Aislamiento, Identificación y Cuantificación de

Carbohidratos
Aislamiento de lactosa, identificación de azúcares en base
a su carácter reductor y concentración de azúcar en una
muestra-espectrofotometría.

Descripción breve
Obtención del disacárido lactosa que se encuentra en productos lácteos como la leche
de vaca y su posterior identificación por medio de reacciones que permiten la
clasificación de azúcares reductores o no reductores (se trabaja con más azúcares).
Finalmente, con ayuda del espectrofotómetro se lee la absorbancia generada por los
azúcares con determinadas concentraciones.

Lab. Estructura de Biomoléculas y Cinética Enzimática

Profesor: Luis Felipe Padilla Vaca
Por: Fonseca Yepez Sofia, Rodríguez Álvarez J. Paola y Villavicencio Bosch Jessica
Introducción
Los hidratos de carbono, glúcidos o sacáridos son moléculas biológicas simples en
cuanto a su composición química, sin embargo, desempeñan funciones vitales
fundamentales. La denominación hidratos de carbono se debe a que la mayoría de
ellos responde a la fórmula estequiométrica CH2On, si bien algunos pueden estar
modificados conteniendo otros grupos como fosfato, sulfato o amino.

Las unidades monoméricas de los hidratos de carbono son los monosacáridos; la

unión de dos moléculas por medio de un enlace glucosídico forma los disacáridos.
Cuando se unen pocas unidades monosacáridas se denominan oligosacáridos y
polisacáridos cuando se unen muchos monómeros.

Los hidratos de carbono desempeñan funciones muy variadas en los seres vivos y
juegan un papel central en el ciclo energético de la biosfera, también participan en
la formación de estructuras que protegen las células, como la celulosa de las
células vegetales, los polisacáridos de las paredes bacterianas y los
exoesqueletos de los antrópodos. Al unirse con las proteínas o lípidos de la
superficie celular desempeñan la comunicación celular.

La principal característica de los monosacáridos es que responden a la fórmula

(CH2O)n, encontrándose n en un rango de 3 a 7. Químicamente son
polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas. Su clasificación se basa atendiendo al
grupo carbonilo (C=O), es decir, si este grupo es un aldehído (aldosas) o una
cetona (cetosas), así como al número de átomos de carbonos.

Una característica fundamental de los monosacáridos es que presentan

estereoisomería al ser moléculas quirales, cada centro quiral tendrá dos posibles
configuraciones, denominadas D o L. En solución acuosa adoptan una
configuración ciclada que presenta un nuevo carbono asimétrico denominado
anomérico. Adopta dicha configuración ciclada cuando uno de sus grupos hidroxilo
reacciona con el grupo carbonilo, sea aldehído o cetona, y forman un enlace
denominado hemiacetal o hemicetal, respectivamente. Los azúcares de 6 o más
carbonos adoptan la forma de un anillo de seis miembros y se conocen como
piranosas. Las cetonas de 6 carbonos y las aldosas de 5 adoptan la forma de un
anillo de cinco miembros denominándose furanosas.

Si el OH está en el lado opuesto del anillo del grupo CH2OH que designa la
configuración D o L (C-5 en hexosas) se denomina anómero α y si están del
mismo lado del plano se denomina anómero β.
La unión de dos monosacáridos mediante el enlace O-Glucosídico producirá una
gran variedad de disacáridos, dependiendo de los monómeros que participen en el
enlace y los grupos que reaccionen en el mismo. Por ejemplo, la unión de dos
moléculas de D-glucosa mediante enlaces ∝ (1 → 4) produce el disacárido
maltosa, pero si la unión es de tipo 𝛽(1 → 4)se produce la celobiosa. También son
importantes los disacáridos formados por unidades monosacáridas diferentes,
como lo son la lactosa y la sacarosa. La lactosa está formada por uniones 𝛽(1 →
4) entre galactosa y glucosa, aportando la galactosa el carbono anomérico y
quedando libre el carbono anomérico de la glucosa, es, por tanto, un azúcar
reductor, como la maltosa y la celobiosa. En todos estos casos el enlace que se
ha formado es O-glucosídico monocarbonílico.

