Revista de Microbiología e Investigación Biotecnológica

Biblioteca de investigación Scholars

J. Microbiol. Biotech. Res., 2016, 6 (5): 39-46

(http://scholarsresearchlibrary.com/archive.html)

ISSN: 2231 -3168

CODEN (EE. UU.): JMBRB4

EvaluaciónEvaluación comparativa del análisis computacional y experimental de

Polifenol oxidasa del camote (Ipomoea Batatas)

Hezekiah Toluwase Fatoki

Departamento de Bioquímica, Universidad Federal de Tecnología, P.M.B. 704, Akure, Nigeria

ABSTRACTO

El tubérculo de batata (Ipomoea Batatas) es un contribuyente significativo a las necesidades

calóricas de todo el mundo. Es rico en complejo carbohidratos, fibra dietética, sodio y
betacaroteno. El pardeamiento enzimático ocurre como resultado de la oxidación por polifenol
oxidasa (PPO), de compuestos fenólicos a quinonas y su eventual (catalizado no enzimático)
polimerización a pigmentos de melanina. En este estudio, los resultados del análisis
computacional de PPO de batata fueron alineados con los resultados experimentales de
laboratorio húmedo, se identificaron áreas de desigualdad y la bioquímica se proporcionaron
justificaciones para futuras investigaciones.

Palabras clave: Polifenol Oxidasa, Batata, Ipomoea Batatas, Análisis Computacional, Análisis
Experimental.

INTRODUCCIÓN

El tubérculo de batata (Ipomoea Batatas) es un contribuyente significativo a las necesidades

calóricas de todo el mundo. De acuerdo con la Comida y la Organización de la Agricultura (FAO)
estadísticas, la producción mundial de camote en 2011 fue de más de 200 millones toneladas El
principal productor de batata ha sido China seguido de Uganda, Nigeria, Indonesia, Tanzania,
Vietnam, India y Estados Unidos. Además de los almidones simples, las batatas crudas son ricas
en carbohidratos complejos, fibra dietética, sodio y betacaroteno (un carotenoide provitamina
A), aunque tiene contenidos moderados de otros micronutrientes, incluida la vitamina B5, la
vitamina B6 y el manganeso. La batata tiene tanto culinario como no usos culinarios en muchos
países. Se ha informado que la batata es un ejemplo de un alimento transgénico natural cultivo
[1].

La batata es susceptible a las reacciones de pardeamiento que afectan la calidad y la aceptación

del consumidor. Aunque dulce las papas no se decoloran cuando se cortan o cortan en
rebanadas, como lo hacen ciertas frutas como melocotones o manzana, oscurecen o se doran
cuando calor procesado Se ha demostrado que la decoloración se produce cuando la parte
externa de las raíces de la batata fue sometido a temperaturas elevadas no lo suficientemente
altas como para desnaturalizar las enzimas, pero suficientes para alterar las células organización
y, por lo tanto, causar polifenol oxidasa (PPO) para reaccionar con los compuestos fenólicos en
ese tejido.

Las polifenol oxidasas (PPO) son cobre que contienen oxidorreductasas que catalizan la
hidroxilación y oxidación de compuestos fenólicos en presencia de oxígeno molecular. Las
catecolalas (EC 1.10.3.2) oxidan o-difenoles a o-diquinonas, laccasas (EC 1.10.3.1) oxidan los
difenoles oy (y otros sustratos) a las p-diquinonas (y otras quinonas, y semiquinonas) y
cresolasas (EC 1.14.18.1) oxidan monofenoles a quininas [2]. UN Una plétora de estudios
muestran que la polifenol oxidasa (PPO; 1, 2-bencenodiol: oxidorreductasa de oxígeno, EC 1. 10.
3.1) es ampliamente encontrado en la naturaleza [3, 4]. Por lo general, está presente en la
mayoría de los tejidos vegetales [5]. En las plantas, los PPO están ubicados principalmente en la
membrana tilacoide de los cloroplastos y las mitocondrias [6]. Reacciones de bronceado, que
tienen lugar después de la distribución de tejidos ricos en fenoles puede provocar la unión de la
polifenol oxidasa soluble a una fracción de "partículas".

