibles en la región E2 son menos inmunógenos, y permi­
ten una expresión génica significativamente más duradera (En­
gelhardt y col., 1994). La deleción del gen E4 de los vectores
r
adenovirales quizá disminuya también la respuesta inmunitaria
.a
a las células transducidas (Annentano y col., 1998). Las nuevas
generaciones de vectores adenovirales con modificaciones adi­
m
cionales del genoma o el uso de adenovirus no humanos pudie­
ran hacer progresar el empleo de vectores de esta índole. La na­
.co
turaleza episómica del genoma de adenovirus es el factor que
limita al final la duración de la expresión génica en tejidos con
división celular activa, como serían la médula y las superficies
s
epiteliales. Puesto que después de la transferencia génica no to­
co
dos los ciclos de división de la célula blanco se acompañan de
réplica del transgén, las células hijas serán cada vez más esca­
sas y al final no habrá copias de dicho transgén. Acaece la inte­
gración del vector adenoviral, pero no con frecuencia suficiente
como para ser útil.
Inocuidad de las estrategias con vectores adenovirales. La
seguridad de los vectores adenovirales probablemente será es­
clarecida en los ensayos clínicos actuales. Los principales efec­
tos adversos incluyen la respuesta inmunitaria del huésped a las
proteínas del adenovirus, limitación que puede eliminarse con
la obtención de futuras generaciones de vectores. Sin embargo,
existe alguna preocupación de que la réplica del vector se pro­
duzca a pesar de haber eliminado genes reguladores importan­
tes. Son comunes las infecciones por adenovirus en estados na­
turales, por 10 cual existe la posibilidad de que virus de ese tipo
puedan recombinarse con los vectores con deficiencia o incapa­
cidad para la réplica, a fin de que surja un virus recombinante
capaz de réplica. A la fecha no se ha observado tal situación en
los estudios clínicos de fibrosis quística, pero sigue siendo una
posibilidad preocupante. Es más, hay un cúmulo creciente de
pruebas de que algunos tipos celulares pueden contener proteí­
nas con funciones homólogas a las de E l a, y por ello, capaces
de generar un ambiente permisivo para que surja la réplica del
virus recombinante. Con los vectores adenovirales actuales la
situación anterior quizá no culmine en una infección grave, ante
la inmunidad preexistente del huésped a la infección por adeno­
virus. Sin embargo, si futuros adenovirus vectores pueden eva­
dir este mecanismo de protección, seguramente será un enorme
problema la réplica de virus recombinantes.
Virus adenoasociados (adenoafines). A l parecer, los vi­
rus de este tipo (AAV) poseen muchas de las característi­
cas deseables y útiles de los retrovirus y los adenovirus
para su aplicación en geneterapia, sin algunos de sus ¡n­
convenientes potenciales (Kotin, 1994). Son parvovirus no
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autónomos de DNA de un solo cordón que pueden inte­
grarse eficazmente en el genoma de células que no están
en fase de división, de muy diverso origen. La integración
del virus natural es específica del cromosoma 19 (19qI3.3-
qter), o cuando menos muestra integración preferente en
dicho sitio. Los virus adenoafines, aunque muy difundi­
dos en la Naturaleza, no ocasionan enfermedad conocida
en el hombre ni desencadenan respuesta inmunitaria en el
huésped humano infectado. AAV es un virus sin cubierta,
estable a diversas manipulaciones químicas y fisicas, de
modo que es posible purificarlo, concentrarlo y almacenar­
lo por largo tiempo.
En la actualidad, el empleo de AAV como vector en
geneterapia tiene limitaciones por la dificultad de produ­
cirlo en gran escala y, lo que es más importante, porque no
se tienen conocimientos sobre las características biológi­
cas del virus recombinante. Por ejemplo, no se sabe si los
vectores de este tipo pueden o no infectar e integrarse en
células que no están en fase de división, característica im­
portante del virus natural que ha estimulado su empleo. Es
poca la experiencia acumulada en seres humanos con el
uso de estos nuevos vectores. En Estados Unidos, el Re­
i co
combinant DNA Advisory Committee, de los National lns­
ed
titutes of Health, ha aprobado la práctica del primer estu­
dio de AAV en seres humanos con fibrosis quística; puede
m
generar información sobre la duración de la expresión
génica después de la transferencia del gen mediado por
es
AAV en células del epitelio de vías respiratorias que mues­
tran diferenciación terminal.
nt
El AAV tiene dos fases diferentes en su ciclo vital. En ausen­
u
cia del virus auxiliador (adenovirus), el virus natural infectará
una célula huésped, se integrará en el genoma de ésta y penna­
ap
necerá latente por largo tiempo. En presencia del adenovirus se
induce la fase lítica del virus, que depende de la expresión de
w.
genes adenovirales tempranos y ocasiona réplica viral activa.
Desde el punto de vista estructural, el genoma deAAV está com­
puesto por dps estructuras de lectura abierta (llamadas rep y cap),
ww
flanqueadas por secuencias invertidas de repetición terminal
(ITR) o secuencias palindrómicas terminales. La región rep co­
difica cuatro proteínas que median la réplica de AAV, la trans­
cripción de DNA viral y las funciones de endonucleasa que se
utilizan en la integración en el genoma del huésped Los genes
rep son las únicas secuencias AAV necesarias para la réplica
viral. La secuencia cap codifica proteínas estructurales que for­
man la cápside viral. Las secuencias palindrómicas tenninales
(ITRs) contienen los orígenes virales de la réplica, permiten las
señales de encapsidación y participan en la integración del DNA
viral. La función de muchas de estas proteínas y la biología inte­
gral del virus han sido estudiadas en gran medida en virus en
estado natural (Kotin, 1994). También se han obtenido virus re­
combinantes con incapacidad o deficiencia para la réplica, y que
no tienen las secuencias rep y cap, y se han utilizado en gene­
terapia. Los virus recombinantes no han sido estudiados en tan­
to detalle, y no se sabe si conservan todas las características de
las formas naturales (integración topoespecífica en una célula
que no está en fase de división).
Capitulo 5 Geneterapia 95
La producción de grandes cantidades de AAV es mucho más
dificil que la de retrovirus o adenovirus. Es posible obtener AAV
con deficiencia o incapacidad de réplica por cotransfección de
los elementos separados necesarios para la réplica de dichos vi­
rus en una línea celular permisiva (de manera típica las células
de la línea 293). En un método de uso común, se hace transfección
en las células de la línea 293 en el DNA de plásmido que contie­
ne rep y cap bajo control de los "promotores'· de AAV, pero que
carece de las secuencias palindrómicas terminales (ITRs).Al mis­
mo tiempo se hace cotransfección del DNA que contiene el gen
por "empacar" (promotor, intensificador, transgén o señal de
poliadenilación) flanqueado por las secuencias palindrómicas
comentadas. La infección con adenovirus desencadena funcio­
r
nes auxiliadoras que inducen la síntesis de proteínas rep, las que
.a
a su vez transactivan la síntesis de proteínas de la cápside. El
transgéo flanqueado por ITRs es "empacado" en partículas vira­
m
les que pueder¡ ser aisladas y purificadas mediante centrifuga­
.co
ción por densidad, con cloruro de cesio; este método exige que
el plásmido que expresa ITR (ITR < ; en este caso el plásmido
que codifica el transgén) posea minima homología secuencial
con plásmidos y ITR (cap y rep), para aminorar la posibilidad
s
de que ocurra una recombinación que pudiera culminar en la
producción de un virus natural. Están en fase de creación mejo­
res sistemas para la preparación de AAD recombinante que in­
cluyen el empleo de líneas celulares "productoras" que desem­
peñen fuocio.es de rep y cap. Este método, además de simplificar
el esquemade transfección, también generaría proteínas rep y
cap en mayores cantidades, 10 que permitiría obtener volúme­
nes importantes de virus recombinantes.
Vectores de vaccinia (pox virus). La experiencia clíni­
ca extensa acumulada con las vacunas de vaccinia, y su
facilidad de manipulación, han sido el punto de partida
para la obtención de vectores para geneterapia a base de
pox virus (Moss y Fexner, 1987; Moss, 1990). Los virus
de vaccinia son partículas grandes con DNA y cubierta
que muestran réplica en el citoplasma de células infecta­
das. A semejanza de los adenovirus, infectan células que
no están en fase de división y también las que están en
ella, de diferentes tejidos, y así permiten una expresión
génica a corto plazo desde un gcnoma viral no integrado.
Es posible la producción del virus recombinante al inser­
tar el transgén en un plásmido derivado de vaccinia y ha­
cer transfección de este DNA en las células infectadas por
el virus de vaccinia. La recombinación homóloga permite
la generación del virus recombinado que pudiera puri­
ficarse en placas. Se facilita así la obtención de grandes
cantidades de virus, que pueden almacenarse durante lar­
go tiempo. Los virus de vaccinia pueden acomodar inser­
tos mucho mayores de DNA que los retrovirus, los adeno­
virus o los AAV que sirven como vectores. Es más, el virus
natural no existe ya en la Naturaleza en forma "silvestre",
por lo cual es muy poco probable que la recombinación
produzca nuevas cepas. Un inconveniente notable del em­
pleo de este sistema de vectores es que desencadena una
respuesta inmunitaria del huésped, a las 150 o 200 proteí­
nas codificadas por el virus; ello genera grandes dificulta-
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96 Sección 1 PrinClpius generales
des si se pretende repetir la administración. Otro aspecto
preocupante es la réplica del vector, ya que puede ocasio­
nar complicaciones graves en huéspedes inmunodeficien­
tes; el problema anterior podrá superarse si se obtienen
nuevas generaciones de virus de vaccinia sometidos a in­
geniería genética. En la actualidad no se ha adoptado di­
cho sistema vector en ensayos de geneterapia en seres hu­
manos, aunque puede ser útil como vector de vaccinia.
Vectores de virus del herpes simple-1. El virus del her­
pes simple es una partícula grande de DNA de doble cor­
dón (152 kb), que muestra réplica en el núcleo de células
infectadas. Es muy amplia la variedad de células huésped
que puede afectar, y la partícula infecta células en fase de
división y las que no lo están, además de que persiste en
estado no integrado. Es posible insertar en el genoma viral
por recombinación homóloga grandes secuencias de DNA
exógeno, y un virus recombinante con deficiencia o inca­
pacidad para réplica puede purificarse de la placa en célu­
las transcomplementantes (IE+). Estas ventajas para las
estrategias de geneterapia se ven contrarrestadas por la
dificultad para hacer que los preparados virales estén ab­
solutamente libres de virus con capacidad de réplica, y tam­
bién la aparición de una respuesta inmunitaria potente a
i co
proteínas codificadas por el virus que sean directamente
ed
tóxicas para la célula. A pesar de estos inconvenientes
notables, ventajas como su capacidad de acomodar gran­
(20 a 30 kb), la disponibilidad de
m
des insertos de DNA
reservas con gran número de virus y su neurotropismo,
es
han estimulado el interés por la obtención de virus herpé­
ticos como vectores útiles (Kennedy y Steiner, 1993).
nt
La deleción del gen de timidincinasa viral hace que el virus
herpético muestre deficiencia o incapacidad para la réplica
u
de células con bajos niveles de timidincinasa endógena (es de­
ap
cir, células que no están en fase de división y que muestran dife­
renciación terminal). En cambio, las células que son objeto de
división activa (como las tumorales) poseen suficiente actividad
w.
de timidincinasa para permitir la réplica del virus herpético sin
esta enzima. Este tipo de vector puede ser útil para tratar tumo­
ww
res intracraneales, porque las células tumorales, aunque no las
neuronas, experimentarán selectivamente transferencia génica.
Dado que surge la réplica del vector, la diseminación sistémica
puede surgir con este tipo de vector viral; tal situación es muchí­
simo menos probable en los huéspedes inmunocompetentes,
porque es factible que la respuesta inmunitaria celular controle
la diseminación de los virus. El empleo de virus herpéticos como
vectores en huéspedes inmunodeficientes, entre ellos algunos
pacientes cancerosos, puede generar problemas (Valyi-Nagy y
col., 1994).
Otros vectores virales. La necesidad de transferencia
génica histoselectiva ha obligado a considerar otros virus
para tal fm (p. ej., VIH, el virus minúsculo de ratones, los
virus de hepatitis B y el de influenza, como posibles vec­
tores para transferencia génica; estas partículas y otras más
pueden tener aplicaciones basadas en aspectos de su ciclo
vital que culminen en la expresión génica histoselectiva u
otras características peculiares que sean útiles en el trata­
miento de enfermedades especificas (Jolly, 1994).
Comparación de propiedades de los vectores virales en
geneterapia. En fecha reciente, Boviatsis y colaborado­
res ( 1994) compararon la utilidad de retrovirus recombi­
nantes, adenovirus y virus herpéticos como vectores, en
un modelo tumoral de encéfalo de rata, para lo cual utili­
zaron la codificación génica de la p-galactosidasa bacte­
riana, como indicación de transferencia de genes. Sus ex­
perimentos no definieron de manera precisa qué vector es
más eficiente en dicha transferencia, pero advirtieron y
r
detectaron características diferenciales útiles en cada uno
.a
de ellos. Después de administración intralesional, los re"
trovirus y los virus herpéticos vectores, lograron de mane­
m
ra selectiva la transferencia génica de células tumorales, y
no a las neuronas y otras células propias del encéfalo. Por
.co
lo contrario, el adenovirus, en calidad de vector, efectuó la
transducción de células tumorales cerebrales y también de
parénquima cerebral vecino nonnal. En el caso de los re­
s
trovirus vectores, la selectividad por las células tumorales
fue consecuencia de la exigencia de que éstas estuvieran
en fase de división como requisito del virus para la inte­
gración y la expresión transgénica. En el caso de los virus
herpéticos vectores, la selectividad surgió como resultado
de la expresión diferencial de la timidincinasa endógena
en las células tumorales (muy grande) en comparación con
las no neoplásicas (muy pequeña). Los adenovirus mos­
traron poca selectividad celular y cualquier preferencia por
la expresión en células neoplásicas quizá fue consecuen­
cia del sitio de inyección (intratumoral). Otra observación
notable fue el grado de inflamación y de necrosis que sur­
gió después de transferencia génica. El retrovirus vector
no originó respuesta inflamatoria significativa, y la que
indujo el adenovirus fue mínima. Sin embargo, después de
utilizar transferencia génica mediada por virus herpético
hubo notables infiltrados inflamatorios en los tejidos cere­
brales. El estudio en cuestión sugirió la utilidad de los vi­
rus herpéticos como vectores para tratar tumores, pero se­
guramente será dificil aplicar dichos vectores en seres
humanos. Se tendrán que emprender más medidas para con­
trolar la réplica de este vector derivado de patógenos hu­
manos, y es ímport¿. üe prestar gran atención a la intensa
respuesta inflamatoria que se produce. Aún más, como
Boviatsis y colabora lores ( 1 994) destacaron, se descono­
ce la latencia de est tipo de vector, por lo cual tal vez
haya reactivación po recombinación con el virus de tipo
natural (con timidincmasa).
Estrategias de inserción de DNA no virales
Ante las posibles limitaciones inherentes a los virus en
su función de vectores, los investigadores han explorado
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el uso de agentes no virales que medien la captación de
DNA exógeno por la célula. Estos sistemas de inserción
de DNA, que incluyen DNA de plásmido que no está en
complejos, complejos de DNA-liposoma, complejos de
DNA-proteína y partículas de oro revestidas de DNA, se
han elaborado a partir de componentes conocidos. Gra­
cias a ello, su composición se ha definido con exactitud, a
diferencia de los viriones que forman parte de complejos.
Además, desde el punto de vista técnico, su elaboración es
mucho más fácil que la de virus, y en muchos casos estos
sistemas de inserción de DNA pueden producirse sin ne­
cesidad de cultivo celular.
DNA libre purificado de plásmido (no integrado). Curiosa­
mente, es posible inyectar directamente DNA purificado (o
mRNA) en los tejidos y producir una expresión génica transito­
Tia; ello se ilustra mejor en tejido mus�ular, en el que la inyec­
ción directa de DNA no integrado (libre) alcanza su máxima
eficacia. Wolffy colaboradores (1990) demostraron que el DNA
o e! mRNA purificados de plásmido codificaban un gen "repor­
tero", que podria medir la expresión transgénica después de in­
yección directa en el cuadriceps de un ratón. La inyección de
DNA produjo una expresión génica más duradera (se identificó
después de 60 días una cantidad importante de! producto génico),
i
que la de mRNA (la expresión disminuyó después de 18 horas).
ed
Tal vez, e! DNA persista como DNA no integrado de plásmido y
no en su fonna integrada. La comparación directa de adenovirus
m
y retrovirus vectores, con la inyección de DNA de plásmido en
