Microglia promueve la formación de sinapsis dependiente del

aprendizaje a través del factor neurotrófico derivado del cerebro

Resumen
Microglia son los macrófagos residentes del SNC, y sus funciones se han estudiado ampliamente en diversas patologías
cerebrales. Sin embargo, las funciones fisiológicas de la microglia en la plasticidad y la función del cerebro no están
claras. Para abordar esta cuestión, generamos ratones CX 3 CR1 CreER que expresan la recombinasa Cre inducible por tamoxifeno
que permite la manipulación específica de la función del gen en la microglía. Usando CX 3 CR1 CreERpara impulsar la
expresión del receptor de la toxina diftérica en la microglía, descubrimos que la microglia podría agotarse específicamente
en el cerebro tras la administración de la toxina diftérica. Los ratones agotados de microglia mostraron déficits en múltiples
tareas de aprendizaje y una reducción significativa en la formación de sinapsis dependiente del aprendizaje motor. Además,
la eliminación dependiente de Cre del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) de la microglía recapituló en gran
parte los efectos del agotamiento de la microglia. El BDNF microglial aumenta la fosforilación del receptor B de la quinasa
relacionada con la tropomiosina neuronal, un mediador clave de la plasticidad sináptica. Juntos, nuestros hallazgos revelan
que la microglía cumple importantes funciones fisiológicas en el aprendizaje y la memoria al promover la formación de
sinapsis relacionada con el aprendizaje a través de la señalización de BDNF.

Introducción
Microglia es una población de células mieloides residentes que ocupan todas las regiones del sistema nervioso central (SNC) de los
mamíferos. Estudios recientes han demostrado que la microglia coloniza el cerebro temprano durante el desarrollo (día embrionario
9.5) ( Ginhoux et al., 2010 ). A medida que avanza el desarrollo, la transición de microglia de una morfología ameboide a una altamente
ramificada con múltiples procesos finos que muestran una motilidad constante dentro de los tejidos neurales ( Davalos et al.,
2005 , Swinnen et al., 2013 ). Aunque el papel de la microglia en las patologías del SNC se ha estudiado ampliamente, su contribución
a la fisiología normal del SNC sigue sin estar clara. Interrupciones en el factor estimulante de colonias 1 ( CSF-1)) la vía de señalización
en ratones causa una reducción en el número de microglia, así como defectos en la estructura y función neuronal ( Michaelson et al.,
1996 , Roumier et al., 2004 ). En humanos, las mutaciones en la señalización de CSF-1 se han asociado con la demencia presenil
( Paloneva et al., 2000 ). Una variedad de deficiencias estructurales y funcionales también se han asociado con deleciones o
mutaciones con pérdida de función en varios genes expresados en microglia, que incluyen el receptor fractalkine CX 3 CR1, la proteína
de unión CpG 2 de metilo ( Mecp2 ) y la proteína homeobox HoxB8 ( Chen y otros, 2010 ,Derecki et al., 2012 , Paolicelli et al., 2011 ). En
conjunto, estos estudios sugieren que la disfunción microglial tiene un impacto perjudicial significativo sobre el desarrollo y la función
del sistema nervioso central. Sin embargo, debido a que genes como CSF-1 , CX 3 CR1 , Mecp2 y HoxB8 funcionan en muchas
poblaciones mieloides, tanto la microglía como las células mieloides periféricas se vieron afectadas en estos estudios. Debido a que
los déficits en las células mieloides periféricas podrían tener efectos significativos sobre el SNC (Dantzer et al., 2008 ), se debe tener
precaución al deducir la función precisa de la microglía en el cerebro a partir de experimentos con ratones knockout que afectan a las
células mieloides periféricas y del SNC.

Muchas líneas de evidencia indican que la plasticidad estructural sináptica dependiente de la experiencia es importante para el
desarrollo del SNC, así como para el aprendizaje y la formación de la memoria ( Bailey y Kandel, 1993 , Grutzendler y otros, 2002 , Yang
et al., 2009a ). Por ejemplo, el aprendizaje de habilidades motoras induce la formación de espinas dendríticas postsinápticas en la
corteza motora, y la supervivencia de estas espinas se correlaciona fuertemente con la mejora del rendimiento después del
aprendizaje ( Liston et al., 2013 , Yang et al., 2009a).) Estudios recientes han demostrado que los procesos microgliales suelen estar
muy cerca de somatas neuronales y espinas dendríticas, y que la dinámica de los procesos microgliales está regulada por la experiencia
sensorial y / o la actividad neuronal ( Tremblay et al., 2010 , Wake et al., 2009 ) Estos hallazgos sugieren que la microglia puede
desempeñar un papel en la regulación de la plasticidad sináptica dependiente de la experiencia. Recientemente, varios estudios han
sugerido que la microglia está involucrada en la poda sináptica a través de la fagocitosis de las sinapsis durante los períodos posnatales
tempranos, y que este proceso puede verse afectado por la pérdida del receptor fractalkine CX 3 CR1 ( Paolicelli et al., 2011 ) o receptor
complementario 3 ( CR3 /CD11b ) ( Schafer et al., 2012 ). Sin embargo, la fagocitosis sináptica por microglía y los defectos de poda
sináptica observados en ratones nulos en CX 3 CR1 y CR3 están ausentes durante el desarrollo posnatal y la edad
adulta posteriores ( Paolicelli et al., 2011 , Schafer et al., 2012 ). Además, de forma similar a otros genes
mieloides, CX 3 CR1 y CR3tienen funciones no solo en microglia sino también en poblaciones mieloides periféricas, lo que hace difícil
determinar las funciones precisas de la microglía usando CX 3 CR1 y CR3.ratones knockout. Por lo tanto, se desconoce si y cómo la
microglia está involucrada en cambios dependientes de la experiencia de los circuitos sinápticos, particularmente en la vida posnatal
y adulta posterior. Tampoco está claro si la disfunción microglial contribuiría significativamente a los déficits de aprendizaje como se
ve en las enfermedades neurológicas.

Para investigar los papeles precisos de la microglia en el cerebro, generamos una línea de ratón que permite la manipulación genética
específica de la microglía de forma inducible. Aquí, informamos que el agotamiento específico de microglia conduce a déficits en
múltiples tareas de aprendizaje y remodelación sináptica inducida por el aprendizaje. Además, el agotamiento genético del factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) de la microglia recapitula muchos de los fenotipos generados por la deleción de la microglía,
lo que indica que el BDNF microglial es un factor importante para la remodelación sináptica asociada con el aprendizaje y la memoria.

Resultados
Generación de ratones CRX CX 3 CR1 para manipular la expresión génica en Microglia
Con el fin de manipular la función microglial, se generaron ratones CreER CX 3 CR1que expresan la recombinasa Cre inducible
por tamoxifeno (CreER) en microglia bajo el control del promotor CX 3 CR1 endógeno ( Figura 1 A). El gen que codifica
CreER fue seguido por un elemento IRES-EYFP y el sitio de inserción se eligió de acuerdo con estudios previos en los que
la región codificante CX 3 CR1 se reemplazó con GFP potenciada (EGFP) ( Jung et al., 2000 ). Corregir la orientación
del CX 3 CR1El locus y la subsecuente flipasa (FLP) mediada por la recombinasa del cassette de resistencia a la neomicina
se verificó por análisis de transferencia Southern ( Figura 1 B). Se realizó la inmunotinción para el marcador microglial Iba1
y el marcador neuronal NeuN en rodajas de cerebro de CX 3 CR1 Creer / + ratones heterocigotos. Como se esperaba,
encontramos que prácticamente todas las células EYFP + (98.8% ± 1.3%, n = 172) eran Iba1 + , mientras que
ninguna célula NeuN + (n = 401) era EYFP + ( Figura 1 C), lo que indicaba que la transcripción de CreER se expresa
específicamente en microglia en el cerebro. Para probar la funcionalidad de CreER, cruzamos Ratones CX 3 CR1 CreER
a ratones con alelo reportero Rosa26-stop-DsRed ( R26 DsRed ) ( Luche et al., 2007 ) para generar animales CX 3CR1 CreER / + :
R26 DsRed / +
. En ausencia de tamoxifeno, se encontraron pocos DsRed + microglia (0,3% ± 0,01%) en el cerebro de
ratones CX 3 CR1 CreER / + : R26 DsRed / + ( Figura 1 D). Por el contrario, 5 días después del tratamiento con tamoxifeno, la
mayoría (93.9% ± 0.5%) de CX 3 CR1-EYFP + microglia en CX 3 CR1 CreER / + : R26Se encontró que ratones DsRed / + coexpresan
DsRed ( Figuras 1 D y 2A). Por lo tanto, la recombinación mediada por Cre en microglia es altamente eficiente en
ratones CX 3 CR1 CreER / + .
Manipulación dependiente de credos de la expresión génica en Microglia
De acuerdo con estudios previos de los patrones de expresión de CX 3 CR1 ( Jung et al., 2000 ), también se observó
expresión mejorada de proteína fluorescente amarilla (EYFP) en múltiples poblaciones mieloides CD11b + en tejidos
periféricos de ratones CX 3 CR1 CreER / + ( Figura 2 UN). Encontramos que los porcentajes de varias poblaciones mieloides en
el cerebro, la sangre y el bazo eran comparables entre ratones silvestres (WT) y ratones CX 3 CR1 CreER / + en el día postnatal
14 (P14) y P30, lo que sugiere que el desarrollo y la maduración de las poblaciones mieloides, incluida la microglía en el
cerebro, no se alteró en heterocigotosCX 3 ratones CR1 CreER / + que carecen de una copia del gen CX 3 CR1 endógeno ( Figuras
S1 A y S1B disponibles en línea). Como se esperaba, en CX 3 CR1 CreER / +: R26 ratones DsRed / + , la recombinación mediada
por Cre ocurrió no solo en microglia del SNC sino también en poblaciones de células CX 3 CR1 + en el bazo (59.0% ± 3.1%)
y en sangre ( 70,9% ± 4%) 5 días después de la administración de tamoxifeno ( Figuras 2 A y 2C).

