Introducción

Las isoformas de ciclooxigenasa (COX) -1 y -2 comparten 60-65% de identidad de secuencia

dentro de las especies y aproximadamente 85-90% de identidad de secuencia entre diferentes
especies. [1] Son enzimas bifuncionales que llevan a cabo dos reacciones secuenciales en sitios
activos espacialmente distintos, pero mecánicamente acoplados: la bisoxigenación del ácido
araquidónico (AA) a la prostaglandina G2 (PGG2) y la reducción de PGG2 a PGH 2. COX-1 y
COX- 2 son homodímeros de subunidades de 70 kDa, y se requiere dimerización para integridad
estructural y actividad catalítica. Cada monómero contiene un COX y un sitio activo de peroxidasa
y consta de tres dominios estructurales: un dominio corto del factor de crecimiento epidérmico N-
terminal, un dominio de unión a la membrana y un dominio catalítico Cterminal globular grande.
Los monómeros de COX que forman el dímero, aunque idénticos en la enzima de reposo, difieren
unos de otros durante la catálisis. HCOXs funcionan, en la práctica, como heterodímeros
conformacionales que tienen un monómero catalítico (E cat) con un hemo unido y un monómero
alostérico (E allo) que carece de hemo. Estudios de la rotación de sustrato AA en altas
proporciones de enzima a sustrato indican que los inhibidores de tipo no-sustrato se unen al sitio
COX de E allo para modular las propiedades de E cat La subunidad que no funciona puede
proporcionar soporte estructural, lo que permite que su socio monómero para catalizar las
reacciones COX. [2]
Las interacciones de complejidades variables entre ligandos y biomoléculas (grandes) (es decir,
enzimas, ADN, receptores) se estudian a menudo usando un modelo simple de interacciones
ligando-biomolécula para determinar el modo de unión. Para sistemas más complejos, como en el
caso de COX E allo / E cat, la probabilidad de observar una interacción útil para un compuesto
escogido al azar disminuye drásticamente. Exploramos aún más estas implicaciones en el diseño
de nuevos compuestos en un intento de potenciar la actividad de nuestros inhibidores selectivos de
COX-1 para desarrollar agentes terapéuticos para experimentos in vitro e in vivo dirigidos a tejidos
y células específicos.
Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos tradicionales (tNSAIDs) se dirigen a ambas
isoenzimas COX. Los coxibs, dirigidos principalmente a la COX-2, han sido el foco de varios
estudios dirigidos a desarrollar fármacos que carecen de toxicidad gastrointestinal.
Por el contrario, se han descrito pocos inhibidores selectivos de la COX-1, aunque varias
investigaciones farmacológicas han demostrado la participación consolidada de esta enzima en la
carcinogénesis, la patogénesis de la neuroinflamación y el dolor. [1] En la actualidad, la inhibición
selectiva de la COX-1 se considera una prometedora estrategia Cáncer y enfermedades
neurodegenerativas derivadas de la neuroinflamación. [1, 5-7] En muchos tipos de cánceres y
enfermedades neurodegenerativas, la eficacia del fármaco afecta fuertemente a la resistencia a
múltiples fármacos (MDR), un fenómeno que limita la acumulación de células de fármaco debido a
la acción de la bomba de eflujo, Tal como por la glicoproteína P (P-gp), un miembro clave de la
superfamilia de transportadores de eflujo de casete de unión a ATP (ABC). Esto nos llevó a diseñar
inhibidores selectivos de COX-1 [1, 3-5, 9] que también fueron capaces de residir durante un
tiempo más largo dentro de la célula. Hasta ahora, ningún intento de correlacionar la actividad de
COX-1 y P-gp ha tenido éxito.
Por lo tanto, los nuevos compuestos proyectados tienen un resto de reconocimiento de inhibidor de
COX, constituido por uno de los tres inhibidores selectivos bien conocidos tales como
indometacina, [10] P6, [3, 11] o mofezolac [12] (Figura 1) Y un fragmento reconocido por P - gp
como una funcionalidad adicional. En particular, la rodamina 6G (Rh6G) es un sustrato P-gp, y la
6,7-dimetoxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (6,7-DM THIQ) es un elemento clave estructural de
