2º Congreso Nacional de Química Médica Valadez-Vega y col.

EFECTO ANTITUMORAL DE LECTINAS DE FRIJOL

SOBRE CÉLULAS CANCEROSAS SW480
Valadez Vega María del Carmen, Riverón Negrete Leticia, Abdullaev Fikrat, Alvarez Manilla
Dubón Gerardo, García Carrancá Alejandro. Correo electrónico: m.valadezvega@lycos.com

RESUMEN

Las lectinas son proteínas que se unen a carbohidratos con alta especificidad;
en las últimas décadas han tomado gran importancia en diversas áreas de la ciencia,
entre ellas en el área de la clínica, donde se les ha empleado de manera satisfactoria
para la tipificación de grupo sanguíneo, como biomarcador para algunos tipos de
cáncer y como una herramienta en la terapia de ciertas neoplasias. El objetivo del
presente trabajo es el estudiar el efecto quimioprotector de lectinas sobre células de
cáncer de colón. Se empelaron las líneas celulares cancerosas SW480, las cuales
fueron expuestas ante lectinas puras de frijol tepary. Se evaluó el efecto de las lectinas
sobre la proliferación celular empleando la técnica de MTT y [H3] timidita; así mismo se
estudió el efecto de las lectinas sobre la formación de colonias. Los resultados
indicaron que la lectina tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferación de las células y
que dicha inhibición continua aún después de 48 h de que las células fueron
expuestas a la lectina; así mismo se observó un efecto inhibitorio de las lectinas sobre
la capacidad de formar colonias. Los resultados de este trabajo indican que las
lectinas de frijol tepary presentan un potencial para inhibir el desarrollo y proliferación
de células cancerosas SW480.

Palabras clave: lectina, cáncer, proliferación

INTRODUCCION

Las lectinas son proteínas que se caracterizan por su habilidad de unirse a

carbohidratos, son de origen no inmune y además con la capacidad de aglutinar
células, precipitar polisacáridos y glicoproteínas (Goldstein y col, 1980; Sharon y Lis,
1972). Las lectinas representan una clase heterogénea de proteínas o glicoproteínas,
las cuales poseen diferentes actividades biológicas tales como hemaglutinación,
transformación de linfocitos, además de presentar efectos tóxicos sobre células de
vertebrados (Vierbuchen, 1991).

La interacción con lectinas es ampliamente usada para demostrar la existencia

de receptores en la membrana celular y organelos celulares, hormonas, factores de
crecimiento, neurotransmisores y toxinas, los cuales frecuentemente también son
glicoconjugados (Eckhardt y col, 1982; Walker, 1989; Rindele y col, 1989).

Las lectinas presentan mayor afinidad por carbohidratos con estructuras más
complejas que aquellos con estructuras simples (monosacáridos y disacáridos). El
estudio de la interacción lectina–carbohidrato, así como elucidación de las estructuras
de los carbohidratos implicados en la interacción es de gran importancia, ya que tiene
aplicaciones en diversos campos de la ciencia (Sharon, 1975; Watkins, 1980; Lis y
Sharon, 1986; Sharon y Lis, 1989).

Algunos ejemplos relacionados con la aplicación de las lectinas son: La

caracterización de diversos grupos sanguíneos humanos; su uso como matriz para el
aislamiento, purificación y caracterización de glicoproteínas y glicopéptidos también se
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han empleado como sondas para detección de oligosacáridos específicos in situ

(Anesi y col, 1994; Matsubara y col, 1994; Sarker y col, 1994); en caracterizaciones
histológicas, histoquímicas e inmunológicas (Li y col, 1993); en la tipificación de
células y bacterias, en el fraccionamiento de linfocitos y células de médula ósea
(Sharon y Lis, 1990; Alvarez-Fernandez y col, 1990; Barral-Netto y col, 1992;
Nakanishi y col, 1993); También han sido empleadas para la estimulación de linfocitos
y para el análisis de cromosomas en citogenética humana (Sharon y Lis, 1989). Varias
lectinas se han utilizado para estudiar los cambios que ocurren en la superficie celular
durante los procesos fisiológicos y patológicos tales como la diferenciación celular y
como marcadores para el diagnóstico de cáncer (Shoham y col, 1970; Cummings y
Kornfeld, 1982; Lotan y col, 1991; Kim y Clifton, 1993; Endo, 1996; Rak y Miller, 1993;
Sarker y col, 1994; Mody y col, 1995).