La polifenol oxidasa está ampliamente distribuida en plantas y microorganismos y muchos

investigadores están interesados en la polifenol oxidasa aislada de diversas fuentes, como la
batata, el plátano, la manzana, el kiwi, el aguacate, la uva, mangodana comestible, lechuga,
pera; palmito, frijol de cacao, frijol, patata de gallo y ñame [5-9]. Existencia de PPOs en formas
moleculares múltiples (isoformas) se encontró en varias fuentes vegetales. Múltiples formas
detectadas en tal plantas como la manzana, el plátano, la rosa de perro, la uva, el kiwi, la
lechuga, el champiñón, el melocotón, la piña, la patata, la espinaca, fresa y camote. Se
observaron múltiples formas de PPO incluso en presencia de inhibidores de proteasa en mung
extractos de hoja de frijol, fresa y boniato [10-12].

El PPO de la batata ha sido estudiado por varios grupos y se ha demostrado que consiste en
soluble y en partículas fracciones específicas para o-difenoles, especialmente ácido clorogénico
y sus isómeros. Sin embargo, algunas investigaciones han sido realizado uso de calentamiento
pre-peeling, mayor tiempo de peeling con lejía y aditivos [13]. Catechin es un fenólico principal
compuesto encontrado en batata. Se encontró que el pH óptimo de dos isoformas purificadas
de batata era 5.4 y6.7 para la oxidación del ácido clorogénico [12]. Lourenco et al [14]
informaron que la sacarosa y las sales en la reacción elntorno funcionó como agentes
protectores para el PPO contra la desnaturalización térmica.

Debido a su participación en el dorado adverso de los productos vegetales, la polifenol oxidasa

ha recibido mucha atención de investigadores en los campos de la fisiología de las plantas y la
ciencia de los alimentos. El pardeamiento enzimático ocurre como resultado del oxidaciónfenol
oxidasa, de compuestos fenólicos a quinonas y su eventual (catalizado no enzimático)
polimerizacióne melanina [4]. Parece que las reacciones de pardeamiento oxidativo, que se
producen en muchos alimentos de elrigen vegetal, generalmente causa un deterioro en la
calidad de los alimentos al modificar las propiedades nutricionales y organolépticas [15,
dieciséis].

Positivamente, las enzimas polifenol oxidasa tienen aplicaciones significativas en muchas áreas,
como alimentos, medicinas y industriaprocesos alimentarios, la polifenol oxidasa se ha utilizado
principalmente para mejorar el sabor en el té y el café.y cacao. Una de las reacciones más
importantes relacionadas con el desarrollo del sabor en los alimentos es el Strecker degradación
que da amoníaco, dióxido de carbono y aldehídos. Estos aldehídos contribuyen al sabor.
Aldehídos seorman por la degradación oxidativa de aminoácidos no solo durante la interacción
de aminoácidos y azúcares en

altas temperaturas pero también durante la interacción de aminoácidos y polifenoles en

presencia de polifenol oxidasa a temperaturas normales. Por lo tanto, la acción de la polifenol
oxidasa en la degradación de Strecker disminuye el costo del procesa y guarda al productor del
proceso de calentamiento [5]. Las interacciones proteína-polifenol y asociados los cambios
habían sido revisados por ozdal et al. [17].

Hay pocas secuencias de PPO de batata que están disponibles en bases de datos en línea como
en el momento de este estudio. Las dos secuencias más completas y revisadas de la Id. De
Uniprot: Q9ZP19 (PPO1_IPOBA) y Q9MB14 (PPO2_IPOBA) se utilizan en este estudio. En el
momento de este estudio hay menos estructuras computacionales análisis de la enzima PPO
[18, 19, 20], mientras que los que se centraron en la patata dulce PPO [21, 22], sin la propiedades
fisicoquímicas de la papa dulce PPO. En este estudio, los resultados del análisis computacional
de PPO de dulce papa se alinearon con los resultados experimentales de laboratorio húmedo,
se identificaron áreas de desigualdad y Se proporcionaron justificaciones bioquímicas para
futuras investigaciones.