elacridar (un derivado de la acridonecarboxamida inhibidor de la Pgp capaz de modular) y
tariquidar ( El Tariquidar es un inhibidor no competitivo que parece que se une a Pgp en la misma
zona que el ATP, inhibiendo la actividad ATPasa de esta) (Dos sustratos saturantes de P-gp o
compuestos similares a inhibidores). [13-16] La indometacina, P6 y mofezolac se unieron entonces
a un resto Rh6G o 6,7-DM-THIQ para explorar en primer lugar el reconocimiento del inhibidor COX
y, En segundo lugar, verificar si tales nuevas moléculas retienen la actividad de sustrato / inhibidor
de P-gp.
(Dos sustratos saturantes de P-gp o compuestos similares a inhibidores). [13-16] La indometacina,
P6 y mofezolac se unieron entonces a un resto Rh6G o 6,7-DM-THIQ para explorar en primer lugar
el reconocimiento del inhibidor COX y, En segundo lugar, verificar si tales nuevas moléculas
retienen la actividad de sustrato / inhibidor de P-gp.
Una serie de conformacionalmente restringido y regioisomeric indometacina análogos ya se
describieron como multirresistentes moduladores.
La evaluación de los efectos inhibidores de estos compuestos sobre la COX, la P-gp y la
resistencia a múltiples fármacos (MDR) indicó que la modulación de la P-gp resistente a múltiples
fármacos y la proteína 1 resistente a múltiples fármacos por un número de AINEs no está asociada
con COX-1 y Actividad inhibidora de COX-2 [17] El ibuprofeno superó la MDR en células de
sarcoma uterina resistentes a la doxorrubicina humana (MES-SA / Dx-5), expresando altos niveles
de la bomba de eflujo P-gp [18] Rh6G también se conjugó con indometacina, P6 y mofezolac en un
intento de producir moléculas fluorescentes dirigidas a la COX-1 expresada en tejidos sanos y
patológicos /
Células. A continuación se describe la síntesis de estos compuestos originales, su capacidad para
inhibir la actividad COX y su extensión de interacción con la bomba de eflujo de P-gp expresada en
la línea celular MDCK-MDR1. Los resultados de los experimentos de acoplamiento también se
discuten.
Resultados y discusión
Entre los tNSAID, con excepción de la dosis baja de aspirina, sólo unos pocos ejemplos de
inhibidores selectivos de COX-1 se han investigado en profundidad hasta el momento. [1] Para
este estudio, hemos identificado nuevos compuestos derivados de los conductores como la
indometacina (COX-1 IC50 = 0,099 mm; CO _ {2} - IC _ {50} = 4,2 mm), [9] P _ {6} (CO _
2 IC50> 50 mm), [3] y mofezolac [11] (COX - 1 IC _ {50} = 0,024 mm; COX-2 IC 50> 50 mm)
(Figura 1) para identificar aún más las entidades químicas cruciales responsables de la inhibición
selectiva de la COX. La indometacina se eligió como uno de los fármacos analgésicos y
antipiréticos más prescritos. Mofezolac es el ingrediente activo del fármaco analgésico Disopain,
comercialmente disponible en Japón. P6 representa un prototipo del andamio de isoxazol que
hemos estado estudiando. [5, 19, 20]P6 se convirtió en P6-COOH (Figura 2; 32 y 58% de inhibición
de COX-1 y COX-2 actividad, respectivamente, a 50 mm) Añadiendo el grupo carboxílico a la
cadena lateral de isoxazol P6.
Los tres inhibidores de la COX (indometacina, P6-COOH y mofezolac) se unieron al fragmento fluorescente
Rh6G [21] O al resto que interactúa con la bomba de eflujo 6,7-DM-THIQ, [14] obteniendo los compuestos
7-9, 14-17 y 20 La parte inhibidora de la COX-1 de los compuestos y las fracciones Rh6G o 6,7-DM-THIQ se
acoplaron mediante un enlazador de la longitud apropiada [21, 22] para permitir en primer lugar la entrada de
la porción inhibidora de la COX-1 en la porción COX sitio activo para llegar a la radical tirosil
(Tyr385) (Figura 3] [21, 22] y, por tanto, bloquear la oxidación auto-catalítica de AA a PGH2. En
segundo lugar, se seleccionó la longitud del engarce para permitir que la funcionalidad aditiva
Rh6G o 6,7-DM-THIQ permaneciera fuera del sitio de constricción formado por Tyr355, Arg 120 y
Glu 524 (Figura 3a). Los mismos residuos de aminoácidos permiten un acceso más fácil al sitio
activo COX-2, que tiene un bolsillo lateral más grande que la isoforma COX-1 (Figura 3b)

