Manual Tcnico

Biologa reproductiva y citogentica

de la papa

Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale

Abril 2009

Centro Internacional
Red LatinPapa
de la Papa (CIP)
Biologa reproductiva y citogentica de la papa Manual Tcnico
Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale
Centro Internacional de la Papa (CIP) 2009

ii
Tabla de Contenidos

Prlogo iv
Agradecimientos v
Introduccin vi

1 Biologa reproductiva de la papa 1

1.1 El ciclo de vida en papa 1
1.1.1 Ciclo de vida asexual 1
1.1.2 Ciclo de vida sexual 1

2 Mitosis (Divisin nuclear somtica) 3

2.1 Determinacin de ploida en clulas somticas 4
2.1.1 Mtodo de preparacin de cromosomas en races de papa 4
2.1.2 Conteo del nmero de cloroplastos en las clulas guarda 6
2.1.3 Determinacin de ploida por Citometra de flujo 7

3 Meiosis 9
3.1 Meiosis I 9
3.2 Meiosis II 11
3.3 Observacin de meiosis en clulas sexuales 12
3.4 Gametos 2n 13

4 Observacin de polen y determinacin de su fertilidad 14

4.1 Cultivo de polen in Vitro 14
4.2 Crecimiento del tubo polnico in vivo (en el pistilo) 17

5 Cultivo in vitro de embriones inmaduros 19

Literatura consultada 21

iii
Prlogo

La citogentica surge de la necesidad de relacionar los hechos descritos por la gentica

con los fenmenos que ocurren dentro de la clula u rganos especializados. Ella ha
permitido conocer la estructura y funcin de cada uno de los componentes de la clula, y de
estructuras ms especializadas, en relacin con funciones como la reproduccin sexual.

La citogentica clsica y molecular ha hecho posible el anlisis, interpretacin y

trascendencia de ciertas caractersticas, desde las ms simples a las ms complejas
(cromosomas y genes, cromosomas condensados y linearizados), contribuyendo en gran
medida a la resolucin de problemas en aspectos taxonmicos, evolutivos y aplicativos.
Asimismo, los estudios citogenticos permiten realizar valiosos aportes al conocimiento de
los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiacin en las plantas.

Tambin permite la observacin de los caracteres citolgicos de clulas especializadas, su

funcin y comportamiento ante cambios del entorno, o la serie de procesos que se suceden
durante la fertilizacin, aportan conocimiento a la ciencia bsica.

En los programas de mejoramiento la citogentica ayuda dilucidar ciertos fenmenos

genticos, como: el apareamiento y entrecruzamiento entre los cromosomas homlogos, la
relacin entre el polen y pistilo (fertilizacin-fecundacin) e identificacin de
incompatibilidades, irregularidades meiticas en hbridos, produccin de gametos 2n y su
relacin con la formacin de poliploides, etc.

El presente manual servir como gua de capacitacin de investigadores, profesores,

estudiantes y tcnicos. El documento busca llevar a la prctica diversas tcnicas clsicas y
bsicas, que faciliten la observacin e interpretacin de parmetros y resultados genticos,
ayudando a proyectar convenientemente un plan de mejoramiento, as como tambin en
determinados estudios a nivel molecular.

Los ejemplos y las ilustraciones han sido tomados de la papa, la cual, a pesar de contar con
cromosomas pequeos, hace posible evidenciar ciertos fenmenos al nivel citolgico y
estos a su vez relacionarlos con la constitucin y el comportamiento gentico.

Adems, se da los conceptos tericos en cada uno de los temas tratados, pudiendo estas
tcnicas ser aplicadas en otros cultivos.

Los autores

iv
Agradecimientos

La publicacin del presente Manual es gracias al soporte financiero de:

Red Iberoamericana de Innovacin en Mejoramiento y Diseminacin de la Papa -

Red LatinPapa
INIA Espaa
FONTAGRO
Federal Ministry for Economic Cooperation and Development (BMZ)
Centro Internacional de la Papa (CIP)

v
Introduccin

El nmero bsico de cromosomas en el gnero Solanum es doce ( =12). En las papas

silvestres y cultivadas existen diferentes nmeros de ploida, pueden ser 2n=2=24,
2n=3=36, 2n=4=48, 2n=5=60, 2n=6=72. El ms importante y de gran significacin en la
evolucin de las especies de la papa es el nivel tetraploide, que cubre un amplio rango de
distribucin desde la parte meridional de EE.UU. a la regin austral y sur de Chile. El nivel
de ploida se determina contando el nmero de cromosomas en las clulas somticas y/o
clulas sexuales. Otro mtodo rpido y directo es por citometra de flujo que cuantifica la
cantidad de de ADN nuclear, sin embargo necesita de un aparato llamado citmetro de
flujo.

El anlisis citogentico ha sido ampliamente usado en estudios de gentica,

comportamiento de los cromosomas, compatibilidad cromosmica, evolucin, filogenia,
origen y taxonoma, as como tambin para determinar la viabilidad del polen evaluando su
fertilidad tanto in vitro como in vivo (germinacin in situ); determinar la presencia de
gametos no reducidos, el mecanismo por los cuales se producen etc., estudios que nos
permitirn estimar el potencial de las especies o hbridos para propsitos de mejoramiento
permitindonos desarrollar las estrategias a seguir en la transferencia de resistencias a
enfermedades, plagas, etc., a travs de la manipulacin de ploida.

Y es a travs de la biologa reproductiva ya sea asexual o sexual por la cual las plantas
producen nuevos individuos, as:

Microsporognesis, megasporognesis, barreras de pre y post fertilizacin, mutantes

meiticos, polinizacin, embriognesis, desarrollo del endospermo, etc., estn involucrados
en todo el proceso de vida, y su entendimiento nos provee de una gua para la seleccin de
las hibridizaciones que seran exitosas tanto artificialmente como en la naturaleza,
proporcionando las llaves para una eficiente y efectiva manipulacin del material del
germoplasma silvestre, cultivado y avanzado de papa. Alguno de los ms importantes tipos
de informacin necesitada por un mejorador incluye los principios de gentica y
citogentica.

Nuevas tcnicas citolgicas moleculares como FISH, GISH, DNA fibers, abren actualmente
un abanico de oportunidades, sirviendo como intermediario entre mapas fsicos y mapas
genticos, mostrando posiciones aproximadas de genes y marcadores moleculares, en sus
distancias relativas a marcadores estructurales como centrmeros, telmeros, bandas de
heterocromatina y constricciones secundarias.

vi
Captulo 1. Biologa reproductiva de la papa

1.1 El ciclo de vida en papa

Hay una generacin diploide, que consiste en una serie de divisiones mitticas, seguido por
meiosis. Contina con una serie de divisiones haploides, seguido de la fusin de dos
ncleos haploides (gametos), para dar un diploide. Es convencional llamar a la fase
haploide gametofito y la diploide esporofito.

1.1.1 Ciclo de vida asexual

Reproduccin vegetativa de la papa: Asegura la conservacin clonal del genotipo, una

nueva planta se forma a partir de tubrculos, brotes o yemas dando lugar a clones
genticamente idnticos a la planta original, reproduccin que se realiza por mitosis. La
propagacin asexual ha sido una gran ventaja para los mejoradores de papa puesto que se
puede fcilmente obtener un genotipo seleccionado y multiplicarlo. Otro uso prctico de la
propagacin asexual es el cultivo de tejidos y el cultivo de meristemas para la erradicacin
de algunos patgenos.

1.1.2 Ciclo de vida sexual

Reproduccin sexual de la papa: Permite que el material gentico de dos individuos se

combinen y se formen nuevas combinaciones allicas, requiere de la participacin de
rganos reproductivos femeninos (pistilos) y masculinos (anteras) y por el proceso de
polinizacin se formen bayas con semillas y cada una de estas constituye un nuevo
individuo.

Morfologa floral: las flores se encuentran reunidas en agregados llamados inflorescencias,

sosteniendo a la inflorescencia se encuentra el pednculo, y lo que sostiene a cada flor es
el pedicelo, que est dividido en pedicelo inferior y superior.