Con el fin de restringir la recombinación mediada por Cre exclusivamente a microglia, aprovechamos el hecho de que
microglia y otras células CX 3 CR1 +tienen tasas de renovación sustancialmente diferentes y se derivan de diferentes
poblaciones de precursores. Microglia es una población autorrenovable ( Ajami et al., 2007 ) con una baja tasa de
renovación ( Lawson et al., 1992 ), mientras que los monocitos y los macrófagos inflamatorios exhiben una rápida
renovación ( van Furth y Cohn, 1968 ) y se reponen a través de un CX 3 CR1 - población de precursores de médula ósea
( Fogg et al., 2006)) Por lo tanto, al exponernos al tamoxifeno, esperamos que la microglia experimente una recombinación
que persiste una vez que el tamoxifeno se haya disipado. Por el contrario, las poblaciones periféricas de
CX 3 CR1 + experimentarían inicialmente recombinación pero posteriormente serían reemplazadas por células no
recombinadas de CX 3 CR1 - progenitores en ausencia de tamoxifeno adicional ( Figura S1 C). De hecho,
cuando CX 3 CR1 CreER / + : R26 DsRed / + ratones fueron pulsados con tamoxifeno en P1-P3 y examinados 30 días después,
93.0% ± 1.0% de EYFP + microglia resultaron ser DsRed + ( Figuras 2A-2C). En contraste, solo 7.9% ± 1.9% de las células
en el bazo y 1.7% ± 0.5% de las células dentro de la sangre fueron DsRed + ( Figuras 2 A y 2C). Estos resultados
demuestran que los ratones CX 3 CR1 CreER / + , cuando se utilizan 30 días después de la administración de tamoxifeno,
permiten la manipulación dependiente de Cre de la expresión génica casi exclusivamente en microglia.

A continuación, utilizamos una estrategia similar para expresar el receptor de la toxina diftérica (DTR) específicamente en
microglia, y administramos toxina diftérica (DT) para reducir la microglia en el SNC, al tiempo que conservamos intactas
otras poblaciones de CX 3 CR1 + . Para lograr esto, los ratones CX 3 CR1 CreER se cruzaron con ratones que albergaban
el alelo Rosa26-stop-DTR ( R26 iDTR ) ( Buch et al., 2005 ), y los ratones CX 3 CR1 CreER / + : R26 iDTR / + recibieron tamoxifeno ~30
días antes de la administración de DT ( Figura 2 D). Descubrimos que CX 3CR1Los ratones CreER / + : R26 iDTR / + tuvieron una
reducción marcada (99.1% ± 0.8%) de microglia del SNC dentro de 1 día después de la administración de DT ( Figuras
2 E-2G). Por el contrario, el número de microglia no se vio afectado en el cerebro de los ratones control que portaban una
sola copia delalelo CreER CX 3 CR1 solamente. Siete días después de la administración de DT, el número de microglia se
mantuvo significativamente más bajo (84,8% ± 3,0% de reducción) en ratones CX 3 CR1 CreER / + : R26 iDTR / + que en ratones de
control ( Figuras 2E y 2G), lo que sugiere repoblación limitada de microglia dentro de 1 semana de agotamiento. Es
importante destacar que no se observaron diferencias significativas en el número de CX 3 CR1 + CD11b + células en el bazo
o la sangre entre CX 3 CR1 CreER / + : R26 iDTR / + ratones y ratones de control ( Figuras 2 H y 2 I). Estos experimentos
demuestran que los ratones CX 3 CR1 CreER / + : R26 iDTR / + pueden usarse para eliminar específica y robustamente la microglia en
el SNC.
Dentro de la primera semana después del agotamiento microglial, no encontramos diferencias en la viabilidad animal (n =
14-16 por grupo) o el cambio de peso ( Figura S2 A) entre los ratones de control agotados con microglia y los no
agotados. Para investigar si la ablación microglial puede causar respuestas inflamatorias en el SNC, medimos los niveles
de transcripción y proteína del factor de necrosis tumoral citoquinas inflamatorias α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) e IL-6
en tejidos cerebrales, y observamos sin diferencia significativa entre los ratones deficientes en microglia y control ( Figuras
S2 B-S2D). Tampoco encontramos diferencias significativas en la inmunotinción de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y
el transportador de glutamato GLT-1 en los 7 días posteriores al agotamiento microglial en la corteza motora o en la región
CA1 del hipocampo (Figuras S2 E-S2J). Además, no encontramos alteraciones en la permeabilidad de la barrera
hematoencefálica entre ratones deficientes en microglia y control según lo medido por la cantidad de tinte Evans Blue en
el cerebro después de la inyección intravenosa ( Figura S2 K). Para determinar si la depleción de microglia alteraba las
densidades globales de neuronas y sinapsis, teñimos secciones de la corteza motora y la región CA1 del hipocampo para
NeuN, corté la caspasa 3 (CC3) o la proteína vesicular sináptica presynaptic marcador 2 (SV2) y no encontré diferencia
significativa en estos parámetros entre ratones deficientes en microglia y control ( Figura S3 ). Tomados en conjunto, estos
hallazgos sugieren que la reducción de la microglía deja los tejidos cerebrales circundantes mínimamente alterados. Por
lo tanto, CX 3 CR1CreER / + : R26 ratones iDTR proporcionan una herramienta importante para eliminar microglia y examinar su
función en el SNC.
Figura 1.

Generación de ratones que transportan el alelo CX 3 CR1 CreER

(A) Esquema de la estrategia de selección utilizada para knockin de CreER-IRES-YFP en el locus CX 3 CR1 .

(B) Análisis de transferencia Southern de AflII digirió el ADN genómico de no directo (WT), CX 3 CR1 Creer -targeted,
o CX 3 CR1 Creer ratones después de la eliminación de la secuencia de resistencia a la neomicina.

(C) Secciones coronales de la corteza motora de ratones CreER P45 CX 3 CR1 teñidos para EYFP, Iba1 y NeuN.

(D) Secciones coronales de la corteza motora de ratones de los genotipos y tratamientos indicados (barra de escala, 100
μm).

Figura 1. Contexto en el artículo

 Con el fin de manipular la función microglial, se generaron ratones CreER CX 3 CR1 que expresan la recombinasa Cre
inducible por tamoxifeno (CreER) en microglia bajo el control del promotor CX 3CR1 endógeno ( Figura 1 A). El gen que
codifica CreER fue seguido por un elemento IRES-EYFP y el sitio de inserción se eligió de acuerdo con estudios previos
en los que la región codificante CX 3 CR1 se reemplazó con GFP potenciada (EGFP) ( Jung et al., 2000 ). Corregir la
 orientación del CX 3 CR1El locus y la subsecuente flipasa (FLP) mediada por la recombinasa del cassette de resistencia
a la neomicina se verificó por análisis de transferencia Southern ( Figura 1 B). Se realizó la inmunotinción para el
marcador microglial Iba1 y el marcador neuronal NeuN en rodajas de cerebro de CX 3 CR1 Creer / +
ratones
heterocigotos. Como se esperaba, encontramos que prácticamente todas las células EYFP (98.8% ± 1.3%, n = 172)
+

eran Iba1 + , mientras que ninguna célula NeuN + (n = 401) era EYFP + ( Figura 1 C), lo que indicaba que la transcripción
de CreER se expresa específicamente en microglia en el cerebro. Para probar la funcionalidad de CreER,
cruzamos CX 3 CR1Ratones CreER aratonesalelo reportero Rosa26-stop-DsRed ( R26 DsRed ) ( Luche et al., 2007 ) para
generar CX 3 CR1 CreER / + : R26 DsRed / + animales. En ausencia de tamoxifeno, se encontraron pocos DsRed +microglia
(0,3% ± 0,01%) en el cerebro de ratones CX 3 CR1 CreER / +: R26 DsRed / + ( Figura 1 D). Por el contrario, 5 días después del
tratamiento con tamoxifeno, la mayoría (93,9% ± 0,5%) de CX 3CR1-EYFP + microglia en CX 3 CR1CreER / + : se encontró
que
R26 DsRed / + ratones coexpresan DsRed ( Figuras 1 D y 2 A). Por lo tanto, la recombinación mediada por Cre en
microglia es altamente eficiente enratones CX 3 CR1 CreER / + .

Figura 2. Una estrategia para restringir la manipulación de la función génica mediada por cre, incluyendo la
eliminación de microglia

(A) poblaciones de CX 3 CR1-EYFP + CD11b + en diversos tejidos de ratones de los genotipos indicados 5 o 30 días
después del tratamiento con tamoxifeno.

(B) Secciones coronales de la corteza motora de ratones CX 3 CR1 CreER / + : R26 DsRed / + teñidos para EYFP y DsRed 30 días
después del tratamiento con tamoxifeno.

(C) Cuantificación del análisis de clasificación celular activada por fluorescencia por citometría de flujo (FACS) que muestra
el porcentaje de células CX 3 CR1-EYFP + que coexpresan DsRed en tejidos múltiples a los 5 o 30 días después del
tratamiento con tamoxifeno.

(D) Curso temporal de administración y análisis de tamoxifeno / DT.

(E) Análisis FACS de microglia en el cerebro de control y ratones con deficiencia de microglia en los puntos de tiempo
indicados después de la administración de DT. Los gráficos de puntos muestran el número total de células CX 3 CR1-
EYFP + CD11b + bloqueadas en DAPI - CD3 - CD19 - CD45 int .

(F) Secciones coronales de la corteza motora de ratones con control o con depleción de microglia teñidos para Iba1 1 día
después de la administración de DT.

(G) Número de CX 3 CR1-EYFP + CD11b + microglia en el cerebro después de la administración de DT en diversos

momentos.

(H) Análisis FACS que muestra el porcentaje de células CX 3 CR1-EYFP + CD11b + en el bazo y la sangre de ratones
después de la administración de DT.

(I) Cuantificación de los datos mostrados en (H). n = 4 animales por cada condición experimental. Los datos se representan
como media ± SEM. **** p <0.0001, * p <0.05. Barra de escala, 100 μm.

