Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín

Facultad de Ciencias - Escuela de Química

Laboratorio de Bioquímica

Evaluación de la actividad catalítica de la Tirosinasa

procedente de papa, manzana y banano.
1
María Manuela Valderrama Hincapié; 2Alejandra Pérez Perea

Ingeniería Biológica, Ciencias, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín

1
mvalderramah@unal.edu.co; 2alperezp@unal.edu.co

RESUMEN: El pardeamiento enzimático es una reacción de oxidación, catalizada por la enzima conocida como
Tirosinasa. Este proceso supone un oscurecimiento en frutas, verduras y setas, mientras que en animales es responsable
de la formación de pigmentos en piel o pelo. Durante la práctica se evaluó la velocidad de reacción para comparar la
actividad enzimática de la Tirosinasa proveniente de banano, manzana y papa bajo diferentes condiciones, de esto se
pudo comprobar la temperatura estimula la actividad catalítica, mientras que el ácido ascórbico es un inhibidor de la
tirosinasa.

PALABRAS CLAVE: pardeamiento enzimático, tirosinasa, ácido ascórbico

Michaelis - Menten (Km), definida como la concentración de

1. INTRODUCCIÓN: el oscurecimiento de frutas, vegetales e
incluso setas en presencia de oxígeno es debido a la acción de
la Tirosinasa sobre el aminoácido llamado Tirosina; para esto
se produce una serie de reacciones que termina en Melanina,
pigmento oscuro que produce el pardeamiento[1].
sustrato cuando la velocidad incial es igual a la mitad de
la velocidad máxima. Relacionando entonces, la
concentración inicial de sustrato con la velocidad de la
reacción[2].

Para obtener un extracto enzimático se requiere una secuencia

de procedimientos que aseguren la conservación de la actividad
catalítica de la enzima: Ruptura mecánica por molido,
autodigestión del material por otras enzimas de la misma
célula (autolisis), adición de la enzima lisozima, que
hidroliza el polisacárido mureína de la pared celular,
congelación y descongelación rápida, tratamiento con
ultrasonido, separación de residuos poco solubles por
filtración y centrifugación.
La cinética enzimática fue explicada en 1882 por Leonor
Michaelis y Maud Menten a partir de la constante de
2. MATERIALES Y MÉTODOS:
Los materiales se enlistan a continuación:
➔ Solución Buffer de Fosfato a 0.1M de pH 7,2 y 6,0
➔ Solución de L-DOPA (197.2 g/mol) 0.03M en
Buffer a pH = 6.0. (disuelta una cápsula de L-
DOPA en 50 ml de buffer para que quede con una
concentración de 4mg mL o 30mM)
➔ Fuente de Tirosinasa: banano, manzana y papa
➔ Mortero para triturar el material vegetal
➔ Fotocolorímetro
1
 ➔ Centrífuga
4 0,148 0,380 0,222
➔ Hielo picado
5 0,151 0,402 0,241
Para la preparación del extracto enzimático se peló la fruta
o tubérculo, cortándolo en pequeños trozos. Se tomaron 20 6 0,153 0,427 0,248
g y se le adicionaron 15 mL de Buffer de Fosfato de pH de
7 0,155 0,452 0,260
7,2 para triturarlo en un mortero previamente enfriado. Se
adiciona 15 mL más del Buffer. Para el caso del banano se 8 0,159 0,474 0,272
le agregó 45 mL, completando 60 mL.

Acto seguido, se filtró el extracto en una gasa para luego ser

llevado a la centrífuga en tubos de 15 mL a 2000 rpm
durante diez minutos.

Pasado este tiempo se recuperó el sobrenadante, para

disolverlo con solución de Buffer a 7,2 doblando su
volumen. La solución diluida se llevó a la nevera a 4º C.

Para medir la absorbancia se usó una longitud de onda de

420nm en el fotocolorímetro. Usando como blanco una
solución de: 1 mL del extracto enzimático, 3 mL de solución
de Buffer de pH 6 y 1 Ml de agua destilada. Se preparó, Gráfica 1. Absorbancia vs. tiempo
luego de tarar, el primer tubo así: 1 mL del extracto
enzimático, 3 mL de Buffer de pH 6 y 1 mL de DOPA, Con los valores de la pendiente de cada regresión se
inmediatamente después se tomaron las lecturas de determinó la actividad enzimática y velocidad de reacción
absorbancia cada minuto, hasta el minuto ocho. para cada extracto los cuales se muestran a continuación:

Un segundo tubo se preparó así: 1 mL de extracto Actividad enzimática

enzimático y 3 mL de solución de Buffer pH de 6,0. Se llevó Extracto de manzana: 0,004/min x mls de extracto
a un baño de agua hirviendo durante 5 minutos, se dejó Extracto de Banano: 0.0314/min x mls de extracto
enfriar a temperatura ambiente. Acto seguido se le agregó 1 Extracto de Papa: 0,0157/min x mls de extracto
mL de DOPA y se midieron las absorbancias cada minutos
hasta el minuto ocho. Velocidad de reacción
Extracto de manzana: 0,004/min x min
Por último, se utilizó 100 mg de ácido ascórbico como Extracto de Banano: 0.0314/min x min
inhibidor de la enzima; se preparó la solución así: 1mL de Extracto de Papa: 0,0157/min x min
extracto enzimático y 3 mL de Buffer de pH de 6.
Inmediatamente después de agregar DOPA se midieron las Estos datos se pueden traducir en la cantidad de
absorbancias cada minuto, hasta obtener nueve.
dopacromo que se va formando a medida que pasa el
tiempo en presencia de cierta cantidad de enzima
tirosinasa. La medida de la absorbancia a través del
3. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la reacción,
Tabla 1. Lectura de absorbancia en condiciones como expresa la siguiente ecuación:
normales
Tiempo Manzana Banano Papa
(min)
Ecuación 1. Velocidad de reacción de la tirosinasa
0 0,124 0,208 0,151

1 0,133 0,274 0,160 Al observar los resultados en las gráficas es evidente que
para todos los extractos la absorbancia aumento con el
2 0,140 0,312 0,185 paso del tiempo, sin embargo el extracto de banano lo hizo
con mayor velocidad de que los otros dos. El aumento en
3 0,143 0,347 0,209 la absorbancia indica que se esta formando Dopacromo

2
por la acción de la enzima tirosinasa, al ser esta una
sustancia de color café oscuro registra valores de
absorbancia cada vez más altos a medida que se oscurece,
es decir reacciona más L-dopa para convertirse en
dopacromo. La enzima tirosinasa es también conocida
como polifenol oxidasa (PPO)[3], es la responsable del
pardeamiento enzimático, como se mencionó
anteriormente; actúa sobre compuestos fenólicos
pertenecientes a diversas familias como ácidos fenólicos,
cumarinas, lignanos,entre otros que cumplen funciones
importantes en las plantas, como la protección frente a
radiación ultravioleta y frente a condiciones de estrés
biótico gracias a las propiedades antimicrobianas de los
propios compuestos fenólicos y mediante el sellado de
heridas; por lo tanto, el hecho de que en algunos frutos o
vegetales se de ese pardeamiento con mayor intensidad o
más rápido que en otros, como ocurrió en esta práctica,
puede ser consecuencia de los niveles y el tipo de
compuestos fenólicos presentes que va relacionado con el
perfil nutricional del alimento, ademá a pesar de que casi
todos los tejidos vegetales contienen PPO, sin embargo,
el nivel de actividad de PPO y la concentración de sustrato
(aquí, los compuestos fenólicos) pueden variar entre las
variedades de frutas. la especie y el estado de maduración,
el nivel de accesibilidad del O₂ , la naturaleza de los
diferentes compuestos oxidables y la polimerización y
degradación de las o-quinonas[4].
Además de evaluar la actividad de la enzima en función
de la velocidad de reacción, otros factores como la
temperatura y presencia de inhibidores tienen efectos
importantes sobre su actividad catalítica. La siguiente
tabla muestra la información obtenida introducir estas
variables en el estudio.
Tabla 2. Lectura de absorbancia extracto de manzana
en diferentes condiciones
Tiempo Normal Aumento de Presencia de
(min) temperatura inhibidor
0 0,124 0,145 0,072
1 0,133 0,157 0,074
2 0,140 0,158 0,075
3 0,143 0,160 0,076
8 0,159 0,167 0,076
Gráfica 2. Absorbancia vs. Tiempo
¿Qué explicación le puede dar a los resultados de
actividad enzimática a partir de las regresiones
realizadas en las diferentes condiciones: Normal, cambio
de temperatura y presencia de un inhibidor?
Los resultados obtenidos corresponden con la teoría; se
esperaba que con el aumento de temperatura se aumentará
a su vez la actividad catalítica de la enzima, debido a un
aumento en la cantidad de colisiones entre las moléculas
de la Enzima y el Sustrato, generando una la relación
directamente proporcional hasta la temperatura en la que
la Enzima se desnaturaliza por su naturaleza proteica [5].
Por otro lado, la presencia de ácido ascórbico, actuando
como Inhibidor supone en este caso un impedimento
estérico para la conformación del complejo Enzima-
Sustrato, es decir, que este limita la afinidad entre Enzima
y Sustrato, y así retarda la biosíntesis de melanina a partir
de DOPA[6].
Sin embargo, de la gráfica no es posible obtener
directamente mucha información sobre la actividad del
inhibidor.
%Inhibición = [1-(mi/mn)] x 100
Ecuación 2. `mn´ corresponde a la pendiente
en condiciones normales y `mi´ es la
pendiente con inhibidor.
Empleando la ecuación (2) se obtuvo un dato
cuantificable.
%Inhibición= [1-(0,0001/0,004)]x1000= 39/40 x 100 =
97,5%

