2012

Sntesis y determinacin estructural
de pptidos derivados de
Dermaseptina con actividad
antileishmanial
CARLOS ANDRS RODRGUEZ VEGA
Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelln

Facultad de Ciencias
Escuela de Qumica
Maestra en Ciencias Qumica
Proyecto Bicentenario: Actividad citotxica e inmunomoduladora de
pptidos sintticos de origen natural - 20101007930
2011
Sntesis y determinacin estructural
de pptidos derivados de
Dermaseptina con actividad
antileishmanial
CARLOS ANDRS RODRGUEZ VEGA
Tesis presentada como requisito parcial para optar al ttulo de:

Magister en Ciencias Qumica
Directora:
PhD. BLANCA FABIOLA ESPEJO BENAVIDES
Grupo de Investigacin:
Grupo Fisicoqumica Orgnica
Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelln

Facultad de Ciencias
Escuela de Qumica
Maestra en Ciencias Qumica
Proyecto Bicentenario: Actividad citotxica e inmunomoduladora de pptidos sintticos de
origen natural - 20101007930
2011
Agradecimientos
A Dios, por todas las bendiciones y su compaa durante toda mi vida; por iluminar el
camino y fortalecerme en aquellos momentos difciles, poniendo en mi camino personas
valiosas que me ayudaron a superar los obstculos.
A mi familia, especialmente a mi madre Rosana por sus sacrificios que hicieron posible
que pudiera superarme cada da. A mis hermanos Ana M. y Rubn, los cuales
fomentaron en mi el espritu de superacin.
Agradezco sinceramente a la Doctora Blanca Fabiola Espejo Benavides, Directora de mi

tesis de maestra, por su apoyo incondicional, confianza y enseanza durante el
desarrollo de mi tesis.
Al grupo de investigacin en inmunotoxicologa (COL 0068495) de la Universidad

Nacional de Colombia en Bogot, bajo la direccin de la Doctora Gabriela Delgado por
toda la colaboracin brindada en los ensayos biolgicos. Hago un agradecimiento
especial a Julin Prez Cordero por su colaboracin y valiosa amistad.
.
A la Universidad Nacional de Colombia por permitir mi ingreso a los estudios de

educacin superior, acogindome con profesores de alto conocimiento y calidad humana.
Un especial agradecimiento a la profesora y amiga Luz Mary Salazar Pulido por su apoyo
y confianza en mi vida profesional y personal.
A mis amigos Diana M. Arango, Ana Cristina Jaramillo, Pablo Andrs Ruiz, y Alejandro
Chacn por todo su apoyo y colaboracin.
Y a todas aquellas personas que de una u otra forma participaron en la realizacin de

esta investigacin, hago un sincero agradecimiento.
Resumen y Abstract IV
Resumen
En este estudio se sintetizaron 11 pptidos con posible actividad biolgica contra
Leishmania panamensis por medio de sntesis de pptidos en fase slida (SPPS), a
partir de aminocidos N-Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) protegidos [1], purificados por
liofilizacin y cromatografa lquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-HPLC),
caracterizados por espectrometra de masas y dicrosmo circular (DC), lo cual permiti
establecer la estructura secundaria de carcter helical de los pptidos. Se encontr
actividad contra Leishmania panamensis, lo cual nos lleva al uso potencial como
compuesto activo para el tratamiento de la Leishmaniasis. La mejor accin biolgica
contra el parasito se encontr para el pptido DM1, el cual fue capaz de inhibir el
crecimiento de promastigotes de L. panamensis a concentraciones de uso teraputico,
causando porcentajes de hemlisis y de citotoxicidad relativamente bajos.
Palabras clave: Pptidos sintticos, leishmaniasis, Leishmania panamensis, Fmoc.
Abstract
In this study we synthesized and evaluated 11 peptides with possible biological activity
against Leishmania panamensis by solid-phase peptide synthesis (SPPS), from amino
acids N-Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) protected [1], purified by lyophilization and
high performance liquid chromatography in reverse phase (RP-HPLC), characterized by
mass spectrometry and circular dichroism (CD), which allowed us to establish the
secondary structure of helical nature of the peptides. We found activity against
Leishmania panamensis, which leads to the potential use as active compound for the
treatment of leishmaniasis. The best biological action against the parasite was found for
the peptide called DM1, which was able to inhibit the growth of L. panamensis
promastigotes at concentrations of therapeutic use, causing hemolysis rates and
cytotoxicity of monocytes relatively low.
Keywords: Synthetic peptides, leishmaniasis, Leishmania panamensis, Fmoc.
Contenido V
Contenido
Pg.
Resumen ......................................................................................................................... IV
Lista de figuras .............................................................................................................. VII
Lista de tablas .............................................................................................................. VIII
Lista abreviaturas........................................................................................................... IX
Introduccin .................................................................................................................... 1
1. Planteamiento del problema y justificacin ........................................................... 3
2. Hiptesis ................................................................................................................... 7
3. Objetivos ................................................................................................................... 9
3.1 Objetivo general: ................................................................................................ 9
3.2 Objetivos especficos: ........................................................................................ 9
4. Marco terico y estado del arte ............................................................................. 11

4.1 Leishmaniasis, enfermedad tropical endmica ................................................. 11
4.2 Pptidos antimicrobianos, Dermaseptinas ........................................................ 13
4.3 Sntesis de pptidos ......................................................................................... 15
4.4 Sntesis de pptidos en fase slida .................................................................. 16
4.5 Soporte slido para SPPS ................................................................................ 19
4.6 Disolventes en SPPS ....................................................................................... 19
4.7 Agitacin y lavados en SPPS ........................................................................... 20
5. Materiales y mtodos ............................................................................................. 21

5.1 Estudios previos y seleccin de secuencias para sntesis ................................ 21
VI Sntesis y determinacin estructural de pptidos derivados de Dermaseptina con
actividad antileishmanial
5.2 Sntesis qumica en fase slida Fmoc de las secuencias .................................. 21

5.3 Purificacin de los pptidos .............................................................................. 23
5.3.1 Liofilizacin .....................................................................................................23
5.3.2 Cromatografa lquida de alta eficiencia ..........................................................23
5.4 Caracterizacin de los pptidos ........................................................................ 24
5.4.1 Espectrometra de masas MALDI-TOF ...........................................................24
5.4.2 Dicrosmo circular (DC) ..................................................................................24
5.5 Ensayos biolgicos ........................................................................................... 24
5.5.1 Hemates ........................................................................................................25
5.5.2 Monocitos .......................................................................................................25
5.5.3 Parsitos ........................................................................................................25
5.5.4 Pptidos y controles .......................................................................................26
5.5.5 Ensayos de hemlisis .....................................................................................26
5.5.6 Ensayos de citotoxicidad ................................................................................27
5.5.7 Ensayos de efectividad sobre formas extracelulares de L. panamensis. ........28
6. Resultados y discusin ..........................................................................................30

6.1 Estudio previo y anlisis bioinformtico ............................................................. 30
6.2 Sntesis qumica Fmoc de los anlogos seleccionados ..................................... 34
6.3 Purificacin de pptidos .................................................................................... 43
6.4 Caracterizacin de pptidos .............................................................................. 45
6.4.1 Espectrometra de masas MALDI-TOF ...........................................................45
6.4.2 Dicrosmo circular...........................................................................................50
6.5 Ensayos biolgicos ........................................................................................... 53
6.5.1 Ensayo de hemlisis ......................................................................................53
6.5.2 Ensayo de citotoxicidad ..................................................................................55
6.5.3 Ensayos de efectividad sobre promastigotes de L. panamensis .....................55
7. Conclusiones ..........................................................................................................61
Bibliografa .....................................................................................................................63
Lista de figuras VII
Lista de figuras
Figura 1. Principios de SPPS tomado de [56] ................................................................ 17
Figura 2. Epimerizacin por medio de la formacin de Oxazolonas, tomado de [56]. ... 18
Figura 3. Helical Wheel para DM1 ................................................................................. 33
Figura 4. Helical Wheel para DM17 ............................................................................... 33
Figura 5. Reacciones para la activacin de Fmoc-aminocidos con DCC y HOBt ......... 35
Figura 6. Mecanismo de desproteccin grupo Fmoc ..................................................... 37
Figura 7. Reacciones para la prueba de ninhidrina en presencia de un grupo amino. ... 39
Figura 8. Esquema de desanclaje de un pentapptido en medio cido ......................... 41
Figura 9. Esquema de formacin de dicetopiperazinas, tomado de [92] ........................ 42
Figura 10. Corrida cromatogrfica en fase reversa para DM11 ...................................... 44
Figura 11. Formacin de piroglutmico a partir de glutamina......................................... 46
Figura 12. Espectro de masas MALDI-TOF para DM1 ................................................... 47
Figura 13. Espectros de masas MALDI-TOF para anlogos de dermaseptina ............... 48
Figura 14. Espectros de DC para anlogos de dermaseptina ........................................ 52
Figura 15. Efecto de la concentracin de DM1 sobre la supervivencia de L. panamensis
....................................................................................................................................... 57
Figura 16. Grfico de la distribucin de la hidrofobicidad por aminocido para los
anlogos de dermaseptina. ............................................................................................ 58
Lista de tablas VIII
Lista de tablas
Tabla 1. Estudio bioinformtico de Dermaseptina S1...................................................... 31
Tabla 2. Secuencias de los anlogos seleccionados para el estudio .............................. 32
Tabla 3. Tiempo total y nmero de ciclos efectuados para la sntesis de los anlogos ... 41
Tabla 4. Tiempo total y nmero de ciclos en los anlogos de dermaseptina ................... 43
Tabla 5. Tiempos de retencin y pico de masas para los anlogos de dermaseptina ..... 45
Tabla 6. Variaciones ms comunes de m/z encontradas para los anlogos de
dermaseptina .................................................................................................................. 49
Tabla 7. Estructura secundaria de los anlogos de dermaseptina por dicrosmo circular
con el programa CONTINLL............................................................................................ 51
Tabla 8. Actividad hemoltica y citotxica de los pptidos sobre eritrocitos y monocitos de
sangre perifrica humana respectivamente. La concentracin media Hemoltica (HC50) y
la concentracin letal media (CL50) expresada en g/mL ................................................ 54
Tabla 9. Eficacia de los anlogos de dermaseptina sobre promastigotes de L.
panamensis. La concentracin media efectiva (EC50) es expresada en g/mL. ............. 56
Tabla 10. Secuencias de anlogos modificados de DM1 ................................................ 60
Lista de abreviaturas IX
Lista abreviaturas
ACN: acetonitrilo
Boc: tertbutoxicarbonilo
Bzl: bencilo
CE50: Concentracin efectiva media
CH50: Concentracin hemoltica media
CL: Leishmania cutnea
CL50: Concentracin letal media
DC: Dicrosmo circular
DCC: N,N-diciclohexilcarbodiimida
DCM: diclorometano
DIEA: N,N-diisopropiletilamina
DMF: dimetilformamida
EDT: 1,2-etanoditiol
FBS: Suero fetal bovino
Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo
HF: Fluoruro de hidrgeno
HOBt: 1-hidroxibenzotriazol
IPA: isopropanol
L. panamensis: Leishmania panamensis
MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption of Ions Time-of-Flight
NMP: N-metilpirrolidona
OMS: Organizacin mundial de la salud
OtBu: t-butil ster
PA: Poliamida
PAMs: Pptidos antimicrobianos
Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
PBS: Buffer fosfato salino
PEG: Polietilenglicol
PS: Poliestireno entrecruzado
RP-HPLC: Cromatografa lquida de alta eficiencia en fase reversa
RPMI: medio Roswell Park Memorial Institute
SPPS: Sntesis de pptidos en fase slida
TBTU: O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
tBu: t-butilo
TFA: cido trifluoroactico
TFE: 2,2,2-trifluoroetanol
TIS: triisopropilsilano
UFA: Unidades arbitrarias de fluorescencia
VL: Leishmania visceral
Introduccin
Los pptidos antimicrobianos (PAMs) son molculas muy importantes en el sistema
inmune de muchos organismos, incluyendo el humano. Estos pptidos usualmente son
de tamao pequeo, con caractersticas amfipticas y carga positiva totalmente definida
[2, 3]. Para los PAMs se ha encontrado actividad contra virus, hongos, bacterias e incluso
contra clulas tumorales. Los mecanismos de accin de los diferentes pptidos
reportados son demasiados, entre los representativos se encuentran la interaccin con
membrana celular, inhibicin en alguna de las funciones como la sntesis de cidos
nucleicos y protenas, tambin se reporta accin inmunomoduladora y cicatrizante [4, 5].
El presente estudio propuso sintetizar y evaluar la actividad de 11 pptidos sintticos a

diferentes concentraciones frente a parsitos de Leishmania. Los resultados indican que
de las once secuencias, solo 1 mostr actividad Leishmanicida contra promastigotes de
L. panamensis nombrado como DM1. La concentracin efectiva media (CE50) hallada
fue de 151,9g/mL con R2 superior a 0.9 para todos los ensayos. Se realizaron las curvas
de viabilidad de L. panamensis vs la concentracin empleada para DM1.
Se estandariz y se puso a punto la tcnica para obtener por medio de sntesis Fmoc, las
diferentes secuencias peptdicas. Para estas secuencias se vari la concentracin de
activadores, aminocidos y naturaleza del solvente, usando una resina Rink amida de
sustitucin conocida. La cantidad de pptido obtenido estuvo alrededor de los 50 mg de
pptido/ 100 mg de resina. En este estudio, la sntesis en fase slida Fmoc resulto ser
una alternativa limpia y ptima para la produccin de pptidos con actividad biolgica. La
purificacin de cada uno de los pptidos se realiz por cromatografa lquida de alta
eficiencia en fase reversa (RP-HPLC) y liofilizacin. Se logr establecer el gradiente de
solventes ideal para la purificacin de cada uno de los pptidos. La caracterizacin de los
pptidos se realiz por espectrometra de masas MALDI-TOF, en la cual se logr
confirmar las secuencias peptdicas.
2 Introduccin
Con ayuda de las herramientas bioinformticas, usando el servidor Scratch Protein