Figura 2. Contexto en el artículo

 Con el fin de manipular la función microglial, generamos CX 3 CR1 CreER ratones expresando tamoxifeno inducible Cre
recombinasa (CreER) en microglia bajo el control del endógeno CX 3 CR1promotor ( Figura 1, A). El gen que codifica
CreER fue seguido por un elemento IRES-EYFP y el sitio de inserción se eligió de acuerdo con estudios previos en los
que la región codificante de CX 3 CR1se reemplazó con GFP mejorada (EGFP) ( Jung et al., 2000 ). Corregir la
orientación del CX 3 CR1El locus y la subsecuente flipasa (FLP) mediada por recombinasa de la cassette de resistencia
a la neomicina se verificó mediante análisis de transferencia Southern ( Figura 1, B). Se realizó la inmunotinción para
el marcador microglial Iba1 y el marcador neuronal NeuN en rodajas de cerebro de CX 3 CR1 Creer / +
ratones
heterocigotos. Como se esperaba, encontramos que prácticamente todas las células EYFP (98.8% ± 1.3%, n = 172)
+

fueron Iba1 + , mientras que las células NeuN + (n = 401) no fueron EYFP + ( Figura 1 C), lo que indica que La
transcripción de CreER se expresa específicamente en microglia en el cerebro. Para probar la funcionalidad de CreER,
cruzamosRatones Cero CR1 CX 3 aratones alelo reportero Rosa26-stop-DsRed ( R26 DsRed ) ( Luche et al., 2007 ) para
generar animales CX 3 CR1 CreER / + : R26 DsRed / +. En ausencia de tamoxifeno, se encontraron pocos DsRed +microglia (0,3% ±
0,01%) en el cerebro de ratones CX 3 CR1 CreER / +: R26 DsRed / + ( Figura 1 D). Por el contrario, 5 días después del tratamiento
con tamoxifeno, la mayoría (93.9% ± 0.5%) de CX 3CR1-EYFP +microglia en CX 3 CR1 CreER / + : R26 DsRed / + ratones se
coexpresan DsRed ( Figuras 1, D y 2 A). Por lo tanto, la recombinación mediada por Cre en microglia es altamente
eficiente en ratones CX 3 CR1 CreER / + .
 De acuerdo con estudios previos de los patrones de expresión de CX 3 CR1 ( Jung et al., 2000 ), también se observó
expresión mejorada de proteína fluorescente amarilla (EYFP) en múltiples poblaciones mieloides CD11b + en tejidos
periféricos de CX 3 CR1 CreER / + ratones ( Figura 2 A). Encontramos que los porcentajes de varias poblaciones mieloides
en el cerebro, la sangre y el bazo eran comparables entre los ratones de tipo salvaje (WT) y CX 3CR1 CreER / +ratones en
el día postnatal 14 (P14) y P30, lo que sugiere que el desarrollo y la maduración de poblaciones mieloides, incluida la
microglía en el cerebro, no se alteraron en ratones heterocigotos CX 3 CR1 CreER / + que carecían de una copia
del gen CX 3 CR1 endógeno ( Figuras S1 A y S1B disponibles en línea). Como se esperaba, en CX 3 CR1 CreER / + :
R26 ratones DsRed / + , la recombinación mediada por Cre ocurrió no solo en microglia del SNC sino también en poblaciones
de células CX 3CR1 + en el bazo (59.0% ± 3.1%) y en sangre ( 70.9% ± 4%) 5 días después de la administración de
tamoxifeno (Figuras 2 A y 2C).
 Con el fin de restringir la recombinación mediada por Cre exclusivamente a microglia, aprovechamos el hecho de que
microglia y otras células CX 3 CR1 + tienen tasas de renovación sustancialmente diferentes y se derivan de diferentes
poblaciones de precursores. Microglia es una población autorrenovable ( Ajami et al., 2007 ) con una baja tasa de
recambio ( Lawson et al., 1992), mientras que los monocitos y los macrófagos inflamatorios exhiben un rápido recambio
( van Furth y Cohn, 1968 ) y se reponen a través de un CX 3 CR1 - población de precursores de médula ósea ( Fogg et
al., 2006 ). Por lo tanto, al exponernos al tamoxifeno, esperamos que la microglia experimente una recombinación que
persiste una vez que el tamoxifeno se haya disipado. Por el contrario, laspoblacionesperiféricas de
CX 3 CR1 +experimentarían inicialmente recombinación pero posteriormente serían reemplazadas por células no
recombinadas de CX 3 CR1 -progenitores en ausencia de tamoxifeno adicional ( Figura S1, C). De hecho,
cuando CX 3 CR1 CreER / + : R26 DsRed / + ratones fueron pulsados con tamoxifeno en P1-P3 y examinados 30 días después,
93.0% ± 1.0% de EYFP + microglia resultaron ser DsRed + (Figuras 2 A-2C). En contraste, solo 7.9% ± 1.9% de las
células en el bazo y 1.7% ± 0.5% de las células dentro de la sangre fueron DsRed + ( Figuras 2 A y 2C). Estos resultados
demuestran que los ratones CX 3 CR1 CreER / + , cuando se utilizan 30 días después de la administración de tamoxifeno,
permiten la manipulación dependiente de Cre de la expresión génica casi exclusivamente en microglia.
 A continuación, utilizamos una estrategia similar para expresar el receptor de la toxina diftérica (DTR) específicamente
en microglia, y administramos toxina diftérica (DT) para reducir la microglia en el SNC, al tiempo que
conservamos intactas otras poblaciones de CX 3 CR1 + . Para lograr esto, se cruzaron ratones CX 3 CR1 CreER con
ratones que albergaban el alelo Rosa26-stop-DTR ( R26 iDTR ) ( Buch et al., 2005 ) y CX 3 CR1 CreER / + : R26 iDTR / + ratones
recibieron tamoxifeno ~30 días antes de la administración de DT ( Figura 2 D). Descubrimos que CX3 CR1 CreER /

+
: ratones R26 iDTR / +tuvieron una reducción marcada (99,1% ± 0,8%) de microglia del SNC dentro de 1 día después de la
administración de DT ( Figuras 2 E-2G). Por el contrario, el número de microglia no se vio afectado en el cerebro de los
ratones control que portaban una sola copia delalelo CreER CX 3 CR1 solamente. Siete días después de la administración
de DT, el número de microglia se mantuvo significativamente más bajo (84,8% ± 3,0% de reducción)
en ratonesCX 3 CR1 CreER / + : R26 iDTR / + que en ratones de control ( Figuras 2E y 2G), lo que sugiere repoblación limitada de
microglia dentro de 1 semana de agotamiento. Es importante destacar que no se observaron diferencias significativas
en el número de CX 3 CR1 +CD11b + células en el bazo o la sangre entre CX 3 CR1 CreER / + : R26 iDTR / + ratones y ratones
de control ( Figuras 2 H y 2 I). Estos experimentos demuestran que los ratones CX 3 CR1 CreER / + : R26 iDTR / + pueden usarse
para eliminar específica y robustamente la microglia en el SNC.

El agotamiento de Microglia reduce la plasticidad estructural sináptica asociada con el aprendizaje

Estudios recientes han sugerido que la microglia participa en la eliminación de sinapsis a través de un mecanismo de
engatillado fagocítico que involucra el receptor fractalkine CX 3 CR1 ( Paolicelli et al., 2011 ) o el receptor 3 del
complemento ( CR3 / CD11b ) ( Schafer et al., 2012 ). Este proceso de fagocitosis sináptica parece ocurrir solo durante los
períodos postnatales temprano y no tardío ( Paolicelli et al., 2011 , Schafer et al., 2012).) Para determinar la función
potencial de la microglía en el cerebro maduro, primero investigamos si la depleción de microglia podría alterar la plasticidad
estructural sináptica durante el período posnatal tardío (P19) o la edad adulta joven (P30). Utilizando microscopía
transcraneal de dos fotones ( Yang et al., 2009a ), examinamos el efecto de la depleción microglial en la remodelación
basal de espinas dendríticas postsinápticas de neuronas piramidales de la capa V en la corteza motora de ratones Thy1
YFP-H línea cruzados con CX 3CR1 CreER / + o CX 3 CR1 CreER / + : R26 ratones iDTR / + ( Figuras 3A y 3B). Encontramos que ya sea
en P19 o P30, la depleción microglial causó una disminución significativa en la formación y eliminación de la columna
vertebral durante 4 días ( Figuras 3 C y 3D). Además, observamos que la remodelación de la línea de base no se alteró
en ratones CX 3 CR1 CreER / + que carecían de una copia única del gen CX 3 CR1 endógeno , como CX 3 CR1 CreER / + : Thy1
YFP-H y CX 3CR1 + / +
: Thy1 YFP-H ratones mostraron tasas similares de rotación de la columna vertebral ( Figura
S4UN). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que la microglía está involucrada no solo en la eliminación de la
columna sino también en la formación de la columna vertebral durante el desarrollo posnatal tardío y la edad adulta
temprana.

Estudios previos han demostrado que el aprendizaje de habilidades motoras provoca un aumento en la remodelación de
la espina dendrítica en la corteza motora, y que el grado de formación de la nueva columna se correlaciona con la mejora
del rendimiento después del aprendizaje ( Liston et al., 2013 , Yang et al., 2009a ) . Para investigar el papel de la microglía
en este proceso, se examinó si la depleción de la microglía alteró la formación y eliminación de la columna vertebral durante
4 días en respuesta al aprendizaje del motor rotarod ( Figura 3 E). Encontramos una disminución significativa en la
formación dependiente del aprendizaje y la eliminación de las espinas dendríticas en ratones con depleción de microglia
de 1 mes de edad en comparación con los controles de la misma edad ( Figura 3).F). Además, en ratones adultos de 2
meses de edad, la depleción de microglia causó una disminución significativa en la formación de espina dependiente del
aprendizaje, pero no en la eliminación de la columna vertebral ( Figura 3 G). Notablemente, aunque el rendimiento inicial
de los animales agotados por microglia permaneció sin cambios ( Figuras 3H y 3I), hubo una disminución significativa en
la mejora del rendimiento después del aprendizaje motor en ratones con microglia depleted en comparación con los ratones
de control en P30 y P60 ( Figuras 3 J , 3K y S4 B). Estos resultados demuestran que la microglia tiene un papel importante
en la remodelación inducida por el aprendizaje de las sinapsis excitatorias, así como en la mejora del rendimiento de los
animales después del aprendizaje motor.