Figura 3. Hipótesis de trabajo: moléculas diana en los sitios activos a) COX-1 yb) COX-2 Los sitios
activos COX-1 y COX-2 se representan esquemáticamente como canales hidrófobos estrechos
separados de la proteína residual, constituidos en parte por el vestíbulo ancho del dominio de
unión a la membrana con un sitio de constricción compuesto por tres aminoácidos (Arg 120, Tyr355
y Glu 524). El canal está situado en la interfase entre la región que penetra en la membrana y la
Región catalítica. Para la isoforma COX-1, Ile 523 (azul) cierra la cavidad lateral hidrófila situada
lateralmente. En la isoforma COX-2, existe una bolsillo. Hay una abertura de canal más amplia en
COX-2, con el estrechamiento causado por Arg 120 y Tyr355 en COX-1.

Tabla 1. Construcción basada en fragmentos de los compuestos diana 7-9 y 14-17, derivados de
indometacina, P6-COOH y mofezolac.
Se utilizó el compuesto diana 17, que unía los restos inhibidores de la COX y 6,7-DM-THIQ, para probar el
papel del enlazador en esta serie e identificar las características estructurales para diseñar nuevos compuestos
selectivos Inhibidores de la Cox
Química
Las síntesis de 1 - 3 se realizaron mediante una formación de enlace amida entre el correspondiente uno de los
tres inhibidores de COX y una diamina, que se utilizó como enlace. La protección Mono-N-Boc del 1,4-
diaminobutano proporcionó el correspondiente (4-aminobutil) carbamato de terc-butilo Que a su vez
reaccionó con indometacina in situ activada con EDCl / HOBt, P6-COOH y mofezolac (Esquema 1) para dar
los aductos mono-N-Boc 1 -3. La desprotección de N-Boc de 1 -3, precursores de 4-6, se realizó con alto
rendimiento (92-98%) por HCl (g). La conjugación posterior de 4-6 con el resto de rodamina (Rh6G-COOH)
condujo a los compuestos objetivo 7-9 (Esquema 2). Se obtuvo Rh6G-COOH por hidrólisis del Rh6G (éster
etílico) comercialmente disponible en presencia de NaOH. [24]
Los compuestos de destino 14-16 se prepararon a partir del clorhidrato (13) de 5-amino-1- [6,7-dimetoxi-3,4-
dihidroisoquinolin-2- (1H) -il] pentan-1-on haciendo reaccionar los 6, 7-DM-THIQ (11) con ácido 5-
aminovalérico protegido con NBoc (10), activando in situ con EDCl / HOBt, seguido de desprotección con
HCl (g) (Esquema 3). La conjugación posterior de 13 con indometacina, P6-COOH o mofezolac condujo a los
compuestos diana 14 - 16 (Esquema 4). El compuesto objetivo 17, obtenido por conjugación de mofezolac y
6,7-DM-THIQ (11), se preparó para verificar la importancia de la distancia entre la porción inhibidora de
COX-1 y 6,7-DM-THIQ (Esquema 5). Las primeras condiciones sintéticas (Esquema 6) utilizadas para
preparar 14 produjeron la escisión del grupo 4-clorobenzoílo, obteniéndose así el compuesto 20, que se
incluyó en la caracterización farmacológica (Tabla 2)
Esquema 1 . Reactivos y condiciones: a) dicarbonato de di-terc-butilo, dioxano, RT; B) DIEA, EDCl,
HOBt, DMF seco, RT, durante la noche; c) HCl (g), se seca CH 2Cl2, RT, 1,5 h.

Esquema 2. Reactivos y condiciones: a) NaOH (aq), EtOH, reflujo, durante la noche; b)

PyBOP, TEA, CH 2Cl2 / DMSO, RT, 24 hr
Esquema 3. Reactivos y condiciones: a) dicarbonato de di-terc-butilo, dioxano, RT; B) 6,7 -
DM - THIQ (11), DIPEA, EDCl, HOBt, DMF seco, RT, 20 h; c) HCl (g), CH2Cl2 seco, RT, 1 ,5 h.