la transferencia génica en músculo de ratón indicó que los tres
es
sistemas eran más eficientes en la transferencia génica en múscu­
lo en regeneración (inducida por cardiotoxina), que en el músculo
nonnal maduro de ratón. En e! músculo en regeneración, estos
nt
sistemas de transferencia de DNA tuvieron igual eficacia, como
se advirtió por e! número de fibras musculares que expresaron el
u
gen "reportero". Es de interés que, en fibras maduras, la transfe­
ap
rencia génica por inyección directa de DNA de plásmido fue
mejor que la de cualquier otro de los virus vectores (Davis y
col., 1993). Además, no se produjo reacción inflamatoria des­
w.
pués de la inyección directa de DNA, en tanto que con otros
virus vectores hubo inflamación leve. Hasta la fecha la inyec­
ww
ción directa de DNA de plásmido es altamente eficaz sólo en
músculos estriado y cardiaco. Su eficacia puede depender de
características peculiares de la fibra muscular.
Pardculas de oro recubiertas de DNA. El DNA de plásmido
puede fijarse a partículas de oro de una micra de diámetro, para
ser "dispersadas en disparo" en células superficiales. Para ela­
borar dichas partículas se coprecipita el DNA en la esférula de
oro y se impulsa desde una capa de Mylar; se usa como elemen­
to motor una chispa eléctrica o gas presurizado. Esta técnica,
llamada de "pistola génica", se usa para acelerar la introducción
de partículas recubiertas de DNA en células superficiales de la
pie! (epidennis) o en tumores cutáneos (melanomas). La expre­
sión génica dura sólo unos días, lo cual depende más de las cé­
lulas que se busca tratar (como serian las células de la piel
esfaceladas), que el método de administración. En modelos ani­
males, la aplicación de vacunas de DNA con la pistola génica es
altamente eficaz (Finan y col., 1993). Dicha aplicación es muy
adecuada en inmunizaciones mediadas por genes en las que se
Capitulo 5 Geneterapia 97
necesita sÓlo una breve expresión del antígeno para lograr una
respuesta inmunitaria.
Dada la escasa profundidad de penetración del DNA, esta téc­
nica es idónea sólo para células superficiales, de acceso directo.
Es m';'", las capas epidénnicas de la piel abundan en células que
presentan antlgeno, por lo cual constituyen el blanco preferente
para la vacunación. La sencillez, inocuidad y facilidad técnica
de la preparación de este sistema de transferencia de DNA vuel­
ve muy factible su aplicación a gran escala, en comparación con
los sistemas de inserción de DNA viral de que se dispone.
Liposomas. Estos cuerpos se han usado ampliamente
como vehículo para introducir fármacos en forma experi­
r
mental en el interior de las células. El fundamento teórico
.a
es que si se rodean moléculas hidrófilas con moléculas
m
hidrófobas, pueden penetra.r en la célula agentes a los que
de otro modo la membrana celular sería impermeable. Entre
.co
las posibles ventajas de la técnica está la introducción de
fármacos en un sitio intracelular predeterminado y, con
ello, la disminución de la toxicidad.
s
El problema fundamental en la geneterapia in vivo es
co
insertar un transgén, que es una gran molécula hidrófila, a
través de la membrana plasmática y de ahí al núcleo, don­
de pueda incorporarse a la maquinaria de transfección ce­
lular. Al parecer, la tecnología de introducción de liposomas
podría ser muy útil para ese fin, si bien no tiene la eficacia
que se esperaba de ella.
Los liposomas son esferas uni o multilarninares, com­
puestas de muy diversos Iipidos; en su estructura pueden
influir el tipo de lípidos escogidos y el proceso de elabora­
ción. En la membrana lipídica puede incorporarse lipo­
proteína y otras moléculas no lipídicas. Por comodidad,
los liposomas se han clasificado en aniónicos o catiónicos,
con base en sus cargas negativa o positiva netas, respecti­
vamente.
Liposomas aniónicos. Nicolau y colaboradores (1983) seña­
laron por primera vez la introducción in vivo de genes por me­
dio de tiposomas, para lo cual encapsularon un transgén de DNA
que codificaba la insulina en tiposomas aniónicos, e inyectaron
el complejo en ratas. Los animales en que se realizó la transfe­
rencia tuvieron mayores niveles circulantes de insulina y menor
concentración de glucosa sanguínea.
A pesar de los buenos resultados iniciales, el empleo de
tiposomas aniónicos para la introducción de DNA ha tenido in­
convenientes graves. Estas estructuras, si se introducen por vía
intravenosa, se dirigen en particular a las células reticuloendote­
tiales del hígado, de tal modo que es poco útil su uso en otras
células a las que se busca tratar (blancos). La sustancia por trans­
portar debe ser encapsulada dentro de los liposomas. razón por
la que la elaboración de los mismos es compleja. Asimismo, casi
todas las preparaciones de DNA necesarias para la geneterapia
son grandes en comparación con el liposoma, de tal manera que
la eficiencia de la encapsulación es pequeña y quizá poco acce­
sible para aplicaciones prácticas.
Se pueden insertar proteínas en la capa externa de los liposomas
para modificar su comportamiento in vivo, incluida la incorpo­
ración citoselectiva. Este método pennite a los liposomas admi-
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98 Sección J Principios generales
nistrados por vía intravenosa evadir al sistema reticuloendote­
lia\. También los ligandos de proteínas o los anticuerpos contra
moléculas de la superficie celular incorporadas en la superficie
del liposoma, pueden dirigirlos hacia receptores específicos en
la superficie celular en poblaciones de células blanco (Wu y Wu.
1987). La estrategia comentada, a pesar de parecer prometedo­
ra, no se ha aplicado satisfactoriamente en la geneterapia.
lipD.romlls catiónicos. Felgner y colaboradores (1987)
tizaron liposomas catiónicos y demostraron que se ligaban con
avidez y eficacia a ácidos nucleicos (aniónicos), por interaccio­
nes electrostáticas. mediante la simple incubación de los liposo­
mas con los ácidos mencionados, a temperatura ambiente y por
lapsos breves. El DNA o RNA en complejo con los liposomas
catiónicos, penetraba fácilmente en las células en cultivo sin
dañarlas en un grado perceptible. En la figura 5-3 se ilustra de
manera esquemática el posible mecanismo de transfección de
plásmido-liposoma catiónico.
In vivo, los liposomas catiónicos poseen propiedades muy dis­
tintas de las de los aniónicos. La inyección intravenosa de, los
complejos cati6nicos logra la expresión transgénica en casi to­
dos los órganos si el complejo de liposomalDNA se inyecta en
la sangre arterial que llega al órgano. Además, los complejos del
liposoma-DNA pueden administrarse mediante inyección en el
interior de las vías respiratori�s o en aerosol hasta el epitelio
pulmonar predeterminado. En animales de experimentación no
liposomas DNA del
m
plásmido
y el gen
es
, génica que se logran en comparación con los vectores virales,
nt
pu
.a
w
por el DNA ·del
plásmido
ww
genoma
endógeno
Fig. 5-3. Imroducción de DNA mediado por un liposoma catiónico.
Esquema de la rorma en que los complejos del liposoma catiónico­
plásmido logran la transferencia génica a una célula. Son pocos los
conocimientos de la estructura real del complejo plásmido-liposoma.
Asimismo, tampoco se conocen en detalle los procesos que regulan
la penetración en la célula y el transporte al núcleo. El ONA circular
qel plásmido no se incorpora fácilmente en el genoma del huésped ni
muestra réplica en células de mamíferos; por esta situación, la ex­
presión transgénica parece ser de naturaleza episómica.
se ha observado reacción tóxica a la inyección intravenosa, ni a
la aplicación de los complejos de Iiposoma catiónico-plásmido
en aerosol (Brigham y col., 1989).
Los liposomas catiónicos se han utilizado para introducir con­
juntos de genes de DNA en varios modelos experimentales in
vivo. Nabel y colaboradores ( 1 994) introdujeron un gen de his­
tocompatibilidad exógeno mediante inyección directa de com­
sinte­ plejos de plásmido-liposoma en tumores, y mostraron atenua­
ción del crecimiento tumoral en modelos murinos. Hyde y
colaboradores (1993) señalaron que a través de transferencia
génica mediada por liposomas catiónicos se podía corregir la
conductancia de cloruro estimulada porAMP cíclico, dependiente
de CFTR, hasta llevarla a niveles normales en ratones transgé­
nicos homocigotos para una mutación "nula" en el CFTR. Los
r
ratones que recibieron por vía intravenosa el gen que codificaba
.a
la enzima proximal en la síntesis de prostanoides (sintetasa de
prostaglandina) en la forma de un complejo de ¡¡posoma catió­
m
nico-plásmido. produjeron mayores cantidades de prostanoides
derivados del endotelio en pulmones, lo cual protegió a estos
.co
órganos de los efectos de la endotoxemia (Conary y col., 1994).
El cuadro 5-1 incluye metas terapéuticas de las fases iniciales
de la introducción de DNA mediada por liposomas en geneterapia
s
de seres humanos, como sería la introducción de un gen de his­
co tocompatibilidad exógeno a tumores, la introducción de un gen
de al-antitripsina humana en la mucosa de vías nasales de suje­
tos con deficiencia de dicho compuesto. y a subsegmentos del
i
ed
pulmón por broncoscopia fibróptica, y la introducción de un gen
CFTR en la mucosa nasal de personas con fibrosis quística.
En la actualidad, la transfecci6n mediada por liposomas cons­
tituye un método atóxico no inmunógeno de introducir DNA en
diversos tejidos. La aplicación de dicha estrategia se ha visto
frenada por los niveles generalmente menores de transferencia
aunque las nuevas presentaciones de liposomas tienden a mejo­
rar t� eficacia de la transJerencia y ofrecer mejores propiedades
fi�Í(fas. e$ decir1�ayqres conc�ntraciooes del complejo sin agre­
gación. J"al vez las ap,licacione�. de los lipos,?mas en geneterapia
.
se amplíen conforme·se obtengan mejores reactivos, en particu­
lar los que faciliten el suministro citoespecífico.
Conjugados de DNA-proteínas, Algunos grupos han
obtenido siStemas de introducción de ONA citoespecíficos
que utilizan receptores peculiares en la supcrficie de la
célula "predetenninada" (Michael y Curiel, 1994). Al unir
a un ONA transgénico
•
el ligando reconocido por dicho
••
receptor, el complejo ONA-ligando se une de modo selec-
tivo y se intemaliza en la célula blanco (\vu y Wu, 1987).
Estos vectores de conjugados moleculares penniten lograr
una transferencia génica .citoespecífica, sin los problemas
que conllevan los vectores virales, como sería réplica, ·pro­
teínas virales inmu·nógenas con posibilidad de recombina­
ción. Los primeros sistemas modelo se orientaron a obte­
ner medios eficaces de unir ONA al ligando, por medio de
poli cationes, complejos de antígeno-anticuerpo y ligadores
de estreptavidina-biotina. La poli-L-lisina (PLL), un poli­
catión, se utilizaba ampliamente, porque es fácil acoplarlo
a diversos ligandos proteínicos por métodos de enlaces
cruzados de tipo químico. Cuando el aducto del ligando-
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PLL se mezcla con DNA de plásmido se forman comple­
jos macromoleculares en los que se une por cargas elec­
trostáticas el DNA a las moléculas de PLL-ligando. Esas
estructuras toroides (50 a 100 nm de diámetro) presentan
los ligandos al receptor de la superficie celular, al ser
intemalizado eficazmente por endocitosis. Se han utiliza­
do el receptor de transferrina (Zenke y col., 1 990), el re­
ceptor asialo-orosomucoide (Wu y Wu, 1987) y carbohi­
dratos de la superficie celular (Batra y col., 1 994), para
demostrar la posibilidad de la introducción de genes me­
diada por ligandos. El receptor asialo-orosomucoide es de
particular interés, porque se le detecta casi exclusivamen­
te en hepatocitos, de manera que pudiera ser útil para me­
diar la transferencia génica en el hígado.
Los primeros complejos de DNA-ligando fueron inefi­
caces para la transferencia del DNA, porque casi todo el
complejo intemalizado por endocitosis era desviado al
compartimiento lisosómico y el DNA era degradado en él.
Se han utilizado agentes como la cloroquina para bloquear
la degradación en el lisosoma, pero es poca aún la eficien­
cia de la transfección, en comparación con otros métodos
de introducción de DNA. Un procedimiento más eficaz con­
siste en utilizar las funciones de escape endosómicas del
i co
ed
adenovirus. Como se señaló, las proteínas en la cápside
del adenovirus estimulan el escape o separación del com­
plejo de DNA respecto del endosoma, antes de fusionarse
m
con el lisosoma. En teoría, puede emplearse un adenovi­
rus metabólicamente inactivado para escapar de la intro­
es
ducción en el Iisosoma, pero se necesita un número tan
grande de adenovirus para asegurar la colocalización del
nt
virus y el complejo de DNA proteína en el mismo endo­
soma, que surgen efectos citopáticos mediados por el ade­
u
novirus. En consecuencia, los investigadores han obteni­
ap
do complejos con enlaces físicos entre el adenovirus y el
aducto del ligando-DNA, con lo que aseguran su intro­
ducción simultánea en cada endosoma para disminuir la
w.
cantidad de adenovirus necesaria para escapar de su intro­
ducción o captación en el lisosoma, y también su degrada­
ww
ción (Fisher y Wilson, 1994).
Se han utilizado dos métodos generales para obtener comple­
jos de adenovirus-DNA-ligando. Es posible unir por enlaces
covalentes la poli-L-lisina a partículas adenovirales purificadas,
para lo cual se utiliza carbodiimida hidrosoluble; el producto así
obtenido se mezcla con los toroides de receptor de asi.alo­
orosomucoide-poli-L-lisina-DNA para fonnar conjuntos de par­
tículas adenovirales icosahédricas y toroides. El tamaño de es­
tos conjuntos varía desde menos de 200 nm (pequeños), en los
que los toroides únicos están unidos a dos partículas virales,
hasta los grandes (200 a 300 nm), que contienen más de una
docena de partículas virales y toroides. La compos ición de los
cúmulos depende de la cantidad de poli-L-lisina unida a las par­
tículas virales. Tales complejos logran mayores niveles de trans­
rerencia génica específica de hepatocitos con números menores
de virus que las mezclas de toroides y adenovirus no incorpora­
dos (libres) (Cristiano y col., 1 993).
Capítulo 5 Geneterapia 99
La tecnología se podría mejorar todavía más al disponer en
capas de DNA y el ligando sobre la superficie del adenovirus
para crear un adenovirus revestido, y no estructuras laterolatera­
les (virus-toroide-virus) a manera de emparedados, descritas en
párrafos anteriores (Fisher y Wilson, 1994). Con ello se obtie­
nen partículas monovirales, que retienen su capacidad de lisis
endosómica, las cuales están recubiertas con DNA y extienden
el receptor asialo-orosomucoide desde la superficie de la partí­
cula. Estos fragmentos de menor tamaño (menos de 100 nm)
conservan aún: algo de reconocimiento y captación del receptor
adenovírico, en fonna similar a lo que se observa con cúmulos
de mayor tamaño, pero su menor diámetro quizá los vuelva más
idóneos para atravesar el endotelio fenestrado del hígado. El
r
empleo de dos genes "reporteros", uno transportado en el DNA
.a
del plásmido y el otro en el genoma del adenovirus, ha penniti­
do la evaluación simultánea de la infecciosidad viral y la efica­
m
cia de la transferencia génica del plásmido. Al disminuir el nú­
mero de adenovirus necesarios puede eliminarse esencialmente
.co
la citotoxicidad inducida por ellos. La presencia de dos vías de
receptores para la penetración de DNA (receptor de ligando y
receptor de adenovirus) disminuye netamente la especificidad
s
de este sistema de introducción de DNA. La vía del receptor
adenovírico puede ser eliminada eficazmente por empleo de un
anticuerpo contra la proteína fibrilar adenovírica, como un me­
dio para la liga con DNA (Michael y Curiel, 1994), método que
anula la capacidad del virus para ligarse a receptores adeno­
víricos, pero no para mediar el escape y no llegar al lisosoma.
Refinamientos como el empleo de proteínas purificadas "endo­
somalíticas", y no partículas adenovíricas intactas, deben acre­
centar la utilidad de este tipo de sistema de introducción de DNA
(Seth, 1 994).
ENFERMEDADES EN QUE PUEDE SER
UTIL LA GENETERAPIA
Geneterapia dirigida a órganos
Hígado. La geneterapia dirigida al hígado ha surgido
como un modelo importante para tratar enfennedades he­
reditarias y adquiridas. El hígado puede ser el asiento de
muy diversas enfennedades metabólicas, infecciosas y neo­
plásicas. y contra ellas es posible concebir intervenciones
moleculares específicas. Por ej emplo, podrian utilizarse
métodos de transferencia génica para introducir interfe­
rón a en el tratamiento de la hepatitis B; citotóxicos contra
carcinoma del hígado, o aportar un gen faltante para co­
rregir un defecto metabólico hereditario. Las aplicaciones
posibles pueden serlo en mayor grado por la existencia de
múltiples sistemas para dirigir la transferencia génica al
hígado. Para la transferencia génica in vivo se puede lle­
gar al hígado por diversos medios, como serian la inyec­
ción directa y la administración intravenosa e intrabiliar
de vectores. Las estrategias ex vivo se pueden llevar a cabo
por la ablación quirúrgica parc ial del hígado, el aislamien­
to de hepatocitos y la transducción de dichas células in
vitro. Es posible reimplantar en el hígado las células gené­
ticamente modificadas .
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100 5,ección ! Principios generales

