Inmunología Clínica - Citometría de Flujo 1

Citometría de flujo.
Técnica que se utiliza para “medir” células de acuerdo a su tamaño y su composición interna, es decir, su complejidad
interna; Linfocitos presentan baja complejidad en su citoplasma, v/s otras células que presentan gránulos en su
citoplasma, como los eosinófilos. A esto le llamaremos “granularidad” o complejidad interna, encontrándose en
cualquier célula, sin marcar nada. Por eso decimos que son parámetros intrínsecos a la célula. Por lo tanto, los 2
parámetros intrínsecos que podemos medir en un citómetro de flujo son:

→ Tamaño
→ Granularidad

Las células tienen que estar en suspensión líquida (en un fluido) y son interrogadas una por una por una luz, que
corresponde a una luz láser si es un citómetro de flujo. En el caso de un contador hematológico no necesariamente es un
láser. Pero ese principio en que pasa la célula y obstruye el haz de luz o láser y que nosotros seamos capaces de
identificar la ausencia de la luz, cuando va pasando en un “detector”, que nos va a identificar una determinada longitud
de onda, esto es lo que se conoce como Principio Coulter y que fue la base de la medición de muchos contadores
hematológicos.

Célula
LÁSER :D
DETECTOR

Don Wallace Coulter fue quien descubrió este principio, creó una empresa, se hizo multimillonario, empresa de
contadores hematológicos, de citómetros de flujo.

La Citometría de flujo como tal surgió por el año 67 en la Universidad de Stanford, EUA, producto de la investigación en
fotónica y en electrónica. Y se logró crear un aparato que se llamó FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting = separador
celular activado por fluorescencia). Este aparato permitía evaluar características intrínsecas y extrínsecas en las células, y
fue la base de lo que hoy conocemos como Citometro de flujo. Tanto así que una empresa tomo este nombre, FACS, lo
patentó (la empresa de Becton Dickinson) y empezó a sacar a partir del año 71 el primer citómetro de flujo comercial, el
FACS-1. (Anexado con un computador grande)

A medida que se fue perfeccionando la técnica y fue evolucionando la informática, obviamente los componentes se han
ido reduciendo desde el punto de vista informático. Aparecieron una serie de citómetros más nuevos; el FACS-Sort,
entre otros FACS. Obviamente aparecieron equipos de la competencia, Becton Dickinson se manejaba en formato
Macintosh (lo que ahora conocemos como plataforma Apple) Holter en formato IBM (lo que hoy conocemos como
Windows) y actualmente vienen en plataforma Windows.

¿Por qué primero se utilizó la plataforma Macintosh? Porque requería una gran capacidad de procesamiento de datos,
desde el punto de vista de análisis visual.

Actualmente los citómetros de flujo son ampliamente utilizados y son más asequibles. Los contadores hematológicos se
basan en Citometría de flujo. Son equipos caros, hoy en día puede andar entre los 17-18 millones de pesos.

Profe: Yo me titulé el año 92 y entré a trabajar inmediatamente a microbiología en el hospital clínico regional, hasta el
año 97. Me correspondió montar la unidad de micología. Dentro de eso, encontré unos artículos que hablaban de ciclo
celular en hongos y lo hacían por Citometría de flujo y nadie en el país sabia del tema en ese entonces. En eso, llegó un
médico, un gastroenterólogo que hizo su especialidad en Japón, presentó un trabajo acerca de cáncer gástrico y ciclo

Jorgito – TecMed 2017

2 Inmunología Clínica – Citometría de Flujo

celular, todo eso mediante Citometría de flujo. Después de su charla me acerqué a conversar con él. Cuento corto
comenzamos a trabajar juntos y en el transcurso de meses presentamos un proyecto para poder comprar un citómetro
de flujo y dedicarlo a investigación y a clínica. En 6 meses yo me estaba yendo del hospital regional al hospital del
trabajador (Hoy clínica del sur) donde compró el 4º o 5º citómetro del país y que era el más moderno del país. Estoy
hablando de enero de 1997, que en esa época hablamos de alrededor de 120 millones + IVA. (Lo que actualmente
corresponde a 600-700 millones de pesos, cercano al millón de dólares).