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis de PPO Pathway La vía de acción de la polifenol oxidasa en el metabolismo de un

organismo se obtuvo de www.kegg.jp. Sus orthologous proteínas y genomas (GENES), proyectos
de genomas (DGENES) y metagenomes (MGENES) eran entonces examinado.

Análisis de secuencia

Se tomaron dos secuencias de PPO de batata del Uniprot: Q9ZP19 (PPO1_IPOBA) y contiene 496
aminoácidos. residuos ácidos; Q9MB14 (PPO2_IPOBA) y contiene 588 residuos de aminoácidos
y sus homólogos representativos hasta 55.0% de identidad fueron extraídos de la base de datos
de Uniprot, y el formato FASTA fue almacenado en MS- Palabra. Modificación postraduccional
(PMT) para Q9ZP19 y Q9MB14, se derivaron de la base de datos de Uniprot. Se realizaron
múltiples alineaciones de secuencia usando la herramienta Clustalo del European Bioinformatics
Institute, y árbol filogenético fue analizado.
Región aproximada del gel 2D del PPO

Esto se hizo utilizando la herramienta Compute pI / Mw de Expasy. El ID de Uniprot de cada uno

de los PPO de batata; Q9ZP19 y Q9MB14 se pegó en el cuadro de consulta en
http://web.expasy.org/compute_pi/. El terminal N y C fueron insertado, y se obtuvieron el pI
teórico y el peso molecular. Esto fue examinado con punto isoeléctrico calculadora en
http://isoelectric.ovh.org/ [23].

Alineación global del PPO

La alineación global se realizó a través de Needleman-Wunsch Global Sequence Alignment Tool

de NCBI. Los Elormato FASTA de las dos secuencias PPO se ejecutó utilizando Q9ZP19 como
consulta y Q9MB14 como consulta respectivamente contra el siguiente como sujeto: catecol
oxidasa de agrobacterium vitis (Uniprot id: B9JWV3), dominio Laccase proteína de
Agrobacterium tumefaciens F2 (Id de Uniprot: F7U7K9), y proteína de dominio de Laccase de
Agrobacterium rhizogenes (Id de Uniprot: A0A071I220).

Determinación de ortología en PPO

Cada una de las secuencias de Q9ZP19 (PPO1_IPOBA) y Q9MB14 (PPO2_IPOBA) que se

recuperaron de Uniprot, fue ingresado en el blastp de NCBI. La consulta se ejecutó contra la base
de datos SWISS-PROT. La vista de árbol BLAST para Se exploraron Evolución mínima rápida y
Unión de vecinos.

Proteína homóloga estructural para PPO

La secuencia de Q9ZP19 (PPO1_IPOBA) y Q9MB14 (PPO2_IPOBA) que se recuperó de Uniprot se

ejecutó contra La estructura obtenida fue vista y modelada con el visor Cn3D.

RESULTADOS

Funciones de la polifenol oxidasa en una vía del organismo que implica el metabolismo de la
tirosina, para el alcaloide Isoquinoline biosíntesis y biosíntesis de melanina (Fig.1). Los pasos
reales para la acción PPO implican la producción de dopaquinona y L-DOPA de tirosina, y
dopaquinona de L-DOPA.