El disacárido más abundante en la naturaleza es la sacarosa, formada por la unión

entre la glucosa y la fructosa mediante el enlace (𝛼1 → 𝛽2); es decir, ambos
azúcares aportan el enlace de los carbonos anoméricos, formando un enlace
dicarbonílico, y quedando en consecuencia el disacárido sin poder reductor, o
azúcar no reductor.
Una de las reacciones más comunes para identificar la presencia del poder
reductor en los carbohidratos es la Reacción de Benedict. Esta prueba se basa en
la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu+2 en un medio alcalino a Cu+. Este
Cu+ se oxida y se precipita en forma de Cu 2O, lo que proporciona la coloración
positiva de la reacción. La coloración producida va desde verde, amarillo,
anaranjado o rojizo, dependiendo de la concentración de óxido de cobre y esta a
su vez de la cantidad de cobre reducido.

Además uno de los métodos con mejor resultados en la determinación de los

azúcares con carácter reductor, es el Método de Miller (DNS), su principal ventaja
radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un método
espectrofotométrico; es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido
dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra,
seguido de la determinación espectrofotométrica a 540nm de los azúcares
reductores.

Objetivos:
 Obtener carbohidrato de origen natural (lactosa) atendiendo a sus
Azúcares Acción reductora propiedades
Glucosa fisicoquímicas, mediante
técnicas sencillas de
laboratorio.
 Comprobar las
propiedades químicas
más comunes de los
azúcares tales como
solubilidad y poder
reductor.
 Determinar la concentración de azúcar en la muestra de carbohidratos
obtenida previamente por espectrofotometría mediante el método del ácido
dinitrosalicílico.

Resultados:
 EL porcentaje de lactosa obtenido es de 43.56% con algunas impurezas
presentes.
Fructosa  Reacción de
Lactosa Benedict -Identificación de
Sacarosa azúcares reductores-
Almidón
Miel
Lactosa casera (aislada en el lab.)

 Hidrólisis -Identificación de azúcares no reductores-

Azucares Acción
reductora
Sacarosa
Almidón

 Absorbancia -Solución patrón de glucosa (1mg/ml) y reactivo DNS al 1%, -

Glucosa en Reactivo DNS a 200 µg

0.12

y = 0.0005x - 0.0021
0.1

0.08

0.06
Señal

0.04

0.02

0
0 50 100 150 200 250
-0.02
Glucosa (µg)
  Concentración de glucosa presente en la solución problema de azúcar al
1%

Solución problema de Agua (µL) Azúcar(µg)

azúcar al 1% (µL)
5 195 93.8
30 170 357.8
200 0 377.8

Discusión:
Dentro del aislamiento de lactosa contenida en la leche de polvo, en primer paso se fue
aprovechando propiedades fisicoquímicas de los carbohidratos como es la solubilidad en agua,
posteriormente se hizo la separación de las proteínas con ácido acético al 10%, de esta manera la
estructura de la caseína se desnaturaliza (alcanza el punto isoeléctrico del caseinato de calcio pI=
4.6) y pierden su estructura tridimensional, quedando la cadena polipeptídica reducida a un
polímero.Como en toda proteína, al alcanzarse el punto isoeléctrico existe una igualdad de
cargas,convirtiéndose en una molécula neutra y llegando a ser insoluble en disolventes polares,
induciendo la precipitación. Se debe tener cuidado con la concentración y la cantidad de ácido de
otro modo un exceso llega a hidrolizar parte de la lactosa.

De igual manera en al aglomerado apolar van absorbidas moléculas de grasa. En la mezcla ácida
restante, también conocida como suero de leche, quedan disueltas algunas trazas de proteínas y el
objetivo principal que es la lactosa.

Al suero restante se le añade CaCO3 para la precipitación casi completa de las albúminas
(proteínas del suero lactoalbumina y lactoglobulina). Las albuminas son proteínas globulares que
son desnaturalizadas y coaguladas por calentamiento. En seguida de la filtración al vacío y la
eliminación de los residuos, se purifica la lactosa por medio del método de cristalización.