Gracias a eso pude estar presente en distintas áreas de la tecnología médica: en pabellón, en procedimientos quirúrgicos
para poder asegurar que la muestra que se requería era adecuada, o en una UCI apoyando la extracción de una médula,
etc. Pasando por paros cardiorrespiratorios, colapsos del paciente y muerte u.u’

Por lo tanto, lo que vamos a empezar a ver ahora lo vamos a enfocar al área de la inmunología ambulatoria. No nos
vamos a meter mucho con el paciente crítico, pero sí vamos a esbozar temas acerca de patologías graves como una
colitis ulcerosa, enfermedad de Crhon, infección VIH.

Ahora, qué es lo que vamos a evaluar en una célula.

Si por arte de magia yo preparé células en suspensión (después veremos cómo las obtuvimos) y esas células con que voy
a trabajar son leucocitos, los que voy a interrogar con el citómetro de flujo. Vamos a tener una especie de cámara de
lectura en que tendré células de distinto tamaño, en que van a pasar una por una y van a ser interrogadas por un rayo
láser, el que tiene una longitud de onda particular, monocromática y que no varía. Esta longitud de onda, por ejemplo,
puede ser de 488 nm y que corresponde a un láser de Argón (los láser son en función de gases nolbes), que al excitar
estas moléculas del gas se les hace emitir fotones a una determinada longitud de onda, en este caso, el láser de argón es
de 488 nm y es de un color azul.

Entonces, estas células que están en suspensión van a ser

interrogadas en forma INDIVIDUAL por ese rayo láser.
También podemos variar el flujo, aumentándolo para
aumentar la velocidad de análisis.

El que nosotros podamos ampliar o disminuir el rango de flujo depende del medio
en que estén insertas las células.
Profe: ¿Ustedes vieron buscando a nemo? Cuando se mete a la corriente de
Humboldt (Es la corriente australiana oriental ¬¬’), lo que pasa es que cuando
estaban llegando a ella, bastaba que avanzaran un poquitito y la corriente se los
llevara. Lo mismo ocurre acá. Si yo dibujo este flujo hídrico, el flujo de alta velocidad
está en el medio, por lo tanto puedo simular una barrera física, que es el mismo
líquido. Es el mismo liquido en todo el contenido, pero al medio estará a una presión Detector
mucho mayor con un flujo laminar (eso dijo, habrá que creerle .-. ) por lo que la
velocidad aumenta.

Por lo tanto, los componentes de un citómetro de flujo son:

 El componente óptico
 El sistema de fluidos (Siento el más importante)
 El sistema informático

Jorgito – TecMed 2017

 Inmunología Clínica - Citometría de Flujo 3

En el dibujo van pasando las células, las que van a ser incididas con la luz rayo láser a una longitud de onda de 488 nm. Si
yo tengo que la luz del láser se me desvía en menos de 10 grados, voy a necesitar algo para detectar esa luz del láser que
se desvía, un “Detector”, que también detectará la longitud de onda de 488 nm (pues solo se desvía la luz, no se
transforma). Y eso es lo que se conoce como la dispersión frontal de la luz, en inglés conocido como Forward Scatter o
FSC, coloquialmente dicho como Forward. Y es una estimación electrónica (NO real) del tamaño celular. Por lo tanto
cuando yo hablo de forward me estoy refiriendo a tamaño celular.

A medida que la célula va pasando por la luz del láser, la señal se va desviando. A medida que pasa la célula, la señal va
aumentando. Si yo hago un gráfico donde grafico en un Δtiempo (porque el paso de la célula va a demorar un tiempo)

por lo que tengo un Δ Intensidad de señal.

