C APTULO

CARACTERSTICAS 4
GENERALES DE LOS BACTERIFAGOS FILAMENTOSOS 57

CARACTERSTICAS GENERALES
DE LOS BACTERIFAGOS
FILAMENTOSOS
NELSON SANTIAGO VISPO, MARTA DUEAS
*
Centro de Ingienera Gentica y Biotecnologa. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162,
CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.

ALGUNAS PARTICULARIDADES
DE LOS BACTERIFAGOS FILAMENTOSOS
La familia de los fagos filamentosos pertenece al gnero de los Inovirus, que
comprende una serie de bacterifagos acoplados con el ADN en forma de
simple cadena. A diferencia del bacterifago l, el ensamblaje al nivel de la mem-
brana de la clula hospedera y la salida de las partculas virales no causan la
lisis o muerte de la bacteria. Las bacterias infectadas continan vivas; aunque
su velocidad de crecimiento decrece.
Sobre la base de estudios de difraccin de rayos X [1], los fagos filamentosos
han sido divididos en dos clases; la clase I incluye los virus que infectan Esche-
richia coli, los cuales, aunque presentan diferencias en las secuencias
aminoacdicas de las protenas de la envoltura, poseen una estructura similar
entre s. Algunos de estos bacterifagos como M13 [2], f1 [3] y fd [4] infectan
especficamente a clulas hospederas que son portadoras del plsmido
conjugativo F, responsable de la formacin del pilus F. Los bacterifagos N-
especficos (If1, Ike) infectan clulas de E. coli portadoras del plsmido IneN.
La clase II incluye fagos que infectan bacterias diferentes de E. coli [5].

ESTRUCTURA DE LOS BACTERIGAGOS FILAMENTOSOS

El virus tiene una morfologa cilndrica de 900 nm de largo por 6,5 nm de dime-
tro (Figura 4.1), y su cpsida est formada mayoritariamente por la protena
pVIII con alrededor de 2 700 copias por fago. Por estudios de cristalografa y
espectroscopa ha sido posible deducir que pVIII tiene una estructura secunda-
ria de hlices que va desde el extremo carboxilo terminal y llega a una prolina
en la posicin 6 del extremo aminoterminal. La hlice tiene una inclinacin de
20 respecto al eje del virus y se enrolla en una vuelta
 58 CAPTULO 4

helicoidal dextrgira con un paso de 16,5 , en donde la posicin de cada

subunidad se encuentra separada por 72 en el plano horizontal y 33 en el eje
vertical. Esta disposicin geomtrica del virus se repite a travs de todo su eje
hasta la extremidad de la cpsida [6].

Figura 4.1. Representacin esquemtica de la estructura de los bacterifagos filamentosos con

las protenas que conforman su cpsida.

En una de estas extremidades se encuentran tres o cinco copias de las prote-

nas menores pVII y pIX [7]. Segn el modelo actual, basado en la identifica-
cin de homologa entre la secuencias de los monmeros que constituyen la
cpsida, las regiones hidrofbicas de las dos protenas forman uniones con las
regiones correspondientes de la protena pVIII. Estas subunidades de pVIII, a
diferencia de las dispuestas a lo largo del eje, tienen una hlice anfiptica (re-
gin que va desde la Protena 6 a la Tirosina 21 de pVIII) replegada junto a la
correspondiente porcin de pVII. As se forma un revestimiento hidroflico que
interrumpe la continuidad de la regin hidrofbica repetida regularmente.
La regin de pIX que llega hasta el extremo aminoterminal de pVIII tiene la
funcin de estabilizar esta estructura desde el interior.
Al microscopio electrnico las dos extremidades del fago presentan diferente
morfologa: mientras una parece cuadrada, la otra parece puntiaguda. En esta
ltima se pueden observar minsculas partculas que se eliminan tratndolas
 CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS BACTERIFAGOS FILAMENTOSOS 59

con subtilisina, una proteasa que puede dividir la protena pIII en subdominios
[8]. De este hecho se puede concluir que mientras pVII y pIX se encuentran en
la extremidad cuadrada, pVI y pIII se encuentran en la extremidad puntia-
guda. Un modelo de la estructura de estas ltimas protenas, presentes en los
fagos en alrededor de cinco copias, asume que el extremo aminoterminal de
pVI es estructuralmente homlogo a dos monmeros de pVIII que en esta ter-
minacin exponen un mayor nmero de residuos hidrofbicos respecto al
monmero de la posicin interna. De esta forma pVI interacta por una parte
con pVIII y por la otra con el extremo carboxilo terminal de pIII, que expone a
la periferia el dominio globular del extremo aminoterminal.

