CAPÍTULO
Electroforesis
David Alejandro López de la Mora • Ana Soledad Sandoval Rodríguez
Introducción
En biología molecular, una gran cantidad de técni­
cas que se realizan comúnmente requiere el uso de la
electroforesis, lo que supone una parte importante del
procedimiento sistemático del análisis (separación, puri­
ficación, preparación) de los ácidos nucleicos y las pro­
teínas. La mayoría de las biomoléculas poseen una carga
eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio en
el que se encuentran; como consecuencia, pueden des­
plazarse cuando se someten a un campo eléctrico hacia
el polo de carga opuesta al de la molécula. A diferencia
de las proteínas, que pueden tener una carga positiva o
negativa, los ácidos nucleicos sólo poseen carga negati­
va, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en
una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia
el polo positivo, es decir, el ánodo. En el caso de las
proteínas, que suelen ser de carga neutra, se realiza pre­
tratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de
sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se
homogeneizan las proteínas de la muestra y todas migra­
rán hacia el polo positivo; sólo se separarán por tamaño.
El principio de la electroforesis consiste en la mi­
gración proporcional de las moléculas a través de un gel
u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o
tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico.
Elementos necesarios para una
electroforesis
Para realizar una electroforesis se requiere de una serie de
elementos descritos a continuación y enlistados en la fi-
gura 13-1.
Cámara de electroforesis
La cámara de electroforesis es un dispositivo que permite la
generación de un campo eléctrico alrededor de un gel en el
que se depositan las muestras. Este campo se genera dentro
de una solución amortiguadora en la que se encuentra su-
mergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido
de electrolitos permite la transmisión de la corriente eléc-
trica, manteniendo el pH estable al paso de la corriente. La
cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente
de energía. En las cámaras de electroforesis vertical el polo
positivo se encuentra en la parte inferior de la cámara (fi-
gura 13-2A) y en las horizontales, en uno de los extremos
(figura 13-2B). En ambos tipos de cámaras el polo positivo
se identifica con color rojo y el negativo con negro.
13
Gel
La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con
la finalidad de evitar perturbaciones mecánicas durante la
separación. El soporte idóneo es un gel semisólido o gela-
tinoso, compuesto por polímeros que forman una especie
de malla o microporos tridimensionales a través de los cua-
les las moléculas avanzan, según el peso molecular, lo que
permite la separación por tamaño de los diferentes com-
ponentes de la muestra. Los geles pueden ser de agarosa
o poliacrilamida. Para la separación de ácidos nucleicos se
usan geles de agarosa o acrilamida y para proteínas, sólo
de acrilamida.
Geles de agarosa
La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que
tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a tem-
peratura ambiente, que se disuelve con facilidad en tempe-
ratura de 50 a 60°C, se torna líquida y se solidifica cuando
se enfría formando un gel altamente poroso. El gel de aga-
rosa es la manera más efectiva de separar fragmentos de
ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid)
que van de 100 pb a 25 kb. Para elaborar el gel se pesa la
cantidad de agarosa requerida, se disuelve en una solución
amortiguadora adecuada de la misma composición y con-
centración que el buffer de corrimiento y se calienta hasta
formar una solución. Sin dejar enfriar, se vacía de forma
inmediata sobre un molde de forma rectangular y en uno
de los extremos se coloca un aditamento en forma de peine
con la finalidad de generar los pocillos u orificios en los que
se colocarán las muestras (figura 13-3). La agarosa posee
ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto
tóxico y permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con
pesos moleculares variados, según la concentración de
agarosa que se emplee. Sin embargo, su poder de resolu-
ción es menor que el de los geles de poliacrilamida. La con-
centración de agarosa se escoge según el tamaño del ácido
nucleico que se vaya a analizar (cuadro 13-1). El tamaño de
los poros de la matriz del gel depende de la concentración
de agarosa utilizada y la concentración de agarosa es inver-
samente proporcional al tamaño del poro obtenido; esto
es, a mayor concentración, menor tamaño de los poros, y
viceversa, si los poros son pequeños la migración del ácido
nucleico es más lenta. La figura 13-4 representa la migra-
ción de las moléculas de DNA en un gel de agarosa. Du-
rante la electroforesis, los ácidos nucleicos lineales con un
peso molecular alto migran al ánodo con más lentitud que
los de menor peso molecular. Esto se debe a que los ácidos
118 Metodología del DNA recombinante

Cámara de A)
electroforesis Peine para pocillos

MIGRACIÓN DE LA MUESTRA
Gel

Transiluminador Fuente de poder B)

