UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIRIQU

FACULTAD DE MEDICINA
LABORATORIO #6
DETERMINACIN DE LA TEMPERATURA Y EL PH PTIMO DE LA -AMILASA

Integrantes: De Gracia, Pamela 4 776 1767 Fecha de entrega: 07/09/2016

Gonzlez, Mabelis 9 746 993
Pardo, Claudia 9 746 2252
Saldaa, Ashley. 4 782 1856

RESUMEN:
La experiencia se realiz con la finalidad de determinar la temperatura ptima y el pH
ptimo de la accin de la -amilasa sobre el almidn, ya que la misma se encuentra en la
saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva
vegetal.
Para medir la actividad enzimtica de la -amilasa, se utiliz el mtodo colorimtrico que
detecta el almidn. Para ello se cont con una solucin de Lugol (ioduro de potasio), ya
que el almidn en presencia de esta solucin adquiere una coloracin azulada
caracterstica; soluciones de almidn pH 4 con amortiguador pH 4, almidn pH 6.6 con
amortiguador pH 6.6, almidn pH 8 con amortiguador pH 8 todas con NaCl y disolucin -
amilasa a 37C. El efecto del pH en la actividad enzimtica dio positivo a la presencia de
polisacridos (almidn) a pH 4 cambiando de color azulado violeta, pero indicando que no
hay actividad enzimtica. A pH 6.6 y pH 8 la prueba de lugol dio negativa indicando la no
presencia de polisacridos (almidn), pero si hay actividad enzimtica en la enzima.
Para el efecto de la temperatura se uso solamente la solucin de almidn a pH 6.6,
amortiguador pH 6.6 ms NaCl con disolucin de -amilasa a diferentes temperaturas. En
esta se obtuvo positivo para la presencia de polisacridos con la solucin de lugol a
temperaturas de 80C y -5C, pero negativo a la actividad enzimtica, indicando que se
desnaturalizo. Para la temperatura de 37C la solucin fue incolora dando negativo para la
presencia de polisacridos y positivo en su actividad enzimtica.
En conclusin, el pH ptimo y la temperatura optima a la que se obtiene una mxima
actividad enzimtica depender de las condiciones estables de la enzima y que no se de
una desnaturalizacin.

OBJETIVOS:

Determinar la temperatura ptima para la reaccin entre el almidn y la amilasa.

Determinar el pH ptimo para la accin de la alfa amilasa sobre el almidn.
Aplicar un mtodo colorimtrico para la determinacin de parmetros enzimticos.
MARCO TERICO:
El almidn es el polisacrido de reserva ms abundante en vegetales y constituye la
principal fuente de nutricin glucdica para la humanidad. Los almidones estn
constituidos por una mezcla de dos componentes: la amilosa de cadena lineal de unas 200
unidades de D-glucosa unidas por enlaces (1,4) y la amilopectina cadena lineal de D-
glucosas unidas por enlaces tipo (1,4) con numerosas ramificaciones (1,6). El polmero
contiene unas 1000 unidades de glucosa. La -amilosa se disuelve fcilmente en agua,
adquiriendo una estructura secundaria caracterstica, de forma helicoidal, en la que cada
vuelta de hlice comprende seis unidades glucosa. Esta estructura secundaria, en la que
los grupos hidroxilo quedan hacia afuera, permite que el iodo, al penetrar en el interior
del helicoide, confiera a la disolucin una coloracin azul violcea intensa caracterstica
que permite la identificacin positiva de trazas de almidn. Como esta coloracin no es
resultado de ninguna interaccin covalente, el calentamiento origina la desestabilizacin
del helicoide y la prdida de color, que se recupera al enfriar lentamente la disolucin. La
variacin en el pH tiene un efecto anlogo. (Nelson y Cox, 2009).
La alfa amilasa, esta es una enzima hidrolasa, pues la reaccin qumica que acelera es la
hidrlisis. Como se mencion, las enzimas son especficas respecto a sus sustratos. La alfa
amilasa salival tiene como sustrato al almidn y al glucgeno que son polisacridos,
macromolculas compuestas por largas cadenas de carbohidratos. (Horton, Robert;
Moran, Laurence; Ochs, Raymond; Rawn, David; Scrimgeour, Gary. 2001).
La actividad enzimtica es afectada por una serie de factores externos e internos que
pueden ser fsicos, qumicos y biolgicos: temperatura, pH, fuerza inica, concentracin
del sustrato, de la enzima, del producto e inhibidores.
Estos efectos son tan importantes in vivo como en condiciones de laboratorio. Las enzimas
a temperaturas bajas muestran un aumento de su actividad al incrementar la
temperatura, pero a altas temperaturas la enzima sufre desnaturalizacin trmica y la
velocidad de la reaccin disminuye.
Por ser protenas, las enzimas poseen un punto isoelctrico en el que su carga elctrica es
cero; el pH del punto isoelctrico, sin embargo, no es el pH de mxima actividad de la
enzima (pH ptimo). Los cambios de pH afectan profundamente el carcter inico de los
grupos funcionales de la enzima y, por lo tanto, alteran la conformacin de la protena y
con ello, el sitio cataltico. Adems de los efectos puramente inicos, los valores altos o
bajos de pH (cidos o alcalinos) provocan desnaturalizacin de la enzima. (Pacheco,
2001).
MATERIALES

