Conceptos y Tcnicas de Biotecnologa

Curso 2010

Produccin de
metabolitos secundarios
en biorreactores

Alejandro Mentaberry
Departamento de Fisiologa, Biologa Celular y Molecular
FCEN-UBA
Sumario

Potencial econmico de los metabolitos secundarios

Estrategias para incrementar la produccin

de metabolitos secundarios.
- Seleccin de especies vegetales apropiadas
- Seleccin de lneas celulares mejoradas
- Optimizacin de las condiciones de cultivo
- Agregado de precursores
- Suspensiones, rganos y clulas inmovilizadas
- Uso de elicitores microbianos y de estreses abiticos
- Permeabilizacin y remocin in situ

Ingeniera metablica y biotransformacin

Diseo de procesos. Ejemplos

Referencias
 Potencial econmico
de los metabolitos secundarios
Cultivo
de tejidos y El metabolismo secundario regula
Concepto
metabolismo muchas de las relaciones
general
secundario de la planta con el medio circundante

La produccin de metabolitos secundarios est estrechamente

relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.
- Generalmente no est asociada al crecimiento.
- Depende de condiciones determinadas de control hormonal.
- Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y rganos
(races, tallos, hojas y glndulas).
- La biosntesis y acumulacin suele estar fuertemente
compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidos
y de rganos.

Los metabolitos secundarios se producen ante situaciones

de estrs o enfermedad.
- Factores biticos
- Factores abiticos
Las plantas
- Insecticidas - Fragancias - Medicinas
como fuente
- Saborizantes - Antimicrobianos - Herbicidas
de metabolitos - Colorantes - Enzimas - Proteasas
secundarios
de inters Potencial
comercial
- 75% de las nuevas estructuras qumicas descubiertas
provienen de las plantas.

- Slo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-

300.000 especies vegetales que se creen existentes en el
planeta.

- 25% de los medicamentos de las industrias farmacuticas

son de origen vegetal.

- 75% de la poblacin mundial utiliza la medicina tradicional

que consiste principalmente en el uso de extractos
provenientes de plantas.

- Desarrollo creciente de fitoteraputicos y nutracuticos

Ejemplos de
terpenoides
producidos
en plantas Se conocen
Azadiractina
AzadiractinaAA
(antinutrientede insectos) -Ecdisona
unos 25.000
(antinutrientede insectos)
(disruptor de lamuda de insectos)
terpenoides
presentes
en plantas

Hecogenina Digitoxigenina
(aglicona de una saponina; (aglicona de digitoxina; tratamiento
detergente) de congestiones cardacas)

Taxol
Taxol Forbol
Forbol Costunlido
Costunlido
(droga anticancergena) (irritante y cocarcinognico) (repelente de inserctos;
(droga anticancergena) (irritante y cocarcinognico) (repelente de inserctos;
antinutriente de mamferos)
antinutrientede mamferos)
Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales

Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina

Cinchona
officinalis

Cocana

Quinina

Erythroxylon coca
Coffea arabica Cafena

Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas

Ejemplos de Rizoma de ginger

fenlicos
derivados de Unos 8.000 fenlicos
fenilpropanoides se forman en las
gingeroles
plantas por las rutas
Pimiento rojo y negro
del cido shikimico o
del malonato/acetato

norhidrocapsaicina

capsaicina
Granos de caf

piperina

cido clorognico
Corteza de canela

cinnamaldehido
Algunas de las medicinas ms importantes o sus
precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso teraputico
Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$
Hiosciamina, Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinrgicos
escopolamina
Camptotecina Alcaloide indlico Camptotheca Antineoplsico
acuminata
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgsico local
Codena, morfina Alcaloide opiceo Papaver somniferum Analgsico
Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota
Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa
Pilocarpina Alcaloide imidazlico Pilocarpus jaborandi Colinrgico
Nicotina Alcaloide pirrolidnico Nicotiana spp. Terapia antitabaco
Quinina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Antimalrico
Quinidina Alcaloide quinolnico Cinchona spp. Cardiotnico
Reserpina Alcaloide indlico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrpico
Vinblastina, Alcaloide indlico Catharanthus roseus Antineoplsico
vincristina
Yohimbina Alcaloide indlico Apocynaceae, Afrodisaco
Rubiaceae
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$
Artemisinina Lactona sesquiterpnica Artemisia annua Antimalrico
Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales
Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Antitumoral
Glicsidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$
Digoxina, digitoxina Glicsidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotnico
Sennsidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante
Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$
Ipecac Mezcla de alcaloides de Cephaelis Emtico
ipecacuana ipecacuanha
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplsico
Produccin
de metabolitos - Independizarse de factores externos, tales como:
secundarios cambios de temperatura, sequas, plagas,
variabilidad de la produccin, factores polticos
por cultivo y sociales, etc.
in vitro
- Evitar la extincin de especies vegetales.
de clulas
y rganos - Disponer de condiciones controladas en el proceso
vegetales: de produccin y extraccin.