CICLO INFECTIVO DE LOS BACTERIFAGOS FILAMENTOSOS

Los fagos filamentosos infectan exclusivamente bacterias Gram-negativas en
las que se encuentra presente el pilus sexual F. Este pilus se encuentra codifi-
cado por los genes del opern tra de los plsmidos conjugativos F. El pilus es
una estructura que participa en la transferencia del ADN del plsmido F o el
ADN del cromosoma que contiene al plsmido integrado, en la bacteria que
carece del ADN del plsmido. El pilus tiene una estructura tubular formada
de protenas (pilina), la cual es ensamblada y desensamblada por
polimerizaciones y despolimerizaciones de las subunidades de pilina en la
membrana interna de la bacteria [9, 10].
El gen III codifica para un precursor de 42 522 Dalton que sufre un proceso de
maduracin en la membrana bacteriana con el corte de los primeros 18
aminocidos del extremo N-terminal [11]. La protena pIII en la cpsida del
fago presenta una estructura en donde el extremo C-terminal, de forma extendi-
da, interacciona con las otras protenas de la cpsida y el extremo aminoterminal,
replegado y con un giro al exterior, interacciona con el pilus. La protena pVI
participa tambin en la formacin del complejo de adsorcin del fago, tiene
una masa molecular de 12 000 Dalton (112 aminocidos), y al igual que pIII
representa un papel fundamental en el proceso de ensamblaje de la cpsida.
Mutantes de delecin de esta protena son incapaces de infectar y dan lugar a
estructuras polifgicas con una cpsida mucho ms larga que la del fago salvaje.
Durante el proceso infectivo el ADN de simple cadena (ADNsc) del fago
pierde las protenas de la cpsida, las protenas pVIII se mantienen en la
membrana interna clular y son reutilizadas en el ensamblaje de la nueva
progenie [12]. Una vez que entra la molcula de ADNsc se sintetiza el
filamento complementario (-) con la particiapcin de la polimersa
bacteriana. A partir de la horquilla C se inicia la sntesis de un filamento
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(aproximadamente 20 nucletidos) por la ARN polimerasa, el cual constituye

el filamento de inicio que viene elongado por la ADN polimerasa III. Despus
de un primer ciclo de replicacin y con la formacin del filamento (+), la ADN
polimerasa I degrada el filamento de inicio. As se constituye la forma replicativa
(FR) de doble cadena del ADN del fago, que es recircularizado por la ADN
ligasa bacteriana. Una vez concluido este proceso, el producto del gen II (pII)
corta el filamento (+) en una regin especfica situada entre los genes II y IV,
que se denomina regin intergnica (RI) [13].
La protena pII, con una masa molecular de 46 137 Dalton, se encuentra aso-
ciada a la membrana de la clula infectada en el orden de 103 protenas/clula
[14]. Despus del corte realizado por pII, la ADN polimerasa I contina con el
proceso replicativo. Durante los primeros 15-20 min de la infeccin el filamen-
to (+) es convertido en la forma replicativa de doble cadena del ADN (ADNdc).
Cuando se acumulan entre 100-200 copias del ADNdc la protena pV, presente
en alrededor de 105 protenas/clula, se une al filamento (+) e inhibe la sntesis
del filamento (-). De esta forma pV regula el nmero de FR presente en el
interior de la bacteria. El mecanismo de inhibicin implica la unin de pV al
extremo 5 del ARN mensajero (cido ribonucleico mensajero) de pII que de
esta forma no puede ser traducido [15]. La protena pV, con una masa molecular
de 20 000 Dalton, presenta una estructura globular, activa en forma de
homodmero, capaz de unirse al ADN. Esta unin tiene como primera funcin
la regulacin de la replicacin del filamento complementario, y como segunda
inhibir la degradacin del ADNsc por parte de las nucleasas bacterianas. El
complejo pV-ADN presenta una estructura morfolgicamente similar al fago
ensamblado. Los datos de espectroscopa indican que esta estructura forma un
complejo flexible con un dimetro de 8-9 nm y un paso medio de 9 nm en
donde cada subunidad de pV se une a cinco nucletidos del ADN [16]. Esta
precpsida presenta una secuencia nucleotdica terminal denominada seal
morfogentica (SM), La regin del ADN que incluye esta secuencia no es tra-
ducida, su funcin consiste exclusivamente en servir como sitio de unin para
las protenas que participan en el ensamblaje de las partculas fgicas.