Descripcin Cantidad Capacidad

Vaso qumico 2 250 mL

Gotero 3 1 mL

Tubo de ensayo 15 10 mL

Gradilla 2 10 tubos de ensayo

Plancha 1 -

Probeta 1 10 mL

Bao de agua 2 -

termmetro 1

Vaso de fon 2 8 onzas

REACTIVOS

GRADO DE
NOMBRE FRMULA CONCENTRACIN CANTIDAD
TOXICIDAD
Esta sustancia no
20
KI se considera toxica
Lugol gotas
persistente.
Vmitos irritacin
Hidrxido en los ojos,
NaOH 2M 10mL
de Sodio Problemas
gastrointestinales.
-
La amilasa salival es una enzima presente en la saliva que rompe el
Amilasa
almidn en maltosa, glucosa y oligosacridos. La saliva tambin
diluida
estimula la secrecin de enzimas digestivas y lubrica la boca y el
esfago para permitir el paso de slidos.
El almidn est compuesto
fundamentalmente por
Almidn 5 mg/mL glucosa. Aunque puede
contener una serie de
constituyentes en cantidades
 mnimas. Qumicamente es
una mezcla de dos
polisacridos muy similares,
la amilosa y la amilopectina;
contienen regiones cristalinas
y no cristalinas en capas
alternadas.
Irritacin y ardor
pH = 4,0 en los ojos. Daos
Fosfato de Na2HPO4
pH= 6,6 50mL gastrointestinales.
sodio
pH =8,0 Irritacin en vas
respiratorias
Cloruro de NaCl Irritacin de nariz y
- 10mg
Sodio garganta

Por su temperatura
H2O
Hielo en gran cantidad
puede causar dao.

PROCEDIMIENTOS:
PREPARACIN DE LA DISOLUCIN AMILASA (ENZIMA)
EFECTO DEL pH:

DETERMINACIN DE LA TEMPERATURA PTIMA:

RESULTADOS:
Parte I. Efecto del pH.

Tabla1. pH y Temperatura ptimos de la Alfa-amilasa

pH
Tubo Almidn Amortiguador NaCl Temperatura Activi-
a pH a pH dad de
Enzima
1 4 4 10 gotas 37C -
2 6.6 6.6 10 gotas 37C
3 8 8 10 gotas 37C
Patrn
4 6.6 6.6 10 gotas 37C -

IMAGEN1. PRUEBA DE LUGOL

En los tubos 2 y 3 mediante el color

observado podemos decir que la prueba
dio negativa, indicando que no hay
presencia de polisacridos, por efecto de
la -amilasa; en cambio en el tubo 1 se
puede observar que no hubo actividad
cataltica debido a que la prueba dio
positiva al tornarse de violeta oscuro,
indicando la presencia de polisacridos,
ya que la -amilasa no estaba presente
en el tubo 1 podemos decir que se
desnaturaliz por efecto de la
temperatura.