100

MIGRACIÓN DE LA MUESTRA

Figura 13-2.  Cámaras de electroforesis. A) En las cámaras de

Buffer de corrimiento

Marcador de peso

BUFFER
Buffer de carga

electroforesis vertical el corrimiento de la muestra sigue la

gravedad, ya que el polo positivo se encuentra en la parte
Buffer
molecular

1KB

inferior de la cámara. B) En la electroforesis horizontal debe

cuidarse que el ánodo se coloque hacia el extremo del gel
donde corren las muestras, de lo contrario las muestras se
saldrán del gel.
Figura 13-1.  Elementos necesarios para una electroforesis.
En la imagen se aprecian los elementos que se requieren para
el corrimiento electroforético y visualización del gel. geles con un amplio intervalo de tamaños de poro. El gel de
poliacrilamida es el resultado de la polimerización quími-
ca de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. El tamaño
nucleicos de peso elevado tardan más tiempo en atrave- del poro de un gel de acrilamida está determinado por la
sar los poros de agarosa. En el caso de ácidos nucleicos no concentración total de acrilamida presente (acrilamida +
linearizados, como plásmidos circulares (conformación bisacrilamida), que generalmente se maneja en proporción
nativa), ácido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) con
estructuras secundarias o DNA de gran longitud, la mi-
gración no sólo depende del peso molecular, sino también
del grado de empaquetamiento que presenten. En la elec-
troforesis de un plásmido, por ejemplo, se visualizan tres
conformaciones distintas de la misma molécula: la forma
superenrrollada, la semirrelajada y una relajada. Esto se re-
fleja en tres bandas de “tamaño” diferente, aunque se trate
del mismo plásmido (figura 13-5). Por ello, antes de una
electroforesis es importante la linearización y la elimina-
ción de estructuras secundarias por desnaturalización de Figura 13-3.  Preparación de un gel de agarosa. La agarosa es
la muestra. La concentración de agarosa más utilizada para un polvo que para disolverse requiere calentarse hasta la
electroforesis de ácidos nucleicos es de 0.5 a dos por ciento. ebullición del solvente. Una vez obtenida la solución de
agarosa, antes de que se enfríe a menos de 50°C se coloca
Geles de acrilamida en una cámara para formar el gel. El gel se coloca de manera
que los pocillos queden en el extremo donde se localiza el
La acrilamida es un polímero sintético, termoestable, inco- polo negativo de la cámara de electroforesis, para permitir que
loro y químicamente inerte, con el que se pueden generar la muestra corra a lo largo del gel.