Gráfico

La información experimental de Uniprot mostró que Q9MB14 tiene menos conflicto de

secuencia que Q9ZP19, y que la modificación posterior a la traducción en ambas proteínas
implica un enlace disulfuro y un enlace tioéter. La estructura secundaria de Q9ZP19 consiste en
más alfa hélice, menos cadenas beta y menor turno. La secuencia más conservada de 50 Q9ZP19
y Q9MB14 en relación con otras proteínas homólogas

EIQVHNSWLFFPFHRWYLYFYERILGKLIGDPSFGLPFWNWDNPGGMVLPDFLNDSTSSL (105-164) y

EIQVHNSWLFFPFHRWYLYFYERILGKLIGDPTFGLPFWNWDTPAGMLIPQYFRNQNSPL (195-254)
respectivamente.
El resultado de blastp PPO de Q9ZP19 dio 77.4% y 76.0% coinciden para Q9MB14 y Q5ENY2
respectivamente mientras laatriz de identidad porcentual de Clustalo dio 78.18 y 76.77,
respectivamente (figura 2). Hay una homología de más del 55.0% con PPO de Camellia
nitidissima, Cynara cardunculus var. scolymus, álbum de Canarium, Populus euphratica, Populus
Trichocarpa x Populus deltoides, y proteína no caracterizada de Coffea canephora, Theobroma
cacao, Eucalyptus grandis, Populus trichocarpa.

Gráficos

Ambos PPO de batata en la Fig.2 fueron ortólogos con PPO de Cynara cardunculus var. scolymus
(A0A118K104), Larreatricin hidroxilasa de Theobroma cacao (A0A061GEN3), proteínas no
caracterizadas de Coffea canephora (A0A068UEN7). Dado que la ortología no define la distancia
evolutiva, la Evolución Mínima Rápida (Fig.3) proporciona la descripción de la similitud evolutiva.

Gráficos

El PPO de la batata (Ipomoea batata) pertenece al linaje taxonómico de Eudicots. Q9ZP19

mostró relaciónva con las proteínas (Fig. 3a) de basidiomicetos, ascomicetos, gasterópodos,
cefalópodos, bivalvos, nematodos, bacterias GC Gram + altas y a-proteobacteria. Q9MB14
mostró una relación evolutiva cons proteínas (Fig.3b) de peces óseos, basidiomicetos,
ascomicetos, gasterópodos, cefalópodos, bivalvos, nematodos, alto GC Gram + bacterias y a-
proteobacteria.

El cálculo llevado a cabo en la secuencia completa (496 aminoácidos) de Q9ZP19, dio un peso
molecular (Da) de 55011.28 (masa promedio), 54976.54 (masa monoisotópica), y un pI teórico
de 5.78 (Compute_pI) y 5.58 (Calculador de punto isoeléctrico). El peso molecular permaneció
igual. Y el de Q9MB14 (588 aminoácidos), dio un peso molecular (Da) de 65650,61 (masa
promedio), 65609,27 (masa monoisotópica), y un pI teórico de 6.77 (Compute_pI) y 6.43
(calculadora de punto isoeléctrico). El peso molecular permaneció igual.

La alineación global de Q9ZP19 y Q9MB14 no mostró una puntuación significativa con tres
especies de Agrobacterium. Agrobacterium vitis tiene la puntuación y el porcentaje de identidad
más positivos.

Se encontró que Q9ZP19 y Q9MB14 tenían la misma proteína estructuralmente similar, que era
cadena A de catecol oxidasa de Ipomoea batatas (batata) en el Estado Cu (II) -Cu (II) nativo (PDB
ID: 1BT1), que tiene 345 aminoácidos. El parámetro de coincidencia para Q9ZP19 es: Puntuación
= 729 bits (1883), Esperar = 0.0, Método = Composición ajuste de matriz, Identidades = 345/345
(100%), Positivos = 345/345 (100%), Huecos = 0/345 (0%) mientras que para Q9MB14
sonuntuación = 575 bits (1483), Esperar = 0.0, Método = Ajuste de matriz de composición,
Identidades = 264/349 (76%), Positivos = 299/349 (85%), Gaps = 6/349 (1%).

