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18
Tcnicas en biologa celular y molecular
18.1 El microscopio ptico A causa del tamao tan pequeo del tema de estudio, la
18.2 Microscopia electrnica de transmisin biologa celular y molecular depende ms del desarrollo de
18.3 Microscopia electrnica de barrido y nuevos instrumentos y tecnologas que cualquier otra rama de
microscopia de fuerza atmica la biologa. Por consiguiente, es difcil aprender acerca de la
biologa celular y molecular sin aprender tambin respecto a
18.4 Uso de radioistopos la tecnologa que se requiere para reunir datos. En este cap-
18.5 Cultivo celular
18.6 Fraccionamiento del contenido de una clula
mediante centrifugacin diferencial Empleo de doble marcaje de fluorescencia para la vigilancia de fenmenos
dinmicos dentro de los organelos celulares de clulas vivas. Las cisternas
18.7 Aislamiento, purificacin y fraccionamiento de de Golgi de una clula de levadura en gemacin no se organizan en pilas
protenas bien definidas como en la mayor parte de las clulas eucariotas, sino que
18.8 Identificacin de la estructura de protenas y estn dispersas en el citoplasma. Cada una de las estructuras ovaladas
complejos multisubunitarios intensamente coloreadas es una cisterna individual, en la que el color se
debe a la localizacin de molculas de protena con tincin fluorescente. Las
18.9 Fraccionamiento de cidos nucleicos cisternas de color verde contienen una protena marcada con GFP (Vrg4)
18.10 Hibridacin de cido nucleico que interviene en las actividades iniciales del aparato de Golgi, mientras
18.11 Sntesis qumica de DNA que las cisternas de color rojo contienen una protena marcada con DsRed
(Sec7) que participa en actividades tardas de dicho complejo. Esta serie de
18.12 Tecnologa de DNA recombinante micrografas revela la composicin protenica de cisternas individuales
18.13 Amplificacin enzimtica de DNA por PCR durante un lapso aproximado de 13 min (el tiempo transcurrido se indica
18.14 Secuenciacin de DNA en el ngulo inferior izquierdo). La punta de flecha y la flecha sealan dos
de estas cisternas todo el tiempo. Estas dos cisternas se automicrografiaron
18.15 Genotecas de DNA
en las filas inferiores de micrografas. En esta serie se aprecia que la
18.16 Transferencia de DNA a clulas eucariotas y composicin protenica de una cisterna individual cambia con el tiempo de
embriones de mamfero una con protenas de Golgi tempranas (verde) a otra con protenas de
18.17 Determinacin de la funcin de los genes Golgi tardas (rojo). Tales descubrimientos dan apoyo visual directo al
modelo de maduracin de las cisternas que se analiza en la pg. 293.
eucariotas por eliminacin o desactivacin
(Tomada de Eugene Losev, et al., cortesa de Benjamin S.
(silenciamiento) gnica Glick; Nature 441:1004, 2006, Fig. 3a. Reimpresa con autoriza-
18.18 Uso de anticuerpos cin de Macmillan Publishers Ltd.)
tulo se revisan los mtodos que se emplean ms a me-
nudo en este campo sin profundizar mucho en los detalles
y variaciones que se usan. Los objetivos de este captulo
son: describir las formas en que se utilizan las diversas
tcnicas y presentar ejemplos de los tipos de informacin
18.1 | El microscopio ptico
Los microscopios son instrumentos que producen una ima-
gen aumentada de un objeto. La figura 18.1 muestra los com-
ponentes principales de un microscopio ptico compuesto.
Una fuente de luz, que puede ser externa al microscopio o
estar incluida en su base, ilumina la muestra. La lente conden-
sadora subyacente rene los rayos difusos de la fuente de luz e
ilumina la muestra con un pequeo cono de luz brillante que
permite ver las partes muy pequeas de ste despus de la
magnificacin. Los rayos de luz enfocados en la muestra por
la lente condensadora se reciben en la lente del objetivo del
microscopio. A partir de este punto es necesario considerar
dos conjuntos de rayos lumnicos que entran a la lente del ob-
jetivo: los que ya alter la muestra y los que no modific (fig.