por qu? - Hacer viable la produccin de compuestos

complejos con uno o ms C quirales en forma ms
econmica respecto de la sntesis qumica

- Posibilitar la obtencin de nuevos compuestos

no presentes en la planta madre.

- Establecer procesos de biotransformacin slo

realizables por enzimas provenientes de plantas.
Procesos industriales

Tipo de compuesto Producto Compaa

Farmacuticos Shikonina Mitsui Petrochemical Ind.

Berberina Mitsui Petrochemical Ind.
Sanguinarina Vigont Researol Lab.
Gingsensidos Nitto Denko Co.
Taxol Phyton USA
Pigmentos Cartamina Kibun Kyoto University
Fragancias Geraniol Kanedo Co.
Citronerol Kanedo Co.
Saborizantes Vanillina Kanedo Co.
Depigmentadores Arbutina Mitsui Petrochemical Ind.
Productos comerciales potenciales y rendimientos
de algunos cultivos de clulas vegetales

Precio
Producto Especie Aplicacin Rendimiento (%)
(U$S/kg)

Acido rosmarnico Cloeus blumei Antiinflamatorio 21-36 -

Antraquinonas Morinda citrifolia Pigmentos 18 -

Shikonina Lithospermun Antibacteriano, 12,4 4.500

erythrorhizon colorante

Berberina Thalictrum minus Antibacteriano 10,6 3.250

Antocianinas Perilla frutescens Pigmento 8,9 n/a

Diosgenina Dioscorea deltoidea Esteroide 3,8 1.000

Morfina Papaver somniferum Analgsico 0,025 340.000

Sanguinarina Papaver somniferum Antibitico 2,5 4.800

Paclitaxel (Taxol) Taxus brevifolia Anticancergeno 0,06 0,6 M

Vincristina Catharanthus roseus Antileucmico 0 20 M

Tomado de: Scragg. Agricultural Biotechnology, 1998.

Viabilidad de
un proceso Condiciones econmicas:
para su - Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)
escalado a
- Alto rendimiento y productividad del cultivo
nivel industrial comparado con la planta entera

- Buen crecimiento en biorreactores

- Crecimiento lento de la planta entera

como fuente alternativa

Parmetros principales:
- Productividad: g de producto/L/da

- Concentracin mxima de producto:

g de producto/L

- Rendimiento: g producto/g sustrato

 Estrategias para incrementar
la produccin de metabolitos secundarios
Cuantificacin Esquema del patrn de crecimiento
y cintica de una suspensin celular vegetal
de un proceso Td: tiempo de duplicacin de la biomasa
: velocidad especfica de crecimiento del organismo

Rendimiento de biomasa en sustrato

Y: rendimiento
X: biomasa
S: sustrato
Patrones de formacin de producto

Asociado al crecimiento No asociado al crecimiento

Metodologas
utilizadas para
Seleccin de especies vegetales apropiadas
optimizar
la produccin Seleccin de lneas celulares mejoradas
de metabolitos
secundarios Optimizacin de las condiciones de cultivo

Agregado de precursores

Tipo de cultivo: suspensiones, rganos

o clulas inmovilizadas

Uso de elicitores microbianos

y estrs abitico

Permeabilizacin y remocin in situ

Metodologas Screening y seleccin de lneas sobreproductoras
utilizadas para
optimizar - Se facilita cuando el metabolito de inters es un
pigmento, ya que puede hacerse una seleccin
la produccin visual.
de metabolitos - Es importante contar con un mtodo rpido y sencillo
para seleccionar lneas ms productoras (por ejemplo,
secundarios ELISA).