Discusin:
El fin de la experiencia de laboratorio era determinar el pH y temperatura ptima para la
-amilasa. La -amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y
cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn
est formado por 2 tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos
de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosa unidas por enlaces
alfa-C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones
C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La alfa amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en
la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas
(oligosacridos) como productos (Morales, 2001). Debido a su naturaleza proteica tanto
los cambios de pH como en la temperatura pueden provocar su desnaturalizacin.
Si bien es cierto, las enzimas actan sobre un determinado sustrato: en este caso nuestro
sustrato fue el almidn. En la tabla 1, se evala la actividad enzimtica de cada tubo de
ensayo tomando en cuenta la temperatura observndose que en los tubos 2 y 3 la
coloracin amarilla que indica que la enzima actu sobre el sustrato (almidn),
rompiendo los enlaces del almidn para agregar una molcula de agua y convertirlo en un
monosacrido (glucosa).
A estas muestras se le hicieron leves cambios de pH por lo que se debi afectar el carcter
inico de los grupos amino y carboxilo de la enzima, modificando su sitio cataltico y su
conformacin, por lo que en el tubos 1 no hubo reaccin enzimtica puesto que el mismo
estaba a pH 4 el cual no es ptimo para que la enzima reaccione. A los pH de 6.6 y 8 se les
considera pH dentro del rango ptimo para que la enzima reaccione; sin embargo estos
cambios de pH no fueron los suficientemente drsticos como para alterar la estabilidad de
la enzima amilasa y evitar que ejerzan su funcin cataltica.
Por otro lado el tubo 1 y 4 (patrn) reaccionaron positivamente, con la prueba de Lugol,
esto se hizo evidente por la formacin de un color violeta intenso en estas muestras, lo
que indica que la amilasa fue desnaturalizada, demostrando que no hubo actividad
cataltica y que las condiciones (temperatura) alteradas para estas muestras
desnaturalizaron la enzima, debido a que la misma presenta alta sensibilidad a los
cambios de temperatura, debido a su naturaleza proteica, la desnaturalizacin es causada
por la elevacin o descenso de la temperatura que hace que disminuya su concentracin
efectiva y por lo tanto la velocidad de la reaccin. (De Len, 2015).
El Lugol es una solucin de Ioduro de potasio, en la que el almidn en presencia de esta
solucin adquiere una coloracin azulada caracterstica. Su explicacin fsica nos dice que
el iodo se coloca en el interior de la hlice que forma la amilosa (regiones hidrofbicas),
formando un complejo de color azul. Cuando la alfa-amilasa acta, degrada la amilosa, se
desintegra la hlice y por tanto en presencia de Lugol ya no da una coloracin azul.
(Mndez, 2001).

Parte II. Efecto de la temperatura.

Tabla2. pH y Temperatura ptimos de la Alfa-amilasa
Temperatura
Tubo Almidn Amortiguador NaCl Temperatura Activi-
a pH a pH dad de
Enzima
1 6,6 6,6 10 gotas 80C -
2 6.6 6.6 10 gotas -5C .
3 6,6 6,6 10 gotas 37C
Patrn
4 6.6 6.6 10 gotas 37C -
 IMAGEN2. PRUEBA DE LUGOL

En el tubo 3 mediante el color observado

podemos decir que la prueba dio
negativa, indicando que no hay presencia
de polisacridos, porque hubo efecto de
la -amilasa, es decir que hubo actividad
enzimtica; en cambio en el tubo 1 y
tenuemente en el 2 se puede observar
que no hubo actividad cataltica debido a
que la prueba dio positiva al tornarse de
violeta oscuro y lila respectivamente,
indicando la presencia de polisacridos.