Hipercolesterolemia familiar. Las personas con el trastorno
mencionado muestran una deficiencia hereditaria del receptor
de lipoproteína de baja densidad (LDL) y, en consecuencia, sus
niveles plasmáticos de colesterol son extraordinariamente altos
y muestran arteriosclerosis en etapa muy temprana de la vida
(cap. 36). El defecto genético se manifiesta por la menor capaci­
dad del hígado para captar particulas de LDL de la sangre y los
niveles de lípidos séricos constituyen un marcador adecuado de
la enfermedad. Las intervenciones farmacológicas producen re­
sultados parciales, pero la corrección de la disfunción hepática
por trasplante ortotópico de hígado permite que se normalicen
los niveles de lipidemia y se retarde la evolución de la enferme­
dad arterial. La observación clínica anterior sugiere que podrían
lograrse los mismos beneficios si el hígado se modificara por
En particular se sabe poco del recambio normal de hepatocitos y
la fonna en que tal fenómeno se relaciona con la persistencia de
células modificadas genéticamente. No se ha observado hasta la
fecha una respuesta inmunitaria al producto génico terapéutico
que constituye un problema posible en casí todas las geneterapías
de estados de deficiencia. La posibilidad de que un producto
génico "curativo" sirva como neoantígeno varía en diferentes
tipos de deficiencias y depende de la naturaleza del producto
proteínico, y de si dicha deficiencia provino de la ausencia total
de la proteJna o de la expresión de una proteína disfuncional
(mutada). El estudio clínico citado (Grossman y coL, 1 994) cons­
tituye el primer ejemplo de corrección metabólica sostenida de
un defecto genético. La transferencia génica ex vivo probable­
mente será sustituida por estrategias de ese mismo tipo, pero, in

