Revista Microbiologia 2016 PDF

ISSN 2415-251X
Clinica de Enfermedades Infecciosas

Hospital Roosevelt
Revista de microbiologia Volumen No. 1
Enero - Marzo 2016

Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
ISSN 2415-251X
Clinica de Enfermedades Infecciosas

Hospital Roosevelt
Revista de microbiologia Volumen No. 1
Enero - Marzo 2016
EDITOR DE LA REVISTA
Licda Maria Remey Gordillo

Coordinadora General Area de Microbiologia y Hospital Roosevelt
Dr. Carlos Mejía Villatoro

Jefe de la Clínica de Enfermedades Infecciosas
Hospital Roosevelt
CONTRIBUCIONES
Autores:
Licda Maria Remey Gordillo

Licda. Julia Mirelia Cali Arriaga
Licda. Jackelyn Paola Tol Urizar
Licda. Alejandra Castillo
Licda. Veronica Itzep
Licda. Rosa Alvarez
Licda. Diana Baldizòn
Licda. Margarita Boloix
Sr. Héctor Catú
Licda. Lis Jerez
Licda. Ana Lucía Lemus
DIAGRAMACIÓN Y DISEÑO
Mellross Elswith Salazar Alvarez
Editorial
La Microbiología Clínica tiene como objetivo principal establecer el agente causal de las infec-
ciones que afectan al hombre. El Diagnóstico debe ser certero y oportuno, capaz de dirigir un
tratamiento adecuado que conlleve a la recuperación del paciente. El logro del diagnóstico se
basa en la estandarización adecuada de los procedimientos y el conocimiento y uso adecuado
de diferentes tecnologías dirigidas al tipo de microorganismo sospechoso.
En respuesta a las diversas necesidades se tomó la iniciativa de actualizar a los profesionales de
diversas áreas de la salud, mediante la información de temas básicos a través de un Diplomado
de Microbiología Clínica en el cual se incluyeron temas de resistencia antimicrobiana, biología
molecular, diagnóstico y tratamiento de hongos sistémicos y tuberculosis con la participación de
conferencistas expertos en los temas.
Entre las actividades que se realizaron en el Diplomado se tuvieron:
1. Conferencias teóricas donde se presentaron y discutieron temas en aspectos generales y es-

pecíficos sobre diagnóstico, procedimientos estándar, tratamiento de infecciones causadas por
microorganismos bacterianos.
2. Investigación sobre un tema específico sobre resistencia antimicrobiana.
3. Elaboración y presentación de un manual de procedimientos estándar acorde a las necesi-

dades, capacidades y disponibilidad de recursos para el diagnóstico bacteriano microbiológico.
El Diplomado se desarrolló en el Hospital Roosevelt con el apoyo del Programa de Postgrado y

Maestría de la Unidad de Enfermedades Infecciosas que funciona en Hospital Roosevelt desde
el año 2004 y que es avalado por las autoridades docentes y administrativas del hospital Roose-
velt y de la Facultad de Medicina de la Universidad Francisco Marroquín. Tuvo una duración de
6 meses.
Los principales objetivos específicos que se deseaba alcanzar fueron:
1. Asistir y fortalecer los conocimientos de los laboratoristas y médicos de instituciones clínicas

públicas y privadas sobre los principios y la práctica del diagnóstico de microorganismos bacte-
rianos, pruebas y tratamiento antimicrobiano.
2. Conocer y aplicar los reportes de susceptibilidad correctos para guiar el tratamiento del pa-
ciente, logrando que los laboratorios radicados en distintos hospitales y a nivel comunitario sigan
con exactitud los mismos procedimientos de pruebas y de control de calidad.
3. Conocer y aplicar el manejo de bases de datos que permitan tener información que pueda
ser utilizada por especialistas en enfermedades infecciosas, epidemiólogos y otros funcionarios
responsables de la salud para establecer patrones de resistencia a agentes antimicrobianos,
promoviendo el tratamiento óptimo e implementando medidas para limitar la difusión de organis-
mos resistentes en los hospitales y la comunidad.
Al Diplomado se inscribieron un total de 67 personas, 42 profesionales, de los cuales 4 eran Mé-

dicos y 38 Químicos Biólogos, 20 eran estudiantes con pensum cerrado de la carrera de Química
Biológica y 4 técnicos de laboratorio clínico. Se retiraron 9 personas, quedando 58.
Dentro de la población de profesionales Químicos Biólogos se tuvo la participación de profesio-
nales que provenían de Quetzaltenango, Sololá, Chimaltenango, Antigua Guatemala, Amatitlán,
Mazatenango. El 21% de toda la población estaba trabajando en hospitales en la iniciativa pri-
vada.
De los 67 inscritos, completaron el diplomado 58 personas, 52 aprobaron el diplomado lo que

representó un 90% del total de asistentes, 6 no aprobaron, 10.3% y 9 se retiraron. El puntaje
más alto fue de 89 puntos y el más bajo de 61 puntos, con una media de 76 puntos. Únicamente
7 profesionales obtuvieron puntajes por encima de los 80 puntos. El porcentaje de asistencia
fue del 86% en los 10 módulos. El porcentaje de puntualidad fue del 48%.
El módulo que presentó mayor dificultad fue el de Resistencia Antimicrobiana, lo que se reflejó
en los puntajes obtenidos durante el segundo examen parcial que evaluó este módulo, única-
mente el 50% de la población aprobó. Debido a la dificultad se tomó la decisión para el II Diplo-
mado ampliar el módulo y reforzar los temas sobre resistencia.
En general se puede concluir con los resultados obtenidos que los temas tratados fueron correc-
tamente orientados y asimilados por los participantes. Y la elaboración de manuales contribuyó
a una mejor estandarización microbiológica en los lugares de trabajo de donde provenían los
profesionales que elaboraron los trabajos.
Los profesionales participantes completaron la asistencia a X módulos con diferentes temas mi-
crobiológicos y desarrollaron trabajos de investigación. La siguiente edición presenta los traba-
jos más importantes referentes a la información que proveen. Son el reflejo del esfuerzo de sus
realizadores para proporcionar información estandarizada de procedimientos diarios que son
básicos en el trabajo diario en Microbiología. Representan un importante aporte en los temas
desarrollados y son herramientas fundamentales para los laboratorios que trabajan Microbiolo-
gía.
Licda. Maria Remei Gordillo

Dr. Carlos Mejia Villatoro
Manual de tinciones en Microbiologia Clinica -1-1-
Introducción -1-1-
Generalidades -1-1-
Normas de seguridad en el laboratorio -1-1-

Preparación, fijación y coloración de frotes -2-2-
Tinciones en Microbiología Clínica -3-3-

Tinciones simples -3-3-
Tinción de Azul de Metileno de Loeffler -4-4-
Tinción de Azul de Lactofenol -4-4-
Tinción Naranja de Acridina -4-4-
Tinción de Negro de Clorazol -4-4-
KOH con Tinta Azul Parker -5-5-

Tinciones diferenciales -6-6-
Tinción de Gram -6-6-
Tinción de Wright -7-7-
Tinción de Giemsa -8-8-
Tinción de Ziehl-Neelsen -8-8-
Tinción de Kinyoun -10-10-
Tinción de Ziehl-Neelsen Modificado -11-11-
Tinción selectiva de esporas Wirtz-Conklin -11-11-
Tinción de Ácido Peryódico de Schiff (PAS) -12-12-

Tinciones especiales -13-13-

Tinta China -13-13-
Tinción de Auramina-Rodamina -13-13-
Tinción Blanco de Calcofluor -14-14-
Tinción de Gomori-Grocott -14-14-
Referencias -16-16-
Manual de Microbiologia -16-16-
Introducción -17-17-
Generalidades -17-17-
Normas Mínimas de Seguridad en el Laboratorio de Micro-

biología -16-16-
Organización de Área de Trabajo -16-17-
Generalidades de la Estructura Bacteriana -18-18-
Bacterias Gram positivo -18-18-
Bacterias Gram negativo -19-19-
Tinciones Básicas -19-19-
Tinción de Gram -19-19-
Principio -19-19-
Procedimiento de la Tinción de Gram -19-19-
Tinción Ziehl Neelsen -19-19-
Principio -19-19-
Procedimiento de Tinción de Ziehl Neelsen -20-20-
Tinción de Kinyoun -21-21-
Principio -21-21-
Procedimiento de Tinción Kinyoun -21-21-
-21-21-
Tinción Kinyoun Modificado
-21-21-
Principio
-21-21-
Procedimiento de Tinción Kinyoun Modificado
-21-21-
Observación en Fresco
-21-21-
Principio -21-21-
Procedimiento de Observación en Fresco -21-21-
Toma de Muestra y Procedimientos -21-21-
Orocultivo -21-21-
Propósito e importancia -21-22-
Recolección de la muestra y transporte -22-22-
Procedimiento -22-22-
Aislamiento Primario -22-22-
Identificación Streptococcus pyogenes -22-22-
Procedimiento -22-23-
Cultivo de Garganta Especial -23-23-
Propósito -23-23-
Recolección de Muestra y Transporte -24-24-
Toma de muestra para Corynebacterium diphteriae -24-24-
Toma de Muestra para Neisseria meningitidis y Bordetella -24-24-
pertussis -24-24-
Aislamiento primario -25-25-
Corynebacterium diphteriae -25-25-
Neisseria meningitidis -25-25-
Bordetella pertussis -25-25-
-25-25-
Identificación de principales Microorganismos
-25-25-
Corynebacterium diphtheriae
-25-25-
Neisseria Meningitidis
-25-25-
Bordetella pertussis
-25-25-
Hemocultivo y Mielocultivo -27-27-
Propósito -27-27-
Toma de muestra -27-27-
Procedimiento de incubación -27-28-
Identificación de principales microorganismos -28-29-
Líquido cefalorraquídeo y otros líquidos estériles -29-30-
Propósito -30-31-
Aislamiento Primario del Líquido Cefalorraquídeo u otros Lí-
quidos Estériles -31-a la-33-
Coprocultivo 33-34-
-34-34-
Propósito e Importancia
-34-34-
Salmonella sp
-34-34-
Shigella
-34-34-
Vibrio Cholerae
-34-34-
Procedimiento para aislar Salmonella sp, Shigella sp -35-36-
Procedimiento para aislamiento de Vibrio cholerae -35-36-
Identificación de principales Microorganismo -37-37-
Pruebas Bioquímicas -37-38-
Identificación de Salmonella sp -38-39-
Identificación de Shigella sp -39-40-
Identificación de Vibrio cholerae -40-41-
Urocultivo -41-41-
Recolección de la Muestra y Transporte -41-42-
Asilamiento primario -41-41-
Identificación de principales microorganismo -42-42-
Escherichia coli -42-43-
Klebsiela pneumoniae -43-43-
Klebsiella oxytoca -44-44-
Proteus mirabilis -44-44-
Pseudomonas aeruginosa -44-44-
Secreciones Varias -45-45-
-45-45-
Secreciones de heridas y abscesos
-45-45-
Propósito e importancia
-45-45-
Recolección de la muestra y transporte
-45-45-
Toma de muestra de Herida
-45-45-
Toma de muestra de Absceso -45-45-
Toma de muestra en quemaduras -45-45-
Toma de muestra de ojo -45-45-
Toma de muestra de Oído -45-45-
Esquema de identificación de Cocos Gram positivo -46-47-
Identificación de Gram negativo Fermentadores Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae -47-47-
Identificación de Gram Negativo no Fermentador Pseudo-
monas aeroginosa -47-47-
Secreción Vaginal -47-47-
Propósito -47-47-
-48-48-
Identificación de principales microorganismo
-48-48-
Identificación presuntiva de N. gonorrhoeae
-48-48-
Identificación de Gardnerella vaginalis
-49-49-
Identificación de Streptococcus agalactiae
-49-49-
Identificación de Candida albicans -49-49-
Esputo de cultivo bacteriano -49-49-
Propósito -50-50-
Realización del frote del Esputo -50-50-
Criterio de Murria -50-50-
Identificación de Principales Microorganismo -51-51-
Identificación de Streptococcus pneumoniae -51-51-
Identificación de Haemophilus influenzae -51-51-
Anexos -51-51-
Prueba de Catalasa -52-52-
Prueba de Coagulasa -53-53-
Prueba de Manitol Sal -53-53-
Prueba de DNasa -53-53-
Prueba de Novobiocina -53-53-
Prueba de Bacitracina A -54-54-
Prueba de PRY (pirrolidonilarilamidasa) -54-54-
Prueba de CAMP -54-54-
Prueba de Hidrólisis de Hipurato -54-54-
-55-55-
Bilis Esculina
-55-55-
Crecimiento de NaCl 6.5%
-56-56-
Prueba de Sensibilidad a Optoquina
-56-56-
Solubilidad en Bilis
-56-56-
Prueba de Satelitismo -56-56-
Factor de Crecimiento XV -56-56-
Bibliografía -57-a la -59
Manual de Procedimientos Tamizaje, Aislamiento,
Identificacion y Sensibilidad de Micobacterias -60-60-
Generalidades -61-61-
Tuberculosis pulmonar y tuberculosis extrapulmonar -61-62-
Niveles de laboratorio -62-62-
Nivel i -62-62-
Nivel ii -62-62-
Nivel iii -62-62-
Toma de muestra y procedimientos por tipo de muestra -63-63-
Muestras de orina -63-64-
Toma de muestra -64-64-
Chorro medio u orina al vuelo -64-64-
Sondas permanentes -64-64-
Punción o aspirado suprapúbico -64-64-
Catéter -64-64-
Procesamiento de la muestra -64-64-
Requerimientos e instrucciones especiales de muestra de orina -64-64-
Preparación de la muestra previo a la elaboración de frotes -64-64-
Muestras de sangre y médula ósea -64-64-
Medio de cultivo para aislamiento de micobacterias de muestras de -65-65-
sangre y médula ósea
-65-66-
Toma de muestra de sangre y médula ósea
-66-66-
Precauciones para el uso de los frascos
-67-67-
Tratamiento de la muestra en el laboratorio
-67-67-
Preparación de la muestra previo a la elaboración de frotes -67-67-
Muestras de líquido cefalorraquídeo, lavados y otros líquidos corporales -67-68-
Toma de muestra para líquido cefalorraquídeo -68-68-
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra -68-68-
Preparación de la muestra para la elaboración de frotes -68-68-
Muestras de heces -68-69-
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la Muestra de
heces -69-69-
Preparación de la muestra de heces para la elaboración de frotes -69-69-
Muestras de biopsias y secreciones varias -70-70-
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra -70-70-
Preparación de la muestra para la elaboración de frotes -70-70-
muestras de esputo -70-71-
toma de muestra. -71-71-
Procedimiento para obtención de la muestra. -71-71-
Procesamiento de la muestra de esputo --
Preparación y observación directa de una muestra 71-72-
Preparación de un extendido -73-73-
Procedimientos de tinción alcohol-ácido resistencia -73-73-
Coloración de ziehl-neelsen: -73-74-
Coloración de kinyoun: -74-74-
Interpretación e informe de baciloscopías -75-75-
Pruebas de tamizaje -75-75-
Prueba de lam -75-75-
Genexpert -76-76-
-76-77-
Cultivo de micobacterias en lowenstein jensen
-77-79-
Muestras
-80-80-
Métodos para decontaminación de muestras.
Método de n-acetil-l-cisteína-hidróxido de sodio (nalc-naoh)
-81-82-
Método del hidróxido de sodio -83-83-
Método del ácido oxálico -83- 84-
Método mycoprep bbl (método comercial) -85-85-
Inoculación de tubo bactec mgit 960 (indicador de crecimiento de micobac- -86-86-
terias). -86- 87-
Métodos de identificación -89-89-
Test de ácido nicotínico para tb bbl taxo (niacina) -89-92-
Tiras bbl taxo para prueba de nitritos -92-92-
Detección de antígeno mpt64 -92-93-
Identificación de especies comunes de micobacterias (genotype mycobac-
terium cm) -94-107-
Identificación de especies adicionales (genotype mycobacterium as) -108-113-
Identificación del complejo mycobacterium tuberculosis (genotype mtbc) -114-118-
Sensibilidad antibiótica -118-118-
Métodos de determinación de sensibilidad antifímica -119-119-
Método de las proporciones de canetii -119-125-
Método de pcr: identificación del complejo mycobacterium tuberculosis
(genotype® mtbdrplus) -125-131-
Método de sensibilidad antifímica por bactec mgit 960 sire kit -131-133-
Bibliografia -134-134-
Normas de Publicación -135-139-
MANUAL DE TINCIONES
EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
Julia Mirelia Cali Arriaga
Jackelyn Paola Tol Urizar
I. INTRODUCCIÓN
El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Microbiología,

con el fin de conocer todas las técnicas de tinciones que sirven de base en las identificaciones
bacterianas, a la vez se hace mención de las normas de bioseguridad útiles para mantener la se-
guridad dentro del laboratorio y de quienes laboran en el, así como también el procedimiento de
elaboración de frotes y fijación de los mismos. Además está elaborado de tal manera que sea apli-
cable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos del Laboratorio en Microbiología
II. GENERALIDADES 9. Conocer el manejo de todos los equipos y

reactivos a emplear antes de iniciar las activi-
A. Normas mínimas de seguridad dades o hacer uso de ellos. Si usted tiene al-
en el laboratorio de microbiología guna duda, diríjase al supervisor o encargado
del área.
1. Entrar al laboratorio en forma ordenada, 10. Mantener el área de trabajo ordenada, li-
dejar las carteras, libros y otros objetos per- bre de libros, cuadernos u objetos personales,
sonales en el lugar que se les indique para exceptuando aquellos equipos y materiales
tal fin. necesarios para la realización del trabajo.
2. Llevar puesta la bata de laboratorio en 11. Tener cuidado cuando manipule el meche-
todo momento. La misma debe permanecer ro. Nunca debe dejar éste desatendido.
completamente cerrada. 12. Regresar los reactivos y equipos emplea-
3. Limpiar y desinfectar las superficies de dos (microscopio, mechero, etc.), limpios y de
trabajo, antes de comenzar y al finalizar el manera ordenada a su respectivo lugar una
trabajo. vez finalizada la actividad. Reporte cualquier
4. Lavar las manos con agua y jabón antes daño de los mismos al supervisor.
de realizar las actividades programadas, an- 13. Colocar los materiales de vidrio contami-
tes de salir del laboratorio y siempre después nados en los recipientes dispuestos para tal
de manejar materiales que se sabe o se sos- fin. 14. No usar ningún reactivo que no esté
pecha que son contaminantes. debidamente identificado, verificar las etique-
5. Llevar un calzado apropiado, preferible- tas de los mismos y estar seguro de cómo em-
mente cerrado y de suela antideslizante en plearlo.
las áreas de laboratorio. 15. No devolver sustancias a sus envases ori-
6. Evitar llevar al laboratorio, accesorios que ginales.
podrían ser fuente de contaminación (por 16. Emplear pipeteador o bomba de vacio al
ejemplo joyas). medir líquidos. Está rigurosamente prohibido
7. Recoger el cabello largo. Evitar desplaza- pipetear con la boca.
mientos innecesarios, movimientos bruscos. 17. Realizar solamente aquellas actividades
Hablar sólo lo indispensable. programadas y asignadas, no llevar a cabo
8. No comer, beber, fumar, almacenar comi- experimentos actividades no autorizadas.
da, objetos personales o utensilios, aplicarse 18. Reportar inmediatamente cualquier acci-
cosméticos ni ponerse o quitarse lentes de dente al supervisor o encargado del área (de-
contacto en ningún área del laboratorio. rrame de material contaminado, heridas, que-
maduras, etc.), ninguno puede ser catalogado
. como menor.
Pág. 1
Si el cromóforo es un ión positivo el coloran-
te es de tipo básico, pero si la carga es ne-
19. Reducir al mínimo la formación de aeroso- gativa será de tipo ácido. La mayoría de las
les durante la realización de cualquier trabajo. bacterias son teñidas por colorantes básicos,
20. Extremar las precauciones cuando se que permeas la pared celular y se adhieren
utilicen agujas y jeringas para evitar la ino- por enlaces iónicos débiles a moléculas con
culación accidental y la generación de ae- cargas negativas de la célula bacteriana. La
rosoles durante su manipulación y desecho. tinción de las bacterias con azul de metileno,
21. Emplear técnicas asépticas para el manejo es un ejemplo de tinción simple que facilita la
de cultivos de microorganismos (OMS, 2005) . observación de forma, tamaño y arreglo de
las células (Aquiahuatl, Pérez, 2004).
B. Preparación, fijación y coloración
de frotes 1. Preparación de frote:
Debido al pequeño tamaño de la mayoría de a. Muestras sólidas

microorganismos, se requiere de un microsco-
pio óptico, ya sea de campo claro o de campo Tomar la muestra con un hisopo, de preferen-
oscuro para hacer la descripción morfológica cia que el material no sea algodón, puede ser
de éstos. El microscopio de uso más común es dacrón o alginato de calcio.
del de campo claro, en el que la observación
de células cicas es limitada debido a que las Rodar el hisopo con la muestra sobre una lá-
células son incoloras y permiten el paso de una mina portaobjetos limpia de manera que se
gran cantidad de luz (Aquiahuatl, Pérez, 2004). obtenga una preparación homogénea (mis-
mo grueso aproximado en toda la lámina) de
La observación de frotes teñidos es más reco- ésta forma los colorantes penetran de mane-
mendable. El frote se prepara haciendo una ra adecuada en las estructuras presentes en
extensión de los microorganismos sobre una la muestra.
superficie transparente, en la cual se fijan y ti-
ñen los microorganismos. De acuerdo al núme- Dejar secar al aire o secar aplicando calor
ro de soluciones colorantes y a los objetivos de suave debajo de la lámina portaobjetos sin
estudio se pueden realizar diferentes tipos de quemar la muestra (Gordillo, 2005).
tinciones como son: simples, diferenciales y es-
peciales (Aquiahuatl, Pérez, 2004). b. Muestras líquidas
Los frotes de cultivos líquidos se deberían fijar
con alcohol para evitar residuos del medio, que Tomar una pequeña porción del líquido ya
al quemarse darán interferencias en las obser- sea con pipeta pasteur estéril, asa en argolla
vaciones y los de colonias de medios sólidos flameada, asa estéril descartable. Colocar en
se fijan generalmente con calor. Después de la lámina, NO restregar la muestra.
la fijación, los frote son teñidos con diferentes
colorantes sintéticos derivados de anilina en su Dejar secar al aire o secar aplicando calor
mayoría (Aquiahuatl, Pérez, 2004). suave debajo de la lámina portaobjetos sin
quemar la muestra (Gordillo, 2005).
Los colorantes más utilizados son sales for- 1) Fijación del frote
madas por iones coloridos cargados co-
nocidos como cromóforos. Por ejemplo: Fijar los frotes de cultivos líquidos con dos
gotas de metanos o etanol absoluto y dejar
secar al aire (hacer esto en zonas alejadas
del mechero).
Pág. 2
Este es un colorante catiónico y se combi-
na fuertemente con los componentes celula-
Los frotes de cultivos sólidos, completamente res cargados negativamente, con los ácidos
secos se fijarán con calor. Para esto se debe nucléicos y los polisacáridos ácidos (Kone-
pasar la lámina rápidamente 2 – 3 veces en el man, Allen, Janda, Procop, Schreckenberger,
interior de la parte amarilla de la flama del me- Woods, 2008).
chero, evitando el sobrecalentamiento. Dejar
enfriar a hasta alcanzar temperatura ambien- b. Materiales y Reactivos
te (Aquiahuatl, Pérez, 2004). • Azul de metileno
• Alcohol etílico 95%
• Incinerador, mechero Bunsen o de alco-
hol
• Pinzas
• Portaobjetos
• Cultivos bacterianos de 24 horas o mues-
tra biológica
• Microscopio
• Aceite de inmersión
• Soporte de Tinciones
• Goteros
• Agua desmineralizada
• Cronómetro
c. Procedimiento
• Extender la muestra en un portaobjetos
limpio y fijar la muestra.
• Cubrir la extensión con azul de metileno
de Loeffler durante 1-2 minutos
• Retirar exceso de colorante y lavar con
abundante agua desmineralizada.
Figura 1. Preparación y fijación de frotes bacteria- • Dejar secar a temperatura ambiente.
nos a partir de cultivos sólidos y líquidos.
d. Resultados
III. TINCIONES EN MICROBIOLOGÍA
CLÍNICA
A. Tinciones simples
Son aquellas en donde se utiliza un solo colo-
rante, es simple y fácil su realización.
1. Tinción de Azul de Metileno de

Loeffler
a. Principio
Es una tinción simple utilizada para una gran Figura 2. Células epiteliales núcleos
variedad de microorganismos, sin embargo teñidos de azul oscuro y citoplasma
su uso es específico para detectar bacterias azul pálido, bacterias pequeñas azu-
en frotes de líquido cefalorraquídeo en casos les apenas visibles (100X).
de sospecha de meningitis bacteriana.
Pág. 3
d. Resultados
2. Tinción de Azul de Lactofenol
a. Principio
La tinción de Azul de lactofenol se emplea
para observar hongos. Es una tinción simple
(un sólo colorante) y como tal está basada en
la afinidad del colorante por componentes de
las células, en este caso por las estructuras
fúngicas.El azul de lactofenol tiene tres carac-
terísticas que lo hacen especial para obser-
var dichas estructuras en los hongos del tipo
moho obtenidos en los cultivos por aislamiento. Figura 3. Estructuras fúngicas de coloración azul.
El fenol destruye la flora acompañante (algu- 3. Tinción Naranja de Acridina

nas veces en los cultivos, juntos a los hongos
pueden crecer colonias de bacterias). El áci- a. Principio
do láctico conserva las estructuras fúngicas al El fluorocromo naranja de acridina se une al
crear, por decirlo de algún modo, una película ácido nucleído ya sea en su forma nativa o
que las protege provocado por un cambio de desnaturalizada. En algunas preparaciones
gradiente osmótico entre el interior y el exterior de naranja de acridina, el color de la fluores-
de dicha estructura. El azul de algodón tiene la cencia puede variar, dependiendo del pH y de
capacidad de adherirse a las hifas y conidios la concentración. A pH neutro las bacterias,
de los hongos microscópicos (García, Beltran, hongos y material celular se tiñen de naran-
Guzmán, León, Arredondo y Fonseca. 2001). ja rojizo, pero a pH ácido las bacterias y los
hongos mantienen su color naranja rojizo, pero
b. Materiales y Reactivos el material de fondo se tiñe de amarillo ver-
• Solución de azul de lactofenol doso. Se utiliza para la detección de hongos
• Cultivo a evaluar y bacterias en muestras clínicas principalmen-
• Asas te (Flores, Albarado, Thomas, Lobo. 2008).
• Portaobjetos
• Cubreobjetos b. Materiales y Reactivos
• Microscopio
• Solución de naranja de acridina 0.7% (na-
• Aceite de inmersión ranja de acridina doble sal, buffer de aceta-
• Mechero tos pH:4,0)
• Agua salina fisiológica •I ncinerador, mechero Bunsen o de alcohol
• Pinzas
c. Procedimiento • Portaobjetos
• Cultivos bacterianos de 24 horas o mues-
• Colocar una gota de agua salina fisiológica tra biológica
sobre el portaobjetos. • Microscopio de epifluorescencia
• Con el asa picar el cultivo y expandir por • Soporte de Tinciones
encima de la gota de agua salina fisiológica, • Goteros
hasta que no se seque. • Agua desmineralizada
• Después seca la muestra, tomar una gota • Cronómetro
de azul de lactofenol y se añade sobre la
muestra. c. Procedimiento
• Se cubre la muestra con el cubreobjetos • Se cubrir la lámina con la solución de
• Observar en el microscopio. naranja de acridina por dos minutos.
• Procurar que no queden burbujas de aire • Lavar con agua de chorro abundante.
en la preparación, ya que sino lo que se ob- • Dejar secar al aire para su posterior
servara mayoritariamente serán las burbu- observación
jas.
Pág. 4
aproximadamente por dos minutos.
• Observar al microscopio en los objetivos de
d. Resultados 10X y 40X.
Las láminas deben enfocarse utilizando un mi-
croscopio de epifluorescencia, utilizando filtro d. Resultados
azul o amarillo estándar. La coloración observada es negro con diferente
intensidad según el grosor de la quitina.
Figura 4. Tinción de ascosporas.

Figura 5. Examen directo con negro de clorazol se
4. Tinción de Negro de Clorazol observa parénquima y estructuras fúngicas de menos
tamaño e intensidad (40X).
a. Principio
El colorante negro de clorazol permite visualizar 5. KOH con Tinta Azul Parker
rápida y con claridad las estructuras fúngicas,
uniéndose a la quitina, sin embargo, debe te- a. Principio
nerse especial cuidado ya que el reactivo se de- La búsqueda de estructuras fúngicas utilizando
grada con la luz. Es ideal para coloraciones en hidróxido de potasio como
fresco y es necesario apoyarse en el hidróxido aclarante de la queratina es un método sencillo,
de potasio (KOH) para la eliminación de la que- pero este método clásico ha sido mejorado con
ratina presente en la muestra (Arreaza, 2008). el uso de tinta azul Parker lo cual colorea el fon-
do de la tinción con la estructura fúngica y las
b. Materiales y Reactivos contrasta para facilitar su visualización (Pérez,
• Negro de clorazol Weiss, Villanueva, s.f.).
• Dimetil sulfoxido (DMSO) b. Materiales y Reactivos
• KOH 40% • KOH/Tinta Parker relación 1.1
• Portaobjetos • Portaobjetos
• Cubreobjetos • Cubreobjetos
• Bisturí • Bisturí
• Muestra biológica • Muestra biológica
• Microscopio • Microscopio
• Goteros • Goteros
• Agua desmineralzada • Agua desmineralizada
• Cronómetro
c. Procedimiento
• Tomar una porción pequeña de la muestra c Procedimiento
(si es necesario triturar con un bisturí las es- • Tomar una porción pequeña de la muestra
camas) y colocar en un portaobjetos. (si es necesario triturar con un bisturí las es-
• Agregar una gota de la solución de negro de camas) y colocar en un portaobjetos.
clorazol. • Agregar una gota de KOH 20% preparado
• Colocar el material con una lámina cubre con tinta azul Parker.
objetos y dejar incorporarse en la muestra
Pág. 5
d. Resultados • Portaobjetos
• Cultivos bacterianos de 24 horas
• Palillos
• Microscopio
• Goteros
• Agua destilada
• Solución de cristal Violeta
• Lugol
• Safranina
Figura 6. Examen directo de piel con KOH 20% y tinta • Etanol 95%
azul Parker, hifas segmentadas y ramificadas dicotó- • Cronómetro
micamente
c. Procedimiento
B. Tinciones diferenciales
• Cubrir el frote con Cristal Violeta durante 3
min.
Son aquellas donde se utilizan dos o más co-
• Retirar el colorante mediante un suave la-
lorantes y en contaste permite la diferenciación
vado con agua, deslizando el agua sobre el
del microorganismo o la visualización de la es-
portaobjetos, para no desprender la muestra.
tructura deseada.
• Cubrir ahora con Lugol durante 1 min., rea-
lizar otro lavado suave. Todas las células se
1. Tinción de Gram
teñirán de violeta.
• Agregar unas gotas de etanol 95%, desli-
a. Principio
zándolo por el portaobjetos, hasta que las
De gran importancia en Microbiología porque
gotas que salen no tengan casi color. Las cé-
permite diferenciar dos grandes grupos de bac-
lulas gram- pierden el colorante violeta y que-
terias (gram positivo y gram negativo), según
darán incoloras. Las gram + seguirían violeta.
se comporten ante esta tinción. El fundamen-
• Añadir una el colorante safranina (colorante
to radica en la diferente estructura de la pared
de contraste) por 2 min.
celular de ambos grupos: las bacterias gram
• Lavar el colorante con agua. Este coloran-
positivo tienen una gruesa capa de peptidogli-
te sólo entrará en las bacterias gram –, que
cano en su pared, mientras que las bacterias
quedarán rojas. Las gram + seguirán violetas.
gram negativo tienen una capa de peptidogli-
• Secar las preparaciones sobre papel de fil-
cano más fina y una capa lipopolisacarídica
tro.
externa. Tras la tinción con el primer colorante
• Observarlas al microscopio utilizando el ob-
(Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol
jetivo de inmersión
que arrastrará al colorante sólo en las bacte-
rias gram negativo, mientras que en las bacte- d. Resultados
rias gram positivo el colorante queda retenido
y permanecerán azules. Las gram negativo se
teñirán después con un colorante de contras-
te (safranina) para que puedan observarse, de
color rosado al microscopio (López-Jácome y
otros, 2014).
b. Materiales y Reactivos
• Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
• Asa de Siembra en argolla Figura 7. Se observa cocos gram negativo de color rojo por la
safranina y bacilos gram positivo de color morado por el cristal
• Pinzas
violeta.
Pág. 6
bulos sanguíneos. El colorante deberá cubrir
completamente el portaobjetos, pero no debe
2. Tinción de Wright derramarse por los bordes. Deberá agregar-
a. Principio se una cantidad adicional si éste se comienza
Esta tinción tiene diversos usos en microbio- a evaporar.
logía; en la parasitología, se le emplea en la • Agregar directamente al colorante un volu-
búsqueda de hematozoarios como Plasmodium men igual de amortiguador de Wright, para
spp. El reactivo de Wright está compuesto por evitar la coloración débil. Esperar la forma-
eosina y azul de metileno, cuando éste se oxida ción de brillo metálico. Puede usarse de igual
se conoce como azur B a una concentración de manera agua desmineralizada. Dejar actuar
0.8 g/L empleando como solvente alcohol metí- de 10-15 minutos.
lico. La eosina es un colorante ácido que tiene • Lavar con agua en el chorro cuidadosamen-
afinidad por componentes alcalinos. La eosina Y te hasta que la extensión presente un aspec-
es la más utilizada en procedimientos rutinarios. to rosado al examinarlo a simple vista.
Es un compuesto ácido cuya propiedad está ba- • Limpiar el dorso del portaobjetos con una
sada en su polaridad negativa, lo que le permite gasa o algodón humedecido en alcohol para
enlazarse con constituyentes celulares de carga eliminar cualquier resto de colorante.
positiva; por esta razón, colorea componentes • Secar al aire y observar con el microscopio
citoplasmáticos y se les conoce como acidófilos. con el objetivo de inmersión
La tonalidad resultante de la tinción con eosina
es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo d. Resultados
intenso en el caso de los eritrocitos. El típico co- • Los eritrocitos se observarán de color na-
lor de los núcleos celulares, mayoritariamente ranja o rosado.
morado, se basa en la interacción molecular en- • El citoplasma de los monocitos presentarán
tre eosina y un complejo azul de metileno-DNA. una tonalidad azul grisácea con gránulo roji-
La intensidad de la coloración depende del con- zos bastante finos y sus vacuolas caracterís-
tenido de azur B y de la relación con la eosina ticas. El citoplasma de los linfocitos presenta-
amarilla (Ortega, Garibaldi. 2009) rá varias tonalidades azules.
• Los núcleos de los linfocitos y neutrófilos
b. Materiales y Reactivos aparecerán de color púrpura oscuro. Los nú-
• Alcohol 96% cleos de los monocitos de color púrpura algo
• Alcohol Metílico más claros (lila).
• Portaobjetos • Los gránulos de los eosinófilos son de color
• Wright-Giemsa Stain, Modified rojo-anaranjado intenso. Los gránulos de los
• Cubetas para tinción basófilos púrpura azulado muy oscuro. Los
• Pizetas con agua desmineralizada gránulos de los neutrófilos se aprecian de co-
• Toalla de papel lor lila, bastante finos.
• Guantes • Las plaquetas toman coloración violeta o
• Microscopio púrpura.
• Libreta
• Contador celular
• Cronómetro
c. Procedimiento
• Colocar el frote secado al aire sobre una
rejilla o cubeta de tinción con el frote hacia
arriba
Figura 8. Frote periférico con parásitos intracelulares, teñidos
• Cubrir completamente el portaobjetos con el de color violeta
colorante de Wright gota a gota.
• Dejarlo que permanezca en el frote aproxi-
madamente de 5-8 minutos, para fijar los gló-
Pág. 7
eliminar cualquier resto de colorante.
• Secar al aire y observar con el microscopio
3. Tinción de Giemsa con el objetivo de inmersión.
a. Principio d. Resultados
Es la segunda coloración en uso, luego de la • Los núcleos celulares se tornan violeta in-
tinción de Wright, y en importancia de las mez- tenso.
clas de Romanowsky. Es quizás la mejor mo- • Es frecuente encontrar en el método de
dificación de este tipo de coloraciones para Giemsa que la granulación eosinófila no
descubrir parásitos en la sangre, como en el presenta la tonalidad rojo-anaranjada ca-
caso de malaria (Plasmodium spp.) y tripano- racterística sino que presenta una tonalidad
somiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de pardo rojizo. Esta dificultad puede prevenir-
Giemsa también da excelentes resultados para se añadiendo una gota de fucsina fenicada
la tinción rutinaria de frotes sanguíneos. Cuan- por cada 10ml de alcohol metílico utilizado.
do se va a teñir con este colorante, debe fijarse • Las granulaciones neutrófilas (lila) y los
primero la muestra con metanol absoluto por un hematíes (rojo pálido) se tiñen mal; sin
tiempo mínimo de tres minutos (cuando la pre- embargo, esta coloración permite diferen-
paración no incluye metanol). El colorante en ciar algunas formas de metamielocitos que
solución nunca se utiliza de manera directa, por pueden ser confundidos con los monocitos,
lo que se debe diluir con la solución amortigua- pues el protoplasma de los monocitos que-
dora en una proporción de 1:10 ó 1:20 y el tiem- da de color azulado y el de los metamieloci-
po de coloración podrá ser de 10 ó 20 minutos, tos de color rosa.
respectivamente (Ortega, Garibaldi. 2009). • El citoplasma de los linfocitos presenta
una tonalidad azul definida y sus núcleos
b. Materiales y Reactivos violetas de intensidad variable.
• Los gránulos basófilos y las plaquetas se
• Colorante de Giemsa (constituido por una tiñen de color azul, no obstante éstas últi-
mezcla de azul de metileno, eosina y varios mas presentan corpúsculos violetas inter-
azures en dilución acuosa). nos.
• Pinzas
• Portaobjetos
• Muestra biológica
• Microscopio
• Goteros
• Cronómetro
Figura 9. Frote periférico con células sanguíneas de
c. Procedimiento color violeta y eritrocitos de color rosado a rojo.
• Sumergir el frote verticalmente en una solu-
ción de Giemsa preparada temporalmente a 4. Tinción de Ziehl-Neelsen
partir de 1 volumen de la solución colorante
más 9 volúmenes de solución tampón (pBs, a. Principio
pH 6.8) o bien en agua desmineralizada. La tinción de Ziehl-Neelsen (Z-N) fue desarrolla-
• Esperar durante 10-20 minutos. da inicialmente por Paul Ehrlich para poner de
• Lavar el frote con abundante agua, directa- manifiesto la presencia de los bacilos causan-
mente del chorro. tes de la tuberculosis en muestras clínicas de
• Limpiar el dorso del portaobjetos con una pacientes. Esta técnica es capaz de diferenciar
gasa o algodón humedecido en alcohol para los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).
Pág. 8
do con fucsina básica fenicada recién filtrada.
Dispensar el colorante con suavidad, sin sal-
La técnica de Z-N fuerza la penetración de la picar y sin tocar con el gotero o con el embu-
fucsina básica en la pared celular mediante la do los extendidos.
acción combinada del fenol y el calor, que au- • Con la llama de un hisopo embebido en
mentan la fluidez de la capa de ácidos micóli- alcohol calentar suavemente por debajo de
cos: el calor “derrite” el componente ceroso y el los extendidos, con movimientos de vaivén,
fenol actúa a modo de disolvente, permitiendo el hasta que observe que se desprenden los
paso del colorante básico que se une a los áci- primeros vapores blancos. No calentar con
dos micólicos con carga negativa. Cuando cesa mechero.
la aplicación de calor y/o se elimina el exceso • En caso de derrame del colorante, reponer
de fenol mediante un lavado con agua, la pared la fucsina, no dejar secar el preparado.
recupera su consistencia cerosa, pero las molé- • En el término de aproximadamente cinco
culas de fucsina quedan atrapadas en su espe- minutos calentar tres veces hasta emisión de
sor. Con la coloración de Z-N se observan como vapores; esto es suficiente para que la fucsi-
bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo na penetre adecuadamente en el bacilo y se
fucsia, destacándose claramente contra el fon- fije a sus lípidos. No hervir la fucsina porque
do azul (López y otros, 2014). la pared de los bacilos puede destruirse y co-
lorearse mal.
b. Materiales y Reactivos • Con una pinza, levantar cuidadosamente la
• Azul de metileno lámina portaobjetos desde el extremo más
• Alcohol ácido cercano al operador. Enjuagar con abundan-
• Fucsina te agua a baja presión, con un frasco o un
• Mechero grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la
• Portaobjetos superficie eliminando totalmente la solución
• Cubetas para tinción de fucsina. Girar el extendido y lavar con cui-
• Pizetas con agua destilada dado también la parte posterior.
• Toalla de papel • Inclinar el portaobjetos para eliminar el ex-
• Guantes ceso de agua y así evitar diluir los reactivos
• Microscopio que se utilizarán a continuación.
• Libreta
• Cronómetro 2) Decoloración
• Cubrir la totalidad del extendido con solu-
c. Procedimiento ción decolorante y dejar actuar aproximada-
mente 3 minutos.
1) Coloración • Enjuagar con abundante agua a baja pre-
• Disponer dos varillas de vidrio en forma pa- sión.
ralela, a una distancia de aproximadamente • Verificar que el extendido se ha decolora-
5 cm entre una y otra, una sobre un soporte do (las partes más gruesas del extendido a lo
dentro del lavabo/pileta de coloración. sumo conservan un leve tinte rosado). Si se
• Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para observan cúmulos rojos o coloración rosada
las tinciones a realizar en la jornada. Si el nú- intensa, volver a cubrir con solución decolo-
mero de baciloscopia a colorear es pequeño, rante, dejarla actuar entre uno y tres minutos
se puede filtrar la fucsina directamente cuan- y enjuagar nuevamente.
do se la deposita sobre el extendido a través • Eliminar el exceso de agua inclinando el
de un pequeño embudo con papel de filtro. portaobjetos
• Colocar sobre el soporte las láminas fijadas 3) Coloración de fondo
conservando el orden numérico con el exten- • Cubrir todo el extendido con solución de
dido hacia arriba y manteniendo una separa- azul de metileno.
ción de al menos 1cm entre ellas. • Dejar actuar durante un minuto.
• Cubrir totalmente la superficie del extendi-
Pág. 09
croscopio, un manchado diapositivas Kinyoun
mostrará bacilos como organismos rojos y no
• Enjuagar las láminas en ambas caras con ácido-rápido como el azul. Se basa en el com-
agua a baja presión y limpiar parte inferior portamiento ácido-resistente de la cubierta de
con un algodón si ha quedado coloreada. algunos parásitos como Isospora y Cryptospo-
• Observar si las láminas conservan la nu- ridium, los cuales se tiñen de rojo y destacan
meración clara y visible. Si no es así volver a sobre un fondo verde o azul, dependiendo del
numerarlas. colorante de contraste usado (Ortigoza Gutie-
•Dejar secar las láminas a temperatura am- rrez, y Cruz Aguilar, s.f.).
biente, apoyándolas en posición vertical en
un soporte sobre un papel absorbente. No b. Materiales y Reactivos
apoyar papel absorbente sobre el extendido.. • Fucsina fenicada
• Verde de malaquita o Azul de metileno
d. Resultados • Alcohol metílico
• Alcohol etílico
• Alcohol ácido
• Portaobjetos
• Puente de tinción
• Microscopio
c Procedimiento
• Realizar un frote de la muestra.
• Dejar secar perfectamente.
• Cubrir las gotas con unas gotas de alcohol
metílico y dejar que seque.
• Cubrir la preparación con fucsina fenicada
durante 5 mins.
• Lavar con alcohol ácido durante 3 min.
Figura 10. Se observa las bacterias alcohol ácido re- • Enjuagar con agua corriente
sistentes (BAAR) de color rojo fucsia y el resto de mi- • Coloración de contraste, agregar verde de
croorganismos y demás componentes del campo de
malaquita o azul de metileno dejar actuar du-
color azul.
rante 1 min.
• Lavar con agua corriente y dejar secar.
5. Tinción de Kinyoun
• Observar con objetivo de inmersión.
a. Principio
d. Resultados
El Kinyoun mancha es un método para teñir mi-
croorganismos resistentes a los ácidos, es-
pecíficamente Mycobacterium y Nocardia. El
procedimiento para la coloración de Kinyoun
es similar a la tinción de Ziehl-Neelsen, pero
no implica el calentamiento de las diapositivas
siendo stained.1 El método de tinción de Kin-
youn utiliza carbolfucsina como una mancha
principal, seguido de decoloración con una so-
lución de ácido-alcohol y azul de metileno como
Figura 11. Se observan los BAAR de color rojo, las
contrateñir. Kinyoun carbolfuschsin tiene una demás estructuras se tiñen del color del colorante de
mayor concentración de fenol y fucsina básica contraste en este caso verde de malaquita.
y no requiere de calefacción con el fin de man-
char properly.1 Cuando se observa bajo un mi-
Pág. 10
• Cubrir la lámina con colorante azul de meti-
leno por 30 segundos.
6. Tinción de Ziehl-Neelsen Modificado • Lavar el exceso de colorante con abundante
agua del chorro.
a. Principio • Dejar secar a temperatura ambiente y ob-
Esta tinción es útil para visualizar quistes de servar al microscopio.
protozoos intestinales que tienen la propiedad
de ser ácido-alcohol resistente (AAR). Cryptos- d. Resultados
poridium, Cyclospora e Isospora suelen produ-
cir diarrea persistente, sobre todo en pacientes
inmunocomprometidos o con infección por el
VIH.
La técnica de Ziehl-Neelsen modificado fuerza