Muestra
Migración
Patrón o
Ladder
Banda de DNA
Gel
Figura 13-4.  Electroforesis de ácidos nucleicos. Se representa
un gel de agarosa en el cual se visualiza un marcador de peso
molecular junto a las muestras para ayudar en la determi-
nación del peso molecular de los fragmentos. La muestra se
carga en los pocillos y se deja correr hacia el polo negativo.
de 19:1. Regulando la concentración de ambas y su propor-
ción se consiguen distintas porosidades, siempre menores
que la de los geles de agarosa. Cuando la acrilamida se en-
cuentra en disolución acuosa experimenta autopolimeri-
zación de forma espontánea y lenta, con el resultado de
que las moléculas de acrilamida se unen cabeza con cola.
En presencia de un sistema generador de radicales libres
se da una polimerización vinílica en la cual se activan los
monómeros de acrilamida, quedan en estado de radical
libre y reaccionan rápidamente para formar polímeros de
A
B diográfica y registro permanente. La electroforesis con geles
C superior o concentrador y un gel inferior de separación o
Figura 13-5.  Perfil electroforético de un plásmido. Aunque
la molécula de DNA (en este caso un plásmido) tenga la
misma longitud en pb, puede demostrar diversos patrones
de corrimiento electroforético según la conformación de la
estructura. A) Plásmido superenrrollado. B) Plásmido circular.
C) Plásmido linearizado.
Electroforesis 119
Cuadro 13-1.  Concentraciones de agarosa para geles de ácidos
nucleicos. El cuadro indica las concentraciones de agarosa
recomendadas según el peso molecular que se espera encon-
trar en las muestras. Al aumentar la concentración de agarosa
se reduce el poro del gel, lo que permite la discriminación de
fragmentos de menor tamaño.
Agarosa (%) Tamaño de banda
0.3 > 700 pb
0.5 700 pb a 25 kb
0.8 500 pb a 15 kb
1.0 250 pb a 12 kb
1.2 150 pb a 6 kb
1.5 80 pb a 4 kb
2.0 100 pb a 3 kb
3.0 500 pb a 1 kb
4.0 100 pb a 500 pb
6.0 10 pb a 100 pb
cadena larga. El polímero en disolución no forma un gel,
sino que se encuentra en estado viscoso debido a que las
cadenas pueden deslizarse unas sobre otras; la formación
del gel requiere que varias cadenas queden trabadas (lo
que se consigue con la bisacrilamida). La acrilamida es una
neurotoxina, por lo que debe manejarse con precaución.
También es esencial almacenarla en un lugar refrigerado,
seco y oscuro para reducir la autopolimerización y la hi-
drólisis. La bisacrilamida, o N,N´-metilenbisacrilamida,
está compuesta por dos moléculas de poliacrilamida enla-
zadas por sus grupos amino, no reactivos. Este compuesto
se polimeriza junto con la acrilamida y establece puentes
entre las cadenas lineales de poliacrilamida, con lo que se
evita su deslizamiento y conduce a la formación del gel. El
gel de acrilamida es capaz de soportar mayores voltajes que
la agarosa y es susceptible de teñirse por varios procedi­
mientos; también puede desteñirse en caso necesario. Los
geles de acrilamida pueden digerirse para extraer fraccio-
nes separadas (bandas) o desecados para su exposición ra-
de acrilamida siempre se realiza en cámaras verticales. La
electroforesis de proteínas emplea geles de acrilamida de
dos capas a diferente concentración de acrilamida, un gel
de resolución. El gel de concentración tiene un tamaño de
poro grande y se prepara con un amortiguador de Tris/HCl
con pH de 6.8, dos unidades de pH menor que el buffer
de corrimiento hecho de Tris/SDS/glicina. Estas condi-
ciones proporcionan un ambiente para que las proteínas
recubiertas con SDS se concentren. El tamaño del gel de
120 Metodología del DNA recombinante
apilamiento debe ser del doble de la altura del pozo donde
se va aplicar la muestra. Este gel se coloca sobre el gel
de resolución, un gel de poliacrilamida de poro pequeño
hecho de un amortiguador de Tris/HCl, con un pH de 8.8.