18.2). Este ltimo grupo se refiere a la luz proveniente del
condensador que pasa en forma directa a la lente del objetivo
y constituye la luz de fondo del campo visual. El primer grupo
de rayos de luz surge de las mltiples partes de la muestra y
forma la imagen del mismo. La lente del objetivo enfoca estos
rayos de luz para formar una imagen real y magnificada del
objeto dentro de la columna del microscopio (fig. 18.1). Un
segundo sistema de lentes, la lente del ocular, emplea la imagen
formada por la lente del objetivo como objeto para formar
una imagen virtual y aumentada. Un tercer sistema de lentes
localizado en la parte frontal del ojo utiliza la imagen virtual
producida por la lente del ocular como objetivo para producir
una imagen real en la retina. Cuando el tornillo de enfoque
Lente del ocular
Lente del objetivo
Muestra
Lente condensadora
Fuente de luz
Figura 18.1 Diagrama de un corte a travs de un microscopio
ptico compuesto, es decir, un microscopio que tiene lentes tanto
de objetivo como oculares.
que pueden obtenerse mediante tales tcnicas. Se co- 733
mienza con el instrumento que permiti a los bilogos des-
cubrir la existencia de clulas, con lo que se establece un
punto de partida para toda la informacin que se presenta
en este libro.
del microscopio de luz se gira, la distancia relativa entre la
muestra y la lente del objetivo cambia, lo que permite que
laimagen final se enfoque con exactitud en el plano de la re-
tina. La magnificacin total obtenida por el microscopio es el
producto de las magnificaciones logradas por la lente del ob-
jetivo y la lente del ocular.
Resolucin
Hasta este punto slo se consider la magnificacin de un
objeto sin prestar atencin a la calidad de la imagen producida,
Plano de enfoque
de la imagen
Plano de foco de
la fuente de luz
Lente del objetivo
2 Longitud focal de
la lente del objetivo
Plano de la muestra
Lmpara
( ) Rayos de luz que forman la imagen
18.1 El microscopio ptico
( ) Luz de fondo del campo
Figura 18.2 Trayectos que siguen los rayos de luz que forman la
imagen de la muestra y los que forman la luz de fondo del campo.
Los rayos de luz de la muestra se enfocan en la retina, mientras
quelos rayos del fondo estn fuera de foco, con lo que se produce
uncampo brillante difuso. Como se explica en el texto, el poder de
resolucin de una lente del objetivo es proporcional al seno del n-
gulo . Las lentes con mayor poder de resolucin tienen longitudes
focales ms cortas, lo que significa que la muestra se sita ms cerca
de la lente del objetivo cuando se enfoca.
734
(a) (b) (c)
Figura 18.3 Magnificacin contra resolucin. La transicin de
(a) a (b) proporciona al observador una mayor magnificacin y reso-
lucin, mientras que la transicin de (b) a (c) slo produce una ma-
yor magnificacin (magnificacin vaca). De hecho la calidad de la
imagen se deteriora conforme la magnificacin vaca aumenta.
o sea, el nivel al cual los detalles de la muestra se conservan en
la imagen. Supngase que se mira una estructura en el micros-
copio con una lente del objetivo relativamente potente (p. ej.,
63) y una lente ocular que amplifica la imagen del objetivo
cinco veces ms (un ocular 5). Asmase que el campo est
compuesto por cromosomas y es importante identificar el n-
mero que hay, pero algunos estn muy cerca unos de los otros
y no pueden distinguirse como estructuras separadas (fig.
18.3a). Una solucin podra ser cambiar los oculares para in-
crementar el tamao de los objetos que se observan. Si se
cambiara de un ocular 5 a uno 10, lo ms probable es que
la capacidad para contar el nmero de cromosomas aumentara
(fig. 18.3b) porque ahora la imagen de los cromosomas produ-
cida por la lente del objetivo se extiende sobre una parte ms
grande de la retina. Mientras ms fotorreceptores proporcio-
nen informacin respecto a la imagen, ms detalles pueden
verse (fig. 18.4). Sin embargo, si se cambia a un ocular 20, no
es probable que se perciban ms detalles aunque la imagen sea
ms grande (fig. 18.3c), es decir, que ocupe ms superficie re-
tiniana. El cambio de ocular no proporciona ms informacin
porque la imagen producida por el objetivo no tiene ms deta-
lles que aumentar con el mayor poder del ocular. El segundo
cambio en el ocular slo brinda magnificacin vaca (como en
la fig. 18.3c).
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
La calidad ptica de una lente del objetivo se mide por la
extensin en la que pueden discriminarse, o resolverse, los de-
talles finos de una muestra. La difraccin limita la resolucin
que se obtiene con un microscopio. A causa de la difraccin, la
luz que emana de un punto de la muestra nunca puede verse
Fotorreceptor estimulado
Fotorreceptor no estimulado
Figura 18.4 El poder de resolucin del ojo. Ilustracin de la rela-
cin entre la estimulacin de los fotorreceptores individuales (iz-
quierda) y la imagen que se percibira (derecha). El diagrama ilustra
el valor de que la imagen caiga en un rea lo bastante grande de la
retina.
como un punto en la imagen, sino slo como un pequeo
disco. Si los discos producidos por dos puntos cercanos se su-
perponen, los puntos no pueden distinguirse en la imagen. Por
lo tanto, el poder de resolucin de un microscopio puede defi-
nirse en trminos de la capacidad para ver dos puntos vecinos
en el campo visual como dos entidades distintas; dicho poder
de resolucin est limitado por la longitud de onda de la ilu-
minacin de acuerdo con la ecuacin
0.61 l
d
n sen a
donde d es la distancia mnima que debe separar dos puntos en
la muestra para resolverse, lambda () es la longitud de onda
de la luz (527 nm para la luz blanca) y n es el ndice refractivo
del medio presente entre la muestra y la lente del objetivo.