la penetración de la fucsina fenicada en la pa-
red celular mediante la acción combinada del
fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la
capa de ácidos micólicos. Con el lavado con
agua, la pared recupera su consistencia cero-
Figura 12. Se observa Quistes de Cryptosporidium
sa, pero el colorante fucsina queda dentro del (AAR) de color rojo fucsia con contraste azul en el fon-
parásito y este se destaca en contraste al fondo do.
azul (EHAS, 2012).
7. Tinción selectiva de esporas Wirtz-
b. Materiales y Reactivos Conklin
• Carbol fucsina (fucsina fenicada)
• Azul de metileno a. Principio
• Alcohol-Ácido La producción de endosporas bacterianas es
• Mechero una forma de resistencia de algunos géneros de
• Portaobjetos bacterias gram positivas, debido a la ubicación
• Cubetas para tinción intracelular las esporas no se tiñen convencio-
• Pizetas con agua destilada nalmente. Por esta razón se utiliza la tinción de
• Toalla de papel Wirtz-Conklin , en donde los microorganismos
• Guantes son teñidos en caliente con el colorante verde
• Microscopio de malaquita y que el calor aumenta la permea-
• Libreta bilidad de la membrana bacteriana y de la espo-
• Cronómetro ra, posterior a esto se realiza una decoloración
a través del lavado con abundante agua y los
c. Procedimiento extremos de la bacteria son teñidos posterior-
• En una lámina portaobjetos hacer un exten- mente con el colorante de contraste safranina
dido delgado de la muestra de heces, dejar (Vázquez, Martín, Siloniz, Serrano, 2010).
secar a temperatura ambiente y fijar la mues-
tra con calor pasando dos o tres veces por b. Materiales y Reactivos
mechero. • Verde de malaquita
• Cubrir la lámina con colorante carbol fucsina • Safranina
y aplicar calor hasta la emisión de vapores • Etanol 95%
y mantener por 5 minutos, evitando la ebulli- •Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
ción del colorante. •Pinzas
• Lavar el exceso con agua del chorro. • Portaobjetos
• Decolorar con alcohol-ácido durante 20-30 • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra
segundos. biológica
• Lavar con abundante agua del chorro. • Microscopio
Pág. 11
tinción es un método químico muy utilizado en
histología y permite la detección de hongos en
• Aceite de inmersión muestras de tejidos (Pontón, Llovo, 2007).
• Goteros b. Materiales y Reactivos
• Agua desmineralizada • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
• Cronómetro • Pinzas
• Portaobjetos
c. Procedimiento • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra
• Fijar la muestra en una lámina portaobjetos. biológica
• Cubrir la lámina con colorante verde de • Microscopio
malaquita y aplicar calor hasta la emisión de • Aceite de inmersión
vapores y mantener por 5 minutos. • Soporte de Tinciones
• Lavar el exceso con agua del chorro. • Goteros
• Cubrir con la lámina con colorante safrani- • Agua desmineralizada
na por 1 minuto. • Cronómetro
• Lavar el exceso de colorante con abundan- • Ácido periódico
te agua del chorro. • Reactivo de Schiff
• Dejar secar a temperatura ambiente y ob-
servar al microscopio. c. Procedimiento
• Cubrir el material fijado en la lámina con
d. Resultados acido peryodico al 0,5% durante 5 minutos.
• Lavar con agua destilada.
• Agregar el reactivo de Schiff. 20 minutos.
• Lavar con agua del chorro.
• Dejar secar al aire para su posterior obser-
vación
d. Resultados
Figura 13. Tinción de esporas en Bacillus subtilis, la

flecha indica la espora teñida en verde. Microscopia
de campo claro 100X.
8. Tinción de Ácido Peryódico de Schi-

ff (PAS) Figura 14. Se observa dentro del tejido, la presencia
de levaduras de Candida spp.
a. Principio
Se realiza un tratamiento al material con ácido C. Tinciones Especiales
periyódico 0,5%, el cual oxida los 1,2-glicoles Se basan en el hecho que distintas estructuras
formándose grupos aldehídos en los glucanos y celulares tienen distinta composición química,
mananos de las paredes celulares de hongos, de modo que se tiñen selectivamente con cier-
con el reactivo de Schiff (preparación de fucsina tos colorantes.
básica y metabisulfito de sodio) los aldehídos
reaccionan dando un color rojo luminoso. Esta
Pág. 12
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
1. Tinta China • Pipeta
a. Principio
Fue desarrollada originalmente para micros- c. Procedimiento
copia de luz con el fin de rodear y delinear las • En una lámina portaobjetos colocar una
bacterias no teñidas u otros materiales biológi- gota de la tinta china.
cos. Utilizamos diferentes métodos para evaluar • Esterilizar el asa y tomar una muestra de
estructuras individuales, tan pequeñas como las cultivo del hongo o en el caso de la muestra
vesículas sinápticas e incluso de gran tamaño, de LCR colocar con una pipeta una gota so-
como los microorganismos unicelulares. Este bre la tinta.
método es muy útil, aunque está limitado por la • Con el cubreobjetos mezclar la tinta con la
presencia de un fondo oscuro que no permitirá muestra
la correcta identificación de forma nítida y deta- • Colocar el cubreobjetos sobre la prepara-
llada de los componentes de dichas estructuras. ción
• Observar la placa en el microscopio a 40x
En microbiología, la tinción de Tinta China pro- y 10x
porciona un resultado presuntivo de la presen-
cia de Cryptococcus neoformans, microorga- d. Resultados
nismo causante de meningitis en pacientes con
inmunosupresión, siendo la técnica más utiliza-
da para poner de manifiesto su cápsula. Este
hongo presenta dos formas durante su ciclo vi-
tal: una forma asexual y una forma sexual; en la
primera se presenta como levaduras encapsu-
ladas que se reproducen por gemación y puede
ser visualizada por medio de la tinta china. El
principio es simple, ya que sólo se requiere de-
positar una gota de la muestra clínica sobre un
portaobjetos, posteriormente se coloca el colo-
rante y se observa al microscopio sin necesidad Figura 15. Se observa levaduras capsuladas de C.
de fijación, algunas estructuras difundirán el co- neoformans 40X.
lorante y otras no, lo que permitirá un contraste
de las estructuras observadas. Se han utilizado 2. Tinción de Auramina-Rodamina
diferentes colorantes: uno de ellos es la men-
cionada tinta china, la cual tiñe el fondo de la a. Principio
muestra de un color oscuro y la cápsula del C. Los ácidos micólicos de las paredes celulares
neoformans permanece sin teñir. La principal de las micobacterias poseen afinidad para los
dificultad con la tinción negativa es que los mi- fluorocromos auramina y rodamina. Estos colo-
croorganismos tienden a contraerse durante el rantes se fijan a las bacterias, que aparecen de
periodo de secado; para evitarlo, se ha optado color amarillo o naranja brillante contra un fondo
por usar la tinción negativa húmeda, en la cual verdoso. El permanganato de potasio, empleado
los organismos se suspenden en una película como contraste, evita la fluorescencia inespecí-
de tinta china o mancha oscura y el contorno de fica. Todos los microorganismos ácido-alcohol
la cápsula puede ser observado sin el peligro de resistentes, incluyendo los esporozoarios pará-
contracción (López-Jácome y otros, 2014). sitos, se tiñen con estos colorantes. Un aspecto
importante de la coloración rodamina-auramiria
b. Materiales y Reactivos es que luego los frote pueden ser reteñidos con
• Asa la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun direc-
• Tinta China tamente sobre la tinción con el fluorocromo, si
• Mechero se elimina antes el aceite de inmersión.
Pág. 13
carinii. Maeda & Ishida en 1967, describieron
De esta forma, los resultados positivos pueden que este blanqueador de algodón fluorescente,
ser confirmados con las coloraciones tradicio- podía teñir hongos al exponerlo a la luz UV. Ha-
nales, que además permiten la diferenciación geage y Harrington lo utilizaron para la tinción de
morfológica (García, Beltran, Guzmán, León, tejidos fijados en parafina, logrando identificar
Arredondo y Fonseca. 2001). hifas y esporas. La tinción se basa en la capa-
cidad del blanco de calcoflúor para unirse a los
b. Materiales y Reactivos ß 1-3, ß 1-4 polisacáridos (celulosa y quitina) de
• Microscopio de flourescencia la pared fúngica, y en que el compuesto exhibe
• Fluorocromos: auromina, rodamina fluorescencia cuando se expone a luz ultravio-
• Solución decolorante leta, permitiendo delinear claramente elemen-
• Permanganato de potasio (contraste) tos fúngicos. Al igual que en un examen directo
• Glicerol se observarán hifas anchas, no septadas, con
• Fenol ramificaciones en ángulo recto. Se puede uti-
• Agua desmineralizada lizar en tejidos frescos y/o congelados, fijados
• Portaobjetos en parafina y en cultivos puros. Este método
• Cubreobjetos no sirve para teñir bacterias. Otros elementos
• Mechero como por ejemplo fibras vegetales (algodón)
que pudieran teñirse, deben diferenciarse cui-
c. Procedimiento dadosamente por la morfología. Para realizar
• Fijar el frote al calor, en un mechero esta tinción, el tejido debe ser tratado con KOH
• Teñir el frote 15 minutos con los fluorocro- al 10% e igual proporción de solución de calco-
mos auramina-rodamina flúor al 0,05%. Para examinar el extendido se
• Aclarar con agua. requiere un microscopio de fluorescencia. Las
• Coloración de contraste con permanganato estructuras fúngicas se observarán verde claro
de potasio durante 3 minutos
• Aclarar con agua destilada o azul, dependiendo del filtro UV que se utilice
• Lavar con agua y dejar secar al ambiente (Ortigoza Gutierrez y Cruz Aguilar, s.f.).
d. Resultados b. Materiales y Reactivos

• Fenol
• Ácido láctico y azul de algodón
• Fucsina acida
• Rojo allura
• Azul brillante
• Colorante vegetal
• Ácido acético
• Glicerina
c. Procedimiento
• El tejido a evaluar debe ser tratado con KOH
al 10% e igual proporción de solución de cal-
Figura 16. Las bacterias alcohol ácido resistentes se coflúor al 0,05%.
observan en el microscopio de flourescencia (luz ultra- • Para examinar el extendido se requiere un
violeta) como bacterias de color amarillo anaranjado so- microscopio de fluorescencia.
bre un fondo oscuro. • Colocar en un portaobjetos la muestra
• Agregar una gota de KOH dimetil sulfóxido y
3. Tinción Blanco de Calcofluor una gota de calcofluor
• Mezclar, colocar el cubreobjetos
a. Principio • Después de hacer ocurrido la clarificación,
Es un método de tinción fluorescente para la observar con el microscopio de flourescencia
detección de hongos incluyendo Pneumocystis (verde brillante o blanco azulado).
Pág. 14
c. Procedimiento
• Cubrir la muestra fijada en el portaobjetos
d. Resultados con la solución de ácido crómico al 10% du-
Las fibras elásticas y colágeno se observan con rante 10 minutos.
fluorescencia amarillo verdosa, estas se pue- • Lavar con abundante agua desmineralizada.
den confundir con hongos y levaduras, se dife- • Cubrir con la solución de metabisulfato sódi-
rencian en la fluorescencia. co 1% durante 1 minuto.
• Lavar con abundante agua desmineralizada.
• Introducir la lámina en un recipiente con la
solución de metenamina-nitrato de plata, di-
cha solución debió ser previamente calentada
en baño de maría a 800C por 6 minutos, Una
vez introducida la lámina se debe mantener
las condiciones durante 5 minutos más hasta
observar el cambio de color en solución de
marrón a negro.
Figura 17. Se observarán hifas anchas, no septadas, con
• Lavar con abundante agua desmineralizada.
ramificaciones en ángulo recto con fluorescencia blanca.
• Cubrir el portaobjetos con la solución de clo-
ruro de oro 1% de 2 a 5 segundos y lavar con
4. Tinción de Gomori-Grocott agua desmineralizada.
• Cubrir el portaobjetos con la solución verde
a. Principio brillante 0.2% en ácido acético glacial durante
Es una coloración especial para hongos, la co- 1 minuto.
loración está basada en la presencia de ácido • Lavar con abundante agua desmineralizada
crómico, los grupos hidroxilo de los polisacári- y dejar secar a temperatura ambiente.
dos de la pared celular de los hongos son oxi-
dados a aldehídos y estos a su vez reducen el d. Resultados
complejo nitrato-plata metenamina producien-
do la coloración café o negra. Utiliza un buffer
(bisulfito de sodio) y también un colorante de
contraste (cloruro de oro) y uno de fondo (verde
brillante) (Pontón, Llovo, 2007).
b. Materiales y Reactivos
• Ácido crómico
• Bisulfito de sodio
• Metenamina.-nitrato de plata
• Cloruro de oro
• Verde brillante
• Pinzas Figura 18. Se observa levaduras de C. neoformans
• Portaobjetos 100X
• Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra
biológica IV. Referencias
• Microscopio
• Aceite de inmersión A. Aquiahuatl., M. Pérez., M. (2004) Manual de
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vestigación y Atención a Quemados (CENIAQ),
Instituto Nacional de Rehabilitación. Ciudad de
México, DF. Vol. 3 (1). pp 10-18.
Pág. 16
MANUAL DE MICROBIOLOGIA
Alejandra Castillo
Veronica Itzep
1 Introducción tes.
- El personal de laboratorio debe utilizar equi-
Las enfermedades infecciosas constituyen un po de protección apropiados (lentes, mascarilla)
problema de salud pública cada vez en aumen- para evitar en lo posible aerosoles o salpicadu-
to generando costos altos para su tratamiento, ras de las muestras. Las muestra que se deben
esto se ha debido al uso indiscriminado de an- centrifugar debe ser tapadas previamente, al
tibióticos generando la desimanación de bac- destapar algún tubo usar gasas para evitar los
terias multiresistente en el ámbito hospitalario aerosoles.
o comunitario, dificultando el adecuado trata- - Desinfectar las mesas de trabajo antes y des-
miento. pués del manejo de material infeccioso, con al-
Los pacientes hospitalizados como no hospita- cohol al 70% o hipoclorito de sodio.
lizados presentan una variedad de sintomato- - Recipientes adecuados para desechos de ma-
logías, poniendo en evidencia el tipo de enfer- teriales como placas, tubos, muestras clínicas.
medad pero en otros casos dificulta al médico
poder diagnosticar, por lo recurren al laboratorio
El personal de laboratorio debe utilizar equipo
de microbiología para poder obtener diagnósti- de protección como, bata, lentes, mascarillas y
cos certeros y poder tratar al paciente efectiva-guantes.
mente. Al momento de toma de muestras se debe tener
El objetivo del presente manual es poder utili- en cuenta las siguientes instrucciones:
zarlo como una guía de procesos facilitando el - Verificar que el área de trabajo esté limpia
diagnostico de algunas enfermedades infeccio- - Contar con todo los materiales adecuados para
sas frecuentes, describiendo los procedimientos la toma de muestras como, medios de transpor-
de aislamiento como las técnicas presuntivas y te, hisopos, lancetas, portaobjetos, jeringas,
confirmatorias de identificación. solución salina, alcohol al 70%, torniquetes, ga-
sas, frascos estériles, bajalengua, etc.
2 Generalidades - Identificar al paciente, verificar si esta con tra-
2.1 Normas Mínimas de Seguridad en tamiento de antibiótico, revisar el área de toma
el Laboratorio de Microbiología de muestra o qué tipo de prueba solicitan el mé-
dico. Apuntando las anotaciones.
La bioseguridad se refiere a los procesos de - Previo a la toma de muestra verificar y preparar
manejo de los agentes infecciosos para evitar el material adecuado para la toma de muestra.
o proteger al personal de laboratorio, al medio - Rotular los materiales a utilizar
ambiente y a paciente de un riego biológico. El - Lavarse las manos antes del proceso y usar
manejo de microorganismos dentro del laborato- guantes limpios
rio debe realizarse con mucha precaución para - Realizar la toma de muestra según el procedi-
evitar infecciones accidentales. Debe tenerse miento adecuado.
en cuenta las siguientes indicaciones para el
manejo de muestras microbiológicas: 2.2 Organización de Área de Trabajo
- Acceso limitado al área de trabajo,
- Lavar las manos, antes y después del manejar El mobiliario debe ser fuerte y resistente. Los
material infeccioso con jabón germicida o con espacios entre mesas, cabinas y equipo han de
alcohol a 70% en caso de manejo de microor- ser de fácil acceso para la limpieza.
ganismos gram positivo.
- No comer, ni beber alimentos dentro del área - Contar con una campana microbiológica tipo
de trabajo. No fumar. I o II.
- Utilizar descartador para objetos punzocortan-
Pág. 17
Membrana Citoplásmica: localizada por debajo
de la pared celular, que está formada por una
- Contar con asa calibrada de 0.001, asa en ar- bicapa de fosfolípido integral y proteínas peri-
golla y asa en punta. Para Micología asa en L, féricas empotradas. La membrana citoplásmica
pinzas. cumple la función de barrera osmótica, tienen
- La superficie de las mesas de trabajo han de permeabilidad selectiva y permite el ingreso de
ser impermeables al agua y resistente al calor nutrientes y la salida de desechos por mecanis-
moderado, solventes orgánicos, ácidos, álcalis mos de transporte activo y pasivo.
y otros productos químicos. Citoplasma: en el citoplasma bacteriano se
- La silla que se usen deben estar cubiertas por puede dividir en tres partes, región citoplásmi-
material que no sea de tela y que se puede lim- ca de apariencia granular conteniendo RNA,
piar fácilmente. región nuclear o cromatinica que contiene DNA
- La iluminación será adecuada para todas las y la parte liquida que mantiene disueltos los
actividades. Evitar reflejos y brillos molestos. elementos nutritivos. El ARN combinada con
- Contar con mechero de Alcohol o Bunsen con proteínas forma una masa densa y compacta
gas propano, que la llama sea azul. llamadas ribosomas.
- Contar con un microscopio binocular, aceite
de inmersión, laminillas, cubreobjetos, palillos. 2.3.1 Bacterias Gram positivo
- Contar con colorantes para Gram, Zn, KOH,
Giemsa. La envoltura de la bacteria comprende de mem-
brana citoplasmática y una pared celular com-
2.3 Generalidades de la Estructura puesta por una gruesa capa de peptidoglicano
Bacteriana de 20 a 80 nm, que rodea a la anterior. La pa-
red celular se une a la membrana citoplasmáti-
Las diferentes estructuras bacterianas se pue- ca mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La
den dividir en elementos obligatorios para poder capa de peptidoglicano confiere gran resisten-
sobrevivir como pared celular, membrana celu- cia a estas bacterias y responsable de retener
lar, ribosomas y material genético y elementos el cristal violeta durante la tinción de Gram. El
facultativos son los que están presentes en al- ácido teicoico de la pared que está en la super-
gunas celular y pueden seguir viviendo si pier- ficie y se une solo a la capa de peptidoglicano,
den alguna capacidad fisiológica o patológica este ácido es el responsable del determinante
como pilis o fimbrias, cápsula y esporas. antigénico del organismo. (fig. 1)
Pared Celular: está ubicada por fuera de la
membrana plasmática, es una estructura vital
para las bacterias que la poseen. Su función es
proteger a la bacteria de presión osmótica entre
el medio interno de la bacteria y del exterior, ba-
rrera contra sustancias toxicas químicas y bio-
lógicas y le proporciona rigidez a las bacterias.
Está constituida por aminoácidos, aminoazú-
cares, azúcares y grasas. Todas las bacterias
contienen en la pared celular peptidoglicano,
que consiste en cadena lineal de dos azúcares
alternados, N-acetilglucosamina y ácido N-ace-
tilmurámico que se halla ligado un tetrapéptido.
La pared celular permite clasificar las bacterias
en Gram positivo que son capaces de retener
el colorante cristal violeta luego de la decolo-
ración con alcohol cetona y Gram negativo que
pierden el colorante cristal violeta después de
la decoloración.
Pág. 18
función dar color a todas las células. El segun-
do reactivo el lugol, actuando como mordiente,
2.3.2 Bacterias Gram negativo haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared celular de la bacteria. El
La envoltura de la bacteria está compuesta tercer reactivo el decolorante Alcohol-acetona,
por una membrana citoplasmática, una pared donde los organismos Gram positivo no se de-
celular delgada de 2 a 7 nm de peptidoglicano coloran y los Gram negativo si lo hacen. Y el
y una membrana externa. Entre la membrana cuarto reactivo el colorante de contraste Sa-
citoplasmática y la membrana externa se locali- franina, poniendo de manifiesto las bacterias
za el espacio periplásmico, relleno de una sus- Gram negativas.
tancia denominada periplásma la cual contiene
enzimas para la nutrición, enzimas inactivadora 2.4.1.2 Procedimiento de la Tinción de
de antibióticos y proteínas de transporte. Gram
La membrana externa contiene diversas proteí-
nas: porinas, lipopolisacáridos (LPS) y fosfolípi- a. Preparación del Frote
dos. El lipopolisacárido forma tres regiones: po- - Tomar la muestra con un hisopo de dacron o
lisacárido O (antígeno O), polisacárida central alginato de calcio.
(KDO) y el lipido A (endotoxina). (fig. 2) - Rodar el hisopo sobre un portaobjeto
- En caso de muestras liquidas tomar una por-
ción con un asa en argolla flameada y fría, colo-
carlo en un portaobjeto.
- Dejar secar al aire o acelerar el secado acer-
cando el portaobjeto al mechero, pero con pre-
caución porque el calor puede degradar o defor-
marse las bacterias.
b. Preparación de la tinción
- En una bandeja con dos varillas colocar el frote
en forma horizontal
- Colocar el Cristal Violeta suficiente cantidad,
dejar actuar durante 1 minuto
- Lavar suavemente con agua
- Colocar el mordiente Yodo, dejar actuar por 1
minuto
- Lavar suavemente con agua
- Decolorar con Alcohol-Acetona, agregando
gota o gota hasta que salga casi claro o ligera-
2.4 Tinciones Básicas mente azul
2.4.1 Tinción de Gram - Lavar con agua
2.4.1.1 Principio - Agregar safranina como contraste, dejar actuar
por 1 minuto
Es el método de tinción diferencial más utiliza- - Lavar con agua
do en bacteriología, siendo esencial para la cla- - Dejar secar la muestra
sificación y diferenciación de microorganismos, - Examinar al microscopio con objetivo 100X de
la cual divide las bacterias en dos grupos, las inmersión de aceite. Gram Positivo se tiñen de
Gram positivas y las Gram negativas. La reac- morado y Gram negativo de rosado. (fig. 3)
ción de la tinción de Gram está basada en la di-
ferencia en la composición química de la pared
celular bacteriana.
La tinción consta de 4 reactivos químicos, el pri-
mero es el colorante primario cristal violeta, su
Pág. 19
- Cubrir el frote con el reactivo Carbón fucsina,
2.4.2 Tinción Ziehl Neelsen - Por debajo del frote calentar con suavidad has-
2.4.2.1 Principio ta la aparición de vapores durante 1 minuto
- Dejar el colorante durante 4-5 minutos, sin ca-
Es una técnica de tinción diferencial rápida y lentar
económica, usada para identificar microorga- - Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el
nismos patógenos como M. tuberculosis o el exceso de agua
género Apicomplexa (coccidios intestinales) en- - Decolorar el frote con alcohol-ácido
tre otros. - Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el
El fundamento de la tinción se basa en resistir exceso de agua
a la decoloración con alcohol-acido después de - Cubrir el frote con el reactivo azul de metileno
la tinción con colorantes básicos. Las paredes durante 1 minuto
celulares de ciertas bacterias contienen ácidos - Lavar el frote con agua de chorro, dejar secar
grasos (ácidos micólicos) de cadena larga que al aire
les confiere la propiedad de resistir la decolo- - Observar el frote con microscopio con objetivo
ración. 100X en busca de BAAR
La técnica consiste en la penetración de carbón
fucsina en la pared celular mediante el calor
como mordiente, luego de cesar la aplicación
de calor la pared celular cerosa recupera su
consistencia quedando atrapado el colorante.
Las bacterias que resisten la decoloración son
de color rojo observándolo como bastoncitos
delgados, ligeramente curvos. (fig. 4)
2.4.2.2 Procedimiento de Tinción de

Ziehl Neelsen
a. Preparación del frote

- Con un palillo o un asa flameada y fría tomar
muestra y colocarla en un portaobjeto limpio
- Dejar secar a ambiente
- Fijar al calor la muestra, con cuidado
b Preparación de coloración
- En una bandeja con varillas colocar el frote en
posición horizontal
Pág. 20
2.4.4.2 Procedimiento de Tinción Kin-
youn Modificado
2.4.3 Tinción de Kinyoun
2.4.3.1 Principio - Flamear el frote para fijarlo
- Colocar el frote en posición horizontal en una
La tinción es similar a la tinción de Ziehl Nee- bandeja con varillas
lsen, siendo una coloración en frio, utilizando - Cubrir el frote con fucsina-fenicada durante 5
un reactivo especial que además de fucsina minutos
agrega una concentración alta de fenol. El fe- - Lavar con agua de chorro
nol disuelve los lípidos de la pared celular per- - Decolorar con un ácido débil ácido sulfúrico,
mitiendo que el colorante primario entre entré, durante aproximadamente 3 minutos
evitando el calentamiento. (fig. 5 ) - Lavar con agua de chorro
- Cubrir el frote con el colorante de contraste
2.4.3.2 Procedimiento de Tinción Kin- Azul de Metileno durante 3 minutos
youn - Lavar con agua de chorro, dejar secar
- En una bandeja con dos varillas, colocar la
laminilla en posición horizontal 2.4.5 Observación en Fresco
- Cubrir la laminilla con carbón fuscina-fenifica- 2.4.5.1 Principio
da durante 5 minutos
- Lavar con agua de chorro Son todas aquellas formas o métodos de ob-
- Decolorar con alcohol-acido servación, mediante los cuales los objetos a in-
- Lavar con agua de chorro vestigarse no sufren cambios o alteraciones en
- Cubrir con el colorante de contraste por 1 mi- cuando a su forma, estructura o composición
nuto química. Es útil para observar especies que se
- Lavar con agua de chorro, secar al aire dañarían al teñirla o fijarlas, como espirilos, así
como observar movilidad, fenómeno de multipli-
cación o esporulación. (fig. 6)
2.4.4 Tinción Kinyoun Modificado

2.4.4.1 Principio
3 Toma de Muestra y Procedimientos
Parecida a la coloración de Kinyoun o en frio,
haciendo la fijación con alcohol metílico para 3.1 Orocultivo
preservar las estructuras celulares y utilizando 3.1.1 Propósito e importancia
ácido sulfúrico al 2% en agua destilada rempla-
zando al alcohol-acido. Esta prueba se realiza para detectar infecciones
en la garganta causada por Estreptococos del
grupo A causando amigdalitis o faringitis.
Pág. 21
Carnero al 5% en un extremo de la caja reali-
zando el inoculo.
El área faríngea puede estar colonizada por g. Enviarlo inmediatamente al laboratorio
varias bacterias como Staphylococcus, Strep-
tococcus, micococos, Moraxella catarrhalis, 3.1.3 Aislamiento Primario
Corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyro- a. Proceder a realizar el estriado en Agar San-
monas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela, gre Carnero al 5%, realizando dos cortadas de
Peptostreptococcus, Actinomyces, levadura, aproximadamente 1 cm para aumentar la identi-
etc., pero el microorganismo más frecuente que ficación de la beta hemolisis. Entre cada estria-
causa faringitis es el Streptococcus pyogenes da y cortada no flamear el asa. (fig. 8)
3.1.2 Recolección de la muestra y

transporte
Previo a la toma de muestra el paciente no debe

estar tomando antibióticos, no haber realizado
gargarismo con algún antiséptico y no es nece-
sario que el paciente se presente en ayuno. En
algunos casos el procedimiento puede causar
nauseas o vómitos.
3.1.2.1 Procedimiento
a. Que el paciente este sentado, pedirle que
trague saliva dos veces b. Incubar por 18 a 24 hrs a 35-36 °C introducir-
b. Indicarle al paciente que vea hacia arriba, lo en una jarra con veladora con el objetivo de
abra la boca y diga aahh crear un ambiente de C02
c. Con ayuda de un bajalengua presionar la c.Buscar colonias de pequeñas de 1 a 1.5 mm
lengua hacia abajo y con una linterna observar de diámetro rodeada de un halo de hemolisis
el área afectada, en busca de áreas inflamada, completa sospechosas con beta-hemolisis sos-
con pus o ulceras blanquecinas.(fig. 7) pechosas de S. pyogenes
d. Con un hisopo estéril de dacrón proceder a la
toma de muestra, con el mayor cuidado de no 3.1.4 Identificación Streptococcus
tocar paredes de la boca ni la lengua. pyogenes
Es el principal microorganismo patógeno hu-

mano que produce infección local o sistémica
y trastornos inmunitarios postestreptocócicos.
Puede causar Faringitis, Erisipe, Celulitis, Gan-
grena estreptocócica, Fiebre puerperal, Pioder-
mia estreptocócica, Síndrome de Choque Toxi-
co, fiebre reumática y glomerulonefritis.
La prueba de catalasa es negativa, susceptible
al Taxo A (bacitracina 0.04 U) formando un halo
de inhibición, resistente al Taxo SXT, la identifi-
cación de pirrolidonilarilamidasa (PYR) y la de-
tección del Antígeno A de Lancefield. (fig. 9)
e. Introducir el hisopo en el medio de transporte
Todd Hewitt, llevarlo a la brevedad posible al 3.1.4.1 Procedimiento
laboratorio. a. Después de la incubación de 16 a 24 horas
f. En caso de realizar la inoculación directa rea- del asilamiento primario, proceder a buscar co-
lizar la inoculación en medio de Agar Sangre de lonias sospechosas de beta hemolisis.
Pág. 22
b. Trasladar una o varias colonias a un agar sangre carnero al 5% en el centro y proceder a realizar
un estriado en forma de tapete
c. Con una pinza flameada y fría colocar un disco de Taxo A (bacitracina 0.04 U)en el centro
d. Incubar por 16 a 24 horas en ambiente de CO2
e. Examinar la caja para observación de un halo de inhibición alrededor del Taxo A. La presencia
del halo indica que se aislo S. pyogenes (fig. 10)
f. Proceder a realizar la prueba de susceptibilidad y pruebas serologías de aglutinación para con-
firmación del grupo
3.2 Cultivo de Garganta Especial

3.2.1 Propósito
La presencia de las bacterias especiales por cultivo se realiza mediante solicitud e investigación
justificada.
Pág. 23
• Corynebacterium diphtheriae: conocido como
bacilo Klebs-Löffler, causante de la difteria, es
investigada por sintomatología que presenta el
paciente, siendo: formación de pseudo-mem-
branas (pellejos) de color gris en la garganta,
que sangran mucho al desprenderse, fiebre y el
paciente se encuentra severamente intoxicado,
afectando las amígdalas, garganta, nariz, mio-
cardio, fibras nerviosas o piel. Bacterias Gram
Positiva, catalasa positiva, inmóvil, no espuru-
lados, bacilos rectos o ligeramente curvados
2-6 um de largo y 0.5 um de diámetro, a menu-
do con en forma de V lo que se conoce como
forma de letras chinas. 3.2.2.2 Toma de Muestra para Neisse-
• Neisseria Meningitidis: Causante de severa y ria meningitidis y Bordetella pertussis
contagiosa meningitis, y se investiga principal-
mente el Líquido Cefalorraquídeo, la presencia El cultivo de garganta/nasofaríngeo para el ais-
la bacteria se realiza en cultivo de garganta en lamiento de N. meningitidis, debe obtenerse de
personal que han estado en contacto con el pa- personal que han tenido contacto directo con al-
ciente, siendo médicos, enfermeras, técnicos gún paciente que se ha detectado la presencia
de laboratorio, siendo importante identificar y de la bacteria en LCR, se obtiene mayor por-
erradicar la bacterias con tratamiento para evi- centaje de aislamiento en toma de muestra na-
tar la desimanación. sofaríngea que de garganta. Figura No. 12
a. Colocar al paciente con la cabeza inmovili-
• Bordetella pertussis: Causante de la tos fe- zada
rina, también conocida con tos convulsa o co- b. Con el pulgar de la mano, levantar suave-
queluche. Se caracteriza por inflamación tra- mente la punta de la nariz
queobronquial y accesos típicos de tos violenta c. Introducir un hisopo de alginato de calcio en
y espasmódica con sensación a asfixia. Coco- unos de los orificios nasales
bacilo Gram Negativo pequeño mide alrededor d. Mover el hisopo hacia atrás y hacia arriba a
de 0,3-0,5 μm de ancho y entre 1,0 y 1,5 μm de lo largo del tabique nasal, hasta llegar a la parte
largo, aerobios, posee capsulas, presenta fila- posterior de la faringe.
mentos similares a pilis. e. Retirar el hisopo con cuidado
f. Inocular el hisopo en medio de transporte o
3.2.2 Recolección de Muestra y Trans- directamente en el medio de cultivo.
porte g. Con otro hisopo tomar muestra y realizar un
3.2.2.1 Toma de muestra para Coryne- frote gram
bacterium diphteriae
a. Con buena iluminación examinar la gargan-
ta, bajar la lengua con ayuda de un bajalengua,
buscar aéreas necróticas o grisáceas (pseudo-
membrana) Fig. 11
b. Con un hisopo alginato de calcio estéril frotar
firmemente las lesiones, retirar el hisopo con
cuidado de no tocar las paredes ni la lengua
de la boca. Tomar por lo menos 3 muestras con
hisopo
c. Un hisopo realizar un frote gram
d. Inocular en los medios de cultivo.
Pág. 24
das en Agar Chocolate-Telurito para realizar las
pruebas de Catalasa y Nitritos
3.2.3 Aislamiento primario Catalasa: Positivo
3.2.3.1 Corynebacterium diphteriae Nitritos: Positivo
a. Inocular el hisopo en un medio inclinado de Reporte:
Loeffer (suero animal más caldo glucosado coa- Si la morfología del crecimiento en medio Loe-
gulado) el medio es de color crema pálido. ffler es típica informar,
b. El segundo hisopo inocular en agar Chocola- Se aisló un bacilo gram-positivo, de morfología
te-Telurito de Potasio compatible con Corynebacterium diphtheriae.
c. Proceder a estriar los medios de cultivo Si la morfología microscópica de crecimiento en
d. Incubar ambos medios aerobicamente por medio Loeffler es típica y hay colonias negras en
36°C por 18 a 24 horas Agar Chocolate-Telurito reportar:
e. Un tercer hisopo inocular en agar Sangre Se aisló Corynebacterium diphtheriae. Identi-
Carnero al 5% para investigar Streptococcus ficación preliminar, pendiente de demostrar la
pyogenes, incubar en ambiente CO2 producción de toxina en vitro o in vivo
f. Teñir el frote Gram y buscar características de
la bacteria
3.2.3.2 Neisseria meningitidis

a. Inocular un hisopo en medio de de Thayer
Martin
b. Estriar el inoculo e incubar a 36°C en ambien-
te CO2 por 18-24 horas
c. Teñir el frote Gram
3.2.3.3 Bordetella pertussis

a. Inocular un hisopo en medio de agar Bor-
det-Gengou o Agar Regan-Lowe
b. Estriar el inoculo e incubar a 36° por 4-5 días3.2.4.2 Neisseria Meningitidis
c. Teñir el frote gram a. Después de la incubación observar colonias
en Agar Chocolate pequeñas, grises, brillantes y
3.2.4 Identificación de principales Mi- ligeramente mucosas
croorganismos b. Realizar un frote Gram con cuidado, observar
3.2.4.1 Corynebacterium diphtheriae diplococos Gram-negativo en forma de granos
a. Después de la incubación del medio Loeffler de café, agrupados en pareja
con dos a ocho horas, preparar dos frotes uno c. Realizar un subcultivo para obtener un cultivo
para gram y otro para Azul de metileno, con cui- puro en agar Chocolate sin inhibidores de colo-
dado de remover lo menos posible nias características y morfología microscópicas
b. Tinción de Gram: bacilos gran-positivo pleo- de la bacteria para las pruebas de identificación
mórficos y en forma de maza, agrupadas en for- como Oxidasa, utilización de azucares y prue-
ma de letras chinas o en formas de V o Y. bas serológicas.
c. Tinción de Azul de Metileno: utilizar Azul de
Metileno de la coloración de Ziehl Neelsen ob- Prueba de Oxidasa
servar el mismo patrón que el gram, solo que la a. Tomar una porción de la colonia a estudio, con
coloración es discontinua en forma de bandas un palillo de madera o un asa plástica, frotar so-
azules por los corpúsculos metacromáticos de bre un disco con reactivo de oxidasa.
polimetafosfato. b. La reacción positiva se da en 10 segundos,
d. En agar Chocolate-Telurito se observan colo- con una coloración morado oscuro a negro indi-
nias de color negro intenso. cando prueba positiva.
e. Sulcultivar en Agar Sangre de Carnero al 5%
colonias características de C. diphtheriae creci-
Pág. 25
Utilización de Azucares Método Agar Cistina
Tripticasa ACT
a. Se utiliza un juego de 4 tubos con agar ACT
con distintas azucares (glucosa, maltosa, lac-
tosa y sacarosa)
b. Tomar una pequeña cantidad con un asa
en punta del crecimiento de un cultivo de N.
meningitidis, de un cultivo puro de 24 horas en
agar Sangre y Chocolate
c. Inocular pinchando varias veces los 10 mm
superiores del medio. Y repetir el proceso con
los otros tubos usando un asa flameada y fría.
d. Cerrar los tubos e incubarlos a 35°C por lo
menos 72 horas hasta 5 días antes de descar- Colonias de B. pertussis
tarlos como negativo Figura No. 14
e. Si se genera una turbidez visible y un color
amarillo en la porción superior del medio, es 3.3 Hemocultivo y Mielocultivo
indicativo de crecimiento y producción de aci- 3.3.1 Propósito
do, intepretando como positiva la prueba.
N. meningitidis, oxida glucosa y la maltosa, El hemocultivo sirve para detectar las bacte-
pero no la lactosa ni la sacarosa. (Tabla No. 1) rias que se están reproduciendo en la sangre,
lo que provoca septicemia. El mielocultivo es
Tabla No. 1 Utilización de Azucares el cultivo de médula ósea y sirve para detectar
bacterias en esta muestra, especialmente Sal-
monella typhi.
El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente
estéril, por lo tanto, la presencia de microorga-
nismo o sus productos constituyen un proble-
ma para todos los órganos y sistemas que son
irrigados por el mismo. La detección e identifi-
cación de los diversos microbianos, es de vital
importancia desde el punto de vista clínico para
instaurar una terapia antimicrobiana adecuada
y desde el punto de vista epidemiológico.
Pág. 26
f. Dispensar el volumen de sangre obtenido rápi-
da y suavemente en el medio de cultivo líquido
3.3 Hemocultivo y Mielocultivo con anticoagulante
3.3.1 Propósito g. Limpiar con alcohol al 70% para remover el
yodo el cual puede causar irritación en algunos
El hemocultivo sirve para detectar las bacterias pacientes.
que se están reproduciendo en la sangre, lo que Las botellas de hemocultivo inoculadas deben
provoca septicemia. El mielocultivo es el cultivo ser enviadas inmediatamente al laboratorio evi-
de médula ósea y sirve para detectar bacterias tando una agitación vigorosa, sin refrigerar. Si
en esta muestra, especialmente Salmonella no es posible llevarlas de inmediato, conservar-
typhi. las a temperatura ambiente por un corto período
El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente de tiempo sin alterar la viabilidad de las bacte-
estéril, por lo tanto, la presencia de microorga- rias. Por un periodo mayor deben conservarse
nismo o sus productos constituyen un proble- en incubadora a 35°C.
ma para todos los órganos y sistemas que son En sepsis: se recomienda tomar dos muestras
irrigados por el mismo. La detección e identifi- de lugares distintos en un lapso de media hora.
cación de los diversos microbianos, es de vital En endocarditis, obtener tres muestras de dife-
importancia desde el punto de vista clínico para rentes lugares en un lapso de 1 a 2 horas.
instaurar una terapia antimicrobiana adecuada
y desde el punto de vista epidemiológico. 3.3.3 Aislamiento primario
3.3.3.1 Procedimiento de incubación
3.3.2 Recolección de la muestra y a. Al obtener la muestra en el frasco de hemocul-
transporte tivo, incubar el frasco a 35-36°C hasta por 7 días
b. Examinar visualmente y con luz transmitida
El momento ideal para obtención de la muestra los frascos de hemocultivo después de 12 y 24
es justo antes del pico más alto de fiebre, sin horas de incubación.
esperar el pico máximo de temperatura, ya que c. Observar si presenta turbidez o lisis de glo-
en este momento hay mayor destrucción del bulos rojos indicando crecimiento bacteriano,
microorganismo. Antes de recibir terapia antimi- entonces realizar una coloración Gram y un sub-
crobiana, si está recibiendo ya terapia antimi- cultivo., si no presenta cambios seguir incuban-
crobina tomar muestra en el momento de baja do por 7 días.
concentración del antibiótico.
3.3.2.1 Toma de muestra

a. Seleccionar el sitio de punción,
b. Preparar el sitio, lavar con agua y jabón. Lim-
piar con alcohol etílico a 70%. Si el paciente no
es alérgico al yodo, lavar en forma concéntrica
con tintura de yodo por 30 segundos
c. Desinfectar las tapas de la botella del hemo-
cultivo con alcohol o yodo.
d. Proceder a la venopunción con jeringa, ex-
traer el volumen de sangre necesario para obte-
ner una dilución en una proporción de 1:5 o 1:10
Volumen de muestra: neonatos 0.5 ml Subcultivo

Niños 1-5 ml
Adultos 10 ml a. Los subcultivos deben realizarse en cabina o
e. Retirar la ligadura y la jeringa al terminar de cerca de un mechero de bunsen
obtener la sangre, colocar una torunda de algo- b. Realizar los subcultivos ciegos dentro de las
dón 12 a 24 horas de incubación
Pág. 27
c.Antes de realizar el subcultivo, desinfectar la superficie de la tapa del frasco con alcohol al 70%
d. Con una jeringa estéril, extraer a través del tapón de la muestras
e. Inocular una gota de muestra del hemocultivo en un extremo de la superficie de las placas de
Agar Sangre, Agar MacConkey, Agar Chocolate y Agar Manitol sal.
f. También colocar una gota sobe un portaobjeto para la tinción de Gram
g. Proceder a realizar la dispersión para obtener colonias aislada
h. Incubar las placas de Agar sangre carnero 5% y Agar Chocolate a 35-36°C por 24 horas en
ambiente de CO2; las placas de MacConkey y Manitol Sal incuabar en ambiente aerobiosis.
i. Observar el gram si se observa morfología bacteriana informar al medico
j. Si no hay crecimiento a las 24 horas, seguir incubando hasta por 48 horas.
k. Si no hubiera desarrollo bacteriano, repetir el procedimiento de sulbcultivo al 5to y 7 mo dia.
l. Streptococcus pneumoniae tiene tendencia a autolisis, deben ser subcultivado a las 12-17 horas
de incubación, repetir a las 48 horas y 7mo día de incubación sin presentar cambio de coloración
o turbidez.(Tabla No. 2)
Tabla No. 2 Alteración del hemocultivo y posible bacteria
3.3.4 Identificación de principales microorganismos
Staphylococcus coagulasa negativo, corinebacterias y especies de bacillus son contaminantes

frecuetnes y a menudo se aíslan en solo una de tres muestras o el paciente no presenta síntomas.
Algunas bacterias frecuente en hemocultivos positivos son:
- Salmonella typhi
- Escherichia coli
- Streptococcus pneumoniae
Pág. 28
Staphylococcus aureus
- Streptococcus pyogenes
- Pseudomonas aeruginosa
- Haemophilus influenzae
3.4 Líquido cefalorraquídeo y otros líquidos estériles

3.4.1 Propósito
Demostrar mediante el cultivo de Líquido Cefalorraquídeo (LCR) u otro tipo de líquido el diagnos-
tico microbiológico de una infección.
Las infecciones del SNC puede ser causada por bacterias, virus, hongos o parásitos que se ha-
llan en el medio ambiente o que forman parte de la flora normal de la superficies corporales; los
agentes causales son introducidos previamente en los tejidos periféricos del hospedero y se diri-
gen al SNC a través del torrente sanguíneo o ocasionado por traumatismos craneoencefálicos.
Pág. 29
Las bacterias que tiene mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son:
Bacterias Gram Negativo
Neisseria meningitidis
Haemophilus influenzae
Escherichia coli y otras enterobacterias
Pseudomonas aeruginosa
Bacterias Gram Positivo

Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Lysteria monocytogenes
Entre otros microorganismos esta Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Cryptococcus

neoformans.
Los síntomas de irritación de las meninges son fiebre, dolor de cabeza, vómitos, rigidez, dolor
de nuca, reflejos aumentados y petequias en la piel.
3.4.2 Recolección de Muestra y Transporte
Las muestras de líquido LCR u otro líquido corporal estéril deben ser tomadas por un profesional
capacitado, antes de iniciar tratamientos con antibióticos, colectadas en recipientes estériles por
lo menos tres frascos para citológico (recuento de glóbulos rojos, recuento de glóbulos blancos,
formula diferencial), químico (glucosa, proteína entre otros) y microbiológico.
Deben ser transportadas inmediatamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no des-
pués de 30 minutos de recolectada. Rotular la muestra adecuadamente y tipo de muestra. Si el
médico sospecha de bacilos alcohol acido resistente BAAR o de hongos debe notificarlo para
evaluar.
Pág. 30
levaduras encapsuladas sembrar en agar Sa-
Los líquidos o fluidos corporales estériles son: bourod por 4 semanas
- Líquido cefalorraquídeo e. Tomar una o dos gotas de líquido con una pi-
- Líquido ventricular (cisternal o craneal) peta pasteur estéril o jeringa estéril e inocular
- Líquido abdominal (peritonel, de diálisis o los medios de cultivo sólidos, Agar Sangre Car-
bilis) nero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar
- Líquido pleural, toracentesis y empiema ( MacConkey.
obtenido del torax) f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero
- Líquido pericardio al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 y
-Líquido sinovial Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente ae-
La muestra de Líquido Cefalorraquídeo LCR se robiosis, a 36°C, revisar a las 24 horas.
obtiene por punción lumbar, se sugiere por lo g. Si el laboratorio cuente con pruebas para de-
menos la colección de la muestra en tres tubos tección de antígenos, realice estas pruebas con
separados para analizar química (glucosa, pro- una pequeña cantidad del LCR o del sobrena-
teínas entre otros), citológico (glóbulos rojos, dante del LCR.
glóbulos blancos y formula diferencial) y cultivo h. Si no se observa crecimiento deben ser rein-
microbiológico de preferencia el tubo no. 2 o el cubados los medios por 72 horas antes de des-
más turbio para el análisis microbiológico. cartados.
i.Si presenta desarrollo de microorganismos so-
bre los medios de cultivo sólidos realizar colora-
ción Gram, de acuerdo a lo observado proceder
a montar las pruebas de identificación y antibio-
grama.
Reportar al médico inmediatamente lo observa-
do en la tinción de Gram, ZN o Tinta China.
Segunda Porción
a Proceder a realizar el examen macroscópico
(color, aspecto, volumen ) y citológico del Líqui-
do estéril
b. El examen citológico de la segunda porción
se analizara
- Recuento de glóbulos rojos
- Recuento de glóbulos blanco
Figura No. 16 - Formula diferencial
c Es este tubo también puede realizarse prue-
3.4.3 Aislamiento Primario del Líquido bas de latex para identificación de Criptococ-
Cefalorraquídeo u otros Líquidos Esté- cus neoformans, H. influenzae, N. meningitidis,
riles. Streptococcus pneumoniae y del grupo B-hemo-
litico.
Primera porción Tercera Porción
a. Tomar un tubo con muestra y Centrifugar la Proceder a realizar el examen químico con eva-
muestra a 3,000 rpm durante 10 minutos luación de glucosa y proteínas.
b.Descartar el sobrenadante y con el sedimen- d. Si en la coloración de Tinta China se obser-
to proceder a realizar frotes para Gram y Zielh van levaduras encapsuladas sembrar en agar
Neelsen ZN; Tinta China Sabourod por 4 semanas
c.Si se observan Bacilos Alcohol Acido Resis- e.Tomar una o dos gotas de líquido con una pi-
tente sembrar en Lowenstein Jensen, siguiendo peta pasteur estéril o jeringa estéril e inocular
el protocolo para aislamiento e identificación de los medios de cultivo sólidos, Agar Sangre Car-
micobacterias por 60 días nero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar
d.Si en la coloración de Tinta China se observan MacConkey.
Pág. 31
Interpretación
Tinción del Gram del sedimento del LCR:
f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero - Observar diplococos Gram Negativo, forma de
al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 riñon, en parejas como grano de café, compati-
y Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente bles con N.meningitidis.
aerobiosis, a 36°C, revisar a las 24 horas. - Cocobacilos Gram Negativo pleomórficos, con
g.Si el laboratorio cuente con pruebas para de- escasa formas bacilares, compatible con H. in-
tección de antígenos, realice estas pruebas con fluenzae
una pequeña cantidad del LCR o del sobrena- - Cocos Gram Positivo, lanceolado, ovalado, dis-
dante del LCR. puestos en parejas o cadena cortas, la capsula
h.Si no se observa crecimiento deben ser rein- se insinúa como un halo claro alrededor de las
cubados los medios por 72 horas antes de des- bacterias, compatible con S. pneumoniae.
cartados. - Bacilos Gram Negativo, compatible con Ente-
i.Si presenta desarrollo de microorganismos so- robacterias o Pseudomonas sp.
bre los medios de cultivo sólidos realizar colora- - Levaduras redondas con gemación, Gram po-
ción Gram, de acuerdo a lo observado proceder sitivo, se insinúa cápsula hacer tinta china, para
a montar las pruebas de identificación y antibio- verificar la presencia de C. neoformans
grama. Tinción de Ziehl Neelsen
Reportar al médico inmediatamente lo observa- - Si se observan bacilos alcohol ácido resistente
cortos, morfología compatible con M. tuberculo-
do en la tinción de Gram, ZN o Tinta China. sis o otras micobacterias.
Segunda Porción Al observar crecimiento a las 24 o 48 horas y
a. Proceder a realizar el examen macroscópico observar crecimiento en distintos medios como
(color, aspecto, volumen ) y citológico del Líqui- guía (Tabla No. 4)
do estéril
b. El examen citológico de la segunda porción Tabla No. 4
se analizara
- Recuento de glóbulos rojos
- Recuento de glóbulos blanco
- Formula diferencial
c Es este tubo también puede realizarse prue-
bas de latex para identificación de Criptococ-
cus neoformans, H. influenzae, N. meningitidis,
Streptococcus pneumoniae y del grupo B-he-
molitico.
Tercera Porción
Proceder a realizar el examen químico con eva- Realizar Frote gram de las colonias para confirmar morfo-
luación de glucosa y proteínas. logía y proceder a identificación (tabla No. 5)
3.4.4 Identificación de principales mi-
croorganismos Tabla No. 5
Pág. 32
identificar más de 40 serotipos. Los factores de
virulencia son Endotoxina, que se libera tras la
3.5 Coprocultivo lisis de la bacteria, que contribuye a la irritación
de la pared intestinal y la Exotoxina o Toxina
3.5.1 Propósito e Importancia Shiga que es una proteína termolábil inmuno-
génica, su acción afecta tanto al intestino como
Método utilizado para identificar diferentes mi- sistema nervioso central.
croorganismos causantes de enfermedades
gastrointestinales, provocando diarreas, vómi- 3.5.1.3 Vibrio Cholerae
tos, fiebre y dolores estomacales.
Los principales enteropátogenos están: Salmo- El género Vibrio agrupa a más de 30 especies,
nella sp, Shigella sp y Vibrio cholerae. pero sólo 12 se consideran patógenas para el
ser humano. La especie más patógena es V.
3.5.1.1 Salmonella sp cholerae, según el antígeno somático (O) se
subdivide en los grupos O1, O2, O3 y O139. El
El género Salmonella se incluye en la fami- Vibrio cholerae grupo O1 presenta 2 biotipos; el
lia Enterobacteriaceae, integrada por bacilos Clásico, y Eltor y ambos biotipos pueden perte-
Gram negativo anaerobios facultativos, son fer- necer a dis serotipos principales Ogawa e Inaba.
mentadores de glucosa pero no lactosa, suelen Los vibrios causantes de cólera son Vibrio cho-
ser móviles por sus flagelos peritricos excepto lerae grupo O1 y grupo O139, fabrican una en-
S. gallinarum, no esporulados, producen ácido dotoxina que es la determinante de las diarreas
sulfúrico y no producen ureasa. secretoras típicas del cólera.
Se distinguen tres únicas especies patógenas Son bacilos Gram negativo, con forma de coma,
primarias: S. thphi, S. Cholerae-suis y S. en- aerobios y anaerobios facultativos. No esporula-
teritidis. Según la serotipificación de Kauffman dos, tiene flagelo polar. Fermenta la glucosa sin
y White, estas se clasifican en más de 2000 producción de gas, catalasa positivo y la mayo-
serotipos con base en antígenos flagelares H ría es oxidasa positiva. Tiene Antígeno somático
(proteicos) y antígeno somáticos O (fracción po- (O), antígeno flagelar (AgH), sus factores de vi-
lisacárida del lipopolisacaridos bacilar). S. typhi rulencia son mucinasa y la toxina colérica.
posee además un antígeno de virulencia (Vi)
3.5.2 Recolección de Muestra y Trans-
3.5.1.2 Shigella porte
a. No estar tomando antibióticos
Shigella es un bacilo Gram negativo, inmóvil, no b. Colectar la muestra de heces frescas en un
formadoras de esporas e incapaces de fermen- frasco limpio y estéril de boca ancha enviarlo an-
tar la lactosa, que puede ocasionar diarrea en tes de 1 hora al laboratorio
especialmente en niños. c. Si no puede emitir muestra de heces se pue-
Existen varias especies diferentes y son clasifi- de proceder a toma de muestra con hisopo. En
cados en cuatro subgrupos niños introducir el hisopo 2.5 cm y en adultos
- Serogrupo A: S. dysenteriae (12 serotipos): introducirlo 4 cm; dar 3 vueltas a la derecha y 3
causa disentería bacilar grave y complicaciones vueltas a la izquierda
- Serogrupo B: S. flexneri (6 serotipos): causa d. Si la muestra es tomada con hisopo introdu-
disentería bacilar moderada cirlo en el medio de transporte como Cary Blair,
- Serogrupo C: S. boydii (23 serotipos): causa e. Enviar la muestras tomadas lo antes posible
disentería bacilar moderada al laboratorio
- Serogrupo D: S. sonnei (1 serotipo): causa di-
sentería bacilar leve 3.5.3Aislamiento Primario
Shigella tienen un patrón antigénico complejo, 3.5.3.1 Procedimiento para aislar Sal-
la mayor parte de las especies comparten el an- monella sp, Shigella sp
tígeno O con otras enterobacterias. El antígeno a. Procesar la muestra lo más pronto posible
O (somático) es un lipopolisacárido que permite
Pág. 33
b. Con un hisopo estéril o asa en argolla tomar
muestras de heces donde hay presencia de
moco, pus o sangre.
c. Tomar un hisopo o una asada de muestra y
colocarlo en caldo de selenito por 12 a 24 horas
a 35-36°C (inhibiendo la flora normal y permite
el desarrollo de salmonella sp y Shigella sp.
d. Tomar tercer hisopo o asa con muestra e
inocular los medios de cultivo selectivos como
MacConkey Sorbitol y XLD o SS, realizando un
inoculo de 1 cm.
e. Con un asa en argolla flameada y fría proce-
der a estriar
f. Incubar por 24 a 48 hrs a 35-36C
g. Revisar la presencia de colonias sospecho-
sas tabla no. 1, realizar identificación y anti-
biograma
El Agar MacConkey Sorbitol utilizado para bus-
car Escherichia coli O 157:H7 en niños menores
de 5 años.
Características macroscópicas en los medios

de cultivo de las bacterias más importantes (Ta-
bla No. 6 y figuras 17) 3.5.3.2 Procedimiento para aisla-
miento de Vibrio cholerae
Tabla No. 6 a. Procesar la muestra lo más pronto posible o muestra
proveniente en medio de transporte de Cary Blair
b.Con un hisopo estéril o asa en argolla tomar muestras
de heces donde hay presencia de moco, pus o sangre.
c.Tomar un hisopo o asa de muestra y colocarlo en Agua
Peptonada Alcalina por 6 a 8 hr a 35-36 °C para enrique-
cimiento de Vibrio cholerae
d.Sulcultivar en medio TCBS (tiosulfato, citrato sales bilia-
res y sacarosa y Agar Sangre
e. Con un asa en argolla flameada y fría proceder a estriar.
Incubar por 24 hrs a 35-36C
f.Revisar la presencia de colonias circulares de borde en-
tero de color amarillo (sacarosa positivo) en medio TCBS y
en agar Sangre colonias hemolíticas. (Figura 18)
Pág. 34
- Proceder a picar una vez el medio por el cen-
tro al fondo del tubo
- Sin sacar el asa recta del tubo estriar el sland
del medio
- Incubar a 36 C por 18 / 24 hrs
- Leer la reacción
B. LIA Agar Lisina Hierro

Mide la capacidad del microorganismo para
descarboxilar un aminoácido (lisina o arginina)
para forma una amina con la consiguiente alca-
linidad, poniéndose de manifiesto por el viraje
del indicador púrpura de bromocresol. El medio
es de color púrpura intenso pH 6.
Procedimiento
- Con un asa recta no flameada del proceso
del TSI,
- Desenrosque el tubo y flamee la boca del
tubo
- Proceder a picar el medio tres veces hasta el
fondo y estriar el sland
- Incubar a 36C por 18 a 24 hrs
- Leer la reacción
3.5.4 Identificación de principales Mi- Tabla No. 6 Interpretación TSI y LIA

croorganismo
3.5.4.1 Pruebas Bioquímicas

Las pruebas bioquímicas consisten en distin-
tos test químicos, la cual se fundamentan en
demostrar si el microorganismo es capaz de
fermentar azúcares, presencia de enzimas,
degradación de compuestos; con el objetivo de
diferenciar bacterias.
Para la realización de las pruebas bioquímicas
se debe tener cuidado utilizar mesclar bacte-
rias y tomar proceder con aislamientos puros.
A. TSI Agar hierro triple azúcar

Determinar la capacidad de la bacteria para
degradar los azucares y la formación de gas
y Acido Sulfhidrico. Color es rojo ladrillo ana-
ranjado pH 7.4. . La fermentación aeróbica se
produce en el sland del tubo y la anaeróbica en
el fondo del tubo.
Procedimiento
- Con un asa recta picar una colonia sospecho-
sa que este aislada
- Desenrosque el tubo y flamee la boca del
tubo
Pág. 35
2. Descarboxilación de Ornitina, capacidad del
organismo de descarboxilar un aminoácido
C.Citrato para formar una amina, por consiguiente la
La utilización de citrato como única fuente de alcalinización
carbono es una prueba útil en la identificación 3. Producción de Indol El triptófano es un ami-
de enterobacterias, se detecta mediante el noácido que puede ser oxidado por ciertas bac-
crecimiento y alcalinización del medio a pH 7.6, terias formando tres metabolitos, Indol, Escatol,
el aumento de pH se visualiza con el indicador y Indolacetico.
Azul de Bromotimol que vira el medio de color Procedimiento
verde a azul oscuro. - Con un asa en línea flameada y fría tomar una
Procedimiento colonia
- Con un asa flameada y fría tomar una colonia - Desenroscar el frasco y flamear la boca del
aislada tubo
- Desenrosque el tubo y flamee la boca del - Introducir el asa en medio del agar hasta el fon-
tubo do
- Proceda a estriar el sland - Incubar por 18-24 hr a 36°C
- Incubar a 36 °C por 18-24 horas - Para la prueba de Indol, agregar 5 gotas del
- Interpretar reactivo de Kovacs, agitar suavemente
Interpretación - Interpretar
Positivo: Crecimiento y viraje azul
Negativo: Sin viraje el medio (verde) Interpretación
Producción de Orinitina: Positivo: color purpura
D. UREA Negativo: color amarillo al fondo del tubo
La tripteína y la glucosa aportan los nutrientes Producción de Indol: Positivo: anillo rojo en la
para el desarrollo del microorganismo, el rojo superficie
de fenol es el indicador del pH y el cloruro de Negativo: no produce color
sodio mantiene el balance osmótico. Las bac- Movilidad: Positivo: Los microorganismos móvi-
terias que hidrolizan la urea por medio de la les migran de la línea de siembre hacia el medio
enzima ureasa liberan amoniaco y dióxido de formando turbidez
carbono, esto alcaliniza el medio virando el rojo Negativo: crecimiento bacteriano solo en la línea
de fenol de amarillo al Rosado Intenso, esta de siembra.
prueba puede realizarse en medio liquido o 3.5.4.2 Identificación de Salmonella sp
sólido. El medio es de color amarillo.
Procedimiento
- De un cultivo puro tomar una colonia con una
asa flameada y fría
- Desenrosque el medio y flamee la boca del
tubo
- Estriar la superficie del sland
- Incubar por 18 a 24 hrs a 36C
- Leer reacción
Interpretación
Positivo: Rosado intenso
Negativo: Sin viraje el medio (Amari-
llo)
E. MIO (Movilidad, Indol y Orinitina)

Utilizado para la identificación de enterobacte-
rias sobre la base de:
1. Movilidad:
Pág. 36
- Mezcle la suspensión y el antisuero completa-
mente y a modo de mecedora mueva el portaob-
jeto repetidamente para observar aglutinación
bajo luz brillante y sobre un fondo negro. Si la
reacción es positiva en 30 seg a 1 min aparecerá
una precipitación.
- Si presenta aglutinación en el control se trata
de una cepa rugosa, y no puede ser serotipifi-
cado.
3.5.4.3 Identificación de Shigella sp

a. Reacción bioquímica
b. Tinción de Gram
Salmonella typhi
c. Serológica
Los cultivos de TSI sospechosa de S. typhi de-
ben analizarse serológicamente con antisueros
de Salmonella Vi y “O” del grupo D. El antígeno
Vi es capsular puede enmascarar la reacción
del grupo somático “O”, por lo que aislamientos
de Salmonella typhi serán normalmente positi-
vos tanto Vi como para el antisuero D.
Procedimiento
- En un portaobjeto límpido colocar tres peque-
ñas gotas de solución salina
- Tomar una porción del crecimiento de la super-
ficie de TSI y suspender cada gota de solución
salina, mezclar
- Añadir una pequeñas gota de antisuero O del
grupo D a una suspensión y una pequeña gota
del antisuero Vi a una segunda. La tercera sus-
pensión será control
Pág. 37
3.5.4.4 Identificación de Vibrio chole-
rae
b. Tinción de Gram
a. Reacción bioquímica
b. Tinción de Gram
c. Serología
S. dysenteriae es las mas común en desintería, los aisla-

mientos con reacciones típicas en la pruebas bioquímicas
deben estudiarse primero con el antisuero mo-
novalente A1, después con el antisuero poliva-
lente B y por ultimo el antisuero polivalente D.
Procedimiento
c. Prueba de Cuerda
- En un portaobjeto dividirlo y en cada sección La prueba se utiliza para distinguir cepas de
colocar una gota de solución salina V. cholerae de Aeromonas. El desoxicolato de
sodio lisas las bacterias, la solución perderá la
- Tomar muestra de las colonias sospechosas
turbidez y el ADN se desprenderá de las células
del TSI u otro medio no selectivo causando la viscosidad.
- Emulsifique el crecimiento en cada gota de Procedimiento
solución salina, mezcle completamente las sus- - En un portaobjeto colocar una gota de desoxi-
pensión para hacerla moderadamente lechosa colato sódico al 0.5 %
- Tomar una colonia a analizar previamente in-
- Añadir una gota pequeña de antisuero y una
cubada en Agar Infusión de Corazón por 18 a
se usara como control 24 hrs
- Mezclar bien la suspensión y el antisuero para - Interpretar
observar autoaglutinación. Interpretación
- Observar el portaobjeto bajo una luz brillante Positivo: Vibrio cholerae; otros vibrios darán po-
y sobre un fondo negro. Reacción positiva den- sitivo o positivo débil
Negativo: Aeromonas
tro de 30 seg a 1 min.
- Si observar una el control que es la colonia
con solución salina, se debe observar una mez-
cla homogénea, si hay presencia de aglutina-
ción no sirve para serotipificado.
Pág. 38
niños.
Llevar la muestra inmediatamente al laborato-
3.6 Urocultivo rio, no pasando más de una hora después de la
3.6.1 Propósito e importancia recolección.
El urocultivo es utilizado para la identificación Mujeres:

de microorganismos causantes de infecciones
urinarias asintomáticas o sintomáticas que van a. Realizar la limpieza en el área genital, sepa-
precedidos de leucocitosos y bacteriuria. Bajo rando los labios mayores, con gasas estéril con
condiciones normales no hay bacterias en el jabón antiséptico limpiar y con otra gasa estéril
tracto urinario. El microorganismo principales con agua quitar el jabón
de infección urinaria son bacilos gram nega- b. Dejar secar
tivo y con mayor frecuencia es la Escherichia c. Proceder a recolectar la muestra en un frasco
coli, seguido de Klebsiella sp, Enterobacter sp., estéril boca ancha, descartando la primera por-
Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, de me- ción de la orina en el sanitario y luego recolectar
nor importancia están los cocos gram positivos la otra porción a medio chorro
como Enterococcus sp., Staphylococcus au- d. Trasladarla inmediatamente al laboratorio.
reus, S. epidermidis, S. saprophyticus y hongos. Hombres:
Cultivos de orinas con presencia de 2 a más mi- a. Realizar la limpieza en la punta del pene con
croorganismos es indicio de una mala limpieza gasa estéril con antiséptico, luego con otra gasa
por lo tanto es una contaminación. con agua estéril quitar el jabón.
El criterio de Kass, es útil para interpretar del b. Dejar secar.
crecimiento del bacteriano y ser considerada c. Proceder a la recolección de la muestra en
una verdadera infección urinaria, siendo este frasco estéril boca ancha, descartando la prime-
criterio de igual o mayor a 100,000 UFC/ML ra porción de la orina en el sanitario y recolectar-
(UFC/ml Unidad formadora de colonias por mi- la otra porción a medio chorro.
lilitro). d. Trasladar inmediatamente al laboratorio.
3.6.2 Recolección de la Muestra y 2. Punción Supra-púbica

Transporte Esta por ser una técnica delicada debe ser toma-
da por un médico pediatra. Es la obtención de la
De preferencia que el paciente no este con te- muestra por jeringa estéril. Esto solo se hace en
rapia antibiótica previa a la recolección de la casos de que los cultivos aerobios dan negativos
muestra, la muestra adecuada es la primera de y con sintomatología, malformación de la uretra
la mañana, de no ser posible por lo menos pa- o sospecha de infección por un anaerobio.
sar dos horas sin orinar para recolectar la mues-
tra. Al momento de tener la muestra enviarla lo
más antes posible al laboratorio no mayor de 2
horas. Recolectar en frasco estéril previa limpie-
za adecuada.
Existen varios procesos de recolección de la
muestra:
1. Chorro medio
Niños: Realizar la limpieza en el área con agua
y jabón, secar, colocar la bolsita de recolección
de orina pediátrica adecuadamente (varones
que el pene quede introducido en el agujero
de la bolsita y mujercitas que el agujero quede
en el centro donde saldrá la orina). No dejar la
bolsita por más de una horas colocada en los
Pág. 39
3. Sondas permanentes
Este procedimiento se utiliza en aquellos enfer-
mos con sonda permanente en los que no es
posible retirar o reemplazar la sonda.
Se desinfecta la parte externa de la sonda en la
zona proximal con alcohol yodado y se punza
la sonda con aguja y jeringa estéril. Se vuelca
el contenido en forma aséptica en un frasco es-
téril.
Criterio de Kass
- Recuentos inferiores a 10,000 UFC/ml, con

hallazgos de cultivos polimicrobianos indican
que hubo una posible contaminación.
- Recuentos de 10,000 a 100,000 UFC/ml, po-
sible bacteriuria
3.6.3 Asilamiento primario - Recuentos igual o mayor a 100,000 UFC/ml
- Proceder a sembrar la orina con un asa cali- en pacientes asintomáticos tienen una probabi-
brada; se utiliza medios de cultivo de Agar San- lidad del 80% de presentar bacteriuria significa-
gre Carnero al 5% permitiendo el crecimiento tiva, probabilidad que aumenta hasta el 96% en
de todo tipo de bacterias, Agar MacConkey paciente sintomático.
permitiendo el crecimiento de bacterias Gram - Muestras obtenidas por Punción Suprapúbica
negativo. También puede usarse Chromocult o cualquier recuento de colonia es significativo.
CLED este inhibe el swarming de Proteus sp
- Con un asa calibrada de 0.001 ml flameada 3.6.4 Identificación de principales mi-
y fría proceder a tomar la muestra de orina pre- croorganismo
viamente agitada y abierta cerca del mechero
- Realizar un línea con el asa calibrada en el 3.6.4.1Escherichia coli
centro de la placa de Agar Sangre y otra línea Reacción bioquímica
con el asa flameada y fría en la placa de Mac-
Conkey de igual manera
- Con un asa no calibrada realizar las estrías en
forma de zigzag.
- Incubar el Agar Sangre en jarra con candela
ambiente de CO2 y el Agar MacConkey en ae-
robiosis a 35-36 °C por 18 a 24 hrs.
- Interpretación, si no hay crecimiento en un
cultivo por 48 horas reportar “Negativo a las 48
horas de Incubación”, si hay presencia de creci-
miento contar el número de colonias presentes
y multiplicar por 1000 si se usa asa calibrada
de 0.001 y multiplicas por 100 si se usó asa
calibrada de 0.01 ml realizar la identificación de
la bacteria por medio de reacciones químicas.
Tener en cuenta el criterio de Kass.
Pág. 40
Escherichia coli (gram negativas)
con la tinción de Gram.
Pág. 41
Pág. 42
- Desinfectar la superficie con alcohol al 70% o
3.7 Secreciones Varias yodo
3.7.1 Secreciones de heridas y absce- - Introducir la aguja a través de la piel o la pared
sos de absceso y aspirar aproximadamente 1 ml del
3.7.1.1 Propósito e importancia material purulento
- Colocarlo en un frasco estéril o un medio de
Está indicado para detectar la presencia de transporte y enviar inmediatamente al laborato-
bacterias causantes de infecciones en piel, ojo, rio
oídos, quemaduras, abscesos y otros. La piel
es el órgano más accesible del cuerpo que pue- 3.7.1.2.3 Toma de muestra en quema-
de tener mayor probabilidad de ser dañado o duras
traumatizado, causando dolor, hinchazón, calor - Limpiar y retirar el tejido muerto o quemado an-
y enrojecimiento alrededor de la herida hasta tes de la obtención de la muestra (hisopado del
formar abscesos. La infección puede ser mono- exudado o una biopsia)
microbianas o polimicrobianas. - Llevar la muestra del tejido en frasco estéril
Los microorganismos más frecuentes S. aureus,
S. epidermides, Enterococos, E. coli, Klebsiella 3.7.1.2.4 Toma de muestra de ojo
sp, Enterobacter sp, P. aeruginosa, Candida al- - Realizar la toma de muestra antes de colocado
bicans. analgésicos locales, colirio o antibióticos
- Proceder a la toma de muestra con hisopo ro-
3.7.1.2 Recolección de la muestra y tando suavemente el hisopo en el ángulo interno
transporte Previo a tomar la muestra del ojo e introducirlo en el medio de transporte
el paciente no debe estar tomando an- - Con un hisopo estéril y húmedo con solución
tibiótico. salina tomar la muestra y realizar los frotes gram
- Si es para investigar Chlamydia trachomatis,
3.7.1.2.1 Toma de muestra de Herida verter el párpado y frotar con una torunda la su-
- Realizar una buena asepsia de los bordes con perficie conjuntival y teñir con coloración Giem-
solución salina estéril, realizando de adentro sa. Observar inclusiones intracitoplasmaticas
hacia fuera en forma concéntrica
- Separa suavemente los bordes de la herida
con el pulgar e índice de la mano.
- Con la otra mano, con cuidado de no tocar los
bordes cutáneos, introducir la punta del hisopo
en la profundidad de la herida, rotando el hisopo
y avanzando hacia fuera.
- Obtener dos muestras
o Una para cultivo, introduciendo en un medio
de transporte amies, stuart.
o La segunda para realizar una coloración
Gram, KOH o ZN realizar inmediatamente. 3.7.1.2.5 Toma de muestra de Oído
- Enviar el medio de transporte al laboratorio.
- Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo
3.7.1.2.2 Toma de muestra de Absceso impregnado con Sol. Salina estéril
- Proceder a la toma de muestra con el medio
La toma de muestra de absceso debe ser toma- de transporte, de atrás hacia delante y de abajo
da por aspiración con jeringa. hacia arriba
-Realizar un frote para coloración Gram con un
- Realizar una limpieza de la superficie con so- hisopo estéril humedecido con sol. Salina esté-
lución salina, debe realizarse de adentro hacia ril, por sospecha de hongo
fuera en forma concéntrica.
Pág. 43
3.7.1.3 Aislamiento primario
- Realizar el inoculo en los medios de cultivo; si es material purulento colocar una gota en un
extremo del medio de cultivo; los medios de cultivo a usar son Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar
MacConkey, Agar Manitol Sal
- Flamear y enfriar un asa en argolla y proceder a estriar. A modo de obtener aislamiento de colo-
nias.
- Incubar el Agar sangre y Agar Chocolate en jara con candela a 37°C y el Agar MacConkey y
Manitol sal en aerobiosis a 37°C por 24 horas
- Observar crecimiento identificando bacterias patógenas. Realizar antibiograma
- Realizar la fijación del frote gram con el mechero y proceder a teñirlo con la coloración Gram o
ZN.
- Si a las 24 horas no hay crecimiento incubar por 24 horas más.
3.7.1.4 Identificación de principales microorganismos

3.7.1.4.1 Esquema de identificación de Cocos Gram positivo
Tabla No. 7 Identificación de Staphylococcus aureus y coagulasa negativa
Pág. 44
Tabla No. 8
Identificación de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y alfa hemolisis
Tabla No. 9
Identificación de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y beta hemolíticos
Tabla No. 10
Identificación de Cocos Gram positivo, catalasa negativa y gamma hemolisis
Pág. 45
3.7.1.4.3 Identificación de Gram Nega-
3.7.1.4.2 Identificación de Gram negativo no Fermentador Pseudomonas ae-
tivo Fermentadores Escherichia coli, roginosa
Klebsiella pneumoniae y Enterobacter Pseudomonas aeroginosa es fácil de reconocer
cloacae en medios de aislamiento primario por la morfo-
En agar MacConkey visualizar la morfología de logía de la colonia que son generalmente plana,
las colonias, (Tabla No. 11 Fig. 19) algo extendidas, bordes aserrados y tienen un
Escherichia coli: lactosa positiva, colonias de brillo metálico, por la producción de pigmentos
borde entero, color fucsia opacas de 2-3mm de difusibles si está presente porque algunas cepas
diámetro. Usualmente se observa una zona opa- no lo producen y son bastante mucoides y son
ca alrededor de la colonia. aislados de pacientes con fibrosis quística y el
Klebsiella pneumoniae: colonias de borde ente- olor característico.(Tabla No. 12, figura No. 20)
ro color rosado a rosado oscuro de 3-4 mm de
diámetro y aspecto mucoide. Tabla No. 12
Enterobacter spp: colonias de borde entero, co-
lor rosada 2-4 mm de diámetro, no tan mucoide
como Klebsiella pneumoniae.
Pág. 46
Mujeres adultas
- Colocar a la paciente en una camilla en po-
3.7.2 Secreción Vaginal sición ginecológica, introducir el especulo hasta
visualizar el cuello
3.7.2.1 Propósito - Introducir el hisopo tomar una muestra e intro-
ducirlo en un medio de transporte Stuart o Amies
La mucosa genital es una región vulnerable a la o Amies con carbón
infección producida tanto por microorganismos - Proceder a tomar dos muestras con hisopo,
constitutivos de la microbiota habitual como por uno para hacer el extendido para la tinción y otro
los adquiridos de forma exógena a través del colocarlo en solución salina estéril para observa-
contacto sexual, están normalmente coloniza- ción en fresco
das por diferentes microorganismos que inclu- - Las muestras en medio de transporte deben
yen estafilococos coagulasa negativo, corine- ser enviada inmediatamente al laboratorio, si no
bacterias, estreptococos, bacterias anaerobias es posible mantenerlo a temperatura ambiente y
y con menor frecuencia levaduras. En edad re- no exceder de 18 horas.
productiva destaca la presencia de Lactobaci- En mujeres embarazadas, en busca de Strep-
llus acidophilus, ejerciendo un control biológico tococcus agalactiae (beta-hemolitico del grupo
y un mecanismo de defensa para el epitelio va- B) se recomienda la toma de muestra introdu-
ginal. Las infecciones del tracto genital femeni- ciendo el hisopo por el canal vaginal sin colocar
no pueden ser de origen endógeno, causadas especulo.
principalmente por Gardnerella vaginalis, Strep-
tococcus agalactiae o Candida sp.
3.7.2.2 Recolección de la muestra y

transporte
Condiciones previas a la obtención de la mues-
tra, no estar en tratamiento de antibiótico, no
realizarse ducha vaginales ni relaciones sexua-
les 24 horas antes de la toma de muestra. Y no
bañarse el día de la recolección de la misma.
Tabla No. 13
En Niñas
En niñas NO utilizar especulo.
- Colocar a la niñas en posición ginecológica
- Realizar una previa limpieza para evitar conta-
minación con flora colonizante
- Utilizar hisopos finos estériles (Dacron) hume-
decido con solución salina y proceder a tomar la
muestra desde los labios menores, introducirlo
en medio de transporte Stuart o Amies o Amies
con carbón
- Utilizar otro hisopo para el extendido
Pág. 47
Tabla No. 14
3.7.2.3 Aislamiento Primario
- Proceder a realizar el inoculo en medios

de cultivo como Agar Sangre, Agar Choco-
late, Agar MacConkey, Thayer Martin, Mani-
tol Sal, rotando el hisopo sobre la superficie.
- Con asa en argolla flameada y fría proce-
der a dispersar la muestra en cuatro cua-
drantes a modo de tener colonias aisladas.
- Incubar las placas de Agar San-
gre, Chocolate y Thayer Martin a 35-
36°C en medio de CO2 por 24 horas Diagrama de identificación de N. gono-
- Las placas de MacConkey y Manitol Sal incubar- rrhoeae
la a 35-#6°C en ambiente aerobiosis por 24 horas
- Concluida las 24 horas observar cre-
cimiento de colonias sospechosas,
3.7.2.4 Identificación de principales

microorganismo
Examen en Fresco: Informar la presencia

de células descamativas, leucocitos y bac-
terias, presencia o ausencia de levaduras
y de trofozooitos de Trichomonas vaginalis.
Gram: Identificar células clave, que son cé-
lulas descamativas recubiertas por coco-
bacilos gram variable, Lactobacilos, pre-
sencia de polimorfonucleares, levaduras. 3.7.2.4.2 Identificación de Gardnere-
Giemsa: Observar cuerpos de inclusión lla vaginalis
sugestivas de C. trachomatis. La técni- Es un bacilo inmóvil no encapsulado de 0.5 por
ca citológica tiene baja sensibilidad, pu- 1.5 a 3 mm, anaerobio facultativo, catalasa y
diendo confirmar por medio de técnicas inmu- oxidasa negativo. El diagnostico se basa en la
nológicas o ampliación de ácidos nucleídos. presencia de al menos tres de cuatro criterios
clínicos por Amsel:1) Descarga fina, blanca ad-
3.7.2.4.1 Identificación presuntiva de herente y homogénea, 2) pH superior a 4.5, 3)
N. gonorrhoeae Prueba de Amina Positiva y 4) Células indicado-
ras o célula clave Tabla No. 15 y Fig. 23
Diplococos gram negativo en pareja, tétradas o Prueba de Aminas: olor característico a pescado
racimo en la tinción de gram, las colonias de color al añadir 1 gota de KOH a una gota de la secre-
rosada a café o grisáceas y brillantes de 0.5-1.0 ción.
de diámetro en medios agar Thayer Martin, oxi-
dasa positiva. Pruebas suplementarias típicas de
N. gonorrhoeae son (Tabla No. 14 figura No. 22)
Pág. 48
Tabla No. 15
3.7.2.4.4 Identificación de Candida

albicans
Se caracteriza por presentar colonias cremosas
de color blanco-amarillento, lustroso poco eleva-
do y de bordes bien definidos Figura No. 25
Tubos germinales
- Suspender un inóculo de la cepa pura de can-
dida de 24 horas de desarrollo en plasma huma-
no fresco (plasma EDTA)
- Incubar por 2 horas aproximadamente a 35-
36°C
- Luego colocar dos gotas en un portaobjeto,
cubrir con cubreobjeto, observar al microscopio
con objetivo 40X
- Interpretación:
3.7.2.4.3 Identificación de Strepto- Positivo: visualiza una estructura elongada que
coccus agalactiae se origina a partir de la levadura.
Streptococcus agalactiae o Estreptococo grupo Negativo: se ven las levaduras redondas sin
B de Lancenfield, es aerobio facultativo, gram elongación.
positivo, diplococo que se agrupan en cadena,
en agar sangre carnero al 5% crecen las colo-
nias de color gris a blanquecino, brillantes y un
poco más brillantes, produce beta hemolisis Ta-
bla No. 16 y fig. 24.
Tabla No. 16
Pág. 49
Chocolate, Agar Manitol Sal y Agar MacConkey
- Con un asa en argolla flamea y fría proceder
3.8 Esputo de cultivo bacteriano a realizar los estriados a modo de obtener colo-
3.8.1 Propósito nias aisladas
- Incubar el Agar Sangre y Chocolate en me-
El esputo es un material mucoso que se segre- dio de CO2 y los medios de Manitol Sal y Mac-
ga en los pulmones o bronquios. El cultivo de Conkey en ambiente aerobios a 35-36°C
esputo está indicado para investigar infeccio- - Realizar frote para tinción de Gram y Ziehl Ne-
nes respiratorias inferiores que pueden causar elsen
neumonía, bronquitis o tuberculosis. - Proceder a verificar colonias sospechosas de
La neumonía bacteriana o infección pulmonar patogenicidad y realizar pruebas primarias y
puede ser causada por: confirmatorias, y el antibiograma
a. Neumonía Neumocóccica: el agente causal
es el Streptococcus pneumoniae. Valoración de la muestras es adecuada toman-
b. Neumonía No Neumocóccica: el agente cau- do en cuenta el criterio de Murria con un frote
sal son Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus teñido de Gram.
aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus
influenzae, y ocasionalmente por otras entero- 3.8.3.1 Realización del frote del Esputo
bacterias. - Colocarlo una porción de la muestra sobre un
portaobjeto y con otro portaobjeto colocarlo en-
La muestra de esputo es muy importante para cimas y realizar leve presión luego deslizar los
poder realizar una buena identificación por tal portaobjetos en direcciones contrarias, a modo
razón la muestra debe ser tomada adecuada- de obtener frotes delgados
mente y rechazar las muestras que estén con- - Dejar secar, y fijarlos con calor sobre el me-
taminadas con saliva. chero pasando el portaobjeto tres veces
- Realizar la tinciones solicitadas, tinción de
3.8.2 Recolección de la muestra y gram y/o tinción de ziehl neelsen (ver Sec. 2.4)
transporte
Condiciones previas antes de la toma de mues- 3.8.3.2 Criterio de Murria
tra que el paciente no debe estar con terapia Para evaluar que la muestra este correctamen-
antibiótica, de preferencia la primera muestra te tomada se debe realizar un frote gram ob-
de la mañana y no realizar gargarismos con an- servarlo al microscopio con objetivo seco débil
tisépticos. (100x) evaluando las siguientes condiciones
Procedimiento según el criterio de Murray y Washington don-
- Indicar al paciente que se realice un lavado de son aceptables las muestras del grupo 4 y 5
bucal con agua, no cepillar los dientes con pas- Tabla No. 17:
ta dental
- Que el paciente se acuesta en la cama boca Tabla No. 17
abajo, que desgarre con fuerza el esputo
- Depositar la muestra en un frasco estéril de
boca ancha
- Enviar lo más pronto posible al laboratorio
3.8.3 Aislamiento primario

- Proceder a inocular los medios de cultivo te-
niendo en cuenta todas las medidas de biose-
guridad
- Con un palillo estéril o asa flameada y fría se-
leccionar porciones del esputo que contenga
sangre o pus
- Inocular en Agar Sangre Carnero al 5%, Agar
Pág. 50
3.8.4 Identificación de Principales Mi-
croorganismo
3.8.4.1 Identificación de Streptococ-

cus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae es el agente co-

mún de las enfermedades respiratorias bajas
y altas, tales como neumonía y otitis media
aguda, y meningitis.
3.8.4.2 Identificación de Haemophilus

influenzae
Es el agente etiológico más frecuente de enfer-

medades como neumonía, meningitis, otitis me-
dia y conjuntivitis. Son bacilos gram negativo,
pequeños o cocobacilos, anaerobios facultati-
vos, requieren factores de crecimiento X y V (X
= hematin, V = nicotinamide adenine dinucleoti-
de(NAD)), crecen en agar chocolate pero no en
agar sangre de carnero y tienen un olor picante
a indol, catalasa positivo, oxidasa positiva Figu-
ra No. 26
Pág. 51
una gota de plasma humano o de conejo sobre
un portaobjeto
4 Anexos - Mezclar suavemente con el asa y después por
4.1 Prueba de Catalasa rotación
Útil para comprobar la presencia del enzima ca- - Observar si hay aglutinación microscópica in-
talasa que se encuentra en la mayoría de las dicando positiva la prueba
bacterias aerobias y anaerobias facultativas
que contiene citocromo, excepto Streptococcus Positivo hay aglutinación dentro 5 a 20 segun-
sp. dos
Material Negativo no hay aglutinación dentro de 3-4 mi-
- Portaobjeto nutos
- H2O2 al 30% En tubo
Procedimiento - Tubo de vidrio estéril colocar 0.5 ml de una
- En un portaobjeto colocar una gota de H2O2 dilución 1:4 de plasma humano o de conejo
al 30% - Tomar una asada de bacterias, rotar suave-
- Tomar con una asa una colonia pura de 18-24 mente el tubo sin sacudir
horas y extender la colonia sobre el agua oxi- - Incubar por 4-6 horas observar a cada 30 mi-
genada suave nutos a 35°C
Positivo: formación de burbujas - No sacudir el tubo en cada chequeo, inclinar el
Negativo: no se observan burbujas tubo suavemente para ir observando el coagulo.
- Descartar el portaobjeto en recipiente con Positivo: formación de un coágulo
desinfectante Negativo: el plasma permanece líquido y no se
formó el coágulo.
4.2 Prueba de Coagulasa

Prueba usada específicamente para diferenciar
las especies del género Estafilococos. 4.3 Prueba de Manitol Sal
Procedimiento
- Sembrar la bacteria a estudio en un medio ma-
nitol sal
-Incubar a 36°C durante 18-24 horas
Positivo: Presencia de crecimiento y cambio de
La coagulasa es una enzima producida por S. color amarillo del medio indica utilización del
aureus, estable al calor, resistente a temperatu- manitol (S. aureus)
ras arriba de 60°C por 30 minutos. Negativo: No hay cambio de color en el medio,
Material permanece rosado o rojizo. (S. epidermidis )
- Plasma EDTA
- Portaobjeto o tubo
Procedimiento
En portaobjetos
- Preparar una suspensión gruesa y bien ho-
mogénea de cada microorganismo en una so-
lución salina estéril.
- Colocar una suspensión de la bacteria con
Pág. 52
4.4 Prueba de DNasa
El Staphylococcus aureus, produce una DNAa-
sa termoestable que hidroliza DNA. La pro-
ducción de DNAsa puede determinarse incor-
porando ácido desoxirrubonucleico (DNA) en
agar nutritivo
Material
- Agar nutritivo o agar DNAsa con azul de tolui-
dina 0.1 gr/l
- HCL 1%
Procedimiento
- Inocular la bacteria a estudio en mancha den-
sa sobre el agar nutritivo
- Incubar de 18 a 24 horas
- Revelar con HCL 1% que precipita el DNA
nativo del medio si se usa solo el agar Nutritivo
Interpretación: Colonias rodeadas por una
zona clara donde el ADN ha sido despolimeri-
zado e hidrolizado es una prueba positiva.
- Si se utiliza Agar DNasa, realizar una siembra
espesa formando un pequeño círculo de aprox.
1 cm
- Incubar a 36°C de 18-24 horas ambiente 4.5 Prueba de Novobiocina
aeróbico Se basa en que ciertas bacterias son sensibles
Positivo: producción de un halo rosado alrede- a la novobiocina.
dor de la colonia que produce DNAsa. Procedimiento
Negativo: no hay cambio de coloración en el - Realizar una suspensión de la bacteria a es-
medio. Alrededor de la colonia permanece tudio en caldo de tripticasa soya al 0.5 de Mac-
azul. Farland
- Inocular en agar Mueller Hinton con la metodo-
logía de Kirby Bauer
- Colocar el disco de novobiocina 5ug
- Incubar a 37 °C por 24 horas
- Un diámetro mayor o igual a 16mm de inhibi-
ción considerado como susceptible.
Sensible: S. epidermides
Resistente: S. saprophyticus
Pág. 53
contenga PYR L-pirrolidonil-b-naftilamida
- Incubar por 4 horas a 35°C
4.6 Prueba de Bacitracina A - Luego agregar un colorante diazo (NN-dime-
Esta prueba útil para el diagnóstico presuntivo til-amino-cinamaldehído)
de Streptococcus beta hemolítico del grupo A Positivo: un desarrollo de color rojo positivo
de Lancefield. (Estreptococos del grupo A y Enterococos)
Material Negativo: no hay cambio de color o se observa
- Agar Sangre Carnero al 5% un color naranja
- Disco de Bacitracina de 0.04 U Nota: algunos estafilococos pueden dar positiva
la prueba.
Procedimiento
- De una aislamiento puro de la colonia beta
hemolítica, suspender en 1 ml de caldo triptica-
sa alcanzar una turbidez similar al 0.5 MacFar-
land
- Con un hisopo realizar el inoculo en un agar
sangre carnero al 5%,
- Proceder a estriar en forma de tapete
- Con una pinza flameada y fría colocar un fis-
co de Bacitracina 0.04 U (Taxo A) en el centro
- Incubar por 16-24 horas en jarra con candela
- Examinar y observar un halo de inhibición
alrededor del disco de Taxo A.
4.8 Prueba de CAMP
Prueba para identificación presuntiva de Es-
treptococos del grupo B (Streptococcus agalac-
tiae beta hemolitico), es el único que produce
una prueba de CAMP positiva. La prueba de-
tecta una proteína extracelular estable al calor
difusible producida por Estreptococos del grupo
B que mejora la hemólisis de eritrocitos por el
Staphylococcus aureus.
Material
- Cepa ATCC S. aureus ATCC 25923
- Agar Sangre de Carnero 5%
Procedimiento
- La cepa de S. aureus ATCC 25923 rayar una
línea recta a través del centro de la placa de
Agar Sangre Carnero.
- Perpendicular a la raya del S. aureus realizar
el inoculo de la bacteria a estudio realizando
4.7 Prueba de PRY (pirrolidonilarila- una línea recta de 2-3 cms de longitud, pero sin
midasa) tocar.
Es una prueba presuntiva tanto Estreptococos - Incubar la placa a 37°C durante 18 – 24 ho-
del grupo A como del grupo D. Reemplaza la ras, en ambiente aeróbico.
prueba de Bacitracina y la prueba de toleran- Positivo: aparece como hemólisis “punta de
cia a la sal para Estreptococos del grupo A y flecha” entre la unión del crecimiento del S.
especies de Enterococo respectivamente. La aureus y Estreptococos del grupo B.
enzima detectada es la pirrolidonil arilamidasa Negativo: no se observa la formación de flecha
Procedimiento de hemólisis.
- Inocular la bacteria a estudio en caldo de que
Pág. 54
Procedimiento
- Una colonia aislada, sembrar en estría en la
zona del pico de flauta.
- Incubar a 35-36°C durante 24-48 horas
Interpretación
La aparición de un color castaño oscuro o ne-
gro en el medio indica hidrólisis de la esculi-
na. Si no hay cambio se considera negativa la
prueba
4.9 Prueba de Hidrólisis de Hipurato

Detectar la capacidad de la bacteria de hidro-
lizar el hipurato mediante la enzima hipurica-
sa. La hidrólisis de hipurato dará como resul-
tado glicina, que reaccionara con la ninhidrina
provocando un cambio de color.
Material
- Tubos con 0.4 ml de hipurato de sodio al 1%
Procedimiento
- Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipura-
to de sódio con el microorganismo 4.11 Crecimiento de NaCl 6.5%
- Incubar por dos horas 36-37°C Diferenciación de Streptococcus del grupo D
- Agregar 0.2 de ninhidrina, si agitar con respecto a Enterococos.
Positivo: Color morado fuerte ( S. agalactiae) Procedimiento
Negativo: no hay cambio de color (S. faecalis) - Inocular 2 ó 3 colonias del microorganismo
en el medio de caldo tripticasa soya + 6.5% de
NaCl
- Incubar a 35°C por 24-48 horas
- Observar el caldo de cultivo
Positivo: turbidez (enterococos)
Negativo: limpio no se observa crecimiento
4.10 Bilis Esculina