Una vez obtenida la lactosa se sometió a la prueba de azúcar reductor, con una reacción de
Benedict, si da una reacción positiva quiere decir que en la estructura del sacárido se encuentra un
grupo aldehído (CHO) en su carbono anomérico, de la misma forma se sometieron a reaccionar la
glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidón, miel y lactosa, de esta manera se podría comparar con
la obtenida por nosotros.

El reactivo de Benedict contiene sales cúpricas que le dan un color azul al reactivo. En medio
alcalino el ion cúprico Cu+2 se transforma en hidróxido cúprico y éste en presencia de un azúcar
reductor se transforma en hidróxido cuproso que, a su vez, por acción del calor se transforma en
óxido cuproso, el cual es insoluble en agua y produce un precipitado de color rojo y amarillento a
bajas concentraciones.
La glucosa es un azúcar reductor, puesto que las formas cíclicas de este azúcar están en equilibrio
con la correspondiente forma lineal aldehídica, un reactivo reacciona con el azúcar eliminando del
equilibrio la forma abierta, la glucosa se oxidó, como se ve en la reacción de arriba, dando lugar a
la reducción del sulfato de cobre (II), de color azul, a óxido de cobre (I) de color rojo- anaranjado.

La fructosa es una cetosa que con ayuda de un medio alcalino caliente se tautomeriza a glucosa. La
tautomería por definición es un equilibrio entre dos isómeros que se diferencian en la posición de
un grupo funcional; la tautomeríamás conocida es la cetoenólica, donde el isómeroceto es el
mayoritario con respecto al enól, mediante una catálisisbásica uno desplaza el equilibrio a la forma
enol.

Obteniendo su isómero glucosa puede reaccionar al reactivo de Benedict porque su aldehído en su

carbono anomérico ya se encuentra libre y en las condiciones de reaccionar
AL formar un enlace

La sacarosa en un principio dio una reacción de Benedict negativa, esto debido a que es un
disacárido con un enlace que no posee carbonos anoméricos libres por lo que carece de poder
reductor. Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza, es decir
incorpora una molécula de agua y se descompone en los monosacáridos que la forman, glucosa y
fructosa que si son reductores. La prueba puede o podría haberse verificado con la hidrólisis que
se realiza con el reactivo de Fheling y si el resultado es positivo aparecería un precipitado rojo. Si el
resultado es negativo, la hidrólisis no se ha realizado correctamente y si en el resultado final
aparece una coloración verde se debe a una hidrólisis parcial de la sacarosa
Se llevó a cabo un método para la determinación de la concentración de azúcar en la muestra de
carbohidratos, el cual se fundamenta en la reacción de los grupos reductores de los azúcares con
el reactivo oxidante (ácido dinitrosalicílico--- DNS). Éste método nos permitió determinar la
presencia de grupos carbónicos libres (C=O) de los azúcares reductores. El procedimiento se basa
en una reacción redox, la cual es una reacción colorimétrica debido a que el ácido 3,5
dinitrosalicílico nos proporciona un color amarillo, mientras que la aparición de ácido 3-amina, 5-
nitrosalicílico provoca un viraje a pardo obscuro, cuya intensidad se refleja proporcional a la
cantidad de azúcares reductores.

Según el método Miller, los azúcares reductores pueden reducir al ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
bajo determinadas condiciones. Cuando el ácido 3,5-dinitrosalicílico es reducido en presencia de
calor, por los azúcares reductores que entran en contacto con él, se desarrolla un cambio de color
parecido al café (con variaciones de amarillo hasta café). El cambio de coloración puede entonces
determinarse por lecturas de densidad óptica, leídas por espectrofotometría a una determinada
longitud de onda. La concentración de los azúcares reductores totales liberados en la muestra se
determina haciendo una interpolación en la curva patrón del azúcar utilizado, graficando la
absorbancia en función de la concentración.

La concentración de azúcares totales se determinó a través de una curva de calibración de la

absorbancia en función de la concentración para la cual se prepararon soluciones de 5-200 µL
utilizando glucosa como estándar. Como blanco para las lecturas se utilizó agua destilada
aplicándole el mismo tratamiento. Para la aplicación del método DNS (Método de Miller), se
prepararon una serie de mezclas en tubos en los que se les añadió por igual el reactivo DNS
(200µL) y posteriormente se analizaron en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 575
nm.