r
mecanismos genéticos, de modo que expresase el receptor de vivo, una vez que se hayan resuelto los problemas de eficacia,

.a
LDL. El conejo Watanabe con hiperlipidemia hereditaria resulta persistencia e inmunogenicidad del vector.
ser el modelo animal ideal para demostrar que tal método puede
producir disminuciones persistentes en LDL sérico (fig. 5-4)

m
Pulmones. Las neumopatías hereditarias más frecuen­
(Chowdhury Y coL, 1991). Se ha tratado a algunos pacientes en
tes son el enfisema familiar y la fibrosis quística. Se han

.co
un ensayo clínico, por medio de la introducci6n de DNA ex vivo
en un retrovirus, y con él introducir el gen receptor de LDL en propuesto geneterapias para mejorar ambos trastornos.
hepatocitos aislados de pacientes después de hepatectomía par­ Enfisema familiar. El enfisema mencionado es conse­
cuencia de un defecto en el gen que codifica la principal

s
cial (Grossman y coL, 1 994). El estudio anterior demostró la
factibilidad, inocuidad y posible eficacia de la geneterapia he­ antiproteasa endógena, la a l-antitripsina; dicha deficien­
pática ex vivo.
Los resultados finales de la transferencia de DNA en los he­
co
cia vuelve al pulmón vulnerable a sufrir lesiones por pro­

�
teasas de neutró:filos liberados en Jos sitios de inflamación.
i
patocitos dependerá de varios factores hasta hoy desconocidos. La proteína al-antitripsina puede obtenerse clínicamente
ed

y administrarse a los sujetos con la enfermedad. El gen

humano ha sido clonado e introducido eficazmente en los
m

pulmones de animales de experimentación (Canonico y

1 994). NlH ha aprobado la práctica de estudios ini­
Coneio
Watanabe con de col.,
es

hiperlipidemia
'Extracción
un lóbulo ciales en seres humanos con deficiencia de a l-antitripsina
hereditaria hepático
(cuadro 5-1).
Fibrosis qulstica.
(WHHL)
nt

.. El cuadro mencionado es el trastorno

In orpor
c ación hereditario más común en poblaciones de raza blanca, y
u

los hepatocitos
de cultivos de
hepatocito s dado que ]a mayor parte de su morbilidad y mortalidad es
ap

Trasplante producto de manifestaciones pulmonares, constituye el

repueblan el hígado

a¿
en la vena
port
modelo ideal para geneterapia de neumopatías heredita­
rias.
' @ l. 1
w.

-
lnfecc i6n con _ ••• En la actualidad, las estrategias de transferencia génica
retrovirus recombinante que ex vivo no representan una opción viable en el pulmón.
ww