Para comprender mejor el efecto de la deleción de microglia en el aprendizaje y la memoria, se compararon los ratones
con control de microglia y los reducidos en dos paradigmas conductuales adicionales: acondicionamiento de miedo con
pistas auditivas (FC) y reconocimiento de objetos novedosos (NOR). Encontramos que los animales con depleción de
microglia exhibieron una respuesta de miedo a la congelación significativamente reducida a la señal auditiva durante la
prueba de recuerdo en comparación con controles no agotados ( Figura 3 L). Además, mientras que los ratones de control
no agotados mostraron una preferencia hacia el objeto nuevo durante la prueba NOR, los ratones con depleción de
microglia no mostraron tal preferencia ( Figura 3).METRO). Por lo tanto, los ratones que carecen de microglia demuestran
déficits en múltiples tareas de comportamiento, lo que subraya un papel importante de la microglía en el aprendizaje y la
memoria que involucra múltiples regiones del cerebro.
Figura 3. Microglia es importante para el aprendizaje de remodelación de columna dependiente y mejora del rendimiento

(A) Cronología de la administración de tamoxifeno / DT e imagen in vivo en ratones CX 3 CR1-iDTR .

(B) Imágenes de dos fotones transcraneales de espinas dendríticas en ratones control y con depleción de microglia. Las
puntas de flecha rellenas y vacías indican espinas formadas o eliminadas entre dos vistas. Asterisk indica filopodia.

(C y D) El porcentaje de espinas que se formaron o eliminaron en 4 días en la corteza motora se redujo significativamente
después de la depleción de microglia en los animales P19 (C) y P30 ( * p <0,05, ** p <0,01, n = 4-6).

(E) Cronología de la administración de tamoxifeno / DT, entrenamiento de rotarod e imaginología in vivo.

(F) La remodelación de la columna vertebral relacionada con el aprendizaje motor se redujo significativamente en ratones
P30 con depleción de microglia ( * p <0.05, ** p <0.01, n = 4-5).
(G) La formación de espina relacionada con el aprendizaje motor se redujo significativamente en ratones P60 con depleción
de microglia ( ** p <0,01, n = 4-5).

(H) Velocidad promedio alcanzada durante la primera sesión de entrenamiento rotarod en ratones P30 (n = 6-7).

(I) Velocidad promedio alcanzada durante la primera sesión de entrenamiento rotarod en ratones P60 (n = 8).

(J) Los ratones con depleción de microglia mostraron una mejora en el rendimiento en comparación con los ratones de
control no agotados durante 1 o 2 días de entrenamiento ( * p <0,05, n = 6-7).

(K) Los ratones P60 con depleción de microglia mostraron una mejora en el rendimiento en comparación con los ratones
de control no agotados durante 1 o 2 días de entrenamiento ( * p <0,05, n = 8).

(L) Porcentaje de congelación en ratones deficientes en microglia o control antes de (pre-CS) y durante (CS) presentación
del estímulo condicionado en la prueba de recuerdo ( * p <0.05, n = 8).

(M) La relación de discriminación del tiempo dedicado a la interacción con un objeto novedoso frente a un objeto familiar
en un ensayo NOR se alteró significativamente en ratones con microglia depleted ( * p <0,05, n = 8). Los datos se
representan como media ± SEM.

Figura 3. Contexto en el artículo

 Estudios recientes han sugerido que la microglia participa en la eliminación de sinapsis a través de un mecanismo de
engatillado fagocítico que involucra el receptor fractalkine CX 3 CR1 ( Paolicelli et al., 2011 ) o el receptor 3
( CR3 / CD11b ) ( Schafer et al. , 2012) Este proceso de fagocitosis sináptica parece ocurrir solo durante los períodos
postnatales temprano y no tardío (Paolicelli et al., 2011; Schafer et al., 2012). Para determinar la función potencial de
la microglía en el cerebro maduro, primero investigamos si la depleción de microglia podría alterar la plasticidad
estructural sináptica durante el período posnatal tardío (P19) o la edad adulta joven (P30). Utilizando microscopía
transcraneal de dos fotones ( Yang et al., 2009a ), examinamos el efecto de la depleción microglial en la remodelación
basal de espinas dendríticas postsinápticas de neuronas piramidales de capa V en la corteza motora de Thy1 YFP-H
línea de ratones cruzados con CX 3 CR1 CreER / + o CX 3 CR1 CreER / +: Ratones R26 iDTR / + ( Figuras 3 A y 3B). Encontramos que
ya sea en P19 o P30, la depleción microglial causó una disminución significativa en la formación y eliminación de la
columna vertebral durante 4 días ( Figuras 3 C y 3D). Además, observamos que la remodelación de la línea de base no
se alteró en ratones CX 3 CR1 CreER / + que carecían de una copia única del gen CX 3 CR1 endógeno , como CX 3 CR1 CreER
/+
: Thy1 YFP-H y CX 3 CR1 + / + : Thy1 YFP-H ratones mostraron tasas similares de rotación de la columna vertebral
( Figura S4 UN). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que la microglía está involucrada no solo en la
eliminación de la columna sino también en la formación de la columna vertebral durante el desarrollo posnatal tardío y
la edad adulta temprana.
 Estudios previos han demostrado que el aprendizaje de habilidades motoras provoca un aumento en la remodelación
de la espina dendrítica en la corteza motora y que el grado de formación de la nueva columna se correlaciona con la
mejora del rendimiento después del aprendizaje (Liston et al., 2013; Yang et al., 2009a) . Para investigar el papel de la
microglía en este proceso, se examinó si la depleción de la microglía alteró la formación y eliminación de la columna
vertebral durante 4 días en respuesta al aprendizaje del motor rotarod ( Figura 3 E). Encontramos una disminución
significativa en la formación dependiente del aprendizaje y la eliminación de las espinas dendríticas en ratones con
depleción de microglia de 1 mes de edad en comparación con los controles de la misma edad ( Figura 3).F). Además,
en ratones adultos de 2 meses de edad, la depleción de microglia causó una disminución significativa en la formación
 de espina dependiente del aprendizaje, pero no en la eliminación de la columna vertebral ( Figura 3 G). Notablemente,
aunque el rendimiento inicial de los animales agotados por microglia permaneció sin cambios ( Figuras3H y 3I), hubo
una disminución significativa en la mejora del rendimiento después del aprendizaje motor en ratones con microglia
depleted en comparación con los ratones de control en P30 y P60 ( Figuras 3 J , 3K y S4 B). Estos resultados
demuestran que la microglia tiene un papel importante en la remodelación inducida por el aprendizaje de las sinapsis
excitatorias, así como en la mejora del rendimiento de los animales después del aprendizaje motor.
 Para comprender mejor el efecto de la deleción de microglia en el aprendizaje y la memoria, se compararon los ratones
con control de microglia y los reducidos en dos paradigmas conductuales adicionales: acondicionamiento de miedo con
pistas auditivas (FC) y reconocimiento de objetos novedosos (NOR). Encontramos que los animales con depleción de
microglia exhibieron una respuesta de miedo a la congelación significativamente reducida a la señal auditiva durante la
prueba de recuerdo en comparación con controles no agotados ( Figura 3 L). Además, mientras que los ratones de
control no agotados mostraron una preferencia hacia el objeto nuevo durante la prueba NOR, los ratones con depleción
de microglia no mostraron tal preferencia ( Figura 3).METRO). Por lo tanto, los ratones que carecen de microglia
demuestran déficits en múltiples tareas de comportamiento, lo que subraya un papel importante de la microglía en el
aprendizaje y la memoria que involucra múltiples regiones del cerebro.

Agotamiento de la microglia altera los niveles de proteínas sinápticas y la función sináptica

glutamatérgica
Nuestros resultados indican que la depleción microglial causa defectos en la remodelación de la espina dendrítica inducida
por el aprendizaje y el rendimiento conductual. Para comprender mejor las alteraciones sinápticas después de la deleción
microglial, se examinaron los niveles de varias proteínas en el cerebro con microglia depleted, centrándose en aquellos
involucrados en la plasticidad sináptica y la función. Primero realizamos una pantalla proteómica cuantitativa a partir de
extractos de proteínas de todo el cerebro mediante cromatografía líquida multidimensional de escopeta y espectrometría
de masas en tándem (LCLC-MS / MS) análisis de proteoma de espectrometría de masas de alta resolución ( Washburn et
al., 2001 ). Específicamente, utilizamos cerebros de ratón marcados con 15 N como estándar interno y mezclamos 15N
cerebro entero 1: 1 con P30 microglia empobrecido o controlar el cerebro del compañero de parto para calcular los perfiles
relativos de proteínas ( Figura 4 A). Un enfoque similar se utilizó anteriormente para el análisis cuantitativo de todo el
proteoma de las proteínas de larga vida y los cambios de sinaptosomas durante el desarrollo ( Savas et al.,
2012). Cuantificamos un total de 6,562 proteínas y encontramos que los niveles de 61 proteínas se alteraron
significativamente como resultado de la depleción de microglia ( Figura 4 B; Tabla S1 ; valor de ANOVA p <0,05, log 2).veces
cambio ≥ 20%). Es importante destacar que 21/61 (34%) de las proteínas significativamente alteradas tenían funciones
conocidas en la plasticidad / función sináptica, como la subunidad del receptor postsináptico de glutamato (NMDA) epsilon-
2 (GluN2B) y el transportador de glutamato vesicular presináptico 1 (VGlut1). Además, encontramos que la subunidad 2
del receptor de glutamato (AMPA) (GluA2) disminuyó, aunque no cumplió con nuestros criterios de significación.

Para investigar más a fondo la alteración de las proteínas sinápticas después de la depleción de microglia, se generaron
fracciones de sinaptosoma de ratones con depleción de microglia y se compararon con los de los controles no agotados. En
línea con los resultados de nuestra pantalla proteómica, encontramos que VGlut1 y GluA2 disminuyen significativamente
en los sinaptosomas de cerebros con microglia depleted. Aunque la proteína GluN2B se incrementó en la fracción de todo
el cerebro como se muestra en nuestra pantalla proteómica, su nivel disminuyó en la fracción de sinaptosoma, lo que
sugiere una alteración diferencial de GluN2B en las fracciones de sinaptosoma frente a no sinaptosoma después de la
depleción microglial. La subunidad NMDAR GluN2A y la subunidad AMPAR GluA1 permanecieron inalteradas entre los
ratones con depleción de microglia y los controles ( Figura 4).C y 4D). Estos resultados apoyan los datos de nuestra
pantalla proteómica y demuestran que los cerebros con depleción de microglia muestran cambios significativos y
específicos de las proteínas sinápticas en las sinapsis glutamatérgicas.