Δ
I
N En un principio voy a detecta poca señal y después cuando
T
E esta full, más señal. Es decir, va pasando la célula y se
N
S empieza a interponer en el camino del láser, por lo que
I
D empieza a aumentar la señal. La célula avanza un poco
A
d
más, me aumenta más la señal. Se forma un plató y a partir
de él empieza a salir la célula del ojo y se me transforma en
una curva de Gauss. Como yo tengo un delta de tiempo, si yo saco la integral de Δ tiempo en función de ΔIntensidad,
puedo tener la información de qué es lo que ocurre bajo la curva. Pero esto es para 1
célula. Imagínense que “Javiera” es una célula y tenemos puros clones de ella,
igualitas. Tendríamos siempre la misma información. Y si yo grafico el número de
células (javieras) v/s tamaño (FSC). Me van a saber en un punto el número de javieras
que tienen un determinado tamaño. Al lado, un cuanto número de javieras un
poquitito más grandes. Voy a terminar transformando todo eso en una curva, en
donde junto la información obtenida por una célula.

Entonces, Forward Scatter es tamaño. Los demás parámetros se aplican exactamente igual.

Ahora, tengo la misma historia

LUZ LÁSER

DETECTOR

Una célula con gránulos. El láser se encuentra con uno de estos gránulos y se me desvía en más de 10 grados, pero en
menos de 90. Obviamente si se me desvió en más de 10 grados, mi detector de forward no me lo va a detectar. Por lo
tanto tendré que tener otro detector, al que llamaremos el detector de Saint, porque esta dispersión lateral de la luz es
lo que vamos a conocer como Saint Scatter o SSC, por lo tanto, tendremos un detector de Saint que detectará los

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4 Inmunología Clínica – Citometría de Flujo

mismos 488 nm de longitud de onda de la luz láser. Saint Scatter es lo que vamos a conocer como granularidad o
complejidad interna.

Por lo tanto, estoy midiendo los dos parámetros intrínsecos a toda célula son tamaño y granularidad, es decir, Forward y
Saint. Esto es lo que va a detectar cualquier citómetro de flujo y no necesito
marcar nada con nada.
Células de acuerdo a su tamaño
Si yo tengo una suspensión de células leucocitarias, recordadas por tamaño en el (creciente):
recuadro, podemos ver que las células más pequeñas son los linfocitos. Por lo
1. Linfocitos
tanto, a medida que van pasando los linfocitos, todas las células juntas. Luego,
2. Monocitos
con todo el procesamiento, esta información se traduce en un “punto”. Otro
3. Neutrófilos
linfocito más grande, otro puntito. Tengo hartos puntitos que me transforman 4. Eosinófilos
esto en una curva. Las células más
pequeñas son los linfocitos. Las células Por razones prácticas nos
que son un poco más grandes, si bien olvidaremos de los basófilos, pues
cuando ustedes hagan frotis, los en sangre periférica son <1%

monocitos se ven grandes pero en

realidad no son tan grandes. Lo que pasa que por el artefacto mecánico del
frotis, el monocito queda “aplastado” y se ve mucho más grande. Pero en la
práctica lo encontraremos adyacente en la curva a los linfocitos, y como son
en menor cantidad, un poco más bajo. Células más grandes van a ser los
neutrófilos, por lo tanto los encontraré siguiente a los monocitos. Y los que son más grandes y están llenos de gránulos
también, son los eosinófilos y estos pueden ser tan grandes que me encontraré con la situación de que saldrán de la
escala.

Veamos qué pasa con la granularidad ahora.

Duda del compañero super estrella del profesor Juan luis: Profesor, tengo una duda. En el eje X ahí se mide el tamaño, y
al lado se ve el número de células. Por lo que yo sabía hay más cantidad de linfocitos que de neutrófilos en la sangre…
Profesor: No importa, no te fijes en la proporción, me interesa que se entienda. Después nos vamos a meter en los
valores de referencia. Buena acotación Benjamín. :v

Veamos qué pasa con la granularidad. Tenemos SSC v/s número de

células. Las células menos granulares son los linfocitos, nuevamente
la misma historia se me traduce en una curva. Un poquito más
granulares los monocitos. Más granulares los neutrofilos, pero
encontramos variación. Hay algunos más granulares pero con un
coeficiente de variación más pequeño.
El coeficiente de variación es cuánto varía la media en relación a la
desviación estándar en una curva normal. Cuento corto, en una
parte habrán células menos granulares y en el otro más granulares
(dentro de la misma curva de neutrofilos). Y los eosinófilos que son mucho más granulares quedan por arriba,
nuevamente se me salen de la escala. Esto lo estoy viendo a la forma de histograma, así se llaman estos datos.