codifica el receptor de lDl

Fig. 5-4. Modelo animal para la transferencia g/nica ex vivo (por
medio de retro virus) del receptor de lipoprotelnas de baja densidad
(LDL).
El conejo Watanabe con hiperlipidemia hereditaria (WHHL) es el
modelo animal ideal de la deficiencia hereditaria del receptor de la
lipoproteína de baja densidad (LOL). La ausencia del receptor de
LOL normalmente expresado en los hepatocitos, hace que los ani­
males rápidamente muestren ateroscJerosis. El modelo presente de­
muestra la factibilidad de transferencia génica ex vivo con un retro­
virus. Se realiza hepatectomía parcial en la que se extrae un tercio de
la víscera. La porción eliminada del hígado se perfunde ex vivo con
enzimas para dispersar los hepatocitos, que después son colocados
en cultivo tisular y expuestos al retrovirus recombinante que expre­
sa el receptor de lipoproteínas de baja densidad. Los hepatocitos que
contienen el DNA viral integrado de manera estable se inyectan en
la vena porta de nuevo al hígado, donde terminan por establecerse.
El método se ha realizado en seres humanos con el mismo trastorno.
Desde los puntos de vista técnico y terapéutico, resulta
imposible la extracción y reimplantación de células de vías
respiratorias. Las células blanco en las vías respiratorias
tienen un recambio extraordinariamente lento, por lo cual
la transferencia génica con retrovirus (que necesita de di­
visión celular) es muy ineficaz. Por lo contrario, los ade­
novirus vectores sirven muy eficazmente para tal aplica­
ción, porque muestran tropismo por el epitelio de vías
respiratorias. Son inconvenientes graves del empleo de di­
chas partículas la naturaleza transitoria de la expresión
génica y la incertidumbre respecto a si una respuesta in­
flamatoria inducida por el virus permitirá administrar de
nuevo el vector. Además, los neutrófilos en las secrecio­
nes de vías respiratorias pueden disminuir la eficiencia de
la transfección. A pesar de todo, se ha emprendido un es­
tudio importante para obtener adenovirus vectores útiles
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para lograr in vivo la transducción de epitelios de vías res­
piratorias.
Se han realizado estudios en seres humanos a los que se ad­
ministró el adenovirus que codifica al regulador del transpor­
te de la fibrosis quística, en el epitelio nasal de individuos con
este problema (Zabner y col., 1993). Con un nUmero relativa­
mente pequeño de virus se observó normalización de la conduc­
tancia de cloruro. La desventaja principal del adenovirus vector
ha sido la respuesta del huésped a proteínas codificadas por el
virus. Se ha observado una respuesta inflamatoria a células
transducidas por adenovirus en modelos animales y en seres
humanos, porque el vector contiene gran pane del genoma
viral natural. Por medio de deleción de un subg:rupo de genes
virales se ha incapacitado al virus para la réplica, pero aún diri­
ge la célula transducida por él, de modo que sintetice proteínas
virales inmunógenas. Versiones nuevas del adenovirus recom­
binante que sirve de vector pudieran superar esta limitación al
atenuar la expresi6n de las proteínas generadas Dor la partícula.
Engelhardt y colaboradores ( 1 994) han demostrado que las alte­
raciones del genoma adenoviral, además de la� deleciones de
Jos genes E J y E3, rljsm;nuye la respuesta inflamatoria des­
pués de la transferencia génica. En el genoma viral se introduce
un mutante E2 terrnosensible (ts 125) que prolifera en forma pre­
ferente a 32°C, dt manera que cuando se utili2;a el virus para
i co
infectar células a 39°C, la proteína E2 mutante resulta menos
ed
eficaz para transac:tivar los genes adenovirales de corriente aba­
jo, que quizá sean los encargados de inducir la respuesta infla­
m
matoria del huésped. En la práctica puede propagarse in vitro el
virus en células pe:nnisivas (línea 293) a 32cC, para usarlas des­
es
pués en la transducción de células in vivo a 37°C. Después de la
transducción in vivo, el virus muestra deficiencia en la réplica
(deJeción de El) y es menos eñciente en la sintesis de proteinas
nt
adenovirales a mayor temperatura corporal. Ello ocasiona me­
nor inflamación, }' expresión transgénica prolol\gada. Están en
u
marcha intentos para mejorar el diseño de los adenovirus vecto­
res, que incluyen mutaciones que eliminarán la región E4, toda
ap
o en parte.
En la actualidad es demasiado pequeño el nÚmero de indivi­
w.
duos tratados en t()dos los estudios de geneterapia de la fibrosis
quística, como pata extraer conclusiones signifi�ativas respecto
a la eficacia del método. Sin embargo, se han definido con exac­
ww
titud los principios de la introducción de matetial genético en
VÍas respiratorias. E�' probable que se }ogren ben.eflcios impor­
tantes con las generaciones futuras del sistema de transferencia
de DNA genético, incluidas las AAV y de liposoma analizadas
en párrafos anteriores, no sólo en la fibrosis quística sino en
otras neumopatías.
Vasos san guineos. El sistema de vasos sanguíneos ha
sido objeto de experimentos de transferencia génica que
han demostrado las posibilidades terapéuticas que tiene la
introducción de genes en dichos tejidos. Las células endo­
teliales que revisten los vasos y las subendoteliales de
músculo liso, han sido punto de gran interés, por su inter­
vención en la aterosclerosis y la posibilidad de ser utiliza­
das para introducir productos transgénicos en la corriente
sanguínea. Las alteraciones genéticas de dichas células
podrían ser útiles para modificar o evitar el proceso de
C·apilulo 5 (jenet�rupia 101
aterosclerosis, o introducir en forma local agentes vasodi­
tatadores, o bien para la administración local de anticoa­
gulantes.
Estrategias ex vivo. Los primeros experimentos se ocuparon
de los métodos de transferencia génica ex vivo. Wilson y cola�
boradores (1989) demostraron que las células del endotelio ca­
nino podían ser modificadas genéticame:nte in vitro mediante
transferencia de genes retrovirales y después ser devueltas en
trasplante al perro en la fonna de un implante vascular de Dacron®
sembrado con las células endoteliales modificadas, de modo que
demostraron expresión transgénica por rnás de cinco semanas.
En otro estudio, las células endoteliales cultivadas de cerdos ena­
r
nos de YUcatán fueron transducidas in vitro con retrovirus que
.a
tenían réplica deficiente, antes de ser introducidos de nuevo en
una arteria por medio de un catéter especial de doble balón. Al
m
ocluir la corriente sanguínea un segmento "desnudo" (sin endo­
telio) de la arteria, el catéter generó un espacio protegido tempo­
.co
ral en el cual fue posible recolocar en la pared vascular las célu­
las endoteliales modificadas (Nabel y col., 1989).
s
Estrategias in vivo. La introducción de genes in vivo, que vuel�
ve innecesarias las células singénicas, será indispensable en apli�
caciones te:rapéuticas, como en el tratamiento de la aterosclero�
siso La transferencia in vivo de genes se hit logrado por medio de
un catéter de doble balón con instilación del sistema de trans­
porte de DNA en el espacio "protegido" del vaso temporalmen­
te ocluido. Con este método se han utilizado retrovirus, liposomas
y adenovirus vectores, para dirigirse a un sitio específico dentro
de un gran vaso.
Aterosclerosis. Se han expresado muy diversos genes por trans­
ferencia in vivo para la creación de aplicaciones clínicas útiles,
y también para tener modeJos de mecanismos patogénicos. La
proliferación de células vasculares y el depósito de la matriz
extracelular proteínica se acompañan de angostamiento ateros­
clerótico de las arterias. Los factores qlle pueden contribuir a
dicho proceso se han estudiado por sobreexpresión de sus genes
en segmentos arteriales. Por ejemplo, cuando el factor de creci­
miento ácido de fibroblastos (FGF- l ) se expresa de modo ectó­
pico en arterias de cerdos, la pared vasctllar se engruesa (hiper­
plasia de la íntima) como resultado de la proliferación de células
de músculo liso (Nabel y coL, 1993c). Además, se forman vasos
nuevos dentro de la pared arterial como consecuencia de la mi­
gr.adÓD y la prDJjferaóón de céluJas endoteJjaJes. En cambio,
cuando se expresa de manera ectópica en el vaso TGF�t H, hay
síntesis de: matriz extra celular y engrosamiento de la íntima
(Nabel y Col., 1993a). También se ha demostrado que el factor B
de crecimiento derivado de plaquetas induce la hiperplasia de la
íntima deSpués de transferencia génica in vivo (Nabel y col.,
1993b). Estos cambios inducidos en forma experimental en la
pared del vaso remedan a los que se observan en las lesiones
aterosclerÓticas. De este modo, la transferencia génica constitu­
ye un medio útil para estudiar los efectos de agentes que pudie­
ran ser parte de un proceso patológico complejo.
YosrNliJjs olJloillllllJllilorio. Con el fm de simuJar otra arte­
riopatía, qUe es la vasculitis autoinmunitatia, se introdujo un gen
de histocompatibilidad exógeno en las paredes' de vasos, por
medio de transferencia de genes en liposomas, con lo que se
obtuvo una respuesta inmunitaria focal en el sitio de la transfe­
rencia, similar en su imagen histológica a la de la arteritis de
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102 Sección / Principios generales
Takayasu (Nabel y col., 1992). Los experimentos en cuestión
demostraron que es posible obtener modelos de enfermedad en
el ser humano al inducir cambios moleculares específicos en los
vasos sanguíneos. Dichos modelos de arteriopatía pueden ser
útiles para evaluar agentes que bloqueen dichos procesos y mOM
difiquen la progresiól\ de la enfermedad.
Prevención de la reestenosis. Además de conocer !}lejor la géM
nesis de las enfermedades vasculares, se han elaborado técnicas
de transferencia géniGa para combatirlas. Por ejemplo, la aterosM
clerosis en arterias coronarias a menudo se trata mediante anM
gioplastia con balón. Se hace dilatación mecánica del segmento
angostado del vaso aterosclerótico por la introducción e inflaM
ción del catéter con balón. Brinda beneficios a largo plazo a
muchos enfermos, pero conlleva un índice grande de reestenosis,
es decir, cierre del vaso (reestenosis) a las pocas semanas de la
dilatación. La reestenosis se produce en parte por la hiperplasia
de músculo liso. La introducción de un adenovirus vector que
codifica la timidincinasa, seguida de administración sistémica
de ganciclovir, bloqueó la hiperplasia de la íntima arterial en un
modelo animal de reestenosis (Ohno y col., 1994).
Geneterapia en cáncer
En los procedimientos de esta índole se han utilizado es­
trategias que dependen de blancos moleculares peculiares
i co
de células cancerosas. Entre los signos comunes de los
ed
cánceres en la especie humana están la activación de
oncogenes o la mutación de genes oncosupresores. Por
m
ejemplo, las mutaciones en el oncogén KirstenMras que se
observan frecuentemente en adenocarcinomas del pulmón,
es
guardan relación con el consumo de tabaco y pudieran
contribuir a la progresión tumoral. En el cáncer humano
tambíén se observan a menudo mutaciones en los genes
nt
oncosupresores. El gen p53 de retinoblastoma, que codiM
tica la proteína nuclear p53 que regula la proliferación
u
celular, es el gen alterado con mayor frecuencia en el
ap
cáncer; los defectos en la función de dicho gen y su pro­
ducto contribuyen a que surja proliferación celular irre­
w.
frenable.
Los procesos moleculares que regulan la proliferación
ww
celular, si bien fundamentales para la progresión de la neo­