En el gel de resolución es donde las proteínas se separan de
acuerdo con su tamaño, de manera dependiente del por-
centaje de acrilamida utilizado para su preparación, como
se describe en el cuadro 13-2. La adición de SDS a los geles
de poliacrilamida es opcional; cuando se hace, mantiene a
las proteínas en estado extendido, lo que facilita la movilidad
electroforética de la proteína mediante el gel y permite que la
movilidad dependa exclusivamente de su masa molecular.
En la figura 13-6 se representa la electroforesis de proteí-
nas en gel de acrilamida.
Buffer de corrimiento
El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH
que el buffer con el que se prepara el gel de resolución, ya
sea de agarosa o de acrilamida. Éste proporciona el medio
para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el
pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. En
el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE
como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris
base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El
buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajus-
tado a pH 8.5. El buffer de corrimiento de electroforesis de
proteínas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM,
a un pH 8.3.
Marcador de peso molecular
Los marcadores de peso molecular son una mezcla de mo-
léculas de DNA o de proteínas de tamaño conocido que
permiten determinar por comparación el tamaño de las
moléculas (ácidos nucleicos o proteínas) contenidos en
Cuadro 13-2.  Concentraciones de acrilamida para geles
de ácidos nucleicos. El cuadro indica las concentraciones de
acrilamida recomendadas según el peso molecular que se
espera encontrar en las muestras. Al aumentar la concentra-
ción de acrilamida se reduce el poro del gel, lo que permite la
discriminación de fragmentos de menor tamaño.
Acrilamida (%) Pares de bases
3.5 1 000 a 2 000
5.0 80 a 500
8.0 60 a 400
12.0 40 a 200
15.0 25 a 150
20.0 6 a 100
Muestra
Gel de
Migración
empacamiento
Patrón o
Ladder
Banda de
proteínas
Gel de
resolución
Figura 13-6.  Electroforesis de proteínas. Las proteínas se
corren en geles de acrilamida formados por dos fases.
Una fase superior donde las moléculas se concentran y una
inferior donde la muestra se separa en sus componentes
según su peso molecular. Al estar pretratadas con SDS, las
proteínas se rodean de cargas negativas, lo que les permite
migrar hacia el polo positivo con independencia de su carga
inicial.
las muestras sometidas a electroforesis. Los marcadores de
peso molecular están disponibles comercialmente en una
amplia variedad. En el caso de marcadores de peso mo-
lecular de ácidos nucleicos, éstos pueden ser bacteriófagos
o plásmidos sometidos a corte con enzimas de restricción
que generan fragmentos de diversos tamaños; también
puede tratarse de moléculas de DNA sintéticas denomina-
das escaleras, porque contienen fragmentos con incremen-
tos de tamaño gradual. En la figura 13-7 se pueden ver las
bandas que se obtienen de los fragmentos con un marca-
dor de uso común, como es el fago Phi X174/Hae III y una
escalera denominada 1 Kbase plus ladder. Los marcadores
de peso molecular de proteínas suelen ser una serie de pro-
teínas de peso molecular conocido (que van desde 10 hasta
300 kDa), las cuales pueden estar teñidas o coloreadas. En
los casos en que la electroforesis sea un paso previo para
la técnica de Western blot, también se dispone de marca-
dores de peso molecular de proteínas recombinantes que
contienen un sitio de unión a inmunoglobulina (Ig) G. El
sitio de unión a IgG puede ser reconocido por un anticuer-
po primario o secundario empleado para la detección de la
proteína buscada por Western blot. Este sistema es com-
patible con quimioluminiscencia, el marcaje cromogénico
y la fluorescencia.
 Electroforesis 121