Gráfico
 DISCUSIÓN

El análisis filogenético de este estudio también se realizó utilizando el modo 'one click' de
phylogeny.fr [24], el árbol de resultados varió de la de Clustalo pero proporcionó medios
simplificados para la presentación de los árboles. Punto isoeléctrico que es el pH en que una
molécula particular no lleva carga eléctrica neta, es un parámetro crítico para muchas
bioquímicas analíticas y técnicas de proteómica, especialmente para electroforesis en gel 2D
(2D-PAGE), enfoque isoeléctrico capilar (cIEF), Cristalografíacromatografía líquida-
espectrometría de masas (LC-MS) [23]. El pH óptimo depende de los componentes de
aminoácidos del sitio activo mientras que el punto isoeléctrico depende de la enzima completa
primaria y terciaria estructura.

El punto isoeléctrico determina el nivel mínimo de solubilidad de una proteína debido a que las
interacciones proteína-proteína son favorecido sobre las interacciones proteína-agua [25, 26].
Un análisis de 9596 estructuras obtenidas del PDB sugirió un enlace entre el pI de una proteína
y el pH al que se cristalizaría. Se encontró que las proteínas ácidas tienden a cristalizarades de
pH por encima de su pI, mientras que las proteínas básicas cristalizaron 0,5-3,0 unidades de pH
por debajo de su pI [27]. Para un Q9MB14 que tenga pI teórico de 6.43-6.77, el tampón utilizado
para PPO a menudo oscila entre pH 6.0-7.0, que es mayormente similar con este pI y esto explica
la eficiencia en el método de cromatografía de purificación de PPO, pero esto podría tener un
efecto negativo electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (PAGE) y ningún efecto en SDS-
PÁGINA. Este cuestionamiento cuestiona la eficacia del peso molecular de 96 kDa informado por
Lourenco et al [14] para La PPO de boniato estaba demasiado lejos del peso molecular calculado
del resultado computacional de este estudio y de Liao et al [28]. Existe una necesidad de
evaluación contemporánea del peso molecular de la polifenol oxidasa de batata utilizando el
método SDS-PAGE de Laemmli [29].

IBT1 se ha utilizado en el modelado de la interacción PPO-sustrato / inhibidor [22]. La estructura

cristalina del dulce La papa (Ipomoea batatas) catecol oxidasa (IbCO, PDB 1BT3) ha servido como
plantilla para el modelo molecular tridimensional en la diversidad estructural de Dandelion PPO
[19]. Los análisis de secuencia comparativa muestran todas las PPO de planta que tienen
comúnestructura de tres dominios [30].

Klabunde et al [21] informaron que el centro de metal dinuclear en la catecol oxidasa es un

enlace tioéter covalente formado entre el átomo de Cε de histidina His 109, uno de los ligandos
de cobre, y el átomo de azufre de cisteína de Cys 92. Allí tambiénformes de unidades de cisteinil-
histidilo en una tirosinasa de Neurospora crassa, así como para moluscos hemocianinas. Las
catecol oxidasas y hemocianinas no muestran una similitud de secuencia significativa y no se
parecen en su pliegue global, a excepción del núcleo catalítico que es notablemente similar en
ambas proteínas. Como se muestra en la Fig.4, la papa dulce PPO tiene una relación de evolución
con bacterias gram-positivas; mientras que Kyndt et al [1] informaron que el El genoma de la
batata (Ipomoea spp.) tiene un alineamiento evolutivo con las especies de Agrobacterium, que
son conocidas por ser bacterias gramnegativas Pero la alineación global de la proteína del
dominio lacasa y la catecol oxidasa del especies de agrobacterium revelaron que tal relación de
evolución con la batata no incluía polifenol oxidasa
Los datos espectroscópicos mostraron que el sitio dicopper catalítico de la tirosinasa, que está
involucrado en la biosíntesis de la pigmento de la piel melanina, estructuralmente se asemeja a
la catecol oxidasa y la hemocianina. Usando sitio dirigido mutagénesis, se identificaron seis
residuos de histidina coordinadores. Una alineación de secuencia de la tirosinasa humana y la
catecol oxidasa de batata muestra que ambas enzimas muestran una identidad de secuencia del
26% en una región de 383 residuos con los seis ligandos metálicos conservados. El centro dimetal
de la catecol oxidasa puede por loanto servir como un modelo para el centro dicopper catalítico
de tirosinasas. Sin embargo, las catecol oxidasas no muestran monooxigenasa actividads que las
tirosinasas exhiben ambos mono-oxigenasa y oxidasa actividad [21].