Alfa () es igual a la mitad del ngulo del cono de luz que
entra a la lente del objetivo, como se muestra en la figura 18.2.
Alfa es una medida de la capacidad de reunin de luz de la
lente y mantiene una relacin directa con su abertura.
El denominador de la ecuacin en la columna 1 se conoce
como abertura numrica (N. A., numerical aperture). Esta l-
tima es una constante para cada lente, una medida de sus cua-
lidadespara reunir luz. La N.A. mxima posible para un obje-
tivo que se disea para usarlo en el aire es 1.0 porque el seno
del mximo ngulo posible de , 90, es 1, y el ndice refractivo
delaire es 1.0. Para un objetivo diseado para sumergirse en
aceite, la N.A. mxima posible se acerca a 1.5. Como regla
general prctica, la mxima magnificacin til de un mi-
croscopio ptico vara entre 500 y 1 000 veces la abertura nu-
mrica del lente del objetivo que se use. Los intentos para
aumentar la imagen despus de este punto producen magnifi-
cacin vaca y la calidad de la imagen se deteriora. Una aber-
tura numrica alta se logra con lentes que tienen una distancia
focal corta, lo que permite colocar la lente muy cerca de la
muestra.
El lmite de resolucin del microscopio ptico se esta-
blece si se sustituye la longitud de onda mnima posible de
iluminacin y la mayor abertura numrica posible en la ecua-
cin previa. Cuando se realizan tales sustituciones, se obtiene
un valor un poco menor de 0.2 m (o 200 nm), que es sufi-
ciente para observar organelos celulares grandes, como los n-
cleos y las mitocondrias. En cambio, el lmite de resolucin del
ojo desnudo, que tiene una abertura numrica cercana a 0.004,
se aproxima a 0.1 mm.
Adems de estos factores tericos, el poder de resolucin
tambin depende de los defectos pticos, o aberraciones. Exis-
ten siete aberraciones pticas importantes y constituyen las
limitaciones que los fabricantes de lentes deben vencer para
producir lentes del objetivo cuyo poder de resolucin real se
aproxime a los lmites tericos. El objetivo est hecho con una
serie compleja de lentes, en lugar de una sola lente conver-
gente, a fin de eliminar estas aberraciones. Por lo general una
unidad de lente proporciona la magnificacin requerida, en
tanto que las dems compensan los errores de la primera para
brindar una imagen general corregida.
Visibilidad
En el lado ms prctico de la microscopia en relacin con los
lmites de la resolucin se encuentra el tema de la visibilidad,
que se refiere a los factores que en realidad permiten observar 735
un objeto. Esto podra parecer un asunto trivial; si el objeto
est ah, puede verse. Considrese el caso de una cuenta de
vidrio transparente. Bajo la mayor parte de las condiciones,
contra casi todos los fondos, la cuenta se ve con claridad. Sin
embargo, si una cuenta de vidrio se deja caer en un recipiente
con aceite de inmersin con el mismo ndice refractivo que el
vidrio, la cuenta desaparece de la vista porque ya no afecta la
luz de ninguna manera obvia que sea distinta al lquido de
fondo. Cualquiera que haya pasado tiempo buscando una
amiba puede apreciar el problema de la visibilidad con el mi-
croscopio ptico.
Lo que se ve a travs de una ventana o por un microsco-
pio son los objetos que afectan la luz de manera distinta al
fondo. Otro trmino para la visibilidad en este sentido de la
palabra es el contraste, o la diferencia en la apariencia entre
las partes adyacentes de un objeto o entre un objeto y su fondo.