molécula cromogénica que emite energía fluorescente y

12 000 permite visualizarla. El transiluminador es el sistema em-
pleado con más frecuencia por ser simple y efectivo. En
1 353
1 078 general emiten energía a una longitud de onda a 302 nm,
872 5 000 aunque también existen para 254 y 365 nm; suelen contar
603
con un botón para baja/alta intensidades por si se requiere
una menor exposición de la muestra a la luz ultravioleta.
Algunos también permiten la selección de entre dos longi-
tudes de onda, lo que los hace más flexibles. Los epitrans­
310 iluminadores (365, 480 nm) generan la emisión visible por
271 281 2 000
fluorescencia igual que el transiluminador pero, a diferen-
234
1 650 cia de éste, la fuente de energía se encuentra reflejada y no
194 pasa a través de la muestra. El epiiluminador es efectivo en
geles muy densos.
Una vez que se tienen los materiales necesarios existen
1 000
188 dos maneras de realizar la electroforesis: de forma hori-
850 zontal y vertical.
650
72
Electroforesis horizontal
500
Se lleva a cabo con gel de agarosa para ácidos nucleicos.
400
Para el corrimiento el buffer debe cubrir el gel, con la fina-
300 lidad de evitar que se seque por el calentamiento inducido
por el paso de la corriente eléctrica. Al momento de cargar
200 las muestras en los pocillos, se puede optar por hacerlo en
100
seco; esto es, llenar parcialmente la cámara con líquido de
corrimiento de tal manera que la parte superior del gel no
se cubra de buffer para que los pocillos puedan llenarse sin
Figura 13-7.  Marcadores de peso molecular para DNA. En la interferencia del líquido. Una vez cargada la muestra, se
la imagen el primer carril corresponde a las bandas que se corre por unos minutos a bajo voltaje hasta que la muestra
obtienen de los fragmentos con un marcador como es el fago entre en el gel y entonces se cubre del todo con el buffer de
Phi X174 digerido por la enzima Hae III, mientras el segundo corrimiento. También existe la técnica denominada elec-
carril muestra los fragmentos de una escalera formada por
troforesis submarina, en la que la totalidad del gel se cubre
segmentos sintéticos de DNA.
con buffer de corrimiento, desde el momento de cargar las
muestras en los pocillos, como se ejemplifica en la figura
13-8. En esta técnica el buffer siempre debe cubrir el gel, y
Buffer de carga se llama submarina porque la muestra se coloca con el gel
Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad sumergido en el buffer.
y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el poci-
llo y evita su salida del gel; permite, además, monitorear el
corrimiento de la muestra en el gel. Se emplea en relación Electroforesis vertical
1:3 para ácidos nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a la
Empleada de forma exclusiva con gel de poliacrilamida, se
cantidad de muestra. El buffer de carga de ácidos nucleicos
utiliza para proteínas o ácidos nucleicos de pequeño tama-
contiene Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glice-
ño. El gel debe estar contenido entre dos placas rectangula-
rol. Mientras que el buffer de carga para proteínas contiene
res de vidrio donde la corriente eléctrica se genera gracias
Tris-HCl, pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul
al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las
de bromofenol. En el caso de que se deseen condiciones
cubetas o compartimientos del ánodo y el cátodo como se
reductoras y desnaturalizantes, deberá añadirse betamer-
aprecia en la figura 13-9.
captoetanol a este buffer y habrá que calentar las muestras
a 95°C por cinco minutos.
Procedimiento general de una
Transiluminador ultravioleta electroforesis
El transiluminador es un aparato que transmite luz del es- A continuación se exponen los pasos de los que consta una
pectro ultravioleta a través de la muestra, lo cual excita la electroforesis típica.
122 Metodología del DNA recombinante
– +
Migración de la muestra
Figura 13-8.  Ejemplificación de electroforesis submarina. La
muestra se coloca después de haber vertido el buffer de
corrimiento y retirado el peine que sirve de molde para la
formación de los pocillos.
 1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentra-
ción requerida.
 2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga
adecuado.
 3. Cargar las muestras en el gel.
 4. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente.
 5. Visualizar los ácidos nucleicos o las proteínas.
Electroforesis de ácidos nucleicos
El método más común para la electroforesis de DNA es
elaborar un gel horizontal de agarosa, con una concentra-
ción de 0.5 a 2%. La carga eléctrica de la molécula de DNA
la otorgan sus grupos fosfato, de carga negativa, y cuyo nú-
Figura 13-9.  Electroforesis vertical. En esta cámara se aprecia cómo el gel de acrilamida ha quedado embebido en el buffer de
corrimiento en su extremo superior gracias a la colocación de amortiguador en la parte interna de la cámara. El buffer de la parte
externa permite que el polo positivo cuente con la misma solución buffer que transmita la corriente a la parte inferior del gel.
mero es igual al doble del número de pares de bases. Dado
que la forma de la molécula de DNA siempre es la misma,
la movilidad de la electroforesis dependerá únicamente
de la longitud del DNA (pb) y se representará en bandas
(figura 13-10). El corrimiento se realiza a voltajes de entre
25 y 100 V; a mayor voltaje mayor velocidad de corrimien-
to. El avance electroforético se monitorea a través de la vi-
sualización de los colorantes (azul de bromofenol y azul de
xileno) contenidos en el buffer de carga con el que se mez-
cló la muestra previa a su colocación en el pocillo. Si los
fragmentos de DNA son pequeños (menos de 50 pb) o bien
se requiere discernir entre fragmentos de ácidos nucleicos
con una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, se recomienda
utilizar un gel de poliacrilamida que permita esta resolu-
ción. Las agarosas con un punto de fusión bajo permiten la
preparación de geles a elevadas concentraciones y se acon-
seja para obtener una buena separación de moléculas de
DNA con < 1 000 pb. Son ideales para preparar geles analí-
ticos de productos procedentes de técnicas de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction)
u otras. Algunas son capaces de separar fragmentos que
difieren entre 10 y 20 pb. Para la preparación del gel debe
estandarizarse primero qué concentración de agarosa es la
más adecuada, según la muestra que se desee separar.
El volumen de agarosa depende del tamaño de la cá-
mara de electroforesis; 20 a 25 ml son suficientes para
las dimensiones más comunes del gel: 8 × 6 × 0.5 cm
(L × A × A). Inmediatamente después de vaciar la agarosa
a la cámara, debe insertarse el o los peines necesarios. La
agarosa tarda en solidificar alrededor de 20 min, mientras
que la poliacrilamida, unos 30 min. Una vez solidificado el
gel, se añade el buffer de corrimiento (TAE o TBE) a con-
centración 1X, cubriendo perfectamente el gel (0.5 a 1 cm
por encima del gel) y se retiran los peines. Las muestras se
Buffer interno
Buffer externo