Esquema 4. Reactivos y condiciones: a) DIPEA, EDCl, HOBt, DMF seca, RT, 20 h

Esquema 5. Reactivos y condiciones: a) DIEA, EDCl, HOBt, DMF seca, RT, durante la noche
Esquema 6. Reactivos y condiciones: a) SOCl2, 0°C; b) CH3OH anhidro, reflujo; c)
indometacina, HOBt, DCC, DIEA / CH2Cl2 anhidro; D) LiOH, THF, RT; e) DCC, DMAP (0 8C, 30
min) / CH2Cl2 anhidro; F) 6,7 - DM - THIQ (11), 16 h, RT.

Biología
Todos los compuestos sintetizados se ensayaron para determinar su actividad inhibidora hacia las
enzimas COX-1 y COX-2, respectivamente (Tabla 2), usando un kit de ensayo de detección de
inhibidor COX (ovino) colorimétrico. COX es una enzima bifuncional que exhibe tanto la actividad
de la ciclooxigenasa como la peroxidasa. La indometacina inhibió selectivamente la COX-1 con SI
= 0,02 (Tabla 2). Rh6G-COOH no inhibió la actividad de COXs a 50 mm. Una Combinación de
indometacina y Rh6G-COOH, con un enlazador de 1,4-diaminobutano, proporcionó al compuesto
7, que no fue capaz de inhibir COX-1, aunque disminuyó la actividad de COX-2 a 50 mm por 28%.
Por otra parte, se encontró que el compuesto 8 era altamente selectivo para COX-1, con IC50 = 6,0
mm y una falta total de eficacia hacia la COX-2 a concentraciones de hasta 50 mm, aunque se
encontró que la conjugación del resto Rh6G Con P6 para dar el compuesto 8 da como resultado
una pérdida de fluorescencia (datos no mostrados). Se encontró que el Compuesto 9 era un
inhibidor pobre, con actividad sólo hacia COX-1 (16% de inhibición a 50 mm)
Dentro de la serie de derivados de 6,7-DM-THIQ, el derivado de indometacina 14 era
completamente inactivo hacia ambas isoformas de COX, y su análogo (20) mostró sólo un 10% de
inhibición de COX-1. El compuesto 15, derivado de P6-COOH, afectó ligeramente sólo a la
actividad de COX-1 (23% de inhibición a 50 mm). El derivado 16 de Mofezolac, a una
concentración de 50 mm, mostró 33 y 13% de inhibición de COX-1 y COX-2, respectivamente. El
elemento estructural común en todos los compuestos diana era la distancia aproximada entre los
fragmentos de unión a COX y P-gp. Esto se eligió sobre la base de los resultados obtenidos de la
construcción de imágenes agentes fluorescentes para la visualización selectiva de COX-2 en la
inflamación y el cáncer. [21, 22] Tal longitud de unión resultó ser adecuada para permitir que 8
tuviera el resto P6 próximo al residuo Tyr385 en el sitio catalítico de COX-1 y el resto de Rh6G
voluminoso en la proximidad de la entrada del canal hidrófobo largo del dominio de unión a la
membrana COX (Figura 4). En ausencia de un enlazador, como con el compuesto 17, se
observaron 48% y 69% de inhibición de la actividad COX-1 y COX-2, respectivamente, a una
concentración de 50 mm (COX-2 IC50 = 0,95 mm).
TABLA 2 Actividad inhibidora de la COX de los compuestos diana 7-9, 14-17 y 20
[A] Actividad inhibidora hacia COX-1 y COX-2 determinada a concentraciones de compuesto
de 50 mm usando un kit de ensayo de detección de inhibidor COX (ovino) colorimétrico. [B]
Los valores son la media ?? SEM de tres experimentos separados; n / A. : No activo, es
decir, no se observó actividad inhibidora a 50 mm.

Figura 4. Modos de unión del compuesto 8 (a, amarillo) y del compuesto 17 (c, violeta) en los
sitios activos COX-1 y COX-2, respectivamente. Dos dimensiones de la proyección de b) 8
COX-1 y d) 17-COX-2 interacciones generadas con MOE(entorno operativo molecular) . [42]
Sólo se muestran y se etiquetan los residuos situados dentro de 4,5 \ mu del ligando unido.
Los enlaces de hidrógeno discutidos en el texto se representan como líneas negras
discontinuas. Los restos del sitio de constricción (Arg 120, Tyr 355 y Glu 524), que separan
el vestíbulo del sitio activo COX situado encima de él, están subrayados y coloreados de
rojo.