Predictor (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) [6], se realizaron las predicciones de la
estructura secundaria de cada una de las secuencias, las cuales fueron comparadas con
los datos experimentales obtenidos por medio de dicrosmo circular (DC), indicando que
tanto por medio de las herramientas bioinformticas como por DC el carcter helical de
todas las secuencias estuvo por encima de 41.5%.
Por otro lado, a las mximas concentraciones evaluadas para cada uno de los pptidos,
la citotoxicidad sobre monocitos de sangre perifrica humana fue mnima calculndose
concentracin letal media (CL50) superiores a 200g/mL. El estudio del carcter
hemoltico de cada una de las secuencias se evalu sobre eritrocitos humanos de
donantes sanos grupo O Rh positivo, encontrando porcentajes menores de 6.2% a la
mxima concentracin del estudio.
1. Planteamiento del problema y justificacin
Las infecciones bacterianas y parasitarias en humanos han aumentado de forma
dramtica debido a la aparicin de cepas resistentes a los compuestos antibacterianos y
antiparasitarios, por lo que la bsqueda y desarrollo de nuevos compuestos con actividad
antibacterial y antiparasitaria se ha convertido en una prioridad para el control de la
resistencia y multirresistencia que los microorganismos generan en el organismo. Aunque
la resistencia a los pptidos antimicrobianos es mucho menor comparada con antibiticos
convencionales, existen mecanismos de resistencia, tales como la degradacin por
proteasas, la liberacin de protenas inhibidoras o cambios en la conformacin de la
membrana externa del patgeno [7] que hacen que se busquen y mejoren este tipo de
molculas. El desarrollo de nuevos agentes antibacterianos requiere de la elaboracin
eficaz de compuestos que preferiblemente sean encontrados de manera natural y que
sean viables de obtener por medio de metodologas sintticas relativamente econmicas
y favorables con el medioambiente, haciendo a este tipo de molculas selectivas y con
alta actividad frente a los diferentes microorganismos que causan diferentes
enfermedades.
La diversidad de pptidos de origen natural que tienen actividad biolgica demostrada es

alta. Hasta el momento se encuentran reportadas 21,698 secuencias contra cncer,
enfermedades cardiovasculares, diabetes, apoptosis entre otras [8]. Se ha encontrado
que la linfa de los insectos, los grnulos de los neutrfilos humanos y la piel de las ranas
contienen pptidos que pueden matar bacterias en medios de cultivos [7]. Adems de
destruir directamente microorganismos, algunos son capaces de promover la generacin
de cierta inmunidad, particularmente de la inmunidad innata, lo que genera el concepto
de pptidos de defensa innata [9, 10]. A partir de la estructura de los pptidos naturales
se llevan a cabo variaciones en la sntesis para obtener nuevos pptidos que aumenten
la actividad antimicrobiana y presenten baja toxicidad, como es el caso de la actividad
antileishmanial [11, 12].
4
Sntesis y determinacin estructural de pptidos derivados de Dermaseptina con

actividad antileishmanial
Las especies como insectos, animales y plantas que son capaces de sobrevivir y convivir
en un medio ambiente hostil donde un ser humano no podra, eventualmente poseeran
un "sistema inmune" o de defensa que proporciona una mayor posibilidad de
supervivencia. Estas cualidades pueden ser usadas al enfrentarlas a ciertos
microorganismos que causen problemas en el hombre. Si buscamos, localizamos e
identificamos las molculas secretadas por estos organismos, en su mayora pptidos,
podremos llegar a encontrar nuevas y efectivas soluciones que permitan tratar y enfrentar
ciertas enfermedades que son resistentes a medicamentos conocidos actualmente.
Uno de los problemas que se ha intentado enfrentar es una enfermedad de tipo

parasitaria denominada Leishmaniasis, que tiene un carcter endmico en regiones de
Amrica, frica, Asia y los pases europeos meridionales. Segn datos de la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS), ms de 350 millones de personas en 88 pases
corren el riesgo de infeccin de esta enfermedad tropical. Se cree que cerca de 12
millones de personas estn infectadas actualmente, y se esperan de 1-2 millones de
nuevos casos por ao [13]. Hasta el momento no existe ninguna vacuna eficaz contra la
leishmaniasis y el nico mtodo para tratar la enfermedad consiste en tratamiento con
diferentes frmacos los cuales en su mayora se han desarrollado a mitad del siglo
pasado [14]. Como la resistencia del parsito frente a los medicamentos usados se
vuelve ms frecuente, hay una creciente preocupacin de que los frmacos actualmente
se conviertan en tratamientos ineficaces para el control de la enfermedad. En
consecuencia, existe una necesidad apremiante de desarrollar nuevos compuestos que
sean activos contra cepas resistentes de los medicamentos que actualmente se usan
para el tratamiento de la Leishmania. Por tanto, el desarrollo de nuevos agentes
antileishmaniales basados en pptidos con una actividad especfica se convierte en una
alternativa de gran inters para combatir la enfermedad.
En este trabajo se realiz el diseo y sntesis de pptidos derivados de Dermaseptina

(ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ) [12, 15], los cuales fueron
sintetizados por la tcnica en fase slida Fmoc, purificados por Liofilizacin y HPLC en
fase reversa (RP-HPLC) y caracterizados por espectrometra de masas MALDI-TOF y
Dicrosmo Circular (DC). De los pptidos evaluados, solo 1 present actividad contra
Planteamiento del problema y justificacin 5
promastigotes de L. panamensis lo cual es un indicio de su potencial actividad

antimicrobiana contra esta especie del parsito Leishmania.
2. Hiptesis
El uso de pptidos como tratamiento contra la Leishmania est muy poco estudiado. Uno
de los estudios reportados consiste en evaluar el potencial antileishmanial de Andropina,
Cecropina A, Cecropina B, Cecropina P1 y Dermaseptina. De los pptidos evaluados,
slo Dermaseptina present actividad Leishmanicida (selectiva frente a Leishmania
major) y a concentraciones iguales o superiores a 12.5 g/mL present actividad
hemoltica y citotxica [16]. La modificacin de las secuencias con actividad demostrada,
abrir un campo ms amplio para el mejoramiento de molculas biolgicamente activas y
de mayor eficacia para el control y tratamiento de la enfermedad. La actividad citotxica
demostrada de los pptidos sobre la bicapa lipdica y al momento de usarlos va
sistmica hace que se tenga en cuenta esta actividad para el mejoramiento de
propiedades como carga y estructura de los pptidos [3]. Realizar rompimientos dirigidos
de la secuencia de Dermaseptina con ayuda de herramientas bioinformticas, tendr
efecto sobre la actividad antileishmanial de L. panamensis, citotoxicidad y carcter
hemoltico, las cuales estarn relacionadas directamente con la variacin de la estructura
secundaria, en especial -hlice, y de alguna manera con la carga de las molculas
propuestas.
3. Objetivos
3.1 Objetivo general:

Sintetizar y evaluar 11 pptidos derivados de Dermaseptina que posean accin sobre
promastigotes de Leishmania aumentando la actividad antileishmanial.
3.2 Objetivos especficos:

Adecuar los protocolos necesarios para sintetizar y purificar pptidos con
actividad biolgica contra leishmaniasis.
Evaluar la contribucin de la estructura de los pptidos en la actividad frente a
Leishmania.
Estudiar la accin biolgica de los pptidos sintetizados y compararla con la de
pptidos ya reportados.
Modificar los anlogos de Dermaseptina usando herramientas bioinformticas con
el fin de aumentar la actividad antileishmanial.
4. Marco terico y estado del arte
4.1 Leishmaniasis, enfermedad tropical endmica

Una de las enfermedades relevantes en los humanos es la Leishmaniasis, causada por
un parsito protozoo que afecta principalmente a vertebrados, incluido el hombre,
perteneciente a la familia Trypanosoniatidae y causante del conjunto genrico de
enfermedades denominado leishmaniasis, las cuales tienen diversos sntomas y
bsicamente dependen de la especie de Leishmania y del estado inmunolgico del
hospedador [17, 18]. El origen de la enfermedad an no es muy claro, pero se cree que
su origen es en frica migrando posteriormente del viejo mundo a Amrica hace mas de
3 millones de aos [19]. Las formas clnicas de la enfermedad son tres: la cutnea, la
muco-cutnea y la visceral o kala azar. La forma ms comn de la enfermedad es la
cutnea, con un amplio espectro de manifestaciones, que van desde lesiones simples en
la piel, hasta destruccin de tejido en la mucosa [20]. La leishmaniasis visceral es la
forma ms severa de la enfermedad, y se caracteriza por sntomas como fiebre
prolongada, agrandamiento del bazo, aumento de las inmunoglobulinas, entre otros. En
la mayora de los casos, si no es atendida a tiempo, la leishmaniasis visceral puede
causar la muerte [21]. La mortalidad y la morbilidad causadas por leishmaniasis (tanto la
leishmaniasis visceral [VL] y Leishmaniasis cutnea [CL]) solo es superado por la malaria
y la filariasis linftica, llamada comnmente elefantiasis [22].
La propagacin y la gravedad de la enfermedad se ven aumentadas por su coinfeccin

con VIH en algunos pacientes [23]. El tratamiento para la leishmaniasis, as como para la
tripanosomiasis (otra enfermedad parasitaria causada por kinetoplastidios), es complejo.
La forma ms grave de la Leishmania, la VL requiere de un tratamiento con
medicamentos que resulta ser prolongado, costoso y con reacciones adversas en el
organismo. Adems, se complica por la resistencia que genera la Leishmania contra los
medicamentos [24, 25]. Esta tendencia a la resistencia de los actuales medicamentos por
12 Sntesis y determinacin estructural de pptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
parte del parsito, ha dado lugar a la utilizacin de frmacos ms txicos en el

tratamiento de esta infeccin parasitaria. Esos factores junto con la falta de vacunas
eficaces contra la enfermedad, hacen que el descubrimiento de nuevos agentes
teraputicos sea una prioridad para la OMS y el mundo entero [26].
Los frmacos actualmente en uso para el tratamiento de la Leishmaniasis se limitan a

cuatro. Los compuestos de primera lnea son dos antimoniales pentavalentes,
estibogluconato de sodio (Pentostam) y antimoniato de metilglumina (Glucantime). Estos
compuestos se usaron por primera vez en 1947 y 1950, respectivamente. Son
administrados por va parenteral en dosis de 10-20 mg Sb/kg/da durante 10 a 30 das.
Las recadas se producen en todas las formas de la leishmaniasis y en la mayora de los
casos es la causa de abandono del tratamiento por parte de los pacientes. S estos
frmacos no son eficaces, se usan los compuestos de segunda lnea que son la
pentamidina (Lomidine) y anfotericina B (Fungizone), introducidos en 1940 y 1959,
respectivamente [24, 27].
Hasta el momento no existen vacunas efectivas que permitan combatir o prevenir la

Leishmaniasis [28], aunque algunos medicamentos experimentales estn pasando por
ensayos clnicos. Estos son:
El alopurinol, un frmaco en uso para el tratamiento de la gota. Se supone que
funciona como un sustrato alternativo para la enzima transferasa hipoxantina
guanina fosforribosil (HGPRTase), lo que conduce a la inhibicin de la sntesis de
protenas en el parsito. Tambin es usado para tratar la enfermedad de Chagas
y actualmente para el tratamiento de la leishmaniasis en perros. [29]
El Ambisome, una formulacin de anfotericina B en liposomas. Debido a la alta
capacidad de interaccin de los macrfagos, las clulas husped del parsito
Leishmania, el frmaco se convierte en un objetivo especfico y es captado por
estas clulas. Esto aumenta la eficacia y reduce la toxicidad del frmaco. [30]
El Ketoconazol (Janssen Pharmaceutica), un inhibidor del citocromo P450 y de la
sntesis de egosterol que corresponde a esteroles de la membrana. Adems se
usa para el tratamiento tpico de enfermedades sistmicas y otras infecciones por
hongos. Tambin inhibe la sntesis de esteroles en Leishmania e interfiere con su
Marco terico y estado del arte 13
crecimiento y divisin intracelulares. Se usa en perros y en seres humanos en

algunos pases latinoamericanos [30, 31].
La leishmaniasis representa un reto mundial para el descubrimiento de nuevas

alternativas que permitan controlar y frenar la infeccin. En Colombia el panorama sobre
la enfermedad no es muy alentador, se tiene reportes que en el periodo comprendido
entre el 2005 al 2009 Colombia registro cerca de 63000 casos de leishmaniasis cutnea,
de los cuales el 50% compromete a militares de las fuerzas armadas colombianas. Una
de las preocupaciones es el aumento de las notificaciones acerca de casos de
Leishmania, reflejando un posible incremento de la transmisin atribuido a factores como
el aumento del contacto humano con ambientes silvestres en donde aumenta el riesgo
por transmisin con la fauna especifica del lugar y a los cambios de los entornos,
incluyendo zonas selvticas donde el acceso al sistema de salud no es el ideal [32, 33].
El potencial uso de emulsiones, liposomas y nanopartculas que sean capaces de portar

un frmaco activo contra la enfermedad, ha adquirido mucho inters debido
principalmente a su versatilidad y a las ventajas de este tipo de molculas al tiempo de
atacar cualquier forma del parasito [28]. La liberacin controlada de medicamentos y
molculas biolgicamente activas, en especial nanopartculas, es de gran inters, debido
a que son consideradas partculas inteligentes de pequeo tamao (de 1nm hasta
100nm) que contienen una seccin de reconocimiento y una parte teraputica. La
variedad de este tipo de partculas es alta, se conocen nanopartculas de naturaleza
orgnica e inorgnica con caractersticas biodegradables y no degradables [34].
4.2 Pptidos antimicrobianos, Dermaseptinas
En los aos sesenta se observ la presencia de un pptido con actividad antimicrobiana

y hemoltica en la piel de un sapo de panza amarilla, Bombina variegata y se le denomin
bombinina por Kiss y Michl [35]. En 1972 Habermann [36] descubri en el veneno de
ciertas abejas y avispas un pptido que fue denominado melitina. Posteriormente, en
1980 Hans en Estocolmo demostr la presencia de pptidos antibiticos inducibles en la
hemolinfa de lepidpteros [37]. Se sabe que tanto plantas como animales e incluso
microorganismos comparten un mecanismo de defensa efectivo frente a los patgenos
invasores. Existen trabajos descritos en insectos [37], crustceos [38], anfibios [39],
mamferos [40] y plantas [41], bacterias, hongos y virus [42]. En determinadas
circunstancias, y ante un proceso inflamatorio o infeccioso, la presencia de stos
pptidos antibiticos en diferentes animales y tambin en los humanos aumenta. Adems
se sabe que los pptidos producidos por clulas eucariotas pueden presentar actividad
antibacteriana, antifngica, antiparasitaria, antiviral o antitumoral [41].
Los antimicrobianos convencionales, son aquellas molculas que logran inhibir el

crecimiento o que eliminan totalmente al microorganismo, denominada accin
bacteriosttica o accin bactericida respectivamente. La obtencin de esos compuestos
activos puede provenir de diferentes fuentes como insectos, anfibios, mamferos y
plantas para la preparacin de productos farmacuticos. Los antibiticos, como la
penicilina, son molculas que en la mayora de los casos tienen actividad antimicrobiana
y fueron obtenidas en un principio por hongos y levaduras. Actualmente, algunos
investigadores obtienen nuevos agentes medicinales partiendo de ventajas naturales de
ciertos pases e integrando reas como la bioqumica, biologa molecular y ltimamente
la bioinformtica, para permitir el hallazgo de novedosos antimicrobianos que son parte
de las lneas primarias de defensa de los organismos [43, 44].
Por otro lado, encontramos las Dermaseptinas