La necesidad del contraste puede apreciarse si se consideran
las estrellas. En tanto que el cielo claro de la noche puede estar
lleno de estrellas, el mismo cielo durante el da parece carente
de cuerpos celestes. Las estrellas desaparecieron de la vista,
pero no del cielo. Ya no son visibles contra el fondo mucho Figura 18.5 La tincin de Feulgen. Este procedimiento de tincin
es especfico para el DNA, como lo indica la localizacin del pig-
ms brillante.
mento en los cromosomas en esta clula de la punta de la raz de ce-
En el mundo macroscpico, para examinar objetos se bolla que estaba en la metafase de la mitosis al momento que se fij.
hace caer la luz sobre ellos y luego se observa la luz que se re- (Por Ed Reschke.)
fleja a los ojos del observador. En cambio, cuando se utiliza un
microscopio la muestra se coloca entre la fuente de luz y los
ojos, y se ve la luz que se transmite a travs del objeto (o en
trminos ms apropiados, la que difracta el objeto). Si una Preparacin de muestras para microscopia
persona toma un objeto, entra a una habitacin con una fuente de luz de campo claro
de luz y sujeta el objeto entre la fuente de luz y los ojos, puede
apreciarse parte de la dificultad con tal iluminacin; es necesa- Las muestras a observar en el microscopio ptico se dividen
rio que el objeto que se examina sea casi transparente, o sea, en dos categoras amplias: monturas completas y cortes. Una
translcido. Aqu radica otro aspecto del problema: puede ser montura completa es un objeto intacto, ya sea vivo o muerto,
difcil observar objetos que son casi transparentes. y puede consistir en un microorganismo entero como un pro-
Una de las mejores formas para hacer que una mues- tozoario o en una pequea parte de un organismo ms grande.
tra delgada y traslcida sea visible al microscopio es teirla La mayor parte de los tejidos de plantas y animales son dema-
con algn colorante, que absorba slo ciertas longitudes de siado opacos para su anlisis microscpico, a menos que stos
onda del espectro visible. Las longitudes de onda que no se se examinen como una rebanada muy delgada, o corte. Para
absorben se transmiten al ojo, lo que hace que el objeto teido preparar un corte, primero se matan las clulas mediante in-
parezca coloreado. Los distintos colorantes se unen a diferen- mersin del tejido en alguna solucin qumica llamada fijador.
tes tipos de molculas biolgicas, por lo que estos procedi- Un buen fijador penetra rpido en la membrana celular e in-
mientos no slo incrementan la visibilidad de la muestra, moviliza todo su material macromolecular, de modo que laes-
tambin indican en qu puntos de la clula o tejido se encuen- tructura de la clula se mantiene lo ms similar posible a la de
tran los distintos tipos de sustancias. Un buen ejemplo es la la clula viva. Los fijadores ms usuales para la microscopia
tincin de Feulgen, que es especfica para el DNA; hace que ptica son soluciones de formaldehdo, alcohol o cido actico.
los cromosomas se vean coloreados al microscopio (fig. 18.5). Tras la fijacin, el tejido se deshidrata por transferencia a
Un problema de los colorantes es que por lo comn no se travs de una serie de alcoholes y luego se impregna con para-
pueden usar en clulas vivas pues por lo regular son txicos, o fina (cera), lo que brinda soporte mecnico durante el proceso
lo es el entorno de tincin, o los colorantes no penetran la de corte. La parafina se utiliza como medio de impregnacin
membrana plasmtica. Por ejemplo, la tincin de Feulgen re- porque se disuelve de manera fcil con solventes orgnicos.
quiere la hidrlisis del tejido en cido antes de aplicar el pig- Las laminillas que contienen cortes adherentes de parafina se
18.1 El microscopio ptico

mento. sumergen en tolueno, que disuelve la cera y deja una rebanada

Los diferentes tipos de microscopios pticos usan distin-
tos tipos de iluminacin. En un microscopio de campo bri-
llante (claro) el cono de luz que ilumina la muestra se observa
como fondo brillante contra el que la imagen de la muestra
debe contrastarse. La microscopia de campo brillante es ideal
para las muestras de alto contraste, como los cortes teidos de
tejidos, pero es probable que no se obtenga la visibilidad p-
tima para otros especmenes. En las secciones siguientes se
consideran varios medios alternativos para hacer que las
muestras sean ms visibles en un microscopio ptico.
delgada de tejido unido a la laminilla, donde puede teirse o
tratarse con enzimas, anticuerpos u otros agentes. Despus de
la tincin se coloca un cubreobjetos sobre el tejido con un
medio de montaje que tenga el mismo ndice refractivo que el
portaobjetos y el cubreobjetos.
Microscopia de contraste de fase
Las muestras pequeas y no teidas, como una clula viva,
pueden ser difciles de observar con un microscopio de campo
736
(a)
(b)
(c)
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
Figura 18.6 Comparacin de clulas vistas con diferentes tipos
de microscopios pticos. Micrografas pticas de un protista ciliado
tal como se observa en un campo brillante (a), con contraste de fase
(b) y con ptica de contraste por interferencia diferencial (DIC) (o
de Nomarski) (c). El organismo apenas es visible con la iluminacin
de campo brillante, pero se ve con claridad en la microscopia con
contraste de fase y con DIC. (Micrografas por M.I. Walker/
Photo Researchers, Inc.)
brillante (fig. 18.6a). El microscopio de contraste de fase
hace ms visibles los objetos muy transparentes (fig. 18.6b).