Optimizacin del medio de cultivo (variables ms

ensayadas)

- Fuente de carbono
- Limitacin en nitrgeno
- Limitacin en fosfato
- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)
- Relacin C/N

Agregado de precursores

- Bajo costo
- Baja toxicidad
- No muy alejado del producto final en la ruta metablica
Diferencias entre suspensiones de clulas vegetales
y de clulas microbianas
Caracterizacin Clulas Clulas Consecuencias para
microbianas vegetales cultivos a gran escala

Tamao Clulas Agregados de Sedimentacin rpida;

y morfologa Individuales 10-200 m y sensibilidad a fuerzas de corte;
2-10 m de hasta 2 mm formacin de gradientes;
de dimetro dificultad para tomar muestras

Velocidad Rpida; Lenta; td ~ 2-5 das Largos tiempos de proceso;

de crecimiento td ~ 1-2 h baja productividad

Densidad de Pequea 5-20% Necesidad de grandes

inoculacin cantidades de inculo;
escalado ms largo

Sensibilidad a Insensible Sensible / Bajas velocidades

fuerzas de corte Tolerante de agitacin

Aireacin Alta Baja Baja demanda de oxgeno:

fermentadores con baja
transferencia de oxgeno
Acumulacin
del producto Extracelular Intracelular / Permeabilizacin;
a veces extracelular remocin in situ

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Cultivos en
suspensin Problemas a considerar:

- Tasa de crecimiento

- Volumen del inculo

- Tamao y agregacin de las clulas

- Oxigenacin

- Agitacin
Ejemplos de tasas de crecimiento de
suspensiones de clulas vegetales en biorreactores

Tasa de crecimiento Tiempo de

Lnea celular Bioreactores
especfica (d-1) duplicacin (d)

Nicotiana tabacum 600 L (AG) 0,42 1,7

Nicotiana tabacum 15, 30, 130 L (AG) 0,96 0,72
Nicotiana tabacum 15, 500 L (AG) 1,10 0,63
Morinda citrifolia 10 L (EA) 0,48 1,4
Catharanthus roseus 30 L (EA) 0,32 2,2
Helianthus annuus 80 L (EA) 0,30 2,3
Picrasma quassioides 7 L (EA) 0,12 5,9
Quassia amara 7 L (EA) 0,13 5,2

AG: bioreactor con agitacin Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
EA: bioreactor de elevacin por aire (airlift)
La densidad el inculo y del diseo del biorreactor inciden
en el desarrollo de las suspensiones celulares
Efecto de la densidad de inculo Tamao y distribucin de agregados
en el crecimiento de cultivos de Helianthus annuus en varios
de Picrasma quassiodides. biorreactores y en Erlenmeyer

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Scragg. Secondary products from plant tissue culture, 1990.
Tamao de agregado y acumulacin
de metabolitos secundarios
Distribucin del tamaos obtenido en
Porcentaje de callos de Vitis vinifera biorreactores con medio en presencia de
que contienen pigmentos de acuerdo carboximetilcelulosa (crculos cerrados)
con el tamao de los agregados y en medio control (crculos abiertos)

Tomado de: Nagamori et al., Biochemical Engineering Journal, 2001. Tomado de: Honda et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002.
Patrn de flujo de dos diseos de propulsor
Agitador de paletas planas o de Rushton Agitador de paletas inclinadas
(flujo radial) (flujo axial)

deflector deflector

Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.

Diseos de distintos propulsores

Adaptado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles,1998.

Biorreactores de agitacin neumtica

Columna de burbujeo Airlift con tubo interno Airlift con loop externo
El biorreactor ms grande del mundo es de tipo air-lift