Propiedad de algunos microorganismos de hi-
drolizar el glucósido esculina en esculetina y
glucosa, la esculetina producida reacciona con
un sal de hierro incorporada al medio, dando
un color castaño oscuro o negro.
Pág. 55
- Agregar 0.5 ml de solución salina al otro tubo
Control
4.12 Prueba de Sensibilidad a Optoqui- - Agitar suavemente ambos tubos e incubarlos a
na 35°C por 3 horas
La prueba se utiliza un disco de 6mm con 5ug Positivo: Desaparece la turbidez del tubo prueba
de optoquina, tiene como objetivo diferenciar (S. pneumoniae)
Streptococcus pneumoniae de las de Estrepto- Negativo: permanece turbio.
coco viridans. En Agar
Procedimiento - Colonias aisladas en un agar sangre de car-
- Inocular una colonia alfa-hemolítica con un asa nero, agregar una gota de deoxicolato de sodio
estéril en una placa de Agar Sangre Carnero al al 2% (diluir el reactivo al 10% 1:10 con agua
5%, extender la bacteria. destilada)
- Colocar asépticamente un disco de optoquina - Sin invertir la caja incubar a 35°C por 30 minu-
o disco P sobre el estriado. tos
- Incubar en ambiente de CO2 por 18-24 horas Positivo: las colonias desaparecen dejando una
a 36°C. zona de hemólisis parcial en el área donde se
- Interpretar los resultados encontraban. (S. pneumoniae)
Sensible: presencia de un halo mayor a 14mm Negativo: Las colonias son insolubles y perma-
(S. pneumoniae), si se usa disco de 10 mm el necen intactas. (Estreptococos del grupo viri-
halo será mayor o igual a 16mm dans)
Resistente: No hay presencia de halo de inhibi-
ción son estreptococos viridans
4.13 Solubilidad en Bilis 4.14 Prueba de Satelitismo

La prueba de solubilidad en bilis es otra prueba Se conoce como satelitismo al fenomeno de
para identificación de S. pneumoniae. H. influenzae de crecer en colonias diminutas
cercanas a una bacteria productora de factor V
Procedimiento cuando se cultiva en agar sangre de carenro.
En tubo Esto ocurre generalmente con Staphylococcus
- Transferir 0.5 ml de un cultivo de 18-24 horas beta hemolítico porque produce altas cantidades
de un caldo TOdd Hewitt a dos tubos limpios. de factor V (NAD).
- Agregar una gota de rojo de fenol a cada uno
de los tubos Procedimiento
- Ajustar el pH a 7 con NaOH 0.1N -En un agar Sangre de Carnero al 5% estriar en
- Agregar 0.5ml de doxicolato de sodio al 10% a toda la superficie en una sola dirección de Hae-
uno de los dos tubos (Prueba) mophilus.
Pág. 56
- Tomar una asada de un cultivo de Staphylo-
coccus aureus o beta hemolítico, realizando
una estria perpendicular al sembrado.
- Incubar en jarro con canderla o en CO” por 24
horas a 36°C,
- Luego examinar el crecimiento de pequeñas
colonias puntiformes muy cerca de la estria de
estafilococo.
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Pág. 59
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TAMIZAJE, AISLAMIENTO,
IDENTIFICACION Y SENSIBILIDAD DE MICOBACTERIAS
Rosa Alvarez, Diana Baldizon

Margarita Boloix, Hèctor Catú
Lis Jerez, AnaLucia Lemus
1. INTRODUCCION
En la última década, la tuberculosis (TB) ha resurgido como una de las mayores causas de muerte
ya que anualmente se registran cerca de 3 millones; en 1995 causó más de 75,000 muertes en
Latino América y el Caribe, lo cual significa que cerca de 1,100 personas enfermaron y más de
200 murieron por TB cada día. Se estima que existen 8.8 millones de nuevos casos cada año
que corresponden a 52,000 muertes por semana o más de 7,000 cada día, lo que se traduce en
más de 1,000 nuevos casos cada hora, cada día. Estas tasas de muerte reflejan solo parcialmen-
te la tendencia global de la TB, ya que más del 80% de los pacientes se encuentran en la edad
económicamente activa (15 – 49 años). Se estima que en el año 2000, 2 mil millones de personas
se encuentran infectadas con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium, 3 millones de
personas mueren anualmente por complicaciones de tuberculosis en todo el mundo. Se calcula
que hay 8 millones de nuevos casos cada año, el 95% de los cuales aparecen en países en vías
de desarrollo. En los países industrializados, el 80 % de los casos aparecen en personas mayores
de 50 años; en los países en vías de desarrollo el 80% se produce entre los 15 y los 50 años. Se
estima que 3 millones de personas que padecen tuberculosis también tienen VIH/SIDA.
Existen factores predisponentes en los países en vías de desarrollo como:
Inmigración de personas de zonas de alta endemicidad.
Condiciones socioeconómicas bajas en ciudades con alta población.
Aumento de personas infectadas con VIH/SIDA.
Durante las primeras décadas del siglo XX, se dio una disminución progresiva de la incidencia de
la tuberculosis, y alcanzó su menor nivel a comienzos de la década de 1980. Muchos microbió-
logos pensaron que la tuberculosis estaba por ser vencida, dado que la enfermedad alcanzó la
línea basal de cero en muchas partes del mundo a fines de la década de los 70’s. Pero sucedió
todo lo contrario.
Actualmente las tasas de morbilidad y mortalidad han aumentado, con el aparecimiento de cepas
resistentes de Mycobacterium a múltiples drogas y por el VIH/SIDA.
Para Guatemala la Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó una tasa de incidencia de 80
por cada 100,000 habitantes en el año 2000.
La epidemia del Síndrome de Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y el descenso de los estánda-
res socioeconómicos, entre otros, contribuyen al resurgimiento de
la enfermedad en países industrializados. Aunque en la mayoría
de los países en desarrollo, la TB ha sido siempre endémica, su
severidad se ha incrementado debido a la pandemia del Virus de
Inmunodeficiencia Humana (VIH) y a los niveles de pobreza impe-
rantes. La situación de la TB a nivel mundial se ha agravado con
el aparecimiento de cepas multirresistentes a las drogas antituber-
culosas, que incrementan las tasas de mortalidad y representan
un serio problema para el control de esta enfermedad, por ello la
realización de una susceptibilidad antibiótica con un perfil delimita-
do de antibióticos es de gran ayuda para poder evitar y/o disminuir
la multirresistencia y poder brindar tratamientos efectivos.
Pág. 60
La TB puede ser tanto pulmonar, que es la más
2. GENERALIDADES común y ocurre en más del 80% de los casos,
como extrapulmonar. Es importante mencionar
La TB es una enfermedad infecciosa aguda o que aproximadamente un 90% de las personas
crónica que en nues- que se infectan nunca desarrollan la enferme-
tro medio es la infec- dad ya que el bacilo permanece “dormido” den-
ción humana más im- tro del organismo del huésped y su presencia
portante causada por (infección) puede determinarse por una reac-
micobacterias puede ción positiva a la prueba tuberculínica ó PPD
afectar a cualquier (derivado proteico purificado). Además es ne-
tejido del organismo cesario poder determinar la presencia de la en-
pero generalmente se fermedad para poder minimizar la cantidad de
localiza en los pulmo- pacientes con cepas resistentes a los medica-
nes por la inhalación mentos antituberculosos y poder disminuir con
del agente causal que por lo general es Myco- ello la cantidad de enfermos bacilíferos crónicos
bacterium tuberculosis (muy rara vez M. bovis o en las comunidades.
M. africanum). El nombre de Tb deriva de la for-
mación de unas estructuras celulares caracte- 3. PROPÓSITO E IMPORTANCIA
rísticas denominadas tuberculomas, donde los
bacilos quedan encerrados. Este microorganis- La finalidad primordial es demostrar por medio
mo, tiene forma bacilar, es aerobio estricto, de de coloraciones, pruebas de tamizaje, cultivos
crecimiento lento, inmóvil, no poseen cápsula especiales y pruebas de identificación la pre-
ni producen esporas, se tiñe con dificultad por sencia de bacterias que pertenecen al género
su contenido alto de grasas en la pared celular Mycobacterium, especialmente Mycobacterium
por lo que el colorante a utilizar debe poseer tuberculosis. Aproximadamente doce especies
fenol y/o realizarse con calor por lo que una vez de éste género se asocian a infección humana,
teñidas con fuchsina carbólica (fenolada) no se pero en nuestro medio Mycobacterium tubercu-
decoloran al agregar el alcohol acidificado y de losis es la especie de mayor importancia.
allí el término “Bacilos alcohol ácido resisten- La detección de micobacterias es una gran res-
tes” (BAAR). Es resistente al frío, la congela- ponsabilidad para el laboratorio de microbiolo-
ción y desecación. Es muy sensible al calor, la gía, ya que un resultado positivo de frote o culti-
luz solar y ultravioleta. Se divide lentamente, vo implica serias consecuencias para el paciente
por lo que su crecimiento es lento. y afecta su vida con un tratamiento específico
por varios meses, o incluso años; por lo que un
La TB se transmite de un enfermo con tubercu- resultado positivo debe informarse de inmediato
losis pulmonar a otras personas por medio de al médico responsable. Se debe tener todo el
pequeñas gotitas que el paciente expulsa, al to- cuidado de no confundir las muestras, especial-
ser o estornudar. El riesgo a infectarse depen- mente cuando hay en grandes cantidades; se
de de la concentración de gotitas en el aire y recomienda trabajarlas de cinco en cinco. Esto
del período de tiempo que se respire; se reduce evitara que se den resultados falsos ya que los
mediante la renovación del aire, por ventilación mismos traerían serias consecuencias para el
del exterior y paciente.
por la expo-
sición a la luz 3.1. TUBERCULOSIS PULMONAR Y TU-
solar o rayos BERCULOSIS EXTRAPULMONAR
ultravioleta. El diagnóstico de la TB extrapulmonar depende
Cada enfermo de la probabilidad de encontrar los bacilos en
puede conta- los sitios de infección, los cuales se encuentran
giar a 10 a 15 en cantidades muy pequeñas, excepto si hay
personas. caseificación o formación de cavidades,
Pág. 61
4.1. Nivel I
las biopsias del tejido pueden rendir resultados
positivos en comparación a los fluidos en donde Realiza lo siguiente:
el número de los bacilos se ve disminuido por la a. Recolección de muestras clínicas adecuadas
dilución. El diagnóstico de la TB extrapulmonar (incluyendo esputo inducido por aerosol).
es difícil a menudo por su localización en sitios b. Transporte y envío de muestras a un labora-
del organismo de acceso complicado, además torio de nivel superior para el aislamiento e iden-
el carácter serio de esta forma de tuberculosis tificación.
se debe frecuentemente a su diagnóstico tar- c. Puede preparar y examinar frotes para el
dío. diagnóstico presuntivo y/o como monitoreo del
progreso de los pacientes diagnosticados que
Previo a la están siendo tratados con medicamentos.
pandemia del
VIH, aproxi- 4.2. Nivel II
madamente
el 15% de Además de todas las funciones del laboratorio
los nuevos Nivel I, realiza lo siguiente:
casos de TB a. Procesa muestras para su cultivo en medios a
eran extra- base de huevo y medios a base de agar y hue-
pulmonares. vo.
Estos casos b. Identificación de Mycobacterium tuberculosis
son de difícil c. Puede realizar estudios de susceptibilidad an-
diagnóstico, dado que son menos comunes a timicrobiana con drogas antituberculosas prima-
los médicos y porque los sitios de infección son rias
menos accesibles y visibles. La TB extrapulmo- d. Retiene cultivos de micobacterias para test
nar más frecuente son la linfática, pleural, geni- adicionales o repetición de pruebas (se reco-
tourinaria, miliar, ósea, meníngea y peritoneal. miendan 6 meses de retención)
Los pacientes con TB pulmonar activa son alta-
mente infecciosos para otros pacientes y para 4.3. Nivel III
el personal de cuidados de salud, como ya se
ha mencionado en la parte de introducción del Además de las funciones de los laboratorios I y
presente trabajo. Este tipo de transmisión se II, realiza lo siguiente:
asocia a desarrollo rápido de la enfermedad en a) Identificación de todas las especies micobac-
unas cuatro semanas, con mal pronóstico. De terianas de muestras clínicas
igual manera este tipo de transmisión contribu- b) Puede realizar estudios de susceptibilidad
ye en los casos de alta resistencia. . antimicrobiana de micobacterias
El aumento de casos de Tb extrapulmonar, crea c) Puede dirigir investigaciones y brindar entre-
la necesidad de un mejor diagnóstico y nuevas namiento.
técnicas para el aislamiento y susceptibilidad
micobacteriana, estableciendo como punto crí- 5. TOMA DE MUESTRA Y PROCEDI-
tico el menor tiempo posible para el aislamiento MIENTOS POR TIPO DE MUESTRA
y la información sobre la drogo resistencia de
las micobacterias. TOMA DE MUESTRA
4.NIVELES DE LABORATORIO Actualmente se realiza la implementación de

Los niveles de laboratorio en micobacteriología técnicas que producen resultados exactos y pre-
han sido adoptados por la Sociedad Torácica cisos en menor tiempo. El motivo principal es el
Americana (American Thoracic Society), la cual mejoramiento de la calidad del servicio que se le
ha establecido tres niveles de la siguiente ma- presta al paciente y al sistema hospitalario.
nera:
Pág. 62
mal que contamina la orina a su paso, de tal
manera que la orina por micción contiene un
Para lograr esto es necesario que todo el per- pequeño número de bacterias. Debido a que es
sonal médico y de enfermería encargado de necesario distinguir los microorganismos con-
la obtención y extracción de muestras conozca taminantes de los etiológicamente importantes,
los procedimientos estandarizados para tales se debe de efectuar un examen cuantitativo de
propósitos, a manera de evitar falsos resulta- orina para que los resultados puedan ser signi-
dos. ficativos.
Para una selección y recogida correctas de ma-
terial de cultivo es necesario comprender las lo-
calizaciones, variedades y papel de la microbio-
ta normal de la región urinaria.
5.1.2. Toma de Muestra
La toma de muestra de orina es muy importan-

te, pues la veracidad de los resultados depende
casi en un 100% de la forma correcta en la cual
Es preciso entonces, establecer la responsabi- se recolectó la muestra.
lidad e importancia de la TOMA DE MUESTRA,
ya que resulta ser la clave en el aislamiento de TABLA No 1. BACTERIAS COMUNES EN
cualquier microorganismo, depende de esta en VIAS GENITO-URINARIAS
un 100% obtener resultados satisfactorios, en
menor tiempo, lo que conduce a un tratamiento
efectivo del paciente.
Para obtener un buen resultado en el aisla-
miento de microorganismos, en especial de
micobacterias, es preciso comenzar con una
buena toma de muestra, tener una buena es-
tandarización en el preparado de medios de
cultivo, con los que se hará el aislamiento co-
rrecto para tener una identificación posterior. La
pureza del aislamiento determinará el éxito de
la sensibilidad y por consiguiente del tratamien-
to del paciente.
5.1. MUESTRAS DE ORINA
5.1.1. Propósito e importancia
En la actualidad, el examen de micobacterias

en la orina se hace cuando hay signos o sín-
tomas de una tuberculosis renal, insuficiencia
renal o hipertensión. Debe hacerse siempre en
personas, en que se sospecha infección gene-
ral y ya ha sido comprobado que no es de tipo
bacteriano, o tengan antecedentes de tubercu-
losis. Washington JA. Bacteriología Médica. En Lynch MM
La orina excretada por el riñón es estéril a me- Diagnóstico Clínico por el laboratorio
nos que el riñón este infectado. La orina de la +/- Irregular + común ++ predominante
vejiga no contaminada también es estéril. Sin
embargo, la uretra contiene una microbiota nor-
Pág. 63
inyectar la muestra en un tubo expulsando las
burbujas de aire que pueda contener la jeringa,
5.1.2.1. Chorro medio u orina al vuelo y se lleva de inmediato al laboratorio.
Este tipo de muestra constituye la única mues-
Hombre: tra de orina aceptable para cultivos anaerobios,
• Limpiar el meato urinario con agua y jabón. se indica únicamente en pacientes con bacte-
• Colectar la orina a la mitad de la micción en riuria anaerobia. Este tipo de infección es rara
un recipiente estéril tratando de que la orina no y se sospecha su existencia cuando aparecen
toque la boca del frasco. cultivos negativos de especimenes con frotes
• Llevar la orina al laboratorio. positivos para tinción de Gram.
Mujer: 5.1.2.4. Catéter

• Limpiar la vulva con bastante agua y jabón,
teniendo cuidado de quitar bien el jabón. NO es aconsejable debido al riesgo de bacte-
• Secar el área. riuria asociada al procedimiento. El riesgo es del
• Separando los labios, colectar la orina a la mi- 1% en hombres y mujeres ambulatorias, y hasta
tad de la micción en un recipiente estéril tratan- el 20% en mujeres en trabajo de parto.
do de no topar la boca del frasco con los labios.
• Llevar la orina al laboratorio. 5.1.3. Procesamiento de la muestra
Niños: Como se mencionó con anterioridad la orina es

• En los niños pequeños para evitar al máximo estéril, pero también puede encontrarse conta-
la contaminación es necesario limpiar la región minada con alguna bacteria además de encon-
genital con agua y con jabón y/o con solución trarse presente la micobacteria. Por lo que toda
salina. muestra de orina debe pasar por un proceso de
• Colocar la bolsa estéril sobre la región. decontaminación.
• En el momento de obtener la muestra, retirar
cuidadosamente la bolsa, de manera que la ori- 5.1.4. Requerimientos e instrucciones
na no se escurra. especiales de muestra de orina
• Cerrar la bolsa y llevar inmediatamente al la-
boratorio. a. Recolectar 40 ml de orina como mínimo
b. No debe ser recolección por fracciones, ni ori-
5.1.2.2. Sondas permanentes na de 24 horas
c. La primera orina de la mañana
En caso de tenerse un catéter a permanencia d. Tomarla con todas las medidas asépticas se-
con un sistema cerrado de colección, obtener ñaladas con anterioridad
la muestra: e. Utilizar un frasco estéril, de boca ancha.
a. Limpiar el área del catéter o sonda con anti- f. Si se trata de un bebé se tomará en una bolsi-
séptico. ta pediátrica.
b. Utilizando una aguja y jeringa estériles intro- g. El protocolo de evaluación es enviar cinco
ducir en el área desinfectada. muestras de forma seriada
c. Dejar la muestra dentro de la jeringa. NO
trasvasar a un recipiente estéril. 5.1.5. Preparación de la muestra pre-
d. NO recolectar la muestra de la bolsa o des- vio a la elaboración de frotes
conectando el catéter del tubo de recogida.
a. Mezclar cuidadosamente la muestra a mane-
5.1.2.3. Punción o aspirado suprapúbi- ra de obtener una muestra representativa
co b. Transferirla a un tubo con tapón de rosca. Uti-
lizar la mayor cantidad posible
En este procedimiento se obtiene la muestra. c.Centrifugarla por 15min a 3000rpm
Directamente de la vejiga. Se recolecta con
aguja y jeringa estériles; se efectúa la punción;
Pág. 64
tivo para la recuperación de micobacterias de
muestras sanguíneas y MO. El medio incluye
d. Descartar el sobrenadante con cuidado de un agente lítico (saponina), SPS y otros suple-
no perder la mayor cantidad de sedimento mentos que eliminan el paso de procesamiento,
e. Tomar con una pipeta de vidrio 1 gota del se- evitan la coagulación de la sangre y mejoran
dimento y colocarla en un portaobjetos, esperar el crecimiento de las micobacterias. Se puede
a que se seque dentro de la campana (repetirlo inocular directamente un volumen de 3 a 5 ml
por 3-5 veces) a manera de obtener un frote de sangre, y se incuban entre 35°C – 36°C.
que contenga una cantidad representativa Las botellas contienen 29 ml de medio y un sen-
f. Esperar a que se seque por lo menos 10 mi- sor interno que detecta dióxido de carbono como
nutos para evitar que se lave al teñir indicador de crecimiento microbiano. El sistema
registra lecturas cada 10 minutos.
5.2. MUESTRAS DE SANGRE Y MÉDU-
LA ÓSEA REACTIVOS
En condiciones normales la sangre y la médula a. Botellas de tapón negro

ósea (MO) son estériles. Debido a que la piel BacT/Alert MB: frascos estéri-
normal está cubierta de abundante microbiota les y desechables, contienen 29
normal es muy importante tomar la muestra en ml de medio y un sensor interno
condiciones totalmente asépticas. que detecta dióxido de carbono
como indicador del crecimiento
NOTA IMPORTANTE: Todos los especí- bacteriano. NO AIREAR LAS BO-
menes deben de considerarse potencialmente TELLAS. El medio contiene:
infecciosos, por lo que deben de tenerse en • Caldo Middlebrook 7H9 (0.47%
cuenta las medidas universales para p/v)
su manipulación y desecho adecua- • Síntesis pancreática de caseína
do. (0.1% p/v)
Observaciones importantes • Glicerol (1.0% p/v)
La recuperación de micobacterias en • SPS (0.025% p/v)
un hemocultivo depende de los si- • Agua purificada
guientes factores: b. Líquido de enriqueci-
miento MB7BacT: El conteni-
• Obtención de la muestra de sangre en condi- do total del frasco es de 5.5 ml. Se
ciones asépticas. compone de:
• Cantidad de sangre cultivada y momento de la • Albúmina sérica bovina (14.5%
toma de muestra. p/v)
• La relación entre la sangre y el caldo de cul- • Cloruro Sódico (2.5% p/v)
tivo, la cual debe ser 1:10, es decir sangre al • Ácido oleico (0.174 % p/v)
10%. • Saponina (4.4% p/v)
• Se debe de tomar el hemocultivo antes de ini- • Agua purificada
ciar un tratamiento con antibióticos
c. Suplemento de antibióticos: Re-
5.2.1. Medio de cultivo para aislamien- quiere de dos componentes los cuales
to de micobacterias de muestras de se complementan:
sangre y Médula Ósea
Botellas de tapón negro para aislamiento de mi-

cobacterias tanto de sangre como de MO. Las
botellas BacT/ALERT MB en combinación con
el Líquido de enriquecimiento y el suplemento
de antibióticos son un medio de cultivo selec-
Pág. 65
vena y obtener asépticamente 3ml-5ml de san-
Manejo del suplemento antibiótico ya gre.
reconstituido: g. Inyectar la sangre en la botella que contiene
• Reconstituir con 10 ml del líquido reconstitu- el caldo. Se debe de inyectar la sangre suave-
yente. mente sin hacer presión en el émbolo, de mane-
• Guardar en refrigeración una vez reconstituido ra que se evite la hemólisis que puede interferir
de 2-8ªC en el momento de la interpretación de la positi-
• Es estable 7 días después de reconstituido. vidad del cultivo.
• Un vial de 10 ml de antibiótico reconstituido h. Después de obtenida la muestra, llevar los
alcanza para 20 botellas. frascos al laboratorio lo más rápidamente po-
sible. Antes de transcurridos 30 minutos. En el
Conservación del medio de cultivo Botellas para transcurso de este tiempo se le debe agregar
obtención de la muestra. tanto el suplemento antibiótico como el líquido
Conservar los frascos en un lugar seco, fres- de enriquecimiento, una vez transcurrido este
co, en oscuridad y a temperatura ambiente. NO tiempo, no tendrá ningún valor para la muestra
REFRIGERAR. Una exposición prolongada a el agregar ambos constituyentes.
la luz directa podría alterar el indicador fluores- i. NO REFRIGERAR por ninguna razón.
cente. j. Colocar la identificación correspondiente en el
Por ningún motivo deben de airearse las bote- frasco utilizando ÚNICAMENTE la zona des-
llas. tinada para ello. NO COLOCAR MASKING
TAPE, MICROPORE, o cualquier otro tipo de
5.2.2. Toma de muestra de sangre y tape alrededor del frasco.
Médula Ósea Procedimiento para toma de muestra de Médula
Procedimiento para toma de muestra de sangre Ósea.
por venopunción. a. Las muestras de médula ósea para cultivo
a. Tomar la botella para micobacterias. Revisar de micobacterias siempre deben ser obtenidas
y examinar los frascos con el fin de eliminar por el médico, quien puncionará el esternón o
cualquier frasco que presente signos de con- la cresta ilíaca. Procesar exactamente igual que
taminación o defectos. Identificar con los datos para muestra de sangre.
del paciente. b. Tomar la muestra tomando todas las medidas
b. Tomar la botella, Retirar la cápsula o tapón asépticas necesarias
de protección que se encuentra en el tapón del c. De la PRIMERA FRACCIÓN obtenida ino-
frasco. NO DESCARTARLA, y con algodón cular las cajas de petrí que contienen agar Sa-
empapado en solución yodada al 3% en alco- bouraud, Micosel y Micosel con sangre ya que
hol (tintura) limpiar perfectamente bien el tapón ésta es la porción más rica en lo que a celulari-
perforable. Dejar secar mientras se atiende al dad se refiere.
paciente. d. De la SEGUNDA FRACCIÓN inocular un
c. Extraer las muestras de manera aséptica con volumen de 3 a 5 ml en las botellas para cul-
el fin de reducir los riesgos de contaminación. tivo BacT/ALERT MB que en combinación con
Utilizar en general una jeringa o un dispositivo el Fluido de enriquecimiento y el suplemento de
de toma de muestra con cánula antibióticos son un medio de cultivo selectivo
d. Colocar la ligadura en el brazo del paciente; para la recuperación de micobacterias de mues-
palpar la vena y localizar exactamente el sitio tras sanguíneas y otros líquidos
de la punción. e. Si va a llevarse en jeringa debe ser la mayor
e. Limpiar el sitio exacto donde se localizó la cantidad posible con un anticoagulante como
vena con un algodón empapado de tintura de SPS ó heparina en relación 1:1 (No utilizar
yodo al 3%. con movimientos en círculo, hacien- EDTA)
do una espiral que inicia en el sitio de punción f.Transportarlas a temperatura ambiente al labo-
y termina en la parte de afuera. NO vuelva a ratorio durante la primera hora luego de la toma
palpar la vena. Dejar secar. de muestra (NO REFRIGERARLAS)
f. Con aguja y jeringa estériles, puncionar la
Pág. 66
alcanzar la temperatura ambiente) con una je-
ringa estéril en forma aséptica.
5.2.3. Precauciones para el uso de los f.NO DEBEN DE TRANSCURRIR MAS
frascos DE 30 MINUTOS PARA AGREGAR EL
LIQUIDO DE ENRIQUECIMIENTO Y EL
a. Los frascos de cultivo de micobacterias son SUPLEMENTO ANTIBIÓTICO, DESDE
para uso in vitro. EL MOMENTO EN QUE FUE TOMADA
b. Antes de utilizarlos los frascos deben ser LA MUESTRA. Un mayor tiempo puede al-
observados. NO utilizar frascos que presenten terar los resultados.
signos de contaminación, Ej.: color amarillo o g. Luego de haber tratado las botellas (líquido
turbidez. No utilizar frascos que presenten al- de enriquecimiento y suplemento antibiótico)
gún daño. introducir la botella en el equipo BacTAlert 3D y
c. No pegar nada sobre la ventana de lectura, registrarlo, asignándole una posición.
y tampoco sobre el código de barras. Utilizar h. Registrar la posición y completar la hoja de
UNICAMENTE la zona de identificación. registro con los datos correspondientes.
d. No descartar la cápsula o tapón de protec- i. Llenar la hoja de trabajo adjuntando la pape-
ción. Colocarla en el frasco nuevamente des- leta y colocarla en su cartapacio respectivo.
pués de haber inoculado éste. j. Leer diariamente la botella durante 42 días.
e. Antes de inocular la botella desinfectar el ta- k. Si el equipo da alarma de positivo, sacarlo y
pón con alcohol o solución yodada. colocar en la hoja de registro la fecha y la hora
f. Inyectar asépticamente con la aguja montada a la cual dio positivo. Hacer frote de Ziehl Nee-
en la jeringa, el volumen necesario de sangre, lsen y reportarlo.
teniendo cuidado de NO PRODUCIR HEMÓLI- l. Si el cultivo es negativo, luego de 42 días de
SIS ya que esta interfiere en la lectura de los incubación, hacer un frote de ZN al caldo de
frascos. la botella, si es negativo, reportarlo negativo.
g. Los frascos inoculados deben de ser trans- Anotar en la hoja de registro la fecha y la hora.
portados al laboratorio en el menor tiempo po-
sible. 5.2.5. Preparación de la muestra pre-
h. NO ABRIR EL FRASCO POR NINGÚN vio a la elaboración de frotes
MOTIVO.
SANGRE Y MÉDULA ÓSEA
5.2.4. Tratamiento de la muestra en el a. Transferir a un tubo estéril con tapón de ros-
laboratorio ca
b. Centrifugar la mayor cantidad de la muestra
Una vez que la botella ha sido ingresada correc- posible por 15min a 3000rpm
tamente al laboratorio proseguir de la siguiente c. Descartar el sobrenadante con mucho cuida-
manera: do porque la mayor de la parte como su nom-
a. Chequear que los datos del paciente estén bre lo indica es líquida
completos, tanto en la papeleta de ingreso d. Del sedimento tomar de 2-3 gotas para rea-
como en la botella. lizar el frote
b. Identificar las pruebas que se le realizarán a e. Si es Líquido Cefalorraquídeo: tomar con
la botella y si es el medio adecuado para ello. una pipeta de vidrio 1 gota del sedimento y co-
Botellas de tapón negro para cultivo y aisla- locarla en un portaobjetos, esperar a que se
miento de micobacterias. seque (repetirlo por 3-5 veces)
c. Retirar la tapa de protección y limpiar con al- f.Hacer la tinción
cohol el tapón perforable.
d. Agregar 1.0 ml de líquido de enriquecimiento 5.3. MUESTRAS DE LÍQUIDO CEFALO-
con una jeringa estéril en forma aséptica. RRAQUÍDEO, LAVADOS Y OTROS LÍ-
e. Posterior al líquido de enriquecimiento, agre- QUIDOS CORPORALES
gar 0.5 ml de Suplemento de antibiótico (esta
solución debe de sacarse de la refrigeradora y 5.3.1. Propósito e importancia
Pág. 67
El LCR usualmente se colecta en 3 o 4 partes,
El diagnóstico rápido, temprano y preciso de de 2 a 5ml cada una, en tubos o recipientes es-
meningitis tiene un lugar predominante en- tériles. Esto permite el examen más convenien-
tre las urgencias médicas. Depende en alto te y de más confianza para los distintos valores
porcentaje de mantener un elevado índice de que determinan la conducta a seguir por el mé-
sospecha, de obtener en forma adecuada las dico.
muestras y examinarlas a la mayor brevedad.
Debido al elevado riesgo de muerte y/o daño El análisis básico efectuado al LCR y al Líquido
tisular irreversible, a menos que se inicie un tra- pleural y otros líquidos corporales:
tamiento inmediato, rara vez hay una segunda • Cultivo de rutina
oportunidad de obtener una segunda muestra • Cultivo para tuberculosis y hongos.
pretratamiento, lo que hace esencial la primera • Análisis químico (proteínas y glucosa)
muestra para el diagnóstico etiológico específi- • Análisis físico y citológico (aspecto del líquido,
co y óptima atención al paciente. recuento de células, fórmula diferencial).
El dato diagnóstico más urgente es la diferen- • Pruebas de látex para detección de antígeno
ciación entre la meningitis bacteriana purulenta de Cryptococcus neoformans.
y la meningitis granulomatosa y la meningitis
viral. 5.3.3. Requerimientos e instruc-
ciones para el procesamiento de la
Las muestras que se incluyen dentro de Líqui- muestra
dos corporales son:
Líquidos corporales
• Líquido cefalorraquídeo (LCR) • 5-10 ml como mínimo (enviar el máximo de
• Líquido ventricular volumen posible)
• Líquido abdominal (peritoneal, de paracente- • Obtenido en condiciones asépticas
sis, diálisis biliar) • En recipiente estéril
• Líquido pleural, toracentesis y empiema (obte- • Enviar la muestra fraccionada para otros exá-
nidos de tórax) menes microbiológicos
• Líquido pericárdico
• Líquido sinovial Lavados
• 5-10 ml como mínimo
5.3.2. Toma de muestra para Líquido • Recipiente estéril y desechable
Cefalorraquídeo • En ayunas (para asegurar coleccionar la
muestra que ha sido tragada durante el sueño)
La punción lumbar se lleva a cabo con técnica • El Broncoscopio debe estar estéril (evitar con-
aséptica estricta, teniendo cuidado de no pro- taminar con agua de chorro por las micobacte-
vocar compresión del bulbo por extracción rápi- rias saprofíticas)
da del líquido cuando la presión intracraneana
esta notablemente elevada. 5.4. MUESTRAS DE HECES
5.4.1. Propósito e importancia
Demostrar por medio de cultivo, la presencia

de micobacterias. Es decir, micobacterias que
infectan el intestino. Esto causa diarrea, dolor
abdominal, fiebre y en ocasiones la muerte.
Es importante que en pacientes con VIH/SIDA
se realice un diagnóstico diferencial de la si-
guiente manera, utilizando las siguientes tincio-
nes:
Pág. 68
• Recipiente estéril (frasco o caja de petri de vi-
drio sellado (a))
• No sumergir las muestras en solución salina,
formol o formalina
Secreciones
• 0.5 ml como mínimo
• En recipiente estéril, de preferencia en jerin-
gas (si se va a coleccionar la muestra por medio
de una punción es mejor si se cuenta con las de
tipo tuberculina)
• El área de toma de muestra debe estar bien
limpia
5.4.2. Requerimientos e instrucciones • Si son hisopos deben transportarse en Stuart
para el procesamiento de la muestra o Amies
de heces
5.5.2. Preparación de la muestra para
• 1 gr. aproximadamente la elaboración de frotes
• En recipiente estéril, desechable y de boca an-
cha Biopsias de tejido
• Llevar inmediatamente al laboratorio • Colocarla en una caja de petri estéril de vidrio
preferentemente
5.4.3. Preparación de la muestra de • Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, so-
heces para la elaboración de frotes lución salina o agua destilada estéril
• Triturar con bisturí la biopsia en partes peque-
• Observar las características de la muestra y ñas a manera de formar una mezcla homogénea
buscar la parte dónde se encuentre mucoso o • Transferir la solución a un tubo
con estrías de sangre • Agitar por 5min aproximadamente en vortex
• De esta muestra suspender 1 gramo apro- • Centrifugar la solución por 15min a 3000rpm
ximadamente en 2-5ml de caldo 7H9 Middle- • Descartar el sobrenadante
brook, solución salina o agua destilada estéril • Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar
en un tubo estéril el frote
• Agitar en vórtex por 5min • Hacer la tinción
• Centrifugar por 15min a 3000rpm
• Descartar el sobrenadante con cuidado de no Biopsias de Hueso
perder la mayor cantidad de sedimento • Colocarla en una caja de petri estéril de vidrio
• Del sedimento tomar de 2-3 gotas para reali- preferentemente
zar el frote • Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, so-
• Hacer la tinción lución salina o agua destilada estéril
• Si no se observan BAAR NO procesar la • Triturar con bisturí a manera de formar partícu-
muestra para cultivo las lo más pequeñas posibles.
• Hacer por lo menos tres improntas frotando
5.5. MUESTRAS DE BIOPSIAS Y SE- una laminilla contra otra a manera de obtener
CRECIONES VARIAS un frote en cada uno de los extremos y uno en el
centro de la lámina portaobjetos
5.5.1. Requerimientos e instrucciones • Hacer la tinción
para el procesamiento de la muestra
5.6. MUESTRAS DE ESPUTO
Biopsias La muestra de esputo es de utilidad para investi-
•1 gr. aproximadamente gar la causa de infecciones respiratorias inferio-
• Obtenido en condiciones asépticas res (bronquitis, neumonía) y en la investigacion.
Pág. 69
cualquier muestra que no cumpla con el Valor
de tuberculosis. Siempre hay bacterias en una Q establecido.
muestra de esputo, por la contaminación del
material bronquial con saliva. Una muestra de 5.6.2. Procedimiento para obtención
esputo es satisfactoria para estudio si contiene de la muestra.
secreciones respiratorias inferiores.
Esputo para infección bacteriana
Muestras que consisten solo de material hiali-
no o liquido o con abundante saliva son recha- • Obtenerse la primera muestra de la mañana,
zadas por inadecuadas y no ser procesadas dado que el la más espesa y no está contami-
(Ver Valor Q.). En casos muy especiales puede nado con comida.
estudiarse una punción transtraqueal. Aspira- • Indicar al paciente que al despertar se enjua-
dos o lavados bronquiales son adecuados en el gue la boca con agua corriente (sin ningún tipo
paciente intubado o en respirador, si se trans- de antiséptico o pasta dental). Luego acostado
porta el material al laboratorio en una jeringa o en su cama, boca abajo, expectore esputo con
contenedor estéril. fuerza, tosiendo, y lo deposite directamente en
un recipiente estéril de boca ancha (proporcio-
La neumonía bacteriana, o infección del pul- nado por el laboratorio), sin mantenerlo en la
món causada por bacterias puede ser de dos boca para evitar que se mezcle con saliva.
tipos: • Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo muco-
- Neumocóccica: Causada por Streptococcus purulento son suficientes para el gram y el cul-
pneumoniae tivo de rutina, así también para el cultivo de mi-
- No neumocóccica: Causada por Klebsiella cobacterias (BK).
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Strepto- • Llevar la muestra de inmediato al laboratorio.
coccus pyogenes, Haemophilus influenzae y • Realizar el valor Q, para establecer la calidad
rara vez por otras bacterias. de la muestra y establecer si es apta para su
procesamiento.
Los cultivos bacterianos del esputo son un pro-
blema importante, suelen ser recolectados sin 5.6.3. Procesamiento de la muestra de
cuidado, y a menudo son mas representativos Esputo
de saliva que de las secreciones respiratorias Para que una muestra de esputo, sea válida
inferiores, además contienen de ordinario gran para su adecuado cultivo, debe de cumplir con
cantidad de bacterias propias de la cavidad oral ciertos criterios. Estos criterios determinan la
y en pacientes graves hospitalizados contienen Calidad de la muestra, y su representatividad.
con frecuencia bacilos gram negativo que han A continuación se encuentra la tabla para Cál-
colonizado la orofaringe después de la hospita- culo de valor Q. Este método se basa en la
lización. Este tipo de cultivos carece de sensibi- cuantificación de leucocitos polimorfonucleares
lidad y especificidad y son, por lo tanto, difíciles y células epiteliales presentes en la muestra, de
de interpretar. manera que la relación entre éstos determina el
Valor de la calidad del esputo, y por consiguien-
5.6.1. Toma de muestra. te su aceptación o rechazo para cultivarse.
La infección bacteriana de tráquea y bronquios

produce abundante esputo. En el caso del diag-
nóstico de neumonía y tuberculosis es crucial
obtener una buena muestra. El cultivo de ma-
terial no satisfactorio (saliva), causa confusión
al médico, ya sea porque no se detectó el ver-
dadero patógeno, o se cultivó un patógeno in-
cidental sin importancia como agente etiológico
primario. Por esta razón el laboratorio rechaza
Pág. 70
TABLA No. 2 DETERMINACIÓN DEL VALOR Q
TABLA No. 3 Resumen de Requerimientos de Muestras
Pág. 71
La sensibilidad del frote se incrementa de
acuerdo al tipo de coloración. Son más sensi-
6. PREPARACIÓN Y OBSERVACIÓN DI- bles los frotes teñidos con Auramina-Rodami-
RECTA DE UNA MUESTRA na, tinción fluorescente que necesita de un mi-
croscopio fluorescente. Estas técnicas aunque
Las tinciones utilizadas para observación di- más sensibles resultan ser más costosas y no
recta son Ziehl Neelsen, Kinyoun y Aurami- cualquier laboratorio cuenta con un microsco-
na-Rodamina, conocidas como tinciones de pio de fluorescencia.
alcohol-ácido resistencia y juegan un importan-
te papel en el diagnóstico temprano de infec- La importancia de conocer la sensibilidad y la
ciones por micobacterias. La baciloscopía ha especificidad de la baciloscopía en especíme-
sido adoptada por la mayoría de los países en nes de formas pulmonares y extrapulmonares
desarrollo como el procedimiento diagnóstico de la tuberculosis, se encuentra en el hecho de
de elección en los enfermos sintomáticos res- que en muchas instituciones de atención mé-
piratorios por ser un método sencillo, rápido, dica y servicios de urgencias no cuentan con
confiable y económico. otros métodos diagnósticos de reconocida sen-
Las paredes celulares de las micobacterias sibilidad y especificidad como el cultivo. Si bien
debido a su alto contenido de lípidos, le con- la complejidad del cultivo y su costo resultan ser
fieren la propiedad de ligarse al colorante de mayores que la baciloscopía, es mejor alterna-
carbolfuchsina y ser decolorados con una solu- tiva en comparación a otras técnicas sofistica-
ción de alcohol ácido, de ahí su nombre Bacilos das. Por lo tanto, la baciloscopía no puede ser
Alcohol Ácido Resistente (BAAR). Del mismo utilizada como única opción en el diagnóstico
modo, los ácidos micólicos de la pared celu- de la tuberculosis extrapulmonar y se debe utili-
lar de las micobacterias tienen afinidad por los zar el cultivo en todos los especímenes no pul-
fluorocromos auramina-rodamina, los cuales monares.
emiten fluorescencia a cierta longitud de onda En un estudio realizado en el Hospital Universi-
en el microscopio de fluorescencia, permitien- tario de la Universidad León, México, se llegó a
do observar a las micobacterias fácilmente. establecer que únicamente pudieron detectar-
se el 30% de los casos por medio de un frote di-
Respecto a la especificidad es de 99%, ya que recto, y no un 70% como lo señala la literatura.
en la mayoría de los casos los BAAR observa-
dos en esputo corresponden a Mycobacterium Como sabemos existen muestras en las cuales
tuberculosis. Pero respecto a su sensibilidad no la cantidad de bacilos se encuentra muy diluida
es óptimo, ya que puede existir variación del y no llega a ser suficiente para ser detectada
9-46%. Se estima que deben existir de 5,000- mediante un frote directo de la muestra, y ni aun
10,000 bacilos/ml de expectoración para que cuando la misma es centrifugada, por lo que no
puedan ser detectados al microscopio. Es por puede confiarse solamente en la baciloscopía y
ello que se recomienda que las muestras para cualquier caso que sea altamente sospechoso
tinción sean de forma seriada mínimo tres), y debe de ser cultivado y esperar el resultado de
en el caso de orina se recomienda que sean éste, para dar como negativo al paciente.
cinco.
6.1. Preparación de un extendido
En la enfermedad extensa donde se eliminan Todas las fases de preparación del extendido
grandes cantidades de micobacterias, existe deben ser sistematizadas y estandarizadas; la
una buena relación entre frote y cultivo y la sen- disposición del material debe ser siempre la
sibilidad es alta. Pero muchos pacientes pre- misma, de manera que se pueda obtener una
sentan enfermedad mínima o menos avanzada seguridad máxima y garantizar la calidad de la
donde la cantidad de micobacterias es menor técnica.
y la correlación disminuye llegando a ser de un Algunas recomendaciones son las siguientes:
25–40%. - Cada serie de muestras a procesar no debe
exceder de doce.
Pág. 72
• Fijar el extendido pasándolo por encima del
incinerador dentro de la campana (es el más
- Debe utilizarse un portaobjetos (laminilla) por seguro).
cada de las muestras. • Pasar la lámina por el área azul de la llama de
- Los portaobjetos deben ser nuevos de prefe- un mechero Bunsen tres o cuatro veces, pero
rencia ó en buen estado y desgrasados (sumer- evite el sobrecalentamiento.
girlos en alcohol al 95% y pasarlas por la llama • Permita que los frotes se fijen en un calentador
del mechero) eléctrico (65 a 70ºC) al menos por 2 horas.
- Los colorantes deben conservarse en frascos • Colocar las láminas en un recipiente con me-
de color ámbar por un máximo de 3 meses. tanol absoluto por un minuto (puede haber con-
taminación de muestras por micobacterias suel-
Algunas muestras necesitan tratamiento previo tas).
para poder realizar los extendidos, para esto NOTA: la fijación por calor puede que no mate
revise cada una de las secciones por tipo de todas las micobacterias, por lo tanto las láminas
muestra, en la sección Preparación de la mues- deben ser manejadas cuidadosamente y des-
tra para la elaboración de frotes. cartadas en un recipiente adecuado después de
su observación.
Procedimiento h. Antes de sacar las manos de la campana qui-
a. Asignar un número de identificación a la tarse un par de guantes, dejarlo dentro de ella
muestra y colocarlo a la laminilla con tinta inde- dentro de una bolsa de descarte.
leble i. LOS FROTES TANTO POSITIVOS COMO
b. Ordenar las muestras con numeración ascen- NEGATIVOS DEBEN GUARDARSE POR LO
dente de forma horizontal. MENOS SEIS MESES.
c. Colocar cada laminilla frente al envase co-
rrespondiente teniendo el cuidado de no dejar 6.2. Procedimientos de Tinción alco-
impresiones digitales en la parte de la lámina hol-ácido resistencia
reservada para el extendido.
d. Colocarse la bata, la mascarilla, doble par de El diagnóstico de las micobacterias es basado
guantes y lentes de seguridad. en la observación de BAAR en las muestras y su
e. Realizar los frotes colocando la muestra uti- cultivo in vitro, para poder observarlos es nece-
lizando un asa bacteriológica, un palillo o una sario realizar coloraciones como la de Ziehl-Ne-
pipeta sobre la laminilla dependiendo el tipo de elsen (utiliza calor) o Kinyoun (no utiliza calor y
muestra, haciendo un extendido fino y circu- su fuchsina es más concentrada).
lar, de aproximadamente 3 cm. de diámetro y La característica de “alcohol-ácido resistencia”
en dos terceras partes de la laminilla (No hacer típica de las micobacterias hace que la bacilos-
más de un frote por laminilla para evitar confu- copía tenga una importancia fundamental ya
siones), luego se dejan secar dentro de la cam- que se utiliza para seguir el curso del tratamien-
pana. Para que se sequen se necesita por lo to y para dar de alta al paciente en el hospital,
menos esperar de 10 a 15 minutos. para luego poder continuar con su tratamiento
f. Si se trata de esputo es preferible hacer el fro- ambulatorio.
te con palillo de madera cortado en “L” ya que
por la consistencia mucosa de la muestra tien- 6.2.1. Coloración de Ziehl-Neelsen:
de a adherirse mayor cantidad de muestra en a) Fijar el frote con calor dentro de la campana
él que en un asa. Se debe tener en cuenta que b) Dejar enfriar
el lugar en dónde hay más probabilidades de c) Colocar papel filtro
encontrar bacilos está en las partículas sólidas, d) Agregar fuchsina carbónica sobre el frote, ca-
verdosas y sanguinolentas de la expectoración lentar cuidadosamente la lámina por debajo, ya
y en gran medida el resultado del examen desea con un mechero o con un algodón con al-
pende de la elección de esas partículas. cohol hasta emitir vapores blancos (no hervir) y
g. Fijar el frote por alguno de los siguientes mé- dejar reposar por 5 minutos.
todos:
Pág. 73
debe repetirse el frote.
g) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso • En caso de que se observen bacilos con mor-
h) Agregar azul de metileno fología dudosa solicitar una nueva muestra
i) Permitir el reposo del colorante por 1-2 minu- para control.
tos • Si el frote es muy grueso es probable que se
j) Lavar con agua de chorro desprenda de la lámina durante la coloración
k) Permitir que el frote se seque al aire por esto debe evitarse la transferencia de BAAR
l) Examinar con objetivo de inmersión de una preparación a otra por medio del aceite
de inmersión, lentes sucios o colorantes (por lo
6.2.2. Coloración de Kinyoun: que debe limpiarse con papel limpialentes entre
una y otra muestra)
a) Fijar el frote con calor dentro de la campana • Ocasionalmente, la buena selección de las
b) Agregar fucshina de Kinyoun sobre el frote y partes anormales de la muestra para preparar el
dejar reposar por 4 minutos frote puede dar resultados mucho mejores que
c) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso el uso de concentraciones.
d) Agregar alcohol-ácido y dejar reposar por 1-2 • Puede ocurrir que la misma muestra sea nega-
minutos tiva por frote, pero positiva por cultivo pero no lo
e) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso contrario, porque la baciloscopía es menos sen-
f) Agregar azul de metileno sible para detectar micobacterias que el cultivo.
g) Permitir el reposo del colorante por 1-2 mi- • Un frote para diagnóstico de Tb debe exami-
nutos narse de 8-10 minutos antes de darse por nega-
h) Lavar con agua de chorro tivo. Si se trata de LCR debe observarse aún
i) Permitir que el frote se seque al aire por más tiempo.
j) Examinar con objetivo de inmersión • La liberación irregular de micobacterias de los
focos endotraqueales puede dar frotes positivos
6.3. Interpretación e informe de Baci- y negativos en el mismo paciente.
loscopías
Hay varias tablas para el reporte de la cuantifi-
• Los extendidos deben examinarse total y cui- cación de baciloscopía. La siguiente forma de
dadosamente con lente de inmersión (100x) y reportar ha sido estandarizada por la Asociación
oculares 10x y una gota de aceite de inmersión. Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Res-
• Se debe limpiar completamente el lente de piratorias de los Estados Unidos. con el objeto
inmersión entre una y otra muestra que se ob- de poder comparar los resultados de distintos
serve. laboratorios y poder orientar de forma adecua-
• Los bacilos son aproximadamente de 1 a 10 da al personal médico.
μm de largo y aparecen como bacilos ó como Tabla No. 3 Cuantificación de Baciloscopía
bastoncitos delgados bien definidos, ligera-
mente curvos (pueden aparecer doblados) te-
ñidos de rojo brillante (se aprecian mejor con
luz intensa), generalmente con gránulos más
coloreados en su interior, aislados, en parejas o
en pequeños grupos, destacados sobre el azul
claro de la tinción de fondo.
NOTA: algunas micobacterias distintas a Myco-
bacterium tuberculosis pueden aparecer pleo-
mórficas que van desde bacilos largos hasta
Fuente: Asociación Nacional de Tuberculosis y Enferme-
formas cocoides.
dades Respiratorias de Estados Unidos.
• En el frote pueden aparecer artefactos alco-
BAAR (Bacilos alcohol-ácido resistentes)
hol-ácido resistentes, especialmente si el frote
es grueso o no fue suficientemente decolorado.
• En caso que se observen muy escasos BAAR
Pág. 74
trocelulosa capturan este complejo inmunológi-
co que se hace visible gracias a la presencia
del marcador de oro coloidal.
Un resultado positivo (una banda visible de co-
lor púrpura/gris) indica que el antígeno LAM de
las micobacterias está presente en la muestra
en el límite de detección de la prueba o por en-
cima de él.
Fuente: Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social Un resultado negativo (sin banda visible de co-
de Guatemala. lor purpura/gris) indica que este no está presen-
› (mayor) ‹ (menor)
NOTA: De 1-4 BAAR en toda la lámina Repetir muestra te o que se encuentra por debajo del límite de
Si la cantidad de BAAR en la nueva muestra sigue sien- detección. Con el fin de garantizar la validez del
do la misma el resultado es POSITIVO (+) ensayo se ha incorporado una banda de control
de procedimiento en el dispositivo del ensayo.
7. PRUEBAS DE TAMIZAJE
Materiales
Las pruebas de tamizaje son pruebas que ayu- • Tarjetas de análisis de la prueba Alere Deter-
dan a dar un diagnóstico presuntivo de infec- mineTM TB LAM Ag 10 tarjetas (10 pruebas por
ción por Mycobacterium tuberculosis. Se ob- tarjeta)
tiene un resultado más rápido que el cultivo y • Recipientes de recolección de orina
generalmente más sensible que las tinciones. • Pipetas con precisión de 60 µL
Sin embargo, deben ser interpretadas correla- • Tips descartables
cionando la clínica del paciente y los datos de • Temporizador
la historia clínica del paciente.
Obtención de la muestra
7.1. PRUEBA DE LAM Antes de recoger la muestra de orina, se reco-
Principio mienda limpiar la zona genitourinaria con una
La prueba de antígeno de LAM es un análisis toalla limpia. Recoja la orina en un recipiente
inmunocromatográfico diseñado para la de- estándar de recolección de orina fresca.
tección cualitativa del antígeno lipoarabinoma- Conservación de la muestra
nano (LAM) de las micobacterias en orina hu- 1.Si se conservan a temperatura ambiente las
mana. La prueba Alere DetermineTM TB LAM muestras de orina fresca pueden utilizarse a lo
Ag emplea anticuerpos altamente purificados, largo de las 8 horas siguientes a la obtención.
específicos del principal antígeno polisacárido 2. Si el análisis se va a realizar a lo largo de los
del género Mycobacterium: lipoarabinomanano 3 días posteriores a la obtención de las muestra
(LAM). de orina, estas deben almacenarse a una tem-
peratura de entre 2 y 8 °C. Si el análisis se va a
Estos anticuerpos se utilizan tanto como traza- realizar más de 3 días después, se deben con-
dores de captura como de detección. Los an- gelar las muestras a -20 °C o menos.
ticuerpos de captura se absorben en la mem- 3. Si las muestras están congeladas o refrige-
brana de nitrocelulosa de las tiras reactivas. El radas, se deben poner a temperatura ambiente
anticuerpo de detección se marca con un con- una hora antes de utilizarlas.
jugado de partículas de oro coloidal. 4.Las muestras congeladas pueden contener
agregados. Todas las muestras congeladas se
Una vez que la muestra de orina se haya agre- deben centrifugar a 10,000 g durante 5 minutos
gado a la sección de muestra, los anticuerpos a temperatura ambiente. La muestra a utilizar
conjugados con oro coloidal se adhieren al an- se recoge con cuidado del sobrenadante.
tígeno LAM y la muestra los libera de la sección 5.Evitar ciclos de congelado/descongelado re-
petidos. No se pueden utilizar las muestras que
de conjugado. A continuación, los anticuerpos
se hayan congelado y descongelado más de
anti-LAM inmovilizados en la membrana de ni-
tres veces.
Pág. 75
Procedimiento
1. El número deseado de unidades de prueba