Pueden distinguirse diferentes partes de un objeto porque
cada uno de ellos afecta la luz de manera distinta. Una base de
estas diferencias es el ndice refractivo. Los organelos celula-
resestn constituidos por distintas proporciones de varias mo-
lculas: DNA, RNA, protenas, lpidos, carbohidratos, sales y
agua. Es probable que las regiones con composicin diferente
tengan ndices de refraccin distintos. En condiciones norma-
les el ojo humano no puede detectar tales diferencias. Sin em-
bargo, el microscopio de contraste de fase convierte las dife-
rencias del ndice de refraccin en diferencias de intensidad
(brillantez y oscuridad relativas) que son visibles para el ojo
humano. Los microscopios de contraste de fase logran esto:
(1) mediante la separacin de la luz directa que entra a la lente
del objetivo desde la luz difractada que proviene de la muestra
y (2) al hacer que los rayos de luz de estas dos fuentes interfie-
ran unos con los otros. La brillantez u oscuridad relativas de
cada parte de la imagen reflejan la forma en que la luz de esa
parte de la muestra interfiere con la luz directa.
Los microscopios de contraste de fase son ms tiles para
examinar componentes intracelulares de clulas vivas con una
resolucin hasta cierto punto alta. Por ejemplo, la movilidad
dinmica de las mitocondrias, los cromosomas mitticos y
lasvacuolas pueden seguirse y filmarse con este sistema ptico.
La mera observacin del modo en que las diminutas partculas
y vacuolas de las clulas se mueven de un lado a otro al azar
dentro de una clula viva causa una emocin respecto a la vida,
que no puede obtenerse si se observan clulas muertas y tei-
das. El mayor beneficio aportado por la invencin del micros-
copio de contraste de fase no fue el descubrimiento de nuevas
estructuras, sino su empleo diario en laboratorios de investiga-
cin y enseanza para observar clulas de manera ms revela-
dora.
El microscopio de contraste de fase tiene limitaciones
pticas que producen prdida de resolucin y la imagen se
afecta por halos que interfieren y sombras producidas en sitios
donde el ndice refractivo experimenta cambios sbitos; es un
tipo de microscopio de interferencia. Otros tipos de microsco-
pios de interferencia minimizan estos artefactos pticos al lo-
grar una separacin completa de los rayos directos y difracta-
dos por medio del uso de trayectos complejos de luz y prismas.
Otro tipo de sistema de interferencia, llamado contraste de in-
terferencia diferencial (DIC), o a veces interferencia de No-
marski en honor de su desarrollador, presenta una imagen que
tiene una calidad tridimensional aparente (fig. 18.6c). El con-
traste en la microscopia DIC depende de la velocidad de cam-
bio del ndice refractivo en la muestra. En consecuencia los
bordes de las estructuras, donde el ndice refractivo vara mu-
cho en una distancia ms o menos corta, se observan con bas-
tante contraste.
Microscopia de fluorescencia (y tcnicas
relacionadas basadas en la fluorescencia)
En los dos ltimos decenios, el microscopio ptico se ha trans-
formado de un instrumento diseado principalmente para exa-
minar cortes de tejidos fijos, a un instrumento capaz de mostrar
los sucesos dinmicos que ocurren a nivel molecular en las clu-
las vivas. En gran medida, estos avances en la visualizacin de
clulas vivas han sido posibles gracias a innovaciones en la mi-
croscopia de fluorescencia. Esta ltima permite observar la locali-
zacin de determinados compuestos (llamados fluorocromos o
fluorforos) que absorben radiacin ultravioleta invisible y emi-
ten porciones de la energa en las longitudes de onda visibles,
ms largas, un fenmeno que se conoce como fluorescencia. La
fuente de luz en un microscopio de este tipo produce un rayo de
luz ultravioleta que viaja por un filtro, el cual bloquea todas las
longitudes de onda excepto la que puede excitar el fluorocromo.
El rayo de luz monocromtica se enfoca en la muestra que con-
tiene el fluorocromo, que se excita y emite luz de longitud de
onda visible para el observador. Como la fuente de luz produce
slo luz ultravioleta (negra), los objetos teidos con un fluoro-
cromo parecen tener un color brillante contra un fondo negro,
lo que brinda un gran contraste.