plasia, en términos generales, son dificiles de modificar
con los métodos de transferencia génica actuales, por va­
rias razones. En todos los tumores hay comúnmente onco­
genes particulares, como el Kirstein-ras, aunque no de
manera indefectible, incluso de un tipo histológico parti­
cular. De mayor importancia, en cada una de las células
cancerosas se necesitaría interrumpir la función del oncoM
gén específico o restaurar la función del gen oncosupresor,
porque las células no tratadas se dividirían fácilmente. Casi
todas las neoplasias malignas ejercen sus efectos de mor­
bilidad y mortalidad por diseminación metastásica, de modo
que el clínico se enfrenta no sólo al suministro específico
a cada una de las células cancerosas, sino también a comM
batir otras que están en sitios anatómicos muy diversos
(hueso, hígado, pulmón, cerebro y otros órganos más).
Además, muchas lesiones son depósitos metastásicos mi­
croscópicos que no se detectan con las técnicas actuales
de imagenología diagnóstica, todo lo cual dificulta eva­
luar la eficacia de un nuevo método de transferencia génica,
porque en el curso de la prolongada vigilancia que se ne­
cesita, tal vez no se sepa si la ineficacia del tratamiento
fue producto de transferencia génica ineficiente o de cua­
lesquiera otros innumerables fenómenos que pudieron con­
tribuir a la ineficacia de la oncoterapia.
Muchas neoplasias adquieren diversos defectos genéti­
cos en su evolución. Además, otras nacen como conse­
cuencia de mutaciones que ocasionan «ganancia" de funM
ción y no pérdida de ella, de modo que obligan a anular la
nueva actividad. Por ejemplo, la leucemia mielógena cró­
r
.a
nica es resultado de la expresión de un nuevo producto
génico quimérico.
m
En la actualidad, las técnicas de transferencia génica no
tienen un nivel satisfactoriamente alto de eficiencia en su
.co
cometido en un entorno in vivo, razón por la cual se han
investigado otras estrategias que no necesiten eficacia ab­
soluta (100%) de la transferencia. Se han perfeccionado
s
dos métodos generales que pudieran ser eficaces para la
transducción de sólo una minoría de células tumorales: 1)
el "suicidio dirigido a célula" que se logra al dirigir la sÍn­
tesis de un metabolito tóxico que se distribuya en el mi­
croentomo del tumor, y 2) el uso de la ingeniería gené­
tica para desencadenar una respuesta inmunitaria a las cé­
lulas tumorales, por una expresión de citocinas ectópicas
u otros medios para el reconocimiento o la activación in­
munitaria.
Suicidio dirigido a célula. Una forma atractiva de crear
una diferencia "artificial" entre el tejido normal y el neoM
plásico sería convertir un pro fármaco en un metab0lito
tóxico por medio de ingeniería genética de las células tu­
morales. Esto se lograría por la expresión de un gen que
confiriera un fenotipo negativamente selectivo y dominante
a la célula cancerosa, como sería la muerte de ella por eXM
presión de una enzima fannacometabolizante. Varias enzi­
mas pueden realizar dicha tarea, y típicamente matar céluM
las por activación de un profánnaco relativamente atóxico,
a otro con propiedades citotóxicas (cuadro 5-2). Quizá se
logre mayor selectividad en la destrucción de células can­
cerosas si el gen transferido no está normalmente en los
seres humanos (p. ej., timidincinasa de virus de herpes sim­
ple), y no por sobreexpresión de un gen endógeno (como
sería desoxicitidincinasa).
La inserción del gen de la timidincinasa del virus de
herpes simple (HSV-TK) en células cancerosas, junto con
la administración sistémica de aciclovir, se ha vuelto el
sistema de terapia génica prototípico que utiliza la combi­
nación de una enzima y un profánnaco. Muchos investiM
gac!')res han demostrado que la expresión del gen mencio­
nado confiere un fenotipo seleccionable negativo a las
células cancerosas in vitro e in vivo.
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Cuadro 5-2. Combinaciones de enzima-profármaco
en la geneterapia antineoplásica
Profármaco
Gen
Timidincinasa de virus de herpes Ganciclovir
simple (HSV-TK) Aciclovir
Timidincinasa de virus de esto­
matitis vesiculosa (VSV)
Desoxicitidincinasa Ara-C
Fludarabina
2-Clorodesoxiadenosina
Difluorodesoxicitidina
Citocindesaminasa 5-Fluorocitidina
Nucleosidofosforilasa* MeP-dR
* La nucleosidofosforilasa es codificada por el gen DeoD de E. eoli, que
es la secuencia de codificación utilizada en esta estrategia terapéutica.
Ara-C, arabinósido de citocina o citarabina; Ara-M. arabinósido de 6-
metoxipurina; MeP-dR. 2' -desoxirribósido de 6-metilpurina.
Moolten (1986) demostró la sensibilidad adquirida al ganci­
clovir en la línea de células de sarcoma murino transducidas con
i co
un retrovirus vector que produce HSV-TK; las células tumorales
ed
transducidas tuvieron una sensibilidad 200 a 1 000 veces mayor
al ganciclovir que las testigo del mismo tipo. Este dato ha sido
m
duplicado en varios sistemas y modelos de cánceres de roedores
y seres humanos, incluidos los de pulmón, el mesotelioma, el
es
carcinoma hepatocelular, la leucemia, el melanoma y tumores
(modelos) del sistema nervioso central. La eficacia del método
varía notablemente, y pudiera depender de factores que inclu­
nt
yen la función del promotor, las células blanco estudiadas, y la
eficiencia de la transducción.
u
La actividad tumoricida del sistema de HSV-TK-ganciclovir
ap
depende de varios factores. En las células en fase de división el
ganciclovir fosforilado inhibe la síntesis de ONA; el efecto an­
terior no se limita a las células en las que se ha hecho transduc­
w.
ción directa con HSV-TK, puesto que también abarca y afecta
las células vecinas. El fenómeno mencionado que posiblemente
ww
es consecuencia de varios mecanismos, ha recibido el nombre
de "efecto del espectador inocente" y se ha observado en varios
tipos tumorales como los del sistema nervioso central (Freeman
y col., 1993). La transferencia del ganciclovir fosforilado entre
las células ("colaboración metabólica") a través de las uniones
comunicantes o de nexo, ha sido postulada como mecanismo
posible. La fagocitosis por parte de células vecinas de las vesí­
culas apoptóticas que contienen el fosfato de ganciclovir (pro­
venientes de células transducidas y en fase agónica) también ha
sido otro mecanismo propuesto.
Los procesos mediados por mecanismos inmunitarios pudie­
ran explicar también la destrucción significativa de células sin
transducción. En un estudio se observó inmunidad antitumoral
después de la destrucción de tumores encefálicos experimenta­
les, mediada por timidincinasa. En el modelo de roedor utiliza­
do no se sabe si la inmunidad contra el tumor dependió de la
cinasa en cuestión o simplemente fue una manifestación de la
inmunogenicidad inherente de las células neoplásicas (Barba y
col., 1994).
Capítulo 5 Gl:"lIclerapia 103
En fecha más reciente se han utilizado adenovirus vectores
para la transferencia génica de HSV-TK. Chen y colaboradores
(1994a) demostraron regresión de gliomas experimentalmente
después de transferencia génica mediada por adenovirus in vivo
y tratamiento con ganciclovir. Sin embargo, el tratamiento no
eliminó del todo los depósitos tumorales. Las células neoplási­
cas cercanas al sitio de inyección mostraron transducción más
fácil que las distantes, a juzgar por los datos de experimentos
paralelos de transferencia de genes marcadores. Aún más, di­
chas células distantes escaparon a la toxicidad del ganciclovir
por un efecto menor de "espectador inocente" atribuido a la es­
casez de uniones de nexo en la línea de células tumorales del
cerebro del roedor utilizadas. La limitación mencionada puede
r
ser superada en seres humanos mediante la planeación más exacta
.a
del tratamiento por medio de estereotaxia (facilitada con estu­
dios de resonancia magnética y tomografia por emisión de
m
positrones), y por múltiples inyecciones en el tumor.
.co
Otros métodos se han dirigido a introducir genes que si­
mulan una respuesta inmunitaria contra el tumor. Algunos
científicos han argüido que la proliferación tumoral es re­
s
sultado de estimulación del sistema inmunitario, pero hay
pocos datos directos que refuercen esta hipótesis en casi
todas las neoplasias del ser humano. Más bien, se han acu­
mulado pruebas crecientes en el sentido de que las células
neoplásicas expresan determinantes peculiares y únicos
capaces de ser reconocidos por el sistema inmunitario.
Expresiones de citocinas ectópicas. Se ha demostrado
que diversas citocinas disminuyen la proliferación tumo­
ral cuando se expresan de modo ectópico en células neo­
plásicas en su microentorno (Tepper y Mule, 1 994). Las
células del tumor sometidas a métodos de ingeniería gené­
tica para secretar algunas citocinas mostraron menor ca­
pacidad de formar neoplasias cuando se implantaron en
huéspedes singénicos, en tanto que su proliferación in vi­
tro no se modificó, lo cual sugiere que hay inducción
de factores del huésped por reacción a las citocinas, que
disminuyen la tumorigenicidad. Algunos agentes inmuno­
estimulantes no modifican inicialmente el ritmo de proli­
feración del tumor, pero generan inmunidad contra la pro­
liferación mencionada si más tarde se estimula al animal
con células tumorales naturales. Se advierte que las célu­
las tumorales modificadas por ingeniería genética desen­
cadenan muy diversas respuestas inmunitarias en el hués­
ped, que dependen del agente inmunomodulador utilizado.
Por ejemplo, la secreción de interleucina-4 (IL-4) por cé­
lulas �morales desencadena una potente respuesta infla­
matoria local sin efecto alguno en células neoplásicas dis­
tantes o en las células cancerosas administradas en etapas
ulteriores. Por lo contrario, el factor estimulante de colo­
nias de granulocitos-macrófagos (GM.-CSF) tiene poco
efecto en la tumorigenicidad, pero desencadena una po­
tente inmunidad antitumoral (Dranoff y col., 1993). En
muchos casos, los tumores que expresan agentes inmu­
nomoduladores inician efectos inmunitarios múltiples,
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104 Sección / Principios generales
como se observa en neoplasias que secretan interleucina-
2, donde el tumor queda infiltrado con linfocitos T, ma­
crófagos activados, células citocidas naturales, neutrófi­
los y eosinófilos. Además, una citocina puede tener efectos
diversos en tipos tumorales diferentes. Por ejemplo, la in­
terleucina-6 pudiera tener efectos antiproliferativos direc­
tos, reclutar linfocitos citocidas naturales o servir como
un factor de crecimiento autocrino, con base en el tipo de
tumor estudiado. En muchas circunstancias es dificil dife­
renciar los efectos inducidos por la citocina, de los que
son mediados en forma secundaria por otras células efec­
toras inmunitarias; este ha sido el punto de partida de un
método bastante empírico de geneterapia oncológica ba­
sada en citocinas. Las citocinas interleucina- l , -2, -4, -6,
-7 Y -12, el factor a de necrosis tumoral (TNF-a), el inter­
ferón y, los factores estimulantes G-CSF, GM-CSF y las
moléculas coestimulantes de linfocitos inducen destruc­
ción inmunitaria de células neoplásicas, en algunos mode­
4, el TNF-a, el
los. De todos ellos, las interleucinas 2 y
interferón y y el factor GM-CSF han sido utilizados en
estudios preliminares en seres humanos, y para ello se han
utilizado células tumorales sometidas a ingeniería genéti­
ca a fin de que secreten la citocina en cuestión (Tepper y
Mule, 1 994; véase también capítulo 52).
i
ed
Intensificación inmunitaria. Se han creado otros mé­
todos orientados a incrementar la reacción o respuesta in­