ICI, Ltd. factory, Billingham, UK

Instalada en 1980, produce 6.000 Tm de protena bacteriana (Methylophilus methylotrophus)

por mes.
Diseos alternativos para biorreactores
con agitacin mecnica

Biorreactor de tambor rotatorio Biorreactor de membranas

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Bhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.
Cultivo de rganos: races transformadas
Propiedad
Forma de crecimiento
Patrn de crecimiento
Tiempo de duplicacin
Biomasa final
(peso seco/L)
Background gentico
Formacin inicial de producto
Medio de crecimiento
Localizacin del producto
Tipo de proceso
Suspensiones Races transformadas
Clulas simples-agregados Red de ramificaciones
Desorganizado; cada clula Divisin celular localizada;
puede dividirse y expandirse crecimiento linear con
ramificaciones laterales
15 h-das 36 h-das
30-60 g 30-60 g
Heterogneo Euploide
Usualmente bajo Similares a la planta madre
Complejo; hormonas Simple, sales y azcar
y vitaminas
Intracelular- extracelular Intracelular- extracelular
Batch; continuo, deben Batch o continuo, no hay
ser inmovilizadas necesidad de inmovilizar
Fenotipo de raz
transformada con
Agrobacterium
rhizogenes
Algunos
metabolitos Metabolito Gnero
secundarios Alcaloides
producidos Alcaloides piridnicos
Indoles
Nicotiana
Catharanthus
por races Tropano
Cinchona
Duboisia
transformadas Datura

Otros
Betalaina Beta
Sesquiterpenos Lippia
Artemisia
Poliacetilenos Coreopsis, Bidens
Tiofenos Tagetes

Glicsidos cardioactivos Digitalis

Antraquinonas Cassia
Saponinas Panax
Polyines Chaenactis
Lignanos Podophyllum
Linum
Naftoquinonas Lithospermum
Esteroides Solanum

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Biorreactores para el cultivo de races
Biorreactor de lecho de goteo Biorreactor de lecho de niebla
con malla para inmovilizar a las races (nutrient mist reactor)
Inculo
Salida de aire

Malla de
inmovilizacin Adicin de nutrientes

Rotmetro
peristltica
Filtro de aire

Bomba
Bomba de aire

Generador de niebla
Aire Aire Reservorio Intensidad Condensador
On Off de niebla
Cmara
Controlador
Bomba de cultivo

Tomado de:Hairy Roots,

Culture and Applications,
1997.
Cultivo
Ventajas
de tallos
- Cultivos gentica y bioqumicamente estables
- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos
presentes en tallos y hojas (glndulas, epidermis,
etc.); caso de los aceites esenciales
- Niveles similares a los de la planta (no siempre se
cumple).

Desventajas
- Slo para productos sintetizados en tallos y hojas
- Vitrificacin

Compuesto Planta

Piretrinas Chrysanthemum spp.

Cardenlidos Digitalis spp.
Artemisinina Artemisia annua
Aceites esenciales Mentha spp.
Aceites esenciales Pelargoium spp.
Cultivo de tallos de Artemisia annua
para la produccin de artemisinina

Tomado de: Liu et al., Process Biochemistry, 2003.

Airlift modificados: A: airlift con placas para sostener los Produccin de artemisinina en los distintos bioreactores
cultivos de tallos; B: Igual que A, pero con alimentacin por
goteo; C: Igual que A, pero con alimentacin por niebla.
Inmovilizacin
La inmovilizacin se define como
el confinamiento de un biocatilizador,
enzimtico o celular, dentro o sobre
una matriz slida para favorecer
la liberacin del producto y la reutilizacin
del propio biocatilizador.

Unin a una matriz:

- Covalente
- Inica
- Por crosslinking
- Por adsorcin

Entrampamiento:
- Geles o polmeros
- Membranas: microencapsulacin
o reactores de membrana
Inmovilizacin
Ventajas
- Posibilita la reutilizacin del biocatalizador y una
rpida separacin del medio de cultivo.
- Las clulas vegetales permanecen viables
por largos perodos de tiempo.
- Es posible establecer sistemas de cultivo continuo,
con el consiguiente aumento en la productividad.
- Es posible establecer cultivos de alta densidad
permitiendo el uso de biorreactores ms pequeos.
- La inmovilizacin favorecera la interaccin entre
las clulas, favoreciendo cierto grado
de diferenciacin con el consiguiente incremento
en la produccin.
- Es compatible con otras estrategias de optimizacin
. (elicitacin, permeabilizacin y remocin de producto)
- En muchos casos, la misma inmovilizacin induce
la secrecin del producto al medio de cultivo.
Inmovilizacin

Desventajas

- Se agrega una etapa ms al proceso,

con el consiguiente aumento en los costos
operativos. Esto incluye el costo de la matriz
y de toda la maquinaria necesaria
para la inmovilizacin.