MORFOGNESIS DE LOS BACTERIFAGOS FILAMENTOSOS

El modelo propuesto actualmente para el ensamblaje de las protenas que con-
forman la cpsida de los bacterifagos (Figura 4.2) involucra la interaccin de
la secuencia SM con las protenas pVII y pIX. Estas protenas, con una masa
molecular de 36 000 Dalton, son las primeras en unirse al ADNsc y salir de la
clula durante la produccin de la progenie [17]. Las mismas son sintetizadas
en forma madura y poseen un dominio transmembranario en donde los residuos
 CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS BACTERIFAGOS FILAMENTOSOS 61

hidrofbicos interactan con los otros elementos de la cpsida en el proceso de

la morfognesis. En el extremo C-terminal existe un nmero variable de
aminocidos cargados positivamente que contribuyen a formar un complejo de
iniciacin al unirse a la SM. A partir de mutantes defectivos en el proceso de
ensamblaje, en los que esta regin genmica fue delecionada, se han seleccio-
nado algunos seudorrevertantes viables [18].

Figura 4.2. Representacin esquemtica del proceso de ensamblaje de las protenas de la cpsida
de los bacterifagos. El ensamblaje ocurre a travs de un canal formado por pI, pIV
y pXI. La tiorredoxina (Trx) y el ATP se asocian a pI en este proceso. Las flechas
en el periplasma indican el movimiento hipottico de las protenas de la cpsida,
ancladas en la membrana interna (MI) hacia el sitio de ensamblaje. Membrana ex-
terna (ME). Peptidoglicano (PG).

De estos mutantes compensatorios, once han sido secuenciados en el gen IX, uno
en el gen VII y doce en el gen I. El producto del gen VII participa en el proceso de
separacin de pV del ADN y en el recubrimiento del mismo por las protenas de la
cpsida. Todava no esta claro el mecanismo mediante el cual las protenas fgicas
pI y pIV se ubican sobre la membrana interna y externa de la bacteria [19].
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La protena pIV puede ser copurificada con la membrana interna y tambin con
la externa, aunque parece localizarse en las proximidades de esta ltima, con
los dominios amino y carboxilo terminales hacia el espacio periplasmtico [19].
pIV es una protena de una masa molecular de 43 476 Dalton, rica en aminocidos
cargados (7,7 % bsicos y 9,6 % cidos). La prediccin de su estructura secun-
daria sugiere una serie de 16 hojas , con una longitud de 6 a 24 residuos, lo que
permite asociarle una funcin de porina [20]. Esta disposicin de las hojas en
forma perpendicular a la superficie permite el paso de las molculas hidroflicas
sin alterar la estructura de la membrana.
A diferencia de las porinas, [21] pIV no forma multmeros estables al ser some-
tida al calor, aunque resultados recientes muestran la presencia de agregados
que se copurifican por sedimentacin. De esta manera se presentan estructuras
formadas por 10 a 12 monmeros que no parecen estar asociados con otras
protenas bacterianas [22]. Algunos experimentos de sustitucin con protenas
correlacionadas de otros fagos filamentosos concluyeron que el extremo N-
terminal de pIV interacta directamente con pI. Esta asociacin parece ser tem-
poral debido a que las dos protenas no se copurifican [23]. La protena pI tiene
una masa molecular de 39 502 Dalton, presenta una regin hidrofbica de an-
claje a la membrana interna la cual se expande hasta el espacio periplasmtico
con un dominio de 100 aminocidos. El dominio citoplasmtico, adems de
interactuar con la secuencia SM, lo hace con la protena bacteriana tiorredoxina.
Sobre la base del modelo actual, el ensamblaje de la cpsida ocurre simultnea-
mente con el proceso de estrucin: pI y pIV contribuyen a la formacin de un
canal dinmico temporal en cuyo interior ocurre el crecimiento del fago hacia
la superficie externa con el empaquetamiento del genoma por parte de pVIII.
La protena pVIII es codificada por el gen VIII en forma de un precursor de 73
aminocidos el cual sufre en la membrana un proceso de maduracin que im-
plica el corte de los primeros 23 aminocidos por una peptidasa seal bacteriana.
La protena madura de 50 aminocidos puede ser esquemticamente dividida
en tres regiones: aminoterminal, hidrofbica y carboxiloterminal.
Despus de la maduracin, pVIII se encuentra en la membrana con la regin
aminoterminal hacia el periplasma. Los monmeros de pVIII, con ayuda de las
protenas que participan en la morfognesis, se van ubicando helicoidalmente
alrededor de la molcula de ADNsc. En el transcurso del empaquetamiento del
fago las hlices , pertenecientes a la regin hidrofbica, interactan entre s y
estabilizan la estructura final de la cpsida. La regin carboxilo terminal de
pVIII, cargada positivamente, se orienta hacia el interior del virus; esta regin
se une al ADNsc a travs de puentes salinos en una relacin de 2,3 bases por
monmero de pVIII [24]. La sustitucin de residuos de lisina (K+) en la regin
 CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS BACTERIFAGOS FILAMENTOSOS 63