 En biologa celular y molecular existen diversas formas de
utilizar los compuestos fluorescentes. En una de sus aplicacio-
nes ms usuales, un fluorocromo (como la rodamina o la fluo-
rescena) se une en forma covalente (conjugada) con un anti-
cuerpo para producir un anticuerpo fluorescente que puede
emplearse para localizar una protena especfica dentro de la
clula. Esta tcnica se denomina inmunofluorescencia y se ilus-
tra en la micrografa de la figura 9-30a. La inmunofluorescen-
cia se describe mejor en la pgina 783. Las protenas con
marca fluorescente tambin pueden usarse para estudiar pro-
cesos dinmicos mientras ocurren en una clula viva. Por
ejemplo, un fluorocromo especfico puede unirse con una pro-
tena celular, como la actina o la tubulina, y la protena con
marca fluorescente se inyecta en una clula viva (figs. 9.4 y
9-73b). Los fluorforos tambin se utilizan para situar mo-
lculas de DNA o RNA que contienen secuencias especficas
de nucletidos, como se describen en la pgina 402 y se ilus-
tran en la figura 10.19. En otros ejemplos, los fluorforos se
han usado para estudiar el tamao de las molculas que pasan
entre las clulas (ver fig. 7.33), como indicadores de potencia-
les transmembranarios (ver fig. 5.21), o como sondas para co-
nocer la concentracin de calcio libre en el citosol (ver fig.
15-29). El empleo de los fluorforos sensibles al calcio se ex-
pone en la pgina 649.
En todos los ejemplos sealados en el prrafo anterior, las
biomolculas se tornaron fluorescentes al conjugarlas con un
fluorforo orgnico sinttico; sin embargo, tambin se cuenta
con molculas fluorescentes naturales. Los humanos desde
hace miles de aos se han preguntado porqu las medusas y
otros animales marinos emiten luz en la oscuridad. Fue apenas
en el comienzo en el decenio de 1960 cuando Osamu Shimo-
mura descubri que algunas especies de dichos organismos
(Aequorea victoria) emiten luminosidad por la presencia de
protenas fluorescentes como la aequorina y la protena fluo-
rescente verde (GFP; green fluorescent protein), y las pudo pu-
rificar y analizar. En los comienzos del decenio de 1990, Dou-
glas Prasher, Martin Chalfie y colaboradores clonaron el gen
que codifica GFP y demostraron que la protena fluorescente
podra ser incorporada genticamente y expresada en otros
organismos. El estudio en cuestin prepar el terreno para
utilizar GFP para investigar la distribucin espacial y tempo-
ral de las protenas en clulas vivas. A diferencia de la mayor
parte de las otras protenas fluorescentes, GFP no requiere un
cofactor adicional para absorber y emitir luz; en lugar de eso,
se forma un cromforo absorbente/emisor de luz por modifi-
cacin autnoma (o sea, por una reaccin cataltica) de tres de
los aminocidos que conforman la estructura primaria del po-
lipptido GFP. En la mayora de los estudios que usan GFP, se
construye un DNA recombinante en el que la regin codifica-
dora del gen GFP est unida con la regin codificadora del
gen para la protena en estudio. Este DNA recombinante se
utiliza para transfectar a las clulas, que luego sintetizan una
protena quimrica que contiene GFP fluorescente fusionada
con la protena en estudio. El uso de GFP para estudiar la
dinmica de la membrana se describe en la pgina 273. En
estos diversos protocolos experimentales, las protenas marca-
das participan en las actividades normales de la clula y su lo-
calizacin puede seguirse al microscopio para revelar las acti-
vidades dinmicas en las que la protena participa (ver figs. 8.4
y 9.2).
Los estudios imagenolgicos en clulas vivas a menudo
aportan mayor informacin gracias al uso simultneo de va-
riantes de GFP que presentan diferentes propiedades espec-
trales. Las variantes de GFP que florecen con tonos de azul 737
(BFP), amarillo (YFP) y azul verdoso (ciano) (CFP) fueron
generadas por Roger Tsien en la Universidad de California,
San Diego, gracias a la mutagnesis dirigida del gen GFP.
Adems de la anmona de mar se aisl una protena tetram-
rica de fluorescencia roja (DsRed) no emparentada directa-
mente. Tambin se han generado en el laboratorio de Tsien,
variantes monomricas de DsRed (p. ej., mBanana, mTange-
rine, y mOrange), que fluorescen y emiten colores perfecta-
mente identificables, gracias a experimentos de mutagnesis
dirigida. El tipo de informacin que puede obtenerse con esta
paleta de variantes de GFP se ilustra en la figura 18.7, en el
que los investigadores generaron cepas de ratones cuyas neu-
ronas contenan protenas fluorescentes de colores distintos.
Cuando un msculo de uno de estos ratones se expuso por
medios quirrgicos, los investigadores observaron las interac-
ciones dinmicas entre las neuronas de diversos colores y las
uniones neuromusculares inervadas (ver fig. 4.56 que presenta
un dibujo de este tipo de unin). Por ejemplo, observaron
cmo las ramas de una neurona coloreada con CFP competan
con las ramas de una neurona coloreada con YFP por estable-
cer contacto sinptico con el tejido muscular. En cada caso
encontraron que cuando dos neuronas compiten por la inerva-
cin de diferentes fibras musculares, todas las ramas ganado-
ras pertenecen a una de las neuronas, en tanto que todas las
ramas perdedoras pertenecen a la otra neurona (fig. 18.7b).