Estudios de acoplamiento
El sitio COX activo tanto de la COX-1 como de la COX-2 se encuentra Terminal de un largo canal
hidrófobico que se extiende desde la superficie de la proteína al interior de la proteína (Figura 3).
La porción inicial del canal tiene un gran volumen, o vestíbulo, que se estrecha en un sitio de
constricción compuesto por residuos Arg 120, Tyr355 y Glu 524. El sitio de constricción constituye
una compuerta que debe abrirse y cerrarse para que los sustratos e inhibidores pasen dentro o
fuera del sitio COX activo anteriormente localizado. Todos los inhibidores de la COX se unen en el
sitio activo por encima del sitio de constricción y los residuos del sitio de restricción juegan un papel
importante en la unión de los inhibidores que contienen ácido carboxílico a través de una
combinación de apareamiento de iones y enlaces de hidrógeno.
Para obtener más información sobre la probable naturaleza de las interacciones de unión del
compuesto 8 dentro del sitio activo de la COX-1, se realizaron estudios de acoplamiento utilizando
la COX-1 ovina en el complejo con inhibidor unido indometacina- (R) a etil etanolamida (PDB ID:
2OYE). [27] Se ha seleccionado este estructura cristalina, debido a que la cadena lateral de Arg
120 adopta una conformación alterada significativamente para acomodar el inhibidor, en relación
con la conformación más extendida observado en la mayoría de otras estructuras cristalinas de la
COX-1. Una consecuencia de este reajuste estructural es la disrupción del sitio de constricción Arg
120-Tyr 355-Glu 524 y la expansión potencial de la entrada al canal hidrofóbico principal. Las
investigaciones de acoplamiento se llevaron a cabo utilizando el programa de acoplamiento
automatizado GOLD 5.2.2 [28, 29] en combinación con la función de puntuación de ChemPLP,
seguido de rescursión con ChemScore. [3, 19, 30-34] Conformaciones alternativas del Arg1 20,
Tyr355 , Glu 524 y Ser530 se han observado previamente en estructuras cristalinas de COX
complejadas con varios inhibidores, resaltando la plasticidad innata del sitio activo. [26, 35, 36] En
consecuencia, los Arg 120, Tyr355, Glu 524 y Ser530 Las cadenas laterales se dejaron moverse
durante los experimentos de acoplamiento.
Se realizó una validación inicial del protocolo de acoplamiento comparando la conformación,
posición y orientación (pose) del inhibidor indometacina- (R) - a-etil-etanolamida, Tal como se
obtuvo de acoplamiento con la estructura de cristal de rayos X determinada experimentalmente. La
correcta reinstalación del inhibidor cristalizado observado fue un requisito mínimo para determinar
si el programa era aplicable a este sistema. La conformación del ligando superior pronosticada por
el programa GOLD estaba muy cerca de la conformación de la estructura cristalina. La desviación
cuadrática media (RMSD) entre la postura acoplada y su conformación unida en la estructura
cristalina fue de 0,63 \ mu, indicando que GOLD pudo reproducir la postura correcta.
Como se ilustra en la Figura 4a, el resto P6 de 8 se inserta completamente en la cavidad de unión
de la COX-1, mientras que la funcionalidad de la amida secundaria voluminosa Rh6G se proyecta
a través del sitio de constricción en la base del sitio activo y en el vestíbulo ancho en la membrana-
Dominio vinculante. La posición y orientación del resto P6 en el sitio activo de COX - 1 se asemeja
estrechamente al modo de unión B previamente obtenido para el isoxazol 3- (5 - bromofuran - 2 - il)
- 5 - metil - 4 - fenilisoxazol selectivo de COX - 1 ( Br-P6). [9] En particular, el nitrógeno N2 isoxazol
de 8 está dentro de la distancia de enlace de hidrógeno del grupo g-OH de Ser530, que adoptó una
posición descendente durante la simulación de acoplamiento flexible. [3] Los átomos de N2 ··· O
están separados por 3,2 æ y muestran una geometría favorable para la unión de hidrógeno. El
anillo de fenilo en la posición 4 del isoxazol está en estrecho contacto con varias cadenas laterales
hidrófobas, incluyendo Leu 352, Ile 523, Tyr355 y Phe 518. El resto de clorofurilo está orientado
hacia el ápice del sitio activo de COX-1 y forma van Der Waals con los residuos Met 522, Phe 518,
Leu 352, Trp387, Tyr385, Leu 384 y Phe 381. El enlace amida del enlazador que conjuga el resto
P6 hace dos enlaces de hidrógeno, uno con el grupo OH de Tyr355 (dN ··· O = 2,9 æ) y el otro con
el resto guanidinio de Arg 120 (dO ··· N = 2,7 \ lambda), que se sabe que juega un papel
importante en los sustratos de unión y los inhibidores que contienen ácido carboxílico. El enlazador
también está implicado en interacciones hidrófobas con Ile 89, Leu 93, Val116, Val349, Leu 359 y
Leu 531. Además, la porción de Rh6G interactúa con múltiples residuos hidrofóbicos, incluyendo
Ile89, Pro84, Pro86, Leu 115, Val119, Leu123 y Gly471, que proporcionan una fuerza de unión
