Hidroxilamina como agente mutagnico para NeurosporaCrassa

Resumen
La mutagenicidad de Hidroxilamina (HA) ha sido probada en 8 diferentes mutantes de Neurosporacrassa, auxtrofas a
Adenina (ad-3B):

4 mutantes de este set de prueba se revirtieron despus del tratamiento con cido nitroso y metanosulfonato de etilo,
indicando que estos se revirtieron por una substitucin de un par de bases;2 mutantes se revirtieron solo despus del
tratamiento con ICR-170, indicando que estos se revirtieron por una insercin o delecin de un par de bases; y 2 mutantes
se revirtieron solo espontneamente.

La HA indujo reversiones en 3 de los 4 mutantes, los cuales se revirtieron por la sustitucin de un par de bases y en ningn
otro. La especificidad de accin de HA en los mutantes en el presente set de prueba es consistente con la hiptesis de que
la clase predominante de las alteraciones genticas inducidas por HA en Neurosporacrassaes la transicin de un par de
bases, de Guanina-Citosina a AdeninaTimina. Adems se encontr que la frecuencia de reversin despus del
tratamiento con HA aument en proporcin al cuadrado del tiempo del tratamiento.

Introduccin
HA induce una sustitucin de un par de bases en fagos y el tipo de alteracin gentica es preferentemente de G-C a A-T.
La reaccin qumica entre HA y DNA ha sido analizada por FREESE et al, quien encontr que HA reacciona solo con citosina
y HMC. El tratamiento de RNA con HA altera ambos: Uracilo y Citosina; a pH=6.1 la reaccin es mucho ms rpida con
Citosina que con Uracilo, mientras ms alto el pH, la relacin es a la inversa. HA ha mostrado inducir dao cromosomal en
clulas de mamferos, pero ningn ensayo previo ha sido exitoso en identificar las alteraciones genticas inducidas por HA
en eucariotes a nivel molecular. La caracterizacin de mutaciones en Neurospora inducidas por HA es particularmente
importante porque podra ser tan especfico en eucariotes como en fagos, produciendo mutaciones por sustitucin de par
de bases, resultando en transiciones de GC a AT. Tal especificidad podra hacer a HA especialmente idnea para la
caracterizacin de alteraciones genticas inducidas por mutgenos menos especficos a nivel molecular por el significado
de las pruebas para reversibilidad especfica. La prueba para la induccin de reversiones en mutantes resultantes de
alteraciones genticas conocidas es un mtodo ms simple para caracterizar los efectos genticos de mutgenos que
ninguna tcnica conocida que se aplique despus de la mutacin en Neurospora. La caracterizacin estlimitada por la
coleccin de alteraciones genticas en el mutante que comprende este set de prueba. Sin embargo, seleccionando el
revertimiento de mutantes por las alteraciones genticas ms comunes es posible obtener una aproximacin del espectro
de alteraciones genticas producidas por un mutgeno dado.

En este documento un set de prueba de mutantes ad-3B formado por 4 mutantes los cuales se reviertieron solo por la
sustitucin de un par de bases, 2 mutantes que se revirtieron solo por la insercin o delecin de un par de bases, y 2
mutantes los cuales se revirtieron solo espontneamente donde estos se trataron con HA y despus proyectados para
detercar reversiones al tipo solvestre. Los resultados de esta prueba muestran claramente que en HA produce reversin
en aquellas cepas de Neurospora que se revirtieron por una sustitucin de un par de bases. La especificidad de accin de
HA en los mutantes en el presente set de prueba es consistente con la hiptesis de que la clase predominante de
alteraciones genticas inducidas por HA en Neurospora es una transicin de un par de bases, de GC a AT.
Materialesy mtodos

(a) Cepas

Los mutantes con el prefijo 2-17 fueron inducidos por cido Nitroso en la cepa de Neurospora del tipo silvestre 74 A. El
mutante No. 5-4-I es de origen espontneo. Los mutantes han sido aislados por el mtodo directo.

(b) Preparacin del cultivo

En todos los experimentos el tratamiento mutagnico fue llevado a cabo en suspensin de cosecha de conidios, de
matraces Erlenmeyer de 125ml con 20ml demedio completo de glicerol (10ml glicerol/l en lugar de 20ml) mas Sulfato de
Adenina (25mg/L).
Los matraces fueron inoculados y despus incubados por 1 da a 30 C y despus de 6-9 das a 25 C, los conidios fueron
cosechados primero agitndolos con perlas de vidrio (4mm de diam) para romper las cadenas de conidios, despus fueron
suspendidos en solucin salina (0.9%) filtradas a travs de un colador de platino, lavados 2 veces por centrifugacin y
luego resuspendidos en solucin salina, los mutantes Ad-3 difieren entre ellos con respecto al desarrollo del pigmento
purpura en el micelio y conidios cuando crece en medio completado con glicerol, pero al aadir 250 mg de Sulfato de
Adenina/L la acumulacin de pigmento purpura es eliminado.
La densidad de la suspensin de conidios fue medida en un colormetro en el pico de absorcin de 750m.