Una flor contiene 2 juegos de envolturas florales: el cliz y la corola los que forman el
receptculo floral ubicado debajo de las partes frtiles de la flor y compuesto por los
estambres y el pistilo. El estambre consiste de un corto filamento que sostiene a la antera
con dos lbulos que contiene el polen, los cinco estambres se encuentran separados de la
corola. El pistilo est diferenciado en ovario, en la parte baja lleva los vulos, el estigma es
el que recibe el polen y el estilo es el que conecta a ambos. Cada vulo contiene una clula
madre llamada megaspora, la cual est rodeada de un tejido llamado nucela y de un
integumento, cuando es fertilizado y maduro el vulo desarrolla en una semilla.

Esta fase comprende dos aspectos: Meiosis y fertilizacin.

El ms importante acontecimiento de la reproduccin sexual es la creacin de variacin

gentica, nuevos genotipos con atributos genticos de ambos padres pueden estar
combinados en las semillas formadas. De dos eventos en la meiosis como es el crossing
over en la Profase I y la separacin al azar de bivalentes en Metafase I, podemos decir que
cada producto es un nico genotipo. El uso prctico de la reproduccin sexual es lo que
constituye una de las formas para la conservacin de germoplasma, especialmente
silvestre, otro uso es para la produccin de semilla verdadera de papa.

1
 Megasporognesis. Este proceso tiene lugar en el tejido del ovario (contiene de
300 a 600 vulos) y en las clulas madre de las megasporas, dando lugar a clulas
reproductoras llamadas sacos embrionarios, que contienen al gameto femenino u
ovoclula. Una clula materna, megaspora, mediante la I y II divisin meitica forma
4 megasporas, las 3 superiores degeneran y la inferior se convierte en megaspora
funcional, esta dar origen al saco embrionario, que se agranda por
megagametogenesis ocurriendo tres divisiones mitticas, sin citocinesis que darn
origen a 8 ncleos que al orientarse forman el saco embrionario. Uno de los 3
ncleos del extremo micropilar del saco embrionario se trasforma en huevo
funcional. Hay varias alternativas en la formacin del saco embrionario, la descrita
ocurre en la mayora de las Angiospermas.

Microsporognesis. Este proceso tiene lugar en el tejido esporgeno de las

anteras, los ncleos de clulas madres del polen son muy largas justo antes de la
meiosis y en la formacin de las ttradas de las microsporas la pared de callosa
alrededor de cada clula madre del polen puede ser detectada durante la iniciacin
de la meiosis y en cada nueva microspora joven de la ttrada, la que es tambin
separada por una capa de callosa despus de la II divisin meitica, tan pronto
como la formacin de la pared externa del polen empiece a formarse, la callosa
empieza a desaparecer. Las capas meristemticas que dan origen a las diferentes
estructuras u rganos en las plantas, son denominadas L1 que dan lugar a la
epidermis (cloroplasto), L2 que forman las hojas, tallos y flor (rganos sexuales) y la
L3 que generan los tejidos internos del tallo.

2
Captulo 2. Mitosis (Divisin nuclear somtica)

Este proceso ocurre en las clulas conocidas como meristemas (races, hojas, flores) y
meristemas axilares, estas estructuras tienen la capacidad de dividirse a lo largo de todo el
ciclo de vida del organismo.

Es un proceso continuo, en el cual se suceden en una secuencia cuidadosamente

ordenada los complejos preparativos para la divisin, por la cual se hace un reparto
equitativo del material gentico ya duplicado entre las dos clulas resultantes, manteniendo
as la ploida original de la clula. Implica que cada cromtida pueda migrar a un diferente
polo, separacin que es posible mediante el huso mittico o acromtico, estas fibras estn
formadas de microtbulos y sus protenas asociadas por un proceso de polimerizacin, que
se asocian a las cromtides permitiendo que cada una migren hacia los polos una vez que
ambas se separan a nivel centromrico.

Esta polimerizacin puede ser inhibida experimentalmente y muchos tratamientos con

sustancias como la colchicina, 8-hidroxiquinolena, Tjio y Levan (1950), para-
diclorobenceno, piretroides (Klein, 1990, Watanabe y Orrillo 1993, Chen, 2005) y
tratamiento por fro pueden efectivamente acumular clulas en metafase y cromosomas
condensados durante la mitosis. La mitosis comprende una divisin nuclear y somtica
(citocinesis) lo que permite que los organelos pasen ms o menos al azar a una u otra de
las dos clulas.

El ms importante carcter de la mitosis es que el nmero cromosmico permanece

constante a travs de sucesivas divisiones celulares, con una exacta distribucin de
cromosomas en las nuevas clulas formadas, genticamente idnticas entre s,
mantenindose la ploida original de la clula.

Convencionalmente la mitosis se divide en cuatro etapas: Profase, metafase, anafase y

telofase.

Interfase. Es el periodo entre las sucesivas divisiones donde los cromosomas son
prcticamente invisibles an con la ayuda del microscopio, durante esta fase antes
que la clula se divida tiene lugar la replicacin, que es la sntesis del ADN y
formacin de las fibras que conforman el uso mittico o spindle bipolar. Este
periodo pertenece a las etapas G1, S, G2. El genoma completo se replica una y solo
una vez en cada ciclo.

Profase. En esta etapa se aprecia la aparicin ntida de los cromosomas en el

ncleo, ya estn suficientemente condensados y son visibles bajo el microscopio
ptico. Se ve, que cada cromosoma consiste en dos copias longitudinales, llamadas
las cromtidas hermanas, se observan claramente unidas por los centrmeros, el
nuclolo pierde visibilidad, la membrana nuclear desaparece, el huso acromtico va
tomando cuerpo y muchas fibras cortas lo forman, las fibras polares, que llegan
desde cada polo del huso a la regin central hasta la mitad y las fibras cinetocricas
que se insertan en los cromosomas duplicados. Como vemos, estos dos grupos de
fibras posibilitan la separacin de las cromtidas hermanas durante la mitosis, los
cromosomas inician un proceso de acortamiento y engrosamiento. Al final de la
profase, los cromosomas estn completamente condensados y con la desaparicin
de la envoltura nuclear, quedan en contacto con el citoplasma.

3
 Metafase. En esta etapa, los pares de cromtidas, se acortan y se alinean en un
solo plano alrededor del centro de la clula, se observan ms gruesas.

Anafase. En esta etapa se duplican y separan los centrmeros y las cromtidas

hermanas se liberan, se repelen y son engarzadas por las fibras del huso que hacen
traccin sobre ellas, dirigindose a los polos, convirtindose cada cromtida en un
nuevo cromosoma. A medida que contina la anafase, los dos conjuntos idnticos
de cromosomas se mueven hacia los polos opuestos del huso.

Telofase. Al iniciarse esta etapa se nota la futura regin nuclear y aparece la

membrana nuclear, los cromosomas pierden su estado de condensacin y se
alargan. Comienza la formacin del nuclolo. Se produce simultneamente la
citocinesis, o sea la segmentacin y separacin del citoplasma, se termina de formar
la placa celular, la nueva pared celular entre las clulas recin formadas.

2.1 Determinacin de ploida en clulas somticas

Ploida es un trmino referido al nmero de grupos o juegos de cromosomas que una

clula posee.

2.1.1 Mtodo de preparacin de cromosomas en races de papa

Para una correcta determinacin del nmero de cromosomas es necesario contar con
tcnicas citolgicas que den buenos resultados, con un nmero aceptable de metafases
contables, con cromosomas bien separados y coloreados, por lo que las muestras debern
ser colectadas en estado de metafase. Para la acumulacin de cromosomas metafsicos
varios pre-tratamientos qumicos son usados y el mejor protocolo usado en nuestro
laboratorio es descrito (Watanabe y Orrillo, 1993). No hay una tcnica universal, cada
laboratorio toma una o varias tcnicas de acuerdo a las exigencias de cada cultivo.

El conocer la ploida de una especie es de gran ayuda en la determinacin taxonmica y de

gran importancia en los programas de mejoramiento.

