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Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín

Facultad de Ciencias - Escuela de Química

Laboratorio de Bioquímica

Evaluación de la actividad catalítica de la Tirosinasa


procedente de papa, manzana y banano.
1
María Manuela Valderrama Hincapié; 2Alejandra Pérez Perea

Ingeniería Biológica, Ciencias, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín


1
mvalderramah@unal.edu.co; 2alperezp@unal.edu.co

RESUMEN: El pardeamiento enzimático es una reacción de oxidación, catalizada por la enzima conocida como
Tirosinasa. Este proceso supone un oscurecimiento en frutas, verduras y setas, mientras que en animales es responsable
de la formación de pigmentos en piel o pelo. Durante la práctica se evaluó la velocidad de reacción para comparar la
actividad enzimática de la Tirosinasa proveniente de banano, manzana y papa bajo diferentes condiciones, de esto se
pudo comprobar la temperatura estimula la actividad catalítica, mientras que el ácido ascórbico es un inhibidor de la
tirosinasa.

PALABRAS CLAVE: pardeamiento enzimático, tirosinasa, ácido ascórbico

Michaelis - Menten (Km), definida como la concentración de


1. INTRODUCCIÓN: el oscurecimiento de frutas, vegetales e sustrato cuando la velocidad incial es igual a la mitad de
incluso setas en presencia de oxígeno es debido a la acción de
la Tirosinasa sobre el aminoácido llamado Tirosina; para esto la velocidad máxima. Relacionando entonces, la
se produce una serie de reacciones que termina en Melanina, concentración inicial de sustrato con la velocidad de la
pigmento oscuro que produce el pardeamiento[1]. reacción[2].

Para obtener un extracto enzimático se requiere una secuencia


2. MATERIALES Y MÉTODOS:
de procedimientos que aseguren la conservación de la actividad
catalítica de la enzima: Ruptura mecánica por molido, Los materiales se enlistan a continuación:
autodigestión del material por otras enzimas de la misma
célula (autolisis), adición de la enzima lisozima, que ➔ Solución Buffer de Fosfato a 0.1M de pH 7,2 y 6,0
hidroliza el polisacárido mureína de la pared celular, ➔ Solución de L-DOPA (197.2 g/mol) 0.03M en
congelación y descongelación rápida, tratamiento con Buffer a pH = 6.0. (disuelta una cápsula de L-
ultrasonido, separación de residuos poco solubles por DOPA en 50 ml de buffer para que quede con una
filtración y centrifugación. concentración de 4mg mL o 30mM)
➔ Fuente de Tirosinasa: banano, manzana y papa
La cinética enzimática fue explicada en 1882 por Leonor
➔ Mortero para triturar el material vegetal
Michaelis y Maud Menten a partir de la constante de
➔ Fotocolorímetro
1
➔ Centrífuga
4 0,148 0,380 0,222
➔ Hielo picado
5 0,151 0,402 0,241
Para la preparación del extracto enzimático se peló la fruta
o tubérculo, cortándolo en pequeños trozos. Se tomaron 20 6 0,153 0,427 0,248
g y se le adicionaron 15 mL de Buffer de Fosfato de pH de
7 0,155 0,452 0,260
7,2 para triturarlo en un mortero previamente enfriado. Se
adiciona 15 mL más del Buffer. Para el caso del banano se 8 0,159 0,474 0,272
le agregó 45 mL, completando 60 mL.

Acto seguido, se filtró el extracto en una gasa para luego ser


llevado a la centrífuga en tubos de 15 mL a 2000 rpm
durante diez minutos.

Pasado este tiempo se recuperó el sobrenadante, para


disolverlo con solución de Buffer a 7,2 doblando su
volumen. La solución diluida se llevó a la nevera a 4º C.

Para medir la absorbancia se usó una longitud de onda de


420nm en el fotocolorímetro. Usando como blanco una
solución de: 1 mL del extracto enzimático, 3 mL de solución
de Buffer de pH 6 y 1 Ml de agua destilada. Se preparó, Gráfica 1. Absorbancia vs. tiempo
luego de tarar, el primer tubo así: 1 mL del extracto
enzimático, 3 mL de Buffer de pH 6 y 1 mL de DOPA, Con los valores de la pendiente de cada regresión se
inmediatamente después se tomaron las lecturas de determinó la actividad enzimática y velocidad de reacción
absorbancia cada minuto, hasta el minuto ocho. para cada extracto los cuales se muestran a continuación:

Un segundo tubo se preparó así: 1 mL de extracto Actividad enzimática


enzimático y 3 mL de solución de Buffer pH de 6,0. Se llevó Extracto de manzana: 0,004/min x mls de extracto
a un baño de agua hirviendo durante 5 minutos, se dejó Extracto de Banano: 0.0314/min x mls de extracto
enfriar a temperatura ambiente. Acto seguido se le agregó 1 Extracto de Papa: 0,0157/min x mls de extracto
mL de DOPA y se midieron las absorbancias cada minutos
hasta el minuto ocho. Velocidad de reacción
Extracto de manzana: 0,004/min x min
Por último, se utilizó 100 mg de ácido ascórbico como Extracto de Banano: 0.0314/min x min
inhibidor de la enzima; se preparó la solución así: 1mL de Extracto de Papa: 0,0157/min x min
extracto enzimático y 3 mL de Buffer de pH de 6.
Inmediatamente después de agregar DOPA se midieron las Estos datos se pueden traducir en la cantidad de
absorbancias cada minuto, hasta obtener nueve.
dopacromo que se va formando a medida que pasa el
tiempo en presencia de cierta cantidad de enzima
tirosinasa. La medida de la absorbancia a través del
3. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la reacción,
Tabla 1. Lectura de absorbancia en condiciones como expresa la siguiente ecuación:
normales
Tiempo Manzana Banano Papa
(min)
Ecuación 1. Velocidad de reacción de la tirosinasa
0 0,124 0,208 0,151

1 0,133 0,274 0,160 Al observar los resultados en las gráficas es evidente que
para todos los extractos la absorbancia aumento con el
2 0,140 0,312 0,185 paso del tiempo, sin embargo el extracto de banano lo hizo
con mayor velocidad de que los otros dos. El aumento en
3 0,143 0,347 0,209 la absorbancia indica que se esta formando Dopacromo

2
por la acción de la enzima tirosinasa, al ser esta una
8 0,159 0,167 0,076
sustancia de color café oscuro registra valores de
absorbancia cada vez más altos a medida que se oscurece,
es decir reacciona más L-dopa para convertirse en
dopacromo. La enzima tirosinasa es también conocida
como polifenol oxidasa (PPO)[3], es la responsable del
pardeamiento enzimático, como se mencionó
anteriormente; actúa sobre compuestos fenólicos
pertenecientes a diversas familias como ácidos fenólicos,
cumarinas, lignanos,entre otros que cumplen funciones
importantes en las plantas, como la protección frente a
radiación ultravioleta y frente a condiciones de estrés
biótico gracias a las propiedades antimicrobianas de los Gráfica 2. Absorbancia vs. Tiempo
propios compuestos fenólicos y mediante el sellado de
heridas; por lo tanto, el hecho de que en algunos frutos o ¿Qué explicación le puede dar a los resultados de
vegetales se de ese pardeamiento con mayor intensidad o actividad enzimática a partir de las regresiones
más rápido que en otros, como ocurrió en esta práctica, realizadas en las diferentes condiciones: Normal, cambio
puede ser consecuencia de los niveles y el tipo de de temperatura y presencia de un inhibidor?
compuestos fenólicos presentes que va relacionado con el Los resultados obtenidos corresponden con la teoría; se
perfil nutricional del alimento, ademá a pesar de que casi esperaba que con el aumento de temperatura se aumentará
todos los tejidos vegetales contienen PPO, sin embargo, a su vez la actividad catalítica de la enzima, debido a un
el nivel de actividad de PPO y la concentración de sustrato aumento en la cantidad de colisiones entre las moléculas
(aquí, los compuestos fenólicos) pueden variar entre las de la Enzima y el Sustrato, generando una la relación
variedades de frutas. la especie y el estado de maduración, directamente proporcional hasta la temperatura en la que
el nivel de accesibilidad del O₂ , la naturaleza de los la Enzima se desnaturaliza por su naturaleza proteica [5].
diferentes compuestos oxidables y la polimerización y Por otro lado, la presencia de ácido ascórbico, actuando
degradación de las o-quinonas[4]. como Inhibidor supone en este caso un impedimento
estérico para la conformación del complejo Enzima-
Además de evaluar la actividad de la enzima en función Sustrato, es decir, que este limita la afinidad entre Enzima
de la velocidad de reacción, otros factores como la y Sustrato, y así retarda la biosíntesis de melanina a partir
temperatura y presencia de inhibidores tienen efectos de DOPA[6].
importantes sobre su actividad catalítica. La siguiente
tabla muestra la información obtenida introducir estas Sin embargo, de la gráfica no es posible obtener
variables en el estudio. directamente mucha información sobre la actividad del
inhibidor.
Tabla 2. Lectura de absorbancia extracto de manzana
en diferentes condiciones %Inhibición = [1-(mi/mn)] x 100
Ecuación 2. `mn´ corresponde a la pendiente
Tiempo Normal Aumento de Presencia de
(min) temperatura inhibidor en condiciones normales y `mi´ es la
pendiente con inhibidor.
0 0,124 0,145 0,072
Empleando la ecuación (2) se obtuvo un dato
1 0,133 0,157 0,074 cuantificable.
2 0,140 0,158 0,075
%Inhibición= [1-(0,0001/0,004)]x1000= 39/40 x 100 =
3 0,143 0,160 0,076 97,5%