Kanade et al [22] informaron que His244 se coordina con CuB de la catecol oxidasa de batata
(ibCO), mientras que His88 está coordinado con CuA. Phe261 estaba ubicado encima de la
cavidad hidrofóbica, que se ha denominado como la "puerta" Residuo porque bloqueó la
entrada de la cavidad. Explicaron que la ausencia de la monofenolasa de ibCO fue que Phe261
bloquea el enfoque directo y la reorientación de monofenoles a CuA, necesaria para su
hidroxilación. De acuerdo con Liao et al [28] informó que la clonación y caracterización de una
nueva codificación de cDNA PPO de batata es 1984bp con un marco de lectura abierto (ORF) de
1767 pb que codifica un polipéptido de 588 aminoácidos y que la secuencia de codificación era
un gen libre de intrones. Si el cDNA dio 588 aminoácidos, entonces Q9MB14 es el más polifenol
oxidasa funcional en Uniprot más que cualquier otra, y esto podría justificarse porque tiene una
secuencia menor conflicto que Q9ZP19.

Por otra parte, Thangudu et al [31] han informado que solo alrededor de un cuarto de los
distintos disulfuros se conservan en todos los miembros de familias de proteínas y que la
conservación del disulfuro es común en muchas familias. Aunque el las mutaciones del enlace
disulfuro son bastante frecuentes, pero no existe una relación clara entre la identidad de
secuencia entre dos proteínas homólogas y la conservación del enlace disulfuro. La estructura
cristalina de la catecol oxidasa de la batata (1BT1) mostró que hay dos enlaces disulfuro. Para
Q9ZP19, los enlaces disulfuro se formaron entre amino ácidos en las posiciones 11 y 28, 27 y 89,
con reticulación Cys-His en 92 y 109, respectivamente [21]. Su informe de 345 secuencias de
aminoácidos no se corresponden con la secuencia de catecol oxidasa generada por cDNA
informada por Liao et al [28] que dio 588 secuencias de aminoácidos que es similar a la longitud
de la secuencia Q9MB14 con disulfuro formación de enlaces entre aminoácidos en las posiciones
99 y 116, 115 y 179 mientras que el enlace cruzado Cys-His ocurrió entre la cisteína en la posición
183 y la histidina en la posición 199. Sin embargo, este estudio reveló posible estructura similar
para Q9ZP19 y Q9MB14. Los extremos terminales mostrados por la vista Cn3D de la estructura
PDB de 1BT1 en la Fig. 4, reveló las dos cadenas (A y B) de la enzima.

Para probar si estos enlaces disulfuro eran intracatenarios o intercadenas se necesita más
investigación para optimizar procesamientoe la batata [32, 33]. La reducción y la alquilación de
los enlaces disulfuro entre cadenas podría dar como resultado virtualmente ninguna pérdida de
actividad enzimática que dé una mejor comprensión del potencial mecanismo de inhibición de
PPO en la batata. La presencia de un enlace disulfuro también puede explicar termoestabilidad
de la PPO de boniato [34, 14].

CONCLUSIÓN

Los tubérculos de batata son un cultivo invaluable que podría usarse como suplemento dietético
para el tratamiento de dolencias involucrando deficiencia de sodio, vitamina A y betacaroteno.
Con una producción adecuada y un procesamiento eficiente de batata, no hay necesidad de un
proyecto de "arroz dorado".

INFORMACIÓN ADICIONAL

El autor declara no tener intereses financieros en competencia.