La papa no es una especie ideal para estudios citogenticos. Los cromosomas somticos
de S. tuberosum miden de 1.0 a 3.5 m (Dong et al., 2000), nuevas tcnicas (FISH; GISH,
Fiber FISH), estudios de cromosomas en estado de Paquiteno, permiten hoy la
identificacin de los cromosomas y la caracterizacin del genoma de la papa. Figs. 1, 2 y 3.

1. Materiales
Sembrar en macetas pequeas, con musgo bien fino, o vermiculita tubrculos bien
brotados (tambin se pueden usar esquejes de plantas bien enraizadas, semillas
germinadas, plantas de in vitro). La coleccin de races se realiza en plantas bien
pequeas de unos 5 -10 cm de altura. Unas horas antes de colectar es conveniente
regar bien las plantas. La coleccin de las races se hace generalmente temprano,
en la maana alrededor de las 11 am.

2. Pre-tratamiento
Usando una pinza de punta bien fina se colecta puntas de races, aproximadamente
de 10 mm y se coloca en frasquitos o vials conteniendo agua destilada a
temperatura ambiente, despus de 1 h pasar a una solucin de (Permetrina:
La composicion quimica que figura en el envase es la siguiente: (3-Fenoxifenil)metil

4
Mtodo de preparacin de cromosomas en races de papa

Coleccin de races en:

Hidrlisis con HCl 1 N
(H2O destilada + 15uL Permetrina, pH previamente precalentado
Eliminar la solucin
5-5.8)
de pre-fijacin
24
horas

Colocar las races en Placa Eliminar la solucin &

Petri
Adicionar H2O destilada 8-10 min a 600C

Fig. 1: Toma de la muestra de races de papa, prefijacin e hidrlisis con HCl.

Tincin con Lacto-Propinico Orcena (15min Cortar 1-2mm de la punta de las

aprox.) races

Aplastado Presionar para extender el

(Squash) tejido

Lmina lista

Fig. 2: Coloracin con lacto propinico orcena, aplastado (squash).

a
 Observar al
microscopio

4X

2X 4X

Fig. 3: Observacin de clulas en metafase de races de papa, ploidas 2 y 4.

b
 () cis-trans 3-(2,2-dicloroetenil) 2,2-dimetil carboxilato de cicloropropano
(Permetrina),15 l en agua helada a pH 5 a pH 5.8, por 24 horas a 4 C. Caso de no
tener disponible la Permetrina, utilizar agua helada por 48 horas a 4 C, colocando
las botellitas conteniendo las races en un termo con hielo.

3. Fijacin
Es optativo, se puede obviar este paso si es que se desea ver las muestras
inmediatamente, caso de querer guardar las muestras por ms tiempo se fijaran en
alcohol 96 % 3p: cido actico 1p; y se deja a medio ambiente por 24 horas.

Si se quiere guardar en fijador hacerlo en alcohol de 70% y en refrigeracin a 4 C,

prepare suficiente cantidad de solucin fijadora, de tal manera de cubrir bien las
races. Los fijadores se preparan al momento de ser usados.

4. Hidrlisis
Se colocan las muestras en HCl 1N a 60 C de temperatura, por 8 -10 minutos; el
cido se calentara previamente, transcurrido el tiempo de hidrlisis se proceder a
quitar el cido y a lavar con agua destilada.

5. Coloracin
Con lacto-propinico orcena u orcena-actica, se procede a colocar las races en
pequeos contenedores o Petris conteniendo el colorante.

6. Aplastado o squash
Se colocan las races en un porta-objeto, usamos solamente 1-2 mm de la punta,
con una gota del mismo colorante (tambin podemos usar cido actico al 45 %), se
coloca un cubre-objeto y asegurando uno de los extremos procedemos con una
varilla de goma, o un borrador de un lpiz o la punta de l a presionar suavemente, o
dando golpecitos repetidos, pero firmes, permitiendo la disociacin del tejido.
Colocar el porta-objeto entre papel de filtro y presionar fuerte con el dedo pulgar
squash, pero tratando de evitar cualquier movimiento lateral del porta-objeto.

7. Observacin
La muestra se coloca bajo microscopio ptico, inicialmente a 10 X, 20 X con el
objetivo de seleccionar las mejores metafases y luego pasar a objetivos de 40 X y
100X para el conteo de cromosomas, las clulas deben estar intactas, no
superpuestas ni con artefactos que puedan distorsionar el conteo exacto de
cromosomas.

Preparacin de Lacto-propinico orcena: Disolver 1 g de orcena en una mezcla de 23

ml de cido lctico y 23 ml de cido propinico a temperatura ambiente, completar a 100 ml
con agua destilada, agitar bien y filtrar (Haskell y Wills, 1968) NOTA: Para obtener buenos
resultados es necesario tener muy buenas races, finas, no muy gruesas; las plantas deben
estar en perfecto estado de desarrollo.

Pre - tratamiento

Propsito: Separacin de los cromosomas, acortarlos, y la clarificacin de los

centrmeros a fin de hacerlos visibles para chequear el nmero bsico.

5
 Otro pre-tratamiento que da buenos resultados es con agua helada, en lugar del uso
de Permetrina, se utiliza agua destilada helada por 48 horas a 4 C y colocando los
frascos (vials) que contienen las raicillas en un termo en el cual se ha colocado
cubitos de hielo con agua, el resto del procedimiento es igual.

Otras tcnicas utilizan:

8-Hidroxiquinolea, es insoluble en agua y ter. Soluble en alcohol, acetona,

cloroformo y benceno.

Preparacin: 0.002M, solucin en agua destilada. Pesar 0.29 g de 8-

Hidroxiquinolena y disolver en 25 ml del solvente escogido (generalmente alcohol) y
se agrega el agua destilada poco a poco, hacindola deslizar muy lentamente por
una bagueta o vara de vidrio, evitando la precipitacin de solucin, hasta completar
1 l. Usar un frasco oscuro y guardar a medio ambiente. Tratamiento por un mnimo
de 3 horas, lo ptimo sera 5 horas a 15 C.

Colchicina, 0.05-0.5% W/V en agua destilada por 4-6 horas a 10-15 C en

refrigeracin. Es una tcnica popular desafortunadamente bastante cara y con
posibilidad de ser este producto carcinognico. Para obtener races en mitosis se
puede usar bajas concentraciones de colchicina en semillas en estado de
germinacin.

Paradiclorobenceno, alpha-bromonaftaleno, son otros de los qumicos usados.

2.1.2 Conteo del nmero de cloroplastos en las clulas guarda

Aunque no es una tcnica para determinar la exacta ploida de un genotipo, cuancdo

manejamos una gran cantidad de material nos permite discriminar el grupo diploide de los
otros grupos. Por ejemplo cuando queremos seleccionar haploides (2n=2=24).

1. Toma de la muestra
Colectar hojas o los fololos terminales de una misma planta y colocarlos en una
placa Petri con papel toalla o filtro humedecido con agua.

2. Procedimiento
Obtener con la ayuda de una pinza fina el tejido epidrmico del envs de la hoja, de
la zona prxima a las nervaduras, e inmediatamente colocarlo sobre un porta-
objetos donde previamente se ha colocado una a dos gotas de solucin de KI - I y
luego volver a colocar muy suavemente encima de la muestra otras dos gotas de KI
- I y cubrir suavemente con un cubre-objeto.

3. Observacin
Examinar la preparacin bajo el microscopio ptico, a un aumento de 10 X, 20 X
40 X. El contaje de cloroplastos se realiza solo en una de las clulas guarda de los
estomas. El nmero promedio de cloroplastos nos dar una indicacin de nivel de
ploida, as para una ploida 2x en papa, el promedio es de 5 - 8 cloroplastos por
clula guarda, contajes mayores a 9 nos indica un nivel ms alto de ploida. Es
aconsejable por lo menos obtener el promedio en 10 clulas guarda. Figs. 4 y 5.

