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AISLAMIENTO DE ARN EN LEVADURAS

1. OBJETIVOS
1.1 Aislar ARN a partir de levadura Saccharomyces cerevisae seca

2. INTRODUCCION

El ARN, a diferencia del ADN, se distribuye en toda la clula. La mayora del

ARN se encuentra en el citoplasma como ARN soluble ribosomal, pero
aproximadamente el 10% se encuentra en el ncleo y un poco cantidad se halla en las
mitocondrias. Para que le ADN y ARN pueda ser analizados y estudiados por los
diferentes mtodos propuestos, es necesario que previamente stas macromolculas
sean aisladas de la estructura celular.

Segn el mtodo de extraccin, el mtodo PLUMMER, el ARN se obtiene de un

homogenizado de clulas de levaduras al cual se le agregar una solucin de fenol
concentrada. Esta solucin de fenol concentrada rompe los enlaces de hidrgeno en la
macromolcula, causando desnaturalizacin de la protena. La suspensin turbia se
centrifuga y aparecen dos fases: la fase inferior de fenol contiene ADN y la superior
acuosa contiene carbohidratos y ARN. La protena desnaturalizada se halla presente en
ambas fases y puede removerse por centrifugacin. El ARN se precipita luego con
etanol. El producto obtenido no contiene ADN pero generalmente est contaminado con
polisacridos. Se puede obtener mayor purificacin tratando esta preparacin con
amilasa.

Para determinar la presencia de ARN extrado se puede utilizar mtodos

espectrofotomtricos como la absorcin ultravioleta (basado en el gran poder de
absorcin de los cidos nucleicos en la regin UV del espectro), mtodos qumicos
colormetros (basados en la capacidad de determinados compuestos para formar
complejos carnognicos al reaccionar con los cidos nucleicos).

La presente experiencia de laboratorio tiene como finalidad extraer o aislar ARN

de clulas de Saccharomyces cerevisae levadura de pan o vino. El reactivo de
orcinol, en presencia de cloruro frrico como catalizador, reacciona con furfural,
formado por calentamiento de la pentosa con HCLcc, para dar un color verde
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3. MATERIAL METODOS
3.1 Material Biologico:

Levadura Saccharomyces cerevisae (10g de levadura seca)

3.2. Reactivos y soluciones

Solucin concentrada de fenol
Acetato de potasio al 20%
Alcohol etlico comercial
Mezcla etanol:agua (3:1)
Reactivo orcinol
Agua destilada

3.3. Material y equipos de laboratorio

Balanza y centrifuga
Bagueta y gotero de punta fina
Vaso de PP
Pipetas
Tubos de ensayos
Bao mara

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. AISLAMIENTO DE ARN

Suspender 10g de levadura seca activa en 40 ml de agua destilada a
37C e incubar por 15 minuto a esta temperatura
Retira el beaker, agregar 5oml de solucin concentrada de fenol (muy
corrosivo) y agitar mecnicamente la suspensin durante 30 minutos a
T ambiente
Centrifugar en frio a 4000 rpm durante 10 minutos para romper la
emulsin
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Con una pipeta de punta fina trasvasar cuidadosamente la capa

superior acuosa a un tubo de ensayo y centrifugar en frio a 4000 rpm
durante 10 minutos ms para separar la protena desnaturalizada
Medir el volumen de sobrenadante obtenido, trasvasar a un beaker de
100 ml y agregar acetato de potasio al 20% hasta obtener una
concentracin final de 2% (20g/L) de la sal
Precipitar el ARN aadiendo dos volmenes de alcoholo etlico
comercial. Lugo, colocar el sistema en hielo y dejarlo all por una hora
(este tiempo estar en funcin de una franca y mayor precipitacin del
ARN)
Separar el precipitado por centrifugacin en frio a 3500 rpm por 5
minutos. Opcionalmente, se puede eliminar por decantacin una
cantidad prudencial del volumen total antes de centrifugar
Lavar el precipitado con 8ml de una mezcla etanol:agua (3:1),
disolviendo con una bagueta y centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos
Lavar el precipitado con 8ml de etanol, centrifugar a 3500 rpm por 5
minutos y eliminar el sobrenadante, el precipitado es ARN

4.2. EVALUACION DEL AISLAMIENTO DE ARN (REACCION DE

ORCINOL)
SISTEMA (Tubos)
COMPONENTES (ml) Y PROCESO
1 2
Agua destilada 1 1
Precipitado (ARN) pizca ------
Reactivo orcinol 1 1
Calentar en bao de agua de ebullicin por 5-10 minutos. Retirar los tubos y
enfriar
Agua destilada 2 2
Mezclar y observar una coloracin verde la cual indica presencia de ARN

La intensidad del color verde estar expresada que tanto se ha aislado el ARN
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5. ESQUEMA.
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6. RESULTADO
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7. DISCUSION.
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8. CONCLUSION.
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9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

10. CUESTIONARIO.
1. Cul es el efecto del fenol sobre las levaduras?
2. Porqu se utiliza el acetato de potasio en la extraccin del ARN?
3. Cul es el efecto del etanol en el proceso de extraccin del ARN?
4. Cules son los constituyentes del ARN?
5. Porqu se emplea el reactivo de orcinol?
6. Qu tipos de ARN conoces? Seale las caractersticas de cada uno de
ellas
7. Todos los organismos vivos presentan ARN?
8. Cul es el papel biolgico del ARN?
9. en qu se diferencia las molculas de ARN de la ADN?
10. A qu se debe la coloracin verde luego de adiciona el reactivo de
orcinol?