(GLWSKIKEVGKEAAKAAAKAAGKAALGAVSEAV), que corresponden a una familia de
ocho pptidos estrechamente relacionados que fueron aislados originalmente de la piel
de una rana de Sur Amrica (Phyllomedusa sauvagei). Estos compuestos son pptidos
lineales, compuestos de 28 a 34 aminocidos, con estructura en -hlices de tipo
anfiptica en disolventes apolares [45]. Todos los pptidos conservan residuos de
Triptfano (W) en la posicin 3, y una carga positiva atribuible a la presencia de residuos
de Lisina (K) que marcan una cierta distribucin en la secuencia [45, 46]. Algunas
dermaseptinas muestran una notable capacidad para inhibir clulas microbianas de
manera eficiente, rpida e irreversible sin efecto txico sobre las clulas de mamferos
[47, 48]. Se ha demostrado que las Dermaseptinas tambin son eficaces contra
protozoos (Leishmania mexicana y Plasmodium falciparum) [49-51], levaduras y hongos

filamentosos (Aspergillus fumigatus y Aspergillus niger) [46, 51].
4.3 Sntesis de pptidos

Los pptidos (del griego Peptein que significa digerir) son molculas en la
mayora de los casos biolgicamente activas constituidas de aminocidos. Los pptidos
se pueden explicar como la formacin qumica repetida de enlaces amida, en los cuales,
las funciones carboxilo y amina de L--aminocidos adyacentes son conectados entre s.
La complejidad de este enlace es muy alta, ya que los L--aminocidos como su nombre
lo indica, tienen dos grupos funcionales, y estos dan la posibilidad de formar especies no
deseadas, por lo cual es necesario proteger ciertos grupos funcionales y nicamente
dejar desprotegidas una de las funciones para lograr el enlace peptdico deseado.
Adems, muchos de estos aminocidos tienen grupos funcionales en su cadena lateral,
lo que hace que deban estar protegidos durante la sntesis. Cuando la secuencia de
aminocidos es superior a 50 aminocidos, se denomina protena, considerando las
protenas como los compuestos de gran peso molecular, de actividad biolgica
reconocida y constituida de pptidos.
La historia de la sntesis qumica de pptidos inicia desde 1901, cuando Emil Fischer
logr descomponer ciertas protenas en aminocidos y tambin formar de manera
sinttica el primer dipptido de Glicilglicina por hidrlisis de dicetopiperacina de la glicina
[52]. En ese momento solo se realizaban pptidos de un solo tipo de residuo, y el avance
de la sntesis qumica se vio retrasada. En 1906, Fischer junto con Axhausen sintetizaron
un octadecapeptido L-(G)3-L-(G)3-L-(G)9, para el cual se emple el primer grupo protector
tipo uretano, etoxycarbonilo (C2H5OCO), el cual abri la puerta para usar protectores de
este tipo, que son removidos en condiciones bsicas. En 1932, Max Bergmann y
Leonidas Zervas, introdujeron el grupo benzyloxicarbonilo como grupo protector, que fue
usado en 1953 para producir una de las primeras hormonas oligopeptdicas, la Oxytocina
por du Vigneaud [52]. Los anteriores mtodos se basaban en la adicin secuencial de
aminocidos en solucin, que implicaba pasos muy tediosos de purificacin y
cuantificacin. En 1963, Merrifield realiz la primera sntesis de un tetrapptido LAGV por
estrategia en fase slida, usando una resina de poliestireno como soporte slido [53]. A
partir de ese momento, la sntesis en fase slida para la produccin de pptidos ha
avanzado considerablemente.
Los mtodos de sntesis actualmente se puede dividir en dos grandes clases, Lineal y
Convergente. En la sntesis lineal la elongacin secuencial de la cadena peptdica se da
aminocido tras aminocido [54]. Es importante resaltar que la sntesis qumica de los
pptidos se da por la adicin de los aminocidos de manera contraria a la que se da en el
ribosoma, se va adicionando el aminocido al soporte slido por su extremo C- terminal
hasta el N-terminal, para evitar la prdida de la quiralidad de los residuos implicados. En
la estrategia convergente, las unidades que se agregan no son aminocidos protegidos,
sino que son pptidos protegidos [55].
4.4 Sntesis de pptidos en fase slida

La sntesis en fase slida no es una metodologa exclusiva para la alternativa secuencial,
pero ha tenido mayor importancia en este tipo de sntesis. La sntesis de pptidos implica
numerosos pasos repetitivos y el uso de un soporte slido con numerosas ventajas. Los
excesos de los reactivos y de productos secundarios se pueden separar del pptido
insoluble simplemente por filtracin y lavados, haciendo que todos los pasos de sntesis
se realicen de manera consecutiva. Los principios de SPPS se ilustran en la figura 1. El
aminocido C-terminal y N-protegido es anclado a travs de su grupo carboxilo a un
grupo hidroxilo (o cloro) o resina con un grupo amina para producir un pptido con
extremo C-terminal de tipo ster o amida respectivamente. Despus de anclar el primer
aminocido, la secuencia deseada se va montando por metodologa lineal desde el
extremo C-terminal a N-terminal mediante ciclos repetitivos de n-desprotecciones y
reacciones de acoplamiento de aminocidos. La cadena lateral de ciertos grupos
funcionales de los aminocidos debe estar protegida de manera permanente mediante
grupos protectores (Pn) que son estables en las condiciones de reaccin utilizadas
durante la elongacin del pptido.
El grupo -amino tiene proteccin de tipo temporal (T) que es generalmente compuestos
derivados de uretano. El grupo de proteccin temporal (T) puede ser fcilmente removido
bajo condiciones suaves que preservan la integridad del pptido y reduce la

epimerizacin (la mayora de los casos conduce a la formacin de Oxazolonas) como se
ilustra en la figura 2. La funcin protectora de tipo uretano para evitar la epimerizacin
tambin explica el predominio de la estrategia de sntesis desde el extremo C-terminal a
N-terminal. Despus del acoplamiento, el exceso de reactivos se elimina por filtracin y
lavados. La desproteccin del grupo protector temporal N-terminal se realiza para permitir
la adicin del siguiente aminocido protegido por N-uretano y activados en su extremo
cido -carboxlico. Este proceso (desproteccin / acoplamiento) se repite hasta llegar a
la secuencia deseada. En una etapa final, el pptido se libera de la resina y los grupos de
proteccin de las cadenas laterales (Pn) son eliminados [56].
Figura 1. Principios de SPPS tomado de [56]

Figura 2. Epimerizacin por medio de la formacin de Oxazolonas, tomado de [56].
En SPPS, se utilizan dos estrategias principales: Boc/Bzl y Fmoc/tBu denominados as

por los grupos protectores T/Pn. La estrategia Boc (terc-butoxicarbonilo) se basa en el
grado de labilidad cida del grupo protector. El grupo Boc se elimina mediante lavados
con cidos de fuerza moderada [33% de cido Trifluoroactico (TFA) en Diclorometano
(DCM)] lo que implica que los protectores de tipo Bzl (bencilo) que se usan para las
cadenas laterales deban ser estables en estas condiciones. Luego de la remocin del
grupo Boc por medio cido, se debe hacer una neutralizacin [5% de N,N-
diisopropiletilamina (DIEA) en DCM]. La eliminacin de los protectores de la cadena
lateral y separacin del pptido al soporte slido requiere de tratamientos cidos mas
fuertes como el fluoruro de hidrgeno (HF) anhidro [56]. Debido a que el HF es un cido
extremadamente fuerte que puede alterar la integridad de la secuencia peptdica y que
necesita de espacios fsicos especiales para su manipulacin, se desarrollo una
estrategia ms suave basada en el grupo Fmoc [1]. Este grupo se elimina con bases de
fuerza moderada [20-25% de piperidina en dimetilformamida (DMF)], a travs de una
reaccin de -eliminacin. Esta ventaja permite el uso de protectores de tipo t-butilo (tBu)
que son lbiles en presencia de cidos como el TFA. La ventaja adicional de Fmoc sobre
Boc es el uso de protectores de tipo ortogonal [57, 58], puesto de otra manera, se
pueden eliminar los grupos protectores mediante dos estrategias qumicas diferentes,
permitiendo el uso de condiciones cidas ms dbiles para la liberacin final.
4.5 Soporte slido para SPPS

A menudo el trmino "resina" es mal utilizado en lugar de sistema-linker,
ignorando el hecho de que la matriz polimrica es igual de importante como la solucin
donde se encuentra el aminocido activado y listo para realizar el acople [59]. Existen en
el mercado muchsimos soportes slidos disponibles y de gran variedad. La eleccin del
soporte slido se da por la secuencia peptdica a sintetizar y al linker o brazo
espaciador ms adecuado para la sntesis.
La resina que comnmente se usa para SPPS se basa en una matriz polimrica de
poliestireno entrecruzado (PS). La distribucin de ese entrecruzamiento se da por
tamaos que oscilan de 200-400 mesh (que corresponde a un dimetro de alrededor de
50 micras) y una sustitucin entre 0.5 a 0,8 mmol/g. Estas caractersticas garantizan en
el polmero buenas propiedades de hinchamiento en disolventes tpicos de lavados como
DMF y DCM, una buena distribucin de los reactivos en toda la zona del polmero,
garantizando la accesibilidad de los reactivos. Para pptidos de tamao superior (ms de
25 residuos) o secuencias difciles se requiere un grado de sustitucin menor (0,1-0,3
mmol/g). Resinas a base de poliamida (PA) y polietilenglicol (PEG) son mucho ms
hidroflicas que las PS, por tanto se comportan mejor para secuencias con cierta
dificultad [59].
4.6 Disolventes en SPPS

En cuanto a los disolventes usados durante la sntesis stos son de gran importancia ya
que para llevar a cabo el crecimiento de la cadena peptdica, ste debe garantizar el
mximo volumen desplegado de la resina, la interaccin de los aminocidos con la parte
activa y la solubilidad de los aminocidos activados, para mejorar los rendimientos de los
acoplamientos. Para las PS el DCM presenta una ptima propiedad de hinchamiento o
aumento de volumen en la resina. Para los pasos de acoplamiento el uso de disolventes
polares aprticos como DMF o N-metilpirrolidona (NMP) se prefieren para mejorar la
solubilidad de los reactivos. Alcoholes y el agua no son disolventes adecuados para las
resinas PS ya que reducen el tamao de la resina, encogindola. Esta propiedad es
usada para realizar los lavados y ayudar a retirar de manera eficiente los reactivos en
exceso. Despus de ese encogimiento, la resina se vuelve a hinchar usando DCM o DMF
[56].
4.7 Agitacin y lavados en SPPS

Otro factor importante cuando se est realizando un acople es la agitacin, sta no debe
ser brusca como la que se obtiene con agitacin magntica, ya que el fenmeno del
acople se da por un la difusin y la interaccin entre las partes (aminocido activado y
resina), con lo que agitaciones vigorosas pueden provocar daos en la resina debido a
que est constituida de granos muy finos y frgiles [56].
Los pasos de lavado se usan para eliminar los productos secundarios y el exceso de
reactivos usados en los pasos de acoplamiento y desproteccin. El mtodo simple es
llenar el reactor con el solvente a usar en el lavado, dejarlo en agitacin durante un corto
tiempo (1-3 min) y desechar la solucin de lavado. Se recomienda hacer varios lavados
con pequea cantidad de disolvente y no pocos lavados con demasiada cantidad. Los
protocolos de acoplamiento y desproteccin varan segn el tipo de activador de la
funcin carboxilo del aminocido, el tipo de soporte slido, el tipo de reactor y la
secuencia a sintetizar, al igual que la desproteccin final del pptido.
5. Materiales y mtodos
5.1 Estudios previos y seleccin de secuencias para

sntesis
Para la seleccin de las secuencias, se procede a realizar cortes sucesivos de la
secuencia Dermaseptina S1 (ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ) desde
el extremo N-terminal hasta el C- terminal cada 15 residuos. El nmero de residuos para
los cortes fue seleccionado por estudios previos de la evaluacin de la actividad
antimicrobial sobre anlogos de Dermaseptina S1, en donde se encontr que el
fragmento mnimo que posee actividad antimicrobial comparable con la secuencia
original es DS1(115)-NH2 [60]. Luego de los cortes se realiza la prediccin de estructura
secundaria para cada anlogo de Dermaseptina con los servidores Scratch Protein
Predictor (SPP, http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) [6] y Protein Predictor (PP,
http://www.predictprotein.org/) [61] los cuales muestran la posible conformacin
secundaria de cada uno de los residuos en la secuencia peptdica.
Posteriormente se calcula la carga neta de cada uno de los anlogos y se hace el

anlisis de relacin entre estructura secundaria y carga de la molcula, la cual busca
favorecer las secuencias que puedan tener una mayor estructura secundaria en hlice y
una distribucin anfiptica de carga en la secuencia. Las secuencias seleccionadas
forman parte de la matriz de estudio e intentan ilustrar la contribucin de cada residuo en
la posicin del pptido.
5.2 Sntesis qumica en fase slida Fmoc de las

secuencias
La sntesis lineal en fase slida de los pptidos se lleva a cabo usando la estrategia N-
Fmoc. Los disolventes usados para la sntesis son diclorometano (DCM), isopropanol
(IPA), N,N'-dimetilformamida (DMF) y 1-metil-2-pirrolidona (NMP). Los activadores que se

usan son N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), y
tetrafluoroborato de O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU). Para las
desprotecciones se usa piperidina, cido trifluoroactico (TFA), 1,2-etanoditiol (EDT),
triisopropilsilano (TIS). Como soporte slido polimrico se usa una resina Rink Amida de
sustitucin 0.40 mmol/g. Los diferentes L--aminocidos (Fmoc-aminocidos) tienen una
pureza >99%. El grupo protector -amino terminal en todos los aminocidos es el 9-
fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). El protector de la cadena lateral para la Lisina (K) y el
Triptfano (W) fue el tertbutoxicarbonilo (Boc), para la Serina (S), Tirosina (Y) y Treonina
(T) fue el grupo tertbutilo (tBu), para la Arginina (R) fue el grupo 2,2,4,6,7-
pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf), para el cido Glutmico (E) y el cido
Asprtico (D) el grupo protector fue t-butil ster (OtBu) y el resto de aminocidos usados
no tenan proteccin en su cadena lateral.
Para las reacciones de activacin se usa DCC y HOBt (1:1) en DMF a 5 excesos con
respecto al aminocido. Los acoples son dejados en agitacin constante y a temperatura
ambiente durante 6 horas. Para los acoples que presenten alguna dificultad, se cambia la
estrategia de activacin con DCC y TBTU (1:1) en NMP a 7 excesos durante 2 horas. Las
activaciones de la funcin carboxilo se cumplen como es descrito por Merrifield y
Amblard [53, 56], la cual consiste en formar un ster activo entre el aminocido y los
reactivos de activacin, para posteriormente realizar la reaccin del ster con el amino
libre y disponible. Las reacciones de acople de las cadenas peptdicas se ejecutar
siguiendo el procedimiento desarrollado por Albericio y Barany [57, 58], el cual garantiza
un tiempo de reaccin adecuado para favorecer la reaccin entre el ster del aminocido
activado y el nuevo amino libre. Despus de ste tiempo de acople, viene la liberacin
del grupo protector de la funcin amino y su eliminacin del medio de reaccin mediante
una serie de lavados. Esto se realiza hasta obtener las secuencias deseadas. Para
comprobar el avance de cada acople se realizan pruebas de ninhidrina segn
procedimiento de Merrifield y Van [62, 63], el cual consiste en la reaccin entre la funcin
amino que se encuentra libre con hidrato de ninhidrina para formar un aducto que
presenta una coloracin azul. El desanclaje final se realiza por tratamiento de la resina
con 95% TFA, 2% TIS, 2% Agua y 1% EDT durante 2 horas con agitacin constante a
Materiales y mtodos 23
temperatura ambiente. La extraccin del pptido se realiza por medio de lavados

sucesivos con ter etlico frio. Este protocolo de desanclaje y desproteccin del pptido
fue establecido por Barany y Kates [58, 64].
5.3 Purificacin de los pptidos
5.3.1 Liofilizacin
La liofilizacin de los pptidos se realiza en un equipo LABCONCO 117 de 2.5 L. Todas
las muestras se someten a un precongelamiento a -50C durante 24 horas. Luego de la
precongelacin, las muestras se introducen en un recipiente que se conecta al sistema
de vaco. La temperatura de congelacin de la cmara de refrigeracin es de -50C y se
mantiene durante 24 h. La presin del sistema de liofilizacin se encuentra en valores
cercanos de 0.08 mbar (0,03 0,2 mbar) a una velocidad de 0,5C/min. Al final del
proceso se obtienen presiones cercanas a 0,01 mbar. El liofilizador cuenta con cierre
manual de la cmara de refrigeracin y las muestras despus de la liofilizacin son
retiradas. El pptido obtenido es conservado en un desecador para las pruebas
posteriores. Este protocolo de precongelamiento, liofilizacin y almacenamiento de los
pptidos liofilizados fue establecido por Zinge P. [65].
5.3.2 Cromatografa lquida de alta eficiencia