considerable. El oxígeno de carboxilato de O2 de Glu524 es de 2,5 \ alpha a partir de la carga
positiva sobre el nitrógeno etílico de amonio de la fracción Rh6G, neutralizando así las cargas
enterradas. El núcleo Rh6G está anclado adicionalmente a la región de vestíbulo de COX-1 a
través de una interacción de catión favorable entre su anillo benzofusionado y Arg 79, así como a
través de un enlace de hidrógeno asociado formado también por el mismo residuo de aminoácido
con el anillo central O1 Átomo de Rh6G.
En particular, en la estructura COX-1 con el compuesto 8 unido, a pesar que la cadena lateral de
Arg120 reorienta para formar un enlace de hidrógeno con el ligando, está en posición para
conservar el puente salino con Glu524. En esta conformación, Arg 120 ya no interactúa con el
grupo OH de Tyr355, que a su vez interactúa con el ligando, dejando el fondo del sitio de unión a
COX-1 en una conformación abierta. Nuestro reajuste estructural predicho de Arg 120 está de
acuerdo con la observado en la estructura cristalina de la indometacina- (R) -a-etil-etanolamida
complejada con COX-1,
Que este residuo adopta una conformación significativamente alterada para acomodar el ligando
en comparación con las estructuras cristalinas de diferentes complejos de ligando de COX-1
(incluyendo AINEs y sustratos de ácidos grasos). Para racionalizar la alta actividad inhibitoria del
compuesto 17 hacia COX-2, también se llevaron a cabo experimentos de acoplamiento con el sitio
de unión a COX-2 (PDB ID: 6COX) [26]. La diferencia principal entre los dos sitios COX activos es
la sustitución de dos residuos de isoleucina (Ile434 e Ile523) en COX-1 por dos aminoácidos
menos voluminosos (Val434 y Val523) en COX-2. Esta doble sustitución abre un bolsillo lateral
polar, ampliando el volumen del sitio COX-2 activo. Adicionalmente, la sustitución de His513 en
COX-1 por Arg 513 en COX-2 permite la unión de hidrógeno con el resto sulfonilo de inhibidores de
COX-2. Una segunda diferencia, en la parte superior del canal, es la sustitución de Phe503 en
COX-1 por Leu503 en COX-2. El residuo más pequeño en COX-2 permite que Leu384 cree un
espacio extra en la parte superior del sitio de unión en COX-2, permitiendo así que los inhibidores
más grandes se unan.
GOLD predijo con éxito una postura de unión plausible para 17 dentro del bolsillo de unión de
COX-2. Como se ilustra en la Figura 4c, la funcionalidad mofezolac del ligando se inserta
completamente en la cavidad de unión de COX-2, mientras que la porción voluminosa de 6,7-DM-
THIQ se proyecta a través del sitio de constricción en la base del sitio activo y en el ancho Lobby
en el dominio de unión a la membrana. En particular, el nitrógeno N2 isoxazol de 17 está acoplado
en un enlace de hidrógeno con el grupo OH de Ser530 (dN2 ··· O = 2,7 æ). El anillo de p-
metoxifenilo en la posición 3 del anillo de isoxazol se dirige hacia la parte superior del sitio activo
de COX-2 y forma interacciones hidrófobas con los residuos Leu352, Phe381, Leu384, Tyr385,
Trp387, Phe518, Met522 y Gly526. El grupo pmetoxi acepta un enlace de hidrógeno del grupo
Tyr385 OH (dO ··· O = 3,3 æ). Es importante destacar que el anillo de p-metoxifenilo en la posición
4 sobresale hacia el bolsillo lateral de COX-2 y hace contactos hidrófobos con los restos His90,
Tyr355, Ala516, Phe518 y Val523. El grupo p-metoxi está dentro de la distancia de enlace de
hidrógeno del átomo de nitrógeno del residuo His90 (dO ··· N e2 = 3,2 æ). Además, la amida C = O
del comp. 17 forma un enlace de hidrógeno con el grupo guanidinio de Arg 120 (dNH2 ··· O = 3,0 \
lambda). Finalmente, el resto 6,7-DM-THIQ se extiende dentro de la región del vestíbulo de la
enzima y hace contactos hidrófobos con los residuos Val89, Leu93, Ile112, Tyr115, Val116, Tyr355
y Leu359.
La comparación de los complejos 8 / COX-1 y 17 / COX-2 revela sorprendentes similitudes y
diferencias en la unión de los ligandos (Figura 5). Curiosamente, los dos inhibidores se unen en
conformaciones muy similares, con su nitrógeno N2 isoxazol y enlace de hidrógeno a Ser530 en
ambas isoenzimas. Sin embargo, 17 hace dos enlaces de hidrógeno con la hendidura de unión de
COX-2: uno entre el metoxi oxígeno en el fenilo en C3 del isoxazol y el grupo hidroxi Tyr385 y el
otro entre el oxígeno del metoxi en el fenilo en C4 del isoxazol y El átomo de nitrógeno del anillo
His90 imidazol.
La selectividad del compuesto 8 para la COX-1 es probable que se deba a las interacciones
favorables del resto Rh6G con los residuos de los sitios de constricción y de vestíbulo,
contribuyendo significativamente a la estabilidad del complejo.
Figura 5. Superposición de las mejores posiciones de 8 (amarillo) y 17 (violeta) en los sitios
COX-1 y COX-2 activos, respectivamente.