Para probar si los cambios en la abundancia de las proteínas sinápticas GluN2B, VGlut1 y GluA2 después de la depleción
de microglia afectan a la función sináptica glutamatérgica, se realizaron registros de patch clamp de células enteras de las
neuronas piramidales de la capa V en la corteza motora de ratones P30 1 día después del agotamiento de
microglia. Encontramos que las frecuencias de las corrientes postsinápticas excitadoras en miniatura de NMDA y AMPA
mediadas (mEPSC) se redujeron significativamente en comparación con los controles ( Figura 4 E-4H), lo que sugiere una
disminución en la liberación espontánea de glutamato en ausencia de microglia. Además, el tiempo de decaimiento de
NMDA mEPSCs, pero no AMPA mEPSCs, se redujo significativamente en animales con microglia depleted, mientras que
la amplitud de NMDA espontánea y AMPA mEPSCs se mantuvo sin cambios ( Figuras 4F y 4H). La disminución en el
tiempo de decaimiento de los mEPSCs NMDA es consistente con la reducción de las subunidades GluN2B en ratones con
microglia depleción, ya que los receptores NMDA dominantes GluN2A tienen tiempos de decaimiento más rápidos ( Chen
et al., 1999 ). Tomados en conjunto, estos datos indican que la microglia desempeña un papel en la regulación del nivel de
varias proteínas sinápticas que son importantes para la función de las sinapsis excitatorias glutamatérgicas en el cerebro.

La eliminación de BDNF de Microglia reduce la plasticidad estructural sináptica dependiente del

aprendizaje
Los resultados anteriores muestran que la deleción de microglia causa una reducción en varias proteínas sinápticas
implicadas en la plasticidad y la función sináptica. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la interacción
entre la microglía y las neuronas siguen siendo desconocidos. Para abordar esta cuestión, investigamos el papel del factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en la mediación de las interacciones microglía-neurona. Elegimos estudiar BDNF
microglial por dos razones: en primer lugar, BDNF existe en muchos tipos celulares, incluida la microglia, y se ha
demostrado que BDNF de microglia modula la plasticidad neuronal en un modelo murino de dolor neuropático ( Coull et
al., 2005 ). En segundo lugar, BDNF es un potente regulador del desarrollo sináptico y la plasticidad ( Chao, 2003 ), y
aumenta la plasticidad de la espina dendrítica en la corteza del adulto (Chakravarthy et al., 2006 ), la activación de GluN2B
( Levine et al., 1998 ) y el nivel de VGlut1 ( Melo et al., 2013 ). Dados nuestros hallazgos de que la depleción de microglia
causa una reducción de GluN2B y VGlut1, así como de la plasticidad de la espina dendrítica, es posible que la falta de
BGLF microglial pueda ser la base de algunos de los fenotipos asociados con la depleción de microglia. Para probar esta
posibilidad, cruzamos CX 3 CR1 CreER ratones con ratones que contienen un alelo flojo de BDNF ( BDNF flox ) ( Rios et al.,
2001 ) para eliminar BDNF de microglia. Primero validamos este enfoque clasificando CX 3CR1-EYFP -células o CX 3 CR1-
EYFP + microglia de los cerebros de CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl / + ( BDNF fl / + ), o CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl / fl ( BDNF fl / fl )
ratones que se le había dado tamoxifeno ( Figura S5 A) y se ensayó la recombinación del alelo condicional
de BDNF usando una estrategia basada en PCR. Como era de esperar, no se observó recombinación en CX 3 CR1-EYFP -
células. Por el contrario, se observó una fuerte recombinación del alelo floxed en CX 3CR1-EYFP + microglia de BDNF fl /
+ o BDNF fl / fl ratones ( Figura 5 A). Después de la administración de tamoxifeno, el nivel de ARNm de BDNF en microglia
de CX 3CR1 CreER / + : BDNF fl / fl ratones se redujo marcadamente en comparación con CX 3CR1 CreER / + : BDNF fl / + controles
( Figura 5 B). Curiosamente, los niveles generales de proteína BDNF en la corteza y el hipocampo de CX 3 CR1 CreER / + :
BDNF fl / fllos ratones no se modificaron en comparación con CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl / + controles ( Figura 5 C). Tomados en
conjunto, estos resultados indican que BDNF puede eliminarse específicamente de la microglía sin causar una alteración
significativa en el nivel total de la proteína BDNF en la corteza o el hipocampo.

Para investigar el impacto potencial de la eliminación microglial de BDNF, primero tiñéronse la corteza motora y la región
CA1 del hipocampo para NeuN, caspasa 3 o SV2 escindida, pero no se encontraron diferencias significativas en estos
parámetros entre ratones microgliales borrados con BDNF y control ( Figuras S5 B- S5D). Por lo tanto, la eliminación
microglial de BDNF no altera las densidades globales de las neuronas o las sinapsis en la corteza o el hipocampo. A
continuación preguntamos si la eliminación de BDNF de la microglía tenía algún efecto sobre el nivel de expresión de
proteínas sinápticas, la plasticidad sináptica inducida por el aprendizaje motor y la mejora del rendimiento después del
aprendizaje. Se realizó un análisis de western blot de sinaptosomas y se encontró una disminución significativa en los
niveles de GluN2B y VGlut1, pero no de GluA2, en ratones que carecían de BDNF microglial ( BDNF fl / fl) en comparación
con los ratones de control ( BDNF fl / + ) ( Figuras 5 D y 5E). Es importante destacar que la eliminación de BDNF de la
microglía resultó en una disminución significativa en la formación de la columna inducida por el aprendizaje motor, pero no
en la eliminación de la columna vertebral, durante 2 días ( Figuras 5 F y 5G). Además, similar a lo observado para animales
con microglia, mientras que la eliminación de BDNF de microglia no tuvo efecto sobre el funcionamiento basal del rotarod,
los ratones que carecen de BDNF microglial demostraron una reducción en la mejora del rendimiento después del
entrenamiento motor en comparación con los controles ( Figuras 5 H y 5I) . Los ratones que carecen de BGLF microglial
también mostraron una respuesta al miedo por congelación significativamente reducida al estímulo de la señal auditiva
condicionada durante la prueba de recuerdo ( Figura 5).J). En la tarea NOR, sin embargo, los ratones que carecían de
BDNF microglial no mostraron una diferencia significativa de los ratones control ( Figura 5 K). Tomados en conjunto, estos
resultados demuestran que la pérdida de BDNF microglial recapitula varios defectos observados en ratones con deficiencia
de microglia y sugieren que el BDNF microglial es un importante regulador de la formación sináptica inducida por el
aprendizaje y del comportamiento.
Figura 4. Las propiedades bioquímicas y electrofisiológicas de las sinapsis se alteran en los cerebros empobrecidos en
microglia

(A) Esquema proteómico cuantitativo para identificar proteínas del SNC alteradas después del agotamiento microglial. Los
homogenados de cerebro control (n = 3) o agotado por microglia (n = 3) se mezclaron 1: 1 con patrón interno 15 N y se
prepararon juntos. Las muestras fueron analizadas por LCLC-MS / MS escopeta proteómica. Los puntos verdes
representan microglia.

(B) Gráfico de volcán de resumen proteómico (eje x = log 2 CX 3 CR1 CreER / + / CX 3 CR1 CreER / + : R26 iDTR / + ; eje y = -
log 10 valor deANOVA p). Círculos negros abiertos: proteínas cuantificadas; círculos rojos abiertos: proteínas
significativamente alteradas; círculos llenos de verde: proteínas significativamente alteradas con funciones sinápticas
conocidas.

(C) Las fracciones de sinaptosomas de cerebros de control o con microglia agotados sondeados con anticuerpos indicados
por western blot.
(D) Cuantificación densitométrica de Western Blots en (C) ( * p <0.05, n = 6).

(E) Ejemplos de mEPSCs NMDA en neuronas piramidales de la capa V de ratones control y con reducción de microglia.

(F) Frecuencia, amplitud y tiempo de disminución de mEPSC NMDA medios en el control (n = 17 células) y ratones con
depleción de microglia (n = 17 células). mEPSC frecuencia y el tiempo de desintegración se redujeron significativamente
en ratones con microglia depleted (p <0,001).

(G) Ejemplos de mEPSCs de AMPA en neuronas piramidales de la capa V de ratones control y con reducción de microglia.

(H) Frecuencia, amplitud y tiempo de disminución mEPSC promedio en el control (n = 9 células) y ratones sin microglia (n
= 8 células). La frecuencia mEPSC se redujo significativamente en ratones con microglia depleted (p <0,05). Los datos se
representan como media ± SEM.