de las 10 tarjetas de análisis pueden extraerse
doblando o rasgando la perforación.
Inserto Prueba de LAM, Alere
NOTA:
La extracción de las unidades de prueba debe iniciarse 7.2. GENEXPERT
en el lateral derecho de la tarjeta de análisis con el fin
de conservar el número de lote que aparece en el lateral Principio
izquierdo de esta.
El análisis debe iniciarse a lo largo de las 2 horas poste-
El sistema GeneXpert integra y automatiza el
riores a la retirada de la cubierta protectora de aluminio
de cada prueba. procesamiento de muestras, la amplificación de
ácidos nucleicos y la detección de las secuen-
2. Retire la cubierta protectora de aluminio de cias diana en muestras sencillas o complejas
cada prueba. mediante ensayos de PCR y PCR de transcrip-
tasa inversa en tiempo real. El sistema consta
3. Aplique 60 µL de la muestra (pipeta de pre- de un instrumento, una computadora, un lector
cisión) a la sección de muestra (sección blanca de códigos de barras y un software precargado
marcada con el símbolo de la flecha). para la realización de pruebas con las mues-
tras recogidas y la visualización de los resulta-
4. Espere un mínimo de 25 minutos y lea el re- dos. Este sistema requiere el uso de cartuchos
sultado. Visualice la tira en un entorno con una GeneXpert desechables de un solo uso para
iluminación interior estándar o en la sombra. los reactivos y el proceso de PCR. Dado que
No la visualice bajo la luz directa del sol. Los los cartuchos son independientes, se elimina
resultados permanecen estables hasta unos 35 el riesgo de contaminación cruzada entre las
minutos después de haber aplicado la muestra. muestras.
Si han transcurrido más de 35 minutos no lea
los resultaos de la muestra. El Xpert MTB/RIF incluye reactivos para la de-
tección de MTB y la resistencia a RIF, así como
Control de calidad un control de procesamiento de la muestra
(SPC, por sus siglas en ingles) para controlar el
En la tira de reacción se debe observar una procesamiento adecuado de las bacterias dia-
banda control de la prueba. Si, una vez aca- na y detectar la presencia de inhibidores en la
bado el ensayo, la banda de control no torna a reacción PCR. El control de comprobación de la
un color purpura/gris, el resultado de la prueba sonda (PCC, por sus siglas en inglés) comprue-
no es válido y no se debe volver a analizar la ba la rehidratación de los reactivos, el llenado
muestra. del tubo de PCR en el cartucho, la integridad de
la sonda y la estabilidad del colorante.
Interpretación de los resultados
Los cebadores del Xpert MTB/RIF Assay am-
Para facilitar la lectura e interpretación de los plifican una parte del gen rpoB que contiene la
resultados cuando éstos se observan muy pá- región central de 81 pares de bases. Las son-
lidos, se puede utilizar la Tarjeta de Escala de das son capaces de distinguir entre la secuen-
Referencia (incluida en el kit), la cual se sostie- cia natural conservada y las mutaciones de la
ne a la par del resultado. región central que se asocian a la resistencia a
rifampicina.
Pág. 76
3. Aparecerá una pantalla para seleccionar se-
sión en windows, seleccione “cepheid” e intro-
Materiales duzca la contraseña “cphd”
• Cartuchos Xpert MTB/RIF con tubos de reac- 4. Al ingresar a windows, el software de genex-
ción integrados. pert se iniciara automáticamente, si no, presio-
• Sistema GeneXpert Dx equipado con el sof- ne el icono de genexpert dx software en el es-
tware GX4.0. critorio.
• Recipientes estériles y herméticos, con tapa 5. Introducir el usuario y contraseña correspon-
para toma de muestra. diente para cada usuario.
• Guantes desechables y protección ocular 6. Al ingresar, aparecerá un recuadro pregun-
• Etiquetas o rotulador permanente tando si quiere hacer algún manejo de la base
• Pipetas de transferencia para el procesamien- de datos, presionar “no”.
to de la muestra 7. Luego aparecerá un recuadro preguntando si
quiere hacer un backup, presionar “no”.
Procedimiento 8. Al terminar de ingresar los módulos del ge-
• Limpie adecuadamente el área de trabajo nexpert deben aparecer en el lado izquierdo
(pase un algodón con cloro 10% y luego otro como “disponibles”.
con etanol 70%, secar con algodón) 9. El equipo está listo para usar.
• Remueva un cartucho y un vial del reactivo de
muestra del kit GeneXpe rt MTB/RIF Actualización de un test (nueva versión)
• Agregue 2 volúmenes de reactivo de muestra 1. Introduzca el cd que viene con el nuevo kit
por una de esputo en el recipiente colector (2:1) de reactivos en el lector del cds del computador.
NOTA: para este paso, se puede utilizar la muestra di- 2. Dentro del software, presione el botón “definir
recta; es decir, sin haber realizado proceso de deconta- ensayo”.
minación o se puede utilizar muestra ya decontaminada.
En general, todas las muestras se decontaminan primero 3. Presione el botón “importar” en la parte infe-
y únicamente las muestras de líquido cefalorraquídeo se rior de la pantalla.
utilizan directas. Para ver el proceso de decontaminación 4. En la ventana que se despliega seleccionar el
de muestras previo a este paso, consultar sección 8.2 y directorio del cd en la barra superior.
ubicar el método de decontaminación que se esté reali- 5. Abra la carpeta de que corresponde para el
zando, de preferencia el método de NALC-NaOH ya sea
con reactivos preparados in house o comerciales. sistema genexpert (“nombre de la prueba” ge-
nexpert system).
• Enrosque adecuada mente la tapa 6. En la carpeta seleccione el archivo con termi-
• Asegúrese que la tapa cierre adecuadamente. nación “.gxa”
• Mezcle el contenedor vigorosamente 10- 20 7. Presiona “aceptar”
veces. 8. En la parte izquierda de la pantalla “definir
• Dejar reposar a temperatura ambiente por 15 ensayo” aparecerá la nueva versión del test ac-
minutos (al minuto 10 vuelva a mezclar). tualizado listo para usarse.
• Utilizando la pipeta desechable transfiera,
CUIDADOSAMENTE la muestra (llene la pipe- Realización del test en el GeneXpert
ta hasta la marca). 1. Presione el primer botón en la parte superior
• Agregue la muestra al contenedor de mues- del software “crear ensayo”
tra, despacio, evite salpicaduras. 2. En la ventana que se despliega lea el código
• Cierre la tapa del cartucho. de barras del cartucho del ensayo ya preparado.
• Coloque el cartucho en el equipo antes de 30 3. Al leer el código de barras en la ventana apa-
minutos recerá la información del ensayo a realizar.
4. Coloque la identificación de la muestra en el
Encendido del equipo apartado “id de muestra”.
1. Encienda el equipo presionando el switch en 5.Si desea cambiar el modulo en el que será
la parte posterior del equipo genexpert. procesada la muestra selecciónelo.
2. Encienda la computadora. 6.Cuando esté listo para procesar la muestra
presione el botón “iniciar”.
Pág. 77
1. Después de terminar de procesar las mues-
7. Aparecerá el recuadro para que introduzca tras, saque los cartuchos de los módulos.
de nuevo su usuario y contraseña, introdúzca- 2. Cierre el software presionando en la “x” de la
los. parte suprior derecha.
8. Al darle “ok” la luz del módulo seleccionado 3. Aparecerá un recuadro preguntando si quiere
para procesar la muestra empezara a parpa- hacer algún manejo de la base de datos, presio-
dear. nar “no”.
9. Introduzca el cartucho en el módulo y cierre 4. Luego aparecerá un recuadro preguntando si
la compuerta. quiere hacer un backup, presionar “no”.
10. El equipo iniciara 5. El software se cerrara.
11. a procesar su muestra. El tiempo restante 6. Presione “inicio” en la barra de inicio de win-
dependerá del ensayo a realizar. dows.
7. Presione “apagar”
Inserto del test MTB/RIF Cepheid 8. Apague el monitor.
Apagado del equipo Resultados e interpretación
Pág. 78
malaquita) ó en Middlebrook 7H10 (sales de
fosfato y magnesio, vitaminas, cofactores, ácido
Precauciones y limitaciones oléico, albúmina, catalasa, glicerol y dextrosa)
cuando es necesario enriquecer las muestras,
• Trate todas las muestras biológicas, incluidos recuperarlas o para conservación de cepas se
los cartuchos usados, como posibles agentes utiliza el segundo medio de cultivo que se ha
transmisores de infecciones. mencionado.
•Todas las muestras biológicas deberán tratarse
con las medidas de precaución habituales
• Utilice guantes protectores desechables, bata
de laboratorio y protección ocular cuando mani-
pule las muestras y los reactivos.
• Lávese las manos a fondo tras manipular las
muestras y los reactivos de la prueba.
• Siga los procedimientos de seguridad del cen-
tro para trabajar con productos químicos y ma-
nipular muestras biológicas.
• Si se va a procesar más de una muestra a
la vez, abra solo un cartucho, añada la mues-
tra tratada con el reactivo de la muestra (o una
muestra liquida descontaminada) y cierre el car-
8.1. Muestras
tucho antes de añadir la muestra tratada con el
reactivo de la muestra al siguiente cartucho.
Las muestras para realizarles cultivo de mico-
• No abra la tapa del cartucho Xpert MTB/RIF
bacterias están clasificadas dentro de dos cate-
salvo para añadir la muestra tratada.
gorías:
• No use un cartucho que se haya caído o agita-
• De origen pulmonar (esputo, liquido y biopsia
do después de añadir la muestra tratada.
pleural, hisopados laríngeos, cepillados y lava-
dos bronquiales).
8. CULTIVO DE MICOBACTERIAS EN
• De origen extrapulmonar (orina, heces, piel,
LOWENSTEIN JENSEN
sangre, médula ósea, tejidos blandos, aspirados
suprapúbicos de vejiga, biopsias, líquido cefalo-
Los procedimientos para obtener el crecimiento
rraquídeo (LCR), líquido pericárdico, líquido pe-
in vitro de las micobacterias son especializados;
ritoneal, secreciones varias, fluidos y muestras
deben seguirse estrictamente las instrucciones
tisulares en general).
para tener éxito en su recuperación. Por lo gene-
De estas categorías hay dos niveles:
ral, las muestras para cultivo contienen muchas
bacterias de las microbiotas, especialmente el
Tabla No. 5 Tipos de muestras.
esputo que siempre se contamina con microbio-
ta de la boca. Además el esputo es una mues-
tra difícil de manipular por su mucosidad, tena-
cidad y adherencia. Por estas razones para su
cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo
líquido y descontaminarse; es decir darle algún
tratamiento químico para destruir las bacterias
contaminantes que crecen rápido, pero sin des-
truir a las micobacterias.
El cultivo se realiza en Lowenstein Jensen que

es un medio muy nutritivo (Huevos enteros fres-
cos, fécula de papa, glicerol, sales de fosfato
y magnesio, L-asparagina, glicerol y verde de
Pág. 79
bovina 0.2%, o caldo líquido para micobacte-
rias (Ej. Middlebrook 7H9 ó Dubos) al triturador
Las muestras normalmente contaminadas ya de tejido. Si la muestra es mucoide puede agre-
sea por microbiota normal que es arrastrada al garse N-acetil-L-cisteína (NALC)
obtenerla o por su propia naturaleza requieren - Mantener el tubo de lado e insertar el pistilo.
el paso de digestión-decontaminación, por el Empujar la muestra al fondo del tubo
contrario las muestras normalmente no conta- - Detener el tubo en la mano, empujar el pistilo
minadas no lo requieren pero en la mayoría de hacia delante y atrás en ángulo 90˚
los casos pueden requerir de concentración. En - Triturar la muestra hasta lograr una suspen-
la tabla No.6 se encuentra la preparación se- sión homogénea
gún tipo de muestra previo al procedimiento de - Remover cuidadosamente el pistilo del tubo.
decontaminación. Utilizar un volumen pequeño de medio para en-
* Si se cuenta con triturador para biopsias pro- juagar la punta del pistilo dentro del recipiente
ceder de la siguiente manera: de descarte
- Transferir la muestra al triturador de tejido es- - Tapar el tubo con un tapón de rosca estéril
téril usando un asa o aguja para colocarla en la
pared lateral del tubo del triturador
- Agregar 10 partes de NaCl 0.85%, albúmina
TABLA No. 6 PREPARACION DE MUESTRAS PREVIO AL PROCEDIMIENTO
DECONTAMINACION
Pág. 80
preparación genera calor.
8.2. Métodos para decontaminación Combinar volúmenes iguales de las solucio-

de muestras. nes 1 y 2, autoclavear a 121˚C por 15 minutos
en balones de preferencia con tapón de rosca.
Las micobacterias se recuperan óptimamente NOTA: la solución puede ser guardada a tempe-
de muestras clínicas cuando se utilizan méto- ratura ambiente, pero es preferible que se man-
dos para liberarlas de células y fluidos corpo- tenga en refrigeración; la desventaja de tenerla
rales (digestión) y para remover o reducir los preparada es que el hidróxido de sodio forma
organismos competidores (decontaminación). estructuras blancas como precipitado y en éste
Ningún método es ideal para todas las mues- caso ya no puede utilizarse; por lo que de pre-
tras clínicas en todas las circunstancias. Algu- ferencia hay que prepararlo el día que va a ser
nos métodos utilizan un solo reactivo tanto para utilizado.
digerir como para decontaminar, mientras que
otros utilizan reactivos separados para estas A continuación se presentan cantidades de di-
dos funciones. Cualquiera que sea el método gestor y decontaminante dependiendo de la
elegido, se debe estar prevenido de las limita- cantidad de solución total necesaria para traba-
ciones inherentes al método por lo que deberá jar un determinado número de muestras:
seguir el procedimiento de digestión-deconta-
minación que maximice la recuperación de mi- Tabla No. 7 Cantidades para la prepa-
cobacterias a partir de muestras no estériles. ración del Digestante-Decontaminante
8.2.1. Método de N-Acetil-L-Cisteí-

na-Hidróxido de Sodio (NALC-NaOH)
Principio:
La N-acetil-L-cisteína (NALC) es un agente mu-
colítico que a concentraciones de 0.5 a 2.0%
puede digerir rápidamente aún el esputo más
tenaz en sólo 2 minutos. La decontaminación • Buffer de fosfatos 0.067 M (pH 6.8)
se lleva a cabo por medio de una solución pre-
parada con hidróxido de sodio y citrato de so- a. Buffer alcalino stock
dio. Na2HPO4 (Fosfato disódico anhidro) 9.47 gr
Agua desmineralizada 1000 ml
Materiales:
Indicar en la etiqueta y en el libro de trabajo b. Buffer ácido stock
la fecha de inicio y expiración. Etiquetar todos KH2PO4 (fosfato monopotàsico) 9.07 gr
los reactivos con fecha de preparación, receta, Agua desmineralizada 1000 ml
contenido, concentración, condiciones de al-
macenamiento. • Agregar cada sal a balones volumétricos de
1000 mL.
• Solución stock de Citrato de Sodio-NaOH • Adicionar agua desmineralizada a la marca de
Solución 1 (2.9%) 1000 mL.
- Citrato de sodio dihidratado 29g • Cada buffer puede ser transferido a recipien-
- Agua desmineralizada 1000ml tes con tapón de rosca y esterilizados a 121ºC
Solución 2 (4%) por 15 min, para ser mezclados después, o pue-
– NaOH en granallas 40g den combinarse inmediatamente y esterilizarse
– Agua desmineralizada 1000ml •La solución puede ser guardada a temperatura
ambiente pero es preferible que se refrigere (2-
Precaución el NaOH es cáustico y su 8ºC).
Pág. 81
i. De preferencia descartar el sobrenadante en
un recipiente de descarte que contenga fenol
c.Solución de trabajo de buffer de fosfatos (pH al 5% y del sedimento remover una porción (ya
6.8) sea una asada grande ó de preferencia 2-3 go-
• Combinar volúmenes iguales de los stocks altas con una pipeta estéril) para colocar sobre el
calino y ácido ó 640ml del fosfato disódico con medio sólido de cultivo.
360ml de la solución de fosfato monopotásico y j. Inocular el sedimento de la muestra en 2 tubos
chequear el pH de la solución. de Löwenstein Jensen.
• Agregar pequeñas cantidades de buffer alcali- k. Incubar los tubos de forma horizontal a 37°C
no para incrementar el pH o pequeñas cantida- por 2-5 días
des de buffer ácido para disminuirlo. l. Seguir incubando los tubos de forma vertical
en una gradilla.
• Solución NALC-NaOH-Citrato de sodio m. Realizar lecturas 2 veces por semana.
Justo antes de usar, combinar el NALC con n. Observar crecimiento de colonias con las si-
la solución de NaOH-Citrato de sodio. La so- guientes características: color crema, rugosas,
lución detrabajo puede ser utilizada por las 2 secas y bien adheridas al medio.
horas consecutivas de su preparación, luego o. Realizar frotes con Zielh Neelsen, para com-
debe descartarse. probar crecimiento de bacilos alcohol ácido re-
sistentes.
Procedimiento p. Si se completan 8 semanas y no hay creci-
miento se dejan de incubar y se reportan como
a. Agregar un volumen de la solución de trabajo negativos para micobacterias.
NALC-NaOH-Citrato de sodio igual al volumen
de la muestra en un tubo Falcon con tapón de 8.2.2. Método del Hidróxido de
rosca. Sodio
b. Mezclar suavemente y de forma invertida Principio:
para asegurar que la solución tenga contacto
con todas las superficies del interior del tubo y El hidróxido de sodio es tanto un digestante
tapón. como un decontaminante, y su efecto es muy
c. Agitar el tubo (muestra + solución de trabajo) bueno. Su actividad mucolítica más efectiva
en Vortex por 5 a 30 segundos hasta dejar la ocurre a una concentración de 4%.
muestra licuada, se debe evitar una agitación
en exceso ya que NALC es inestable en pre- Materiales:
sencia de oxígeno y adquiere un color amarillo • Solución NaOH 4%
por oxidación de NALC, si esta coloración se - Granallas de NaOH 40g
da el NALC se inactiva. - Agua desmineralizada 1000ml
d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a -Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121˚C.
temperatura ambiente por 15 minutos para que
se lleve a cabo el proceso de decontaminación. Procedimiento
e. Si fuera necesaria una decontaminación más a. Agregar un volumen de NaOH igual al volu-
activa, incrementar la concentración de sosa men de la muestra en un tubo con tapón de ros-
de la tabla al 5% o al 6% en lugar de aumentar ca.
el tiempo de exposición al reactivo decontami- b. Mezclar suavemente y de forma invertida el
nante. tubo.
f. Neutralizar la muestra añadiendo agua des- c. Agitar el tubo (muestra + NaOH) en Vortex
tilada estéril ó buffer de fosfatos (pH 6.8) hasta por 30 segundos.
la marca de 45-50; para detener el proceso de d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a
decontaminación. temperatura ambiente por 15 minutos para que
g. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. se lleve a cabo el proceso de decontaminación.
h. Centrifugar a 3000rpm en centrífuga refrige- e.Diluir la muestra con agua desmineralizada
rada durante 15 minutos. para detener el proceso de decontaminación.
Pág. 82
c. Agitar el tubo (muestra + ácido oxálico) en
Vortex por 30 segundos.
f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a
g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos. temperatura ambiente por 30 minutos para que
h. De preferencia descartar el sobrenadante en se lleve a cabo el proceso de decontaminación.
un recipiente de descarte que contenga fenol e. Diluir la muestra con solución salina 0.85%
al 5% y del sedimento remover una porción estéril para detener el proceso de decontamina-
(ya sea una asada grande ó de preferencia 2-3 ción.
gotas con una pipeta estéril) para colocar sobre f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo.
el medio sólido de cultivo. g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos.
El NaOH debe utilizarse a la menor concentra- h. De preferencia descartar el sobrenadante en
ción que efectivamente digiera y decontamine un recipiente de descarte.
efectivamente las muestras. Si ocurre conta- i. Agregar algunas gotas de rojo de fenol al se-
minación excesiva con el uso de NaOH 2% hay dimento.
que incrementar la concentración primero al j. Neutralizar el sedimento con NaOH 4% hasta
3% y luego a 4% antes de aumentar el tiempo obtener un color rosa pálido.
de exposición. k. Del sedimento remover una porción (ya sea
una asada grande ó de preferencia 2-3 gotas
8.2.3. Método del Ácido Oxálico con una pipeta estéril) para colocar sobre el me-
Principio: dio sólido de cultivo.
El ácido oxálico (ácido etanodioico) es común a

muchas plantas y vegetales por lo que depen-
de de un viraje de colores para poder deconta-
minar efectivamente las muestras.
Materiales:
a. Reactivo de ácido oxálico al 5%
• Ácido oxálico 50gr
• Agua desmineralizada 1000ml
• Esterilizar en autoclave por 15 minutos a
121˚C. 8.2.4. Método MycoPrep BBL (método
comercial)
b. Indicador de Rojo de fenol Principio
• Rojo de fenol 8mg La mayoría de las muestras enviadas para con-
• NaOH 20ml firmación de infección por micobacterias con
• Agua desmineralizada 000ml cultivo están contaminadas por la microbiota
• Esterilizar en autoclave por 15 minutos a normal. Por esta razón deben ser tratadas con
121˚C. un procedimiento de digestión y descontamina-
Disolver el rojo de fenol en NaOH al 4% en un ción. La solución de N-acetil-L-cisteína-hidróxi-
agitador magnético, puede que se requiera de
do sódico (NALC-NaOH) es Cuando el reactivo
calentamiento leve. Transferir la solución a un
se diluye con la muestra en cantidades iguales
balón volumétrico y aforar a 1000ml con agua
provee digestión y decontaminación con una
destilada. Guardar la solución a temperatura
ambiente. concentración NaOH al 1 %, el citrato de sodio
enlaza los iones de metal pesado presentes en
Procedimiento la muestra que pueden inactivar el NALC. El
a. Agregar un volumen de ácido oxálico al 5% tampón fosfato ph 6.8 disminuye la actividad de
igual al volumen de la muestra en un tubo con la solución de NALC-NaOH y reduce la grave-
tapón de rosca. dad específica de la muestra. Materiales
b. Mezclar suavemente y de forma invertida el Verificar la etiqueta y fecha de expiración.
tubo.
Pág. 83
si las ampollas están rotas, ausentes o bien si
no contienen polvo. No utilice si hay evidencia
de deterioro (e. g. el color del reactivo se vuel-
Materiales ve amarillo). No utilice el tampón fosfato si los
paquetes están desgarrados o abiertos.
Verificar la etiqueta y fecha de expiración.
• Reactivo BBL MycoPrep Fórmula aproxima- RECOGIDA Y MANIPULACIÓN DE LAS
da (ajustada y/o enriquecida para satisfacer MUESTRAS
los criterios de rendimiento) por un litro de agua
Se requiere la utilización de prácticas y proce-
- NaOH en granallas 20g dimientos de bioseguridad de nivel 2 y equipo e
- Citrato trisódico (Na3C6H5O7.2H2O) 14.5g instalaciones para contención cuando se mani-
Cada ampolla de vidrio sellada dentro del fras- pulen muestras clínicas sin producir aerosoles,
co contiene un mínimo de 0.370 g de NALC(- como en la preparación de frotis acidorresisten-
C5H9NO3S) tes. Todas las actividades que generen aeroso-
les deben llevarse a cabo en una campana de
• Tampón fosfato BBL Mycoprep Fórmula apro- flujo laminar nivel II. Se requiere utilización de
ximada (ajustada y/o enriquecida para satisfa- prácticas de bioseguridad de nivel 3 y equipo e
cer los criterios de rendimiento) por 500 ml de instalaciones para contención en las activida-
agua purificada des de laboratorio que incluyan la propagación
y manipulación de cultivos de M. tuberculosis
-Fosfato disódico (Na2HPO4) 2.37g y M. bovis. Los estudios en animales también
-Fosfato monopotásico (KH2PO4) 2.27g requieren la implementación de procedimientos
especiales.
Ph Final de 6.8
Advertencias y precaución: Para uso de diag- Procedimiento
nostico in vitro.
a. Prepare el tampón fosfato BBL MycoPrep
El reactivo NALC-NaOH contiene alcalinos según sea necesario, vaciando el contenido de
fuertes y causa quemaduras graves. Se debe un paquete en un matraz volumétrico de 500
usar guantes y protección para los ojos y la mL y rellenado con agua purificada. Transfiera
cara. El NaOH irrita los ojos y la piel. En caso la solución tampón a un envase con tapa de
de contacto con los ojos o la piel, enjuagar in- rosca y póngala en el autoclave a 121° C du-
mediatamente con un producto para lavado rante 15 minutos con la tapa floja. Déjela enfriar
ocular o abundante agua potable durante al a temperatura ambiente y apriete la tapa.
menos 15 minutos y consulte al médico. Si es
ingerido, tome leche, clara de huevo o abun- b. Con cuidado para no derramarlo, afloje la
dante agua y consulte al médico. Mantenga tapa de rosca del frasco de reactivo MycoPrep.
fuera del alcance de los niños. Extraiga todo exceso de aire del frasco y ase-
gure la tapa. Coloque el frasco en posición ver-
Precaución: Rompa la ampolla cerca del tical y apriételo hasta que se rompa la ampolla.
centro una sola vez. No siga manipulando la (Nota: el frasco de 150 mL contiene dos ampo-
ampolla ya que el frasco de plástico puede per- llas y se deben romper las dos). Agite suave-
forarse y causarle heridas. mente para disolver el NALC.
Instrucciones para el almacenamien- Evite agitar en exceso. UNA VEZ ROTA LA

to: En cuanto se reciba, guardar a una tempe- AMPOLLA, EL REACTIVO DEBE USAR-
ratura entre 15 y 30°C. No congelar. No abrir SE EN UN LAPSO DE 24 HORAS.
hasta que vayan a utilizarse.
Deterioro del producto: No utilice los reactivos
Pág. 84
cimiento BACTEC MGIT y la mezcla antibiótica
BBL MGIT PANTA está destinado para la detec-
c. En un gabinete de seguridad biológica, utili- ción y recuperación de micobacterias utilizan-
ce un tubo para centrifuga estéril libre de aero- do los sistemas BACTEC MGIT 960. Los tipos
soles de 50 mL y con tapa de rosca, añada can- de muestras aceptables son muestras clínicas
tidades iguales de la muestra y de la solución digeridas y decontaminadas (excepto orina) y
de NALC-NaOH activada (aproximadamente 5 fluidos corporales estériles (excepto sangre).
mL de cada uno)
Principio
d. Tape el tubo para centrifuga y mezcle en
un vortex hasta que la muestra se licúe. Si la Se tiene un compuesto fluorescente en la parte
muestra es muy viscosa añada más solución inferior de los tubos de 16x100 mm de fondo re-
de NALC-NaOH y vuelva a mezclar. dondo. El compuesto fluorescente es sensible
a la presencia de oxígeno disuelto en el caldo.
e. Deje reposar la mezcla a temperatura am- Al inicio la gran cantidad de oxígeno disuelto
biente durante 15 minutos y agite suavemente apaga las emisiones procedentes del compues-
de vez en cuando. Evite tratar la muestra en to y se puede detectar muy poca fluorescencia.
exceso. Más tarde, los microorganismos que respiran
activamente consumen el oxígeno y permiten
f. Añada el tampón de fosfatos ya preparado al que se detecte la fluorescencia.
tubo para centrifuga hasta alcanzar los 40 mL
y mezcle. Centrifugar entre 15 y 20 minutos a Los tubos que se introducen en el instrumento
3,000 gravedades.
BACTEC MGIT son incubados continuamente a
37°C y este controla los tubos cada 60 minutos
g. Decante con cuidado todo el fluido sobrena-
para detectar un aumento en la fluorescencia.
dante
El análisis de la fluorescencia, este análisis se
h. Añada una pequeña cantidad de tampón de utiliza para determinar si el instrumento detecta
fosfatos con un pH 6.8 (0.5 a 2 mL) y vuelva a el tubo como positivo con organismos viables.
suspender el sedimento. Utilice la suspensión Cada tubo positivo contiene aproximadamente
para preparar frotis y para los procedimientos 105 a 106 UFC/ml. Los frascos de cultivo que
micobacteriológicos. permanecen negativos durante un mínimo de
42 días (hasta 56 días) y que no muestran in-
Control de Calidad del Usuario: dicios de ser positivos se retiran del instrumen-
• Examine los componentes del equipo de cada to como negativos y se esterilizan antes de ser
lote o envío que se reciba por Deterioro del Pro- desechados.
ducto.
• Inocular una caja de agar sangre para bús- El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT
queda de bacterias u hongos contaminantes. se añade a cada tubo MGIT para proporcionar
• Inocular los reactivos del Mycoprep (buffer y substancias esenciales para el crecimiento rápi-
solución NaOH-citrato de sodio-NALC en tubo do de micobacterias. El ácido oleíco es usado
de medio sólido y tubo de medio líquido para por las micobacterias y es muy importante en el
verificar esterilidad. metabolismo micobacteriano. La albúmina ac-
túa como agente protector al ligar ácidos grasos
8.3. Inoculación de Tubo Bactec MGIT libres que pueden ser tóxicos para las especies
960 (Indicador de crecimiento de Mi- de Mycobacterium, ayudando a su recupera-
cobacterias). ción. La dextrosa es una fuente de energía.
El uso del tubo BBL MGIT indicador de creci-

miento enriquecido con el suplemento de cre-
Pág. 85
La catalasa destruye las peroxidasas tóxicas Base de caldo Middlebrook 7H) modificado
que pueden estar presentes en el medio. 5.9 g.
La contaminación se reduce al suplementar el Peptona de caseína 1.25 g.
caldo de base con el suplemento de crecimien-
to BACTEC MGIT/mezcla antibiótica BBBL El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT
MGIT PANTA antes de la inoculación con una contiene 15 mL de Caldo de enriquecimiento
muestra clínica. Middlebrook OADC.
Fórmula aproximada por L de agua purificada:
Materiales y Reactivos Albumina bovina 50.0 g
Catalasa 0.03 g.
El tubo indicador de crecimiento BBL MGIT Dextrosa 20.0 g
contiene: 110 uL de indicador fluorescente y 7 Ácido oléico 0,1 g.
mL de caldo. El indicador contiene cloruro pen- Estearato de polioxietileno (POES) 1.1g.
tahidratado de Tris-4, 7-difenil-1, 10-fenantroli-
na rutenio en una base desilicona. Los tubos MGIT 960 INGRESO O EGRESO DE TU-
se limpian con un chorro de CO2 al 10% y se BOS O GRADILLAS
cierran con tapones de polipropileno. 1.Ingreso de los tubos o gradillas al equipo (este
Formula aproximada por L de agua purificada procedimiento no es realizado por nosotros)
del tubo indicador de crecimiento BBL-MGIT: A.Ingreso desde el instrumento
Pág. 86
Después del ingreso de los tubos, el instrumento automáticamente realizara la lectura de los
tubos cada hora durante el tiempo necesario para la interpretación del procedimiento.
MANTENIMIENTO DIARIO MGIT 960
• Verificar luces internas y externas:
• Correcto funcionamiento
Pág. 87
• Verificar de Temperatura
• Correcto funcionamiento
Pág. 88
• Registrar los resultados con una amina primaria o secundaria (anilina).
Kilburn y Kubica modificaron utilizando una tira
9. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN impregnada con los reactivos. El tiocianato po-
tásico acidificado con cloramina T libera cloruro
9.1. TEST DE ÁCIDO NICOTÍNICO PARA de cianógeno, el cual reacciona con ácido ni-
TB BBL TAXO (NIACINA) cotínico y produce un color amarillo. Si no hay
ácido nicotínico no aparece ningún color.
Principio Materiales
Las tiras de análisis de ácido nicotínico para TB Las tiras de análisis de ácido nicotínico para
contienen reactivos para la detección de la pro- TB BBL Taxo son tiras de papel absorbente im-
ducción de ácido nicotínico por micobacterias. pregnadas con tiocianato potásico, cloramina
Se utiliza el control de ácido nicotínico para TB T, ácido citríco y aminosalicilato de sodio.
BBL taxo como control positivo en el análisis de
ácido nicotínico. Los discos de papel control están impregnados
con nicotinamida. Cuando se usan siguiendo
Todas las micobacterias producen ácido nico- las instrucciones, producen una solución ama-
tínico, o niacina, sustancia que desempeña rilla equivalente aproximadamente a 5 ug de
un papel esencial en las reacciones de oxida- ácido nicotínico.
ción-reducción. Debido al bloqueo de una vía Medios de cultivos.
metabólica, M. tuberculosis y ciertas cepas ais- • Agua destilada o desionizada estéril o solu-
ladaS de M. simiae y de M. chelonae producen ción salina 0.85% estéril.
las mayores cantidades de este compuesto. El • Tubos estériles de 13 x 75 mm.
ácido nicotínico se acumula en los medios de • Tapones para tubo.
cultivo en los que están creciendo los microor- • Pipetas de trasferencia estéril.
ganismos y puede extraerse de dichos medios. • Pinzas.
El ácido nicotínico producido por el microorga- • Cepas para control de Calidad
nismo reacciona con el bromuro de cianógeno y
Pág. 89
jo en cada uno de los tubos (control positivo,
control negativo, muestra) y taparlos inmedia-
Almacenamiento: Conservar las tiras a 2 a 8° tamente.
C. La fecha de vencimiento es vigente para el d. Mezclar gentilmente pero no agitar. Repetir
producto cuando está envasado en su recipien- este movimiento después de 5 a 10 min.
te intacto y ha sido conservado según las ins- e. Después de 15 min. pero no más de 30 min.,
trucciones. comparar el color de los extractos
f. Autoclavear y descartar los tubos después de
Preparación de la muestra completar la prueba.
• Agregar 1.5 ml de solución salina 0.85% o Resultados

agua desmineralizada estéril a un cultivo de 3-4 Un resultado positivo para el test de niacina se
semanas de crecimiento con al menos 50 a 100 evidencia por la aparición de color amarillo en
colonias. el extracto de la muestra y en el control positivo;
• Frotar con un asa plástica estéril sobre el cre- la ausencia de color en el control negativo.
cimiento para permitir la extracción de la niaci-
na. No utilizar cultivos contaminados. Precauciones
• Inclinar los tubos de modo que la superficie
del medio esté en posición horizontal y cubierta
con el líquido utilizado. Permitir que permanez-
ca en esta posición por 20 a 30 minutos.
• Cuidadosamente remover aproximadamente
0.6 ml del extracto de cada muestra con una
pipeta estéril y transferirlo a un tubo de 13 x 75
mm.
a. Preparación de controles
* Positivo:
-Colocar 0.6 ml de solución salina 0.85% ó • Únicamente cultivos de 3 a 4 semanas de cre-
agua desmineralizada estéril en un tubo de 13 cimiento con al menos 50 a 100 colonias deben
x 75 mm usarse en el test de producción de niacina. Una
-Agregar uno de los discos control de niacina, menor cantidad de colonias puede dar resulta-
tapar y agitar moderadamente 3 veces por 15 dos negativos o dudosos.
min. • No deben utilizarse cultivos contaminados.
-Rotular como control positivo. • Deben observarse las precauciones para el
manejo de Mycobacterium tuberculosis al rea-
*Negativo: lizar ésta prueba.
-Colocar 0.6 ml de solución salina 0.85% ó • Los tubos tapados deben ser autoclaveados
agua desmineralizada estéril en un tubo de 13 después de completar la prueba.
x 75 mm
- Rotular como control negativo. Limitaciones
Aunque un resultado fuertemente positivo para
Procedimiento el test de niacina en micobacterias no cromo-
génicas, es altamente indicativo de Mycobacte-
a. Procesar el cultivo como se indica en prepa- rium tuberculosis se considera únicamente una
ración de la muestra y colocar 0.6 ml del extrac- identificación preliminar de este organismo. La
to de cada muestra en tubos de 13 x 75 mm identificación completa y final de Mycobacte-
b. Mantener a mano los tubos control positivo y rium tuberculosis y otras micobacterias clínica-
negativo mente significativas se basa en los resultados
c. Utilizando pinzas flameadas, dejar caer una obtenidos en una batería de información que in-
tira del test de niacina, con la flecha hacia aba- cluye test bioquímicos, patrones de susceptibi-
lidad antibiótica y características morfológicas.
Pág. 90
Almacenamiento
Conservar las tiras de 2 a 8° C. No exponer
Se considera que los medios de cultivo desarro- a humedad y temperaturas elevadas. Proteger
llados en medios a base de huevo son los que de la luz, las tiras son fotosensibles. La fecha
producen los resultados más homogéneos, se de vencimiento es vigente para el producto
obtienen resultados satisfactorios con agar de cuando está envasado en su recipiente intacto
Middlebrook y Cohn suplementado con ácido y ha sido conservado según las instrucciones.
aspártico al 0.1 %.
Procedimiento
a. Utilice un cultivo de 3 – 4 semanas hecho en
medio de Lowenstein-Jensen, medio Petragna-
ni u otro medio de huevo coagulado.
b. Añada 0.5 ml de agua destilada a un tubo
limpio de 20x110mm con tapón de rosca.
c. Utilizando una pipeta estéril de 1 mL o una
9.2. TIRAS BBL TAXO PARA PRUEBA espátula, saque dos agregados de colonias del
DE NITRITOS cultivo. Añada las colonias al agua destilada y
disperse las colonias utilizando la pipeta o la es-
Principio pátula. Alternativamente, añada 1.5 ml de solu-
Se utilizan para detectar los microorganismos ción salina estéril en cada cultivo inclinado y re-
nitrato reductasa positivos, especialmente mi- mueva el cultivo para una suspensión espesa.
cobacterias en la prueba de reducción de ni- Transfiera 0.5 ml de esta suspensión de cultivo
trato. a un tubo vacío y estéril para analizar.
La capacidad que tiene la micobacteria de re- d. Con las pinzas esterilizadas al fuego, añada
ducir los nitratos a nitritos es útil para diferen- cuidadosamente una tira BBL Taxo para prue-
ciarlas. Esta prueba separa las micobacerias ba de nitrito al tubo. Oriente la tira para poder
de crecimiento lento que son nitrato positivas introducir primero la parte inferior de la misma,
como ejemplo M. tuberculosis, M. kansasii y señalada con una flecha, en el tubo. Sostenga
M. fortuitum de las de crecimiento rápido que el tubo en sentido vertical.
son negativas o débilmente positivas como por e. Cierre el tubo con el tapón e incúbelo a 35 +/-
ejemplo M. bovis, M. avium complex y M. intra- 2°C durante 2 horas. Agite el tubo suavemente
cellulare. al concluir la primera y la segunda hora de incu-
La presencia de la enzima nitrato reductasa se bación. No incline el tubo
detecta por la producción de un producto final f. Después de 2 horas de incubación, incline el
coloreado. tubo cuidadosamente de un lado a otro 6 veces
para humedecer la tira entera. Inclínelos tubos
Materiales a temperatura ambiente para cubrir la tira con el
• Las tiras BBL Taxo para prueba de nitrito son líquido. Deje los tubos en esta posición durante
tiras de papel absorbente impregnadas de ni- 10 min.
trato sódico tamponado, ácido cítrico, yoduro Resultados
potásico y almidón. El cambio del color de la parte superior de la tira
• Medios de cultivos. a azul claro o azul oscuro indica la reducción
• Agua destilada o desionizada estéril. de nitrato. La ausencia de un cambio de color
• Tubos estériles de 20 x 110 mm con tapón de indica una reacción negativa.
rosca. Control de Calidad
• Pipetas de trasferencia o espátula. Especificaciones de la identidad, las tiras de pa-
• Pinzas. pel blancas con flecas negras apuntando hacia
• Incubadora. abajo.
• Cepas para control de Calidad Respuesta del cultivo: Prepare tubos con agua
destilada. Inocúlelos con los organismos a ana-
lizar.
Pág. 91
anticuerpo-conjugado coloide dorado, se une
al antígeno MPT64 en la muestra, en medio
Introduzca las tiras en los tubos con la flecha líquido.
apuntando hacia abajo. Incube a 35 +/- 2°C
durante 2 horas. La presencia del color azul El complejo entonces continua fluyendo y se
en la parte superior de la tira indica una reac- une al anti- MPT64 monoclonal de ratón sobre
ción positiva. la fase sólida en la línea de prueba, producien-
do una banda de color de rojo a purpura. En
ausencia del MPT64 no hay línea en la región
de banda de prueba.
Materiales y Reactivos
• Dispositivo de prueba individualmente empa-