MATERIALES Y MÉTODOS

Se empleó frijol tepary para la purificación de la lectina, la cual se realizó

mediante cromatografía de afinidad empleando una columna a base de mini leak–
fetuina, de acuerdo a lo reportado por González Flores (1990) con algunas
modificaciones.

Estudios de proliferación y de post-incubación celular. Para determinar el efecto

de las lectinas sobre la proliferación celular se realizaron ensayos en los cuales se
emplearon células de cáncer de colon (Sw480). Las células fueron sembradas en
medio de cultivo DMEM, en microplaca de 24 pozos a una población de 5.0 X104
células por pozo. Por otro lado, se sembraron células en microplaca de 96 pozos, a
una densidad de 5.0 X103 células/pozo. Las microplacas se dejaron en incubación por
24 h, la término de este tiempo el medio de cultivo se le agregó lectinas a la
concentración de 0, 10, 25, 50 y 100 µg/mL; una vez expuestas a la lectina las células
se dejaban en incubación por 24 h al término de los cuales se determinaba la
proliferación.

Las células sembradas en las microplacas de 24 pozos se utilizaron para

analizar la proliferación celular por incorporación de timidina tritiada, mientras que las
células cultivadas en microplaca de 96 pozos se utilizaron para analizar la proliferación
celular por metabolismo, empleando la técnica de azul de tetrazolium (MTT).

Determinación de proliferación celular mediante la técnica de timidina tritiada

([3H] timidina). Para la determinación de proliferación celular mediante la Técnica de
timidina tritiada ([3H] timidina), a las células previamente expuestas a la lectina se les
eliminó el medio y se agregó medio de cultivo conteniendo 3 µCi/mL de timidina tritiada
(Amersham, Pharmacia) y se dejó incubar por 30 min para permitir la incorporación de
la radiomarca. Posteriormente se eliminó el medio radiactivo y las células fueron
lavadas con PBS. Después se agregaron 500 µL de EDTA-SDS y se dejó en reposo
durante 20 min a temperatura ambiente para lisar las células. Una vez transcurrido
este tiempo se adicionaron 500 µL de ácido tricloro acético (TCA) frío al 10 % y la
mezcla se dejó reaccionar 50 min en un baño de hielo para la precipitación de lisados
celulares.

Por otro lado, un trozo de membrana de nitrocelulosa (BioRad) se mojó con

TCA frío y se colocó en un dispositivo de filtración para membranas, donde se realizó
la filtración de los lisados celulares, los cuales fueron lavados con TCA frío. Ya que se
lavaron las muestras, las membranas fueron secadas a temperatura ambiente hasta
eliminar toda la humedad, es tranfirieron a viales de centelleo a los cuales se les
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agregó líquido de centelleo (Beckman). Los viales son llevados al contador de

centelleo líquido (Beckman LS 6500) y la radiación de las muestras producidas por la
timidina tritiada es cuantificada en DPM, cuyo valor es directamente proporcional a la
proliferación celular.

Determinación de proliferación celular mediante la técnica de MTT. Se

determinó mediante la técnica de Sladowski (1993), la cual fue modificada de la
prueba inicialmente realizada por Mosman (1983), la cual se basa en la reducción de
la sal de tetrasolium, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2 y l)-2-5-difeniltetrazolium (MTT,
Sigma), a un colorante formazán insoluble formado por las enzimas mitocondriales en
las células viables.

Para la realización de los ensayos de viabilidad en las microplacas a cada pozo

con células previamente expuestas a la lectina, se le aplican 10 µL de MTT, se
dejaban reaccionar durante 3 h en incubación, para posteriormente eliminar el medio
con MTT. Posteriormente a cada pozo se aplicaban 100 µL de dimetil sulfóxido
(DMSO) concentrado y la microplaca se agitó durante 15 min. Una vez transcurrido
este tiempo se leía la absorbancia de cada pozo a una longitud de onda de 540 nm en
un contador ELISA para microplacas (Labsystem Multiskan MS, México).

Ensayo de formación de colonias. 2 X 105 células SW480 fueron sembradas en

caja petri con medio DMEM, después de 2 días se aplicaron diferentes
concentraciones de de lectina y se incubaron por 3 h, posteriormente las células
fueron tripsinizados, se colectaron 200 células para ser sembradas en cajas petri para
estimar la formación de colonias. Después de 10 días e incubación, las colonias
resultantes fueron enjuagadas con buffer de fosfatos salino, las células se fijan con
metanol, se tiñen con Giemsa y se determina el número de colonias que fueron
capaces de formarse.