Pero veamos cómo lo podemos mezclar en un solo gráfico, donde yo vea en el eje Y  SSC y en el eje X  FSC.

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¿Cuál va a ser la célula que tiene poco tamaño y poca granularidad? Los linfocitos. Como van pasando, se me forma una
especie de “nube” de puntos.

Un poquito más grandes y granulares, los monocitos. Más grandes los

neutrofilos, pero en cuando a granularidad son más dispersos, por lo
que me voy a encontrar con la situación de una “nube” más vertical. 5%
No me aumentan mucho en tamaño, pero si me varían en cuanto a
granularidad en el eje Y. Y los eosinófilos quedan fuera de escala
nuevamente.
10% 35%
Ahora, imagínense que a Griselda le sacamos sangre, le vamos a
analizar sus poblaciones linfocitarias (Linfocitos T, Linfocitos B, NKT) 50%
Marcamos la célula, la hacemos pasar por el tubo, una por una, y
registramos un número de 20.000 células. Esto se conoce como
“adquisición”. Pasada las 20.000 células, queda guardada la información como un archivo binario. Y ese archivo lo
analizo con un software. Por lo tanto, si yo pasé 20.000 células, voy a poner números al azar (Marcados en rojo).
¿Cuántas células tendría de linfocitos? 10.000, pues como es el 50% y yo pasé 20.000. Ahora, si yo quiero analizar las
células mononucleares, es decir, linfocitos y monocitos, que corresponden a un 60% de las células que pase por el
citómetro. Entonces ya puedo ir teniendo una aproximación.

Ahora es más, quiero ver cómo se distribuye el tamaño de mis linfocitos. Por lo
tanto me conviene hacer un gráfico tipo histograma, como los que vimos
anteriormente. FSC v/s número de células. Pero tengo un problema, se me
puede interferir si yo quiero ver el tamaño. Fíjense, se me superponen.
Entonces, aquí me conviene hacer lo siguiente. Pesco el mouse y dibujo una
región alrededor de la “nube” de linfocitos, en rojo, R1 o ventana de análisis. Pr
lo tanto, le digo al computador que me grafique el tamaño, pero solo de R1. Así
vere solo la curva de R1. Puedo dibujar R2, R3 alrededor de las nubes. Esto también se conoce como “GATE”, gate 1,
gate 2, gate 3. Tambien se combinar: si quiero R1 con R2, pero sin R3 y
empiezo a combinar teoría de conjuntos. (-.-‘) ¿Por qué? Porque aquí si
yo considero R1 con R2, pero sin R3, voy a ver esto.

Ahora si tengo pacientes que cursan con monocitosis (aumento de

monocitos), muchas veces los monocitos son pequeños, por lo tanto voy
a tener mi región de linfoticos y mis monocitos estarán medios
“aporreados” y se me van a confundir. Entonces, tengo que buscar la
forma de poder diferenciarlo y es aquí donde las estrategias de
“GATING” nos ayudan en combinar distintas regiones.

Resumiendo, parámetros intrínsecos son tamaño y granularidad.

¿Cómo podemos ver estas células? – En forma de histograma o por grafico de dos parámetros.

¿Podemos diferenciar células pequeñas de las que son más grandes? – Si

Ahora, ¿ustedes han visto en los libros de BioCel esas fotos de la célula con el citoesqueleto en verde?, que están
tomadas con microscopios de fluorescencia.

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6 Inmunología Clínica – Citometría de Flujo

¿Qué características tienen esas sustancias que les agregan, esa cosa que es verde? Esa molécula va a tener algo. A una
determinada longitud de onda va a tener un “espectro de excitación”

Algo la va a excitar, en este caso es la luz, fotones, que le hace

cambiar su longitud de onda en lo que se conoce como “espectro
de emisión”. Y esto que está en el espectro de emisión es lo que
nosotros vamos a ver. En el caso de esas fotos de microscopía, se
utiliza un fluorocromo en base a fluroceína y se ve en un color
verde.