6
 Conteo del nmero de cloroplastos en las clulas guarda

Colecta de hojas,
foliolos

Obtencin del tejido epidrmico Muestra lista para su

del envs usando una pinza fina cbservacin

Fig. 4: Procedimiento para la obtencin de muestras para el contaje de cloroplastos en

clulas guarda de estomas.

Promedio del N
de cloroplastos Posible ncleo
por clula guarda ploida

7-8 2X Cloroplasto
9 - 11 3X
12 -14 4X
15 -16 5X Clula
guarda
Huamn, 1995

Contar los cloroplastos en 10 clulas guarda, de tamao similar y

solo una clula por estoma

Genotipo Diploide Posiblemente Genotipo

Tetraploide

Fig. 5: Criterios de evaluacin para el contaje del nmero de cloroplastos.

c
Determinacin de ploida por Citometra de flujo

Fig. 6: Citmetro de Flujo (Ploidy Analyser) PARTEC I.

Fig. 7: Materiales requeridos.

d
 Es recomendable utilizarlo en la seleccin de diploides y no para ploidas ms altas.
Huaman (1995) asocia niveles de ploida al nmero de cloroplastos por clula
guarda en determinaciones hechas en papas cultivadas.

Preparacin de KI-I

1. 1 g de KI

2. 1 g de I

3. Ambos reactivos disolver en 100 ml de Etanol al 70%, guardar en frasco oscuro.

2.1.3 Determinacin de ploida por Citometra de flujo

La tcnica de la citometra de flujo es, bsicamente un mtodo analtico que permite la

medida de emisin de fluorescencia y dispersin de luz de muestras marcadas (ncleos)
con sondas fluorescentes, que a medida que desfilan, de una en una y son arrastradas por
un flujo portador del analizador de ploida (Partec PA-II Ploidy Analyser), que fluye del punto
de inyeccin al detector y finalmente a la botella de desecho, frente a un sistema de
deteccin (lmpara de mercurio que emite luz ultravioleta de 488 nm de longitud de onda).
La corriente de ncleos en suspensin pasa por una cmara de cuarzo (conducto de 10 m
que no permite el paso simultneo de dos unidades), mientras es iluminada por la luz
ultravioleta; producindose dos fenmenos simultneos: Dispersin de luz y el fluorocromo
DAPI fijado al ADN emite una fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN en el ncleo,
emisin de luz fluorescente que es reconocida y captada por un fotorreceptor.

De esta forma, la citometra de flujo permite medir la cantidad de ADN existente en los
ncleos de las clulas, es un mtodo rpido y directo de establecer la ploida de una planta.
El citmetro de flujo debe ser previamente calibrado antes de iniciar el proceso de
evaluacin de ploida. Fig. 6.

Calibracin del aparato

El sistema se calibra previamente situando el pico correspondiente a un contenido de ADN

igual a 2C (diploide) sobre el valor 100 de la escala de abscisas, o en su defecto sobre el
valor 50. El patrn se determina segn el rea relativa en porcentaje de los picos
correspondientes a las distintas poblaciones celulares (2C, 4C, 5C, etc.).

El GAIN, se utiliza para mejorar la ampliacin y el alto voltaje del foto multiplicador, entre 0
y 1000 V, segn el aumento o reduccin del Gain la relacin eje de abscisas (eje x) y
ploida puede tener con valor = 50, 2C diploide, 75 igual a 3C (triploide) y 100 igual a 4C
(tetraploide), mientras si se aumenta dicho GAIN, este puede tener la siguiente relacin:
100= 2C (diploide), 150=3C (triploide) y 200= 4C (tetraploide).

Es importante tambin el uso de controles de conocida ploida en cada cultivo a evaluar.

Procedimiento

1. Materiales
Colectar fololos jvenes de la parte apical y colocarlos en placas Petri, y luego
tomar aprximadamente unos 40-50 mg. Fig. 7.

7
 2. Preparacin
La muestra a analizar se coloca en una placa Petri y se adiciona 0.5 ml del buffer de
extraccin (CyStain UV Ploidy) y se cortan los fololos con una hoja de afeitar,
seccionando muy finamente en pequeos cuadraditos. Una vez est disgregado el
tejido, se le adiciona nuevamente 1.5 ml del buffer de extraccin y se incuba por 5
minutos a temperatura ambiente. Este buffer de extraccin de ncleos, contiene el
fluorocromo DAPI (4, 6 diamino-2-phenilindole), que tie el ADN.

Una vez resuspendida la mezcla se pasa a travs de un filtro de nylon de 30 m

(Partec 50 m, Cell TricsTM), lo cual permite separar los ncleos, que caen a un tubo
receptor, el cual se coloca en el analizador. Figs. 8 y 9.

3. Observacin
Los resultados de la muestra son cuantificados por el sistema electrnico, que se
encarga de la cuantificacin de los destellos de la fluorescencia y de la luz
dispersada, bajo el control del ordenador, el cual almacena los datos de miles de
clulas por cada muestra, y representa los resultados grficamente.

El sistema informtico que lleva incorporado el citmetro convierte cada seal

fluorescente en un resultado que es presentado en un histograma en una escala
logartmica. El grfico resultante ordena los datos segn el contenido nuclear de
ADN en el eje de abscisas, y contabiliza el nmero de ncleos de cada tipo en el eje
de ordenadas. Figs. 9 y 10.

Todas las clulas que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN
medido, y este pico representa un nivel de ploida.

El ruido consiste en una pequea seal indeseada y aparece en los canales bajos.
Una razn para este ruido son los fragmentos resultantes de las clulas al momento
de su preparacin.

La cuantificacin del ADN nos permite conocer tambin la existencia de

aneuploidas, donde los histogramas se desplazan levemente hacia uno u otro lado
de la ploida esperada.

Interpretacin del histograma

El histograma resultante muestra el nmero de clulas por ml, que han sido contabilizadas
(eje y), mientras que en el eje horizontal (eje x) indica el contenido nuclear de ADN, as
todas las clulas que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN y un pico
representa un nivel de ploida. Fig. 11.

8
 Colectar aprox. 50mg Cortar solo los foliolos Colocarlos en 0.5 ml el
hojas jvenes apicales buffer de extraccin
(Cystain UV ploidy)

Adicionar 1.5ml de CyStain

UV ploidy e incubar por 5 Picar muy suavemente y
minutos de arriba hacia abajo

Fig. 8: Procedimiento utilizado en la preparacin de muestras para su anlisis en el

Analizador de ploida (Citmetro de Flujo).

Filtrar la muestra en Colocar la muestra en el

filtros de 30m Clitmetro de Flujo
(Partec Cell Trics 30)

Citmetro de Flujo
Ploidy Analyzer (PA) Partec I

Fig. 9: Filtracin de la muestra y su colocacin en el Citmetro de flujo para su lectura.

e
 K.Soto
Se establece los parmetros para Histograma de la muestra
la lectura de la muestra

Fig. 10: Medicin, procesamiento de los datos y representacin de los resultados.

2x 4x

< 4X

Fig. 11: Histogramas con los resultados para plodas 2, 4 y <4, encontradas en GON,
ADG y en un hbrido somtico respectivamente.

f
Captulo 3. Meiosis

Este trmino se deriva del griego meioum (reducir). Cada organismo tiene un nmero de
cromosomas caracterstico de su especie.

Este proceso ocurre antes de la formacin de las clulas reproductivas o esporas, en el

cual el nmero diploide normal se reduce a un juego nico o haploide (n) en cada gameto,
el nmero haploide se designa como n y el nmero diploide como 2n. La meiosis es
tambin precedida por una fase S, durante la cual ocurre la sntesis de ADN (algo de
sntesis de ADN ocurre durante la primera profase de la meiosis). Antes de iniciarse la
meiosis el material gentico en el ncleo diploide ha sido replicado slo una vez, cada
cromosoma consiste de dos cromtidas hermanas idnticas.

Consiste en dos divisiones nucleares sucesivas, ellas son distinguidas como meiosis I y
meiosis II.

La comprensin del proceso de la meiosis es fundamental para interpretar el proceso y

funcin de la recombinacin gentica en la evolucin cromosmica.