los compuestos diana 7-9 y 15-17, que contenían cada uno un fragmento P-gpinteracting, también
se estudiaron por su capacidad para modular la actividad de la bomba de eflujo midiendo la
acumulación de calceína en células MDCK-MDR1 que sobreexpresan P-gp y determinando la
permeabilidad aparente a través de un Caco -2 monocapa de células. Los compuestos 7 y 9, a
pesar de portar el resto Rh6G, no interaccionaron con el transportador de eflujo, como lo
demuestran sus valores bajos de EC50 (Tabla 3). Los valores de CE50 se determinaron ajustando
el porcentaje de aumento de fluorescencia frente a log [dosis]. [39] Todos los otros compuestos (8
y 15-17) mostraron una interacción significativa con P-gp (EC50 valores que van desde 0,42 hasta
4,61 mm). El ensayo de permeabilidad realizado sobre los mismos compuestos (Tabla 3)
proporcionó valores BA / AB (Papp, permeabilidad aparente)> 2, lo que indica que son sustratos de
P-gp. [40]

Tabla 3. Resultados del ensayo de calceína-AM y determinación de Papp

Conclusiones
En este estudio, se preparó un conjunto de nuevas moléculas para permitir el avance del
conocimiento del reconocimiento molecular del sitio activo de la COX, complementado por
experimentos de simulación de acoplamiento que aportaron información adicional sobre el modo
de unión de estos compuestos. Dos compuestos fueron identificados como altamente selectivos
COX-1 y COX-2 inhibidores, respectivamente (8, COX-1 IC50 = 6,0 mm, 17, COX-2 IC50 = 0,95
mm). Los estudios de acoplamiento molecular racionalizaron esta fuerte actividad inhibidora de
COX-1 y COX-2. El resto diarilisoxazol (P6) de 8 se inserta completamente en la cavidad de unión
de COX-1, mientras que la funcionalidad de Rh6G voluminosa se proyecta a través del sitio de
constricción en el vestíbulo ancho en el dominio de unión a la membrana. La porción Rh6G
interacciona con múltiples residuos hidrófobos, proporcionando una fuerza de unión considerable.
Por otra parte, el inhibidor selectivo COX-2 17 rompe el sitio de constricción en la boca del sitio
activo y proyecta su fracción 6,7-DM-THIQ dentro de la región del vestíbulo no unida de forma
estérica. Se esperaba que Rh6G y 6,7-DM-THIQ, presentes en 8 y 17, respectivamente, confieren
una modulación de actividad P-gp opuesta a los dos compuestos. Por el contrario, 8 y 17 retenido
COX-1 o COX-2 actividad inhibitoria, respectivamente, pero ambos se comportaron como sustratos
de P-gp (BA / AB> 2, Tabla 3). Todos estos resultados se han tenido en cuenta para estudios
posteriores