Por lo tanto, cada fluorocromo tiene su espectro de excitación y su espectro de emisión. Ahora, desde el punto de vista
de Citometría de flujo nosotros también vamos a utilizar fluorocromos, pero estos tienen que tener un espectro de
excitación que sea acorde con mi láser. Si este no es capaz de tomar este espectro de excitación, no me sirve el
fluorocromo.

La fluroceína tiene la particularidad que se une a proteínas. Es decir, la puedo unir a anticuerpos, dependiendo si estoy
trabajando con Ac monoclonales o policlonales. Supongamos que estamos trabajando con Ac monoclonal, un anti-CD3
que marcará la molécula CD3, que está
presente en Linfcitos T (CD4 y CD8). Entonces yo
voy a tener el láser, que va a incidir sobre las
células que van pasando. Voy a tener la
desviación frontal de la luz (Detector FSC que
me mide la longitud de onda de 488 nm y
estimo tamaño), pero también tengo la
dispersión lateral de la luz (detector SSC que
mide longitud de onda 488 nm y estima
granularidad). Ahora, si esta célula se le une el
Ac (con mi marcador verde, que en un principio
no lo es todavía), pasan mis células, algunas
como no tienen CD3 pasan y no se detectan.
Pero pensemos que pasa una célula a la cual está unida a mi marcador. El láser va a excitar ese fluorocromo, porque
tiene su espectro de excitación, por lo tanto va a salir aquí una fluorescencia que será de color verde y va a haber un
canal conocido como FL-1 que me va a medir la fluorescencia 1, que es de color verde y cuya longitud de onda será otra.
No va a ser los 488 nm. Por lo tanto puedo estar evaluando tamaño, granularidad (que son dos parámetros intrínsecos) y
uno extrínseco: CD3. Por lo tanto, en total estoy evaluando 3 parámetros: 2 intrínsecos y 1 extrínseco. ¿Cuántos colores
estoy evaluando? – UNO, el verde.

Por lo tanto, yo agregué el anti-CD3 con FITC (en verde en el dibujo). Voy a agregar otro, un anti-CD4 con PE
(Ficoeritrina), otro fluorocromo que emite en color rojo. Y también esta conjugado, por lo que si está unido se me va a
excitar y va a emitir otra fluorescencia y lo detectará un FL-2. Así estaré midiendo 4 parámetros en total, 2 intrínsecos y
2 extrínsecos, con 2 colores (verde y rojo).

Agregamos otro, un anti-CD8 con TC (Tricol) de fluorocromo, quien al ser excitado emitirá una fluorescencia de color
morado, captada por FL-3. En total, estaré midiendo 5 parámetros, 2 intrínsecos y 3 extrínsecos, y en total 3 colores.
Esta es la configuración interna de un citómetro de flujo de 3 colores.

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 Inmunología Clínica - Citometría de Flujo 7

Ejemplo, si digo un citómetro de flujo de 5 colores: en total me mide 7 parámetros. ¿De qué va a depender la cantidad
de colores? – De la disponibilidad de fluorocromos y de la estructura interna del citómetro, porque: (vamos a hacer la
misma simulación) (Marcado con estrella en dibujo) tengo célula y se envía la luz del láser. Pero se va a encontrar con un
“filtro” dispuesto en una determinada posición y va a hacer que se me refleje y va finalmente al detector FL-1. Paralelo a
eso, la fluorescencia roja también va pasando, pero se encuentra con el mismo filtro, pero como tiene una longitud de
onda mayor, pasa por el primer filtro, pero habrá otro más arriba que permitirá reflejar dicha longitud de onda hacia un
segundo detector FL-2. Lo mismo para FL-3. Esto dependerá de la configuración interna de cada citómetro y de la
orientación que tengan los filtros. Esa señal captada por el detector es codificada electrónicamente, mediante un
software.