- Al agregar un barrera ms al sistema,

aumentan los problemas relacionados
con la transferencia de nutrientes
y de oxgeno.

- El agregado de otra etapa en el proceso

aumenta los riesgos de contaminacin.
Inmovilizacin
Efectos de la inmovilizacin en la produccin de metabolitos secundarios
Especie Producto Incremento Tipo de inmovilizacin

Capsicum frutescens Capsaicina > 100 Poliuretano

Capsicum frutescens Capsaicina > 100 Gel
Cofffea arabica Metilxantinas 13 Gel
Catharanthus roseus Ajmalicina 3,5 Gel
Tagetes patula Tiofenos 20 Agregados naturales

Efectos de la inmovilizacin en la liberacin de metabolitos secundarios

% Producto en el medio
Compuesto Planta Clulas Libres Inmovilizadas

Ferruginol Salvia miltiorrhiza 26 45

Solasodina Solanum surattense 7 47-59
L-DOPA Mucuna pruriens - 90
Capsaicina Capsicum frutescens Trazas 100
Tomado de: Payne et al., Plant cell and tissues culture en liquid ssytem. 1991.
Biorreactores para clulas inmovilizadas

Agitacin mecnica Lecho empaquetado Lecho fluidizado

La inmovilizacin en el contexto de distintas
opciones de cultivos de tejidos

Tomado de: Payne et al. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1991.
Elicitacin

Agentes biticos

- Extractos de paredes de hongos o bacterias

- Acido araquidnico
- Quitosano
- Metil jasmonato

Agentes abiticos

- Metales pesados
- Radiacin UV
- Presin osmtica
- Ultrasonido
Incremento de la produccin de metabolitos secundarios
por elicitacin en diferentes cultivos in vitro

Producto Especie Elicitor Concentracin Producto Producto despus

del elicitor en control de elicitacin
Alcaloides Catharanthus roseus Phytium aphanidermatum 10 ml / 50 mL 50 mol / L 75 mol / L
indlicos (suspensiones) (extracto crudo) de cultivo

Alcaloides Datura stramonium Phytophtora megasperma 55 mg / L de cultivo 0,85 mg / g peso seco 4,27 mg / g peso seco
del tropano (suspensiones) (extracto crudo)

Capsidiol Capsicum annum Trichoderma virideae 20 g / mL 0 1 mg / frasco

(suspensiones) (extracto crudo)

Berberna Thalictrum rugosum Saccaromyces cereviseae 0,2 mg / g peso fresco 0,5% peso seco 2% peso seco
(suspensiones) (extracto crudo)

Dopamina Sanguinaria canadensis Verticilium dahliae 1 ml / 15 mL 3 mg / g peso fresco 15 mg / g peso fresco

(suspensiones) (extracto crudo) de cultivo

Shikonina Lithospermum erythrorizon Endgeno 1 mg / mL 0 28 g / 10 mL

(suspensiones) (extracto crudo)

Alcaloides Catharanthus roseus Penicilinum spp. 0,01 g / L peso seco 3 mg / g peso seco
indlicos (races transformadas) (extracto crudo) 9 mg / g peso seco

Isoflavonoides Lotus corniculatus Glutation abitico 10 mM 0

(races transformadas) 160 g / g peso fresco

Tiofenos Tagetes patula Fusarium conglutanis 0,2 mg / mL 0,2 g /100 g

(races transformadas) (extracto crudo) de medio peso seco 0,55 g / 100 g
peso seco
Tomado de: Singh. Hairy Roots, Culture and Applications, 1997.
Efecto de la configuracin del biorreactor
sobre el proceso de elicitacin

Dosaje de elicitor necesario para

biorreactor en columna de burbujeo
y para biorreactores de lecho de goteo Gastos de elicitor por biorreactor para
o de niebla en funcin de la constante de biorreactor en columna de burbujeo y para
equilibrio entre el elicitor y receptor biorreactor de lecho de goteo o niebla.

Tomado de: Singh, Hairy root Culture and Applications, 1997.