4 0,148 0,161 0,074 La acción de la enzima tirosinasa en presencia del ácido

ascórbico fue inhibida casi en su totalidad en comparación
5 0,151 0,162 0,074
con la actividad de la enzima en condiciones normales.
6 0,153 0,164 0,074 Por lo que se puede considerar un inhibidor efectivo de
PPOs, además de una buena alternativa para el uso de otro
7 0,155 0,165 0,075 inhibidores como sulfitos o sulfhidrilos, de los más

3
comunes utilizados para evitar el pardeamiento en frutos,
sobre todo en las industrias, ya que estos compuestos
están sujetos a restricciones debido a que provocan
efectos adversos en la salud en personas sensibles[4].
¿Cómo inhibe el ácido ascórbico la reacción bioquímica
catalizada por la enzima tirosinasa?
Esto ha sido un tema ampliamente discutido que ha sido
comentado por diversos autores; hasta hace poco se creía
que se debía a que afectaba ciertos estructuras que tenían
presente el cobre, inhibiendo así, la actividad catalítica de
la Enzima[6]. Otros autores más recientes, señalan que el
ácido ascórbico actúa como un agente reductor de las o-
quinonas, producidas por la oxidación de los sustratos, a
o-difenoles no coleados, que son más estables; sin afectar
el sitio activo de la Tirosinasa[7].
Sin embargo también señalan que el ácido ascórbico
puede actuar como Inhibidor sólo en bajas
concentraciones, debido a que la acumulación de estos
difenoles puede reactivar indirectamente la vía
metabólica cuando este agente reductor ha sido gastado[7].
Lo anterior debe ser tenido en consideración para la
elaboración de productos cosméticos. De igual manera, la
melanina y en general el pardeamiento enzimático debe
ser tenido en cuenta en las diferentes industrias, sobre
todo en la alimenticia, debido a que las alteraciones en los
colores afecta el valor comercial de productos tales como
frutas, verduras e incluso crustáceos, asimismo como la
fabricación de vinos[1].
http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/enzimas/tirosinasa.html
(último acceso: 3 de Agosto de 2019)
[2] Horton R. H, Moran L. A, Scrimgeour K. G, Perry M. D, Rawn
J. D. Principios de Bioquímica (4ta Edición). México: Pearson
Educación; 2008.
[3] SCIENTIFIC AMERICAN, a Division of Springer Nature
America, Inc. Why do apple slices turn brown after being cut?
Scientific American. Jul 30, 2007. Disponible en :
https://www.scientificamerican.com/article/experts-why-cut-
apples-turn-brown/
[4] Morante C. J, Agnieszka O. A, Bru M. R, Carranza P. M, Pico
S. R, Nieto R. E. Distribución, localización e inhibidores de las
polifenol oxidasas en frutos y vegetales usados como alimento.
Disponible en :
http://www.uteq.edu.ec/revistacyt/publico/archivos/C2_Doc2.pdf
[5] Mckee T, Mckee J. R. Bioquímica, la base molecular de la vida
(3era Edición). Madrid:McGraw-Hill; 2003.
[6] Ramon J, Jose Neptuno Rodriguez Lopez J N, García Canovas
F. Efect of L-ascorbic acid on the monophenolase activity of
tyrosinase. Biochemical Journal. 1993; 295. Disponible
en:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1134854/pdf/
biochemj00102-0303.pdf (último acceso: 3 de Agosto de 2019)
[7] Guerrero Eraso C. A. Inhibición de la actividad enzimática de
la Polifenol Oxidasa extraída del Banano (Cavendish valery)
mediante sistemas bifásicos acuosos con Isoespintanol y ácido
ascórbico. Tesis para optar al título de Magíster en Ciencia y
Tecnología de Alimentos. Universidad Nacional de Colombia,
Sede Medellín; 2009.

5. CONCLUSIONES:

- La actividad catalítica se puede ver afectada por

factores como la temperatura y la presencia de
inhibidores. Para el primer caso, se produce un
aumento más o menos proporcional mientras que para
el segundo caso se disminuye considerablemente.
- La inhibición de una Enzima puede efectuarse a
través de diferentes mecanismos, ya sea por
competencia por el sitio activo de esta, o debido a que
la presencia del Inhibidor afecta la afinidad de los
Sustratos con la Enzima, generando muchas veces un
impedimento estérico.
- Los procesos a llevar a cabo para la obtención de un
extracto enzimático deben ser muy rigurosos y
meticulosos para que se conserve el poder catalítico
de las Enzimas que se busca estudiar.

6. REFERENCIAS:

[1] Calvo M. Universidad de Zaragoza. Disponible en:

4