Figura 4. Contexto en el artículo

 Nuestros resultados indican que la depleción microglial causa defectos en la remodelación de la espina dendrítica
inducida por el aprendizaje y el rendimiento conductual. Para comprender mejor las alteraciones sinápticas después de
la deleción microglial, se examinaron los niveles de varias proteínas en el cerebro con microglia depleted, centrándose
en aquellos involucrados en la plasticidad sináptica y la función. Primero realizamos una selección proteómica
cuantitativa a partir de extractos proteicos de cerebro completo mediante cromatografía líquida multidimensional de
escopeta-espectrometría de masas en tándem (LCLC-MS / MS) análisis de proteoma de espectrometría de masas de
alta resolución ( Washburn et al., 2001 ) . Específicamente, utilizamos cerebros de ratón marcados con 15 N como
estándar interno y mezclamos 15N cerebro entero 1: 1 con P30 microglia empobrecido o controlar el cerebro del
compañero de parto para calcular los perfiles relativos de proteínas ( Figura 4 A). Un enfoque similar se utilizó
anteriormente para el análisis cuantitativo de todo el proteoma de las proteínas de larga vida y los cambios de
sinaptosomas durante el desarrollo ( Savas et al., 2012 ). Cuantificamos un total de 6,562 proteínas y encontramos que
los niveles de 61 proteínas se alteraron significativamente como resultado de la depleción de microglia ( Figura
4 B; Tabla S1 ; ANOVA p valor <0.05, log 2 veces cambian ≥ 20%). Es importante destacar que 21/61 (34%) de las
proteínas significativamente alteradas tenían funciones conocidas en la plasticidad / función sináptica, como la
subunidad del receptor postsináptico de glutamato (NMDA) epsilon-2 (GluN2B) y el transportador de glutamato vesicular
presináptico 1 (VGlut1). Además, encontramos que la subunidad 2 del receptor de glutamato (AMPA) (GluA2)
disminuyó, aunque no cumplió con nuestros criterios de significación.
 Para investigar más a fondo la alteración de las proteínas sinápticas después de la depleción de microglia, se generaron
fracciones de sinaptosoma de ratones con depleción de microglia y se compararon con los de los controles no
agotados. En línea con los resultados de nuestra pantalla proteómica, encontramos que VGlut1 y GluA2 disminuyen
significativamente en los sinaptosomas de cerebros con microglia depleted. Aunque la proteína GluN2B se incrementó
en la fracción de todo el cerebro como se muestra en nuestra pantalla proteómica, su nivel disminuyó en la fracción de
sinaptosoma, lo que sugiere una alteración diferencial de GluN2B en las fracciones de sinaptosoma frente a no
sinaptosoma después de la depleción microglial. La subunidad NMDAR GluN2A y la subunidad AMPAR GluA1
permanecieron inalteradas entre los ratones con depleción de microglia y los controles ( Figura 4).C y 4D). Estos
resultados apoyan los datos de nuestra pantalla proteómica y demuestran que los cerebros con depleción de microglia
muestran cambios significativos y específicos de las proteínas sinápticas en las sinapsis glutamatérgicas.
 Para probar si los cambios en la abundancia de las proteínas sinápticas GluN2B, VGlut1 y GluA2 después de la
depleción de microglia afectan a la función sináptica glutamatérgica, se realizaron registros de patch clamp de células
enteras de las neuronas piramidales de la capa V en la corteza motora de ratones P30 1 día después del agotamiento
 de microglia. Encontramos que las frecuencias de las corrientes postsinápticas excitadoras en miniatura de NMDA y
AMPA mediadas (mEPSC) se redujeron significativamente en comparación con los controles ( Figura 4 E-4H), lo que
sugiere una disminución en la liberación espontánea de glutamato en ausencia de microglia. Además, el tiempo de
decaimiento de NMDA mEPSCs, pero no AMPA mEPSCs, se redujo significativamente en animales con microglia
depleted, mientras que la amplitud de NMDA espontánea y AMPA mEPSCs se mantuvo sin cambios ( Figuras 4F y
4H). La disminución en el tiempo de desintegración de los mEPSCs NMDA es consistente con la reducción de las
subunidades GluN2B en ratones desprovistos de microglia, ya que los receptores NMDA dominantes GluN2A tienen
tiempos de desintegración más rápidos ( Chen et al., 1999 ). Tomados en conjunto, estos datos indican que la microglia
desempeña un papel en la regulación del nivel de varias proteínas sinápticas que son importantes para la función de
las sinapsis excitatorias glutamatérgicas en el cerebro.

El BDNF microglial afecta la plasticidad sináptica a través de la vía de señalización del receptor B de
la quinasa relacionada con la tropomiosina
Como los procesos microgliales se ubican muy cerca de las sinapsis, el BDNF microglial podría liberarse para afectar
directamente la estructura y la función de las sinapsis cercanas. Alternativamente, el BDNF microglial podría tener un papel
en la diferenciación microglial o la homeostasis, y la eliminación de BDNF de la microglía podría actuar de forma autocrina
e indirectamente afectar la plasticidad sináptica. Para distinguir entre estas posibilidades, primero comparamos el número
total, la tasa de proliferación y la distribución tisular de microglia entre CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl / fl y CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl
/+
controles, pero encontramos no hay diferencias significativas en ninguno de estos parámetros (Figuras S6 A-S6E). Para
examinar si la pérdida de BGLF microglial podría alterar la asociación de procesos microgliales con espinas dendríticas,
medimos el porcentaje de espinas de las neuronas piramidales de la capa V en la corteza motora que
tenían procesos Iba1 +microgliales dentro de 1 μm y no encontraron diferencias significativas entre CX 3CR1 CreER / + : BDNF fl
/ fl y CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl / + ratones de control ( Figuras S6 F y S6G). Estos resultados demuestran que la pérdida de
BDNF a partir de microglia no altera el número, proliferación o distribución de microglia, o la asociación espacial de
procesos microgliales con espinas dendríticas.

Los hallazgos anteriores sugieren que el BDNF microglial puede liberarse para afectar directamente la plasticidad de las
sinapsis cercanas. El BDNF se produce dentro de las neuronas como un propéptido (proBDNF) que posteriormente se
escinde para generar BDNF maduro (mBDNF). Debido a que las formas pro y madura de BDNF se unen a diferentes
receptores en la superficie de las neuronas (p75 / sortilina y receptores de quinasa relacionados con tropomiosina B [TrkB],
respectivamente) para afectar diferentes procesos celulares ( Chao, 2003 ), preguntamos si, y en que forma, BDNF puede
ser producido y secretado por microglia. Debido a que la proteína BDNF endógena es difícil de detectar debido a la baja
abundancia ( Herzog et al., 1994 ), utilizamos ratones knockin BDNF-hemaglutinina ( BDNF-HA ) en los que el BDNFel gen
se reemplaza por BDNF marcado con HA ( Yang et al., 2009b ). Generamos cultivos purificados de neuronas del
hipocampo o microglia de ratones P1 BDNF-HA / HA (pureza microglial 98,6% ± 0,1%; Figura S6 H) y BDNF marcado con
HA inmunoprecipitado a partir de lisados celulares o medios de cultivo de ambos tipos de células. De acuerdo con los
resultados previos, se pudieron detectar cantidades significativas tanto de proBDNF como de mBDNF tanto en los lisados
celulares como en los medios de cultivo de las neuronas BDNF-HA. Notablemente, ambas formas de BDNF también se
detectaron en lisados celulares y medios de cultivo de cultivos de microglia puros, aunque la distribución de pro-BDNF a
mBDNF en lisados microgliales parecía estar ponderada hacia la forma madura ( Figura 6).UN). Estos resultados
demuestran que la microglia es capaz de producir y secretar tanto pro-BDNF como mBDNF.

Está bien establecido que el BDNF maduro se une a los receptores TrkB ubicados en las neuronas, y la unión de mBDNF
a TrkB desencadena una cascada de señalización que promueve la autofosforilación de TrkB y la plasticidad sináptica
( Chao, 2003 ). De acuerdo con una interacción entre microglia BDNF y receptores TrkB, el análisis de western blot de
sinaptosomas mostró una disminución significativa en los niveles de TrkB fosforilada (p-TrkB) en CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl
/ fl
ratones que carecen de BDNF microglial en comparación con controlar CX 3CR1 CreER / + : BDNF fl / + ratones ( Figura
6SEGUNDO). Para investigar aún más la señalización de microglia BDNF y TrkB, probamos la capacidad de los medios
de cultivos de microglia purificada (medios acondicionados con microglia [MCM]) de CX 3 CR1 CreER / + : BDNF + /

+ o CX 3 CR1 CreER / + : BDNF flox / flox P1 ratones para fosforilar TrkB en cultivos de neuronas corticales purificadas. En 30 min,
MCM de CX 3 CR1 CreER / +
: BDNF + / +
ratones fue capaz de aumentar significativamente la fosforilación de TrkB en
comparación con los niveles basales en cultivos neuronales no tratados. Es importante destacar que MCM generado a
partir de cultivos microgliales desprovistos de BDNF ( Figura S6I) no pudo aumentar la fosforilación de TrkB ( Figuras 6 C
y 6D). Estudios anteriores demostraron que el ATP actúa a través del receptor purinérgico P2X 4 es capaz de aumentar
tanto la síntesis y liberación de BDNF de microglia in vitro ( Trang et al., 2009 ). Para probar si ATP y / o P2X 4 R también
están involucrados en la capacidad de MCM para fosforilar TrkB, tratamos cultivos purificados de microglia con ATP o con
ATP y el antagonista P2X 4R 2 ', 3'- O- (2,4,6-trinitrofenil) -ATP (TNP-ATP) antes de cosechar MCM. El pretratamiento de
cultivos de microglia con ATP aumentó significativamente la capacidad de MCM para fosforilar TrkB, y este aumento se
bloqueó mediante la adición de TNP-ATP a los cultivos ( Figuras 6 C y 6D). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren
que microglial BDNF promueve la plasticidad estructural sináptica que implica la activación de la señalización TrkB
Figura 5. La pérdida de los resultados microgliales del BDNF en los niveles alterados de proteínas sinápticas, la plasticidad
estructural sináptica y la mejora del rendimiento después del aprendizaje

Análisis basado en PCR (A) de WT (BDNF WT ), condicionales no eliminados (BDNF flox ), y condicionales suprimido
(BDNF Δ alelos) de BDNF de CX 3 CR1-EYFP - y CX 3 CR1-EYFP + células clasificadas desde el SNC de CX 3 CR1 CreER / + :
BDNF flox / + o CX 3 CR1 CreER / +: BDNF flox / flox después del tratamiento con tamoxifeno.

(B) Análisis cuantitativo en tiempo real de PCR de ARNm de BDNFaislado de CX 3 CR1-EYFP + microglia purificada a partir
de ratonesBDNF flox / + o BDNF flox / flox ( ** p <0,01, n = 3).
(C) los niveles de proteína promedio total del BDNF en la corteza o el hipocampo de CX 3 CR1 Creer / + : BDNF flox /

+
o CX 3 CR1 Creer / + : BDNF Flox Flox / ratones medidos por ELISA (n = 4).

(D) Fracciones de sinaptosomas de los cerebros de CX 3 CR1 CreER / + : BDNF flox / + o CX 3 CR1 CreER / + : ratones BDNF flox /

flox sondados con los anticuerpos indicados.

(E) Cuantificación densitométrica de transferencias Western en (D) ( *p <0.05, n = 6).

(F) transcraneal de dos fotones de imágenes de las espinas dendríticas en ratones Thy1 YFP cruzado con CX 3 CR1 Creer /
+
: BDNF flox / + o CX 3 CR1 Creer / + : BDNF flox / flox ratones antes o después de la formación rotarod. Las puntas de flecha llenas y
vacías indican espinas que se formaron o eliminaron, respectivamente, entre dos vistas. Asterisk indica filopodia. Barra de
escala, 2 μm.

(G) Porcentaje de espinas existentes que se eliminaron o espinas nuevas que se formaron durante 2 días de entrenamiento
en la corteza motora de ratones BDNF flox / + o BDNF flox / flox ( *** p <0,001, n = 4).