Mayor intensidad
Mayor tamaño
Menor intensidad
Menor tamaño
Figura 13-10.  Movilidad de fragmentos de DNA. La imagen
muestra fragmentos de DNA de mayor a menor tamaño
(parte superior hacia parte inferior) visualizados con un agente
intercalante. Se aprecia cómo la intensidad de la banda obser-
vada es variable, lo que indica groso modo cuál fragmento se
encuentra en mayor cantidad y cuál en menor.
mezclan con el buffer de carga y se depositan de forma cui-
dadosa en los pocillos, con lo que se evita que se salgan y
puedan contaminar el pocillo contiguo. Debe considerarse
el uso de un marcador de peso molecular en, por lo menos,
uno de los carriles, para la determinación del peso molecu-
lar de la muestra. Este marcador también debe mezclarse
con un buffer de carga, excepto cuando ya viene preparado
para su uso de la casa comercial en que se obtuvo.
Una vez depositadas las muestras en los pocillos, se
procede a la transmisión de la corriente eléctrica. Se co-
nectan los cables de la fuente de energía de cada polo eléc-
trico a la cámara de electroforesis en el electrodo que le
corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el peso
molecular de las moléculas de DNA que se va a separar.
Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb)
se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100
V. Para muestras de DNA genómico y plasmídico (> 2 kb)
se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V. En la figu-
ra 13-11 se aprecia una fuente de energía, con su pantalla,
que indica el amperaje. Es importante que se estandarice el
tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor reso-
lución posible.
Durante el corrimiento se monitorea la migración de
la muestra con colores que contiene el buffer de carga, en
que se observa el color azul y el verde correspondientes
a los colorantes azul de bromofenol y azul de xileno, de
forma respectiva. En geles de agarosa, dentro del rango
Electroforesis 123
V
mA
V/A
STOP RUN/PAUSE VOLTS/AMPER
Figura 13-11.  Fuente de poder. La imagen muestra una típica
fuente de poder donde se indica el miliamperaje a que está
siendo corrida la muestra. La selección de las condiciones de
corrimiento puede ser con un amperaje constante o bien a
voltaje constante, como en este caso.
de 0.5 y 1.5%, el azul de xileno migra de manera similar
a un fragmento de DNA de 4 kb, mientras que el azul de
bromofenol se comporta como un fragmento de 300 pb.
La electroforesis se detiene cuando se considera que la
muestra se localiza en la posición deseada, o bien cuando
la muestra ha corrido por lo menos tres cuartas partes
del gel.
Hay múltiples factores que pueden afectar la migra-
ción del DNA, como la concentración del gel utilizado, el
tamaño de la molécula de DNA muestra, el empaqueta-
miento del DNA, el voltaje, la temperatura del buffer de
corrimiento (que puede aumentar demasiado si el voltaje
es muy alto), la contaminación con agentes intercalantes
en la muestra, la composición del buffer de corrimiento,
etcétera.
Visualización de las muestras
Para la visualización de los ácidos nucleicos se utiliza un
colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que tiene la
propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del
DNA y el RNA. Debido a esta propiedad es un agente mu-
tagénico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de
etidio, por lo general, se incorpora a la agarosa (0.5 mg/
ml) antes de permitir la solidificación, o puede incorporar-
se luego del corrimiento, incubando el gel en una solución
que lo contenga a 0.5 mg/ml. El bromuro de etidio emite
fluorescencia de color naranja cuando se expone a la luz ul-
travioleta con longitud de absorción de 254 nm, y longitud
de emisión de 366 nm. La señal fluorescente es proporcio-