La cromatografa (RP-HPLC) de los pptidos se realiza en un cromatgrafo Agilent
Technologies Serie 1200, usando columnas Zorbax Eclipse XDB-C18 RP-18 (5 m). Los
solventes usados en la cromatografa son metanol, acetonitrilo, agua y cido
trifluoroactico (TFA) de una pureza grado HPLC. Los pptidos son eludos mediante el
uso de un sistema de gradiente lineal A/B de 0 a 70 % B (A: Agua desionizada 0.01%
TFA), (B: acetonitrilo 0.01% TFA), a una velocidad de flujo de 1.0 mL/min en la modalidad
analtica y de 5.0 mL/min en la modalidad Semipreparativa. Se inyectan 20 L de
muestra (1mg/mL) en modalidad analtica y 500 L (10mg/mL), las cuales se someten a
la corrida cromatogrfica correspondiente. El tiempo total de corrida en las dos
modalidades es de 45 minutos a temperatura ambiente. La deteccin de las seales se
logra mediante el uso de un detector UV-VIS (ultravioleta visible) con un seguimiento a
220 nm de acuerdo al protocolo establecido inicialmente por Choi [66].
5.4 Caracterizacin de los pptidos
5.4.1 Espectrometra de masas MALDI-TOF

La caracterizacin por medio de la espectrometra de masas con desorcin inica
provocada por lser y asistida por matriz con deteccin de tiempo de vuelo MALDI-TOF
(Matrix-Assisted Laser Desorption of Ions Time-of-Flight), se realiza en un espectrmetro
de masas Bruker Daltonios Serie microflex MALDI-TOF Compass 1.2 aplicando un
campo elctrico de 3 nanosegundos, a una longitud de onda de 337 nm incidiendo una
luz lser a una intensidad de 50 J. La matriz que se emplea es una solucin
sobresaturada de cido -ciano-4-hidroxicinmico. La concentracin del pptido es de
5.0 x 10-4 mg/L, sembrando en placa 2.5 L de una solucin que contiene una relacin
1:6 de pptido y matriz respectivamente. El protocolo anteriormente mencionado fue
establecido por Rodthongkum [67].
5.4.2 Dicrosmo circular (DC)

Los espectros de DC son procesados por un espectropolarmetro Jasco (Jasco
Internacional Co J-810) usando una cubeta de cuarzo, con una longitud de paso ptico
de 0,1. Los pptidos son ledos a una concentracin de 5,0x10-6 M al 30% de
trifluoroetanol (TFE) en un rango de 190-260 nm con una velocidad de 50nm/min y un
ancho de banda de 0.5 nm. Los datos son promediados y se calcula el contenido de
estructuras secundarias incluyendo -hlice en los pptidos mediante tres programas
que realizan la deconvolucin de las seales CONTIN/LL [68], CDSSTR [69] y SELCON3
[70], lo cuales vienen incorporados con el software del equipo.
5.5 Ensayos biolgicos

Los ensayos biolgicos fueron realizados por el por Doctor Jos Julin Prez Cordero, en
el laboratorio del Grupo de Investigacin en Inmunotoxicologa (COL 0068495) de la
Universidad Nacional de Colombia en Bogot, dirigido por la Doctora Gabriela Delgado.
Esta colaboracin, estuvo enmarcada en un macroproyecto financiado por la
Vicerrectora de Investigacin de la Universidad Nacional de Colombia, Convocatoria

Bicentenario, 2009.
5.5.1 Hemates
Para la obtencin de glbulos rojos se obtuvo sangre perifrica de voluntarios sanos O
positivo [Acorde con la normatividad vigente, respecto a la donacin de muestras con
fines de investigacin, disposiciones legales vigentes emanadas del Ministerio de la
Proteccin Social de la Repblica de Colombia, Resolucin No. 008430 DE 1993 (4 de
Octubre 1993)]. Los glbulos rojos fueron separados de la sangre completa mediante
centrifugacin y diluidos en buffer fosfato salino (Phosphate buffered saline (PBS)) para
su empleo en los ensayos de hemlisis. El protocolo sobre la obtencin de los glbulos
rojos de sangre perifrica humana es el establecido por Turpin [71].
5.5.2 Monocitos
Los monocitos se obtienen a partir de la separacin de glbulos blancos por
centrifugacin en gradiente de Ficoll (Ficoll-Hypaque, Sigma AldrichSt Louis. USA) a
2800 revoluciones por minuto (r.p.m.) durante 30 minutos, a partir de muestras de
voluntarios sanos. La fraccin de glbulos blancos, se lava tres veces en PBS mediante
centrifugacin siguiendo el protocolo enunciado por Carter [72] y posteriormente
sembrada en cajas de Petri de Poliestireno (BD Biosciences, Falcon) en medio RPMI
1640 [73] (Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) durante 2 horas de
incubacin, al cabo de las cuales, la fraccin no adherente es removida. La fraccin de
monocitos adheridos, se recolecta y siembra en cajas de 96 pozos fondo plano (TPP
Tissue Culture Labware 92096, Suiza) e incubada durante 24 horas a 37 C con
atmsfera de CO2 al 5%. Despus de este periodo, puede ser empleado en los ensayos
de citotoxicidad.
5.5.3 Parsitos
Promastigotes de L. panamensis fueron cultivados en medio RPMI 1640 (Gibco,
Scotland, UK) suplementado al 10% con Suero Fetal Bovino (FBS, Microgen, Bogot,
Colombia), y L-glutamina (Gibco BRL-Life Technologies Inc, Grand Island, NY) 10X, a 26
C. Los parsitos en fase estacionaria fueron usados en los ensayos de efectividad sobre
formas extracelulares de esta especie de Leishmania.
5.5.4 Pptidos y controles

Como pptido control fue utilizado CLIP, que corresponde a la cadena peptdica
invariable naturalmente cargada en el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y
que para el caso del tipo II es reemplazado enzimticamente dentro de los endosomas
para cargar esta molcula con fragmentos peptdicos en el proceso de presentacin de
antgenos [74]. Como control positivo de tratamiento, se us el isotianato de pentamidina,
el cual se ha convertido en el medicamento de eleccin para el tratamiento de la LC en
varios pases donde la enfermedad es endmica, presentando una eficacia muy similar a
los antimoniales pentavalentes pero con una incidencia menor de efectos adversos [75-
77]. La pentamidina, fue usada en concentraciones seriadas a partir de 10 g/mL en los
ensayos de citotoxicidad y de efectividad contra la forma extracelular de L. panamensis.
5.5.5 Ensayos de hemlisis

Para determinar la actividad hemoltica de los pptidos de inters, como parte del efecto
no deseado de formulaciones antileishmaniales, se sembraron en cajas de 96 pozos
fondo en V (Corning, USA), 0,1 mL de suspensin de eritrocitos humanos de donantes
sanos grupo O Rh + por pozo, a una concentracin de 2% de su hematocrito final en
solucin salina fisiolgica al 0.9% (Baxter, Colombia). Se evaluaron por duplicado, ocho
concentraciones distintas del pptido, adicionando un volumen de 0,1 mL/pozo de cada
dilucin. Fueron incluidos pozos controles con iguales diluciones de CLIP, pentamidina,
eritrocitos sin pptido en Solucin Salina correspondiente al 0% de hemlisis, y eritrocitos
en agua destilada estril como control del 100% de hemlisis. Luego de la incubacin a
37 C con CO2 al 5% durante 2 horas, las cajas fueron centrifugadas a 3500 r.p.m. y los
sobrenadantes fueron recolectados para la determinacin de la concentracin de
hemoglobina mediante la determinacin de la absorbancia a 550nm en un
espectrofotmetro digital (Ultramark Microplate Reader, Bio-Rad, USA) [78]. Tomando
como control negativo o 100% de viabilidad, las unidades de absorbancia de los
eritrocitos no expuestos a ninguna sustancia y diluidos en solucin salina. Las unidades
de absorbancia obtenidas de la lectura de la solucin de eritrocitos expuestos a agua

destilada estril, fueron consideradas como 100% de hemlisis y respecto a ella fueron
normalizados los datos obtenidos en unidades de absorbancia de los sobrenadantes de
los diferentes pozos con solucin de eritrocitos, expuestos a cada uno de los pptidos y
pentamidina (a sus diferentes concentraciones) siendo calculado entonces, el porcentaje
de hemlisis para cada caso segn la siguiente frmula: % hemlisis a una concentracin
X = (Unidades de Absorbancia a concentracin X x 100) / unidades de absorbancia de
solucin de eritrocitos expuestos a agua destilada. Posterior a la obtencin de los
porcentajes de hemlisis, los datos fueron exportados al programa GraphPad Prism 5
Demo Software (GraphPad Software Demo, Inc, La Jolla, CA, USA) [79] para la
obtencin de una curva concentracin-respuesta y el clculo de la concentracin
hemoltica media (CH50), que equivale a la concentracin de un pptido que produce la
lisis del 50% de los eritrocitos en una solucin. Cada ensayo se realiz por triplicado y en
tres ocasiones distintas.
5.5.6 Ensayos de citotoxicidad

Para establecer el efecto citotxico de los PAMs sobre monocitos, se sembraron en cajas
de 96 pozos, 0,1 mL de suspensin celular por pozo, a una concentracin de 1 x 105
monocitos/mL en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino (fetal calf
serum FCS) al 5%. Luego de 24 horas de incubacin a 37 C con CO2 al 5% para permitir
la adhesin celular, se evaluaron por duplicado ocho concentraciones distintas de cada
pptido en RPMI 1640 a partir de 200 g/mL, adicionando un volumen de 0.1mL/pozo de
cada dilucin. Fueron incluidos pozos controles con iguales diluciones de CLIP,
pentamidina, monocitos sin pptido, y uno solo con RPMI 1640. Luego de la incubacin a
37 C con CO2 al 5% durante 72 horas, la viabilidad celular fue evaluada mediante el
mtodo de Alamar Blue el cual se describe a continuacin basado en el protocolo
establecido por Khromykh [80]. Se adicion resazurina (Sigma Aldrich, USA) a una
concentracin de 44mM y luego de 4 horas adicionales de incubacin bajo las mismas
condiciones anteriores, se leyeron las unidades arbitrarias de fluorescencia (UFA)
utilizando un espectrofluormetro (Genios Tecan Plate Reader) y el Software Magellan).
Los datos obtenidos en UFA, fueron exportados al programa Microsoft Excel 2000 y
procesados para la obtencin de los porcentajes de viabilidad celular con cada uno de los
pptidos y controles a sus respectivas concentraciones. Se consider como 100% de

viabilidad, las UFA obtenidas de la lectura de los pozos de clulas no tratadas, ni
expuestas a ninguno de los controles. Los datos obtenidos de los dems tratamientos y
controles, fueron procesados con respecto a ste mediante la frmula: % de viabilidad a
una concentracin X = (UFA a concentracin X x 100) / UFA de clulas en condiciones
normales de cultivo y no expuestas a ningn tratamiento. Estos porcentajes fueron
exportados posteriormente al programa GraphPad Prism 5 Demo Software (GraphPad
Software, Inc, La Jolla, CA, USA) [79] para el trazo de una curva concentracin-respuesta
y posterior obtencin de la concentracin citotxica media (CL50), la cual corresponde a
la concentracin de un pptido, que genera la muerte del 50% de las clulas en el cultivo.
Cada ensayo se realiz por duplicado.
5.5.7 Ensayos de efectividad sobre formas extracelulares de L.

panamensis.
Una suspensin de promastigotes de L. panamensis a una concentracin de 2 x 106

promastigotes por mL, fueron expuestos a los pptidos a 8 concentraciones distintas,
obtenidas por diluciones seriadas a partir de 200 g/mL. Los cultivos fueron sembrados
en cajas de 96 pozos fondo plano (TPP Tissue Culture Labware, Suiza), a 0,1 mL/pozo e
incubados a 26 C en RPMI 1640. La viabilidad de los parsitos fue evaluada mediante el
mtodo de Alamar Blue adicionando este colorante a una concentracin final de 44mM, e
incubando durante 48 horas a 26 C, luego de lo cual, las UFA, derivadas del metabolito
secundario resofurina, fueron determinadas mediante el uso del espectrofluormetro
Genios Tecan [80]. Los datos fueron transferidos al programa Microsoft Excel 2000 para
su posterior procesamiento considerando las UFA, obtenidas de los pozos con
promastigotes cultivados en las condiciones descritas y no expuestos a ningn
tratamiento (100% de viabilidad). Los datos obtenidos de la lectura de cada uno de los
tratamientos, fueron procesados con respecto al 100% de viabilidad, mediante la frmula:
% de viabilidad a X concentracin = (UFA a X concentracin x 100) / UFA de parsitos en
condiciones normales de cultivo y no expuestos a ninguna sustancia. Posteriormente, los
porcentajes obtenidos, fueron exportados al programa GraphPad Prism 5 Demo Software
(GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, USA) para el trazo de una curva concentracin-
respuesta y la determinacin de la concentracin efectiva media (CE50), que

corresponde a la concentracin de pptido capaz de inducir la muerte del 50% de los
parsitos expuestos. Cada ensayo fue realizado por triplicado y en tres ocasiones
distintas.
6. Resultados y discusin
6.1 Estudio previo y anlisis bioinformtico