Conclusión:

Parte A.

La leche es un complemento alimenticio muy importante por su alto contenido de aminoácidos

esenciales, vitaminas, minerales, carbohidratos y grasas. La caseína es uno de los componentes
mayoritarios en la leche, junto con las grasas, el agua y la lactosa. La composición de la leche varía
de acuerdo al mamífero que la sintetice. La leche puede separarse en sus componentes principales
de una manera muy sencilla, al adicionarse HOAc, en conjunto con otros reactivos orgánicos
comunes. Una mezcla de varios componentes puede ser separada por medios simples tan sólo
controlando el pH y luego la polaridad de los disolventes utilizados, de manera que ciertos
compuestos precipiten y otros no, obteniendo así una mezcla fácilmente separable por medio de
filtración, decantación, centrifugación o una combinación de estas.
Parte B.

Gracias a las propiedades químicas del los azúcares, en especial del poder reductor, se pudo
comprobar la presencia de carbonos anoméricos (azúcar reductor) en distintos azúcares, en los
cuales al presenciar que la sacarosa arrojaba resultados negativos en cuanto a la prueba de
Benedict (indicador de que es un disacárido no reductor) se hidrolizó la sacarosa
descomponiéndola en sus dos azucares que la conforman, glucosa y fructosa, los cuales son
azúcares reductores.

Parte C.

Se realizó un procedimiento para la determinación de azúcares reductores totales por el método

del DNS. Este procedimiento del DNS se llevó a cabo con ayuda de calor, lo que posteriormente
reflejó un alto coeficiente de correlación de los azúcares reductores totales, esto se debió a que el
procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores
presentes. Además se realizó una curva de calibración patrón que se elaboró con diferentes
concentraciones de glucosa, en la que se pudo observar que la absorbancia de ésta es
directamente proporcional a la concentración de azúcares presentes en las soluciones. Por su
parte en la curva se reflejó una desviación donde probablemente se deba a algunos
contaminantes del ambiente.

El método del ácido dinitrosalicílico es realmente eficiente en cuanto a la determinación de la

concentración de azúcar en la muestra de carbohidratos obtenida previamente por
espectrofotometría y todo gracias a las propiedades químicas de los azúcares como el poder
reductor que es un indicador de la presencia de grupos carbonilos libres y con el cual podemos
rectificar la cuantificación del tipo de azúcar que se está tratando.

Referencias:

Dosal, M., & Villanueva, M. (2008). CURVAS DE CALIBRACIÓN EN LOS MÉTODOS

ANALÍTICOS.Consultado el 2 de agosto 2018 en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CURVASDECALIBRACION_23498.pdf

Carbohidratos. (2015). Este artículo es un derivado modificado de “Carbohydrates

(Carbohidratos)”, de OpenStaxCollege, Biología.Consultado el 26 de agosto 2018 en:
https://es.khanacademy.org/science/biology/macromolecules/carbohydrates-and-
sugars/a/carbohydrates
El carbonato de calcio en los alimentos l Sección Industria Alimenticia. (2006). Consultado el 26 de
agosto 2018 en: https://www.quiminet.com/articulos/el-carbonato-de-calcio-en-los-alimentos-
8219.htm

Vallejo, M. (2013). Identificación de Carbohidratos a través de reactivos. Recuperado el 30 de

agosto 2018 en:
http://www.academia.edu/6347596/Identificación_de_Carbohidratos_a_través_de_reactivos

Feduchi E., Blasco I., Romero C.S. & Yáñez E. (2011). Bioquímica conceptos esenciales; Sección 1
Capítulo 2, págs. 23-40 Delegación Miguel Hidalgo, 11570, México D.F., México: Editorial Médica
Panamericana.

Murray, R., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., Rodwell, V., & Weil, P. (2012). Harper: Bioquímica
Ilustrada (29edición., p. Capítulo 14: Carbohidratos importantes desde el punto de vista fisiológico,
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Bohinski, R., & Elizondo Mata, R. (1998). Bioquímica (5th ed.,Capítulo diez: Carbohidratos. p. 382-
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