DISCUSIN:
La amilasa, como otras enzimas funciona como catalizador; es decir, cataliza la hidrlisis
del almidn. Es necesario siempre recordar que una enzima aumenta la velocidad de
reaccin, interviene en la misma pero se obtiene intacta al final; adems cualquier cambio
en su temperatura o pH optimo (generalmente un rango muy estrecho) hace que la
enzima pierda su estructura tridimensional y por consiguiente su funcin (Werner , 2008).
En este experimento cualitativo demostramos lo anteriormente explicado utilizando la
prueba de lugol (solucin yodurada de yodo); es decir, confirmamos la ausencia o
presencia del almidn. En general, un violeta confirma la presencia de almidn.
La razn del uso del NaCl es que la alfa amilasa salival humana necesita los iones Cl para
su actividad; es decir, que la presencia de estos iones forma parte de sus condiciones
ptimas de funcionalidad.
Para la determinacin de la temperatura ptima utilizamos los tubos de ensayo 1, 2 y 3.
En este punto es importante establecer que la concentracin de la enzima, el sustrato y el
pH se mantuvieron constantes y lo que vari fue la temperatura. En el tubo 3 que tena
pH= 6,6 y buffer tambin a pH 6,6 , enzima con temperatura de 37 C; no observamos una
coloracin lo que indica reaccin negativa para lugol. Esto nos dice que la enzima pudo
funcionar correctamente a esa temperatura y fue capaz de catalizar la hidrlisis del
almidn. En los tubos 1 y 2 cuyas temperaturas fueron 80 C y -5 C, observamos una
coloracin violeta en ambas que indica presencia de almidn. El color que dan los
polisacridos con el lugol (solucin de I2 y de IK) se debe a que el I2 ocupa espacios vacos
en las hlices de la cadena de unidades de glucosa, formando un compuesto de inclusin
que altera las propiedades fsicas del polisacrido, especialmente la absorcin lumnica. En
estas dos condiciones de temperatura la enzima no pudo reaccionar correctamente ya
que se haba desnaturalizado. Estos resultados nos dicen que la temperatura ptima para
la amilasa es 37 C que corresponde a la temperatura normal interna del organismo.
Para explicar esto, debemos hablar en trminos de velocidad de reaccin. En una reaccin
que no est catalizada, la velocidad de reaccin es proporcional a la temperatura, es decir
que si la temperatura aumenta la velocidad de reaccin tambin. Esto no es cierto para
una reaccin catalizada como la de nuestro experimento. Lo que ocurrira se puede
explicar mediante la siguiente grfica:
Segn Voet & Voet (2006), en esta grfica
observamos que al empezar con una baja
temperatura y luego ir aumentando
tambin va aumentando la velocidad de
reaccin. Sin embargo, las
conformaciones de una protena son muy
sensibles a los cambios de temperatura,
por esto al llegar a la temperatura ptima
cualquier aumento subsiguiente de la
misma alterar la conformacin de la
enzima. Esto significa que el sustrato no encajar en el sitio activo de la protena (en la
superficie de la enzima) por lo que la velocidad de reaccin disminuye. Un pequeo
cambio de la temperatura no afecta drsticamente la enzima ya que entre un rango muy
estrecho este proceso es reversible y la protena puede volver a la conformacin que tena
antes. Al salir de este rango indudablemente la enzima sufrir desnaturalizacin, la cual es
irreversible. Esto significa que la enzima quedar completamente inactiva. Este mismo
principio es el que se aplica en la preservacin de alimentos a bajas temperaturas por
medio refrigeracin.

CONCLUSIONES:
Se conoci que la temperatura juega un papel importante para el desarrollo de las reacciones
enzimticas dentro del organismo, las temperaturas extremas desnaturalizan las enzimas (80 y -
5C), sin embargo, la temperatura entre el rango fisiolgico tiende a aumentar la velocidad de sus
reacciones.