nal a la cantidad de producto, como puede observarse en
la figura 13-12. Su sensibilidad permite detectar cerca de
30 pg de ácido nucleico por banda (según el grosor del gel).
El bromuro de etidio es teratogénico, mutagénico y cance-
rígeno, por lo que para este procedimiento se recomienda
124 Metodología del DNA recombinante
el uso de guantes. En la actualidad, el bromuro de etidio
se ha sustituido por un compuesto comercial, SYBR® Safe,
que se une de manera no covalente a los ácidos nucleicos.
Este colorante tiene una fluorescencia a 280, una excita-
ción máxima a 502 nm y una emisión máxima a 530 nm.
Con este colorante, el DNA puede visualizarse con una luz
ultravioleta en el rango de 470 a 530 nm. Por otro lado,
el colorante de cianina asimétrico el SYBR®-Green es un
fluoróforo que se une con gran afinidad al surco menor del
DNA bicatenario, y es unas 25 veces más fluorescente que
el bromuro de etidio. Este colorante con epiiluminación de
254 nm puede detectar 60 pg de dsDNA/banda; 1 a 2 ng
de oligonucleótidos, y 100 a 300 pg de RNA o ssDNA/banda.
Para los geles de acrilamida una alternativa al bromuro de
etidio es el nitrato de plata; sin embargo, éste utiliza reac-
tivos peligrosos, como el formaldehído. Por otro lado, la
tinción con plata es más sensible que el bromuro de etidio,
más barata a largo plazo y menos tóxica. En la figura 13-12
se aprecia una muestra visualizada por bromuro de etidio
y otra por SYBR® Safe.
Electroforesis de proteínas
El método más empleado para electroforesis de proteínas
se lleva a cabo en un sistema discontinuo; es decir, un
gel conformado por dos geles de poliacrilamida (uno de
resolución y otro de compactamiento), que difieren en su
concentración, composición y pH. Los geles están unidos
pero limitados por una fase de separación visible a contra
luz; para lograrlo, deben prepararse por separado, espe-
A)
Figura 13-12.  Visualización de fragmentos de DNA. Estas imágenes son de un gel de agarosa donde la muestra fue visualizada por
A) bromuro de etidio y B) colorante de cianina asimétrico (SyberR-Green).
rando la polimerización total del primero, para continuar
con la del segundo; de lo contrario, en estado líquido, se
mezclarían.
Para el caso de los geles de acrilamida para ácidos
nucleicos sólo se tiene una fase, conformada por el gel de
resolución, en el que las moléculas de DNA migrarán, ge-
nerando un patrón electroforético, según su tamaño.
Para electroforesis de proteínas, la acrilamida se pre-
para a partir de una solución al 30% de acrilamida-bisacri-
lamida 19:1. Ésta se mezcla con el buffer correspondiente y
una solución de SDS; además, se añade persulfato de amo-
nio (APS) y N,N,N´,N´-tetrametiletilenodiamina (TEMED)
como polimerizadores en concentraciones del orden de 1 a
10 mM. El APS genera radicales libres, por lo que es un ini-
ciador de la reacción de polimerización que al final forma
el gel. El TEMED funciona como otro iniciador de polime-
rización. Las propiedades del gel resultante dependen de la
concentración de APS y TEMED, ya que un aumento en
su concentración disminuye la longitud media de la cadena
de polímero y, por lo tanto, disminuye su elasticidad y le
resta transparencia al gel. Por ello, debe utilizarse la menor
concentración posible de catalizadores que permita la po-
limerización en un tiempo óptimo.
El gel de acrilamida se forma entre dos vidrios, y el
sistema completo se sumerge en el buffer de corrimiento
dentro de la cámara vertical de electroforesis. En el mo-
mento de sumergir los geles en el tanque, se debe asegurar
que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el
buffer. Es común en los geles de acrilamida realizar un pre-
corrimiento de unos 10 a 30 min a voltajes bajos, con el
B)