Todo este proceso es dinmico, abarca atraccin, apareamiento, intercambio y ulterior

separacin de los cromosomas homlogos paternos y maternos.

Durante este proceso cada gameto lleva slo un miembro de cada par de homlogos.

En toda clula diploide, cada cromosoma proviene del gameto de uno de los progenitores y
su pareja, del gameto del otro progenitor, estos pares de cromosomas se conocen como
pares homlogos, los que se asemejan en tamao, forma y en el tipo de informacin
hereditaria que contienen.

Adems de mantener un nmero constante de cromosomas de generacin en generacin,

es una fuente de nuevas combinaciones de material gentico dentro de los mismos
cromosomas.

Cada divisin meitica es formalmente dividida en profase, metafase, anafase y telofase.

De esos el ms complejo y largo es la profase I la cual est subdividida en: leptoteno,
zygoteno, paquiteno y diacinesis.

3.1 Meiosis I

3.1.1 Profase I

La cromatina se condensa y los cromosomas se hacen visibles con el microscopio ptico.

Durante este proceso cada gameto lleva slo un miembro de cada par de homlogos.

Leptoteno: Los cromosomas aparecen como largos filamentos, y repartidos a lo

largo se pueden observar los crommeros como las cuentas de un rosario. No se
pueden individualizar los cromosomas y la membrana nuclear est presente.
Zygoteno: Comienza el apareamiento de los cromosomas homlogos, a este
proceso se le llama sinapsis, aqu se hace evidente la pareja de cromosomas
homlogos, atrados uno con otro. El apareamiento es muy preciso, punto por punto

9
 a manera de un cierre de cremallera. Cada homlogo consta de dos cromtidas
hermanas y el par de homlogos consta de cuatro cromtidas (ttrada) y a los pares
asociados se les llama bivalentes. Es el complejo sinaptonmico de naturaleza
proteica el que mantiene los cromosomas homlogos estrechamente unidos
formando un bivalente, se cree que su existencia es necesaria para que se produzca
el entrecruzamiento, la formacin de quiasmas (del griego, Chiasma: punto de
cruzamiento) y el evento de recombinacin.
Paquiteno: Este estado evidencia la unin longitudinal de los homlogos y
desdoblados cada uno en dos cromtidas. Las cromtidas de cada homlogo se
llaman cromtidas hermanas. Dos cromtidas homlogas se rompen al mismo nivel
y de inmediato se intercambian en este punto ambos segmentos, las otras dos
quedan intactas. Esto es lo que se conoce como entrecruzamiento, la evidencia
citolgica visible son las llamados quiasmas. Una serie de intercambios de material
gentico ocurre entre cromtidas no hermanas u homologas.
Diploteno: Los cromosomas homlogos comienzan a repelerse entre s, excepto en
los puntos de intercambio o quiasmas. El nuclolo y la membrana nuclear
desaparecen y el crossing-over se hace visible. La consecuencia es la formacin
de nuevas combinaciones de genes, con alteracin de la informacin gentica
localizada en los cromosomas afectados.
Diacinesis: Las bivalentes se hallan ms condensadas. Paulatinamente el proceso
de terminacin continua a medida que el nmero de quiasmas disminuye y empieza
a aparecer el huso acromtico, los bivalentes quedan unidos por sus centrmeros al
huso, y la membrana nuclear desaparece y comienza a formarse el spindle.

3.1.2 Metafase I

Los bivalentes se sitan a cada lado del plano ecuatorial. El huso (spindle) se ha formado
completamente y cada homlogo tiene su centrmero. Por ello el cromosoma completo se
dirige a uno de los polos. Los cromosomas aparecen ms condensados.

3.1.3 Anafase I

Los cromosomas homlogos se han separado y migran hacia los polos respectivos u
opuestos de la clula por accin de los microtbulos del huso acromtico, sin embargo
debido a los entrecruzamientos ocurridos, las cromtidas no son idnticas como lo fueron al
comienzo de la meiosis. Nuevas combinaciones han surgido en cromtidas no hermanas,
en tanto que las otras dos quedan intactas. Los centrmeros no se dividen, las cromtidas
hermanas continan unidas, pero los homlogos se separan. Como resultado para
cualquiera de los pares homlogos, un polo recibe un cromosoma de origen paterno y el
polo contrario un cromosoma de origen materno. Y no todos los cromosomas paternos se
dirigen hacia el mismo polo. De hecho cualquier combinacin de cromosomas maternos y
paternos puede desplazarse hacia un polo determinado.

3.1.4 Telofase I

Los cromosomas propenden a alargarse, algunas veces el nuclolo y la membrana nuclear

reaparece. Las clulas formadas contienen la mitad del nmero de cromosomas presentes
en la clula madre. Set haploide de cromosomas. Los cromosomas se encuentran
reagrupados en cada polo.

10
Ha concluido la fase reduccional en la cual el par de cromosomas homlogos son
separados en dos clulas hijas.

3.2 Meiosis II

Se parece a la mitosis, excepto en que no est precedida por la duplicacin del material
cromosmico

3.2.1 Profase II

Cada clula es haploide, la membrana nuclear empieza a desintegrarse y el nuclolo

desaparece al final de la profase II, sta es corta y le sigue una reorganizacin del huso
acromtico.

3.2.2 Metafase II

En esta etapa los cromosomas que han quedado en los polos se colocan en el plano
ecuatorial y se adhieren a las fibras del huso.

3.2.3 Anafase II

En esta fase los centrmeros se dividen y las cromtidas hermanas, que ahora son
cromosomas, se separan y se van hacia los polos opuestos.

3.2.4 Telofase II

En esta fase se forma una ttrada de microsporas, se han formado nuevas paredes
celulares, cada ncleo lleva un nmero haploide de cromosomas, cada cromosoma est
representado una vez, Y cada ncleo de un segmento puede recibir cualquier combinacin
factible de cromtidas de origen materno y paterno.

La divisin meitica tiene tres importantes eventos

1. Transformacin de los cromosomas por la ocurrencia del entrecruzamiento

(crossing-over) en combinaciones completamente nuevas.
2. Re-arreglo del genoma por una distribucin al azar de los cromosomas homlogos.
3. Reduccin del nmero de cromosomas de diploide (2n) a haploide (n).

De estos eventos, el ms decisivo es la recombinacin, siendo probablemente la ms

importante contribucin a la evolucin y a la diversidad gentica.

11
3.3 Observacin de meiosis en clulas sexuales de papa
El proceso de microsporognesis generalmente termina entre los 7 y 14 das anteriores a la
floracin, muestras apropiadas de botones florales dependen de varios factores: como el
medio ambiente, la hora y los factores genticos. Figs. 12, 13, 14 y 15.

Procedimiento

1. Fijacin
Usar Carnoy modificado fresco (3:1 alcohol absoluto: solucin saturada de acetato
frrico en cido propinico), el cual es dispensado en frascos con tapa rosca,
sumergir la muestra de botones de diferentes estados de desarrollo, previamente
haciendo un corte con un bistur en la punta de los botones para permitir que el
fijador penetre. Aqu deben permanecer de 24 a 48 horas a temperatura ambiental.

Para largos periodos de almacenamiento en refrigeracin, se recomienda guardar

las muestras en etanol al 70 % a 4 C.

2. Preparacin
Tomar varios tamaos de botones en una placa Petri o en un vidrio de reloj con 70
% de etanol y chequear cada botn si est en estado ptimo para la observacin de
meiosis.

Diseccionar la antera, sobre una lmina porta objeto, cortando los extremos aplastar
presionndola con una aguja de diseccin para luego remover los restos de la
antera y colocando rpidamente una gota de carmn propinico o de lacto propinico
orcena, cubrir con un cubre objeto.

Las agujas, pinzas de diseccin deben limpiarse frecuentemente para evitar su

corrosin.

3. Observacin
Examinar la preparacin bajo el microscopio ptico, a un aumento de 40 X o 100 X,
si estuviera en un estado ptimo, calentar levemente la muestra pasando por la
llama de un mechero y retirar el exceso de tinte colocando la lmina entre 2 papeles
de filtro. Se puede golpear suavemente el cubre objeto para expandir los
cromosomas.