(H) Velocidad promedio alcanzada durante la primera sesión de entrenamiento rotarod (n = 5-7).

(I) Aumento del rendimiento en la tarea de aprendizaje motor durante 1 o 2 días de entrenamiento rotarod ( * p <0,05; barras
de error, SEM; n = 5-7).

(J) Porcentaje de congelación en el control CX 3 CR1 CreER / + : BDNF flox / + y CX 3 CR1 CreER / + : BDNF flox / flox ratones antes (pre-
CS) y durante (CS) presentación del estímulo condicionado en el prueba de recuerdo ( * p <0.05, n = 6-7).

(K) La relación de discriminación del tiempo dedicado a la interacción con un objeto novedoso frente a un objeto familiar
en un ensayo NOR se alteró significativamente en ratones agotados de BDNF microglial ( * p <0,05, n = 8). Los datos se
representan como media ± SEM.

Figura 5. Contexto en el artículo

 Los resultados anteriores muestran que la deleción de microglia causa una reducción en varias proteínas sinápticas
implicadas en la plasticidad y la función sináptica. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la
interacción entre la microglía y las neuronas siguen siendo desconocidos. Para abordar esta cuestión, investigamos el
papel del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en la mediación de las interacciones microglía-
neurona. Elegimos estudiar el BDNF microglial por dos razones: en primer lugar, BDNF existe en muchos tipos de
células, incluida microglia, y se ha demostrado que BDNF de microglia modula la plasticidad neuronal en un modelo
murino de dolor neuropático ( Coull et al., 2005 ). En segundo lugar, BDNF es un potente regulador del desarrollo
sináptico y la plasticidad ( Chao, 2003 ), y aumenta la plasticidad de la espina dendrítica en la corteza del adulto
( Chakravarthy et al., 2006 ), la activación de GluN2B ( Levine et al., 1998 ) y el nivel de VGlut1 ( Melo et al.,
2013 ). Dados nuestros hallazgos de que la depleción de microglia causa una reducción de GluN2B y VGlut1, así como
de la plasticidad de la espina dendrítica, es posible que la falta de BGLF microglial pueda ser la base de algunos de los
fenotipos asociados con la depleción de microglia. Para probar esta posibilidad, cruzamos ratones CX 3CR1 CreER con
ratones que contienen un alelo flojo de BDNF ( BDNF flox ) (Rios et al., 2001 ) para eliminar BDNF de microglia. Primer
lugar, validado este enfoque mediante la clasificación CX 3CR1-EYFP - células o CX 3 CR1-EYFP + microglia de los
cerebros de CX 3 CR1 Creer / + : BDNF fl / + ( BDNF fl / + ), o CX 3 CR1 Creer / + : BDNF fl / fl ( BDNF fl / fl ) ratones que habían recibido
tamoxifeno (Figura S5 A) y analizados para la recombinación del BDNFcondicionalalelo utilizando una estrategia
basada en PCR. Como era de esperar, no se observó recombinación en CX 3 CR1-EYFP -células. Por el contrario, se
observó una fuerte recombinación del alelo floxed en CX 3 CR1-EYFP + microglia de BDNF fl / + o BDNF fl / fl ratones
( Figura 5 A). Después de la administración de tamoxifeno, el nivel de ARNm de BDNF en microglia de CX 3 CR1 CreER /
+
: BDNF fl / fl
ratones se redujo marcadamente en comparación con CX 3 CR1 CreER / +
: BDNF fl / +
controles (Figura
 5B). Curiosamente, los niveles globales de proteína BDNF en la corteza y el hipocampo de CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl /
fl ratones no se modificaron en comparación con CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl / + controles ( Figura 5 C). Tomados en
conjunto, estos resultados indican que BDNF puede eliminarse específicamente de la microglía sin causar una
alteración significativa en el nivel total de la proteína BDNF en la corteza o el hipocampo.
 Para investigar el impacto potencial de la eliminación microglial de BDNF, primero tiñéronse la corteza motora y la
región CA1 del hipocampo para NeuN, caspasa 3 o SV2 escindida, pero no encontraron diferencias significativas en
estos parámetros entre ratones microgliales borrados con BDNF y control ( Figuras S5 B-S5D). Por lo tanto, la
eliminación microglial de BDNF no altera las densidades globales de las neuronas o las sinapsis en la corteza o el
hipocampo. A continuación preguntamos si la eliminación de BDNF de la microglía tenía algún efecto sobre el nivel de
expresión de proteínas sinápticas, la plasticidad sináptica inducida por el aprendizaje motor y la mejora del rendimiento
después del aprendizaje. Realizamos análisis de western blot de sinaptosomas y encontramos una disminución
significativa en los niveles de GluN2B y VGlut1, pero no GluA2, en ratones que carecen de BDNF microglial ( BDNF)fl /
fl ) en comparación con los ratones control ( BDNF fl / + ) ( Figuras 5 D y 5E). Es importante destacar que la eliminación
de BDNF de la microglía resultó en una disminución significativa en la formación de la columna inducida por el
aprendizaje motor, pero no en la eliminación de la columna vertebral, durante 2 días ( Figuras 5 F y 5G). Además,
similar a lo observado para animales con microglia, mientras que la eliminación de BDNF de microglia no tuvo efecto
sobre el funcionamiento basal del rotarod, los ratones que carecen de BDNF microglial demostraron una reducción en
la mejora del rendimiento después del entrenamiento motor en comparación con los controles ( Figuras 5 H y 5I) . Los
ratones que carecen de BGLF microglial también mostraron una respuesta al miedo por congelación significativamente
reducida al estímulo de señal acústica condicionado durante la prueba de recuerdo (Figura 5 J). En la tarea NOR, sin
embargo, los ratones que carecían de BDNF microglial no mostraron una diferencia significativa de los ratones control
( Figura 5 K). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la pérdida de BDNF microglial recapitula varios
defectos observados en ratones con depleción de microglia y sugieren que el BDNF microglial es un importante
regulador de la formación sináptica inducida por el aprendizaje y del comportamiento.
Figura 6. Microglia Produce tanto Pro-BDNF como mBDNF para fosforilar TrkB neuronal

(A) Se cultivaron neuronas o microglia a partir de ratones P1 de animales BDNF-HA o WT. Los lisados celulares o medios
de cultivo se inmunoprecipitaron con un anticuerpo de conejo a HA. Pro-BDNF y mBDNF se detectaron mediante
inmunotransferencia con un segundo anticuerpo para HA (HA1.1 de ratón).

(B) westerns Synaptosome para p-TrkB de CX 3 CR1 CreER / + : BDNF flox / + o CX 3 CR1 CreER / + : BDNF flox / flox ratones ( * p <0,05,
n = 6).

(C) inmunotransferencias representativas de neuronas de rata E18 a los 8 días in vitro, tratadas como se indica.

(D) Cuantificación densitométrica de western blots de p-TrkB en (C) ( *p <0,05, ** p <0,005, n = 9). Los datos se representan
como media ± SEM.

Figura 6. Contexto en el artículo

 Los hallazgos anteriores sugieren que el BDNF microglial puede liberarse para afectar directamente la plasticidad de
las sinapsis cercanas. El BDNF se produce dentro de las neuronas como un propéptido (proBDNF) que posteriormente
se escinde para generar BDNF maduro (mBDNF). Debido a que las formas pro y maduras de BDNF unen diferentes
receptores en la superficie de las neuronas (p75 / sortilina y receptores de quinasa relacionados con tropomiosina B
[TrkB], respectivamente) para afectar diferentes procesos celulares ( Chao, 2003 ), preguntamos si , y en qué forma,
BDNF puede ser producido y secretado por microglia. Debido a que la proteína BDNF endógena es difícil de detectar
debido a la baja abundancia ( Herzog et al., 1994 ), utilizamos ratones BDNF-hemaglutinina knockin ( BDNF-HA ) en
los cuales elEl gen BDNF se reemplaza por BDNF marcado con HA ( Yang et al., 2009b ). Generamos cultivos
purificados de neuronas hipocampales o microglia de ratones P1 BDNF-HA / HA (pureza microglial 98,6% ±
0,1%; Figura S6 H) y BDNF etiquetado con HA inmunoprecipitado a partir de lisados celulares o medios de cultivo de
ambos tipos de células . De acuerdo con los resultados previos, se pudieron detectar cantidades significativas tanto de
proBDNF como de mBDNF tanto en los lisados celulares como en los medios de cultivo de las neuronas BDNF-
 HA. Notablemente, ambas formas de BDNF también se detectaron en lisados celulares y medios de cultivo de cultivos
de microglia puros, aunque la distribución de pro-BDNF a mBDNF en lisados microgliales parecía estar ponderada
hacia la forma madura (Figura 6 A). Estos resultados demuestran que la microglia es capaz de producir y secretar tanto
pro-BDNF como mBDNF.
 Está bien establecido que el BDNF maduro se une a los receptores TrkB ubicados en las neuronas, y la unión de
mBDNF a TrkB desencadena una cascada de señalización que promueve la autofosforilación de TrkB y la plasticidad
sináptica ( Chao, 2003 ). De acuerdo con una interacción entre microglia BDNF y receptores TrkB, el análisis de western
blot de sinaptosomas mostró una disminución significativa en los niveles de TrkB fosforilada (p-TrkB) en CX 3 CR1 CreER
/+
: BDNF fl / fl ratones que carecen de BDNF microglial en comparación con controlar CX 3 CR1 CreER / + : BDNF fl / + ratones
( Figura 6SEGUNDO). Para investigar aún más la señalización de microglia BDNF y TrkB, probamos la capacidad de
los medios de cultivos de microglia purificada (medios acondicionados con microglia [MCM]) de CX 3 CR1 CreER / + : BDNF +
/+
o CX 3 CR1 CreER / + : BDNF flox / flox P1 ratones para fosforilar TrkB en cultivos de neuronas corticales purificadas. En 30
min, MCM de CX 3 CR1 CreER / + : BDNF + / + ratones fue capaz de aumentar significativamente la fosforilación de TrkB en
comparación con los niveles basales en cultivos neuronales no tratados. Es importante destacar que MCM generado a
partir de cultivos microgliales desprovistos de BDNF ( Figura S6 I) no pudo aumentar la fosforilación de TrkB ( Figuras
6 C y 6D). Estudios anteriores demostraron que el ATP actúa a través del receptor purinérgico P2X 4 es capaz de
aumentar tanto la síntesis y liberación de BDNF de microglia in vitro ( Trang et al., 2009 ). Para probar si ATP y / o
P2X 4 R también están involucrados en la capacidad de MCM para fosforilar TrkB, tratamos cultivos purificados de
microglia con ATP o con ATP y el antagonista P2X 4R 2 ', 3'- O- (2,4,6-trinitrofenil) -ATP (TNP-ATP) antes de cosechar
MCM. El pretratamiento de cultivos de microglia con ATP aumentó significativamente la capacidad de MCM para
fosforilar TrkB, y este aumento se bloqueó mediante la adición de TNP-ATP a los cultivos ( Figuras 6 C y 6D). Tomados
en conjunto, estos hallazgos sugieren que microglial BDNF promueve la plasticidad estructural sináptica que implica la
activación de la señalización TrkB.