Se realiz una bsqueda del carcter Antimicobacterial y Antileishmanial que presentaba
la secuencia de Dermaseptina S1 (ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ),
la cual en estudios previos se reporta como posible herramienta teraputica para el
tratamiento de la Leishmaniasis [81]. Al evaluar la secuencia desde el extremo N-terminal
hacia el C-terminal en el servidor AntiBP Server, se encontraron valores positivos en la
prediccin de la accin Antimicrobial para algunos fragmentos. Dichos valores indican la
posible actividad antimicrobiana que est directamente asociada a la secuencia basada
en la informacin que recolecta el servidor con alrededor de 500 pptidos
antimicrobianos base y una funcin de base radial junto con un polinomio kernal, que
son propios del software de prediccin [82]. En la tabla 1 se muestran los resultados
obtenidos para cada uno de los fragmentos al realizar la evaluacin en el servidor. Por
otro lado se realizaron cortes sucesivos de la secuencia original cada 15 residuos
partiendo desde el extremo N terminal, basndonos en los resultados encontrados por
Savoia [60], segn el cual secuencia mnima con actividad biolgica es de 15 residuos.
A todos los cortes de la secuencia de 15 residuos se les realiz una prediccin de la

estructura secundaria con los servidores Scratch Protein Predictor (SPP,
http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) [6] y Protein Predictor (PP,
http://www.predictprotein.org/) [61] mostrando un valor elevado en la estructura de tipo -
hlice para la mayora de los anlogos. Como se observa en la tabla 1, el valor
antimicrobial para algunas secuencias es negativo (valores en rojo), lo que nos sugiere
que por prediccin dichos fragmentos no poseen carcter antimicrobial.
Resultados y discusin 31
Tabla 1. Estudio bioinformtico de Dermaseptina S1

Abreviatura SECUENCIA Porcentaje Helice Carga Total Score Antimicrobial
DERMs1 A L W K T M L K K L G T M A L H A G K A A L G A A A D T I S Q G T Q 85.3 4 ND
DM1 A L W K T M L K K L G T M A L 60.0 3 1.367
DM2 L W K T M L K K L G T M A L H 53.3 4 0.402
DM3 W K T M L K K L G T M A L H A 40.0 4 -0.205
DM4 K T M L K K L G T M A L H A G 20.0 4 -0.937
DM5 T M L K K L G T M A L H A G K 66.7 4 0.605
DM6 M L K K L G T M A L H A G K A 60.0 4 0.286
DM7 L K K L G T M A L H A G K A A 46.7 4 -0.401
DM8 K K L G T M A L H A G K A A L 13.3 4 0.075
DM9 K L G T M A L H A G K A A L G 60.0 3 -0.825
DM10 L G T M A L H A G K A A L G A 60.0 2 -0.418
DM11 G T M A L H A G K A A L G A A 60.0 2 0.509
DM12 T M A L H A G K A A L G A A A 40.0 2 -0.880
DM13 M A L H A G K A A L G A A A D 26.7 1 -0.781
DM14 A L H A G K A A L G A A A D T 33.3 1 0.183
DM15 L H A G K A A L G A A A D T I 66.7 1 -1.687
DM16 H A G K A A L G A A A D T I S 60.0 1 -1.230
DM17 A G K A A L G A A A D T I S Q 73.3 0 -0.151
DM18 G K A A L G A A A D T I S Q G 66.7 0 -1.909
DM19 K A A L G A A A D T I S Q G T 60.0 0 -1.636
DM20 A A L G A A A D T I S Q G T Q 60.0 -1 -2.135
ND Valor no disponible
El valor ms elevado de la prediccin antimicrobial lo presenta el anlogo nombrado

DM1, que tambin posee un elevado porcentaje helical. La mayora de los fragmentos
que no poseen accin antimicrobiana por prediccin son los que poseen un carcter
catinico superior a 3 en la secuencia, excepto en las secuencias DM3, DM4, DM7, DM9
y DM10, que a pesar de tener un carcter catinico, no poseen un valor antimicrobial
aceptable por prediccin antimicrobial. El menor valor del carcter antimicrobiano lo
presenta DM20, que corresponde al fragmento con el mayor carcter aninico en la
secuencia, que en principio estara de acuerdo a lo reportado para los pptidos, ya que el
primer paso de accin de este tipo de pptidos sugiere la interaccin con fosfolpidos de
membrana celular [83], haciendo que para DM20 esta interaccin no se realice
efectivamente, lo que genera que la prediccin para la secuencia sea negativa. La
seleccin final de los anlogos para ser sintetizados se defini por el alto contenido de -
hlice y carcter catinico, que concuerda con la polaridad tpica de los pptidos
antimicrobianos, favoreciendo la interaccin con la membrana celular y su efecto
inmunomodulador sobre las clulas. Los resultados de la seleccin de los anlogos son
mostrados en la tabla 2.
Tabla 2. Secuencias de los anlogos seleccionados para el estudio
Abreviatura SECUENCIA Porcentaje Helice Carga Total Score Antimicrobial

DERMs1 A L W K T M L K K L G T M A L H A G K A A L G A A A D T I S Q G T Q 85.3 4 ND
DM1 A L W K T M L K K L G T M A L 60.0 3 1.367
DM5 T M L K K L G T M A L H A G K 66.7 4 0.605
DM6 M L K K L G T M A L H A G K A 60.0 4 0.286
DM9 K L G T M A L H A G K A A L G 60.0 3 -0.825
DM10 L G T M A L H A G K A A L G A 60.0 2 -0.418
DM11 G T M A L H A G K A A L G A A 60.0 2 0.509
DM16 H A G K A A L G A A A D T I S 60.0 1 -1.230
DM17 A G K A A L G A A A D T I S Q 73.3 0 -0.151
DM18 G K A A L G A A A D T I S Q G 66.7 0 -1.909
DM19 K A A L G A A A D T I S Q G T 60.0 0 -1.636
DM20 A A L G A A A D T I S Q G T Q 60.0 -1 -2.135
El principio estructural fundamental de los PAMs nace en su capacidad de adoptar una

forma en la que los aminocidos hidrofbicos y catinicos son organizados
espacialmente en sectores discretos de la molcula (diseo anfiptico). Para las
secuencias seleccionadas y mostradas en la tabla 2, se realiz el diseo anfiptico, en
donde se observ la distribucin catinica por una cara de la hlice y una distribucin
hidrofbica para la otra cara. En la figura 3 se muestra la distribucin helical de los
aminocidos para DM1, se puede observar los residuos polares de tipo catinico en la
parte superior y los residuos de carcter hidrofbico en la parte inferior de la figura. Este
tipo de distribucin anfiptica se encontr para la mayora de los anlogos seleccionados,
excepto para DM17, DM19 y DM20, donde la distribucin no se da uniformemente y se
presenta una ausencia del carcter catinico, haciendo que se presente una
conformacin polar aninica por una cara de la hlice y una apolar por la otra cara.
En todas las secuencias seleccionadas se observa un porcentaje helical mayor a 60%, lo

que sugiere que la distribucin de tipo anfiptica mostrada en la figura 3 para DM1, es
adecuada para todos los anlogos e indica la cercana espacial de cada uno de los
residuos. El tipo de residuo con los cuales existe una mayor interaccin y el tamao de
dichos residuos, tambin nos brinda una idea aproximada del grado de dificultad que se
puede dar al intentar acoplar un residuo en la sntesis qumica, y brinda una luz acerca
de la forma en la que la cadena peptdica se va plegando para adquirir su estructura
secundaria de tipo helical.
Figura 3. Helical Wheel para DM1

Helical Wheel From 1 to 16
Ala 1
Lys 8 Thr 12
Leu 15 Thr 5
Lys 4
Gly 11 Lys 9
Leu 2
Leu 7 Met 13
Ala 14 Met 6
Trp 3
Leu 10
Para la secuencia DM17 y DERMs1 el valor de helicidad es 73.3% y 85.3%

respectivamente, lo cual sugiere que el tipo de distribucin helical sea mayor, Aun as,
para DM17 la distribucin anfiptica no es la mejor (figura 4). Debido a que DM17 no
presenta un carcter catinico, la distribucin de los aminocidos polares se hace de
manera uniforme, lo que impide que la carga positiva del pptido quede sectorizada hacia
una cara de la hlice.
Figura 4. Helical Wheel para DM17

Helical Wheel From 1 to 16
Ala 1
Ala 8 Thr 12
Gln 15 Ala 5
Ala 4
Asp 11 Ala 9
Gly 2
Gly 7 Ile 13
Ser 14 Leu 6
Lys 3
Ala 10
Este tipo de estudio bioinformtico es de gran importancia antes de realizar la sntesis

qumica de pptidos, ya que permite predecir de alguna manera la estructura secundaria
de las secuencias, la distribucin espacial de los aminocidos y la posible actividad
antimicrobial de los pptidos, convirtindose en una valiosa herramienta predictiva para
la construccin de anlogos de una secuencia determinada. Es importante resaltar que a
pesar de que los valores de prediccin bioinformtica en la mayora de los casos son
confiables, estos criterios no pueden ser los nicos para la seleccin de las secuencias
candidatas a sntesis, ya que dichos valores no necesariamente se ajustan a los
resultados reales de las secuencias y solo con la sntesis, caracterizacin y evaluacin
de la actividad biolgica para cada secuencia, es posible confirmar o no, los valores
predichos por el estudio bioinformtico.
6.2 Sntesis qumica Fmoc de los anlogos

seleccionados
La sntesis de todos los anlogos se llev a cabo por tecnologa N-Fmoc en fase slida.
Se us como soporte slido una resina Rink Amida [84], la cual presentaba un grado de
sustitucin de 0,40 mmol/g. La sntesis de los anlogos se inici con la adicin del primer
aminocido del extremo C-terminal, para lo cual se realiz el enlace peptdico entre el
grupo carboxilo del aminocido y el grupo amino de la resina. En todas las secuencias
este primer acople requiri de un segundo ciclo, para lo cual se aument el nmero de
excesos de los activadores y del tiempo de reaccin. La razn para que este acople
tenga un mayor grado de dificultad radica en que el soporte slido es una resina que
tiene propiedades mecnicas especficas, principalmente la capacidad de hincharse y
comprimirse, las cuales por el tamao relativamente pequeo de la resina y la poca
disponibilidad del sitio amino, hace que requiera mayor esfuerzo para la formacin del
primer enlace peptdico junto con mayor tiempo. Para todos los acoples fue necesario
realizar una preactivacin con DCC y HOBt en NMP durante 10 minutos, lo cual favorece
que el aminocido a acoplarse se encuentre activado por el grupo carbonilo para
posteriormente generar el enlace peptdico de una manera ms eficiente. En los acoples
que despus de un segundo intento no daban la coloracin amarilla tpica de amino
protegido en la prueba de ninhidrina [62], se aumentaba el numero de excesos a 10.
El primer paso para realizar el enlace peptdico es la activacin del grupo carbonilo de
cada aminocido, dicha activacin se realiza mediante la adiccin de DCC y HOBt en un
solvente aprtico como es la DMF o NMP. El aminocido protegido por el grupo Fmoc en
su amino, forma en primer paso un ster, O-acilisourea, que rpidamente se convierte en
N-acilisourea, sta ltima insoluble en el medio de reaccin. La O-acilisourea formada en
presencia de HOBt forma un ster activo de benzotriazol, que es la especie final que
reacciona con el grupo amino libre disponible para realizar el enlace peptdico. El
mecanismo de reaccin entre un aminocido y el grupo amino de la resina es mostrado
en la figura 5. Para que las reacciones 5a, 5b y 5c se presenten, se deja durante 10
minutos aproximadamente el aminocido a acoplar con los excesos de los activadores
DCC y HOBt a temperatura ambiente y con agitacin constante, tiempo en el cual
empieza a aparecer un precipitado que corresponde a la N-acilisourea formada, que se
muestra en la figura 5b. La conversin de la O-acilisourea a N-acilisourea (figura 5b) es
una reaccin lenta y se ve minimizada con la adicin de HOBt, para formar el ster activo
de benzotriazol, siendo sta una reaccin rpida (figura 5c) [85].
Despus de los pasos de preactivacin, reacciones 5a, 5b y 5c, el ster activo de

benzotriazol formado se deja en agitacin constante y a temperatura ambiente durante
un tiempo aproximado de 6 horas, en el cual se realiza la reaccin de acople entre el
grupo amino libre y el grupo carboxilo activado (figura 5d). Esta reaccin se realiza en un
solvente aprotico NMP DMF, el cual garantiza que el soporte slido se encuentre en las
condiciones adecuadas para realizar la reaccin.
La remocin del grupo protector amino Fmoc se realiza con lavados de piperidina al 25%
( 35%) en DMF durante un corto tiempo. La piperidina es una base que remueve
eficientemente el grupo Fmoc del medio, formando un aducto dibenzofulveno de
piperidina que absorbe fuertemente en la region UV, es soluble y facilmente removible
del medio de reaccin mediante varios lavados cortos con DMF [56, 86, 87]. El
mecanismo de desproteccin para la posterior remocin del grupo Fmoc es mostrado en
la figura 6. En el paso 6a se muestra el ataque de la piperidina al proton del grupo Fmoc,
formando una especie inestable que rpidamente hace una deslocalizacin electrnica
para dar los subproductos obtenidos en 6b. En los pasos 6d y 6e se muestra el aducto
final formado entre la piperidina y el grupo Fmoc removido. La remocin del grupo Fmoc
usando piperidina puede ser monitoreada por espectroscopia UV (270-312 nm) [88], ya
que el aducto presentado en 6e es un subproducto que absorbe en la region UV, el
seguimiento de ese aducto es un procedimiento comn usado en los sintetizadores de
pptidos automatizados pero no es muy usado en la SPPS manual [56].
Figura 5. Reacciones para la activacin de Fmoc-aminocidos con DCC y HOBt