RESULTADOS Y DISCUSION

Efecto de lectinas sobre la proliferación celular determinada mediante la técnica

de MTT. La Figura 1 muestra el gráfico correspondiente a los resultados del estudio de
proliferación celular, para cada una de las líneas celulares. Como se puede observar
existe una clara tendencia inhibitoria en la proliferación celular, lo cual se traduce en
una disminución de la población celular, dependiente de la concentración de lectina.

Efecto post-incubatorio con lectinas sobre la proliferación celular determinado

mediante la técnica de MTT. Una vez realizado el estudio de proliferación celular, otro
grupo de células fue empleado para estudiar el efecto post-incubatorio; en el cual las
células fueron expuestas por 24 h a cuatro concentraciones de lectina (10, 25, 50 y
100 µg/mL), después la lectina fue retirada del medio de cultivo y se continuó
incubando las células por 24 y 48 h (post-incubación) únicamente con medio de cultivo
completo. Seguido a la post-incubación, se determinó nuevamente la proliferación
celular empleando la técnica de MTT, para que de esta manera se estableciera la
capacidad de recuperación de las células o bien el efecto inhibitorio sostenido de las
lectinas sobre la proliferación celular.

En la Figura 2 se observa el efecto post-incubatorio para las células Sw480,

donde se puede observar una tendencia hacia la recuperación de las células a las 24 h
de post-incubación, viéndose aumentada la proliferación celular; por otro lado a 25
µg/mL de lectina la recuperación de las células es mayor ya que la proliferación celular
aumenta al incrementar el tiempo de post-incubación; mientras que a las
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concentraciones de 50 y 100 µg/mL la proliferación es mayor a las 24 h que a las 48 h,

lo cual indica una mayor recuperación de las células a ese tiempo de post-incubación.

Figura 1. Efecto de lectinas sobre la proliferación Figura 2. Efecto post-incubatorio de lectinas

celular sobre células SW480

120 70
% Proliferación

100 60 0H

% Inhibición
80 50
24 H
40
60 48 H
30
40
20
20 10
0 0
0 10 25 50 100 0 10 25 50 100

Concentración de Lectina (ug/mL) Concentración de Lectina (ug/mL)

En la Figura 3 se muestran los resultados en porcentaje de incorporación de

[3H] timidina para el ensayo de proliferación celular.

En el gráfico se puede ver la tendencia que presentaron las células a las

concentraciones probadas, observándose un claro efecto hacia inhibir la proliferación
celular al incrementar la concentración de lectina. Lo cual se ve reflejado en una
disminución en la [3H] timidita incorporada, lo cual indica una disminución en la
proliferación celular.

En la Figura 4 se muestran los gráficos de concentración de lectina vs

incorporación de [3H] timidina para las células empleadas en el estudio de post-
incubación. La línea celular presenta una tendencia hacia la disminución en la
incorporación de [3H] timidina al aumentar el tiempo de incubación y que este efecto
es similar en las tres concentraciones de lectina, lo cual demuestra un efecto inhibitorio
en la proliferación celular con respecto al tiempo, el cual es independiente de la
concentración de lectina.

Figura 3. Efecto de lectinas sobre la proiferación de células

malignas determinado por la técnica de timidina tritiada
Figura 4. Efecto post-incubatorio de las lectinas
sobre la proliferación celulr
120
% Incorporación

100 120
Incorporación (% )

80 100
60 80 0H

40 60 24 h
40 48 H
20
20
0 0
0 10 25 50 100 0 10 25 50 100
Cocnentración de lectina (ug/mL) Concentración de Lectina (ug/mL)

El estudio de formación de colonias, indicó que a medida que se incrementa la

concentración de lectinas se presenta una disminución en la capacidad de las células
para inhibir la formación de colonias, lo cual nos indica que las lectinas estas
produciendo un efecto citotóxico sobre las células y que dicho efecto es constante, de
tal manera que no le es posible a las células recuperarse.

Los estudios de proliferación celular realizados por la técnica de MTT y por

incorporación de timidina tritiada mostraron que la lectina de tepary inhibe
considerablemente la proliferación de las células. Los estudios de post-incubación
mostraron diferencia en la proliferación celular dependiente de la técnica empleada
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para su determinación, ya que para la prueba de MTT las células mostraron

recuperación después de que la lectina fue retirara del medio de cultivo; mientras que
cuando se utilizó la técnica de timidita tritiada no se observó recuperación de las
células después de que la lectina fue retirada del medio de cultivo, lo que implica que
el efecto de la lectina continúa ejerciendo su acción tóxica sobre las células después
de 48 h de la post incubación.

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