Con el advenimiento del VIH, a principio de la década de los 80, cuando ya estaba pasando la estigmatización hacia los
homosexuales y se empezó a ver que los pacientes con SIDA tenían una disminución en el recuento de los Linfocitos T
CD4 y que se podía evaluar con microscopía de fluorescencia, a alguien se le ocurrió analizarlo por Citometría de flujo.
¡Un negocio! Espectacular, desde el punto de vista de venta de equipos, de reactivos, Ac, fluorocromos. Tanto así que la
infección por VIH se maneja en función de 2 características: La carga viral y en función de los linfocitos T CD4 mediante
citometría de flujo. Todo eso hasta el 11 de septiembre del 2001 (las torres gemelas), después vino todo un asunto de
que enviaban cartas con ANTRAX al capitolio. Hubo muchas alarmas con sobres de esto, donde mostraban en TV una
serie de camiones con containers. A raíz de esto, el sistema de defensa norteamericana liberó la patente de un
citómetro de flujo de 17 parámetros :0 (es decir, 15 colores). Ahí se supo que el primer citómetro de flujo en realidad se
desarrollo durante la Segunda Guerra Mundial, por un caballero de apellido Gucker y que pasó a ser top-secret y que
apuntaba a la pesquisa de esporas de una guerra bacteriológica.

En el 67 se desarrolló desde el punto de vista de investigación, pero recién ahí se pudo ver un claro ejemplo de la
dicotomía que hay entre la investigación en el área militar y la transferencia hacia el área civil. A raíz de lo que paso el
2001 (11/9) se liberó esa patente. Antes de eso eran exorbitantes los precios de los citómetros y no eran tan complejos.

Retomando. Pensemos en esa muestra de linfocitos que pasé por el equipo, que las puedo separar en tamaño y
granularidad (FSC y SSC). Pero yo también marqué un anti-CD3. Entonces si yo tengo una célula que tenía CD3, voy a
encontrar la fluorescencia. Si no tiene CD3, no encontraré fluorescencia. Por lo tanto, si yo pudiera graficar número de
células v/s anti-CD3, voy a encontrar células que son negativas para CD3 (-) y células que son positivas para CD3 (+).
Ahora, para poder ver esto yo tengo que hacer mi “GATING”,
entonces voy a estar viendo solamente lo que me conviene para
linfocitos, porque si no, se me pueden superponer las curvas. Por lo
tanto se debe hacer la restricción de GATE.

Entonces, voy a tratar la receta típica de una marcación típica de un

Ac anti-CD3, dependiendo de lo que me diga el fabricante del
anticuerpo, puede ser

o 50 a 100 microlitros de sangre total (ST) anticoagulada, fundamentalmente con EDTA como antiguaculante.
o Pueden ser de 5 a 30 microlitros del Ac

Con eso se me va a unir el Ac, en oscuridad, a Tº ambiente (30

minutos DRT (.-.))

Luego de eso agrego una solución de lisis (tiene un fijador y un

amortiguador), que va a permitir que se lisen los glóbulos rojos,

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8 Inmunología Clínica – Citometría de Flujo

pero además me va a fijar los leucocitos. Esto lo tengo por 10 minutos y después centrifugo. El sobrenadante va a
quedar rojito, porque se lisaron los glóbulos rojos, lo elimino. Re-suspendo el sedimendo y lo lavo con PBS.

¿Se acuerdan del concepto de lavar? – Agrego la solución de lisis, va a quedar todo rojo. Si yo lo centrifugo, y abajo
encontraré pegados los leucocitos, como una manchita. El sobrenadante (rojo) lo elimino y lo que queda en el fondo, le
agrego PBD y eso me permite que estas células que todavía le queda solución de lisis se me vaya esta, y esto me va a
quedar un leve tono rojizo, muy leve. Después centrifugo nuevamente, elimino el sobrenadante y eso lo re-suspendo.
Así yo tengo un buen lavado de células.