Discusión
La falta de herramientas para perturbar específicamente la microglía en puntos de tiempo definidos en un animal vivo ha
dificultado delinear las funciones precisas de la microglía en el cerebro fisiológico. En este trabajo, hemos generado una
herramienta que permite la manipulación específica e inducible de números y funciones microgliales dentro del
SNC. Usando esta herramienta, hemos revelado un papel fisiológico de la microglía en el aprendizaje y el aprendizaje de
la remodelación estructural sináptica asociada al aprendizaje. Además, el uso de ratones CX 3 CR1 CreER nos permitió
descubrir un papel importante del BDNF microglial en estos procesos.

Interacciones entre Microglia y Neuronas: promoción de la formación de sinapsis inducida por el

aprendizaje
Los procesos microgliales son constantemente móviles en el cerebro fisiológico y se encuentran muy cerca de las sinapsis
tanto en la corteza postnatal temprana como en la adulta ( Davalos et al., 2005 , Tremblay et al., 2010 , Wake et al.,
2009 ). El resultado funcional de la interacción microglial con las neuronas parece depender de la etapa de desarrollo del
SNC. En el cerebro embrionario, que tiene altos niveles de muerte celular neuronal programada, se ha observado que
microglia fagocita las neuronas apoptóticas ( Peri y Nüsslein-Volhard, 2008 ) o participa activamente en la muerte de
neuronas ( Marín-Teva et al., 2004).) En el tectum óptico del pez cebra embrionario, la microglia parece jugar un papel en
la homeostasis de la actividad neuronal mediante el silenciamiento de las neuronas a través de un mecanismo dependiente
del contacto ( Li et al., 2012 ). Trabajos recientes han demostrado que los ratones que carecen de CX 3 CR1 han retrasado
la invasión de los campos del barril cortical por microglia, y un retraso transitorio en la conmutación de la subunidad del
receptor AMPA normalmente observada en las sinapsis del cólax del tálamocortical ( Hoshiko et al., 2012 ). Además,
recientemente se propuso que la microglía está involucrada en la absorción activa de las sinapsis en el hipocampo y el
núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) durante el desarrollo postnatal temprano ( Paolicelli et al., 2011 , Schafer et al.,
2012).) Se cree que la poda de las sinapsis dentro del dLGN depende de la presencia de CR3 , que puede interactuar con
la proteína C3 sinapticamente localizada que actúa como una señal positiva para la fagocitosis de los terminales axonales
presinápticos.

Aprovechando los ratones CX 3 CR1 CreER y las imágenes de dos fotones transcraneales, observamos una disminución
significativa en la formación inducida por aprendizaje de espinas dendríticas postsinápticas en ausencia de microglia o
BGLF microglial en ratones adultos jóvenes y adultos. Dos líneas de evidencia sugieren que la principal función sináptica
de la microglía en el cerebro maduro es la promoción de la formación de la espina dendrítica en lugar de la eliminación de
la columna vertebral. En primer lugar, la eliminación de BDNF de la microglía causa una disminución significativa en la
formación de la espina inducida por el aprendizaje, pero no en la eliminación de la columna vertebral, durante 2 días. En
segundo lugar, estudios previos han demostrado que la formación de la columna vertebral inducida por el aprendizaje
motor ocurre 2 días antes de la eliminación de la columna, y que los grados de formación y eliminación de la columna
vertebral están fuertemente correlacionados (Liston et al., 2013 , Yang et al., 2009a ). Por lo tanto, la disminución de la
eliminación de la columna observada en ausencia de microglía puede ser simplemente el resultado de la formación de
menos espinas después del aprendizaje motor. Vale la pena señalar que también observamos una disminución en la
formación y eliminación de la columna vertebral en P19. Esto aumenta la posibilidad de que la microglia tenga una función
importante en promover la formación de sinapsis no solo durante la etapa postnatal tardía y la edad adulta, sino también
durante el período posnatal temprano (por ejemplo, la primera semana posnatal), cuando la sinaptogénesis y la poda son
extensas.

Estudios previos han demostrado que la formación de sinapsis dependiente del aprendizaje se correlaciona fuertemente
con la mejora del rendimiento después del aprendizaje ( Liston et al., 2013 , Yang et al., 2009a) Concomitantemente con
la reducción de la formación de espina inducida por el aprendizaje, observamos una disminución significativa en la mejora
del rendimiento después del aprendizaje rotarod en ausencia de microglia o microglial BDNF. Además, encontramos que
microglia tiene un papel importante en el aprendizaje del miedo y las tareas NOR. Estos resultados subrayan la importante
función de la microglía en la formación de correlaciones estructurales de experiencias de aprendizaje que son críticas para
el desempeño conductual. Estos hallazgos también sugieren que las disfunciones microgliales pueden causar una
reducción de la formación sináptica dependiente del aprendizaje y contribuir a los déficits de aprendizaje en enfermedades
neurológicas. Además, debido a que la activación de la microglía es común en muchas enfermedades neurodegenerativas
y acompaña a las alteraciones de la expresión génica, la activación de microglia puede comprometer la función fisiológica
de la microglía y contribuir a la fisiopatología de la enfermedad. Uso futuro deLos ratones CX 3 CR1 CreER para activar e
inactivar importantes vías de señalización en la microglía ayudarán a abordar estas cuestiones.
El papel del BDNF microglial en la plasticidad y la función sináptica
La neurotrofina BDNF es un mediador crítico de la supervivencia neuronal, la diferenciación y la plasticidad ( Chao,
2003 ). Aunque la principal fuente de BDNF en el cerebro adulto parece ser las neuronas ( Rauskolb et al., 2010 ), BDNF
también se puede detectar en oligodendrocitos, astrocitos y microglia ( Dougherty et al., 2000 ). A través de la inactivación
genética condicional, hemos determinado que el BDNF microglial también juega un papel importante en el cerebro sano
mediante la regulación de la formación de sinapsis inducida por el aprendizaje. Nuestros resultados que muestran que los
niveles globales de proteína BDNF no cambian en ausencia de BDNF microglial están de acuerdo con los hallazgos previos
de que pequeños cambios en los niveles de BDNF o la presencia de un SNP en el BDNFel gen podría tener efectos
neurológicos significativos ( Greenberg et al., 2009 ). Debido a que los procesos microgliales son altamente móviles y se
encuentran muy próximos a las terminales sinápticas ( Davalos et al., 2005 , Tremblay et al., 2010 , Wake et al., 2009 ),
nuestros datos plantean la posibilidad de que la liberación de BDNF a partir de microglia pueda ser regulado de manera
localizada y / o dependiente de la actividad. De hecho, la mayoría de la liberación de BDNF por las neuronas en el cerebro
adulto parece ser desencadenada por la actividad neuronal ( Balkowiec y Katz, 2000 ). Es atractivo especular que BDNF
puede secretarse de procesos microgliales para modular específicamente un subconjunto de conexiones sinápticas
involucradas en una tarea de aprendizaje particular.

¿A través de qué mecanismos ejerce el microglial BDNF sus efectos sobre el SNC? Nuestros resultados sugieren que, al
igual que el BDNF neuronal, el BDNF microglial podría actuar sobre TrkB neuronal y modular la transmisión sináptica
glutamatérgica y la plasticidad ( Rex et al., 2007 ). Microglial BDNF también podría afectar la transmisión sináptica
inhibitoria a través de la señalización TrkB, como se ha demostrado en la médula espinal ( Coull et al., 2005 ) y el
hipocampo ( Zheng et al., 2011 ). Además, la propia microglía expresa TrkB activado y se ha demostrado que el BDNF
liberado a partir de microglia aumenta su proliferación ( Spencer-Segal et al., 2011) Aunque no podemos detectar cambios
en el número o la distribución espacial de la microglía en ratones que carecen de BGLF microglial, sería interesante
investigar si el BDNF microglial puede actuar de forma autocrina para influir en la función microglial. Un área igualmente
interesante para una mayor investigación son las señales que desencadenan la liberación de BDNF desde la microglía
dentro de la corteza. Varias líneas de evidencia sugieren que un estímulo principal para la liberación de BDNF a partir de
microglia es la unión de ATP al receptor purinérgico P2X 4 R. Porque el ATP se libera en sitios de transmisión sináptica
activa ( Khakh y North, 2012 ) y actúa como un potente quimioatrayente para procesos microgliales ( Davalos et al., 2005)),
una posibilidad intrigante es que ATP recluta procesos microgliales a las sinapsis activas donde posteriormente liberan
BDNF. Nuestros experimentos in vitro sugieren que los receptores P2X 4podrían desempeñar un papel importante en la
promoción de la liberación de BDNF y la fosforilación de TrkB. Sin embargo, queda por determinar si el nivel basal de
los receptores P2X 4 es suficiente para promover la liberación de BDNF en el SNC normal, o si otros factores también
contribuyen. Por último, la microglia puede modular las funciones sinápticas en el sistema nervioso central sano que son
independientes del BDNF. Nuestra pantalla de proteómica identificó numerosas proteínas con funciones sinápticas
conocidas que se alteraron en ausencia de microglia ( Tabla S1 ). Estudios futuros con CX 3 CR1 CreER se requiere que los
ratones entiendan mejor cómo la microglía afecta la plasticidad sináptica y la función a través del BDNF y otras vías de
señalización tanto en el cerebro en desarrollo como en el adulto.