Las micrografas presentadas al inicio del captulo constituyen
(a) (b)
Figura 18.7 Uso de variantes de GFP para seguir las interaccio-
nes dinmicas entre neuronas y sus clulas blanco in vivo. (a) Por-
cin de cerebro de un ratn con dos neuronas fluorescentes de
colores diferentes. Los ratones se obtienen mediante el aparea-
18.1 El microscopio ptico
miento de animales transgnicos cuyas neuronas se marcan con una
u otra protena fluorescente. (b) Micrografa con fluorescencia de
porciones de dos neuronas, una marcada con YFP y otra marcada
con CFP. Las flechas indican dos uniones neuromusculares distintas
en dos fibras musculares diferentes en las que la rama axonal mar-
cada con YFP venci a la rama marcada con CFP. La tercera unin
est inervada con el axn marcado con CFP en ausencia de compe-
tencia. (a: Cortesa de N. Kasthuri y J. W. Lichtman, Wash-
ington University School of Medicine; b: reimpresa con
autorizacin de Narayanan Kasthrui y Jeff W. Lichtman,
Nature 424:429, 2003, fig. 4a.Reimpresa con autorizacin de
Macmillan Publishers Ltd.)
738 otro ejemplo de lo mucho que se puede aprender sobre la di-
nmica espacial y temporal de fenmenos celulares por el uso
de dos o ms protenas fluorescentes espectralmente diferen-
tes. En esta situacin, la estrategia de dos marcadores permi-
ti a los investigadores vigilar los movimientos simultneos de
dos protenas en tiempo real, tal como acaece dentro de los
confines de un organelo celular particular. Otro ejemplo se
describe en la Va experimental del captulo 8 (pg. 321).
Las variantes de GFP tambin son tiles en una tcnica
llamada transferencia de energa por resonancia de fluorescencia
(FRET), que se emplea para medir cambios en la distancia
entre dos partes de una protena (o entre dos protenas separa-
das dentro de una estructura ms grande). La tcnica de
FRET puede usarse para estudiar estos cambios mientras ocu-
rren in vitro o dentro de una clula viva. Esta tcnica se basa
en el hecho de que la energa de excitacin puede transferirse
de un grupo fluorescente (un donador) a otro grupo fluores-
cente (un receptor), siempre y cuando ambos grupos estn
muy prximos (1 a 10 nm). Dicha transferencia de energa
reduce la intensidad de la fluorescencia del donador e incre-
menta la intensidad de fluorescencia del receptor. La eficiencia
de la transferencia entre dos grupos fluorescentes unidos a si-
tios estratgicos de una protena disminuye mucho cuando
ladistancia entre los dos grupos aumenta. Como resultado la
determinacin de los cambios en la fluorescencia de los grupos
donador y receptor que se producen durante algn proceso
brinda una medida de los cambios en la distancia entre ellos
en las distintas etapas del proceso. Esta tcnica se ilustra en la
figura 18.8, en la que dos variantes de GFP (marcadas ECFP
y EYFP) se unieron en forma covalente con dos partes distin-
PKG
PKG
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
tas de una protena cinasa dependiente de cGMP (PKG). En
ausencia de un cGMP unido, los dos fluorocromos estn de-
masiado separados para que haya transferencia de energa. La
unin de cGMP induce un cambio en la conformacin de
la protena que aproxima los dos fluorocromos lo suficiente
para que la FRET ocurra. La FRET tambin puede em-
plearsepara seguir procesos como el plegamiento de una pro-
tena o la asociacin y disociacin de los componentes dentro
de una membrana. La separacin de las colas citoplsmicas de
subunidades de integrina despus de la activacin por talina
(fig. 7.14) es un ejemplo de un suceso que se ha estudiado por
FRET. La figura 15.8 seala un ejemplo temprano en el que la
tcnica de FRET se utiliz para identificar los cambios de las
concentraciones de cAMP despus de que un neurotransmi-
sor se uniera a un receptor de superficie.
Otra innovacin de la microscopia por fluorescencia ha
sido la elaboracin de programas computacionales, para gene-
rar gran numero de imgenes y calificarlas con base en diver-
sas caractersticas. Las tcnicas automatizadas comentadas
han sido particularmente tiles para detectar los fenotipos de
clulas sometidas a una biblioteca de siRNA diferentes, en la
bsqueda de genes que codifiquen protenas que intervengan
en un proceso celular particular como es el trnsito de mem-
branas (pg. 278) o la mitosis (pg. 780). Adems de ser una
maniobra tediosa y lenta, el intento de analizar por tcnicas
manuales galeras de imgenes como las que se muestran en la
figura 18.50, quiz introduzca errores que son consecuencia de
diferencias subjetivas inherentes y sesgos de observadores hu-
manos.