munitaria a células cancerosas. Uno de ellos consiste en
m
expresar moléculas altamente inmunógenas en la superfi­
es
cie de las células neoplásicas, como seria la expresión de
los antígenos alotípicos del complejo mayor de histocom­
patibilidad (MHC); o bien, en vez de expresar un antígeno
nt
"exógeno" de rechazo, pueden modificarse las células neo­
plásicas, de modo que sean reconocidos en mejor forma
u
los antígenos oncorreactivos débilmente inmunógenos, de
ap
tipo endógeno. Se sabe desde hace mucho que se necesi­
tan vías "coestimulantes" adicionales diferentes del recep­
w.
tor de linfocitos T para lograr la activación de este tipo de
leucocitos (cap. 52). Las moléculas B7-1 y B7-2 estimu­
lan una vía de ese tipo. Las B7, cuya expresión normal­
ww
mente se limita a las células presentadoras del antígeno y
a otras células efectoras inmunitarias especializadas. ocu­
pan receptores específicos (CD-28 y CTLA-4) en la su­
perficie de linfocitos T, junto con la unión antigénica al
receptor del linfocito T. En consecuencia, surgen activa­
ción de linfocitos T, proliferación celular y producción de
citocina, lo cual genera la inmunidad antitumoral. La falta
de una señal coestimulante en el momento de la ocupación
del receptor en linfocitos T no es un hecho intrascendente,
sino que origina una anergia oncoespecífica y no sólo la
incapacidad de activar el linfocito T (cap. 52). Por tanto,
cabria esperar que la sola presencia de antígenos en las
células tumorales produzca un estado de tolerancia inmu­
nológica y no otro de reactividad inmunitaria, si no se pro­
dujeran fenómenos coestimulantes. En efecto, esto es lo
que se ha observado en muchas situaciones en que los tu­
mores de seres humanos proliferaron al parecer sin res­
tricción alguna, por no haber intervenido los mecanismos
inmunitarios del huésped. Cuando algunas células tumo­
rales reciben moléculas coestimulantes acaece la activa­
ción eficaz de linfocitos T, situación que se ha demostrado
por expresión ectópica de la molécula B7 en células tumo...
rales, que después se utilizan para estimular una respuesta
inmunitaria en la línea de células tumorales "de origen"
Varios investigadores han utilizado este método experimental
para demostrar que los tumores a los que se confiere la capaci­
dad de coestimulación con moléculas B7 pueden activar el sis­
tema inmunitario del huésped para reconocer y erradicar las cé­
r
lulas neoplásicas. Chen y colaboradores (1994b) coexpresaron
.a
la molécula B7 y el antígeno de rechazo E7 del virus del papilo­
ma humano en células de melanoma murino K 1735. Dichas cé­
m
lulas, inyectadas en ratones singénicos (E7+ B7+) indujeron una
respuesta inmunitaria dependiente de la molécula comentada,
.co
que ocasionó la regresión del tumor. En cambio, las células tu­
morales E7+B7- no indujeron una respuesta antineoplásica. Aún
más, una vez precondicionados por las células E7+B7+, los ra­
s
tones pudieron rechazar células tumorales E7+B7- que se les
co
inyectaron más tarde. Sin embargo, dichos animales no pudie­
ron rechazar los tumores "de células precursoras" que no tenían
el gen E7-; el estudio también indicó que el rechazo inmunitario
exigió la presencia de linfocitos T CD8+, pero no CD4+.
Un estudio semejante, de Li y colaboradores (1994), sugirió
la contribución de los linfocitos CD8+ y CD4+ en la inmunidad
tumoral. Los autores hicieron transfección de una línea celular
Kl735 que expresaba moléculas de clases 1 y 11 del MHC, para
que expresara la molécula B7-1 y el antígeno p97. Se sabe que
este último antígeno es muy inmunógeno y estimula la produc­
ción de clonas CD4+ específicas contra él. La expresión de la
molécula B7, cuando tuvo coexpresión con p97, estimuló la ex­
pansión de los linfocitos T citotóxicos CD8+.y CD4+. Aún más,
a pesar de que las células secretoras más importantes fueron los
linfocitos T CD8+, se requirieron ambos tipos de leucocitos para
eliminar nódulos tumorales establecidos. La experiencia en se·
res humanos dernuestra con nitidez que la simple presencia de
antígenos oncorreactivos no induce una respuesta inmunitaria.
La deducción que puede hacerse de los estudios comentados es
que la ineficacia de los antígenos tumorales puede ser superada
por la expresión de moléculas B7 a células neoplásicas. En es­
tos experimentos y otros más, la presencia de las moléculas de
clase 11 de MHC en la superficie de las células cancerosas, ade­
más de las moléculas de clase 1, contribuye a la respuesta inmu­
nitaria integral, en particular el componente CD4+ de la respuesta.
Casi ningún tumor en seres humanos expresa rnoléculas de cla­
se 11, por lo cual puede ser necesaria, para que haya una respues­
ta eficaz de linfocitos T CD4+, una intervención que abarque
más allá de la expresión de moléculas B7. En consecuencia,
pudiera ser provechosa la estimulación con citocinas que logren
el efecto comentado.
Los experimentos mencionados se realizaron con lo que hoy
se conoce como molécula B7·1. Otros han indicado que otras
moléculas (B7-2 y quizá algunas más) pueden unirse a los mis­
mos receptores de linfocitos T que la molécula B7-1 (CD-28 y
CTLA-4) e inactivar las vías coestimulantes de los linfocitos
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mencionados. Apenas comienza a explorarse la función diferen­
cial de estos Jigandos similares. El curso cronológico y el nivel
relativo de su expresión son totalmente diferentes, como lo es su
capacidad de ser regulados en forma diferencial por los mismos
estímulos. En los estudios de receptores de B7, CTLA-4 y CD-28
se ha identificado un nivel semejante de complejidad. El papel
diferencial de estas moléculas, en su relación con la función
normal del sistema inmunitario, comienza a esclarecerse, pero
todavía se desconoce qué moléculas de tipo B7 constituirán el
medio más eficaz para desencadenar la inmunidad antitumoral
(véase el cap. 52, donde se revisan los mecanismos celulares de
intensificación y supresión inmunitarias).
La activación de células T, a pesar de depender en forma casi
absoluta de TCR y de vías de coestimulación, también puede ser
apoyada por otras funciones de las que se encarga normalmente
la célula presentadora del antígeno. La interleucina-12 (IL-12)
es secretada por células presentadoras de antígeno y actúa al
ligarse a receptores específicos en linfocitos T y células citocidas
naturales. La interleucina mencionada induce la formación de
interferón y y estimula la producción de una respuesta citotóxi­
ca de linfocitos T. En un modelo de tumor murino, la interleuci­
na-] 2 producida en el microentomo de un nódulo tumoral en
desarrollo, retrasó la aparición de nódulos tumorales detecta­
bles (Ohno y col., 1 994). En dicho modelo, la interleucina-1 2 no
generó inmunidad antitumoral protectora, es decir, se retrasó la
i co
aparición del tumor, pero no se impidió del todo. Resulta intere­
ed
sante que la línea celular de melanomas BL-6 derivada de B I 6
tiene poca inmunogenicidad, pero aun así, fue capaz d e activar
linfocitos T cuando recibió el apoyo de dicha citocina de origen
m
exógeno. Otros investigadores han señalado que las líneas de
es
células tumorales B 1 6 no son capaces de inducir una respuesta
inmunitaria cuando se someten a transducción para que expre­
sen la molécula B7-1. El hecho de que la interleucina-12 in­
nt
duzca reactividad inmunitaria a una neoplasia, cuando no lo
puede hacer la molécula B7-1 sugiere que estas moléculas
u
inmunomoduladoras pudieran tener funciones diferentes. En fe­
cha reciente se ha demostrado que B7-1 e IL-12 actúan en forma
ap
sinérgica para inducir la proliferación de linfocitos T y la pro­
ducción de citocinas (interferón y y TNF-a) (cap. 52).
w.
No se han identificado con precisión todos los obstáculos para
la obtención de vacunas antitumorales preparadas por ingenie­
ría genética. La tolerancia inmunitaria de células neoplásicas
ww
puede ser producto de varios mecanismos, como la secreción de
agentes inmunosupresores por parte de las células neoplásicas
(p. ej., TGF-,B), y es necesario crear otros medios para vencer la
tolerancia. A pesar de todo, la expresión ectópica de los genes
en células cancerosas es un medio muy flexible y potente que
pudiera mejorar las técnicas terapéuticas actuales de los anti­
neoplásicos administrados por vía sistémica (cap, 5 1).
Transferencia génica en células
hematopoyéticas precursoras
La transferencia génica en células precursoras en la mé­
dula ósea ha sido un método propuesto contra diversos tras­
tornos hereditarios y adquiridos; entre los primeros están
los que se manifiestan en células producidas por la médu­
la ósea (como enfermedad drepanocítica, talasemias, en-
Capítulo 5 Geneterapia 105
fermedad granulomatosa crónica y varios cuadros linfo­
chicos), y entre las segundas o adquiridas, afectación se­
cundaria de las células provenientes de la médula roja
(como serían síndrome de inmunodeficiencia adquirida
[SIDA) y mielosupresión inducida por quimioterapia). La
capacidad de repoblación que tienen a largo plazo los pre­
cursores en la médula ósea, también hace que la transfe­
rencia génica pudiera ser un método útil para la produc­
ción e introducción de proteínas sintetizadas normalmen­
te por células no hematopoyéticas (como las proteínas de
la coagulación). El trasplante de médula ósea ha sido uno
de los fundamentos para emprender el estudio de la gene­
r
terapia. El número creciente de enfermedades que pueden
.a
ser tratadas de manera eficaz con el trasplante comentado
demuestra la eficacia terapéutica de contar con una médu­
m
la "corregida". Por ejemplo, es posible curar mediante tras­
plante de médula ósea, obtenida de un donante normal, la
.co
talasemia j3 intensa (defecto hereditario en la biosíntesis
de hemoglobina). La geneterapia equivalente consistiría
corregir la propia médula del enfermo y no sustituirla por
s
una médula normal "exógena". La médula ósea puede ser
extraída y reimplantada fácilmente, por lo cual constituye
un elemento ideal para estrategias de geneterapia ex vivo.
La meta definitiva sería poder transferir genes en células
hematopoyéticas precursoras y permitir que éstas recons­
tituyan la médula ósea con la expresión selectiva del gen
transferido en una línea de células hematopoyéticas espe­
cíficas.
Trastornos de inmunodeficiencia. La geneterapia po­
dría ser un tratamiento útil en diversas enfermedades por
inmunodeficiencia. Como señalamos, el primer cuadro tra­
tado por este método fue una forma de inmunodeficiencia
combinada grave (SCID), causada por deficiencia de la
enzima adenosindesaminasa (ADA). En niños con dicho
trastorno, la falta de ADA hace que se acumule el trifosfa­
to de desoxiadenosina, producto tóxico para los linfocitos;
surgen así infecciones mortales recurrentes, por las res­
puestas inmunitarias deficientes mediadas por células y de
tipo humoral. Las medidas terapéuticas actuales incluyen
trasplante de médula ósea obtenida de un hermano HLA­
compatible. La reposición de ADA por vía endovenosa,
aunque es un método menos eficaz, se ha utilizado en ca­
sos en que no se cuenta con un donador idóneo de médula
roja. El primer ensayo clínico de geneterapia en la defi­
ciencia de ADA produjo mejoría en el enfermo, pero no se
ha logrado cura permanente del trastorno. Los primeros
pacientes fueron tratados por transferencia génica repeti­
da en linfocitos de sangre periférica que habían sido aisla­
dos por aféresis. Un método preferible sería insertar el gen