Tubo Tubo Entonces ya tenemos los leucocitos en PBS y ya estamos en

condiciones de pasarlas por el equipo. Entonces ahora
veamos qué pasa cuando agregamos el anti-CD3. Para eso
vamos a hacer el ensayo con dos tubos. Tubo 1 y 2,
obviamente sangre total en ambos tubos. Anticuerpo, al
primero no le voy a agregar, pero al segundo tubo sí. ¿Por
qué? Porque con el primero yo me voy a asegurar que no
hay nada positivo. Si quiero marcar CD3 y no le agregué anticuerpo no voy a tener marcación, por definición. Es lo que
llamamos “blanquear”, es decir, utilizar blancos (como en análisis instrumental :’c). Nos va a servir para decir que el tubo
1 es negativo. Por lo tanto, cuando yo evalúo lo que está en el tubo 2, sé que es positivo. En que se traduce esto. Pasé
las células, las 20.000, se hizo la reducción de “GATE” y vamos a graficar anti-CD3 v/s Nº de células. Paso el tubo 1, sin
marcar y me encontraré con esta situación (1). Entonces yo voy a decir que a la izquierda estarán las células que son
negativas. Con el mouse separo en “marquers” y digo: todo lo que esté en M1(derecha) va a ser positivo y todo lo que
esté en el marquer 2 (M2) va a ser negativo. Ahora que pasa con el tubo que sigue con el anticuerpo, pero dejando la
2 base de este marquer, porque este me dijo que en la zona de la
1
derecha iba a encontrar cosas positivas, por lo tanto, si yo paso lo que
está marcado me voy a encontrar con esta situación (1), células que
son negativas pero también células que son positivas. Si estamos
3 hablando de linfocitos de sangre periférica, linfocitos T (a la derecha,
en 1) y de linfocitos no T (a la izquierda, en 1). Además podemos decir
4 que los LT son un 50 %.

5 Recordemos que el marcador de CD3 en Fit-C y para anti-CD4 con

Ficoeritrina (PE)

Hacemos lo mismo con células marcadas con anti-CD4 (2). Tenemos

lo mismo, lo que es negativo, fijamos el “marquer” y a la izquierda
estarán las que son negativas y a la derecha las que son positivas.
Entonces vamos a encontrar las células que son CD4 (+) (a la derecha,
en 2) y células que son CD4 (-) (a la izquierda, en 2). CD4 (+) me indica
que solo son CD4 positivas, por lo que si yo tengo un monocito
pequeño, que se metió en la “GATE” de linfocitos y que es CD4 positivo, lo encontraré en la misma zona CD4 (+).

Ahora yo quiero cambiar esto (2). Voy a cambiar los ejes de CD4 y Nº de células para llegar a (3). Todo lo que esté hacia
arriba del “marquer” será positivo y hacia abajo lo que está negativo. Es lo mismo, pero cambié la orientación de los
ejes.

Jorgito – TecMed 2017

 Inmunología Clínica - Citometría de Flujo 9

Ahora vamos a mezclar (1) y (3) en uno solo, el (4), donde vamos a poner CD3 v/s CD4. Con verde vamos a ver CD3 (en
eje x), lo que es negativo a la izquierda y lo que es positivo a la derecha. Por lo tanto tenemos el marquer. Con rojo (se
ve como rosado en la imagen :s) vamos a tener CD4. En la mitad de abajo lo que es negativo y en la mitad superior lo
que es positivo. Así en total tendremos cuadrantes debido a los marquer de cada grafico.

Recapitulemos, se divide en cuadrantes y se les da arbitrariamente un número a cada uno (gráfico 5). ¿En qué cuadrante
voy a encontrar las células que son positivas para la fluorescencia a CD3? – En el cuadrante 2 y en el 4 (Ver gráfico 4).
Acuérdense del gráfico cartesiano (x,y).