Preparacin de la solucin saturada de acetato frrico: Se aaden 10 g de acetato

frrico a 100 ml de cido propinico puro, mezclar bien, dejar sedimentar y decantar
cuidadosamente la solucin, evitando que parte del precipitado pase a la solucin a usarse.

Preparacin de carmn propinico: Preparar una solucin al 45% de cido propinico,

calentar hasta que hierva, luego aadir 1 g de carmn, dejar hervir y filtrar.
A esta solucin agregar 5 gotas de solucin saturada de acetato frrico en
45% de cido propinico.

12
 Observacin de meiosis en clulas sexuales

Botones florales recolectados Anteras en alcohol de 70%

en Fijador Carnoy Modificado colocadas en placa Petri listas
para su diseccin

Antera diseccionada

Fig. 12: Fijacin y preparacin de muestras de botones florales.

Microsporognesis
Clulas madre del
polen

Clulas madre del

polen
Clulas
nutritivas

Arquesporio

Clulas del Tapetum

Polen
Meiosis

Fig. 13: Microsporognesis -Tejido esporgeno - Formacin del polen.

g
 Profase I

Paquiteno Diacinesis

AI

MI

Metafase I Anafase I

Fig. 14: Meiosis I, mostrando Paquiteno - Diacinesis (Profase I), Metafase I y Anafase I.

Telofase I

M II Metafase II, ejes de

AII
los spindles (flecha)
son paralelos

Anafase II, ps y
telofase temprana II
(flecha)

TI
Telofase I,
Anafase II

Anafase II, husos

normales y
AII paralelos

Fig. 15: Meiosis I, Telofase I y Meiosis II, Metafase II, Anafase II, Telofase II, husos
normales y paralelos.

h
3.4. Gametos 2n

Gametos con el nmero somtico de cromosomas (gametos 2n) son el resultado de

mecanismos que afectan formacin normal de los gametos, durante la fase premeiotica,
meitica y post meitica. La incidencia de gametos 2n es frecuente en el reino vegetal, y su
ocurrencia ha sido reportada en muchas especies de familias, incluyendo Crucferae,
Leguminosae, Rosaceae, Solanaceae y Vitaceae (Veilleaux, 1985).

Los gametos no reducidos son de gran utilidad, ya que facilitan la poliploidizacin sexual y a
la vez proporcionan un mtodo muy efectivo para transmitir la heterocigosidad y la epistasis
del nivel 2X al 4X.

Pueden ser detectados: Por la ocurrencia de progenie tetraploide en cruzamientos 2x 4x,

4x 2x; distribucin bimodal del dimetro del polen: grande (2n) & normal (n). La presencia
de ttradas, diadas y/o triadas en el estado de formacin de microsporas. Fig. 16.

La poliploida es una caracterstica distintiva del reino vegetal y ha tenido un papel muy
importante en la evolucin de las plantas superiores especialmente la Angiospermas,
incluyendo las especies cultivadas de mayor importancia mundial tales como el trigo, papa,
avena, caa de azcar y algodn que son poliploides. Camadro (1986).

Los poliploides pueden originarse por duplicacin espontnea del complemento

cromosmico somtico (poliploidizacin asexual) o por el funcionamiento de gametos 2n
(poliploidizacin sexual).

Formacin de
n ttradas y
diadas
Formacin de
2n
polen normal y
polen 2n

Formacin de triadas
(orientacin tripolar)
y ttradas

Fig.16: Formacin de dadas por husos paralelos-polen 2n y formacin de triadas en

Telofase II, los husos adoptan una configuracin tripolar.

13
Captulo 4. Observacin de polen y determinacin de su
fertilidad

El trmino viabilidad o frtil se refiere a la capacidad de los granos de polen de germinar en

el estigma, este conocimiento es uno de los ms importantes aspectos para una eficiente
reproduccin sexual. Granos de polen funcional (viables o frtiles) se observan claramente
redondos con el citoplasma teido uniformemente de rojo, con morfologa normal, son
considerados potencialmente funcionales, mientras los granos abortivos, no viables o
estriles, no se tien, o son poco coloreados, con el citoplasma granular y permanecen
encogidos, con citoplasma retrado (eclipse de esterilidad), deformes. Figs. 17, 18, 19, 20 y
21.

1. Colectar las flores prximas a la dehiscencia.

2. Colocar una o dos gotas de colorante gelatina aceto-carmn glicerol, en el centro de
un porta-objeto, y sobre ella colocar una pequea cantidad de polen que puede ser
obtenido de una o ms anteras con la ayuda de un vibrador o dando golpecitos a las
anteras con una aguja de diseccin para hacer caer directamente el polen sobre la
lmina porta-objeto. Si el polen ha sido colectado en cpsulas de gelatina, una
cantidad suficiente es colocada de la misma manera con la punta de una aguja o
con mondadientes.
3. Mover ligeramente con una aguja de diseccin o con el mismo mondadientes para
asegurar una distribucin uniforme y luego cubrir con un cubre-objeto, dejar por lo
menos 24 horas para que los granos de polen se tian. Colocar las muestran en una
mesa o tablero, evitando colocarlas verticalmente hasta despus de unos das en
que hayan sellado y luego colocar en cajas porta-objetos para guardarlas en
refrigeracin a 4 C.

Otro test de viabilidad es el X-Gal test, donde el polen es incubado por 30 minutos en la
oscuridad a 37 C en un medio (Singh et al., 1985) de 1 mg X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-
indoyle--galactoside) disuelto en 50 l de N, N dimethyl formamide y 1 ml del buffer
acetato (50 mmol, pH 4.8). Este test es recomendado por Trognitz, 1991 por su alta
reproducibilidad. El grano de polen es considerado viable si se torna azul y si se muestra
con un citoplasma teido uniformemente. Figs. 22 y 23.

Preparacin de gelatina aceto-carmn glicerol

Preparar una solucin de 45% de cido actico con agua destilada y calentar hasta llegar a
ebullicin, luego agregar 2 g de carmn hasta que el carmn est completamente disuelto y
quede aproximadamente 60 ml. Dejar enfriar y filtrar, finalmente agregar igual volumen de
glicerina. Todo el proceso se realiza bajo campana extractora y constante agitacin. (Marks,
1954).

4.1 Cultivo de polen in vitro

La observacin del desarrollo del tubo polnico al cultivar el polen en un medio adecuado,
nos permite distinguir el polen no viable de las incompatibilidades que pueden ocurrir a nivel
del estilo. Varios investigadores han reportado el uso de medios de cultivo para la
germinacin y crecimiento del tubo polnico. Mortenson y col (1964) reportaron que una
solucin de 20 % de sucrosa + 50 ppm de cido brico fue el medio ms adecuado para la

14
Observacin de polen y determinacin de su fertilidad

Polen colectado en
cpsula de gelatina
Coleccin de polen

La muestra es colocada en 2 - 3 Materiales

gotas de colorante

Fig. 17: Procedimiento para la toma de muestra, coloracin del polen.

Fig. 18: Muestras fijadas de polen para su observacin.

i
 COLORANTE: Gelatina Aceto-carmn Glicerol

COLORACIN + polen bien formado= VIABILIDAD

Polen normal (n) + polen

estril no coloreado Polen estril (n) coloreado y no coloreado

Polen doble,
coloreado y no
coloreado

Fig. 19: Diferentes calidades de polen, normal (n), estril, polen 2n, polen doble.

Eclipse de
esterilidad

Polen
anmalo

Ttradas estriles

Fig. 20: Polen anmalo: Con eclipse de esterilidad, malformado y ttradas estriles.

j
 Polen n y 2n coloreados

Polen n y 2n estriles

Fig. 21: Polen (n), polen 2n coloreados (viables) y estriles.