Fmoc
O NH
Fmoc H O H N C N N O R
N + NH t-Bu
H R O
t-Bu
a
Fmoc-Aminocido diciclohexilcarbodiimida(DCC) O-acilisourea
Fmoc t-Bu
NH Fmoc
R
O NH
O O
N O R N
NH
NH t-Bu
O-acilisourea N-acilisourea
Fmoc t-Bu
NH O R
O HO
N O R
+ N
N O
NH
N Fmoc
N N
NH t-Bu N
O-acilisourea HOBt ster activo de benzotriazol
t-Bu O t-Bu
O R R
NH
O NH
N
NH
Fmoc
+ H2N Fmoc
N
N
CH 3
CH 3 d
ster activo de benzotriazol grupo NH2 disponible Acople formado
Para los lavados de remocin de los subproductos con DMF, es muy importante que toda
la piperidina sea removida del medio eficientemente para que no genere reacciones de
desproteccin en pasos de la sintesis donde no es adecuado su uso. Ademas de los
lavados con DMF, se hacen lavados con IPA y con DCM para garantizar la remocin de
la piperidina y de los subproductos del medio de reaccin. La reaccin de desproteccin
en todos los casos fue verificada mediante el uso de la prueba de ninhidrina, arrojando
un color azul, confirmando que la reaccin de desproteccin fue adecuada y que existen
grupos amino libre disponibles para el siguiente paso de la sintesis.
Figura 6. Mecanismo de desproteccin grupo Fmoc
CH3
O CH3
O
H3C
O
O
H3C
NH O
O
H
O NH + O
N
-
C
NH O
+
R O
H +
O NH N
O PEG
NH H2
R O
O PEG
NH
a
CH3 CH3
O O
H3C H3C
O O
O
-
C
NH O + -
HN O O O
NH NH
+
O
O CH2 O
R R
O PEG O PEG
NH NH
CH3 CH3
O O
H3C H3C
O
+ O
+
- +
HN O N O
H2N N
NH H2
NH H
R O
R O
PEG
O
NH O
NH
PEG
c
+ N -
C
H
CH2
+
HN
d
-
C
+ N
HN
La sensibilidad de la reaccin de ninhidrina como prueba cualitativa y cuantitativa para

determinar aminas primarias es muy alta. En la figura 7 se muestra las reacciones
primordiales para la prueba de ninhidrina con un aminocido. En los primeros pasos de la
figura 7 se ilustra la reaccin del hidrato de ninhidrina con el grupo amino de un
aminocido, reaccin que involucra el desplazamiento de un grupo OH por un grupo NH2
(figura 7b), paso que es determinante en la velocidad de reaccin segn reportes de
Friedman [89]. Los productos de la reaccin de un aminocido con ninhidrina son CO2
(figura 7c), un aldehdo (RCHO) (figura 7d), y un aducto de ninhidrina denominado
purpura de Ruhemann (figura 7f). La etapa 7c corresponde a una descarboxilacin que
segn reportes no es la etapa determinante de la reaccin debido a que esta reaccin es
unimolecular y no est sujeta a impedimentos estricos marcados [89]. La reaccin de
ninhidrina se lleva a cabo a 100 C durante 5 minutos, tiempo en el cual el hidrato de
ninhidrina en piridina es capaz de reaccionar con el grupo NH2 del aminocido para
formar un color purpura intenso que corresponde a la formacin del aducto mostrado en
la figura 7f. Si en el medio no existe un grupo amino disponible para realizar la reaccin,
la solucin queda de un color amarillo claro y corresponde a un resultado negativo para
la prueba de ninhidrina. Basados en el mecanismo descrito para la reaccin de
ninhidrina, se ha confirmado que la prueba es negativa para aminos unidos directamente
a tomos de carbonos terciarios o para aminas terciarias impedidas estricamente [89].
Segn los resultados esperados para la prueba de ninhidrina, esta reaccin se usa en la
sntesis de pptidos para determinar si en el medio de reaccin existen grupos NH2
disponibles que an no hayan formado el enlace peptdico descrito en la figura 7d.
Cuando en el medio el grupo amino se encuentra protegido por el grupo Fmoc, la prueba
de ninhidrina da negativa, pero s en cambio el grupo amino protegido ha sido sometido a
la etapa de desproteccin con piperidina, en el medio se encontraran grupos NH2 libres

que hacen que la prueba de ninhidrina sea positiva dando un color purpura intenso.
Figura 7. Reacciones para la prueba de ninhidrina en presencia de un grupo amino.

O O
OH
O H2O
OH +
O O a
O
O O
O
H2N N
O + OH + H2O
OH
R R
O
O
b
O O
O
N N
O O
OH
+
R R
O O
c
O
O O
NH2 H
N
+ H2O
+ R
R O
O
d
O
O
O O
N
NH2 + O
+ H2O
O O
O O
e
O O
H
O O
N N
O O O
O
f
Para cada paso de acople y desproteccin fue necesario llevar a cabo la prueba de
ninhidrina, la cual era el indicativo cualitativo para evaluar el avance de SPPS. Cada
prueba cont con un blanco, que sirvi como comparativo para calificar la prueba de
ninhidrina. Es importante anotar que para muchos otros compuestos la prueba de
ninhidrina da positiva sin presentar la estructura mostrada en la figura 7f. Entre los
compuestos que presentan la prueba de ninhidrina positiva de forma anormal son por
ejemplo los aminocidos polifuncionales como arginina, asparagina, cistena y triptfano,
los iminocidos como la prolina y el cido pipeclico, las aminas aromticas como la
anilina, y otros compuestos como la fructosa, cido levulnico, los iones cianuro entre
otros. Este tipo de compuestos presentan reaccin de ninhidrina denominada no clsica

[89].
La etapa de desanclaje se realiza mediante la adicin de TFA (80%-97%) y compuestos

que sean capaces de capturar y eliminar los grupos protectores de cadenas laterales
denominados scavengers. Se realiza el desanclaje con el porcentaje adecudado de
TFA y scavengers dependiendo de los aminocidos presentes y grupos protectores de
las cadenas laterales de los aminocidos. El esquema de desproteccin para pptidos
sintetizados mediante tcnica Fmoc es mostrado en la figura 8, donde se muestra
claramente la funcin del TFA y de los scavengers. En la figura 8 se muestra el
desanclaje de un pentapptido con TFA y los scavengers necesarios que son Anisol,
EDT, fenol y agua. Dependiendo de la secuencia obtenida se escogen los scavengers y
su porcentaje en el desanclaje final [56]. Los pptidos son recogidos sobre ter etlico
fro, con lo que se logra observar la precipitacin de un slido blanco que corresponde al
pptido libre obtenido. Mediante la filtracin y lavados con ter etlico al pptido, se
realiza la remocin de las especies formadas entre los diferentes scavengers usados en
el desanclaje y los grupos protectores de las cadenas laterales, garantizando la remocin
efectiva de especies no deseadas. El rendimiento promedio calculado para las diferentes
sntesis fue de 74%. Este valor de rendimiento es relativamente alto si se tiene en cuenta
la prdida de material en cada ensayo de ninhidrina, ya que por cada residuo se deben
hacer como mnimo 2 ensayos de verificacin con ninhidrina que son de tipo destructivo.
Los tiempos de reaccin para cada anlogo de dermaseptina son mostrados en la tabla
3. El mayor tiempo de sntesis fue requerido para el anlogo DM18, con un total de 465
horas y 24 ciclos, 9 ciclos ms de los 15 ciclos necesarios para completar la sntesis.
Esta dificultad puede explicarse debido a la presencia de glicina en el extremo C-
terminal, que puede adoptar fcilmente una conformacin Cis resultando el enlace amida,
lo que hace que la ciclizacin para formar dicetopiperazinas sea muy probable (ver figura
9) [90, 91].
Figura 8. Esquema de desanclaje de un pentapptido en medio cido
S NH
O
O CH3
H2N NH O
CH3
O
NH
NH O CH3
CH3 O NH
O
H3C
NH
H3C O
O CH3
H3C O
H3C
TFA:tioanisol:EDT:fenol:agua
82.5:5:2.5:5:5
HS
NH2
O
+ O
H3N NH OH
O
O
NH O H 3C
NH H3C
O CH3
F 3C H3C S S
O NH HO CH3 Ph
CH3 CH3 +
H3C OH H 3C S CH3 CH3
H3C
Ph Ph
O H3C
O CH3 CH3
HO
Tabla 3. Tiempo total y nmero de ciclos efectuados para la sntesis de los anlogos
Pptido tiempo total (h) Ciclos

DM1 326 17
DM5 409 21
DM6 278 15
DM9 325 17
DM10 326 17
DM11 405 20
DM16 416 21
DM17 440 22
DM18 465 24
DM19 390 20
DM20 330 17
Figura 9. Esquema de formacin de dicetopiperazinas, tomado de [92]
Para los diferentes anlogos de dermaseptina se present una mayor dificultad en los
ltimos acoples de las sntesis con el aminocido Lisina (K). La Lisina debido a su
carcter catinico presenta efectos de repulsin de carga en la estructura del pptido, lo
que explicara la dificultad de aadirse a la secuencia peptdica que se est formando. La
dificultad obtenida en los ltimos acoples de la sntesis se explica debido al impedimento
estrico que presenta la estructura de los pptidos que van tomando su conformacin
helical y la repulsin que generan los residuos, en especial Lisina y Triptfano en la
estructura. Al evaluar los tiempos de reaccin para los anlogos, se comprob la
dificultad que tienen los ltimos acoples en la sntesis peptdica, ya que necesitan ms
tiempo de reaccin y se evidenci que para aminocidos de menor tamao y de carcter
menos polar, el acople requiere menor tiempo, ver tabla 4. En general los anlogos de
dermaseptina presentaron un grado de dificultad elevado con el fragmento de la
secuencia AAA, debido a que el posible plegamiento e interacciones de tipo hidrofbico
desfavorecen que el nuevo aminocido llegue efectivamente al punto de reaccin.
Podemos observar tambin que los aminocidos en mayor proporcin dentro de los
anlogos de dermaseptina son alanina, leucina y lisina, lo que verifica la alta helicidad de
las secuencias, ya que estos aminocidos son considerados buenos formadores de
hlice [93].
Tabla 4. Tiempo total y nmero de ciclos en los anlogos de dermaseptina
Aminocido tiempo (h) Ciclos

A 1235 65
G 721 35
L 578 28
K 385 20
T 321 17
M 200 10
H 132 7
D 81 5
I 150 8
Q 180 9
S 109 6
W 18 1
6.3 Purificacin de pptidos

Luego de realizar el desanclaje de los anlogos de dermaseptina (figura 8) y los lavados
con ter etlico, el pptido obtenido es disuelto en agua desionizada y congelado a -70 C
durante 12 horas. Luego los pptidos son liofilizados durante 24 horas con lo cual se
logra obtener el pptido slido. Despus de la liofilizacin cada pptido se purifica por
cromatografa lquida de alta eficiencia en fase reversa, en donde se obtiene el gradiente
de ACN-AGUA efectivo para la separacin de los pptidos en modalidad analtica, que se
usan de igual manera en la modalidad semipreparativa. Al realizar la corrida
cromatogrfica se obtuvieron en algunos casos ms de dos picos significativos, un
ejemplo se muestra en la figura 10, a tiempo de retencin de 17,8 min, 19,0 y a 19,1 min
para el anlogo DM11. La presencia de los tres picos en el cromatograma posiblemente
se debe a subproductos de la reaccin o a una posible delecin en uno de los acoples, lo
cual es confirmado despus por masas. Las corridas cromatogrficas para la mayora de
los anlogos muestran un nico pico que corresponde al pptido obtenido, el cual es
verificado por espectrometra de masas MALDI-TOF y discutido ms adelante. Los
tiempos de retencin para cada pico representativo de los anlogos son mostrados en la
tabla 5. Para la mayora de los anlogos se encontraron tiempos de retencin
relativamente similares y cercanos a 18 min haciendo corridas cromatogrficas en
modalidad analtica, los cuales sirvieron para la posterior corrida en modalidad

semipreparativa. Para las corridas de DM5, DM11, DM17 y DM19 se encontraron ms de
un pico representativo (valores mostrados en verde), los cuales fueron separados por
HPLC en modalidad semipreparativa y analizados por espectrometra de masas.
Es importante resaltar que para todos los anlogos de dermaseptina a pesar de

encontrar un solo pico por HPLC, todos fueron recolectados en modalidad
semipreparativa y las fracciones recolectadas fueron liofilizadas y conservadas en un
desecador para los estudios posteriores. El mayor tiempo de retencin se encontr para
DM1, lo cual no es lgico inicialmente, ya que es uno de los pptidos con carga
relativamente alta (+3), lo que indica una mayor polaridad comparado con otras
secuencias. Esta diferencia se puede explicar por medio de la rueda helical (helical
wheel) para DM1 (figura 3), la cual muestra claramente una buena organizacin de los
residuos apolares sobre una de las caras de la hlice y cuenta con la ventaja de tener un
residuo heterocclico aromtico apolar como el W, el cual aumenta el efecto de
disminucin de la polaridad sobre toda la secuencia debido a su tamao y disposicin
sobre la hlice.
Figura 10. Corrida cromatogrfica en fase reversa para DM11
VWD1 A, Wavelength=220 nm(DERMASEPTINAS\DM11000001.D)

mAU
19.131
700
600
17.809
500
19.004
400
20.503
300
200
100
0
17 18 19 20 21 min
Tabla 5. Tiempos de retencin y pico de masas para los anlogos de dermaseptina
a +b +c
Abreviatura tR MH MH
DM1 21,566 1705,4 1704,047
DM5 16,586 1600,2 1599,140
DM6 18,176 1570,2 1568,955
DM9 18,386 1438,9 1438,071
DM10 18,301 1381,8 1380,937
DM11 19,131 1339,8 1339,135
DM16 18,644 1353,7 1353,130
DM17 15,276 1344,7 1545,156
DM18 15,473 1330,6 1330,077
DM19 18,634 1374,7 1274,893
DM20 15,566 1374,7 1374,069
a
tR es el tiempo de retencin en minutos determinado por RP-HPLC analtica.
b
El pico de masas (MH+) calculado con valores de literatura.
C
El pico de masas (MH+) fue obtenido por MS MALDI-TOF.
6.4 Caracterizacin de pptidos
6.4.1 Espectrometra de masas MALDI-TOF