Liberacin
del producto
al medio DMSO

Shock trmico

Cambios de pH

Limitacin de fosfato y oxgeno

Elicitacin

Detergentes y aceites de siliconas

Electropermeabilizacin
Remocin Lquido-lquido:
de producto
Compuestos inmiscibles en agua: Se utilizan solventes
in situ orgnicos o lpidos (sistemas de dos fases agua-orgnico).
Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.

Compuestos miscibles en agua: Se utilizan sales o soluciones

de polmeros (sistemas de dos fases acuosas).
Ejemplos: DEAE, PEG.

Slido-lquido:
La segunda fase es un material slido como resinas u otros
absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.

Requerimientos:
- Autoclavables
- No txicos
- Fcil separacin del producto de inters
de la segunda fase
- No modificacin del medio de cultivo
- Permanencia de las clulas en la fase acuosa
Adaptaciones para la extraccin in situ del producto
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Diagrama de un tanque de agitacin mecnica modificado Diagrama de un biorreactor de agitacin

para operar con remocin in situ del producto por lquido con loop externo
1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar races;
3: sensor de oxgeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor
DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de
vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;
12: marco de la malla
Extraccin in situ de alcaloides con aceite de silicona a
partir de un cultivo de clulas de Eschscholtzia californica

A: particin de alcaloides con

diferentes cantidades de polimetil-
silanos. Los alcaloides se acumulan
en la fase superior.
B: Extraccin in situ de alcaloides
en la parte superior de un
fermentador de elevacin por aire
de 2 L.
Secuencia en la Seleccin de la planta por su contenido de metabolitos
optimizacin de secundarios para iniciar cultivos in vitro

un proceso para
la produccin
Establecimiento de cultivos in vitro
de metabolitos
secundarios
Estabilizacin y seleccin de cultivos
in vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,
liberacin al medio

Optimizacin de medio de cultivo para produccin

por diseo factorial: nutrientes, precursores, elicitacin,
liberacin y remocin in situ

Optimizacin en biorreactores: escalado

Sistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusin,
en dos etapas. Extraccin y purificacin del producto
Ingeniera metablica
y biotransformacin
Estrategias
para modificar
el metabolismo Completar rutas metablicas mediante
secundario insercin de genes heterlogos
mediante Amplificar rutas normales
manipulacin
gentica Bloquear rutas alternativas

Bloquear rutas normales

Modificar la regulacin de rutas normales

Modificar los mecanismos de secrecin

y exportacin

Bloquear rutas de degradacin

Ingeniera metablica del metabolismo secundario

Especie Enzima Producto Observaciones

Peganum harmala Triptofano decarboxilasa Serotonina Incremento de 10-20 veces

(suspensiones y races) (TDC) en producto

Hyosciamus muticus Hiosciamina-6-hidroxilasa Escopolamina Contenido de producto 4 veces

(races transformadas) (H6H) superior a planta control

Catharanthus roseus Triptofano decarboxilasa (TDC) Alcaloides indlicos Contenido de TIAs de 300 mg/L
(suspensiones) y estrictosidina sintasa (STR) (TIAs) comparado con control 50mg/L.
Lneas inestables

Catharanthus roseus ORCA3 (factor Alcaloides indlicos Incremento de la concentracin de TIAs

(suspensiones) De transcripcin) (TIAs) de 3 veces despus de agregar
el precursor secologanina

Coptis japonica (S)-esculerina 9-O- Berberina Incremento del flujo hacia la produccin
(suspensiones) metiltransferasa (SMT) de berberina de 15%

Mentha spp. Desoxixilulosa fosfato Aceites esenciales Incremento del 50% ene l contenido
(planta) reductoisomerasa (DXR) de aceites esenciales

Zea mays C1 y R (factores Antocianinas Produccin de antocianinas y fenoles

(callos) de transcripcin) que no se producan en los callos sin
transformar.
Ingeniera
metablica
Problemas
del
metabolismo - Clonado de genes
secundario
- Estabilidad de lneas transgnicas