o ¿Cómo va a ser el cuadrante 2 para el eje X? –

Positivo (+)
o ¿Cómo va a ser el cuadrante 4 para el eje X? –
Positivo (+), porque todo lo que tenga CD3
positivo estará en la región vertical que abarca
los cuadrantes 2 y 4
o ¿Cómo es el cuadrante 1 para el eje X? –
Negativo (-)
o ¿Cómo es el cuadrante 3 para el eje X? – Negativo (-)
o ¿Cómo es el cuadrante 1 para el eje Y? – Positivo (-), todo lo que esté positivo está desde la mitad hacia arriba.
o ¿Cómo es el cuadrante 2 para el eje X? – Positivo (+)
o ¿Cómo es el cuadrante 3 para el eje Y? – Negativo (-)

¿En qué cuadrante están los linfocitos T “helper”? – En el cuadrante 2 (Wooooow xd)

¿Por qué? – Porque los linfocitos T “helper” tienen presente CD3 y CD4 como marcadores

Ahora, ya no hablaremos de cuadrante 1, 2, 3,4, sino que vamos a hablar de

cuadrante superior izquierdo-derecho, cuadrante inferior izquierdo-derecho.
Por lo tanto, si yo tengo:

¿En qué cuadrante están los Linfocitos T helper? – En el superior derecho,

entonces yo puedo decir que tengo los helper.

¿Qué voy a tener en el cuadrante inferior derecho? – No, mejor veámoslo de

otra manera.

¿Se acuerdan que yo puedo sacar porcentaje de esto?, Me van a tener que
creer que en el cuadrante superior derecho hay un 50%. En el inferior
derecho hay 30%. En el inferior izquierdo hay un 20% y en el superior
Marcadores linfocitarios
izquierdo hay 0%.
Linfocitos T: CD3(+)
o ¿En qué cuadrante están los Linfocitos T helper?, ¿qué % de
LTh: CD3(+), CD4(+), CD8(-)
linfocitos T helper tenemos? Un 50%.
LT sup/cit: CD3(+), CD4(-), CD8(+)
o ¿Qué células voy a tener en el cuadrante inferior derecho, que
LB: CD3(-), CD4(-), CD19(+)
son positivas para CD3, que son negativas para CD4? Linfocitos B.
NK: CD3(-), CD16(+), CD56(+)
NK-T: CD3(+), CD16(-), CD56(+)

Jorgito – TecMed 2017

10 Inmunología Clínica – Citometría de Flujo

¿Qué más? ¿No se acuerdan de los marcadores? – NOOOOOOOOOO ¬¬’

No olvidar marcadores de población linfocitaria. Se los voy a explicar de nuevo con CD4 y de ahí vamos a dar la tarea.

Si yo tengo aquí un recuento leucocitario (entregado por el hemograma) de 10.000 leucocitos/mm 3, a través de la
formula diferencial logramos decir que tiene un 50% de linfocitos (No entraré en esos detalles, porque eso tienen que
revisarlo si o si para el martes ¬¬’). Ese es el % de linfocitos, por lo tanto yo puedo sacar el % de linfocitos absolutos.
Cómo lo hago. Digo: si tengo 10.000 leucocitos es el 100%, 50% va a ser X, ¿Cuánto es eso? – 5.000 y por lo tanto tengo
5.000 linfocitos absolutos.

Ahora, si yo tengo un 50% de linfocitos T CD4, si 5.000 linfocitos absolutos es mi 100% de linfocitos, 50% de linfocitos T
CD4 va a ser X, por lo tanto voy a tener 2.500 linfocitos T CD4/mm 3. Que no tiene nada que ver con que yo tenga 10.00
células contadas en el citómetro (en la explicación anterior, con el citómetro). Es simplemente coincidencia. Cuando yo
analizo tamaño y granularidad, encuentro que justo hay 10.000, es justo coincidencia. A mí me interesa evaluar los % de
la “GATE”, NO los % del total.

TAREA.

Si tengo un recuento de leucocitos de 8.500, con un 35% de linfocitos. Quiero que para la próxima clase me traigan % y
Nº absoluto de todos los linfocitos de la tabla.

Leucocitos % Nº Absoluto Y si se atreven a dar la interpretación inmunológica, mejor.

LT total
LT CD4
LT CD8
NK
NK-T
LB
𝑻𝑪𝑫𝟒
Relación
𝑻 𝑪𝑫𝟖

Jorgito – TecMed 2017