4 0,148 0,161 0,074 La acción de la enzima tirosinasa en presencia del ácido


ascórbico fue inhibida casi en su totalidad en comparación
5 0,151 0,162 0,074
con la actividad de la enzima en condiciones normales.
6 0,153 0,164 0,074 Por lo que se puede considerar un inhibidor efectivo de
PPOs, además de una buena alternativa para el uso de otro
7 0,155 0,165 0,075 inhibidores como sulfitos o sulfhidrilos, de los más

3
comunes utilizados para evitar el pardeamiento en frutos, http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/enzimas/tirosinasa.html
sobre todo en las industrias, ya que estos compuestos (último acceso: 3 de Agosto de 2019)
están sujetos a restricciones debido a que provocan
[2] Horton R. H, Moran L. A, Scrimgeour K. G, Perry M. D, Rawn
efectos adversos en la salud en personas sensibles[4]. J. D. Principios de Bioquímica (4ta Edición). México: Pearson
Educación; 2008.
¿Cómo inhibe el ácido ascórbico la reacción bioquímica
catalizada por la enzima tirosinasa? [3] SCIENTIFIC AMERICAN, a Division of Springer Nature
America, Inc. Why do apple slices turn brown after being cut?
Esto ha sido un tema ampliamente discutido que ha sido Scientific American. Jul 30, 2007. Disponible en :
comentado por diversos autores; hasta hace poco se creía https://www.scientificamerican.com/article/experts-why-cut-
que se debía a que afectaba ciertos estructuras que tenían apples-turn-brown/
presente el cobre, inhibiendo así, la actividad catalítica de
[4] Morante C. J, Agnieszka O. A, Bru M. R, Carranza P. M, Pico
la Enzima[6]. Otros autores más recientes, señalan que el
S. R, Nieto R. E. Distribución, localización e inhibidores de las
ácido ascórbico actúa como un agente reductor de las o- polifenol oxidasas en frutos y vegetales usados como alimento.
quinonas, producidas por la oxidación de los sustratos, a Disponible en :
o-difenoles no coleados, que son más estables; sin afectar http://www.uteq.edu.ec/revistacyt/publico/archivos/C2_Doc2.pdf
el sitio activo de la Tirosinasa[7].
[5] Mckee T, Mckee J. R. Bioquímica, la base molecular de la vida
(3era Edición). Madrid:McGraw-Hill; 2003.
Sin embargo también señalan que el ácido ascórbico
puede actuar como Inhibidor sólo en bajas [6] Ramon J, Jose Neptuno Rodriguez Lopez J N, García Canovas
concentraciones, debido a que la acumulación de estos F. Efect of L-ascorbic acid on the monophenolase activity of
tyrosinase. Biochemical Journal. 1993; 295. Disponible
difenoles puede reactivar indirectamente la vía
en:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1134854/pdf/
metabólica cuando este agente reductor ha sido gastado[7]. biochemj00102-0303.pdf (último acceso: 3 de Agosto de 2019)
Lo anterior debe ser tenido en consideración para la
elaboración de productos cosméticos. De igual manera, la [7] Guerrero Eraso C. A. Inhibición de la actividad enzimática de
melanina y en general el pardeamiento enzimático debe la Polifenol Oxidasa extraída del Banano (Cavendish valery)
mediante sistemas bifásicos acuosos con Isoespintanol y ácido
ser tenido en cuenta en las diferentes industrias, sobre ascórbico. Tesis para optar al título de Magíster en Ciencia y
todo en la alimenticia, debido a que las alteraciones en los Tecnología de Alimentos. Universidad Nacional de Colombia,
colores afecta el valor comercial de productos tales como Sede Medellín; 2009.
frutas, verduras e incluso crustáceos, asimismo como la
fabricación de vinos[1].

5. CONCLUSIONES:

- La actividad catalítica se puede ver afectada por


factores como la temperatura y la presencia de
inhibidores. Para el primer caso, se produce un
aumento más o menos proporcional mientras que para
el segundo caso se disminuye considerablemente.
- La inhibición de una Enzima puede efectuarse a
través de diferentes mecanismos, ya sea por
competencia por el sitio activo de esta, o debido a que
la presencia del Inhibidor afecta la afinidad de los
Sustratos con la Enzima, generando muchas veces un
impedimento estérico.
- Los procesos a llevar a cabo para la obtención de un
extracto enzimático deben ser muy rigurosos y
meticulosos para que se conserve el poder catalítico
de las Enzimas que se busca estudiar.

6. REFERENCIAS:

[1] Calvo M. Universidad de Zaragoza. Disponible en:


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