A B

C D

Fig. 22: A. Polen normal (n), B. Polen n y 2n, C. Polen normal y estril, D. Polen estril.
Coloracin X-Gal.

k
 A B

C D

Fig. 23: A. Polen con 3 poros germinativos, B. Polen doble, C. Polen con 2 poros
germinativos, D. Polen estril. Coloracin X-Gal.

l
 Cultivo de polen in vitro

Materiales y medio de sucrosa al

20% + cido brico 200 ppm +
Tween 20 (0.2%)

Siembra del polen en el Polen ya sembrado bajo

medio de cultivo cmara hmeda

Fig. 24: Procedimiento para el cultivo de polen in vitro en medio de sucrosa, cido brico y
Tween 20 bajo condiciones de cmara hmeda.

A B

C D

Fig. 25: A y B. Polen germinado y con buen crecimiento en el medio de cultivo. C. Polen
con mediana germinacin D. Polen con escasa germinacin.

m
 A B

C D

Fig. 26: A. Polen no germinado, B. Slo uno de los granos del polen doble germinando,
C. Escaso polen germinado, D. Polen soltando su contenido.

n
germinacin in vitro de polen de Solanum, mientras que Bamberg y Hanneman (1991)
encuentran que el medio de 20% de lactosa + 50 ppm de cido brico fue superior al medio
con sucrosa, as Trognitz (1991) encuentra una respuesta altamente variable para este
mismo medio. Gonzles y col (2002) usando un medio compuesto por sacarosa 12%,
Nitrato de Calcio (CaNO3) 300 ppm, Sulfato de Magnesio (MgSO4) 200 ppm, Nitrato de
Potasio (KNO3) 100ppm, Acido Brico (H3BO4) 100 ppm en solucin acuosa pH=6, refieren
que les report resultados confiables.

4.1.1 Preparacin del medio

1. Reactivos
Sucrosa (sacarosa), concentracin en la solucin al 20%
Acido Brico (H3BO4) 100 ppm (Solucin madre 200 mg en 100 ml)
Tween 20, 0.2 %

2. Preparacin del Medio de cultivo

Se prepara con 5 ml de la solucin madre de cido brico a 200 ppm y se agrega 20
g de sucrosa y Tween 20, 0.2% en un cilindro graduado (Vaso de 100 cc) y se
completa el volumen a 100 cc, agitar bien.

3. Procedimiento para la Germinacin

Colocar 4 gotas (aproximadamente 15 l de medio/gota), en una placa Petri con la
ayuda de una aguja, o con palillo de dientes colocar pequesimas cantidades de
polen sobre cada gota, la tapa de la placa Petri a la cual se ha colocado un papel
filtro humedecido va a contribuir a formar una pequea cmara hmeda. Las placas
Petri se colocan a 20-24 C. Despus de 24 horas se coloca una gota de lugol, o de
colorantes como orcena actica, carmin propinico, lacto propinico orceina y se
cubre con un cubre-objeto de 22 x 40 mm y se procede a la observacin bajo el
microscpio ptico. Se cuenta como granos germinados aquellos que por lo menos
el tubo del polen ha crecido de igual tamao o mayor al dimetro del grano de polen.
Para registrar los datos se cuentan en unos 10 sitios el nmero de granos de polen
que muestran el tubo de germinacin. Figs. 24, 25 y 26.

Polinizacin y fertilizacin

Cuando las anteras se tornan dehiscentes, los granos de polen son transferidos al
estigma(s) por los insectos o la mano del hombre. Una vez en contacto con el estigma, los
granos de polen germinan formando el tubo polnico. En cada una de las microsporas
haploides formadas durante la meiosis, el ncleo se divide por mitosis y desarrolla un grano
de polen bicelular (gametofito masculino inmaduro). Una de las clulas se divide
posteriormente otra vez habitualmente despus del desarrollo del tubo polnico, dando
como resultado tres clulas haploides por grano de polen: dos gametos masculinos
masculinos (ncleo germinativo y ncleo espermtico).y la clula generadora del tubo
polnico. El tubo contina creciendo y entra al vulo a travs del micrpilo. Los dos gametos
son entonces liberados dentro de la sinrgida. El saco embrionario contiene 8 ncleos y
cada uno con una dotacin haploide de cromosomas. Los dos ncleos cerca al centro del
saco embrionario son referidos como ncleos polares; la clula huevo u oosfera est
situada cerca al micrpilo.

Finalmente un ncleo espermtico entra en la clula huevo y el otro se une a los dos
ncleos polares, este acontecimiento es llamado doble fertilizacin, entonces se forma un
cigoto diploide, que luego desarrolla en embrin y la unin del otro ncleo espermtico con

15
dos ncleos polares, llamado fusin triple resulta en la formacin del tejido nutritivo llamado
endospermo (3n). Se conoce a este proceso como doble fertilizacin, este es un proceso
complejo, el embrin pasa por sus primeras etapas de desarrollo mientras se encuentra
dentro del ovario de la flor, los integumentos se desarrollan en la cubierta de la semilla y el
ovario mismo madura y se transforma en fruto.

Las polinizaciones o fertilizaciones, deben realizarse usualmente en la maana antes de las

10 a m, si los das son calurosos es posible hacerlos al final de la tarde. El probable xito
del cruzamiento es apreciado por un pedicelo sostenido y ligeramente curvado, unos 2-4
das despus de la polinizacin con un posterior desarrollo de frutos (bayas), los cuales
sern cosechados cerca de 30-45 das dependiendo de las especies. Normalmente los
frutos son protegidos durante su desarrollo con una malla de fina gasa. Despus de la
cosecha, (25-40 das), se colocarn en bolsas de papel hasta su maduracin a temperatura
ambiente, esperando hasta que se tornen suaves lo cual permite que el proceso de
extraccin sea ms fcil, la extraccin que se hace en un recipiente con agua donde son
separadas las semillas de las otras partes del fruto. Las semillas viables tienden a irse
hacia el fondo, mientras las semillas llamadas vanas flotan. Las semillas obtenidas as
debern ser secadas, colocadas en papel de platina especial y selladas para guardar en
cmara de refrigeracin a 4 C. Fig. 27.

Polinizacin y fertilizacin

Colecta de polen Emasculacin de las anteras

Identificacin del
Polinizacin cruzamiento Guardar el polen en
cpsulas de gelatina

Fig. 27: Procedimiento para efectuar las polinizaciones en un bloque de cruzamientos.

16
4.2 Crecimiento del tubo polnico in vivo (en el pistilo)

Un mtodo til para monitorear la fertilidad del polen es teirlo y visualizarlo para observar
como crecen a lo largo del pistilo. Durante la polinizacin, el grano de polen hace contacto
con las clulas receptivas del pistilo lo que favorece el crecimiento del polen de algunos
genotipos, mientras que se opone o rechaza otros. Esta interaccin polenpistilo establece
lmites de endogamia o de exogamia.

El anlisis del crecimiento del tubo polnico nos permite hallar las diferencias existentes en
cruzamientos compatibles, parcialmente o completamente incompatibles.

Dos tipos de incompatibilidad pueden ser distinguidos en Solanum, auto-incompatibilidad o

incompatibilidad interespecfica.

Para monitorear el crecimiento del tubo polnico in situ:

1. Fijacin
Sumergir los carpelos (pistilos) en la solucin de Schreiter (Schreiter and Tiemann,
1977), los que sern colectados 48 horas despus de realizada la polinizacin, 2-6
pistilos por muestra, los que sern retirados intactos de las flores, cortados desde la
base con un escapelo. Se debe guardar las muestran en refrigeracin a 4 C hasta
una semana antes de la preparacin. La solucin es re-usable cerca de 10 ciclos. Si
se torna turbia o grumosa debe nuevamente filtrarse. La solucin debe manejarse
con mucho cuidado y con guantes ya que el azul de anilina es cancergeno.

2. Preparacin
Hervir las muestras fijadas en un bao de mara, hasta que el tejido se aclare y
suavice suficientemente, pero no ms que 30 minutos. El tiempo de preparacin
depender de la consistencia del tejido, variando entre genotipos. El tejido en esta
etapa se torna extremadamente frgil, hay que tener mucho cuidado en su
manipulacin.