Limitaciones cado en una bolsa de aluminio con un dese-
La prueba de reducción de nitrato es valiosa cante
para l identificación de M. tuberculosis y otras • Buffer de extracción (para preparación de
micobacterias clínicamente significativas. Sin muestras a partir de cultivos sólidos).
embargo, esta prueba es sólo una parte de la • Instrucciones de uso.
batería bioquímica necesaria para la identifica-
ción preliminar de estos organismos. Procedimiento
9.3.
DETECCIÓN DE ANTÍGENO a. Retirar el dispositivo de prueba de su bol-
MPT64 sa de aluminio y ubíquelo sobre una superficie
plana y seca.
Principio b. Adicionar 100μl del cultivo líquido (o 100μl
Prueba de casete que consta de una almoha- del cultivo solido suspendido en buffer) dentro
dilla para la muestra, una almohadilla de conju- del pozo de muestra.
gado dorado, una membrana de nitrocelulosa c. Cuando la prueba comience a correr, se
y una almohadilla absorbente. Los anti-MPT64 verá el color purpura desplazándose a través
monoclonal de ratón están inmovilizados so- de la ventana de resultados en el centro del
bre la membrana de nitrocelulosa como ma- dispositivo de prueba.
terial de captura (línea del test). Tiene aña- d. Interprete los resultados de prueba 15 mi-
didos otros anticuerpos los cuales reconocen nutos después de la aplicación de la muestra.
otros epítopes del MPT64, conjugados con las
partículas del coloide dorado, fueron usados
para la captura del antígeno y la detección en
un ensayo tipo sándwich. El dispositivo de la
prueba rápida SD BIOLINE Ag MPT64 tiene
una letra C (Línea control) y la letra “T” (Línea
de prueba) sobre la superficie del casete.
Ambas líneas, control y test no son visibles
en la ventana de resultado antes de la aplica-
ción de cualquier muestra. La “Línea Control”
es usada como control del procedimiento. La
línea control debe siempre aparecer si el pro-
cedimiento de prueba es realizada adecua-
damente y los reactivos de prueba de la línea
control están funcionando. Cuando la muestra
es aplicada en el pozo de muestras, esta flu-
ye lateralmente a través de la membrana, el
Pág. 92
La hibridación incluye los siguientes pasos: des-
naturalización química del producto a amplificar;
Resultados hibridación de amplicones de una sola cadena,
marcados con biotina, a sondas unidas a mem-
brana; lavado astringente; adición de conjugado
de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una
reacción de tinción mediada por AP. Una planti-
lla asegura la interpretación sencilla y rápida del
esquema de bandas obtenido.
MATERIALES
• Agua destilada (para uso en biología molecu-
lar)
• Baño de agua
• Baño de agua con agitación/TwinCubator
• Baño de ultrasonidos
• Centrífuga de mesa
• Cronómetro
• ADN polimerasa termoestable con tampón (re-
comendación: HotStarTaq DNA Polymerase de
Qiagen)
• Guantes desechables
Precauciones • Papel absorbente
Todos los procedimientos se deben realizar en • Pinzas
campanas biológicamente seguras. Use tubos • Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μL
de ensayo con tapa para evitar infección del • Plataforma de agitación/TwinCubator
usuario cuando requiera de cultivos con mues- • Probeta graduada
tras. • Puntas de pipeta desechables con filtro
• Reactivos para extracción de ADN, así como
9.4. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES equipos necesarios
COMUNES DE MICOBACTERIAS (Ge- • Termociclador (rango de calentamiento 3°C/
noType Mycobacterium CM) seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión
+/–0,2°C)
PRINCIPIO • Termómetro calibrado
El kit GenoType Mycobacterium CM (Common • Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
Mycobacteria) está basado en la tecnología
DNA•STRIP y permite la identificación de las si- 1. Preparación de muestra y controles (si apli-
guientes especies de micobacterias: M. avium can controles)
ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. for- Las muestras para extracción son a partir de
tuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas
scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, en 300 μL agua ultrapura libre de DNasa y RNa-
M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa.
ulcerans, M. tuberculosis complex, y M. xenopi. Las muestras también pueden extraerse a partir
El procedimiento completo se divide en tres pa- de cultivos positivos en medio líquido, se trasla-
sos: extracción de ADN procedente de cultivo da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
(placas de cultivo/medio líquido; los reactivos DNasa y RNasa.
necesarios no se suministran), una amplifica-
ción múltiplex con primers marcados con bio-
tina (la ADN polimerasa termoestable no se in-
cluye), y una hibridación reversa.
Pág. 93
– 5 μL 10x de tampón para incubación de poli-
PROCEDIMIENTO merasa – no suministrado.
– x μL de solución MgCl21) – no suministrado
EXTRACCIÓN DE ADN – 1-2 unidades de DNA polimerasa termoesta-
Puede usarse un crecimiento bacteriano en ble (consulte el manual) – no suministrado
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi- – y μL de agua para obtener un volumen de 45
ddlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, μl (sin considerar el volumen de enzima) – no
MB-Check). Este test no puede usarse para suministrado.
detectar micobacterias directamente de mues- – Añada 5 μL de solución de ADN (20-100 ng
tras de pacientes. La zona de trabajo ha de es- de ADN) para obtener un volumen final de 50
tar libre de ADN amplificado. Es crucial el ca- μL (sin considerar el volumen de enzima).
lentamiento de las muestras a 95°C durante,
al menos, 20 minutos con objeto de inactivar 1) Dependiendo del sistema enzima/tampón
bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- usado, la concentración óptima de MgCl2 pue-
quier procedimiento de extracción de ADN que de variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta
produzca ADN de bacterias amplificable. El si- que algunos tampones para incubación ya con-
guiente protocolo rápido normalmente produce tienen MgCl2.
ADN adecuado para amplificación:
La evaluación del rendimiento del ensayo Ge-
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en me- noType Mycobacterium CM fue realizada utili-
dio sólido, recoja bacterias con un asa de ino- zando la Polimerasa HotStarTaq ADN de Qia-
culación y suspéndalas en aproximadamente gen. Las cantidades necesarias por muestra
300 μL de agua (grado Biología Molecular). cuando utilice esta enzima son las siguientes:
1b. Cuando use crecimiento bacteriano pro-
cedente de medio líquido, aplique directamente – 35 μL de PNM – suministrado
1 mL. Concentre las bacterias mediante centri- – 5 μL 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (con-
fugación 15 min en una centrífuga de sobreme- tien e 15 mM de MgCl2) – no suministrado
sa en un rotor con contenedor de aerosoles y – 2 μL 25 mM de solución MgCl2 – no suminis-
en una cabina de seguridad de clase II a 10000 trado
x g aproximadamente. Deseche el sobrenadan- – 0,2 μL (1 U) de HotStarTaq – no suministrado
te y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de – 3 μL de agua (para uso en biología molecular)
agua (ver más arriba) con un vórtex. – no suministrado
2 Incube las bacterias procedentes del aparta- – 5 μL de solución de DNA (añada el ADN en
do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño una zona distinta)
de agua. – La concentración final de MgCl2 en la mezcla
3 Incube durante 15 min en un baño de ultra- de amplificación será de 2,5 mM.
sonidos.
4 Centrifugue durante 5 min a máxima veloci- Determine el número de muestras a amplificar
dad y utilice directamente 5 μL del sobrenadan- (número de muestras a analizar más las mues-
te para la PCR. En caso de que la solución de tras de control). Por ejemplo, un control de con-
ADN haya de almacenarse por períodos pro- taminación contiene 5 μL de agua en lugar de
longados de tiempo, transfiera el sobrenadante solución de ADN. Prepare una mezcla que con-
a un tubo nuevo. tenga todos los reactivos excepto la solución de
ADN y mezcle bien. No utilice vórtex.
AMPLIFICACIÓN Alicuote la mezcla madre en volúmenes de 45
Prepare la mezcla de amplificación (45 μL) en μl en tubos preparados de PCR.
una habitación libre de ADN. La muestra debe
añadirse en un área separada.
Mezcle por tubo:
– 35 μL de PNM – suministrado
Pág. 94
uno de los pocillos usados.
2. Añada a la solución 20 μL de muestra am-
2) Perfil de amplificación plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar
bien e incube a temperatura ambiente durante
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos
usando pinzas e identifíquelas marcando bajo
el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siem-
pre guantes cuando manipule tiras.
3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL
de Tampón de Hibridación (HYB, verde) pre-
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta
que la solución tenga un color homogéneo.
Tenga la precaución de no derramar solución
en los pocillos cercanos.
Los productos para amplificación pueden alma- 4. Ponga una tira en cada pocillo.
cenarse entre +8 y –20°C. Las tiras tienen que quedar completamente cu-
Para comprobar la reacción de amplificación, biertas por la solución y el lado con la sonda
aplique directamente 5 μL de cada muestra a hacia arriba (identificable por el marcador co-
un gel de agarosa al 2% sin la adición de tam- loreado próximo al extremo inferior). Usando
pón de carga. Los amplicones tienen una longi- pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha-
tud aproximada de 230 pb (Control de Género) berse girado durante su inmersión. Limpie cui-
y 200 pb (Control Universal/amplicon espe- dadosamente las pinzas después de cada uso
cie-específico). para evitar contaminación. Ello, es también de
aplicación en los pasos siguientes.
HIBRIDACIÓN 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con
Preparación agitación o en el TwinCubator durante 30 minu-
Precaliente en baño de agua con agitación o tos a 45°C.
TwinCubator a 45°C; la máxima desviación to- Ajuste la frecuencia de agitación del baño de
lerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. agua para que realice una mezcla completa y
Precaliente las soluciones HYB y STR a 37- constante de la solución. Para obtener una ade-
45°C antes de usar. cuada transferencia de calor, la bandeja debe
Los reactivos han de estar libres de precipitado estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de
(tenga en cuenta, no obstante que la solución su altura.
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. 6. Aspire completamente el Tampón de Hibrida-
Caliente a temperatura ambiente los restan- ción.
tes reactivos, con la excepción del CON-C y Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el a una bomba de vacío.
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el 7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astrin-
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 gente (STR, roja) a cada tira e incube durante
con sus tampones respectivos (CON-C con 15 minutos a 45°C en un baño con agitación o
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades TwinCubator.
necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera- Desde este paso, en adelante, trabaje a tem-
tura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de peratura ambiente. Elimine completamente la
concentrado a 1 mL de los respectivos tampo- Solución de Lavado Astringente.
nes. Diluya el CON- C antes de cada uso. El Deseche la Solución de Lavado en un contene-
SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si dor y elimine todo el líquido restante volcando
se almacena a temperatura ambiente y se pro- la bandeja y golpeándola suavemente sobre un
tege de la luz. papel absorbente. Ello es también de aplicación
a todos los demás pasos de lavado.
1.Dispense 20 μL de la Solución de Desnatu-
ralización (DEN, azul) en una esquina de cada
Pág. 95
8.Lave una vez cada tira con 1 mL de Solución
de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agi-
tado del TwinCubator (elimine el RIN después
de la incubación).
9. Añada 1 mL de Conjugado diluído (ver más
arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
sobre la plataforma de agitado del TwinCuba-
tor.
10. Elimine la solución y lave cada tira dos ve-
ces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de
Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
aproximadamente con 1 mL de agua destila-
da (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma
de agitación del TwinCubator (deseche la solu-
ción cada vez).
Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua
después del lavado anterior.
11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más Control de Conjugado (CC)
arriba) a cada tira e incube sin agitación y pro- Debe aparecer una línea en esta zona, docu-
tegiéndolas de la luz. mentando la eficacia del conjugado unido y la
Dependiendo de las condiciones del test (por reacción del sustrato.
ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in-
cubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 Control Universal (UC)
minutos. Tiempos prolongados de incubación Esta zona detecta, como es conocido, todas
del sustrato pueden conducir a una tinción in- las micobacterias y miembros del grupo de
crementada del fondo y podría dificultar la in- bacterias gram-positivas con alto contenido de
terpretación de los resultados. G+C. Si esta zona y el Control de Conjugado
12. Detenga la reacción aclarando brevemente se tiñen como positivas, pero el restante es-
por dos veces con agua destilada. quema de bandas no puede ser asignado a
13. Usando pinzas, saque las tiras de la ban- una micobacteria específica, se deben aplicar
deja y séquelas entre dos capas de papel ab- métodos adicionales para identificar la espe-
sorbente. cie bacteriana correspondiente.
Solamente han de considerarse aquellas ban-
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN das cuyas intensidades sean tan fuertes, o
Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la más fuertes, que la intensidad del Control Uni-
luz. Con cada kit se proporciona un formulario versal.
de evaluación. Cuando se utilice este formula-
rio de evaluación, pegue las tiras reveladas en Control de Género (GC)
los campos marcados, alineando las bandas La coloración en esta zona documenta, como
CC y UC con las respectivas líneas del formu- conocida, la presencia de un miembro del gé-
lario. Anote el número de las bandas positivas nero Mycobacterium. La intensidad de esta
en la penúltima columna y determine la especie banda varía dependiendo de la especie de Mi-
con la ayuda de la tabla de interpretación y re- cobacteria.
gistre el nombre de las especies identificadas La banda del Control de Género puede des-
en la última columna. La plantilla suministrada aparecer a pesar de la presencia de DNA mi-
cobacteriano; sin embargo, siempre que esté
también sirve como ayuda para evaluación y presente un patrón de bandeo específico de
ha de ser alineada con las bandas UC y CC de especie, la reacción de amplificación se llevó
la tira. Cada tira tiene un total de 17 zonas de acabo correctamente y el resultado del ensayo
reacción (ver esquema). es válido.
Pág. 96
Otras bandas
Cuando no aparece patrón de bandas especí- Sondas Específicas; para la evaluación ver la
fico de especie, un patrón que indique la pre- tabla de interpretación.
sencia de una bacteria gram-positiva con alto
contenido en G+C puede, en casos raros, estar No todas las bandas de una tira han de mostrar
originado por una Micobacteria que no puede la misma intensidad.
ser detectada por este kit. Por favor, tenga en Si fue usada una gran cantidad de amplicón,
cuenta que puede identificar especias adiciona- pueden aparecer bandas adicionales.
les de micobacterias con el kit GenoType Myco-
bacterium AS. TABLA DE INTERPRETACIÓN
pacientes de riesgo (infectados por microorga-

PRECAUCIONES nismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Vi-
Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los
(PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cual- cultivos realizados a partir de esas muestras
quier fuente potencial de DNA contaminante. Si deben ser etiquetados y manejados siempre
se requiere almacenar durante más de 4 sema- bajo las condiciones de seguridad adecuadas,
nas, almacene a –20°C. A fin de evitar congela- de acuerdo con las guías institucionales. Ob-
ciones y descongelaciones repetidas, alicuote serve todas las normas medioambientales y de
el PNM. Almacene el resto de los componentes seguridad, tanto federales, estatales como lo-
del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos des- cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
pués de su fecha de caducidad. El tratamiento y preparación de la muestra, in-
Los especímenes de los pacientes y los culti- cluyendo el paso de inactivación por calor, de-
vos realizados a partir de especímenes de pa- ben ser llevados a cabo en una cabina de se-
cientes deben ser considerados siempre como guridad de clase II.
potencialmente infecciosos. Las muestras de
Pág. 97
personas cualificadas, bien entrenadas en el
procedimiento de utilización del ensayo y fami-
Antes del paso de inactivación por calor las liarizadas con métodos de biología molecular.
muestras deben ser centrifugadas en un rotor La evaluación de este sistema de análisis fue
con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime-
contenedor de aerosoles solamente en la ca- rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
bina de seguridad. Después de la inactivación características de rendimiento de este ensayo
por calor se puede utilizar un rotor standard no han sido validadas para todas las polimera-
para centrifugar las muestras fuera de la cabina sas disponibles comercialmente, el usuario es
de seguridad. el encargado de evaluar la aplicabilidad de otras
Observe las precauciones normales para pre- polimerasas distintas de las arriba menciona-
parar la amplificación. Es esencial que todos los das.
materiales y reactivos usados para extracción
de DNA y amplificación estén libres de DNasas. 9.5. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
ADICIONALES (GenoType Mycobacte-
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- rium AS)
mar las siguientes medidas especiales de se-
guridad: PRINCIPIO
La Solución de Desnaturalización (DEN) contie- El kit GenoType Mycobacterium AS (Additinonal
ne <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. Species) está basado en la tecnología DNA•S-
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- TRIP y permite la identificación de las siguientes
metil Sulfóxido y es irritante. especies de micobacterias:
M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M.
LIMITACIONES celatum, M. smegmatis, M. genavense, M.
Los miembros del M. tuberculosis complex no lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M.
pueden ser diferenciados. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kan-
Antes de la amplificación, el DNA ha de ser ais- sasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, y M.
lado de cultivo bacteriano realizado por un mé- shimoidei.
todo idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que El procedimiento completo se divide en tres pa-
la muestra de DNA ha sido amplificada eficien- sos: aislamiento de ADN procedente de cultivo
temente durante la reacción de amplificación. (placas de cultivo/medio líquido; los reactivos
El test sólo funciona dentro de los límites de las necesarios no se suministran), una amplifica-
regiones genómicas para las que los primers ción múltiplex con primers marcados con biotina
y sondas han sido elegidos. El análisis de se- (la ADN polimerasa termoestable no se incluye),
cuencias potenciales permanece reservado y una hibridación reversa.
para la reanudación de investigaciones. La hibridación incluye los siguientes pasos: des-
La presencia de múltiples especies de bacte- naturalización química del producto a amplificar;
rias en la muestra a analizar puede dificultar la hibridación de amplicones de una sola cadena,
interpretación de resultados. marcados con biotina, a sondas unidas a mem-
Como cualquier sistema de detección basado brana; lavado astringente; adición de conjugado
en la hibridación, este sistema contempla la po- de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una
sibilidad de que variaciones de las secuencias reacción de tinción mediada por AP. Una planti-
en las regiones genómicas que fueron elegidas lla asegura la interpretación sencilla y rápida del
para los primers y sondas, y la detección de re- esquema de bandas obtenido.
giones para las cuales el kit no fue diseñado,
pueden conducir a resultados falsos. Debido a MATERIALES
la gran variabilidad existente en los genomas – Agua destilada (para uso en biología molecu-
bacterianos es posible que ciertos sub-tipos lar)
puedan no ser detectados. El test refleja los co- – Baño de agua
nocimientos de Hain Lifescience. – Baño de agua con agitación/TwinCubator
La utilización de este ensayo está limitada a – Baño de ultrasonidos
Pág. 98
un asa de inoculación y suspéndalas en apro-
ximadamente 300 μl de agua (grado Biología
Centrífuga de mesa Molecular).
– Cronómetro 1b. Cuando use crecimiento bacteriano proce-
– ADN polimerasa termoestable con tampón dente de medio líquido, aplique directamente 1
(recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase ml. Concentre las bacterias mediante centrifu-
de Qiagen) gación 15 min en una centrífuga de sobremesa
– Guantes desechables en un rotor con contenedor de aerosoles y en
– Papel absorbente una cabina de seguridad de clase II a 10000 x
– Pinzas g aproximadamente. Deseche el sobrenadante
– Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de
– Plataforma de agitación/TwinCubator agua (ver más arriba) con un vórtex.
– Probeta graduada 2. Incube las bacterias procedentes del aparta-
– Puntas de pipeta desechables con filtro do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño
– Reactivos para extracción de ADN, así como de agua.
equipos necesarios 3 Incube durante 15 min en un baño de ultraso-
– Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ nidos.
seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión 4 Centrifugue durante 5 min a máxima veloci-
+/–0,2°C) dad y utilice directamente 5 μl del sobrenadan-
– Termómetro calibrado te para la PCR. En caso de que la solución de
– Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa ADN haya de almacenarse por períodos prolon-
gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
PREPARACIÒN DE LA MUESTRA un tubo nuevo.
Las muestras para extracción son a partir de
colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas AMPLIFICACIÓN
en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa y RNa- Prepare la mezcla de amplificación (45 μL) en
sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. una habitación libre de ADN. La muestra debe
Las muestras también pueden extraerse a partir añadirse en un área separada.
de cultivos positivos en medio líquido, se trasla-
da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de Mezcle por tubo:
DNasa y RNasa. –35 µL de PNM – suministrado
–5 µL 10x de tampón para incubación de poli-
PROCEDIMIENTO merasa – no suministrado.
–x µL de solución MgCl 1) – no suministrado
EXTRACCIÓN DE ADN –1-2 unidades de DNA polimerasa termoestable
Puede usarse un crecimiento bacteriano en pla- (consulte el manual) – no suministrado
cas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Midd- –y µL de agua para obtener un volumen de 45
lebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, MB- µl (sin considerar el volumen de enzima) – no
Check). Este test no puede usarse para detectar suministrado.
micobacterias directamente de muestras de pa- –Añada 5 µL de solución de ADN (20-100 ng de
cientes. La zona de trabajo ha de estar libre de ADN) para obtener un volumen final de 50 µL
ADN amplificado. Es crucial el calentamiento (sin considerar el volumen de enzima).
de las muestras a 95°C durante, al menos, 20 1) Dependiendo del sistema enzima/tampón
minutos con objeto de inactivar bacterias vege- usado, la concentración óptima de MgCl puede
variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que
tativas. Se puede seguir cualquier procedimien- algunos tampones para incubación ya contie-
to de extracción de ADN que produzca ADN de nen MgCl .
bacterias amplificable. El siguiente protocolo rá- La evaluación del rendimiento del ensayo Geno-
pido normalmente produce ADN adecuado para Type Mycobacterium AS fue realizada utilizan-
amplificación: do la Polimerasa HotStarTaq DNA de Qiagen.
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en me- Las cantidades necesarias por muestra cuando
dio sólido, recoja las colonias de bacterias con utilice esta enzima son las siguientes:
Pág. 99
HIBRIDACIÓN
Preparación
–35 µL de PNM – suministrado Precaliente en baño de agua con agitación o
–5 µL 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (contie- TwinCubator a 45°C; la máxima desviación to-
ne 15 mM de MgCl2) – no suministrado lerada en la temperatura idónea es de +/–1°C.
–2 µL25 mM de solución MgCl2 – no suminis- Precaliente las soluciones HYB y STR a 37-
trado 45°C antes de usar.
–0,2 µL (1 U) de HotStarTaq – no suministrado Los reactivos han de estar libres de precipitado
–3 µL de agua (para uso en biología molecular) (tenga en cuenta, no obstante que la solución
– no suministrado CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
–5 µL de solución de DNA (añada el DNA en Caliente a temperatura ambiente los restan-
una zona distinta) tes reactivos, con la excepción del CON-C y
La concentración final de MgCL2 en la mezcla el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
de amplificación será de 2,5 mM. Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
Determine el número de muestras a amplificar con sus tampones respectivos (CON-C con
(número de muestras a analizar más las mues- CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
tras de control). Por ejemplo, un control de con- necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera-
taminación contiene 5 µL de agua en lugar de tura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de
solución de ADN. Prepare una mezcla que con- concentrado a 1 mlL de los respectivos tampo-
tenga todos los reactivos excepto la solución de nes. Diluya el CON- C antes de cada uso. El
ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. Alicuote la SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si
mezcla madre en volúmenes de 45 µL en tubos se almacena a temperatura ambiente y se pro-
preparados de PCR. tege de la luz.
1. Dispense 20 μL de la Solución de Desnatu-
2) Perfil de amplificación *) ralización (DEN, azul) en una esquina de cada
uno de los pocillos usados.
2. Añada a la solución 20 μL de muestra am-
plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar
bien e incube a temperatura ambiente durante
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos
usando pinzas e identifíquelas marcando bajo
el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siem-
pre guantes cuando manipule tiras.
3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL
de Tampón de Hibridación (HYB, verde) pre-
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta
que la solución tenga un color homogéneo.
en los pocillos cercanos.
4. Ponga una tira en cada pocillo.
Los productos para amplificación pueden alma- Las tiras tienen que quedar completamente cu-
cenarse entre–20°CY 8 °C biertas por la solución y el lado con la sonda
Para comprobar la reacción de amplificación, hacia arriba (identificable por el marcador co-
aplique directamente 5 μl de cada muestra a un loreado próximo al extremo inferior). Usando
gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha-
de carga. Los amplicones tienen una longitud berse girado durante su inmersión. Limpie cui-
aproximada de 230 pb (Control de Género) y dadosamente las pinzas después de cada uso
200 pb (Control Universal/amplicon espe- para evitar contaminación. Ello, es también de
cie-específico). aplicación en los pasos siguientes.
Pág. 100
crementada del fondo y podría dificultar la inter-
pretación de los resultados.
12. Detenga la reacción aclarando brevemente
5. Ponga la bandeja en el baño de agua con por dos veces con agua destilada.
agitación o en el TwinCubator durante 30 minu- 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande-
tos a 45°C. ja y séquelas entre dos capas de papel absor-
Ajuste la frecuencia de agitación del baño de bente.
agua para que realice una mezcla completa
y constante de la solución. Para obtener una RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
adecuada transferencia de calor, la bandeja Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la
debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 luz. Con cada kit se proporciona un formulario
de su altura. de evaluación. Cuando se utilice este formula-
6. Aspire completamente el Tampón de Hibri- rio de evaluación, pegue las tiras reveladas en
dación. los campos marcados, alineando las bandas
Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada CC y UC con las respectivas líneas del formu-
a una bomba de vacío. lario. Anote el número de las bandas positivas
7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astrin- en la penúltima columna y determine la especie
gente (STR, roja) a cada tira e incube durante con la ayuda de la tabla de interpretación y re-
15 minutos a 45°C en un baño con agitación o gistre el nombre de las especies identificadas
TwinCubator. en la última columna. La plantilla suministrada
Desde este paso, en adelante, trabaje a tem- también sirve como ayuda para evaluación y ha
peratura ambiente. Elimine completamente la de ser alineada con las bandas UC y CC de la
Solución de Lavado Astringente. tira. Cada tira tiene un total de 17 zonas de re-
Deseche la Solución de Lavado en un contene- acción (ver esquema).
dor y elimine todo el líquido restante volcando
la bandeja y golpeándola suavemente sobre un
papel absorbente. Ello es también de aplicación
8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solución
de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agita-
do del TwinCubator (elimine el RIN después de
la incubación).
9. Añada 1 mL de Conjugado diluído (ver más
arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
10. Elimine la solución y lave cada tira dos ve-
ces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de
Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
aproximadamente con 1 ml de agua destilada Control de Conjugado (CC)
(ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de Debe aparecer una línea en esta zona, docu-
agitación del TwinCubator (deseche la solución mentando la eficacia del conjugado unido y la
cada vez). reacción del sustrato.
Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua
después del lavado anterior. Control Universal (UC)
11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más Esta zona detecta, como es conocido, todas las
arriba) a cada tira e incube sin agitación y pro- micobacterias y miembros del grupo de bacte-
rias gram-positivas con alto contenido de G+C.
tegiéndolas de la luz. Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen
Dependiendo de las condiciones del test (por como positivas, pero el restante esquema de
ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in- bandas no puede ser asignado a una micobac-
cubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 teria específica, se deben aplicar métodos adi-
minutos. Tiempos prolongados de incubación cionales para identificar la especie bacteriana
del sustrato pueden conducir a una tinción in- correspondiente.
Pág. 101
contenido en G+C puede, en casos raros, estar
originado por una Micobacteria que no puede
Control de Género (GC) ser detectada por este kit. Por favor, tenga en
La coloración en esta zona documenta, como cuenta que puede identificar especias adiciona-
conocida, la presencia de un miembro del gé- les de micobacterias con el kit GenoType Myco-
nero Mycobacterium. La intensidad de esta bacterium AS.
banda varía dependiendo de la especie de Mi-
cobacteria. Otras bandas
La banda del Control de Género puede desapa- Sondas Específicas; para la evaluación ver la
recer a pesar de la presencia de DNA micobac- tabla de interpretación.
teriano; sin embargo, siempre que esté presen-
te un patrón de bandeo específico de especie, No todas las bandas de una tira han de mostrar
la reacción de amplificación se llevó acabo co- la misma intensidad.
rrectamente y el resultado del ensayo es válido. Si fue usada una gran cantidad de amplicón,
Cuando no aparece patrón de bandas especí- pueden aparecer bandas adicionales.
fico de especie, un patrón que indique la pre-
sencia de una bacteria gram-positiva con alto TABLA DE INTERPRETACIÓN
Cuando utilice bacterias crecidas en medio lí- idéntica morfología de colonias).

quido, la contaminación bacteriana puede posi-
blemente generar el mismo patrón de bandas.
Este resultado, por tanto, es válido únicamente
cuando el DNA fue aislado del crecimiento bac-
teriano en medio sólido (colonias individuales/
Pág. 102
2) M. nebraskense muestra el mismo patrón de tes de riesgo (infectados por microorganismos
bandas que M. haemophilum. patógenos incluyendo Hepatitis B y Virus de
3) Si se genera este patrón de bandas con el Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cultivos
kit GenoType Mycobacterium AS, se puede di- realizados a partir de esas muestras deben ser
ferencia entre M. szulgai y M. intermedium uti- etiquetados y manejados siempre bajo las con-
lizando GenoType Mycobacterium CM.. M szul- diciones de seguridad adecuadas, de acuerdo
gai mostrará bandeo en las bandas 1, 2, 3, 10 con las guías institucionales. Observe todas las
y 11, y M. Intermedium mostrará bandeo en las normas medioambientales y de seguridad, tanto
bandas 1, 2, 3 y 10. federales, estatales como locales. Lleve siem-
4) Debido a variaciones de secuencia M. kan- pre guantes y ropa adecuada.
sasii puede producir 4 patrones diferentes de El tratamiento y preparación de la muestra, in-
bandeo. cluyendo el paso de inactivación por calor, de-
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu-
PRECAUCIONES ridad de clase II. Antes del paso de inactivación
Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido por calor las muestras deben ser centrifugadas
(PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cual- en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir
quier fuente potencial de DNA contaminante. Si el rotor con contenedor de aerosoles solamente
se requiere almacenar durante más de 4 sema- en la cabina de seguridad. Después de la inac-
nas, almacene a –20°C. A fin de evitar congela- tivación por calor se puede utilizar un rotor stan-
ciones y descongelaciones repetidas, alicuote el dard para centrifugar las muestras fuera de la
PNM. Almacene el resto de los componentes del cabina de seguridad.
kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después de Observe las precauciones normales para prepa-
su fecha de caducidad. rar la amplificación. Es esencial que todos los
Los especímenes de los pacientes y los cultivos materiales y reactivos usados para extracción
realizados a partir de especímenes de pacientes de DNA y amplificación estén libres de DNasas.
deben ser considerados siempre como poten-
cialmente infecciosos. Las muestras de pacien-
Pág. 103
(GenoType MTBC)
PRINCIPIO
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- El kit GenoType MTBC está basado en la tec-
mar las siguientes medidas especiales de se- nología DNA•STRIP que permite en base a los
guridad: polimorfismos genéticos, por los que la ADN
La Solución de Desnaturalización (DEN) con- girasa B diferencia genéticamete de especies/
tiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y cepas pertenecientes al grupo Mycobacterium
piel. tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae,
metil Sulfóxido y es irritante. M. microti, y M. tuberculosis/“M. canettii”.
El procedimiento completo se divide en tres pa-
LIMITACIONES sos: extracción de ADN procedente de cultivo
Antes de la amplificación, el ADN ha de ser ais- (placas de cultivo/medio líquido; los reactivos
lado de cultivo bacteriano realizado por un mé- necesarios no se suministran), una amplifica-
todo idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que ción múltiplex con primers marcados con bio-
la muestra de ADN ha sido amplificada eficien- tina (la ADN polimerasa termoestable no se in-
temente durante la reacción de amplificación. cluye), y una hibridación reversa.
El test sólo funciona dentro de los límites de La hibridación incluye los siguientes pasos:
las regiones genómicas para las que los pri- desnaturalización química del producto a am-
plificar; hibridación de amplicones de una sola
mers y sondas han sido elegidos. El análisis de cadena, marcados con biotina, a sondas unidas
secuencias potenciales permanece reservado a membrana; lavado astringente; adición de
para la reanudación de investigaciones. conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina
La presencia de múltiples especies de bacte- (AP), y una reacción de tinción mediada por AP.
rias en la muestra a analizar puede dificultar la Una plantilla asegura la interpretación sencilla y
interpretación de resultados. rápida del esquema de bandas obtenido.
Como cualquier sistema de detección basado
MATERIALES
en la hibridación, este sistema contempla la
posibilidad de que variaciones de las secuen- –Agua destilada (para uso en biología molecu-
cias en las regiones genómicas que fueron lar)
elegidas para los primers y sondas, y la detec- – Baño de agua
ción de regiones para las cuales el kit no fue –Baño de agua con agitación/TwinCubator
diseñado, pueden conducir a resultados falsos. –Baño de ultrasonidos
Debido a la gran variabilidad existente en los –Centrífuga de mesa
genomas bacterianos es posible que ciertos –Cronómetro
subtipos puedan no ser detectados. El test re- –ADN polimerasa termoestable con tampón
fleja los conocimientos de Hain Life- science. (recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase
La utilización de este ensayo está limitada a de Qiagen)
personas cualificadas, bien entrenadas en el –Guantes desechables
procedimiento de utilización del ensayo y fami- –Papel absorbente
liarizadas con métodos de biología molecular. –Pinzas
La evaluación de este sistema de análisis fue –Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl
llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime- –Plataforma de agitación/TwinCubator
rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las –Probeta graduada
características de rendimiento de este ensayo –Puntas de pipeta desechables con filtro
no han sido validadas para todas las polime- –Reactivos para extracción de DNA, así como
rasas disponibles comercialmente, el usuario equipos necesarios
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de –Termociclador (rango de calentamiento 3°C/
otras polimerasas distintas de las arriba men- seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión
cionadas. +/–0,2°C)
– Termómetro calibrado
9.6. IDENTIFICACIÓN DEL COMPLE- – Tubos para PCR, libres de DNasa y
JO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS RNasa
Pág. 104
dad y utilice directamente 5 μL del sobrenadan-
te para la PCR. En caso de que la solución de
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ADN haya de almacenarse por períodos prolon-
Las muestras para extracción son a partir de gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas un tubo nuevo.
en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa y RNa-
sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. AMPLIFICACIÓN
Las muestras también pueden extraerse a partir Prepare la mezcla de amplificación (45 μL) en
de cultivos positivos en medio líquido, se trasla- una habitación libre de ADN. La muestra debe
da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de añadirse en un área separada.
DNasa y RNasa.
Mezcle por tubo:
PROCEDIMIENTO –35 µL de AM B – suministrado
–10 µL de AM A- suministrado
EXTRACCIÓN DE ADN –Añada 5 µL de solución de ADN (20-100 ng de
Puede usarse un crecimiento bacteriano en ADN) para obtener un volumen final de 50 µL
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi- (sin considerar el volumen de enzima).
ddlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC,
MB-Check). Este test no puede usarse para Determine el número de muestras a amplificar
detectar micobacterias directamente de mues- (número de muestras a analizar más las mues-
tras de pacientes. La zona de trabajo ha de es- tras de control). Por ejemplo, un control de con-
tar libre de ADN amplificado. Es crucial el ca- taminación contiene 5 µL de agua en lugar de
lentamiento de las muestras a 95°C durante, solución de ADN. Prepare una mezcla que con-
al menos, 20 minutos con objeto de inactivar tenga todos los reactivos excepto la solución de
bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. Alicuote la
quier procedimiento de extracción de ADN que mezcla madre en volúmenes de 45 µl en tubos
produzca ADN de bacterias amplificable. El si- preparados de PCR.
guiente protocolo rápido normalmente produce
ADN adecuado para amplificación: 2) Perfil de amplificación *)
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en me-

dio sólido, recoja las colonias de bacterias con
Molecular).
1b. Cuando use crecimiento bacteriano proce-
dente de medio líquido, aplique directamente 1
mL. Concentre las bacterias mediante centrifu-
gación 15 min en una centrífuga de sobremesa
en un rotor con contenedor de aerosoles y en
una cabina de seguridad de clase II a 10000 x
g aproximadamente. Deseche el sobrenadante Los productos para amplificación pueden al-
y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de macenarse entre –20°C y 8°C.
agua (ver más arriba) con un vórtex. Para comprobar la reacción de amplificación,
2. Incube las bacterias procedentes del aparta- aplique directamente 5 μL de cada muestra
do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño a un gel de agarosa al 2% sin la adición de
de agua. tampón de carga. Los amplicones tienen una
3 Incube durante 15 min en un baño de ultra- longitud aproximada de 230 pb (Control de Gé-
sonidos. nero) y 200 pb (Control Universal/amplicon es-
4 Centrifugue durante 5 min a máxima veloci- pecie-específico).
Pág. 105
para evitar contaminación. Ello, es también de
aplicación en los pasos siguientes.
HIBRIDACIÓN 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con
Preparación agitación o en el TwinCubator durante 30 minu-
Precaliente en baño de agua con agitación o tos a 45°C.
TwinCubator a 45°C; la máxima desviación to- Ajuste la frecuencia de agitación del baño de
lerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. agua para que realice una mezcla completa
Precaliente las soluciones HYB y STR a 37- y constante de la solución. Para obtener una
45°C antes de usar. adecuada transferencia de calor, la bandeja
Los reactivos han de estar libres de precipitado debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3
(tenga en cuenta, no obstante que la solución de su altura.
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. 6. Aspire completamente el Tampón de Hibri-
Caliente a temperatura ambiente los restan- dación.
tes reactivos, con la excepción del CON-C y Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el a una bomba de vacío.
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el 7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astrin-
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 gente (STR, roja) a cada tira e incube durante
con sus tampones respectivos (CON-C con 15 minutos a 45°C en un baño con agitación o
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades TwinCubator.
necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera- Desde este paso, en adelante, trabaje a tem-
tura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de peratura ambiente. Elimine completamente la
concentrado a 1 mL de los respectivos tampo- Solución de Lavado Astringente.
nes. Diluya el CON- C antes de cada uso. El Deseche la Solución de Lavado en un contene-
SUB-C diluído es estable durante 4 semanas dor y elimine todo el líquido restante volcando
si se almacena a temperatura ambiente y se la bandeja y golpeándola suavemente sobre un
protege de la luz. papel absorbente. Ello es también de aplica-
ción a todos los demás pasos de lavado.
1. Dispense 20 μL de la Solución de Desnatu- 8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solución
ralización (DEN, azul) en una esquina de cada de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agita-
uno de los pocillos usados. do del TwinCubator (elimine el RIN después de
2. Añada a la solución 20 μL de muestra am- la incubación).
plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar 9. Añada 1 mL de Conjugado diluído (ver más
bien e incube a temperatura ambiente durante arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tu- sobre la plataforma de agitado del TwinCuba-
bos usando pinzas e identifíquelas marcando tor.
bajo el marcador coloreado con un lápiz. Lleve 10. Elimine la solución y lave cada tira dos ve-
siempre guantes cuando manipule tiras. ces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de
3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
de Tampón de Hibridación (HYB, verde) pre- aproximada- mente con 1 ml de agua destilada
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de
que la solución tenga un color homogéneo. agitación del TwinCubator (deseche la solución
Tenga la precaución de no derramar solución cada vez).
en los pocillos cercanos. Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua
4. Ponga una tira en cada pocillo. después del lavado anterior.
Las tiras tienen que quedar completamente cu- 11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más
biertas por la solución y el lado con la sonda arriba) a cada tira e incube sin agitación y pro-
hacia arriba (identificable por el marcador co- tegiéndolas de la luz.
loreado próximo al extremo inferior). Usando Dependiendo de las condiciones del test (por
pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha- ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in-
berse girado durante su inmersión. Limpie cui- cubación del sustrato puede variar entre 3 y 20
dadosamente las pinzas después de cada uso minutos.
Pág. 106
Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen
como positivas, pero el restante esquema de
Tiempos prolongados de incubación del sustra- bandas no puede ser asignado a una micobac-
to pueden conducir a una tinción incrementada teria específica, se deben aplicar métodos adi-
del fondo y podría dificultar la interpretación de cionales para identificar la especie bacteriana
los resultados. correspondiente.
12. Detenga la reacción aclarando brevemente Solamente han de considerarse aquellas ban-
por dos veces con agua destilada. das cuyas intensidades sean tan fuertes, o más
13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande- fuertes, que la intensidad del Control Universal.
ja y séquelas entre dos capas de papel absor-
bente. MTBC
Esta zona hibrida, como es conocido, con ampli-
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN cones generados de todos los miembros cono-
Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la cidos de Mycobacterium tuberculosis complex.
luz. Con cada kit se proporciona un formulario Otras bandas
de evaluación. Cuando se utilice este formulario Sondas Específicas; para la evaluación ver la
de evaluación, pegue las tiras reveladas en los tabla de interpretación.
campos marcados, alineando las bandas CC
y UC con las respectivas líneas del formulario. No todas las bandas de una tira han de mostrar
Anote el número de las bandas positivas en la la misma intensidad.
penúltima columna y determine la especie con Si fue usada una gran cantidad de amplicón,
la ayuda de la tabla de interpretación y registre pueden aparecer bandas adicionales.
el nombre de las especies identificadas en la
última columna. La plantilla suministrada tam- TABLA DE INTERPRETACIÓN
bién sirve como ayuda para evaluación y ha de
ser alineada con las bandas UC y CC de la tira.
Cada tira tiene un total de 13 zonas de reacción
(ver esquema).
PRECAUCIONES
Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido
Control de Conjugado (CC) (PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cual-
Debe aparecer una línea en esta zona, docu- quier fuente potencial de ADN contaminante. Si
mentando la eficacia del conjugado unido y la se requiere almacenar durante más de 4 sema-
reacción del sustrato. nas, almacene a –20°C. A fin de evitar conge-
laciones y descongelaciones repetidas, alicuote
Control Universal (UC) el PNM. Almacene el resto de los componentes
Esta zona detecta, como es conocido, todas las del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después
micobacterias y miembros del grupo de bacte- de su fecha de caducidad.
Pág. 107
secuencias potenciales permanece reservado
para la reanudación de investigaciones.
Los especímenes de los pacientes y los culti- La presencia de múltiples especies de bacte-
vos realizados a partir de especímenes de pa- rias en la muestra a analizar puede dificultar la
cientes deben ser considerados siempre como interpretación de resultados.
potencialmente infecciosos. Las muestras de Como cualquier sistema de detección basado
pacientes de riesgo (infectados por microorga- en la hibridación, este sistema contempla la
nismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Vi- posibilidad de que variaciones de las secuen-
rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cias en las regiones genómicas que fueron
cultivos realizados a partir de esas muestras elegidas para los primers y sondas, y la detec-
deben ser etiquetados y manejados siempre ción de regiones para las cuales el kit no fue
bajo las condiciones de seguridad adecuadas, diseñado, pueden conducir a resultados falsos.
de acuerdo con las guías institucionales. Ob- Debido a la gran variabilidad existente en los
serve todas las normas medioambientales y de genomas bacterianos es posible que ciertos
seguridad, tanto federales, estatales como lo- subtipos puedan no ser detectados. El test re-
cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. fleja los conocimientos de Hain Life- science.
El tratamiento y preparación de la muestra, in- La utilización de este ensayo está limitada a
cluyendo el paso de inactivación por calor, de- personas cualificadas, bien entrenadas en el
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu- procedimiento de utilización del ensayo y fami-
ridad de clase II. Antes del paso de inactivación liarizadas con métodos de biología molecular.
por calor las muestras deben ser centrifugadas La evaluación de este sistema de análisis fue
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime-
el rotor con contenedor de aerosoles solamente rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
en la cabina de seguridad. Después de la in- características de rendimiento de este ensayo
activación por calor se puede utilizar un rotor no han sido validadas para todas las polime-
standard para centrifugar las muestras fuera de rasas disponibles comercialmente, el usuario
la cabina de seguridad. es el encargado de evaluar la aplicabilidad de
Observe las precauciones normales para pre- otras polimerasas distintas de las arriba men-
parar la amplificación. Es esencial que todos los cionadas.
de ADN y amplificación estén libres de DNasas. 9.5. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
ADICIONALES (GenoType Mycobacte-
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- rium AS)
guridad: PRINCIPIO
La Solución de Desnaturalización (DEN) con-
tiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y El kit GenoType Mycobacterium AS (Additi-
piel. nonal Species) está basado en la tecnología
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- DNA•STRIP y permite la identificación de las
metil Sulfóxido y es irritante. siguientes especies de micobacterias:
LIMITACIONES M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M.