carboxilo terminal de pVIII conlleva a una variacin en el nmero de protenas

necesarias para saturar la carga negativa de los grupos fosfatos del ADN y, por
consiguiente, producen una modificacin en la longitud del virus [25].
La culminacin de la morfognesis del fago est determinada por la insercin
del complejo proteico de pVI y pIII, que es el ltimo en salir de la bacteria. Es
particularmente interesante que la regin genmica a la que se une este com-
plejo contiene una parte del gen III, como si esta regin contuviera una seal de
terminacin.
Se ha observado que el 2,5 % de la progenie fgica est constituida por virus
con una longitud el doble de lo normal [26]. El modelo actual plantea que la
unin de monmeros de pVIII ocurre hasta que la ausencia de ADNsc causa un
aumento de la afinidad de pVI por el sitio de terminacin. De este modo la
unin de pVI con pVIII/ADNsc interrumpe el crecimiento del fago y cierra la
extremidad distal [27].
Los fagos filamentosos no producen la lisis de las bacterias que infectan, sino
que el crecimiento de las mismas disminuye como consecuencia de la replicacin
del fago. Esta disminucin que va desde hasta de la velocidad normal se
traduce en las placas de medio de cultivo con la presencia de pequeas placas
trbidas en un medio de agar con un sembrado a saturacin de una cepa permisiva
de E. coli [28].
El genoma de los fagos filamentosos esta constituido por una molcula de
ADNsc, de 6,4 kb (6,407 kb para M13 y f1 y 6,408 kb para fd). El ADNsc
contiene toda la informacin necesaria para la sntesis de sus 11 protenas,
las cuales difieren en cuanto a la talla y al nmero de copias [29]. La dispo-
sicin de los genes virales en el orden de la transcripcin es:
IIXVVIIIXVIIIIIIVIIXIIV.
Esta organizacin refleja una relacin funcional en dependencia de la distan-
cia entre los genes: los productos de los genes II, X y V son necesarios para
la replicacin; los genes estructurales van del VII al VI; mientras que el I, XI
y el IV participan en la morfognesis [30]. Se ha demostrado, mediante di-
gestiones con nucleasas especficas para el ADNsc y datos cristalogrficos,
que slo el 2 % del genoma del fago posee una estructura secundaria apareada.
Entre estas regiones apareadas se encuentra la secuencia SM y junto a ella,
algunas estructuras en forma de horquilla de gran importancia para la
replicacin genmica [31]. Todas estas secuencias se encuentran entre los
genes IV y II en la regin intergnica (RI) mayor, adems de una porcin
genmica de alrededor de 508 nucletidos no codificantes donde se encuen-
tran algunos terminadores de la transcripcin [32].
 64 CAPTULO 4