(c) Tratamiento

Todos los tratamientos fueron llevados a cabo con suspensin de conidios en matraces Erlenmeyer en un agitador
rotatorio en bao de agua a 25 C para mantener a los conidios en suspensin durante el tratamiento. 5 minutos antes de
finalizar el tratamiento los conidios fueron centrifugados y el sobrenadante fue decantado. Al momento del enfriamiento
despus del tratamiento con cualquiera de los agentes: NA, EMS o ICR-170, los conidios fueron resuspendidos en una
solucin salina (minimo de Fries) ajustado a pH 8 con NaOH.
Este procedimiento se realiz por duplicado.

La solucin de sal mnimo de FRIEs ajustado a pH se ha usado para determinar inmediatamente la reaccin entre clulas
y compuestos alquilantes y NA.

(d) Tratamiento con NA

Los conidios fueron suspendidos en Acetato de sodio 0.05M buffer a pH 4.5. Un volumen de preparado fresco de solucin
de Nitrato de sodio a 0.02M fue aadido a 3 volmenes de conidios. La concentracin final de NaNO2 fue de 0.005M y el
tratamiento fue finalizado como se describe anteriormente 40 min despus de iniciar el tratamiento

(e) Tratamiento con EMS

Los conidios fueron suspendidos en buffer de Fosfato a 0.067M a pH de 7. El tratamiento se comenz aadiendo suficiente
EMS para llegar a la concentracin final 0.1M, el tratamiento suspendido 300 min despus

(f) Tratamiento con ICR-170

ICR-170 es el cdigo numrico asignado a Metoxi-6 cloro-9-(3-[ 2 ]-aminopropilamino) Clorhidrato

de acridina.
Los conidios fueron suspendidos en un buffer de Fosfatos a 0.067 M pH de 7. El tratamiento se comenz adicionando 1
volumen de Solucin de ICR-170 (250mg/L H2O) recin preparada a 49 volmenes de la suspensin de conidios, que da
una concentracin final de 10.5M. El tratamiento fue terminado como se describi anteriormente 130 min despus del
comienzo del tratamiento. El tratamiento y otras manipulaciones incluyendo ICR-170 y conidios fueron realizadas bajo luz
roja para eliminar los efectos fotodinmicos asociados con el anillo de acridina, las placas tambin fueron incubadas en la
oscuridad por lo menos 24 h para dar tiempo a los conidios de crecer a pequeas colonias.

(g) Tratamiento con HA

Antes del tratamiento con HA, los conidios fueron suspendidos en NaCL 3M y a continuacin diluidos 5 veces en la reaccin
de HA, dando una concentracin final de HA de 1M. 5min despus el tratamiento fue terminado, los conidios fueron
centrifugados y decantados, y al momento de terminar los conidios fueron resuspendidos en NaCl 3M. Este procedimiento
de lavado se realiz 2 veces y despus los conidios fueron suspendidos en la solucin de sal del medio mnimo de FRIES
ajustado a pH 8.

(h) Medio en placa

Para estimar la viabilidad del tratamiento y de los conidios sin tratar, fueron sembrados en un medio de Westergaard
suplementado con Sorbosa, glucosa, fructosa, cido casamnico, una solucin de vitamina como en el completado de
glicerol y Sulfato de Adenina.
Para estimar el nmero de reversiones los conidios fueron sembrados en el mismo substrato usado para conteo de
sobrevivientes pero suplementado con 0.2mg/L de Sulfato deAdenina en lugar de 25 mg/L.
Los conidios fueron colocados en placas a una densidad de 106/mL y 2x105 conidios/mL. Para el conteo de reversiones
despus de los tratamientos con NA, EMS o ICR-170 la densidad de los conidios fue de 2x108 en un volumen total de 500mL

Para el conteo de las reversiones despus del tratamiento con HA la densidad de los conidios fue de 2x105/ml en un
volumen total de 500ml.

(i) Prueba estadstica

La prueba para significancia est hecha de acuerdo a BIRNBAUM. EL nmero de reversiones es considerado como tener
una distribucin de Poisson. La probabilidad es calculada asumiendo que las sig 2 relaciones pertenecen a la misma
poblacin.

( )
(sin ) + ( .

sin + .

Una probabilidad menos a 5% indica una diferencia significativa entre el nmero de reversiones en el control y las series
tratadas.

Resultados y Discusin

(a) Supresores

La identificacin de la alteracin gentica por mutante determinando la especificidad en la induccin de reversiones

despus del tratamiento con agentes diferentes se puede distorsionar por la aparicin de mutaciones por supresin junto
con mutaciones por reversin. Los que se revirtieron de 20 mutantes diferentes inducidos en el Loci ad-3, han sido
analizados por la ocurrencia de supresores extragenticos, y ninguno fue encontrado, por lo tanto nosotros podramos
asumir que las ocurrencias de supresores fuera de los locus ad-3A o ad-3B son raros o que no ocurren.
La influencia de los supresores en la identificacin de las alteraciones genticas en mutantes ad-3 ser discutido a
continuacin en otro documento. Adems se est haciendo un anlisis detallado de reversiones inducidas de mutantes
ad-3P para proveer ms informacin en este punto. Sin embargo, desde las reversiones de los mutantes en el presente
set de prueba aparecieron antes y estn en la parte principal sin acumular pigmentos purpuras usualmente producidos
por mutantes ad-3, probablemente parece que la frecuencia de supresores extra gnicos en el anlisis presente es baja.