El pH y temperatura ptimos para la funcin cataltica de la -Amilasa en la reaccin hidroltica

del almidn fueron anlogas a las condiciones en el cuerpo humano; temperatura de 37C y pH 7
(6,6).

Todas las enzimas difieren en cuanto a resistencia de pH y temperatura. En el organismo la

exposicin a procesos febriles puede llevar a una falla en la estructura de las enzimas y por ende a
una falla sistmica generalizada, pues el 95% de nuestras clulas dependen de las reacciones
enzimticas.

CUESTIONARIO:
1. Investigue las caractersticas bioqumicas y el pH para las siguientes enzimas:
- Papana: pH ptimo para su actividad es de 5.0 7.0
Es una enzima de la hidrolasa de la proteasa de la cistena presente en la papaya.
Fue la primera protena vegetal que se le pudo elucidar su estructura cristalina
consta de 212 aminocidos, 34 de los cuales estn ionizados.
Esta enzima posee un gran poder de hidrolisis, mayor que cualquier otra enzima
proteoltica, es muy activa en la hidrlisis de amidas y steres. Adems, tiene poca
especificidad, puede hidrolizar sustratos sintticos los cuales son generalmente
considerados como sustratos de tripsina, quimiotripsinas o pepsinas. La papana ha
de ser til como biocatalizador en reacciones de esterificacin y como
biocatalizador especifico en la esterificacin de cidos grasos con l-butanol.
- Lipasa cida: el pH ptimo para su actividad es de 4,5
La lipasa cida es una enzima fundamental en el metabolismo de los triglicridos y
del colesterol, los cuales se acumulan en los tejidos.

- Ureasa: el pH ptimo para su actividad es de 7.0

La ureasa es una exoenzima que cataliza la reaccin de hidrlisis de la urea, el
principal producto celular nitrogenado de la degradacin de las protenas y los
cidos nucleicos, el cual es ms fcil de eliminar que otras formas de nitrgeno
(como el amoniaco) porque es soluble en agua y menos txico.
2. Cules son las hidrolasas que junto con las amilasas son responsables del
catabolismo del almidn?
Las hidrolasas que actan en el catabolismo del almidn junto con la amilasa es:
- Glicosil hidrolasa
- ADPG hidrolasa
- Almidn fosforilasa
- -amilasa
3. Qu efecto tiene la temperatura sobre la actividad enzimtica?
Las reacciones enzimticas presentan sensibilidad a los cambios de temperatura.
Debido a su naturaleza proteica, la desnaturalizacin de las enzimas, causada por
elevacin de la temperatura hace que disminuya su concentracin efectiva y por
tanto la velocidad de reaccin. A temperatura mayores de 55C se destruye la
 funcin cataltica. Es por esta razn que todas las enzimas tienen una temperatura
ptima en la cual pueden desempear sus funciones.

BIBLIOGRAFA:
- Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2009) Lehninger: Principios de la Bioqumica.
(5ta. ed.). OMEGA: Barcelona, Espaa.
- Horton, Robert; Moran, Laurence; Ochs, Raymond; Rawn, David; Scrimgeour,
Gary. (2001). Bioqumica. (1era. ed.). Prentice Hall: Mxico.
- Pacheco, D. (2001). Bioqumica Estructural y Aplicada a la Medicina. 1ra
Edicin. Instituto Politcnico Nacional: Mxico.
- Voet, D., & Voet, J. G. (2006). Bioqumica. Buenos Aires: Ed. Mdica
Panamericana.
- Werner , M.-E. (2008). Bioqumica. Fundamentos para Medicina y Ciencias de la
Vida. Espaa: Reverte.
- Morales. Actividad enzimtica,
2001 (documento en lnea) Internet, Fecha de consulta 10 de septiembre de 2016.
Disponible en: http://academisc.uprm.edu/-jvelezg/labmoleculas.pdf
- De Len, Enzimas, 2015
(documento en lnea) Internet, Fecha de consulta 10 de septiembre de 2016.
Disponible en:
http://www.euroschool.Iu/prof.montilla/ficheroactivi/actividadesbio4_6/PROTEINAS
- Mndez, Funcin cataltica,
2001 (documento en lnea) Internet, Fecha de consulta 10 de septiembre de 2016.
Disponible en: http://www.monografas.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimatica-
amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf
- Fuentes., E. (12 de octubre de 2013). GLOBALHEALINGCENTER. Recuperado el 13 de 9
de 16, de globalhealingcenter: http://www.globalhealingcenter.net/salud-
natural/amilasa-beneficios.html
ANEXOS:

BENEFICIOS PARA LA SALUD DE LA AMILASA

Publicado el 12 de October de 2013 por Dr. Edward F. Group III, DC, ND, DACBN, DABFM
La amilasa es una de las principales enzimas que digieren el almidn secretadas en el
cuerpo por ende bajo su pH y temperatura ptima vemos un funcionamiento importante.

1. PUEDE AYUDAR A DISMINUIR LAS RESPUESTAS AUTOINMUNES E

INFLAMATORIAS: Un estudio de las enzimas digestivas y las enfermedades
autoinmunes mostr que estas enzimas podran ayudar a retardar la agrupacin de
antgenos (molculas que desencadenan las respuestas inmunes), as como el dao
en los tejidos resultante de la elevada conglomeracin de anticuerpos (protenas
del sistema inmune que neutralizan las clulas extraas). Algunos cientficos estn
investigando la posibilidad de que las enzimas como la amilasa puedan
desempear un papel en el impulso de la actividad inmunomoduladora para
detener estos fuertes estados inmunes.

2. RESISTENTE A LA INFLAMACIN: Muchos grupos de investigacin europeos estn

estudiando activamente las enzimas como la amilasa. Las enzimas orales estn
incluso siendo utilizadas en los pases europeos en lugar de los medicamentos
 antiinflamatorios. Los estudios muestran que las enzimas orales pueden ser muy
eficaces en la reduccin de la inflamacin asociada con afecciones tales como la
osteoartritis, la artritis reumatoide, as como otros desequilibrios causados por la
inflamacin. Varios estudios comparativos controlados con placebo descubrieron
que los pacientes con enfermedades reumticas que consuman enzimas
experimentaron algunos efectos analgsicos y antiinflamatorios. Estos estudios
confirman que los preparados de enzimas puede ser tan eficaces como los
medicamentos antiinflamatorios comnmente prescritos no esteroideos, sin
muchos de los dainos efectos secundarios.

3. APOYA A LA SALUD INMUNODEPRIMIDA: La terapia enzimtica est incluso

siendo estudiada en Suiza para su uso como un tratamiento de apoyo para el
cncer. La enzima amilasa en particular se encontr que muestra capacidades
sorprendentes en la inhibicin del crecimiento de clulas tumorales con
posibilidades de metstasis. La enzimoterapia puede reducir los efectos adversos
causados por la radioterapia y la quimioterapia. Existen tambin evidencias de
que, en algunos tipos de tumores, la supervivencia puede prolongarse. El efecto
beneficioso de la terapia enzimtica sistmica parece basarse en su potencial
antiinflamatorio.

4. DISMINUYE LOS EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO: Aunque muchos cientficos

discrepan de la cuestin de si la produccin de enzimas disminuye o no a medida
que envejecemos, un estudio de laboratorio descubri que la amilasa pancretica
disminuy el 41% en ratas envejecidas. Del mismo modo, un estudio en humanos
realizado en Argentina encontr que la secrecin de amilasa y lipasa disminuy en
las mujeres mayores de 45 aos, pero que est en realidad aument en los
hombres de la misma edad.