celatum, M. smegmatis, M. genavense, M.
Antes de la amplificación, el ADN ha de ser ais- lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M.
lado de cultivo bacteriano realizado por un mé- intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M.
todo idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum,
la muestra de ADN ha sido amplificada eficien- y M. shimoidei.
temente durante la reacción de amplificación.
El test sólo funciona dentro de los límites de
las regiones genómicas para las que los pri-
mers y sondas han sido elegidos. El análisis de
Pág. 108
da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
El procedimiento completo se divide en tres pa- DNasa y RNasa.
sos: aislamiento de ADN procedente de cultivo
(placas de cultivo/medio líquido; los reactivos PROCEDIMIENTO
necesarios no se suministran), una amplifica- EXTRACCIÓN DE ADN
ción múltiplex con primers marcados con biotina Puede usarse un crecimiento bacteriano en pla-
(la ADN polimerasa termoestable no se incluye), cas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Midd-
y una hibridación reversa. lebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, MB-
La hibridación incluye los siguientes pasos: des- Check). Este test no puede usarse para detectar
naturalización química del producto a amplificar; micobacterias directamente de muestras de pa-
hibridación de amplicones de una sola cadena, cientes. La zona de trabajo ha de estar libre de
marcados con biotina, a sondas unidas a mem- ADN amplificado. Es crucial el calentamiento
brana; lavado astringente; adición de conjugado de las muestras a 95°C durante, al menos, 20
de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una minutos con objeto de inactivar bacterias vege-
reacción de tinción mediada por AP. Una planti- tativas. Se puede seguir cualquier procedimien-
lla asegura la interpretación sencilla y rápida del to de extracción de ADN que produzca ADN de
esquema de bandas obtenido. bacterias amplificable. El siguiente protocolo rá-
pido normalmente produce ADN adecuado para
MATERIALES amplificación:
– Agua destilada (para uso en biología molecu- Cuando use crecimiento bacteriano en medio
lar) sólido, recoja las colonias de bacterias con un
– Baño de agua asa de inoculación y suspéndalas en aproxima-
– Baño de agua con agitación/TwinCubator damente 300 μl de agua (grado Biología Mole-
– Baño de ultrasonidos cular).
– Centrífuga de mesa 1b. Cuando use crecimiento bacteriano proce-
– Cronómetro dente de medio líquido, aplique directamente 1
– ADN polimerasa termoestable con tampón ml. Concentre las bacterias mediante centrifu-
(recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase gación 15 min en una centrífuga de sobremesa
de Qiagen) en un rotor con contenedor de aerosoles y en
– Guantes desechables una cabina de seguridad de clase II a 10000 x
– Papel absorbente g aproximadamente. Deseche el sobrenadante
– Pinzas y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de
– Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl agua (ver más arriba) con un vórtex.
– Plataforma de agitación/TwinCubator 2. Incube las bacterias procedentes del aparta-
– Probeta graduada do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño
– Puntas de pipeta desechables con filtro de agua.
– Reactivos para extracción de ADN, así como 3 Incube durante 15 min en un baño de ultraso-
equipos necesarios nidos.
– Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ 4 Centrifugue durante 5 min a máxima veloci-
seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión dad y utilice directamente 5 μl del sobrenadan-
+/–0,2°C) te para la PCR. En caso de que la solución de
– Termómetro calibrado ADN haya de almacenarse por períodos prolon-
– Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
un tubo nuevo.
PREPARACIÒN DE LA MUESTRA
Las muestras para extracción son a partir de AMPLIFICACIÓN
colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas Prepare la mezcla de amplificación (45 μL) en
en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa y RNa- una habitación libre de ADN. La muestra debe
sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. añadirse en un área separada.
Las muestras también pueden extraerse a partir
Pág. 109
2) Perfil de amplificación *)
Mezcle por tubo:

–35 µL de PNM – suministrado
–5 µL 10x de tampón para incubación de poli-
merasa – no suministrado.
–x µL de solución MgCl 1) – no suministrado
–1-2 unidades de DNA polimerasa termoesta-
ble (consulte el manual) – no suministrado
–y µL de agua para obtener un volumen de 45
µl (sin considerar el volumen de enzima) – no
suministrado.
–Añada 5 µL de solución de ADN (20-100 ng de
ADN) para obtener un volumen final de 50 µL
(sin considerar el volumen de enzima).
1) Dependiendo del sistema enzima/tampón

usado, la concentración óptima de MgCl puede
variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que
algunos tampones para incubación ya contie-
nen MgCl . Los productos para amplificación pueden alma-
cenarse entre–20°CY 8 °C
La evaluación del rendimiento del ensayo Ge- Para comprobar la reacción de amplificación,
noType Mycobacterium AS fue realizada uti- aplique directamente 5 μl de cada muestra a un
lizando la Polimerasa HotStarTaq DNA de Qia- gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón
gen. Las cantidades necesarias por muestra de carga. Los amplicones tienen una longitud
cuando utilice esta enzima son las siguientes: aproximada de 230 pb (Control de Género) y
200 pb (Control Universal/amplicon espe-
–35 µL de PNM – suministrado cie-específico).
–5 µL 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (contie-
ne 15 mM de MgCl2) – no suministrado HIBRIDACIÓN
–2 µL25 mM de solución MgCl2 – no suminis- Preparación
trado Precaliente en baño de agua con agitación o
–0,2 µL (1 U) de HotStarTaq – no suministrado TwinCubator a 45°C; la máxima desviación to-
–3 µL de agua (para uso en biología molecular) lerada en la temperatura idónea es de +/–1°C.
– no suministrado Precaliente las soluciones HYB y STR a 37-
–5 µL de solución de DNA (añada el DNA en 45°C antes de usar.
una zona distinta) Los reactivos han de estar libres de precipitado
La concentración final de MgCL2 en la mezcla (tenga en cuenta, no obstante que la solución
de amplificación será de 2,5 mM. CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
Caliente a temperatura ambiente los restan-
Determine el número de muestras a amplificar tes reactivos, con la excepción del CON-C y
(número de muestras a analizar más las mues- el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
tras de control). Por ejemplo, un control de con- Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
taminación contiene 5 µL de agua en lugar de Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
solución de ADN. Prepare una mezcla que con- con sus tampones respectivos (CON-C con
tenga todos los reactivos excepto la solución de CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. Alicuote la necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera-
mezcla madre en volúmenes de 45 µL en tubos tura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de
preparados de PCR. concentrado a 1 mlL de los respectivos tampo-
nes. Diluya el CON- C antes de cada uso.
Pág. 110
Solución de Lavado Astringente.
Deseche la Solución de Lavado en un contene-
El SUB-C diluído es estable durante 4 sema- dor y elimine todo el líquido restante volcando
nas si se almacena a temperatura ambiente y la bandeja y golpeándola suavemente sobre un
se protege de la luz. papel absorbente. Ello es también de aplicación
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
usando pinzas e identifíquelas marcando bajo 10. Elimine la solución y lave cada tira dos ve-
el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siem- ces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de
pre guantes cuando manipule tiras. Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL aproximadamente con 1 ml de agua destilada
de Tampón de Hibridación (HYB, verde) pre- (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta agitación del TwinCubator (deseche la solución
que la solución tenga un color homogéneo. cada vez).
Tenga la precaución de no derramar solución Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua
en los pocillos cercanos. después del lavado anterior.
4. Ponga una tira en cada pocillo. 11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más
Las tiras tienen que quedar completamente cu- arriba) a cada tira e incube sin agitación y pro-
biertas por la solución y el lado con la sonda tegiéndolas de la luz.
hacia arriba (identificable por el marcador co- Dependiendo de las condiciones del test (por
loreado próximo al extremo inferior). Usando ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in-
pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha- cubación del sustrato puede variar entre 3 y 20
berse girado durante su inmersión. Limpie cui- minutos. Tiempos prolongados de incubación
dadosamente las pinzas después de cada uso del sustrato pueden conducir a una tinción in-
para evitar contaminación. Ello, es también de crementada del fondo y podría dificultar la inter-
aplicación en los pasos siguientes. pretación de los resultados.
5. Ponga la bandeja en el baño de agua con 12. Detenga la reacción aclarando brevemente
agitación o en el TwinCubator durante 30 minu- por dos veces con agua destilada.
tos a 45°C. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande-
Ajuste la frecuencia de agitación del baño de ja y séquelas entre dos capas de papel absor-
agua para que realice una mezcla completa y bente.
constante de la solución. Para obtener una ade-
cuada transferencia de calor, la bandeja debe RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la
su altura. luz. Con cada kit se proporciona un formulario
6. Aspire completamente el Tampón de Hibrida- de evaluación. Cuando se utilice este formulario
ción. de evaluación, pegue las tiras reveladas en los
Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada campos marcados, alineando las bandas CC
a una bomba de vacío. y UC con las respectivas líneas del formulario.
7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astrin- Anote el número de las bandas positivas en la
gente (STR, roja) a cada tira e incube durante penúltima columna y determine la especie con
15 minutos a 45°C en un baño con agitación o la ayuda de la tabla de interpretación y registre
TwinCubator. el nombre de las especies identificadas en la
Desde este paso, en adelante, trabaje a tem- última columna.
peratura ambiente. Elimine completamente la
Pág. 111
especie, la reacción de amplificación se llevó
acabo correctamente y el resultado del ensayo
La plantilla suministrada también sirve como es válido.
ayuda para evaluación y ha de ser alineada Cuando no aparece patrón de bandas especí-
con las bandas UC y CC de la tira. Cada tira fico de especie, un patrón que indique la pre-
tiene un total de 17 zonas de reacción (ver es- sencia de una bacteria gram-positiva con alto
quema). contenido en G+C puede, en casos raros, estar
originado por una Micobacteria que no puede
ser detectada por este kit. Por favor, tenga en
cuenta que puede identificar especias adicio-
nales de micobacterias con el kit GenoType
Mycobacterium AS.
Otras bandas
Sondas Específicas; para la evaluación ver la
tabla de interpretación.
No todas las bandas de una tira han de mostrar

la misma intensidad.
Si fue usada una gran cantidad de amplicón,
pueden aparecer bandas adicionales.
Control de Conjugado (CC) TABLA DE INTERPRETACIÓN

Debe aparecer una línea en esta zona, docu-
mentando la eficacia del conjugado unido y la
reacción del sustrato.
Control Universal (UC)

Esta zona detecta, como es conocido, todas las
micobacterias y miembros del grupo de bacte-
Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen
como positivas, pero el restante esquema de
bandas no puede ser asignado a una micobac-
teria específica, se deben aplicar métodos adi-
cionales para identificar la especie bacteriana
correspondiente.
Solamente han de considerarse aquellas ban-
das cuyas intensidades sean tan fuertes, o más
fuertes, que la intensidad del Control Universal.
Control de Género (GC) Cuando utilice bacterias crecidas en medio lí-

La coloración en esta zona documenta, como quido, la contaminación bacteriana puede posi-
conocida, la presencia de un miembro del gé- blemente generar el mismo patrón de bandas.
nero Mycobacterium. La intensidad de esta Este resultado, por tanto, es válido únicamente
banda varía dependiendo de la especie de Mi- cuando el DNA fue aislado del crecimiento bac-
cobacteria. teriano en medio sólido (colonias individuales/
La banda del Control de Género puede des- idéntica morfología de colonias).
aparecer a pesar de la presencia de DNA mi-
cobacteriano; sin embargo, siempre que esté
presente un patrón de bandeo específico de
Pág. 112
de acuerdo con las guías institucionales. Ob-
serve todas las normas medioambientales y de
seguridad, tanto federales, estatales como lo-
cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
El tratamiento y preparación de la muestra, in-
cluyendo el paso de inactivación por calor, de-
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu-
ridad de clase II. Antes del paso de inactivación
por calor las muestras deben ser centrifugadas
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir
el rotor con contenedor de aerosoles solamente
en la cabina de seguridad. Después de la in-
activación por calor se puede utilizar un rotor
standard para centrifugar las muestras fuera de
la cabina de seguridad.
Observe las precauciones normales para pre-
parar la amplificación. Es esencial que todos los
2) M. nebraskense muestra el mismo patrón de de DNA y amplificación estén libres de DNasas.
bandas que M. haemophilum.
3) Si se genera este patrón de bandas con el Cuando manipule los reactivos del kit debe to-
kit GenoType Mycobacterium AS, se puede di- mar las siguientes medidas especiales de se-
ferencia entre M. szulgai y M. intermedium utili- guridad:
zando GenoType Mycobacterium CM.. M szul- La Solución de Desnaturalización (DEN) contie-
gai mostrará bandeo en las bandas 1, 2, 3, 10 ne <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel.
y 11, y M. Intermedium mostrará bandeo en las El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di-
bandas 1, 2, 3 y 10. metil Sulfóxido y es irritante.
4) Debido a variaciones de secuencia M. kan-
sasii puede producir 4 patrones diferentes de LIMITACIONES
bandeo. Antes de la amplificación, el ADN ha de ser ais-
lado de cultivo bacteriano realizado por un mé-
PRECAUCIONES todo idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que
Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido la muestra de ADN ha sido amplificada eficien-
(PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cual- temente durante la reacción de amplificación.
quier fuente potencial de DNA contaminante. Si El test sólo funciona dentro de los límites de las
se requiere almacenar durante más de 4 sema- regiones genómicas para las que los primers
nas, almacene a –20°C. A fin de evitar congela- y sondas han sido elegidos. El análisis de se-
ciones y descongelaciones repetidas, alicuote cuencias potenciales permanece reservado
el PNM. Almacene el resto de los componentes para la reanudación de investigaciones.
del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después
de su fecha de caducidad. La presencia de múltiples especies de bacterias
Los especímenes de los pacientes y los culti- en la muestra a analizar puede dificultar la inter-
vos realizados a partir de especímenes de pa- pretación de resultados.
cientes deben ser considerados siempre como
potencialmente infecciosos. Las muestras de Como cualquier sistema de detección basado
pacientes de riesgo (infectados por microorga- en la hibridación, este sistema contempla la
nismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Vi- posibilidad de que variaciones de las secuen-
rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cias en las regiones genómicas que fueron ele-
cultivos realizados a partir de esas muestras gidas para los primers y sondas, y la detección
deben ser etiquetados y manejados siempre de regiones para las cuales el kit no fue diseña-
bajo las condiciones de seguridad adecuadas, do, pueden conducir a resultados falsos.
Pág. 113
MATERIALES
– Agua destilada (para uso en biología mole-
Debido a la gran variabilidad existente en los cular)
genomas bacterianos es posible que ciertos – Baño de agua
subtipos puedan no ser detectados. El test re- – Baño de agua con agitación/TwinCubator
fleja los conocimientos de Hain Life- science. – Baño de ultrasonidos
La utilización de este ensayo está limitada a – Centrífuga de mesa
personas cualificadas, bien entrenadas en el – Cronómetro
procedimiento de utilización del ensayo y fami- – ADN polimerasa termoestable con tampón
liarizadas con métodos de biología molecular. (recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase
La evaluación de este sistema de análisis fue de Qiagen)
llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime- – Guantes desechables
rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las – Papel absorbente
características de rendimiento de este ensayo – Pinzas
no han sido validadas para todas las polime- – Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl
rasas disponibles comercialmente, el usuario – Plataforma de agitación/TwinCubator
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de – Probeta graduada
otras polimerasas distintas de las arriba men- – Puntas de pipeta desechables con filtro
cionadas. – Reactivos para extracción de DNA, así como
equipos necesarios
9.6. IDENTIFICACIÓN DEL COMPLE- – Termociclador (rango de calentamiento 3°C/
JO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión
(GenoType MTBC) +/–0,2°C)
– Termómetro calibrado
PRINCIPIO – Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
El kit GenoType MTBC está basado en la tec-
nología DNA•STRIP que permite en base a los PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
polimorfismos genéticos, por los que la ADN Las muestras para extracción son a partir de
girasa B diferencia genéticamete de especies/ colonias aisladas de cultivo sólido, suspendi-
cepas pertenecientes al grupo Mycobacterium das en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa
tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y
BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae, RNsa.
M. microti, y M. tuberculosis/“M. canettii”. Las muestras también pueden extraerse a par-
El procedimiento completo se divide en tres pa- tir de cultivos positivos en medio líquido, se
sos: extracción de ADN procedente de cultivo traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR,
(placas de cultivo/medio líquido; los reactivos libre de DNasa y RNasa.
necesarios no se suministran), una amplifica-
ción múltiplex con primers marcados con bioti- PROCEDIMIENTO
na (la ADN polimerasa termoestable no se in-
cluye), y una hibridación reversa. EXTRACCIÓN DE ADN
La hibridación incluye los siguientes pasos: Puede usarse un crecimiento bacteriano en
desnaturalización química del producto a am- placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi-
plificar; hibridación de amplicones de una sola ddlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC,
cadena, marcados con biotina, a sondas uni- MB-Check). Este test no puede usarse para de-
das a membrana; lavado astringente; adición tectar micobacterias directamente de muestras
de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidi- de pacientes. La zona de trabajo ha de estar
na (AP), y una reacción de tinción mediada por libre de ADN amplificado. Es crucial el calen-
AP. Una plantilla asegura la interpretación sen- tamiento de las muestras a 95°C durante, al
cilla y rápida del esquema de bandas obtenido. menos, 20 minutos con objeto de inactivar bac-
terias vegetativas.
Pág. 114
solución de ADN. Prepare una mezcla que con-
tenga todos los reactivos excepto la solución de
20 minutos con objeto de inactivar bacterias ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. Alicuote la
vegetativas. Se puede seguir cualquier proce- mezcla madre en volúmenes de 45 µl en tubos
dimiento de extracción de ADN que produzca preparados de PCR.
ADN de bacterias amplificable. El siguiente pro-
tocolo rápido normalmente produce ADN ade- 2) Perfil de amplificación *)
cuado para amplificación:

dio sólido, recoja las colonias de bacterias con
Molecular).
mL. Concentre las bacterias mediante centrifu-
g aproximadamente. Deseche el sobrenadante
y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de Los productos para amplificación pueden alma-
agua (ver más arriba) con un vórtex. cenarse entre –20°C y 8°C.
2. Incube las bacterias procedentes del aparta- Para comprobar la reacción de amplificación,
do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño aplique directamente 5 μL de cada muestra a
de agua. un gel de agarosa al 2% sin la adición de tam-
3 Incube durante 15 min en un baño de ultra- pón de carga. Los amplicones tienen una longi-
sonidos. tud aproximada de 230 pb (Control de Género)
4 Centrifugue durante 5 min a máxima veloci- y 200 pb (Control Universal/amplicon espe-
dad y utilice directamente 5 μL del sobrenadan- cie-específico).
te para la PCR. En caso de que la solución de
ADN haya de almacenarse por períodos prolon- HIBRIDACIÓN
gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a Preparación
un tubo nuevo. Precaliente en baño de agua con agitación o
TwinCubator a 45°C; la máxima desviación to-
AMPLIFICACIÓN lerada en la temperatura idónea es de +/–1°C.
Prepare la mezcla de amplificación (45 μL) en Precaliente las soluciones HYB y STR a 37-
una habitación libre de ADN. La muestra debe 45°C antes de usar.
añadirse en un área separada.
Los reactivos han de estar libres de precipitado
Mezcle por tubo: (tenga en cuenta, no obstante que la solución
–35 µL de AM B – suministrado CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
–10 µL de AM A- suministrado Caliente a temperatura ambiente los restan-
–Añada 5 µL de solución de ADN (20-100 ng de tes reactivos, con la excepción del CON-C y
ADN) para obtener un volumen final de 50 µL el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
(sin considerar el volumen de enzima). Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
Determine el número de muestras a amplificar con sus tampones respectivos (CON-C con
(número de muestras a analizar más las mues- CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
tras de control). Por ejemplo, un control de con- necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera-
taminación contiene 5 µL de agua en lugar de tura ambiente.
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en las cantidades necesarias. Mezcle bien y Desde este paso, en adelante, trabaje a tem-
equilibre a temperatura ambiente. Para cada peratura ambiente. Elimine completamente la
tira añada 10 μL de concentrado a 1 mL de los Solución de Lavado Astringente.
respectivos tampones. Diluya el CON- C antes Deseche la Solución de Lavado en un contene-
de cada uso. El SUB-C diluído es estable du- dor y elimine todo el líquido restante volcando
rante 4 semanas si se almacena a temperatura la bandeja y golpeándola suavemente sobre un
ambiente y se protege de la luz. papel absorbente. Ello es también de aplicación
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
usando pinzas e identifíquelas marcando bajo 10. Elimine la solución y lave cada tira dos ve-
el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siem- ces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de
pre guantes cuando manipule tiras. Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL aproximadamente con 1 ml de agua destilada
de Tampón de Hibridación (HYB, verde) pre- (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta agitación del TwinCubator (deseche la solución
que la solución tenga un color homogéneo. cada vez).
Tenga la precaución de no derramar solución Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua
en los pocillos cercanos. después del lavado anterior.
4. Ponga una tira en cada pocillo. 11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más
Las tiras tienen que quedar completamente cu- arriba) a cada tira e incube sin agitación y pro-
biertas por la solución y el lado con la sonda tegiéndolas de la luz.
hacia arriba (identificable por el marcador co- Dependiendo de las condiciones del test (por
loreado próximo al extremo inferior). Usando ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in-
pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha- cubación del sustrato puede variar entre 3 y 20
berse girado durante su inmersión. Limpie cui- minutos. Tiempos prolongados de incubación
dadosamente las pinzas después de cada uso del sustrato pueden conducir a una tinción in-
para evitar contaminación. Ello, es también de crementada del fondo y podría dificultar la inter-
aplicación en los pasos siguientes. pretación de los resultados.
5. Ponga la bandeja en el baño de agua con 12. Detenga la reacción aclarando brevemente
agitación o en el TwinCubator durante 30 minu- por dos veces con agua destilada.
tos a 45°C. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande-
Ajuste la frecuencia de agitación del baño de ja y séquelas entre dos capas de papel absor-
agua para que realice una mezcla completa y bente.
constante de la solución. Para obtener una ade-
cuada transferencia de calor, la bandeja debe RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la
su altura. luz. Con cada kit se proporciona un formulario
6. Aspire completamente el Tampón de Hibrida- de evaluación. Cuando se utilice este formulario
ción. de evaluación, pegue las tiras reveladas en los
Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada campos marcados, alineando las bandas CC y
a una bomba de vacío. UC con las respectivas líneas del formulario.
7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astrin- Anote el número de las bandas positivas en la
gente (STR, roja) a cada tira e incube durante penúltima columna y determine la especie con
15 minutos a 45°C en un baño con agitación o la ayuda de la tabla de interpretación y registre
TwinCubator. el nombre de las especies identificadas en la
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No todas las bandas de una tira han de mostrar
la misma intensidad.
última columna. La plantilla suministrada tam- Si fue usada una gran cantidad de amplicón,
bién sirve como ayuda para evaluación y ha de pueden aparecer bandas adicionales.
ser alineada con las bandas UC y CC de la tira.
Cada tira tiene un total de 13 zonas de reacción TABLA DE INTERPRETACIÓN
(ver esquema).
Control de Conjugado (CC)

Debe aparecer una línea en esta zona, docu-
mentando la eficacia del conjugado unido y la PRECAUCIONES
reacción del sustrato.
Control Universal (UC) (PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cual-
Esta zona detecta, como es conocido, todas las quier fuente potencial de ADN contaminante. Si
micobacterias y miembros del grupo de bacte- se requiere almacenar durante más de 4 sema-
rias gram-positivas con alto contenido de G+C. nas, almacene a –20°C. A fin de evitar congela-
Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen ciones y descongelaciones repetidas, alicuote
como positivas, pero el restante esquema de el PNM. Almacene el resto de los componentes
bandas no puede ser asignado a una micobac- del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después
teria específica, se deben aplicar métodos adi- de su fecha de caducidad.
cionales para identificar la especie bacteriana Los especímenes de los pacientes y los culti-
correspondiente. vos realizados a partir de especímenes de pa-
Solamente han de considerarse aquellas ban- cientes deben ser considerados siempre como
das cuyas intensidades sean tan fuertes, o más potencialmente infecciosos. Las muestras de
fuertes, que la intensidad del Control Universal. pacientes de riesgo (infectados por microorga-
nismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Vi-
MTBC rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los
Esta zona hibrida, como es conocido, con am- cultivos realizados a partir de esas muestras
plicones generados de todos los miembros co- deben ser etiquetados y manejados siempre
nocidos de Mycobacterium tuberculosis com- bajo las condiciones de seguridad adecuadas,
plex. de acuerdo con las guías institucionales.
Otras bandas Observe todas las normas medioambientales y
Sondas Específicas; para la evaluación ver la de seguridad, tanto federales, estatales como
tabla de interpretación. locales. Lleve siempre guantes y ropa adecua-
da.
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fleja los conocimientos de Hain Life- science.
El tratamiento y preparación de la muestra, in- La utilización de este ensayo está limitada a
cluyendo el paso de inactivación por calor, de- personas cualificadas, bien entrenadas en el
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu- procedimiento de utilización del ensayo y fami-
ridad de clase II. Antes del paso de inactivación liarizadas con métodos de biología molecular.
por calor las muestras deben ser centrifugadas La evaluación de este sistema de análisis fue
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime-
el rotor con contenedor de aerosoles solamente rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
en la cabina de seguridad. Después de la in- características de rendimiento de este ensayo
activación por calor se puede utilizar un rotor no han sido validadas para todas las polime-
standard para centrifugar las muestras fuera de rasas disponibles comercialmente, el usuario
la cabina de seguridad. es el encargado de evaluar la aplicabilidad de
Observe las precauciones normales para pre- otras polimerasas distintas de las arriba men-
parar la amplificación. Es esencial que todos los cionadas.
de ADN y amplificación estén libres de DNasas.
10. SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- 10.1. INTRODUCCIÓN
guridad: La tuberculosis (Tb) es una enfermedad ree-
La Solución de Desnaturalización (DEN) contie- mergente causada principalmente por Myco-
ne <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. bacterium tuberculosis y que infecta a un tercio
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- de la población mundial. Dentro de los princi-
metil Sulfóxido y es irritante. pales objetivos en el desarrollo de procedimien-
tos para realizar susceptibilidad antibiótica es
LIMITACIONES poder identificar la presencia de cepas resisten-
tes y multiresistentes.
Antes de la amplificación, el ADN ha de ser ais- Para el tratamiento se utilizan varios medica-
lado de cultivo bacteriano realizado por un mé- mentos para evitar la aparición de resistencias
todo idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que por mutaciones naturales en las micobacterias.
la muestra de ADN ha sido amplificada eficien- Las drogas de primera línea son rifampicina
temente durante la reacción de amplificación. (RIF), isoniacida (INH), estreptomicina (SM) y
El test sólo funciona dentro de los límites de las etambutol (EMB); todas tienen cierto grado de
regiones genómicas para las que los primers toxicidad pero son relativamente seguras y cau-
y sondas han sido elegidos. El análisis de se- san pocos efectos secundarios.
cuencias potenciales permanece reservado Los test de susceptibilidad desempeñan un pa-
para la reanudación de investigaciones. pel muy importante en epidemiología, debido a
La presencia de múltiples especies de bacte- que detectan la aparición de resistencia provo-
rias en la muestra a analizar puede dificultar la cada por fallas en la administración o en la su-
interpretación de resultados. pervisión de un tratamiento adecuado. También
Como cualquier sistema de detección basado es importante porque los resultados pueden ser
en la hibridación, este sistema contempla la utilizados como una guía para iniciar la terapia,
posibilidad de que variaciones de las secuen- para confirmar la resistencia antibiótica en un
cias en las regiones genómicas que fueron paciente que demuestra respuesta insatisfacto-
elegidas para los primers y sondas, y la detec- ria al tratamiento y para la evaluar la tendencia
ción de regiones para las cuales el kit no fue de resistencia primaria y adquirida dentro de
diseñado, pueden conducir a resultados falsos. una comunidad.
Debido a la gran variabilidad existente en los En Guatemala las pruebas de susceptibilidad a
genomas bacterianos es posible que ciertos fármacos no se llevan a cabo rutinariamente,
subtipos puedan no ser detectados. El test re- lo cual hace surgir la posibilidad de esquemas
inadecuados de tratamiento para pacientes
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miten que las fuentes de infección se detengan.
El esquema se divide en dos fases:
con cepas multiresistentes. Fase intensiva: durante la cual se toma el trata-
miento todos los días.
a. Tratamiento. Fase de continuación: durante la cual los me-
El tratamiento está condicionado al compor- dicamentos se toman dos ó tres veces por se-
tamiento en el crecimiento del bacilo, a partir mana.
de un bacilo se origina una colonia, luego se
multiplica dependiendo de las características 10.2. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN
de cada bacilo el crecimiento puede ser inerte DE SENSIBILIDAD ANTIFÍMICA
ó con metabolismo inactivo, lento ó intermedio;
cuando se alcanza cierto número de bacilos se 10.2.1. MÉTODO DE LAS PROPORCIO-
empiezan a producir mutaciones naturales y NES DE CANETII
espontáneas, ésta mutación da lugar a la apa-
rición de resistencias de tipo cromosómicas y Un método utilizado para la determinación de la
por ello irreversibles las cuáles se encuentran susceptibilidad de micobacterias es el método
en relación con el número de bacilos presentes modificado de las proporciones. Los resultados
y el fármaco utilizado, es por ello que el trata- de éste método son reportados como un porcen-
miento debe ser combinado ya que no todos taje del total de la población bacteriana, el cuál
los elementos de las colonias poseen el mismo es definido por la cantidad de crecimiento en
comportamiento frente a las drogas. un medio que contiene el medicamento, com-
parada con el crecimiento en un medio control
b. Drogas de primera línea. libre de medicamento. Cuando más del 1% de
INH, RIF, SM, EMB y Pirazinamida (PZA) son la población bacilar es resistente a la concen-
los cinco medicamentos clasificados como dro- tración crítica de la droga, la micobacteria se
gas de primera línea debido a que poseen baja considera resistente. La concentración crítica
toxicidad y por la actividad que poseen, la INH del medicamento es aquella a la cual se inhibe
es la droga de mayor utilidad y de mayor uso. el crecimiento de la mayoría de bacterias.
Entre las dosis utilizadas de las drogas para el El principio del método se basa en que una sus-
tratamiento del Tb se pueden mencionar: pensión estandarizada del organismo a evaluar
INH 300mg diarios Posee baja toxicidad para se inocula en cajas de agar 7H10 que contiene
el hígado. un agente antimicrobiano, generalmente dro-
RIF 600mg diarios Posee baja toxicidad. gas de primera línea INH, RIF, SM, EMB com-
SM De uso limitado debido a su forma de admi- parado con un control que no contiene droga.
nistración (vía intramuscular), causa citotoxici- Entre las ventajas de este método se pueden
dad y disfunción renal. citar que de los métodos que existen en la ac-
EMB 15mg/kg/día Posee baja toxicidad. tualidad, éste es el más accesible y aplicable
PZA 25mg/kg/día Es hepatotóxica y produ- para la mayoría de los laboratorios de salud
ce hiperuricemia. del país. Entre las desventajas están, que las
micobacterias algunas veces se agrupan en
c. Drogas de segunda línea. grumos, o no crecen satisfactoriamente por lo
Este grupo de drogas es poco utilizado, excep- tanto es difícil obtener suspensiones homogé-
to en áreas en las que existen rangos grandes neas del inóculo. Es un método que requiere
de resistencia a las drogas de primera línea, personal capacitado por ser un método muy la-
éste grupo incluye ofloxacina, cicloserina, ca- borioso en cuanto a tiempo para preparación de
preomicina, etionamida, tiacetazona, kanamici- medios, además el procedimiento es minucio-
na/amikacina. so. Utiliza un medio de cultivo muy enriquecido
y si no se tiene el equipo y las condiciones de
d. Esquemas de tratamiento. esterilidad que exige el método, puede conta-
Si los esquemas de tratamiento se siguen de minarse fácilmente.
forma adecuada y con supervisión estricta per-
Pág. 119
- Disolver 106 mg (100,000μg) de INH en 10
ml de agua destilada. Esta es una solución de
PROCEDIMIENTO 10,000μg/ml.
- Esterilizar con filtro millipore.
El método modificado de las proporciones fue - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril.
seleccionado por las condiciones de laboratorio Esta es una solución 1,000μg/ml.
con las que se cuenta actualmente, se conside- - Agregar 1ml de 1,000μg/ml a 9ml de agua des-
ra reproducible y exacto. El mismo consiste en tilada estéril. Esta es una solución de 100μg/ml.
utilizar los antibióticos de primera línea selec- -Agregar 0.5 ml de 100μg/ml a 250ml de medio
cionados a diferentes valores de concentración. para obtener una concentración final de 0.2μg
Cada antibiótico reconstituido se incorpora al INH/ml de medio.
agar Middlebrook 7H10 previamente enriqueci- - Agregar 0.25 mL de 1,000μg/ml a 250ml de
do con ácido oleico-albúmina-dextrosa-catala- medio para obtener una concentración final de
sa (OADC) y luego se prepara en cajas de Petri 1μg INH/ml de medio.
de cuatro cuadrantes, o 15x125 mm. (10 ml.
aprox.) o con 13x100 mm (6 ml aprox). Dilucio- Estreptomicina (SM) en caja
nes estandarizadas de las micobacterias son - 131.4 mg dihidrosulfato de SM = 100mg de
inoculadas en el agar con antibiótico. Las cajas SM
de Petri se colocan en una incubadora a 37ºC - Disolver 131.4 mg de dihidrosulfato de estrep-
y se observan durante 2 a 3 semanas para de- tomicina en 10 ml de agua destilada. Esta es
tectar crecimiento. una solución de 10,000μg/ml.
- Esterilizar con filtro millipore.
Cada erlenmeyer con 225 middlebrook agar a - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril.
esto se le agrega 25 mL de OADC TOTAL: 250 Esta es una solución 1,000μg/ml.
mL - Agregar 0.4ml de solución 1,000μg/ml a 200ml
A. Preparación de soluciones antimicrobianas de medio para obtener una concentración final
• Preparar 1,000μg/ml de soluciones stock de de 2.0μg SM/ml de medio.
isoniacida, estreptomicina, rifampicina y etam-
butol de la casa sigma. Estreptomicina (SM) en tubo
• Alicuotar la solución stock en tubos de poli- - 131.4 mg dihidrosulfato de SM = 100mg de
propileno estériles y congelar por no más de 12 SM
meses a -20ºC (preferiblemente a -70ºC). - Disolver 131.4 mg de dihidrosulfato de estrep-
Isoniacida (INH) en caja tomicina en 10 ml de agua destilada. Esta es
- 106mg INH = 100 mg INH una solución de 10,000μg/ml.
- Disolver 106 mg (100,000μg) de INH en 10 - Esterilizar con filtro millipore.
ml de agua destilada. Esta es una solución de - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril.
10,000μg/ml. Esta es una solución 1,000μg/ml.
- Esterilizar con filtro millipore. - Agregar 0.5ml de solución 1,000μg/ml a 250ml
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. de medio para obtener una concentración final
Esta es una solución 1,000μg/ml. de 2.0 μg SM/ml de medio.
- Agregar 1ml de 1,000μg/ml a 9ml de agua des-
tilada estéril. Esta es una solución de 100μg/ml. Rifampicina (RIF) (Rifampin) en caja
- Agregar 0.4ml de 100μg/ml a 200ml de medio - 105 mg rifampicina = 100mg de rifampina.
para obtener una concentración final de 0.2μg - Disolver 105 mg. de rifampicina en 2 ml. de
INH/ml de medio. dimetil sulfóxido (DMSO) ó dimetilformami-
- Agregar 0.2 mL de 1,000μg/ml a 200ml de meda y completar hasta 10 mL con agua destila-
dio para obtener una concentración final de 1μg da (8 mL agua). para hacer una solución de
INH/ml de medio. 10,000μg/ml.
-Esterilizar con filtro millipore
Isoniacida (INH) en tubo - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril.
- 106mg INH = 100 mg INH Esta es una solución 1,000μg/ml.
Pág. 120
- especificada por el fabricante, y lentamente
Agregar 0.2 ml de solución 1,000μg/ml a 200ml agregar al agua. Permitir que el medio se disuel-
de medio para obtener una concentración final va ligeramente antes de agregar más. Agregar
de 1.0 μg rifampicina/ml de medio. el medio al agua de una sola vez puede causar
grumos que no se disolverán.
Rifampicina (RIF) (Rifampin) en tubo 6. Agregar 10ml de glicerol al balón y continuar
- 105 mg rifampicina = 100mg de rifampina. mezclando por otros 3 a 5 minutos. Continuar
- Disolver 105 mg. de rifampicina en 2 ml. de calentando (con agitación constante) hasta que
dimetil sulfóxido (DMSO) ó dimetilformamida y el medio se aclare (aproximadamente son 20
completar hasta 10 mL con agua destilada (8 mL minutos)
agua). para hacer una solución de 10,000μg/ml. 7. Remover el balón del calor.
- Esterilizar con filtro millipore. 8. Usar la probeta de 500ml, y alicuotar el agar
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. derretido dentro de los balones como sigue:
Esta es una solución 1,000μg/ml. - Agregar 180ml de agar a 6 balones de 500ml
- Agregar 0.25ml de solución 1,000μg/ml a - Agregar 540ml de agar a 1 balón de 1 litro
250ml de medio para obtener una concentración - Agregar un magneto a cada balón
final de 1.0μg rifampicina/ml de medio. - Cubrir los balones con tapaderas plásticas de
tapón de rosca, tapones de esponja, o papel
Etambutol (EMB) en caja aluminio, y autoclavear por 15 minutos a 121ºC.
- 136 mg d-etambutol = 100mg de EMB 9. Después de autoclavear, colocar los balones
- Disolver 100mg de d-etambutol en 10 ml de en un baño de agua ó en horno programado a
agua destilada. 50 a 56ºC para enfriar.
- Esterilizar con filtro millipore. 10. Si se desea, el agar puede dejarse solidificar
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. a temperatura ambiente y guardado en envases
Esta es una solución 1,000μg/ml. bien tapados protegidos de la luz a 2-8ºC hasta
- Agregar 1.0 ml de solución 1,000μg/ml a 200ml por 2 semanas. Previo a la preparación de ca-
de medio para obtener una concentración final jas, derretir el agar colocando el envase en un
de 5 μg etambutol/ml de medio. baño de agua hirviendo.
Etambutol (EMB) en tubo EN TUBO

- 136mg d-etambutol = 100mg de EMB 11. Usar la probeta de 500ml, y alicuotar el agar
- Disolver 100mg de d-etambutol en 10 ml de derretido dentro de los balones como sigue:
agua destilada. - Agregar 225ml de agar a 6 balones de 500ml
- Esterilizar con filtro millipore. (PARA ANTIBIOTICOS)
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. - Agregar 250ml de agar a 1 balón de 1 litro
Esta es una solución 1,000μg/ml. (PARA CONTROL DE CRECIMIENTO)
- Agregar 1.25ml de solución 1,000μg/ml a - Agregar un magneto a cada balón
250ml de medio para obtener una concentración Cubrir los balones con tapaderas plásticas de
final de 5 μg etambutol/ml de medio. tapón de rosca, tapones de esponja, o papel
aluminio, y autoclavear por 15 minutos a 121ºC
B. Preparación de medios. AGREGAR 25 mL de OADC (ESTO ES PARA
1. Calentar el baño de agua a 50-56ºC. 20 TUBOS MÁXIMO 25 TUBOS EXACTOS)
2. Preparar el agar base 7H10
3. Agregar 1,800ml de agua destilada a un balón C. Etiquetado de las cajas.
de 2 litros. 1. Preparar 70 cajas cuadriplate en dos colum-
4. Agregar un magneto para agitación, y agitar nas de 35 cajas cada una.
el agar en una estufa con agitación magnética 2. Etiquetar todas las cajas de una columna con
a velocidad media y a temperatura media a ele- el número 1.
vada. 3. Etiquetar todas las cajas de la segunda co-
5. Pesar la cantidad de agar Middlebrook 7H10 lumna con el número 2.
Pág. 121
antimicrobianos.
4. El número en la caja es un código para los
antimicrobianos dispensados en esa caja.
Tabla No. 8 Número de organismos por cam-

po
NOTA:
- Contar un acumulo como un solo organismo. (μg/ml)= microgramos por mililitro
- Utilizar objetivo de aceite de inmersión (para a = la solución stock de antimicrobianos
conteo de organismos teñidos con carbolfucs- (1,000μg/ml excepto que se especifique otro)
hina) se agrega a 180ml de agar con 20mL OADC.
- Utilizar objetivo seco fuerte (para conteo de *1=100 ug/ml
organismos teñidos con fluorocromo)
8. Retirar un frasco de tapón de rosca conte-
D. Preparación de cajas. niendo 360ml de agar a 56˚C.
9. Agregar 40ml de OADC al frasco y agitar len-
1. Permitir que los antimicrobianos se descon- tamente (no aplicar calor)
gelen a temperatura ambiente, y usarlos lo más 10. Continuar la agitación por 1 a 2min.
rápido posible. Nunca permitir que se reconge- 11. Utilizando una pipeta estéril o un dispensa-
len. dor, dispensar 5ml del agar libre de droga den-
2. Retirar un frasco de 200ml de enriquecedor tro del cuadrante I de las 70 cajas.
OADC del refrigerador, y atemperar. 12. Permitir que el agar se solidifique a tempe-
3. Retirar un frasco de tapón de rosca de 500ml ratura ambiente dentro de una campana de flu-
conteniendo 180ml de agar Middlebrook 7H10 jo laminar.
y agitar en un plato de agitación para homoge- 13. Cuando el agar esté solidificado colocarlo
nizar el medio (sin calor) en bolsas plásticas y guardar a 2-8˚C en la os-
4. Agregarle 20ml de enriquecedor OADC cuan- curidad.
do el agar tenga una temperatura de 56˚C y ho- 14. Etiquetar con una fecha de expiración de 1
mogenizar (no aplicar calor) mes.
5. Agregar la cantidad apropiada de antimicro- . Preparación del inóculo.
biano para obtener una concentración final de
0.2μm de INH y continuar la agitación por 1 a 2 1.Escoger de 3-5 colonias (representando to-
min (ver tabla No. 9) dos los tipos de colonias si se encuentran múlti-
6. Utilizando una pipeta estéril o un dispensa- ples tipos) y emulsificarlas en 4ml de caldo Du-
dor, dispensar 5ml de agar con INH en el cua- bos-Tween-albúmina contenido en un tubo de
drante II de las 35 cajas etiquetadas con 1 (ver vidrio (13x100mm) al cual se le han agregado
tabla No. 9) de seis a ocho perlas de vidrio.
7. Repetir los pasos del 1 al 6 para los otros 2. Agitar en vórtex por 1 a 2 min.
antimicrobianos y dispensarlos dentro de los 3. Dejar reposar el tubo por 30 minutos, de
cuadrantes de las cajas 1 y 2 (ver tabla No. 9) modo que las partículas grandes sedimenten.
4. Decantar el sobrenadante y transferirlo a otro
Tabla No 9. Preparación de cajas con tubo de vidrio estéril (13x100).
Pág. 122
absorbido dentro del medio (aproximadamente
por una hora).
5. Ajustar la turbidez de la suspensión del so- 12. Envolver cada caja en una bolsa de polipro-
brenadante con caldo Dubos-Tween-albúmina pileno permeable a CO2 y colocar las cajas con
hasta alcanzar el estándar 1.0 de McFarland el agar hacia abajo.
(Conteniendo aproximadamente 107 UFC/ml). 13. Incubar las cajas a 36ºC en una atmósfera
6. Diluir la suspensión a 10-2 y 10-4 con agua de 5 al 10% de CO2.
destilada estéril.
G. Lectura de cajas.
F. Inoculación e incubación.
1. Después de 1 a 2 días de incubación, exami-
1. Para cada organismo a ser evaluado, llevar a nar el agar sangre y el agar Middlebrook 7H10
temperatura ambiente 2 grupos de cajas cuadri- para evidenciar bacterias contaminantes. Si se
plate con el medio para susceptibilidad (un gru- detecta contaminación, descartar todas las ca-
po de cajas incluye: una caja etiquetada como jas y repetir la evaluación con un nuevo inóculo.
1 y otra como 2). Asegurar que la superficie (Algunas veces es necesario preparar varios
del agar este seca (secar cualquier gota con un subcultivos para obtener un inóculo puro).
hisopo de algodón estéril). Incubar y continuar examinando la pureza del
2. Etiquetar estas dos cajas para la evaluación agar sangre diariamente por 7 días y la pureza
de susceptibilidad con el número de cultivo del del agar 7H10 semanalmente mientras dure la
paciente y la dilución, por ejemplo 10-2. evaluación.
3. Inocular este primer grupo de cajas para 2. Examinar el cuadrante control (sin antimicro-
evaluar susceptibilidad de dilución 10-2 con la biano) semanalmente. Cuando se observe cre-
suspensión de la dilución 10-2 de la siguiente cimiento de 1+ o más (ver tabla 2), leer todas
manera. las cajas. Si el crecimiento no es suficiente
4. Usando una pipeta estéril con algodón en el entre 2 y 3 semanas de incubación, se repite el
extremo posterior, inocular una gota de la sus- test. Es importante tener en cuenta que:
pensión a evaluar, sin que la pipeta toque la No hay que dar un reporte final de resultados
superficie del medio, en cada esquina de cada de resistencia o susceptibilidad hasta que las
cuadrante (3 gotas por cuadrante). cajas hayan sido incubadas por 3 semanas.
5. Mantener la pipeta perpendicular al agar para 3. Examinar todos los cuadrantes, y estimar
asegurar la uniformidad de las gotas, tener cui- el número de colonias creciendo en cada cua-
dado de no tocar la superficie del agar con la drante (contando el número total de colonias
punta de la pipeta. creciendo en los tres círculos de crecimiento).
6. Tener cuidado de colocar las gotas de modo 4. Cuantificar el crecimiento como se especifica
que no se corran al borde de la caja de petri (es a continuación.
difícil contar colonias en el borde de la caja). 5. Se debe notar la presencia de cualquier mi-
7. Repetir el procedimiento anterior para cada crocolonia como las colonias en el medio con-
cuadrante de la caja. teniendo antibiótico que son más pequeñas que
8. Etiquetar e inocular el segundo grupo de aquellas en el medio control.
cajas para evaluación de susceptibilidad con la 6. Cuantificar el crecimiento y registrar el núme-
dilución 10-4 de la misma manera. ro de colonias.
9. Evaluar una cepa de control de calidad a di- 7. Calcular el porcentaje de resistencia dividien-
luciones 10-2 y 10-4. do el número de colonias creciendo en el medio
10. Inocular una caja de agar sangre y una caja con antibiótico dentro del número de colonias
de agar Middlebrook 7H10 con 1 ó 2 gotas de creciendo en el medio control y multiplicando
la suspensión anterior y estriarlas con asa en por 100.
argolla a manera de aislar colonias.
11. Permitir que las cajas inoculadas permanez- Tabla No.10 Cuantificación del creci-
can con el agar hacia arriba a temperatura am- miento de colonias de micobacterias
biente (en la campana) hasta que el inóculo sea en cajas de agar.
Pág. 123
1 Cantidad exacta de colonias contadas.
H. Resultados.
1. Interpretación.
Si el control de calidad es aceptable, interpretar como se especifica a continuación:

1.1. Interpretar los resultados de la dilución de organismos que presente un número contable de
colonias (idealmente de 50 a 100) en el crecimiento del cuadrante control.
1.2. Nunca utilizar la dilución con recuento de colonias ≤50.
1.3. Utilizar la dilución con recuento de colonias de 4+ con precaución.
1.4. Si ambas diluciones muestran crecimiento 4+ y el organismo es susceptible a todos los anti-
bióticos, interpretar los resultados. Si el organismo muestra resistencia a cualquier antibiótico, la
resistencia puede deberse a un inóculo muy cargado. Repetir completamente la prueba.
Tabla No. 11 Ejemplos de reportes.
1.5. La presencia de microcolonias sugiere que el aislamiento puede ser resistente al antibiótico
pero que tiene algún efecto en el organismo y puede ser efectivo en combinación con otras dro-
gas.
1.6. Interpretar un resultado como resistente cuando la proporción del crecimiento en el medio
conteniendo antibiótico es ≥1% del crecimiento en el medio libre de antibiótico.
1.7. Ejemplos:
Pág. 124
El kit GenoType® MTBDRplus está basado en
a. nterpretación de resistencia. la tecnología DNA•STRIP® y permite la identi-
ficación mediante genética molecular del com-
Crecimiento control (cuadrante I) 200 colonias plejo Mycobacterium tuberculosis y su resis-
(3+) tencia a rifampicina y/o isonizida, desde cultivo
INH, 0.2 μg/ml (cuadrante II) 7 colonias o muestras clínicas pulmonares baciloscopia
7 colonias x 100% = 3.5%, i.e., Resistente. positivas. La identificación de la resistencia a
200 colonias rifampicina es posible gracias a la detección de
las mutaciones más significativas del gen rpoB
No es necesario realizar un recuento real de las (que codifica por la subunidad β de la ARN po-
colonias para aquellas concentraciones cuan- limerasa). Para testar la resistencia de isoniazi-
do el crecimiento es obviamente <1% ó ≥1%. da de alto nivel es examinado el gen katG (que
codifica por la catalasa perioxidasa), y para tes-
b. Con un control de calidad aceptable, reportar tar la resistencia a isoniazida de bajo nivel, es
como sigue el siguiente ejemplo. examinada la región del promotor del gen inhA
(que codifica por la NADH enoil ACP reducta-
Tabla No. 12 Control de calidad sa). El procedimiento completo se divide en
tres pasos: aislamiento de DNA procedente de
cultivo (medio sólido/medio líquido) o de mues-
tra clínica (muestras pulmonares baciloscopia
positivas decontaminadas) – los reactivos ne-
cesarios no se suministran – una amplificación
múltiplex con primers marcados con biotina (la
DNA polimerasa termoestable no se incluye), y
una hibridación reversa.
La hibridación incluye los siguientes pasos:
desnaturalización química del producto a am-
plificar, hibridación de amplicones en una sola
cadena, marcados con biotina, a sondas unidas
INH= isoniacida, SM= estreptomicina, RIF= ri- a membrana, lavado astringente, adición de
fampicina, EMB= etambutol conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina
R= resistente, S= susceptible (AP), y una reacción de tinción mediada por AP.
(μg/ml)= microgramos por mililitro. Una plantilla asegura la interpretación sencilla y
rápida del esquema de bandas obtenido.
Médicos experimentados algunas veces utili-
MATERIALES
zan el porcentaje de organismos resistentes al
• Agua destilada (para uso en biología molecu-
agente antimicrobiano como una guía para la
lar)
eficacia de la terapia. Por ello es importante
• Baño de agua
calcular y registrar el porcentaje de resistencia
• Baño de agua con agitación/TwinCubator
en una hoja de trabajo, y mantener esta infor-
• Baño de ultrasonidos
mación disponible para los médicos que la re-
quieran. • Centrífuga de mesa
• Cronómetro
10.2.2. MÉTODO DE PCR: IDENTIFI- • DNA polimerasa termoestable con tampón (re-
CACIÓN DEL COMPLEJO MYCOBAC- comendación: HotStarTaq DNA Polymerase de
TERIUM TUBERCULOSIS (GenoType® Qiagen)
MTBDRplus) • Guantes desechables
• Papel absorbente
PRINCIPIO
Pág. 125
• Pinzas g aproximadamente. Deseche el sobrenadan-
• Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl te y resuspenda las bacterias en 100-300 μl de
• Plataforma de agitación/TwinCubator agua (ver más arriba) con un vortex.
• Probeta graduada 2. Incube las bacterias procedentes del aparta-
• Puntas de pipeta desechables con filtro do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño
• Reactivos para extracción de DNA, así como de agua.
equipos necesarios 3 Incube durante 15 min en un baño de ultraso-
•Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ nidos.
seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión 4 Centrifugue durante 5 min a máxima veloci-
+/–0,2°C) dad y utilice directamente 5 μl del sobrenadan-
• Termómetro calibrado te para la PCR. En caso de que la solución de
• Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa DNA haya de almacenarse por períodos prolon-
gados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
PREPARACIÒN DE LA MUESTRA un tubo nuevo.
Las muestras para extracción son a partir de
colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas AMPLIFICACIÓN
en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa y RNa- Prepare la mezcla de amplificación (45 μl) en
sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. una habitación libre de DNA. La muestra debe
Las muestras también pueden extraerse a partir añadirse en un área separada.
da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de Mezcle por tubo:
DNasa y RNasa. –35 µl de AM B – suministrado
–10 µl de AM A- suministrado
PROCEDIMIENTO –Añada 10 µl de solución de DNA (20-100 ng
EXTRACCIÓN DE ADN de DNA) para obtener un volumen final de 55 µl
Puede usarse un crecimiento bacteriano en (sin considerar el volumen de enzima).
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi-
ddlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, Determine el número de muestras a amplificar
MB-Check). Este test no puede usarse para (número de muestras a analizar más las mues-
detectar micobacterias directamente de muestras de control). Por ejemplo, un control de con-
tras de pacientes. La zona de trabajo ha de es- taminación contiene 5 µl de agua en lugar de
tar libre de DNA amplificado. Es crucial el ca- solución de DNA. Prepare una mezcla que con-
lentamiento de las muestras a 95°C durante, tenga todos los reactivos excepto la solución de
al menos, 20 minutos con objeto de inactivar DNA y mezcle bién. No utilice vortex. Alicuote la
bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- mezcla madre en volúmenes de 45 µl en tubos
quier procedimiento de extracción de DNA que preparados de PCR.
produzca DNA de bacterias amplificable. El si-
guiente protocolo rápido normalmente produce 2) Perfil de amplificación *)
DNA adecuado para amplificación:

dio sólido, recoja bacterias con un asa de ino-
culación y suspéndalas en aproximadamente
300 μl de agua (grado Biología Molecular).
ml. Concentre las bacterias mediante centrifu-
Pág. 126
Los productos para amplificación pueden alma- en los pocillos cercanos.
cenarse entre +8 y –20°C. 4. Ponga una tira en cada pocillo.
Para comprobar la reacción de amplificación, Las tiras tienen que quedar completamente cu-
aplique directamente 5 μl de cada muestra a un biertas por la solución y el lado con la sonda
gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón hacia arriba (identificable por el marcador co-
de carga. Los amplicones tienen una longitud loreado próximo al extremo inferior). Usando
aproximada de 230 pb (Control de Género) pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha-
y 200 pb (Control Universal/amplicon espe- berse girado durante su inmersión. Limpie cui-
cie-específico). dadosamente las pinzas después de cada uso
para evitar contaminación. Ello, es también de
HIBRIDACIÓN aplicación en los pasos siguientes.
Preparación 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con
Precaliente en baño de agua con agitación o agitación o en el TwinCubator durante 30 minu-
TwinCubator a 45°C; la máxima desviación to- tos a 45°C.
lerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. Ajuste la frecuencia de agitación del baño de
Precaliente las soluciones HYB y STR a 37- agua para que realice una mezcla completa y
45°C antes de usar. constante de la solución. Para obtener una ade-
Los reactivos han de estar libres de precipitado cuada transferencia de calor, la bandeja debe
(tenga en cuenta, no obstante que la solución estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. su altura.
Caliente a temperatura ambiente los restan- 6. Aspire completamente el Tampón de Hibrida-
tes reactivos, con la excepción del CON-C y ción.
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el a una bomba de vacío.
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 7. Añada 1 ml de Solución de Lavado Astrin-
con sus tampones respectivos (CON-C con gente (STR, roja) a cada tira e incube durante
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades 15 minutos a 45°C en un baño con agitación o
necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera- TwinCubator.
tura ambiente. Para cada tira añada 10 μl de Desde este paso, en adelante, trabaje a tem-
concentrado a 1 ml de los respectivos tampo- peratura ambiente. Elimine completamente la
nes. Diluya el CON- C antes de cada uso. El Solución de Lavado Astringente.
SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si Deseche la Solución de Lavado en un contene-
se almacena a temperatura ambiente y se pro- dor y elimine todo el líquido restante volcando
tege de la luz. la bandeja y golpeándola suavemente sobre un
papel absorbente. Ello es también de aplicación
1. Dispense 20 μl de la Solución de Desnaturali- a todos los demás pasos de lavado.
zación (DEN, azul) en una esquina de cada uno 8. Lave una vez cada tira con 1 ml de Solución
de los pocillos usados. de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agita-
2. Añada a la solución 20 μl de muestra am- do del TwinCubator (elimine el RIN después de
plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar la incubación).
bien e incube a temperatura ambiente durante 9. Añada 1 ml de Conjugado diluído (ver más
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
usando pinzas e identifíquelas marcando bajo sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siem- 10. Elimine la solución y lave cada tira dos ve-
pre guantes cuando manipule tiras. ces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de
3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 ml Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
de Tampón de Hibridación (HYB, verde) pre- aproximada- mente con 1 ml de agua destilada
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta (ej.: botella de lavado) ) sobre la plataforma de
que la solución tenga un color homogéneo. agitación del TwinCubator (deseche la solución
cada vez).
Pág. 127
Control de Conjugado (CC)
Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua Debe aparecer una línea en esta zona, docu-
después del lavado anterior. mentando la eficacia del conjugado unido y la
11. Añada 1 ml de sustrato diluído (ver más arri- reacción del sustrato.
ba) a cada tira e incube sin agitación y prote-
giéndolas de la luz. Control Universal (UC)
Dependiendo de las condiciones del test (por Esta zona detecta, como es conocido, todas las
ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in- micobacterias y miembros del grupo de bacte-
cubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 rias gram-positivas con alto contenido de G+C.
minutos. Tiempos prolongados de incubación Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen
del sustrato pueden conducir a una tinción in- como positivas, pero el restante esquema de
crementada del fondo y podría dificultar la inter- bandas no puede ser asignado a una micobac-
pretación de los resultados. teria específica, se deben aplicar métodos adi-
12. Detenga la reacción aclarando brevemente cionales para identificar la especie bacteriana
por dos veces con agua destilada. correspondiente.
13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande- Solamente han de considerarse aquellas ban-
ja y séquelas entre dos capas de papel absor- das cuyas intensidades sean tan fuertes, o más
bente. fuertes, que la intensidad del Control Universal.
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN M. tuberculosis complex (TUB)

Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la Esta zona hibrida, como es conocido, con ampli-
luz. Con cada kit se proporciona un formulario cones generados de todos los miembros cono-
de evaluación. Cuando se utilice este formulario cidos de Mycobacterium tuberculosis complex.
de evaluación, pegue las tiras reveladas en los Si la zona TUB es negativa, la bacteria testada
campos marcados, alineando las bandas CC no pertenece al complejo M. tuberculosis y no
y AC con las respectivas líneas del formulario. puede ser evaluada mediante este sistema.
Por razones técnicas, la distancia entre cada
Locus Control (rpoB, katG, y inhA)
sonda de la tira puede variar ligeramente. Por
tanto, para una lectura precisa, por favor utilice Las zonas del Locus Control detectan una re-
la plantilla que encontrará en cada kit, y alinee gión del gen específica para cada respectivo
separadamente para cada uno de los tres loci locus y siempre han de ser positivas, cuando la
detectados, con su respectivo Locus Control. banda de TUB haya documentado la presencia
Determine el estado de la resistencia y anote de M. tuberculosis.
en las respectivas columnas. Como ayuda para
la interpretación se dan ejemplos de evaluacio- Sondas Wild type
nes en el siguiente apartado. No todas las ban- Las sondas wild type comprenden las áreas de
das de una tira muestran la misma intensidad.
resistencia más importantes de los genes res-
Cada tira tiene un total de 27 zonas de reacción
(ver esquema). pectivos (ver figura 1, tabla 1, 2 y 3) Cuando to-
das las sondas Wild type de un gen son positi-
vas, no se detectan mutaciones en las regiones
examinadas. La cepa testada es sensible para
el respectivo antibiótico.
En caso de una mutación, el respectivo ampli-
cón no puede unirse a la correspondiente son-
da Wild type. La ausencia de señal en al menos
una de las sondas Wild type indica, por tanto,
resistencia de la cepa testada al respectivo an-
tibiótico.
Solamente serán consideradas como positivas
aquellas bandas cuya intensidad sea igual o
mayor que la banda de Control de Amplifica-
ción.
Pág. 128
Si todas las bandas wild type muestra señal,
este resultado es clasificado como positivo y
Cada patrón que se desvíe del patrón wild type marcaremos la columna de WT de los respe-
indica resistencia de la cepa testada. El patrón tivos genes con el signo “+”. Si la menos una
de bandas obtenido con las sondas rpoB permi- de las bandas de Wild type está ausente, este
te dibujar una conclusión sobre la resistencia a resultado es clasificado como negativo y marca-
rifampicina de las cepas testadas, el patrón de remos la columna de WT de los mismos genes
bandas obtenido con las sondas katG permite con “–“.
dibujar una conclusión sobre las resistencias de Las columnas de mutación solamente se marca-
alto nivel a isoniazida, el patrón de bandas ob- rán con un signo negativo cuando no aparezca
tenido con las sondas inhA permiten dibujar una ninguna de las bandas correspondientes a las
conclusión sobre las resistencias de bajo nivel mutaciones. Si al menos una de las bandas de
a isoniazida de las cepas testadas, respectiva- mutación aparece positive, este resultado se
mente. clasificará como positivo, y la columna MUT del
respectivo gen se marcará con un “+”.
Sondas de mutación
Las sondas de mutación detectan algunas de Seguidamente se explican dos de los ejemplos
las resistencias más comunes mediadas por arriba mostrados:
mutaciones (ver 1, 2 y 3). Comparadas con El ejemplo 1 muestra el patrón de bandas del
otras muestras, las señales positivas de las son- wild type. Todas las sondas de Wild type mues-
das de mutación rpoB MUT2A y MUT2B pueden tran señal, pero ninguna de las sondas de muta-
mostrar una señal más débil. ción lo hacen, por tanto, la tarjeta de evaluación
Solamente deben ser consideradas aquellas muestra un “+” en las tres columnas del wild
bandas cuya intensidad es de la misma inten- type y un “–“ en las tres columnas de las muta-
sidad o mayor que las del Control de Amplifica- ciones. De acuerdo a estos datos, las casillas
ción. „RMP sensitive“ e „INH sensitive“ se marcarán
Cada patrón que se desvíe del patrón del wild „+“.
type indica resistencia de la cepa testada. El pa-
trón de bandas obtenido con la sonda rpoB per- Una de las sondas de rpoB y de katG wild type
mite dibujar una conclusión sobre la resistencia están ausentes en el ejemplo 5; por tanto en las
a rifampicina de la cepa testada, el patrón de casillas de rpoB WT y katG WT se marcará “–“.
bandas del katG sobre un nivel alto y el patrón Ya que ninguna de las sondas de mutación son
de bandas del inhA sobre una nivel bajo de re- positivas, estas casillas se marcarán también
sistencia a isoniazida respectivamente. con “–“. La región promotora de inhA no se des-
vía del patrón wild type. La cepa es evaluada
TABLA DE INTERPRETACIÓN como RMP e INH resistente. La resistencia a
INH está causada por una mutación en el gen
katG y es por tanto una resistencia a isoniazida
de alto nivel.
PRECAUCIONES

(PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cual-
quier fuente potencial de DNA contaminante. Si
se requiere almacenar durante más de 4 sema-
nas, almacene a –20°C. A fin de evitar congela-
ciones y descongelaciones repetidas, alicuote el
PNM. Almacene el resto de los componentes del
kit en 2-8°C.
Pág. 129
bilidad.
Como en cualquier análisis basado en DNA,
No utilice los reactivos después de su fecha de este test sólamente analiza la secuencia de
caducidad. ácidos nucléicos y no la de aminoácidos. Es
Los especímenes de los pacientes y los culti- posible, por tanto, que mutaciones que no cau-
vos realizados a partir de especímenes de pa- san un cambio de aminoácido (mutaciones si-
cientes deben ser considerados siempre como lenciosas) podrían producir la ausencia de una
potencialmente infecciosos. Las muestras de de las sondas wild type.
pacientes de riesgo (infectados por microorga- Los datos más recientes indican que a pesar de
nismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Vi- aparezca una mutación L533P en la respectiva
rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cepa, esta puede todavía ser sensible a RMP.
cultivos realizados a partir de esas muestras Por tanto, si la banda WT8 está ausente y la
deben ser etiquetados y manejados siempre sonda de la mutación rpoB MUT3 no se tiñe,
bajo las condiciones de seguridad adecuadas, deben ser considerados los resultados de la
de acuerdo con las guías institucionales. Ob- resistencia fenotípica.
serve todas las normas medioambientales y de En los últimos años han sido publicadas muta-
seguridad, tanto federales, estatales como lo- ciones adicionales dentro de las testadas en la
cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. región del gen rpoB causantes de la resisten-
El tratamiento y preparación de la muestra, in- cia a rifampicina. Ya que estas mutaciones son
cluyendo el paso de inactivación por calor, de- muy raras, estas no fueron accesibles para la
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu- validación de este sistema y fueron solamente
ridad de clase II. Antes del paso de inactivación detectadas in silico. Sin embargo, una detec-
por calor las muestras deben ser centrifugadas ción in silico no excluye la posibilidad de que
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir alguna de las mutaciones no pueda ser detec-
el rotor con contenedor de aerosoles solamen- tada in vitro.
te en la cabina de seguridad. Después de la El GenoType® MTBDRplus solamente detecta
inactivación por calor se puede utilizar un rotor aquellas resistencias del M. tuberculosis com-
standard para centrifugar las muestras fuera de plex que tienen sus orígenes en la regiones de
la cabina de seguridad. rpoB, katG e inhA examinadas aquí. Resisten-
Observe las precauciones normales para pre- cias que tienen sus orígenes en mutaciones en
parar la amplificación. Es esencial que todos los otros genes o regiones de genes, así como,
materiales y reactivos usados para extracción otras resistencias o mecanismos de resistencia
de DNA y amplificación estén libres de DNasas. rifampicina e isoniazida no serán detectados
por este test.
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- El usuario debe tener o adquirir información so-
mar las siguientes medidas especiales de se- bre el patrón de distribución de las mutaciones
guridad: locales de los genes investigados con este test.
La Solución de Desnaturalización (DEN) con- La presencia de múltiples especies de bacte-
tiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y rias en la muestra a analizar puede dificultar la
piel. interpretación de resultados.
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- Teóricamente, puede existir resistencia a pesar
metil Sulfóxido y es irritante. de que aparezca un modelo wild type. Si, en
un ensayo, la muestra contiene una cepa que
LIMITACIONES ha desarrollado una he- teroresistencia y la re-
La declaración dada en este manual con res- sistencia se debida a una mutación no cubierta
pecto a la capacidad del método, se refiere a por las sondas, aparecerá el patrón de bandas
muestras de cultivos y muestras clínicas pul- de wild type. Del mismo modo, si la muestra
monares baciloscopia positivas. Los datos dis- contie nen más de una cepa del complejo M.
ponibles sobre muestras clínicas extrapulmo- tuberculosis (debido a un cultivo mixto o una
nares baciloscopia positivas no son suficientes contaminación) y una de ellas alberga una mu-
para trazar una conclusión acerca de su aplica- tación que no está cubierta por las sondas
Pág. 130
geno disuelto en caldo por crecimiento de los
microorganismos.
de mutación, aparecerá también el patrón de El kit BACTEC MGIT 960 SIRE es un análisis
cualitativo con duración de 4 a 13 días. El aná-
bandas de wild type. Como en el caso de otras
lisis se basa en la comparación del crecimien-
pruebas de diagnóstico, los resultados de este
to de la cepa aislada de M. tuberculosis en un
ensayo sólo pueden interpretarse en conjunción
tubo que contiene antibiótico con el crecimiento
con otros datos clínicos y de laboratorio adicio-
en un tubo sin antibiótico (control del crecimien-
nales a disposición del facultativo responsable.
to). El instrumento BACTEC MGIT controla los
Antes de la amplificación, el DNA ha de ser ais-
tubos para detectar un aumento de su fluore-
lado de cultivo bacteriano o muestras clínicas
cencia. Utiliza el análisis de la fluorecencia del
pulmonares baciloscopia positivas, utilizando
tubo con antibiótico en comparación de la fluo-
un método idóneo. Ha de tenerse la seguridad
recencia del tubo de control de crecimiento para
de que la muestra de DNA ha sido amplificada
determinar los resultados de sensibilidad.
eficientemente durante la reacción de amplifica-
ción. El test solo funciona dentro de los límites
de las regiones genómicas para las que los pri- Materiales
mers y sondas han sido elegidos. El análisis de Kit SIRE contiene frascos individuales liofiliza-
secuencias potenciales permanece reservado dos de estreptomicina 332 ug, isoniazida 33.2
para la reanudación de investigaciones. ug, rifampicina 332 ug y etambutol 1,660 ug y 8
Como cualquier sistema de detección basado frascos de suplemento SIRE.
en la hibridación, este sistema contempla la po- Suplemento BACTEC SIRE contienen 20 ml de
sibilidad de que variaciones de las secuencias medio de enriquecimiento Middlebrook OADC.
en las regiones genómicas que fueron elegidas Formula por litro de agua:
para los primers y sondas, y la detección de re- Albumina bovina 50 gr. Catalasa 0,03gr.
giones para las cuales el kit no fue diseñado, Dextrosa 20 gr.
pueden conducir a resultados falsos. Debido a Ácido oleico 0,6 gr.
la gran variabilidad existente en los genomas Suminstrados: Kit BACTEC MGIT 90 SIRE con
bacterianos es posible que ciertos sub-tipos un frasco de cada antibiótico liofilizado y ocho
puedan no ser detectados. El test refleja los co- frascos de suplemento SIRE (se obtiene apro-
nocimientos de Hain Lifescience. ximadamente 40 análisis por cada antibiótico
La utilización de este ensayo está limitada a del kit).No sumisntrados: Tubos de crecimiento
personas cualificadas, bien entrenadas en el MGIT 7 ml, medios de cultivo auxiliares como
procedimiento de utilización del ensayo y fami- Middlebrook caldo 7H9, reactivos como solu-
liarizadas con métodos de biología molecular. ción salina estéril, cepas ATCC para el control
La evaluación de este sistema de análisis fue de calidad y equipo de laboratorio para el pro-
llevada acabo utilizando la HotStarTaq polime- ceso como vortex, nefelómetro,etc.
rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
características de rendimiento de este ensayo Almacenamiento
no han sido validadas para todas las polime- Los antibióticos liofilizados deben estar a 2 -8°C.
rasas disponibles comercialmente, el usuario Una vez reconstituidos se puede congelar y al-
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de macenar a temperatura igual o menor a -20°C
otras polimerasas distintas de las arriba men- durante un máximo de 6 meses siempre que no
cionadas. se pase la fecha de caducidad original. Una vez
descongeladas deben usarse inmediatamente,
10.2.3. MÉTODO DE SENSIBILIDAD AN- desechar cualquier porción no utilizada.
TIFÍMICA POR BACTEC MGIT 960 SIRE Suplemente SIRE debe almacenar en lugar os-
KIT curo de 2 -8 °C. Evitar congelación y sobreca-
lentamiento. Abrir y usar antes de la fecha de
Principio
caducidad. Reducir al mínimo la exposición a
El tubo MGIT para detección de crecimiento mi-
la luz
cobateriano es caldo midlebrook 7H9 con com-
puesto fluorescente el cual es sensible al oxí-
Pág. 131
8. Diluir 1 ml de la suspensión ajustada en 4 ml
de solución salina estéril (dilucion 1:5). Conti-
nuar con el proceso de inoculación para el aná-
Procedimiento lisis de sensibilidad.
Preparación antifimicos: Reconstituir cada fras- A partir de un tuboBACTEC MGIT de 7 ml po-

co de liofilizado del kit SIRE con 4 ml de agua sitivos:
estéril destilada/desionizada para preparar so- 1. El primer día en que el instrumento registra
luciones de reserva de estreptomicina de 83 un resultado positivo para un tubo MGIT se
ug/ml, de isoniazida de 8.3 ug/ml, rifampicina considera el días 0.
de 83 ug/ml y de etambutol de 415 ug/ml 2. Para preparación del inóculo de análisis,
Preparación del inóculo: Todos las preparacio- debe usarse un tubo MGIT de 7 ml positivo el
nes deben realizarse a partir de cultivos puros día después de que el instrumento BACTEC
de M. tuberculosis. Deben estar previamente MGIT registre el resultado positivo (día 1) hasta
identificadas y aseguras que es de cultivo puro. el quinto día, inclusive (día 5) después de que
El inoculo puede prepararse a partir de un me- el instrumento registre el resultado positivo. Si
dio sólido de un tubo BATEC MGIT 7 ml positi- un tubo á permanecido positivo más de cinco
vo, además los que crecen en medios líquidos días, se debe hacer un subcultivo en un nuevo
y sólidos se pueden utilizar para preparar un tubo MGIR de7 ml que contenga suplemento
tubo MGITi de siembra que sirve para preparar para crecimiento BACTEC MGIT, analizarlo en
el inóculo. el instrumento BACTEC MGIT hasta que se re-
gistre positivo y utilizarlo de uno a cinco días
A partir de Medios Sólidos: después de mostrar positividad.
1. Aagregar 4 ml de cald Middlebrook 7H9 o 3. Si el tubo es positivo los días 1 ó 2, utilice
caldo de MGIT a un tubo estéril de 16.5 x 128 el caldo de suspensión MGIT para los procedi-
mm con tapon de rosca con 8 a 10 microesfe- mientos de inoculación. Mezcla bien. Continuar
ras de vidrio. con el proceso de inoculación para el análisis
2. Con un asa estéril separar el mayor núme- de sesibilidad.
ro de colonias de un cultivo de 14 días como Preparación de un tubo MGIT de siembra a
máximo, evitando recoger medio sólido. Poner partir de medios sólidos
en suspensión las colonias en el caldo Middle- 1. Con un asa de inoculación estéril retire el
brook 7H9. crecimiento del agar inclinado y añádalo a un
3. Agitar la suspensión en un agitador Vortex tubo MGIT de 7 ml suplementado con 0.8 ml de
durante 2 – 3 min para dispensar los grumos suplemento para crecimiento BACTEC MGIT.
más granes. La turbidez de la suspensión debe 2. Cierre bien y mezcle suavemente invistiendo
superar el patrón 1.0 de McFarland. 2 a 3 veces.
4. Dejar que la suspensión repose durante 20 3. Ponga el tubo en el instrumento BACTEC
minutos sin moverla. MGIT y analice hasta obtener un resultado po-
5. Transferir el líquido sobrenadante a otro sitivo. El tiempo para obtener positivo debe ser
tubo estéril de 16.5 x 128 mm con tapón (evitar igual o superior a 4 días para su uso como inó-
transferir parte del sedimento) y deja reposar culo AST. Si se vuelve positivo antes de los 4
por 15 minutos. días volver al paso 1 y preparar un tubo nuevo
6. Transferir el líquido sobrenadante (debe es- de siembra.
tar homogéneo sin grumos) a un tercer tubo 4. Proceda a utilizar el tubo durante el día uno
estéril de 16.5 por 128 mm. (en este paso la al cinco después de la positividad. Continuar
suspensión el microorganismo debe ser supe- con el procedimiento a partir de un tubo BAC-
rior a 0.5 de MacFArland TEC 7 ml positivo.
7. Ajustar la suspensión a un patrón 0.5 de
MacFarlan mediante comparación visual con Procedimiento de inoculación para el análisis
un patrón 0.5 o con u nefelómetro. No ajustar de sensibilidad con el kit BACTEC MGIT 960
por debajo del 0.5 de Mac fArland. SIRE:
Pág. 132
precauciones estándar y las normas operativas
de seguridad.
1. Etiquetar cinco tubos MGIT de 7 ml para cada El trabajo con cultivos de M. tuberculosis re-
cepa aislada analizada. Etiquetar uno como CC quiere prácticas, equipo de contención e insta-
(control de crecimiento), uno como STR, uno laciones de nivel des eguridad biológica (BSL)3.
como INH, uno como RIF y uno como EMB. Antes de usar debe revisar los tubos y frascos
Colocar los tubos en la secuencia correcta en en busca de indicios de contaminación o daño.
el transportador del tamaño apropiado para el Desecharse los que no parezcan aptos. No de-
conjunto de AST. ben usarse tubos con daños.
2. Agregar asépticamente 0.8 mL de suplemen- En caso que se rompa un tubo:
to BACTEC MGIT SIRE a cada tubo. Importan- 1. Cierre los cajones del instrumento
te utilizar el suplemento suministrado con el kit. 2. Apagar el instrumento.
3. Con una micropipeta, transferir aséptica- 3. Desalojar la zona inmediatamente
mente 100 ul de la solución MGIT STR de 83 4. Consultar las normar de manejo de manipu-
ug/mL al tubo MGIT que tiene la etiqueta co- lación de líquidos y materias contaminadas así
rrespondiente. Con una micropipeta, transferir como aerosol de micobacterias descritas.
asépticamente 100 uL de la solución MGIT INH 4. Preparación de inóculo del tubo de Control de
de 8.3 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta co- Crecimiento: Con una pipeta, transferir asépti-
rrespondiente. Con una micropipeta 100 uL de camente 0.1 mL de la suspensión de microor-
RIF de 83 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta ganismos (Preparación de inóculo) a 10 ml de
correspondiente. solución salina estéril para preparar la suspen-
sión 1:100 de control de crecimiento. Mezclar
Con una micropipeta transferir 100 uL de EMB bien la suspensión de control de crecimiento.
de 415 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta co- Inocular 0.5 mL de la suspensión 1:100 de con-
rrespondiente. Importante agregar el antifími- trol de crecimiento en el tubo MGIT que tiene la
co apropiad al tubo corresponiente. No agre- etiqueta CC
gar antifímico al tubo de control de crecimiento.
Advertencias y Precauciones
Toda muestra para análisis debe manejarse
como potencialmente infecciosas y seguirse las
precauciones estándar y las normas operativas
de seguridad.
El trabajo con cultivos de M. tuberculosis re-
quiere prácticas, equipo de contención e insta-
Los antifímicos se reconstituyen con 4 ml de laciones de nivel des eguridad biológica (BSL)3.
agua estéril/desionizada para lograr la concen- Antes de usar debe revisar los tubos y frascos
tración adecuada en busca de indicios de contaminación o daño.
4. Preparación de inóculo del tubo de Control de Desecharse los que no parezcan aptos. No de-
Crecimiento: Con una pipeta, transferir asépti- ben usarse tubos con daños.
camente 0.1 mL de la suspensión de microor- En caso que se rompa un tubo:
ganismos (Preparación de inóculo) a 10 ml de 1. Cierre los cajones del instrumento
solución salina estéril para preparar la suspen- 2. Apagar el instrumento.
sión 1:100 de control de crecimiento. Mezclar 3. Desalojar la zona inmediatamente
bien la suspensión de control de crecimiento. 4. Consultar las normar de manejo de manipu-
Inocular 0.5 mL de la suspensión 1:100 de con- lación de líquidos y materias contaminadas así
trol de crecimiento en el tubo MGIT que tiene la como aerosol de micobacterias descritas.
etiqueta CC
Advertencias y Precauciones
Toda muestra para análisis debe manejarse
como potencialmente infecciosas y seguirse las
Pág. 133
for Acid-Fast Microscopy. U.S. Departament of Health,
Education, and Welfare. Public Health Service. 2a. (Ed).
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Smithwick, Ronald W. M.S. (1980). Laboratory Manual
Pág. 134
NORMAS DE PUBLICACIÓN 2014
La revista de Medicina Interna de Guatemala es el órgano oficial de divulgación de la Asociación

de Medicina Interna de Guatemala (AMIG) y tiene como principal objetivo establecer un eje de
comunicación e integración entre los médicos internistas de Guatemala. La publicación es cua-
trimestral y es distribuida en hospitales, facultades de ciencias de la salud, clínicas, instituciones
educadoras y de investigación, así como por vía electrónica y colocada en la página electrónica
de la AMIG. Nuestros principales lectores son especialistas en Medicina Interna y sub-especia-
listas de Medicina Interna. El contenido de la revista puede ser consultado vía internet, en el sitio
www.asomigua.org o a través de Facebook: Asociación de Medicina Interna de Guatemala.
La revista recibe trabajos en español, con resumen en inglés, y está constituida por secciones de
editorial, artículos originales, artículos de revisión (actualización), notas previas/cartas al editor,
derecho a respuesta (una sola), fotos clínicas, casos interesantes. Asimismo, la revista ofrece
cobertura e información sobre los principales eventos científicos relacionados a la especialidad.
Los artículos de revisión (actualización) serán solicitados por el comité editorial según las necesi-
dades epidemiológicas y clínicas para Guatemala.
Los manuscritos en triplicado serán dirigidos al Dr. Carlos Rodolfo Mejía Villatoro coordinador
del comité editorial de la revista y recibidos en la sede de la Asociación de Medicina Interna de
Guatemala en la 12 calle 2-04, zona 9, edificio Plaza del Sol, oficina 319 nivel 3, ciudad de Gua-
temala. Se puede remitir el texto por vía electrónica a la dirección revista.asomigua@gmail.com
en formato Word utilizando letra arial 12 a doble espacio en una solo columna.
Los trabajos serán evaluados por el coordinador del comité editorial y por dos especialistas anó-
nimos elegidos entre los miembros del comité Editorial y entre los afiliados de la Asociación de
Medicina Interna de Guatemala con reconocida experiencia en el asunto. El comité Editorial tiene
la facultad de rechazar aquellos trabajos que no juzgue apropiados, así como de proponer modifi-
caciones cuando lo considere necesario. La correspondencia con los autores será realizada, por
correo electrónico exclusivamente.
Los trabajos deben de seguir la siguiente estructura:
1. Carta de presentación
Los trabajos deberán ser precedidos de una carta de presentación dirigida al coordinador del
comité editorial, en la que se incluya el título del trabajo, un párrafo destacando la importancia
del artículo y la sección en la que se solicita la publicación. Los autores deben explicitar que el
trabajo no ha sido publicado con anterioridad ni ha sido enviado simultáneamente a otra revista.
Asimismo, se indicará que todos los autores están de acuerdo con el contenido del trabajo, que
ceden los derechos de publicación a la Revista Medicina interna de Guatemala y que no existen
conflicto de intereses.
El formato general para las diversas secciones de la Revista se presenta de la siguiente manera:
Pág. 135

2. Primera pagina
La primera página del trabajo incluirá obligatoriamente los siguientes puntos:
- Título del trabajo conciso, completo y explicativo sobre el asunto al que se refiere.
- Nombre completo de los autores, sin abreviaciones. Los autores deberán indicar la forma en
que deseen ser citados.
- Título académico completo de los autores, con el nombre y la dirección de la institución de tra-
bajo a la que están afiliados.
- Especificación de la unidad o departamento de la institución donde el trabajo fue realizado.
- Nombre, dirección, e-mail y número de teléfono/fax del autor designado para recibir la corres-
pondencia.
3. Resumen:
El resumen debe presentar los siguientes puntos:
Ser enviado en el idioma original (español o inglés). En los casos de artículos en inglés, se deben
enviar el resumen en español e inglés.
Extensión máxima de 300 palabras para los artículos originales y revisiones, y de 250 palabras
para las notas previas y relatos de casos.
Ser informativos y no indicativos, explicando de forma clara los objetivos, métodos, resultados y
conclusiones derivadas del estudio.
En los descriptores deben incluirse por lo menos 3 y hasta un máximo de 10 palabras-clave,
en el idioma original y en inglés, empleadas en el DeCS Descriptores en Ciencias de la Salud,
publicación de la BIREME (Centro Latino-Americano y del Caribe de información en ciencias de
la Salud), disponible en http://decs.bvs.br o en el índex Medicus (Medical Subject Headings),
disponible en http://www.ncbi.nlm.gov/entrez/meshbrower.cgi
Pág. 136
4. Cuerpo del texto
El trabajo debe de ser dividido en las siguientes partes:
Introducción: debe de ser sucinta, proporcionando únicamente la información necesaria para

comprender el trabajo que será presentado posteriormente. No se deben incluir datos ni conclu-
siones. El último párrafo deberá exponer de forma clara los objetivos del trabajo.
Materiales (o Pacientes) y Métodos: debe explicar la metodología utilizada, los criterios de selec-
ción empleado información sobre la población, estudiada, datos sobre los análisis estadísticos e
información concerniente a los aspectos éticos del estudio.
Aspectos Éticos: los artículos sobre investigaciones con seres humanos deben presentar la au-
torización previa del Comité de Ética de la institución en la que se realizó el estudio, así como
mencionar la obtención de consentimiento por escrito, después que el paciente, sus familiares o
su representante legal (en el caso de menores o discapacitados) hayan sido informados sobre los
procedimientos o estudios a ser realizados. Los artículos sobre ensayos con modelos biológicos
deben presentar la aprobación de los protocolos obtenidos.
Los nombres comerciales de los medicamentos deben ser acompañados del nombre genérico
correspondiente, esclareciendo siempre las dosis y la vías de administración.
Resultados: deben de exponerse exclusivamente la descripción y no la interpretación de los datos

obtenidos con la metodología utilizada en el trabajo. Deben de resumir las observaciones más
importantes con cuidado de no repetir las informaciones mostradas en tablas, figuras o gráficos.
En caso que se requiera presentar un volumen grande de datos, deberá preferirse los gráficos en
lugar de las tablas.
Discusión: deben de resaltarse las conclusiones y los aspectos más importantes del trabajo. De-
berá evitarse repetir las informaciones ya presentadas. Se resaltaran las inferencias de los resul-
tados, las deducciones elaboradas y también las limitaciones del estudio. Deberá de comparase
los resultados con los de otros estudios y confrontar las observaciones finales con los objetivos
del trabajo.
Agradecimientos: deben ser limitados a los individuos e instituciones que efectivamente contribu-
yeron para la realización del estudio.
Financiamientos: información detallada sobre la fuente de financiamiento. Si no existe ayuda fi-

nanciera, los autores deberán declarar que no existe conflicto de intereses.
5.Material ilustrativo
Cualquier material utilizado para ilustrar el trabajo (tablas, figuras o fotografías) debe ser presen-
tado en hojas aparte, al final del texto, cada una en una página diferente.
Tablas: deben ser numeradas conforme el orden de parecimiento en el texto, utilizando número
arábigos y deben ser auto explicativas. El título debe ser claro e informativo. Las observaciones
necesarias para esclarecer abreviaturas u otros serán colocadas al pie de la tabla. El formato de
la misma debe de utilizar los comandos de tabulación (tab) y nueva línea (enter).
Pág. 137
Figuras: Deben de ser numeradas conforme orden de aparecimiento en el texto, en números ará-
bigos. Todas las explicaciones deben de ser presentadas en las leyendas. Los gráficos y figuras
deben de ser enviados en “power point”. En el caso de figuras y fotografías, se deberá colocar
en el dorso una etiqueta adhesiva en la que se indique el nombre del primer autor y una flecha
señalando el margen superior. Las fotografías digitales deben de ser enviadas con buena defi-
nición (mínimo 300DPI). De ser necesario, utilizar siempre imágenes producidas por impresoras
de alta resolución y en blanco y negro.
6. Referencias bibliográficas
Las referencias deben ser numeradas consecutivamente en el orden en que fueron mencionadas
en el texto, debiendo ser identificadas en números arábigos colocados como exponentes. Los
nombres de las revistas deben ser abreviados de acuerdo con el “Índex Medicus”, disponible en:
http://www.ncbi.nlm.gv/jrbrowser.cgi.
Las citas deberán comprobarse sobre los artículos originales y se ordenaran según las normas
de Vancouver (1997, edición revisada de Octubre de 2001), disponible en: http://www.icmje.org.
Todos los autores deben ser citados, independientemente de su numero y deberá evitarse es-
cribir para números grandes de autores: et al. No se emplearan frases como “comunicaciones
personales”. Los trabajos aceptados y no publicados en el momento de ser citados pueden ser
incluidos en las referencias, especificando el nombre de la revista, seguido de la expresión “en
prensa” entre paréntesis. A continuación se citan algunos ejemplos de los principales tipos de
referencias utilizadas.
a) Artículo de revista:
1. Bryan CS, Reynolds Kl. Bacteremic nosocomial pneumonia. Am Respir Dis 1984;129:668-671.
2. Carratala J, Guidol R, Pallares R, Dorca J, Verdaguer R, Ariza J, et al. Risk factors for nosoco-
mial Legionella pneumophila pneumonia.Am Rev Respir 1994; 149:625-629.
b) Trabajo publicado por una institución o corporación:

Ministerio de Sanidad y consumo. Liga Española para la Lucha Contra la Hipertensión. Sociedad
Española de Hipertensión. Control de la hipertensión arterial en España. Rev Esp Salud Pública
1996; 70:139-210.
OMS. Informe Anual de Mortalidad Materna en las Américas. Año: xxxxx. Disponible en: www.
who.org por ejemplo.
Encuesta Nacional de Salud Materno Infantil, Guatemala: Año: xxxxs
c) Volumen con suplemento:

Vogel F. Sequential Therapy in the hospital management of lower respiratory infections. Am J
Med 1995; 99 (Supl 6B) : 13S-19S
d) Libros, tesis y monograficas:

1. Hawe P, Degeling D, Hall J. evaluación en promoción de la salud. Guía para trabajadores de
la salud. 1st ed. Barcelona: Masson;1993.
2.World Health Organization. International drug monitoring the role of national centers. Technical
Report Series Nº 498.Geneva: 1972.
3.Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly`s access and utilization (dissertation).
St. Louis (MO): Washinton Univ.;1995.
Pág. 138
4. Nuñes L. Aspectos clínicos, hematológicos e inmunológicos en la estrongyloidiasis. Tesis Uni-
versidad Central de Venezuela; 1993.
e) Capítulo de libro:
Rawlins MD, Thompson JW. Mechanisms of adverse drugs reaction.
En Davies DM, editor. Textbook of Adverse Drug Reaction.4th ed. Oxford University Press; 1991
p 18-45.
f) Resumen de congreso:
Vettorello ML. A influencia de fatores climaticos na incidencia dos acidentes loxoscelicos no
Municipio de Curitiba, no period de 1998 a2001. XXXIX Congresso da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical. 008 TL. Belem, 2003
g) Articulo de fuente o revista electrónica

1. The Counter Bioterrrorism Research Agenda of the National Institute of allergy and Infectious
Diseases for CDC Category A Agents. Washington, DC: National Institute of Allergy and Infec-
tious Diseases; February 202. Disponible en: http://www.nih.gov/dmid/pdf/bioresearchagenda.
pdf.
2. Carucci JA, McGovern TW, Norton SA. Cutaneos anthrax management algorithm. J Am Acad
Dermatol 2001; Nov 21. Disponible en:
http://www.harcourthealth.com/scripts/om.dll/server?arttype=full&article=a121613.
Pág. 139

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ISSN 2415-251X

Clinica de Enfermedades Infecciosas

Revista de microbiologia Volumen No. 1

Enero - Marzo 2016

Clinica de Enfermedades Infecciosas

Revista de microbiologia Volumen No. 1

Enero - Marzo 2016

Licda Maria Remey Gordillo

Dr. Carlos Mejía Villatoro

Licda Maria Remey Gordillo

Mellross Elswith Salazar Alvarez

Entre las actividades que se realizaron en el Diplomado se tuvieron:

1. Conferencias teóricas donde se presentaron y discutieron temas en aspectos generales y es-

2. Investigación sobre un tema específico sobre resistencia antimicrobiana.

3. Elaboración y presentación de un manual de procedimientos estándar acorde a las necesi-

El Diplomado se desarrolló en el Hospital Roosevelt con el apoyo del Programa de Postgrado y

Los principales objetivos específicos que se deseaba alcanzar fueron:

1. Asistir y fortalecer los conocimientos de los laboratoristas y médicos de instituciones clínicas

Al Diplomado se inscribieron un total de 67 personas, 42 profesionales, de los cuales 4 eran Mé-

De los 67 inscritos, completaron el diplomado 58 personas, 52 aprobaron el diplomado lo que

Licda. Maria Remei Gordillo

Normas de seguridad en el laboratorio -1-1-

Tinciones en Microbiología Clínica -3-3-

Manual de Microbiologia -16-16-

Normas Mínimas de Seguridad en el Laboratorio de Micro-

Normas de Publicación -135-139-

El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Microbiología,

II. GENERALIDADES 9. Conocer el manejo de todos los equipos y

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de a. Muestras sólidas

1. Tinción de Azul de Metileno de

El fenol destruye la flora acompañante (algu- 3. Tinción Naranja de Acridina

Figura 4. Tinción de ascosporas.

La técnica de Ziehl-Neelsen modificado fuerza

Figura 13. Tinción de esporas en Bacillus subtilis, la

8. Tinción de Ácido Peryódico de Schi-

d. Resultados b. Materiales y Reactivos

E. García., P. Beltran., C. Guzmán., A. León., P. M. Pontón., J. Llovo., J. (2007) Diagnóstico Mi-

G. Koneman., E. Allen., S. Janda., W. Procop.,

H. López., L. Hernández., M. Colín., C. Ortega.,

2.4.2.2 Procedimiento de Tinción de

a. Preparación del frote

2.4.4 Tinción Kinyoun Modificado

3.1.2 Recolección de la muestra y

Previo a la toma de muestra el paciente no debe

Es el principal microorganismo patógeno hu-

3.2 Cultivo de Garganta Especial

3.2.3.2 Neisseria meningitidis

3.2.3.3 Bordetella pertussis

3.3.2.1 Toma de muestra

Volumen de muestra: neonatos 0.5 ml Subcultivo

Tabla No. 2 Alteración del hemocultivo y posible bacteria

3.3.4 Identificación de principales microorganismos

Staphylococcus coagulasa negativo, corinebacterias y especies de bacillus son contaminantes

3.4 Líquido cefalorraquídeo y otros líquidos estériles

Bacterias Gram Positivo

Entre otros microorganismos esta Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Cryptococcus

3.4.2 Recolección de Muestra y Transporte

Características macroscópicas en los medios

B. LIA Agar Lisina Hierro

3.5.4 Identificación de principales Mi- Tabla No. 6 Interpretación TSI y LIA

3.5.4.1 Pruebas Bioquímicas

A. TSI Agar hierro triple azúcar

E. MIO (Movilidad, Indol y Orinitina)