(b) Alteraciones genticas inducidas por HA

La mutagenicidad de HA ha sido estudiada para determinar si hay especificidad en su actividad de accin por inducir
reversiones con un set de prueba de 8 mutantes (Tabla 1). Basndose en los datos presentes, 4 de estas cepas parecen
ser revertidas solo por sustitucin de un par de bases (reversible por NA y EMS), 2 cepas parecen ser revertidas por la
insercin o delecin de un par de bases (solo reversible por ICR-170), y 2 cepas se revirtieron solo espontneamente.

ICR-170 es un gas de mostaza de acridina monofuncional; mutaciones adelantadas inducidas por ICR-170 en
Neurosporacrassa principalmente parecen ser inserciones o deleciones de un par de bases. Por lo tanto es posible asumir
que los mutantes que se revierten despus del tratamiento con ICR-170 y no despus del tratamiento con NA y EMS, que
predominantemente inducen sustitucin en un par de bases, se revierten por una insercin o delecin de un par de bases.
Sin embargo se encontr que los mutantes que se revirtieron por una sustitucin en un par de bases tambin se revirtieron
despus del tratamiento con ICR-170.
Esto puede explicarse por el hecho de que ICR-170 es un gas de mostaza monofuncional y adems capaz de alquilar, el
resultado de una alquilacin en el DNA es usualmente una sustitucin de un par de bases.
Las frecuencias de reversin despus del tratamiento con HA son bajas comparadas con las frecuencias de reversin
despus del tratamiento con NA y EMS en frecuencia comparables de sobrevivencia. La cepa 2-A-ISS ha sido tratada con
HA a pH 6.2 por varios periodos de tiempo. Una expresin directa para mostrar que HA tiene un efecto mutagnico en
Neurospora puede obtenerse calculando la relacin (M/Mo) donde M= nmero de las reversiones x10 6 conidios despus
del tratamiento con HA y Mo= Nmero de reversiones espontneas x106 conidios. En la figura 1 se puede ver que nosotros
obtuvimos 8 tiempos de muchos mutantes en las series tratadas con HA como en el control. Nosotros podemos adems
concluir que HA es mutagnico en Neurospora. La sobrevivencia no fue ms baja que un 42% aun para los tratamientos
ms largos (fig 2). Se encontr que HA indce reversiones en 3 de las 4 cepas, las cuales se revirtieron por la sustitucin de
un par de bases (Tabla 1).

La falla de la sustitucin de mutantes de cierto par de bases para revertir con HA puede ser explicada si asumimos que
este induce predominantemente transiciones de GC a AT en Neurospora como lo hace en fagos.
Si este fuera el caso, entonces podramos esperar que existen mutantes por sustitucin de un par de bases, que no pueden
ser revertidos por HA.

(c) La cintica de reversiones por induccin.

La frecuencia de reversiones inducidas por HA no son proporcionales al tiempo en Neurospora pero siguen una cintica
de 2do orden (Fig 3). Sin embargo las mutaciones hacia adelante y en reversa inducidas por HA en fagos siguen una cintica
de 1er. Esta inconsistencia podra resultar de muchos mecanismos: (1) que una reversin inducida en Neurospora debe
expresarse por si sola en un conidio, el cual tiene un promedio de 2 ncleos. (2) Que el tratamiento con HA promover
una penetracin ms rpida de HA dentro de la clula, o ms probable (3) que la reaccin de HA con citosina ocurre en 2
pasos, y que la velocidad de la reaccin de los 2 pasos son casi iguales en Neurospora que en fagos.
La velocidad de reaccin en citosina con HA depende del pH; al incrementar el pH hay un descenso en la velocidad de
reaccin. Experimentos para investigar la relacin entre el mecanismo de mutagnesis de HA en virus y Neurospora
estudiando el efecto del pH en las velocidades de mutacin estn en progreso.

(d) Promocin de mutaciones inducidas por HA

Los experimentos se han llevado a cabo para obtener informacin ms detallada de los efectos genticos de HA en
Neurospora por tratamiento de un dicarionte balanceado genticamente marcado.
Las frecuencias de mutaciones adelantadas despus de las 6 h de trataiento bajo las condiciones fueron de 600 mutantes
de conidios sobrevivientes x108 . Las mutaciones obtenidas en este sistema de prueba estn en proceso de ser analizadas
con respecto al genotipo (1 o multiples mutaciones de locus), la complementacin allica (% de mutantes
complementarios as como los tipos de patrones de complementacin) y reversibilidad especfica despus del tratamiento
con NA, EMS, ICR-170 u otros agentes y ser reportado en otra parte.

Investigacin soportada por Institutos Nacionales de Salud y por la comisin de energa atmica de EU bajo el contrato
con la UnionCorbideCorporation.