Las seales obtenidas por espectrometra de masas se resumen en la tabla 5. Se
observan las masas para los diferentes iones moleculares. Debido al tipo de tcnica es
posible encontrar dichos iones sin presentar una fragmentacin de la muestra. Para los
anlogos DM17 y DM19 no se encontr el pico de ion molecular con la masa que
indicaba la secuencia adecuada (valores en rojo tabla 5). Para DM17 se encontr el pico
de m/z de 128.129 que posiblemente corresponde a la ciclizacin intramolecular de la
glutamina N-terminal que conlleva a la formacin de residuos de cido piroglutmico
mostrados en la figura 11 [94]. De igual manera se encontr un pico de m/z de 287.273
para DM19 que es igualmente explicado por la ciclizacin intramolecular de la glutamina
en el extremo N-terminal. Aunque la formacin de piroglutmico en Fmoc normalmente
no se presenta debido a las condiciones bsicas que se mantienen a lo largo de la
sntesis [95], esta puede ocurrir lentamente a pH bsico o neutro y se favorece en
condiciones cidas [96]. La adicin de HOBt como activador en la sntesis, pudo generar
que el pH del medio de reaccin se acidificara a tal punto que la ciclizacin intramolecular
en estas dos secuencias se favoreciera. [97].
Figura 11. Formacin de piroglutmico a partir de glutamina
H O
NH2 O
O N
-NH 3
OH
O OH
NH2
Glutamina Acido piro-glutmico
La mayora de pptidos sintticos tienden a formar aductos salinos en la placa donde se

siembra la muestra para MALDI-TOF. Los aductos de los pptidos que se encuentran
comnmente son los formados por iones como sodio Na+ (+22 Da), potasio K+ (+38 Da)
y los aductos mltiples formados por Na+ K+ (+30 Da) [96]. Estos aumentos en la
relacin m/z por parte de los iones sodio y de los iones potasio en todos los pptidos fue
encontrada. En general, los picos de in molecular en los anlogos de dermaseptina,
excepto en DM17 y DM19, indican que la sntesis qumica de los pptidos se llev en
gran medida de manera adecuada, permitiendo obtener las secuencias peptdicas
deseadas.
En la figura 12 se muestra el espectro de masas MALDI-TOF para la DM1. Se puede

observar un pico en m/z en 1775.111 que corresponde a un pico con masa +71.064 con
respecto a la secuencia de DM1, que posiblemente es debido a la adicin de un residuo
de alanina dentro de la secuencia. En la secuencia DM1 (ALWKTMLKKLGTMAL) estn
presentes 2 residuos de alanina, una al comienzo de la secuencia y otra al final. Cuando
se estaba acoplando la primera alanina que corresponde a la ms cercana del extremo
C-terminal, esta present problemas en el primer ciclo y tuvo que montarse con un nuevo
ciclo, pero lamentablemente el nuevo ciclo se realiz al da siguiente, lo que pudo
favorecer que parte del grupo protector Fmoc se haya retirado del extremo amino, para
que posteriormente llegara una nueva alanina a formar un nuevo acople, formando as la
posible secuencia (ALWKTMLKKLGTMAAL) con la alanina que ingresa en el segundo
ciclo.
Figura 12. Espectro de masas MALDI-TOF para DM1
Es importante anotar que el desprendimiento del grupo Fmoc se lleva a cabo bajo
condiciones bsicas, y que esta se pudo ver favorecida si el soporte slido no se
encontraba totalmente seco cuando se dejo para el segundo ciclo, que corresponde a un
tiempo relativamente largo, y que si a eso se le suma que el pH del medio fue
relativamente bsico, se favorece la desproteccin. Es importante resaltar que la
intensidad del pico de m/z 1775.111 es muy superior al encontrado para DM1 con m/z
1704.047 debido a que la especie 1775.111 posee una mayor facilidad para ionizarse por
MALD-TOF, pero que dichas intensidades de las seales no me da un indicativo de la
concentracin de la especie, lo que si hacen los cromatogramas de HPLC, lo cual se
discuti anteriormente.
En la figura 13 se presentan los espectros de masa MALDI-TOF para todos los anlogos
de dermaseptina. En cada uno de los espectros se logr identificar la seal que
corresponde a la secuencia del anlogo, las cuales se resumen en la tabla 5, excepto
para los anlogos DM17 y DM19. Tambin se logr identificar la mayora de las seales
presentes en todos los espectros, debidas a la adicin o delecin de ciertos residuos, a
ciclizaciones y a otros fenmenos ocurridos en la sntesis, las cuales se resumen en la

tabla 6. En la tabla 6 se muestran las variaciones en la relacin m/z encontradas para los
anlogos de dermaseptina, en donde se puede observar que algunos anlogos de
dermaseptina an contienen estructuras propiamente debidas al desanclaje final.
Figura 13. Espectros de masas MALDI-TOF para anlogos de dermaseptina

DM5 DM6
DM9 DM10
DM11 DM16
DM17 DM18
DM19 DM19
DM20
DM20
Tabla 6. Variaciones ms comunes de m/z encontradas para los anlogos de

dermaseptina
Variacin en masa
Variacin debida a:
promedio
71.09 Alanina (A)
-57.07 Glicina (G)
137.16 Histidina (H)
113.17 Isoleucina (I)
128.19 Lisina (K)
113.17 Leucina (L)
128.14 Glutamina (Q)
87.09 Serina (S)
- 101.12 Treonina (T)
200.46 Aducto HMP (hidroximetilfenil)/TFA
93.20 1,2-etanoditiol (EDT)
22.05 Sodio (Na+)
38.00 Potasio (K+)
60.05 Sodio Potasio (Na+K+)
56.18 t-butyl (tBu)
-17.20 Acido piroglutamico de Q
32.13 Oxidacin de M
162.07 Fmoc unido a pptido
44.93 disodio (Na+Na+)
96.87 Trifluoroacetil (TFA)
117.45 ster de Hidroxibenzotriazol (HOBt)
6.4.2 Dicrosmo circular

Se realiz dicrosmo circular para cada uno de los anlogos sintetizados, y se encontr
para todas las secuencias que el porcentaje de estructura en -hlice es el mayoritario
comparado con los dems porcentajes de las conformaciones de estructura secundaria
(ver tabla 7). Al comparar los valores de prediccin de la estructura secundaria por medio
bioinformtico (ver tabla 2) con los valores obtenidos por dicrosmo circular (ver tabla 7),
se encuentra que en la mayora de las secuencias, excepto en DM6, DM9, DM17 y
DM20, el porcentaje de -hlice encontrado por dicrosmo circular es superior al de la
prediccin bioinformtica. Estos resultados demuestran que la mayora de anlogos de
dermaseptina como se haba descrito por bioinformtica, adoptan una estructura de tipo
helical, y que muy posiblemente esta conformacin favorece la formacin de hlices
anfipticas mencionadas y evaluadas anteriormente por medios bioinformticos. El
menor valor de de helicidad lo present DM9, encontrando tambin que es uno de los
que tiene mayor porcentaje de estructura al azar junto con DM20. Esto se podra explicar
de alguna manera con la hidrofobicidad de los residuos y el desfavorecimiento de la
hlice de tipo anfiptica para estas dos secuencias. Por otro lado se puede observar que
para anlogos de dermaseptina las conformaciones de tipo hojas beta y giros no son
favorecidos debido a que los residuos presentes en la secuencia no permiten este tipo de
conformacin.
Al observar los datos de la tabla 7, se observa que no existen datos para la secuencia
DM19, esto es debido a que el dicrosmo circular de esta secuencia no es posible
calcularla con el programa CONTINLL que trae incorporado el equipo. Sin embargo, al
observar el espectro de dicrosmo circular (figura 14j) se observa la misma tendencia del
espectro para secuencias helicales (figura 14a, 14b y 14f), lo que demuestra que
posiblemente la conformacin de la estructura secundaria para el pptido DM19 es
igualmente helical. En la figura 14 se muestran los espectros para los anlogos de
dermaseptina. En los espectros se observan los dos mnimos de la curva de dicrosmo,
uno cercano a los 205 nm y el otro sobre 225 nm, que indican el carcter de organizacin
en forma helical de los pptidos, que es observable para todos los espectros DC de los
anlogos prcticamente en igual proporcin. Todos los espectros fueron corridos en agua
con 30% de TFE.
Tabla 7. Estructura secundaria de los anlogos de dermaseptina por dicrosmo circular

con el programa CONTINLL
% Hojas
Pptido % Hlice % Giro % Al azar
beta
DM1 98.1 1.8 0.0 0.1
DM5 100.0 0.0 0.0 0.0
DM6 55.5 2.4 14.4 27.7
DM9 41.5 4.8 18.2 35.5
DM10 85.8 0.0 1.1 13.1
DM11 100.0 0.0 0.0 0.0
DM16 77.3 2.6 5.9 14.2
DM17 42.1 0.5 24.8 32.6
DM18 74.4 0.0 0.0 25.6
DM19 SD SD SD SD
DM20 48.6 0.0 3.9 47.5
SD: Sin deconvolucin
Se puede observar que todos los espectros presentan la misma tendencia debida a
estructuras de tipo helical, y al posible efecto que tiene el trifluoroetanol en la estructura
de algunos pptidos (figura 14). Este cosolvente ayuda a estabilizar la hlice debido
posiblemente a que su constante dielctrica es relativamente baja (26.69) comparada
con la del agua (78.50) [98] y posee un momento dipolar alto, lo cual promueve el
plegamiento de la cadena peptdica, favoreciendo as la formacin de puentes de
hidrgeno intramoleculares que estabilizan la hlice. Este posible plegamiento debido al
favorecimiento de los puentes de hidrgeno intramoleculares en el pptido, hacen que el
agua sea expulsada de los alrededores del pptido [99], acompaado con una
disminucin de la constante dielctrica del medio [100]. En varios estudios se ha
encontrado que para pptidos en agua con concentraciones mayores o iguales de 30%
de TFE, se favorece la interaccin hidrofbica entre parte de las cadenas laterales de
ciertos residuos lo que conlleva al plegamiento de la estructura secundaria del pptido
[101, 102].
Figura 14. Espectros de DC para anlogos de dermaseptina
5.00E+05 DM1 DM5

2.00E+05
3.00E+05 1.00E+05
1.00E+05
Ellip. Mol
0.00E+00
Ellip. Mol
-1.00E+05 -1.00E+05
-3.00E+05 -2.00E+05
190 200 210 220 230 240 250 260 190 200 210 220 230 240 250 260
Wavelength (nm) Wavelength (nm)
a b
DM6 DM9
4.40E+04
5.00E+04
0.00E+00
0.00E+00
Ellip. Mol
Ellip. Mol
-4.40E+04
-5.00E+04
-8.80E+04 -1.00E+05
-1.32E+05 -1.50E+05
190 210 230 250 190 210 230 250
c d
DM10 DM11
2.00E+05 2.00E+05
1.00E+05 1.00E+05
0.00E+00
Ellip. Mol
Ellip. Mol
0.00E+00
-1.00E+05 -1.00E+05
-2.00E+05 -2.00E+05
190 210 230 250 190 210 230 250
e f
DM16 DM17
2.00E+05 0.00E+00
1.00E+05 -2.00E+04
0.00E+00
-4.00E+04
Ellip. Mol
Ellip. Mol
-1.00E+05
-6.00E+04
-2.00E+05
-3.00E+05 -8.00E+04
190 210 230 250 190 210 230 250
g h
1.00E+05
DM18 DM19
7.20E+05
0.00E+00
4.20E+05
-1.00E+05
Ellip. Mol
Ellip. Mol
1.20E+05
-2.00E+05 -1.80E+05
-3.00E+05 -4.80E+05
190 210 230 250 190 210 230 250
g h
1.00E+05
DM18 DM19
7.20E+05
0.00E+00
4.20E+05
-1.00E+05
Ellip. Mol
Ellip. Mol
1.20E+05
-2.00E+05 -1.80E+05
-3.00E+05 -4.80E+05
190 210 230 250 190 210 230 250
i j
5.00E+04 DM20
0.00E+00
-5.00E+04
Ellip. Mol
-1.00E+05
-1.50E+05
190 210 230 250
Wavelength (nm)
k
6.5 Ensayos biolgicos
6.5.1 Ensayo de hemlisis

En este estudio se encontr que todos los anlogos de dermaseptina evaluados
presentan baja actividad hemoltica sobre eritrocitos humanos. Los datos son
presentados en la tabla 8, en la cual se observa que la concentracin hemoltica media
(HC50) para todos los pptidos es superior a la concentracin mxima del estudio (200
g/mL). En la cuarta columna se observan los porcentajes de hemlisis a la mxima
concentracin del estudio calculados para cada secuencia. El mayor efecto hemoltico lo
genera DM17 (6.16%), seguido de DM20 (5.61%) y DM5 (4.99%), en donde DM17 y
DM20 tienen un efecto mnimo sobre los glbulos rojos, lo cual es conveniente para la
accin de los pptidos sobre clulas humanas. De los 3 pptidos que presentaron el
mayor efecto hemoltico, el menor efecto lo muestra DM5, posiblemente a que su carga
total es +4, la cual es mayor a la de DM17 (0) y DM20 (-1), lo que dificulta la interaccin
de tipo electrosttica con el glbulo rojo.
Los controles usados en el estudio fueron eritrocitos diluidos en solucin salina sin
exposicin a ninguna sustancia que corresponden al control negativo o 100% de
viabilidad y eritrocitos expuestos a agua destilada estril considerado como control
positivo el cual genera el 100% de hemlisis. Aparte de los pptidos se evalu el carcter
hemoltico que presentan la pentamidina y el pptido CLIP, los cuales corresponden a un
medicamento de eleccin para el tratamiento de la LC en varios pases y a la cadena
peptdica invariable naturalmente cargada en el complejo mayor de histocompatibilidad
(CMH) respectivamente. A la mxima concentracin de los pptidos evaluada, se
encontraron porcentajes de hemlisis inferiores al 6.16% con HC50 superiores a
200g/mL.
Tabla 8. Actividad hemoltica y citotxica de los pptidos sobre eritrocitos y monocitos de

sangre perifrica humana respectivamente. La concentracin media Hemoltica (HC50) y
la concentracin letal media (CL50) expresada en g/mL
% hemlisis a la
CL50 en DC
Pptido HC50 (g/mL) mxima
(g/mL)
concentracin
DM1 >200 >200 1.82
DM5 >200 >200 4.99
DM6 >200 >200 2.15
DM9 >200 >200 1.47
DM10 >200 >200 2.65
DM11 >200 >200 1.05
DM16 >200 >200 1.80
DM17 >200 >200 6.16
DM18 >200 >200 2.03
DM19 >200 >200 2.05
DM20 >200 >200 5.61
Pentamidina > 10 > 10 <1
Clip >200 >200 <1
6.5.2 Ensayo de citotoxicidad

El efecto citotxico sobre clulas monocitos de sangre perifrica humana fue mnimo en
todos los pptidos evaluados, lo cual se reporta en la tabla 8. Estos resultados muestran
que los anlogos de dermaseptina pueden llegar a ser usados como herramienta
teraputica, ya que a concentraciones relativamente altas (>200 g/mL) no se genera
citotoxicidad sobre clulas humanas sanas. La posibilidad del uso de estos anlogos
como posible tratamiento contra LC, es viable solo para aquellas secuencias activas
contra el parasito, sin efectos sobre clulas humanas a las concentraciones de pptido
de uso teraputico.
A las mximas concentraciones evaluadas para cada uno de los pptidos, la citotoxicidad
sobre monocitos de sangre perifrica humana fue mnima calculndose CL50 superiores
a 200g/mL. Estos datos se muestran en la tabla 8.
6.5.3 Ensayos de efectividad sobre promastigotes de L.