de ADA en células hematopoyéticas precursoras pluripo­
tenciales que así reconstituirían el sistema inmunitario con
un repertorio completo de células que lo integran. Los
métodos en cuestión están en fase de estudio. Se ha de­
mostrado en fecha reciente que es posible lograr la correc-
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\66 Sccciún I Pril1cipios gel!{-'I·(lk.�
ción a largo plazo de la deficiencia de ADA (aunque en
nivel bajo) en un modelo de mono rhesus (Van Beusecllem
y col., 1992; Bodine y col., 1993).
Otro cuadro hereditario es la deficiencia de la adheren­
cia de leucocitos (LAD), que es producto de defectos en la
función de tales células. Las personas con este trastorno
no tienen proteínas de superficie celular que medien las
interacciones intercelulares necesarias para la función in­
munitaria. Krauss y colaboradores ( 1 9 9 1 ) crearon una es­
trategia de geneterapia mediada por retrovirus para tratar
el trastorno comentado.
Enfermedades de depósito lisosómico. Las enfenneda­
des de este tipo son consecuencia de la acumulación de
material celular dentro del lisosoma que no es posible de­
gradar, o de material degradado que no puede ser procesa­
do hacia etapas siguientes. Más de 50 trastornos de este
tipo se han identificado en seres humanos y animales. En
estos cuadros, la falta de una enzima lisosómica particular
que coadyuva a la degradación de glucolípidos y acido­
lípidos hace que aumente el tamaño y el número de lisoso­
mas y que, como consecuencia, se perturbe la función ce­
lular. La enfennedad de Gaucher, que se hereda por un
mecanismo recesivo, es un caso típico de enfennedades
i co
de depósito en muchos aspectos. El lípido glucosi1ceramida
ed
se acumula en los macrófagos de sujetos afectados, por­
que tienen glucocerebrosidasa en cantidad deficiente; ello
m
ocasiona hepatomegalia y esplenomegalia, lesiones osteo­
líticas y disfunción variable del sistema nervioso central.
es
Se han identificado algunos defectos genéticos y se ad­
vierte variación significativa en la expresión o aspecto fe­
notípico de la enfennedad dentro de un genotipo particu­
nt
lar (Neufeld y col., 1991).
u
La observación de que es posible la "corrección cruzada" de
ap
fibroblastos cultivados de un sujeto afectado por medio de
cocultivo con células normales que secretan la enzima, dio lu­
gar a la creación de la terapia de reposición. La administración
w.
intravenosa de la enzima en deficiencia no es totalmente eficaz
en los enfermos, por lo cual la reposición ha demostrado que las
ww
células con deficiencia de la enzima pueden captar del exterior
esta sustancia (exógena). También, tal vez el trasplante de cé­
lulas normales de médula ósea al sujeto afectado produzca
mejoría clínica en algunos casos de enfermedad de depósito li­
sosómico. Las células hematopoyéticas trasplantadas pueden in­
troducir la enzima normal en los tejidos afectados. Las células
capaces de elaborar la enzima normal transfieren la enzima se­
cretada a una célula receptora por medio de endocitosis media­
da por receptores, o por transferencia mediada por contacto di­
recto. Esta capacidad de transferencia intercelular de enzimas
lisosómicas a través de endocitosis mediada por receptores se
ha demostrado en diversos modelos animales que incluyen el
modelo murino de deficiencia de P-glucuronidasa (Bou-Gharios
y col., 1993) y un modelo felino de a-manosidosis (Walkley y
coL, 1994). La médula ósea trasplantada pudiera tener utilidad
terapéutica en algunas circunstancias, pero su acción provecho­
sa disminuye por la escasa disponibilidad de donadores idóneos,
y por los peligros de inmunosupresión que conlleva el trasplanté
de médula alógena o exógena. Los métodos de transferencia
génica que pudieran superar estas deficiencias están en fase de
estudio. Por ingenieria genética en la médula del enfermo, para
que exprese la enzima deseada, los leucocitos propios podrían
"hacer llegar" o introducir la enzima normal. En una estrategia
terapéutica propuesta se obtendría médula ósea del enfermo y se
le insertaría en cultivo in vitro el gen "corregido". La reintro�
ducción de las células medulares manipuladas pennitiría la re­
posición de la enzima por largo tiempo, sin necesidad de usar
agentes inmunosupresores. Algunos investigadores han logrado
la transferencia génica mediada por retrovirus en células de
médula ósea de animales y seres humanos, además de demos­
trar la producción duradera de la enzima deseada.
r
.a
Genes de resistencia a fármacos en el tratamiento de
neoplasias. Los mecanismos por los que las células can­
m
cerosas pueden sobrevivir y superar los efectos citotóxi­
cos de los quimioterápicos se han descrito en relación con
.co
varios agentes de esta índole. Los mecanismos en cuestión
incluyen la expresión de genes que pueden inactivar o eli­
minar el fármaco tóxico (cap. 5 1). Los genes limitan la
s
eficacia de innumerables regímenes quimioterápicos, pero
tal vez puedan reutilizarse para que muestren el efecto
contrario, es decir, proteger a los tejidos nonnales de los
efectos tóxicos de los quimioterápicos. En particular un
gen ha recibido enonne atención en este sentido, que es el
gen de resistencia a múltiples fármacos (MDR- l), que codi­
fica la proteína transportadora de múltiples medicamentos
(llamada también glucoproteína P); esta proteína trans­
membrana puede evadir por "bombeo" muy diversos agen­
tes quimioterápicos (como adriamicina, alcaloides de vinca,
epipodofilotoxinas y taxol) y otros productos medicamen­
tosos, de las células nonnales, y así protegerlas de los efec­
tos tóxicos que poseen (Gottesman y col., 1 994). Muchos
cánceres muestran una sensibilidad a los quimioterápicos
que depende de sus dosis, de modo que dosis mayores de
estas sustancias pueden ocasionar mayor regresión tumo­
ral y mejorar la supervivencia (cap. 51); esta situación es
ilustrada adecuadamente por los cánceres testiculares, que
tienen grandes probabilidades de ser curados si se les trata
en fonna intensiva. La toxicidad para los tejidos nonna­
les, en particular la médula ósea, limita el empleo de dosis
mayores de quimioterápicos en muchas neoplasias. Para
resolver este problema se ha utilizado el trasplante de mé­
dula autóloga a fin de evitar que este tejido reciba los efec­
tos tóxicos de dosis altas de quimioterápicos. En algunas
neoplasias (como los cánceres de glándula mamaria y tes­
tículo), la recaída después de la terapia corriente puede
tratarse por la obtención de médula ósea normal no afecta­
da antes de administrar grandes dosis de quimioterápicos.
La médula autóloga almacenada podría reintroducirse al
paciente, a fin de evitar en él la inactivación de la médula
roja inducida por el tratamiento. La quimioterapia en altas
dosis junto con el trasplante de médula autóloga es el pro­
tocolo corriente que se usa contra el cáncer testicular reci-
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divante. Para aprovechar el concepto actual se ha propuesto
una estrategia de geneterapia en la que se uti lizaría el gen
de MDR-l para que la médula ósea se vuelva resistente a
los efectos tóxicos de los quimioterápicos (Gottesman y
col., 1 994).
La transferencia génica en células hematopoyéticas pre­
cursoras ocasiona la expresión transgénica sólo en un por­
centaje pequeño de las células comentadas, pero podrían
utilizarse ciclos sucesivos de quimioterápicos para "refor­
zar" la acción de células de médula transducidas; este
método pudiera utilizarse en cánceres que muestran una
respuesta extraordinaria a dosis de quimioterápicos, y en
los que la mielosupresión consbtuye lamanifestación tóxica
que limita la dosis.
Geneterapia en enferm'edades infecciosas
El hecho de que sea imposible tratar en fonna eficaz in­
numerables tipos de cuadros graves causados por mi­
croorganismos patógenos, con el uso de los antibióticos
corrientes, en particular el causado por el virus de inmu­
nodeficiencia humana y la disponibilidad de blancos mo­
i co
leculares peculiares en dichos patógenos ha alentado la
ed
exploración de la geneterapia contra enfennedades infec­
ciosas.
m
SIDA. Nabel y colaboradores ( 1 994) y Malim y colabo­
es
radores ( 1 992) han utilizado una proteína mutante negati­
va dominante al planear una estrategia de transferencia
nt
génica para tratar el síndrome de inmunodeficiencia ad­
quirida. La proteína rev, producida por el VIH, es una pro­
u
teína reguladora necesaria para la réplica de la partícula.
ap
Se liga a un motivo (motíf) del RNA viral específico (ele­
mento de respuesta rev, RRE) y estimula la síntesis de
nuevas proteínas por la partícula. Los estudios en mo­
w.
delos experimentales indican que al introducir un gen rey
mutante la célula infectada por VIH produce una proteí­
ww
na rev alterada; ha recibido el nombre de Rev M 1 O Y es
capaz de ligarse al mismo motivo que la rev normal, pero
no es útil para estimular la síntesis de nuevas proteínas
virales. En consecuencia, Rev M 1 O inhibe de manera com­
petitiva la actividad de la proteína rev normal y, al final,
atenúa la répl ica del virus de la inmunodefkiencia hu­
mana.
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Capitulo 5 Gcneterapia 107
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utilizar la transferencia génica para estimular la síntesis de
un anticuerpo con especificidad predeterminada; con él se
podría eliminar la necesidad de depender de una respuesta
inmunitaria variable o impredecible a una vacuna (en par­
ticular en sujetos inmunodeficientes), y pudiera utilizarse
para dirigir la síntesis del anticuerpo contra un sitio especí­
fico. En fecha reciente, Chen y colaboradores ( 1 994b) des­
cribieron un anticuerpo monocatenario (cordón único) con
especificidad por la proteína gp 120 del virus de h inmuno­
deficiencia humana que pudiera ser introducido por trans­
ferencia génica; demostraron que los linfocitos T CD4+
r
humanos pueden ser transducidos para que expresen dicho
.a
anticuerpo en el interior de la celula, y que se pudo inhibir
de este modo la formación del sincio citopático y la pro­
m
ducción de VIH- l , aunque no se le pudo elirn!nar.
.co
PERSPECTIVAS
s
La geneterapia en seres humanos, aunque está todavía en
sus albores, brinda la posibilidad de lograr progresos im­
portantes en la prevención y el tratamiento de innumera­
bles enfermedades. Aportaría un nuevo paradigma para el
tratamiento de trastornos que surgen por genes faltantes o
defectuosos, sean de tipo hereditario o adquirido. Es más,
esta tecnología posiblemente también culmine en el trata­
miento de enfermedades "no genéticas" en que pudiera
utilizarse con beneficio terapéutico la síntesis de una pro­
teína histoespecífica. La identificación de nuevos genes
relacionados con enfermedades específicas ampliará el
número de aplicaciones. Sin embargo, en la actualidad, la
aplicación clínica de la geneterapia está más limitada por
el pequeño número de métodos idóneos de transferencia
génica, que por la identificación de blancos idóneos para
la modificación genética. Sin embargo, un número crecien­
te de investigadores se han ocupado de estos problemas, y
seguran\ente surgirán reactivos mejores. Además, los ma­
yores conocimientos de los procesos fisiopatológicos per­
mitirán el diseño de intervenciones fisiológicamente apro­
piadas.
Esperamos que la colaboración más amplia entre médi­
cos, biólogos moleculares y biólogos celulares culmine en
la creación de métodos altamente integradús de esta nue­
va forma de tratamiento.
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