3. Montaje
Los pistilos sern extendidos y montados en lminas porta-objetos, en una gota de
solucin acuosa de 50% de glicerol/agua, cubiertos con un cubre-objeto y aplastados
suavemente. Los pistilos preparados de esta manera donde los tubos polnicos que
contienen callosa pueden ser coloreados por azul de anilina y detectados con luz UV
(Dionne y Spicer, 1958).

Preparacin de la solucin

Para una cantidad total de 1.2 litros de solucin:

100 ml (1 parte) (w/v) de la solucin acuosa de azul de anilina (2%), hervir y filtrar.
700 ml (7 partes) solucin acuosa de 0.2 N K3PO4 * 3 H20 (49.53 g completar a 700
ml con agua destilada)
200 ml (2 partes) 1.0 N Na OH (8.0 g completar a 200 ml con agua destilada)
200 ml (2 partes) (v/v) 10% solucin acuosa de Tween 20 (180 ml de agua destilada
+ 20 ml de Tween 20).

Al azul de anilina preparada, se agrega las dems soluciones y luego se procede a guardar
en frasco oscuro en refrigeracin a 4 C, la solucin toma un color amarillo claro.

17
La evaluacin del crecimiento del tubo del polnico se realizar en microscopio de
fluorescencia, en una magnificacin x 100 con una lmpara HBO 200 UV- como fuente de
luz, BG 12 filtro de excitacin y UG 1 filtro de barrera y un filtro de proteccin Y-455.

Se coloca el carpelo cocinado en una lmina porta-objeto con una gota del glicerol/ agua al
50%. La concentracin demasiado alta del glicerol afecta el material. Pero es posible
sustituir el agua en la solucin del montaje posteriormente agregando el glicerol puro. De
esta manera, las preparaciones son durables si se mantienen en la oscuridad. El tiempo de
la preparacin depende de la consistencia del tejido y vara entre los genotipos.

El crecimiento del tubo polnico ser evaluado usando una escala o matriz combinada de 18
niveles cualitativos (nivel al que llegan los tubos polnicos) y cuantitativa (cantidad de tubos
polnicos, Trognitz, 1991). Figs. 28 y 29.

18
 Crecimiento del tubo polnico in vivo (en el pistilo)

Cantidad (nmero total de tubos polnicos en

el estilo-ovario)

Niveles* > 30 10-30 <10

Valor combinado del nivel y cantidad
de polen
16 17 18
No germinado

Estigma 13 14 15

Estilo-estigma
10 11 12
Estilo

Estilo (final) 7 8 9

Placenta 4 5 6

1 2 3

Fig. 28: Matriz de valores combinados para evaluacin cualitativa (nivel de crecimiento al
cual llegan los tubos polnicos en el pistilo) y cuantitativa (nmero de tubos polnicos
llegando a los diferentes niveles a lo largo del pistilo).
* Niveles de longitud del tubo del polen llegan: 6 - Polen no germinado; 5 - estigma; 4 - estilo
- estigma; 3 - estilo; 2 - final del estilo; 1 - placenta. (Trognitz,1991).

Fig. 29: Diferentes vistas del crecimiento del tubo polnico en el pistilo y ovario despus de
ser coloreado con el colorante fluorescente azul de anilina que reacciona con la callosa.

o
Captulo 5. Cultivo in vitro de embriones inmaduros

La utilizacin de las tcnicas de rescate de embriones ha sido muy importante para la

obtencin de hbridos nter especficos e nter genricos.

La reproduccin de plantas se realiza mediante hibridacin y seleccin. El cruzamiento de

plantas permite al mejorador recombinar caractersticas deseables en nuevos genotipos y a
travs de la seleccin obtener mejores productos. Este proceso depende totalmente de la
produccin de descendencia; en otras palabras, de la formacin de semillas viables.

El cultivo in vitro de embriones permite que embriones que se pierden o no progresan

normalmente debido a su condicin de inmaduros, lleguen a progresar y desarrollar una
plantula si son colocados en un medio adecuado superando con xito la falta de viabilidad
de las semillas procedentes de cruzamientos especialmente difciles, adems de reducir el
tiempo que dura el mejoramiento en muchas plantas (Brown & Torpe, 1995; Rodrigues-
Otubo et al, 2000).

El xito del cultivo in vitro de embriones inmaduros est influenciado por la composicin
qumica del medio de crecimiento, el cual debe ser capaz de inducir el desarrollo exitoso de
embriones hbridos, tambin debe establecerse de acuerdo a los principales requerimientos
nutricionales de la especie (Pellegrineschi et al., 1997).

Procedimiento

Despus de realizados los cruzamientos las bayas se colectan dentro del lapso de 19-27
D.D.P, se efecta una desinfeccin previa usando una solucin que contiene los acaricidas
Azociclotin (Peropal 50 SC): Imidacloprid (Confidor 35 SC) al 1 , adicionndole 6 gotas de
Tween 20, colocando las bayas en esta solucin por aproximadamente 10 minutos, seguido
de una desinfeccin con alcohol 70% por 30 segundos, y finalmente se lavan 2 veces con
agua destilada, proceso que se realiza en un rea destinada para este propsito; por ltimo
se esteriliza superficialmente con una solucin de Hipoclorito de Calcio al 2.5% por 10
minutos y finalmente se enjuaga con agua destilada estril, proceso que se realiza en la
cmara de flujo laminar. En este punto las bayas estn listas para ser cortadas.

Siembra de embriones inmaduros

Medio modificado de Singsit y Hanneman (1991).

Todo ste proceso se realiza dentro de la cmara de flujo laminar en las mayores
condiciones de asepsia. Se cortan las bayas para obtener las semillas inmaduras, stas se
abren a lo largo de su eje longitudinal, usando un escalpelo y una hoja para escalpelo No
11, todo este proceso se realiza con la ayuda de un estereoscpico. Los embriones son
separados cuidadosamente de la cubierta de la semilla y sembrados directamente en las
placas Petri de 60 x 15 mm. conteniendo el medio de cultivo, que consiste de 4.6 g/L del
medio basal Murashige y Skoog (Sigma), fortificado con 4 % de sucrosa, 100 mg/L de mio-
inositol, 0.001 mg/L de adenina, 2.0 mg/L de glicina, 1 g/L de casena hidrolizada, 0.1mg/L
tiamina-HCl, 1mg/L de cido nicotnico, 0.5 mg/L de piridoxina-HCl, 100 mg/L de cido
mlico; 0.7 % de agar, adicionado con 1g/L de carbn activado. El pH del medio se ajusta a
pH 5.6 antes de autoclavarlo a 120 C por 20 minutos y se agrega 0.1 mg/L IAA (cido 3-
indol-actico) y se agrega 0.001 mg/L de kinetina al medio de cultivo por filtracin antes de

19
dispensarlo a las placas Petri. Finalmente las placas Petri se colocaran en la cmara de
crecimiento en un rango de temperatura de 18 a 22 C, 16 horas de fotoperodo y 3000 lux
de intensidad lumnica hasta su germinacin.

Una vez ha desarrollada la plantita se procede al transplante a tubos con el medio de

propagacin MSA que consiste de 4.6 g/L del medio basal Murashige y Skoog (Sigma),
fortificado con 25 g/L de sucrosa, 2.9 g/L de Phytagel y 5 mL del Stock de Vitaminas (0.025
g de GA3 (cido giberlico), 0.5 g de glicina y 0.125 g de cido nicotnico) y a pH 5.6. Fig.
30.

Cultivo in vitro de embriones inmaduros

Torpedo
Apertura de bayas
Bayas listas para ser
Polinizacin cosechadas in vitro

(19-27 DDP)

Globular Corazn

Rescate de pro
embriones en
Descarte de diferentes estados
embriones con
marcador

Pro-embriones
creciendo en medio
de
Plantas de in vitro
creciendo en invernadero cultivo in vitro

Hbrido
rescatado
Propagacin
in vitro

Fig. 30: Procedimiento para el cultivo in vitro de embriones inmaduros.

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