panamensis
De los pptidos evaluados, slo se detect actividad leishmanicida contra promastigotes
de L. panamensis en un pptido, el anlogo denominado DM1. Para este pptido, la
CE50 hallada fue de 151,9g/mL con R2 superior a 0.9 para todos los casos, ver tabla 9.
Al observar los valores de la eficacia sobre L. panamensis presentados en la tabla 9, se
puede observar que la pentamidina presenta una concentracin media efectiva casi 100
veces menor (EC50<1,25g/mL) comparado con el nico anlogo activo contra L.
panamensis DM1 (EC50=151,9g/mL), lo que indica que este medicamento es ms
activo contra la especie de Leishmania, pero es importante resaltar que esa efectividad
del medicamento no es selectiva contra el parasito. La pentamidina, tiene un efecto
compartido para promastigotes y amastigotes, lo cual favorece los protocolos
experimentales, a diferencia de las sales antimoniales como el antimoniato de
meglumina, que al ser un profrmaco, slo resulta efectivo sobre las formas
intracelulares del parsito [33, 103]. El isotianato de pentamidina, se ha convertido en el
medicamento de eleccin para el tratamiento de la LC en varios pases donde la
enfermedad es endmica, presentando una eficacia muy similar a los antimoniales
pentavalentes pero con una incidencia menor de efectos adversos, lo cual se ha
evaluado tambin en Colombia [33, 75-77]. Esa incidencia menor de los efectos adversos
que presenta la pentamidina no es comparable con la posible incidencia del us de
pptidos con accin biolgica, ya que estos efectos adversos se ven disminuidos al
mximo [104]. Por eso, a pesar de que DM1 tiene una CE50 mayor comparado con la
CE50 de la pentamidina, esto no indica que la secuencia DM1 se pueda convertir en una
mejor alternativa para el tratamiento de la LC causada por promastigotes de L.
panamensis.
Tabla 9. Eficacia de los anlogos de dermaseptina sobre promastigotes de L.

panamensis. La concentracin media efectiva (EC50) es expresada en g/mL.
EC50
Leishmania
Pptido
panamensis
(g/mL)
DM1 151.9
DM5 >200
DM6 >200
DM9 >200
DM10 >200
DM11 >200
DM16 >200
DM17 >200
DM18 >200
DM19 >200
DM20 >200
Pentamidina < 1,25
Clip >200
La curva de viabilidad de L. panamensis vs la concentracin empleada de DM1 se

presenta a continuacin (figura 15). Se puede observar que la concentracin efectiva
para llevar al 50% de supervivencia del parasito es cercana a 151,9g/mL. La figura 15
muestra que no existe un efecto importante sobre la supervivencia del parasito a las
concentraciones bajas de DM1 en el estudio, pero cuando la concentracin del pptido
aumenta, dicho efecto aumenta drsticamente, indicando que el pptido a
concentraciones superiores a 150g/mL tiene un efecto alto sobre la supervivencia del
parasito.
Figura 15. Efecto de la concentracin de DM1 sobre la supervivencia de L. panamensis

100
80
% Supervivencia 60
40
20
0
0 50 100 150 200
Concentracin de DM1 / (g/mL)
La diferencia entre DM1, que corresponde al anlogo de dermaseptina activo contra L.

panamensis y los dems anlogos, se encuentra bsicamente en la regin inicial de la
secuencia, que corresponde al extremo amino de la secuencia. La DM1 al igual que la
secuencia dermaseptina S1 son activas contra la forma extracelular del parasito [81] y
poseen un residuo de triptfano (W) invariante en la posicin 3, que bsicamente es el
caracterstico en la familia de dermaseptinas [105]. La nica que posee ese residuo
invariante al inicio de su secuencia es el anlogo DM1, y que se ve favorecido an ms
por la carga neta de la molcula. Al evaluar la hidrofobicidad de los anlogos de
dermaseptina segn la escala de Kyte y Doolittle [106], se puede apreciar la distribucin
hidrofbica e hidroflica de cada anlogo, los cuales se presentan como grficos en la
figura 16. Al observar la distribucin de hidrofobicidad para DM1, se puede observar
claramente que es diferente a los dems anlogos evaluados, DM1 presenta al inicio de
la secuencia dos regiones de carcter hidroflico totalmente definidas que son debidas a
los residuos iniciales W, K y T que no estn presentes en ningn otro anlogo en el
extremo N-terminal. La distribucin de la hidrofobicidad de los dems anlogos no es
totalmente definida como si lo es en DM1, lo que sumado a la presencia de una hlice
totalmente definida de carcter anfiptico, hace que esta distribucin de la hidrofobicidad
a lo largo de la secuencia, posiblemente genere un resultado global sobre la accin de
los anlogos de dermaseptina al ser enfrentados con promastigotes de L. panamensis.
Para el caso de DM5, DM17 y DM20 que corresponden a las secuencias que arrojaron la
actividad hemoltica superior comparado con los dems pptidos, se puede observar en
la figura 16, que la distribucin hidroflica de estos pptidos esta favorecida hacia el
extremo C-terminal de la secuencia, y que adems el carcter hidrofbico de los residuos

no est totalmente definido si se compara con DM1. Esta posible distribucin hidroflica
desplazada hacia el extremo C-terminal, puede afectar de alguna manera la interaccin
con el glbulo rojo, y de alguna manera aumentar la lisis del eritrocito debido a su
interaccin con el pptido.
Figura 16. Grfico de la distribucin de la hidrofobicidad por aminocido para los

anlogos de dermaseptina.
4.5 4.5
4.5
DM5 DM6
DM1
3.5 3.5
3.5
2.5 2.5
2.5
1.5 1.5
1.5
Hidrofobicidad
Hidrofobicidad
0.5 0.5
Hidrofobicidad
0.5
T M L K K L G T M A L H A G K M L K K L G T M A L H A G K A
-0.5 -0.5
A L W K T M L K K L G T M A L
-0.5
-1.5 -1.5
-1.5
-2.5 -2.5
-2.5
-3.5 -3.5
-3.5
-4.5 -4.5
-4.5
4.5 4.5 4.5

DM9 DM10 DM11
3.5 3.5 3.5
2.5 2.5 2.5
1.5 1.5 1.5

Hidrofobicidad
Hidrofobicidad
Hidrofobicidad
0.5 0.5 0.5
K L G T M A L H A G K A A L G L G T M A L H A G K A A L G A G T M A L H A G K A A L G A A
-0.5 -0.5 -0.5
-1.5 -1.5 -1.5
-2.5 -2.5 -2.5
-3.5 -3.5 -3.5
-4.5 -4.5 -4.5
4.5 4.5 4.5

DM16 DM17 DM18
3.5 3.5 3.5
2.5 2.5 2.5
1.5 1.5 1.5

Hidrofobicidad
Hidrofobicidad
Hidrofobicidad
0.5 0.5 0.5
H A G K A A L G A A A D T I S A G K A A L G A A A D T I S Q G K A A L G A A A D T I S Q G
-0.5 -0.5 -0.5
-1.5 -1.5 -1.5
-2.5 -2.5 -2.5
-3.5 -3.5 -3.5
-4.5 -4.5 -4.5
4.5 4.5
DM19 DM20
3.5 3.5
2.5 2.5
1.5 1.5
Hidrofobicidad
Hidrofobicidad
0.5 0.5
K A A L G A A A D T I S Q G T A A L G A A A D T I S Q G T Q
-0.5 -0.5
-1.5 -1.5
-2.5 -2.5
-3.5 -3.5
-4.5 -4.5
Aunque estos resultados no establecen claramente un mecanismo de accin de los

pptidos sobre las formas del parasito, ni lo intentan establecer, dicho mecanismo puede
estar asociado con una actividad dual (sinrgica) de los pptidos, incluyendo la
distribucin de los residuos a travs de una estructura secundaria totalmente definida que
logre su accin sobre las clulas del husped y/o en el parasito. Para poder potencializar
el uso de los pptidos con actividad antileishmanial en medicamentos que traten la
enfermedad, se requiere de estudios adicionales, incluyendo modificaciones qumicas de
los pptidos sintticos para aumentar su efecto contra la Leishmaniasis. En el caso del
presente proyecto, estas modificaciones deben estar enfocadas en el inicio de la
secuencia de dermaseptina (extremo N-terminal), logrando con la variacin de algunos
residuos aumentar su accin leishmanicida selectiva contra promastigotes de L.
panamensis. La estructura secundaria de cada uno de los anlogos de Dermaseptina
juega un papel importante en la actividad contra el parasito, en la cual un mayor
porcentaje de estructura de tipo helical no necesariamente proporciona una mayor accin
antileishmanial, pero la distribucin de los residuos en la secuencia si logran de alguna
manera aumentar dicha accin. Tambin se encontr que un mayor carcter catinico
con distribucin anfiptica e hidrofbica en la secuencia, favorece la interaccin con
membrana celular y favorece la accin leishmanicida sobre L. panamensis.
Al evaluar los resultados obtenidos para los anlogos de dermaseptina, se pueden

sugerir modificaciones de la secuencia activa contra el parasito DM1, e intentar predecir
por medio de herramientas bioinformticas su estructura secundaria, carga total y
distribucin de la hidrofobicidad a travs de una posible estructura helical anfiptica. En
la tabla 10 se presentan algunas modificaciones del anlogo DM1, las cuales cumplen las
caractersticas encontradas para un posible pptido activo contra Leishmania. Todos
conservan un porcentaje de helicidad superior al 53%, una carga total positiva superior a
+3 y presentan un valor de carcter antimicrobial comparable con el calculado para DM1.
Se muestran en rojo los residuos modificados en la secuencia original del anlogo DM1.
Es importante resaltar que todos los anlogos modificados conservan una distribucin
hidrofbica favorable en la totalidad de la secuencia, e intentan mejorar de alguna
manera la distribucin de los residuos en la hlice anfiptica.
Tabla 10. Secuencias de anlogos modificados de DM1
Secuencia Porcentaje Helice Carga Total Score Antimicrobial

GLWKTMLKKLGTMAL 60.0 3 1.940
KLWKTMLKKLGTMAL 60.0 4 1.110
LWKTMLKKLGTMALH 53.3 4 0.402
ALWKTMLKKLGTWAL 60.0 3 1.286
ALWKTWLKKLGTMAL 60.0 3 1.354
GLWKTWLKKLGTWAL 60.0 3 1.853
7. Conclusiones
Se logr estandarizar las condiciones necesarias para sintetizar anlogos de
Dermaseptina S1 por SPPS mediante metodologa Fmoc.
Se logr determinar la estructura secundaria de los anlogos sintetizados y

compararla con datos obtenidos por prediccin bioinformtica, encontrando alta
correlacin entre los valores experimentales y los obtenidos por medio
bioinformtico.
Los anlogos de Dermaseptina evaluados muestran baja actividad hemoltica y

citotxica sobre eritrocitos humanos de donantes sanos grupo O Rh positivo y
monocitos de sangre perifrica respectivamente.
De los pptidos evaluados, el nico pptido que present actividad selectiva

contra promastigotes de L. panamensis fue DM1, lo cual es un indicio de su
potencial actividad antimicrobiana contra esta especie del parsito Leishmania.
Se encontr que la que la concentracin efectiva media para DM1 contra L.

panamensis es de 151,9g/mL, a partir de la cual existe un efecto elevado sobre
la supervivencia del parasito bajo la accin del pptido.
Se logr establecer una relacin directa entre la estructura secundaria de los

pptidos y la distribucin hidrofbica de ciertos residuos a lo largo de la cadena
con la accin leishmanicida de los anlogos evaluados contra promastigotes de
L. panamensis.
Los resultados obtenidos en este proyecto son de gran utilidad para disear y
sintetizar pptidos cortos que sean usados como nuevos frmacos contra la
leishmaniasis y se conviertan en una alternativa para combatir los efectos

adversos que conllevan los tratamientos actuales
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Sntesis y determinacin estructural

CARLOS ANDRS RODRGUEZ VEGA

Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelln

CARLOS ANDRS RODRGUEZ VEGA

Tesis presentada como requisito parcial para optar al ttulo de:

Universidad Nacional de Colombia - Sede Medelln

Agradezco sinceramente a la Doctora Blanca Fabiola Espejo Benavides, Directora de mi

Al grupo de investigacin en inmunotoxicologa (COL 0068495) de la Universidad

A la Universidad Nacional de Colombia por permitir mi ingreso a los estudios de

Y a todas aquellas personas que de una u otra forma participaron en la realizacin de

Lista de figuras .............................................................................................................. VII

Lista de tablas .............................................................................................................. VIII

1. Planteamiento del problema y justificacin ........................................................... 3

4. Marco terico y estado del arte ............................................................................. 11

5. Materiales y mtodos ............................................................................................. 21

5.2 Sntesis qumica en fase slida Fmoc de las secuencias .................................. 21

6. Resultados y discusin ..........................................................................................30

El presente estudio propuso sintetizar y evaluar la actividad de 11 pptidos sintticos a

Con ayuda de las herramientas bioinformticas, usando el servidor Scratch Protein

La diversidad de pptidos de origen natural que tienen actividad biolgica demostrada es

Sntesis y determinacin estructural de pptidos derivados de Dermaseptina con

Uno de los problemas que se ha intentado enfrentar es una enfermedad de tipo

En este trabajo se realiz el diseo y sntesis de pptidos derivados de Dermaseptina

promastigotes de L. panamensis lo cual es un indicio de su potencial actividad

3.1 Objetivo general:

3.2 Objetivos especficos:

4.1 Leishmaniasis, enfermedad tropical endmica

La propagacin y la gravedad de la enfermedad se ven aumentadas por su coinfeccin

parte del parsito, ha dado lugar a la utilizacin de frmacos ms txicos en el

Los frmacos actualmente en uso para el tratamiento de la Leishmaniasis se limitan a

Hasta el momento no existen vacunas efectivas que permitan combatir o prevenir la

crecimiento y divisin intracelulares. Se usa en perros y en seres humanos en

La leishmaniasis representa un reto mundial para el descubrimiento de nuevas

El potencial uso de emulsiones, liposomas y nanopartculas que sean capaces de portar

4.2 Pptidos antimicrobianos, Dermaseptinas

En los aos sesenta se observ la presencia de un pptido con actividad antimicrobiana

Los antimicrobianos convencionales, son aquellas molculas que logran inhibir el

Por otro lado, encontramos las Dermaseptinas

protozoos (Leishmania mexicana y Plasmodium falciparum) [49-51], levaduras y hongos

4.3 Sntesis de pptidos

4.4 Sntesis de pptidos en fase slida

bajo condiciones suaves que preservan la integridad del pptido y reduce la

Figura 1. Principios de SPPS tomado de [56]

Figura 2. Epimerizacin por medio de la formacin de Oxazolonas, tomado de [56].

En SPPS, se utilizan dos estrategias principales: Boc/Bzl y Fmoc/tBu denominados as

4.5 Soporte slido para SPPS

4.6 Disolventes en SPPS

4.7 Agitacin y lavados en SPPS

5.1 Estudios previos y seleccin de secuencias para

Posteriormente se calcula la carga neta de cada uno de los anlogos y se hace el

5.2 Sntesis qumica en fase slida Fmoc de las

(IPA), N,N'-dimetilformamida (DMF) y 1-metil-2-pirrolidona (NMP). Los activadores que se

temperatura ambiente. La extraccin del pptido se realiza por medio de lavados

5.3 Purificacin de los pptidos

5.3.2 Cromatografa lquida de alta eficiencia

5.4 Caracterizacin de los pptidos

5.4.1 Espectrometra de masas MALDI-TOF

5.4.2 Dicrosmo circular (DC)

5.5 Ensayos biolgicos

Vicerrectora de Investigacin de la Universidad Nacional de Colombia, Convocatoria

5.5.4 Pptidos y controles

5.5.5 Ensayos de hemlisis

de absorbancia obtenidas de la lectura de la solucin de eritrocitos expuestos a agua