En el interior del genoma de los fagos filamentosos se encuentra otra secuencia

no codificante entre los genes VIII y III, donde se localiza un terminador de la
transcripcin rho-independiente. Su funcin es esencial para el mantenimiento
del balance transcripcional entre estos dos genes, cuyos productos se encuentran
representados en cantidades bien diferentes [33]. Excepto por estas dos regiones
no codificantes, los diferentes genes se encuentran separados por pocos
nucletidos. El gen IX utiliza algunos nucletidos de los genes vecinos VII y
VIII [34], y lo mismo ocurre para los genes I y IV que tienen en comn 23 bases.
Uno de los problemas an no resueltos es el mecanismo mediante el cual el fago
puede mantener en un genoma tan pequeo, un balance transcripcional tan diverso.

TRANSCRIPCIN DE LAS PROTENAS

DE LOS BACTERIFAGOS FILAMENTOSOS

Una vez que el filamento (-) de ADN ha sido sintetizado se inicia la produccin
de las protenas fgicas a travs del uso de las enzimas del hospedero. Esta
sntesis es independiente de la replicacin del fago y la presencia de estos pro-
ductos ha sido observada incluso en fagos defectivos que no producen partcu-
las infectivas [35]. La RI contiene cinco zonas resistentes a la degradacin por
nucleasas, con una estructura secundaria en forma de horquillas, que juegan un
importante papel en la regulacin del ciclo infectivo del bacterifago.
La horquilla A comprende los nucletidos desde el 5499 hasta el 5576 y como
vecina del gen IV representa la seal morfogentica (SM) que funciona como
terminador de la transcripcin rho-dependiente. De inmediato, hacia el gen II,
se encuentran las horquillas B, C, D y E que poseen actividad de terminadores
de la transcripcin independientes de rho [36]. La sntesis del filamento (-)
comienza, a cargo de la ARN polimerasa, en la horquilla C entre los nucletidos
5736 y 5717. En la horquilla D se inicia la sntesis del filamento (+) entre los nucletidos
5780 y 5781 (5781-5782 en los fd) despus del corte por la protena pII.
A partir de experimentos in vivo ha sido posible individualizar los promotores
de los genes II, X, V, VIII, III y IV. Los intentos de explicar el balance
traduccional han conducido a los diferentes autores a proponer un mecanismo
de cascada en base al cual los genes bajo el dominio de mayor nmero de
promotores, son transcritos ms activamente. Esta hiptesis viene avalada por el
hecho de que los genes III, VI y I tienen niveles transcripcionales comparables.
Por otra parte, el gen VIII, aunque se encuentra junto a promotores de genes
que se transcriben en menor cantidad (genes V, VII y IX), presenta un promotor
especfico que mantiene elevado su nivel transcripcional [37]. Por el contrario,
 CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS BACTERIFAGOS FILAMENTOSOS 65

la ocurrencia de una transcripcin activa del gen VIII no influye sobre los genes
vecinos debido a la presencia de un terminador rho-independiente [38].
Otro factor que puede influir sobre los niveles transcripcionales es la estabilidad
diferencial de los ARN mensajeros. Se ha observado que la vida media del
ARN mensajero decrece con el aumento del tamao en un rango que va desde
0,5 a 11 min. En el caso de los genes VII y I, para los que no se han identificado
promotores especficos, en vez de los mecanismos de transcripcin, se ha pro-
puesto una regulacin traduccional de los niveles proteicos.
Es factible entonces que el balance transcripcional sea el resultado de la combina-
cin de una serie de factores y no debido a la accin de un solo mecanismo [39].
La protena pX es el resultado de la iniciacin de la transcripcin en el codn
300 del gen II que codifica para metionina. Por lo tanto pX y pII tienen la
misma secuencia en el extremo carboxilo terminal.
Los productos de los genes pI, pIV y pXI son necesarios para el ensamblaje,
pero no forman parte de la partcula fgica. La protena pI es sintetizada sin la
secuencia seal en el extremo aminoterminal y su insercin en la membrana es
dependiente del sistema Sec del hospedero [40]. La protena pXI fue primera-
mente llamada pI* debido a que es el resultado de la traduccin del gen I a
partir del codn 241 [41]. Los 108 residuos aminoacdicos de pXI son homlogos
al extremo carboxilo terminal de pI.

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