- Compartimentalizacin de productos

- Transporte y acumulacin de productos

- Limitaciones y arquitectura
de la ruta metablica

- Canales metablicos (limitacin del

flujo metabolico por la capacidad de las
enzimas participantes)
Biotransformacin
La biotransformacin es la conversin de un sustrato (natural o sinttico) por
medio de un biocatalizador (enzima, clula, tejido, rgano, clulas inmovilizadas)
en un producto complejo. Generalmente involucra uno o pocos pasos enzimticos.
Requerimientos:
- Se requiere la presencia de las enzimas necesarias en la clulas y de sus cofactores.
- La velocidad de formacin del producto debe ser mayor que su metabolizacin.
- El cultivo debe tolerar al precursor y al producto formado.
- El precursor debe poder ingresar en la clula y el producto debe ser preferentemente
secretado.
- El precursor debe tener un valor mucho menor al del producto formado.
Planta Precursor Producto
Capsicum frutescens Acido protocatecuico Vainillina y capsaicina
(clulas inmovilizadas) y cido cafeico
Catharanthus roseus Vinblastina Vincristina
(clulas inmovilizadas)
Daucus carota Codeinona Codena
(clulas inmovilizadas)
Mucuna puriens Tirosina L-DOPA
(clulas inmovilizadas)
Rauwfolia serpentina Hidroquinona Arbutina
(clulas inmovilizadas)
Mentha spp. Mentona Neomentol
(clulas inmovilizadas)
Coffea arabica Teobromina Cafena
(clulas inmovilizadas)
Adaptado de: Giri et al., Biotechnology Advances, 2001.
Ejemplos de diseo de procesos
Relacin entre el sistema de cultivo y el patrn
de sntesis del metabolito secundario

Operacin Producto Producto

asociado no-asociado
Batch + +
Batch alimentado + +
Batch alimentado + +
repetitivos
En dos etapas - +
Continuo + -
Perfusin - +
Esquema de un proceso completo para la produccin de un metabolito
secundario por cultivo in vitro de clulas y rganos vegetales
Produccin de shikonina por suspensiones celulares
de Lithospermum erythrorhizon

Shikonina
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery

Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 3 aos.

Suspensiones celulares
- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la produccin.
- Las bajas concentraciones de nitrgeno y la elicitacin inducen
la produccin de shikonina.
- Se utilizan fermentadores de agitacin mecnica y tambor rotatorio.
- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.
Proceso para la produccin de shikonina a partir de clulas
de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Produccin del alcaloide berberina
por suspensiones celulares de Coptis japonica

Berberina
Tomado de: Yamasaki Plant Photo Gallery

Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente de 5-6 aos.

Suspensiones celulares
- Las lneas celulares productoras se seleccionaron a travs de
. protoplastos y screening de por fluorescencia.
- El sistema de cultivo utilizado es el de batch alimentado y el producto est
. asociado al crecimiento.
Produccin de ginsensidos por Panax ginseng

Ginsensidos
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery
Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 5-7 aos .
- Se requieren perodos prolongados de cuidado que exponen a los cultivos
a riesgos de pestes y cambios drsticos de clima.
- La concentracin de saponinas es de 0,5 % peso seco.
Suspensiones celulares
- La concentracin de saponinas es de 0,65 % peso seco.
- La productividad de biomasa es de 700 mg/L/da.
- El medio de cultivo contiene bajas concentraciones de amonio.
- A gran escala se emplean tanques agitados mecnicamente a bajas velocidades.
Races transformadas
- La concentracin de saponinas es de 0,95 % peso seco.
- El medio de cultivo requiere del agregado de 2 mg/L de IBA y de 0,1 mg/L de quinetina.
- A gran escala se emplean tambores rotatorios.
Produccin de taxol por Taxus spp

Tomado de: Schoepke Plant Image Gallery

Taxol

Planta entera
- La edad de los rboles para extraer el producto es de 50-100 aos.
- La concentracin de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.
- Este mtodo de produccin podra llevar a la extincin de la especie.
. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difcil la purificacin del taxol.
. - El material vegeta empleado presenta variacin en la concentracin de precursores.
- Las plantas empleadas crecen lentamente.
Produccin de taxol por Taxus spp