cual se asegura que los pocillos se limpien antes de cargar
las muestras.
Para la preparación de la muestra de proteína se reali-
za una reacción fisicoquímica, en la que se rompen enlaces
peptídicos y puentes disulfuro por acción de detergentes
iónicos (SDS), reactivos reductores (betamercaptoetanol)
y temperaturas elevadas (95°C), que al final consigue des-
naturalizar la proteína hasta su estructura primaria. La
muestra mezclada con el buffer de carga se deposita con
cuidado en los pocillos, evitando la contaminación del po-
cillo contiguo. Hay que considerar el uso de un marcador
estándar de proteínas para la medición del peso molecular
de la muestra, que debe someterse a los mismos tratamien-
tos que la proteína.
Una vez colocadas las muestras de proteínas en cada
pocillo del gel, se conectan los cables correspondientes
de los electrodos a la fuente de energía, con la selección de
voltaje o amperaje adecuados. Para el cálculo del voltaje
es importante conocer la distancia en centímetros del gel
desde la parte superior hasta la parte inferior. La distancia
multiplicada por 8-15 V permitirá determinar el voltaje del
corrimiento. El voltaje óptimo dependerá de la molécula
que se piensa separar; en consecuencia, se recomienda es-
tandarizar este procedimiento. El valor del amperaje o co-
rriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios) de-
penderá de la fuerza iónica del buffer. En el caso de trabajar
con buffer Tris-SDS-glicina, el valor recomendado es de 25
a 30 mA. La electroforesis se realiza hasta que el colorante,
visualizado como una línea azul, haya llegado a los límites
de la parte inferior del gel.
Visualización de las muestras
Si se requiere, el gel se sumerge en un recipiente que con-
tiene el colorante azul brillante de Coomassie y se incuba
por unos minutos; esto permitirá la visualización de las
bandas de proteínas. El proceso de coloración se basa en la
atracción electrostática del enlace peptídico de las proteí-
nas sobre grupos de ácido sulfónico, que tiñen la proteína
de color azul. Asimismo, las fuerzas de van der Waals y
las interacciones hidrofóbicas participan en este proceso
de unión mecánica. La tinción de Coomassie Blue clási-
ca, por lo general puede detectar bandas de proteína de
50 ng mientras que la tinción con plata incrementa este
límite de sensibilidad unas 50 veces. La tinción con plata
consiste en desarrollar el color en el gel por incubación en
soluciones de metano al 140%: ácido acético al 10%, luego
metanol al 40%, seguido de agua y posteriormente tiosul-
fato de sodio al 0.01%. Después de este proceso, se lava y
se procede a la incubación en frío (4°C) en cloruro de plata
al 0.1%; posteriormente, se lava e incuba con carbonato de
sodio al 2% en formalina al 0.04% (llamada también formol
al 35%), que actúa como revelador. Por último, se incuba
con soluciones de ácido acético antes de fotografiar o es-
canear.
Electroforesis 125
Muchas variables pueden influir en la intensidad del
color y todas las proteínas tienen características distintas
de tinción.
Algunas veces, el gel se seca para conservarlo. Para
ello, primero se deshidrata en glicerol-metanol y, poste-
riormente, se coloca en una lámina de celofán hidrof íli-
co y no plastificado que cubra totalmente el gel. Se cubre
el gel con un segundo celofán previamente remojado en
agua y se sella con calor. Aquí se deja secar en condiciones
ambientales por aproximadamente dos días o se acelera el
proceso con el uso de desecadores de geles.
Algunas proteínas pueden migrar de forma irregular
y aparecer con un peso molecular mayor que el esperado;
esto puede deberse a que presentan modificaciones pos-
traduccionales en su estructura, como residuos de gluco-
silación, fosforilación y acetilación, que podrían retardar
la migración de las muestras. Asimismo, si existe desna-
turalización de las proteínas, se considera que la proteína
está degradada y suelen aparecer manchas difusas en todo
el carril.
Aplicaciones de la electroforesis
Algunos de los usos de la electroforesis para ácidos nuclei-
cos en geles de agarosa son determinar los tamaños mo-
leculares de los ácidos nucleicos, analizar los fragmentos
cortados con enzimas de restricción (mapa de restricción),
comparar los tamaños de distintos tipos de DNA, aislar y
recuperar fragmentos de DNA purificados para clonacio-
nes moleculares, y analizar productos de PCR, entre otros.
Asimismo, la electroforesis puede ser un proceso previo a
las técnicas de hibridación, como el Southern blot (DNA)
o el Northern blot (RNA), en que la presencia de deter-
minada secuencia del ácido nucleico en una mezcla de
moléculas se distingue por su tamaño, la cual se confirma
por hibridación con una sonda específica. En el caso de
las proteínas, la electroforesis se aplica para la identifica-
ción de fracciones proteicas o proteínas particulares por
tamaño, como es el caso de la electroforesis de globulinas,
o proteínas séricas; pero, sobre todo, para la identifica-
ción de moléculas particulares empleando después una
reacción antígeno-anticuerpo específica en la técnica de
Western blot. Asimismo, la electroforesis es crucial en téc-
nicas como la secuenciación, en que, tras un corrimiento
electroforético de las cuatro reacciones de elongación con
los dideoxi­nucleótidos (véase el capítulo 18), se puede de-
ducir la secuencia del segmento de ácido nucleico. Incluso,
los secuenciadores automáticos modernos emplean una
electroforesis capilar para el discernimiento de la secuen-
cia. También, los termocicladores en tiempo real basan la
detección de los fragmentos amplificados en una electrofo­
resis capilar, en que es posible la detección inmediata de los
segmentos amplificados y su lectura por el láser correspon-
diente al flurocromo con que el producto está marcado.
126 Metodología del DNA recombinante
Ejercicios de integración
Con base en la imagen de una electroforesis de agarosa para
fragmentos de DNA representada en la imagen, conteste las
siguientes preguntas:
1. ¿De qué peso molecular es la banda de menor tamaño
del carril C?
2. ¿De qué peso molecular es la banda de mayor tamaño
del carril D?
3. ¿En qué carril y qué peso molecular presenta la banda
que tiene mayor concentración?
4. ¿En qué carril y qué peso tiene la banda de menor con­
centración?
5. Suponiendo que son muestras de DNA digeridas por
enzimas de restricción, ¿qué carriles contienen aparen­
temente la misma muestra. Explique su respuesta?
6. ¿En qué carril se localiza el marcador de peso mo­
lecular?
7. Indique el sentido de corrimiento de las muestras con
una flecha.
8. Señale la polaridad correspondiente a cada extremo
del gel.