Taxol
Schoepke Plant Image Gallery

Suspensiones celulares de T. brevifolia

- Se emplean metiljasmonato o extractos fngicos como elicitores.
- La composicin ptima de gases es 10% (v/v) oxgeno, 0,5% (v/v) dixido de carbono y 5 ppm de etileno.
- El incremento de la presin osmtica, sacarosa (60 g/L), estimula la produccin.
- Los precursores como la fenilalanina y el cido benzoico incrementan la productividad.
- El taxol puede ser removido in situ con resinas como XAD y el solvente dibutilftalato.
- El sistema de operacin se realizan en dos etapas: la primera para el crecimiento y la segunda
en un medio de produccin con elicitacin.
- Los reactores que se utilizan son de tipo airlift, columna de burbujeo u otros que produzcan
poco estrs hidrodinmico (escalado hasta 75.000 L).
Produccin de alcaloides indlicos de Catharantus roseus:
vincristina y vinblastina

Vinblastina

Tomado de: Manhart Plant Image Gallery

Planta entera
- La planta tiene bajas concentraciones
de alcaloides.
- La purificacin y extraccin son costosas.
Suspensiones celulares
- La limitacin de fosfato y nitrgeno combinado con la elictacin, inducen la produccin de
del precursor ajmalicina (utilizado para tratar hipertencin y problemas cardiolgicos).
- Las lneas celulares seleccionadas son resistentes a las fuerzas de corte, posibilitando
el desarrollo de cultivos a gran escala,
- En los cultivos a gran escala es necesario re-circular los gases de salida.
- Las suspensiones no acumulan alcaloides indlicos dimricos: vinblastina y vincristina.
- Se necesitara aumentar la productividad 40 veces respecto de la productividad especfica
obtenida actualmente (0,26 mg/g peso seco/da) para que el proceso sea viable.
Fenilpropanoides y flavonoides: algunos casos tpicos...

Estructuras de
vainillina y de
distintas
antocianinas
Pelargonidina-3-glucsido R2=OH (1)
Cianidina-3-glucsido R2+R3=OH (2)
Vainillina (1) Delfinidina-3-glucsido R1+R2+R3=OH (3)

Produccin de vainillina en clulas y tallos de Vanilla planifolia cultivados in vitro

Material Medio % Peso Seco Referencia
Fruto - 0,002 Wescott et al., 1994
Races areas transfectadas B5 0,7 Wescott et al., 1994

Produccin de antocianinas por clulas cultivadas in vitro

Especie Material Medio % Peso Seco Referencia

Aralia cordata Suspensin celular B5a cianidin 3-xilosilglucosido 10,3 Sakamoto et al., 1994
Vitis vinifera Suspensin celular B5b Do y Cormier, 1991
Oxalis reclinata Suspensin celular MSc Crouch et al., 1993
a Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L
b Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L NAA, 0,1 mg/L cinetina, y 15 mM total N
c Medio de Murashige y Skoog (1962) con 5 mg ANA y 0,5 mg/L cinetina

Tomado de: Kurtz and Constabel, Agricultural Biotechnology, 1998.

Conclusiones
Aspectos bioingenieriles a resolver:

- Diseo de biorreactores especiales para cultivos

de tejidos vegetales
- Instrumentacin y control de los bioprocesos
- Diseo de biorreactores ms econmicos
- Mtodos no letales para liberacin
de los metabolitos secundarios
- Mtodo adecuado para la remocin in situ

Aspectos biolgicos a resolver:

- Conocimiento de la regulacin de las rutas

biosintticas: enzimas y factores de transcripcin
- Conocimiento de la regulacin del transporte
y acumulacin de los metabolitos secundarios
- Conocimientos de los mecanismos
de degradacin del producto
Referencias 1. Plant Biotechnology. Fowler, M., Gwarren,G.S. and
Moo-Young, M. (eds.). Pergamon Press, 1992.
2. Plant cell and tissues culture en liquid system. Payne,
G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L. Munich
Hanser Publishers, 1991.
3. Secondary products from plant tissue culture.
Charlwood, B. and Rhodes, M.J.C. (ed.). Oxford
University Press, 1990.
4. Design, formulation, and optimization of media. In:
Bioreactor System Design. Asenjo, J. and Merchuk, J.
(ed.) Marcel Dekker Publishers, 1995.
5. Hairy Roots, Culture and Application. Doran, P. (ed.).
Harwood Academic Publishers, 1997.
6. Bioprocess Engineering Principles. Doran, P. Academic
Press, Harcout Brace and Company Publishers, 1998.