Otra innovacin reciente en la microscopia por fluores-
cencia es el terreno de la microscopia multifotnica, en que los
fluorforos presentes en el interior de clulas son excitados
por la llegada simultnea de dos o ms fotones de longitud de
onda ms larga. Cuanto ms larga sea la longitud de onda del
fotn, menor ser su energa (de modo que los torna menos
destructivos de las clulas iluminadas y para la absorcin de
fluorforos) y mayor ser su capacidad de penetracin. Por el
uso de microscopia multifotnica los investigadores pueden
rastrear los desplazamientos de protenas fluorescentes que se
encuentran como mnimo a una profundidad de 200 m en el
interior de tejido vivo. Un ejemplo de tal tcnica se incluye en

la figura 17.11 en que las clulas inmunitarias marcadas por

fluorescencia son vigiladas conforme se desplazan en el inte-
rior de un ganglio linftico extirpado.

Figura 18.8 Transferencia de energa por resonancia de fluores-

cencia (FRET). Este esquema muestra un ejemplo del uso de la
tecnologa FRET para seguir el cambio en la conformacin de una
protena (PKG) despus de la unin con cGMP. Las dos protenas
pequeas fluorescentes con forma de barril [CFP intensificada
(ECFP) y YFP intensificada (EYFP)], se muestran en su color fluo-
rescente. En ausencia de cGMP, la excitacin de ECFP con luz de
440 nm produjo la emisin de luz de 480 nm de la protena fluores-
cente. Despus de la unin con cGMP, un cambio en la conforma-
cin en PKG aproxima lo suficiente las dos protenas fluorescentes
para que la FRET ocurra. Como resultado, la excitacin del donador
de ECFP con luz de 440 nm produce la transferencia de energa al
receptor de EYFP y la emisin de luz de 535 nm del receptor. Las
versiones intensificadas de estas protenas tienen mayor intensidad
de fluorescencia y tienden a ser ms estables que las molculas pro-
tenicas originales. (Tomada de Moritoshi Sato y Yoshio Ume-
zawa, Analytical Chemistry 72:5924, 2000. 2000 American
Chemical Society.)
Microscopia con video y procesamiento
de imgenes
As como el campo microscpico puede verse con los ojos o
filmarse con una cmara, tambin puede verse por medios
electrnicos y grabarse con una videocmara. Las videocma-
ras ofrecen varias ventajas para visualizar muestras. Se cons-
truyen tipos especiales de videocmaras (llamadas dispositivo
acoplado a la carga [CCD, charge-coupled device], o cmaras
CCD) que son muy sensibles a la luz, lo que les permite obte-
ner imgenes con iluminacin escasa. Esto es muy til cuando
se observan especmenes vivos, a los que el calor de una fuente
luminosa daa con facilidad y especmenes con tincin fluo-
rescente, que se desvanece en poco tiempo con la exposicin
ala luz. Adems, las videocmaras pueden detectar y amplifi-
car diferencias muy pequeas en el contraste dentro de una
muestra, de manera que los objetos muy pequeos se tornan
visibles. Por ejemplo, las fotografas de la figura 9.22a exponen
imgenes de microtbulos individuales (dimetro 0.025 m)
que estn muy por debajo del lmite de resolucin de un mi-
croscopio ptico estndar (0.2 m). Una ventaja adicional es
que las imgenes electrnicas generadas por cmaras de video
son transformadas fcilmente en imgenes digitales y estas
ltimas incluyen un nmero discreto de elementos grficos
(pixeles), de modo que a cada uno se ha asignado un valor
cromtico y de brillo correspondiente al sitio de la imagen
original. Las imgenes digitales se almacenan como archivos
en computadoras y se someten a procesamiento para ampliar
enormemente su contenido informativo. En una tcnica, el
fondo desenfocado distractor de un campo visual se almacena
en la computadora y luego se sustrae de la imagen que con-
tiene la muestra. Esto incrementa mucho la claridad de la
imagen. De igual manera las diferencias de la brillantez en
laimagen pueden convertirse en diferencias de color, lo que las
vuelve mucho ms evidentes al ojo humano.
Microscopia confocal de barrido lser
El uso de videocmaras, imgenes electrnicas y procesa-
miento por computadora condujo al renacimiento de la mi-
croscopia ptica en los ltimos 20 aos. Tambin contribuy
el desarrollo de un nuevo microscopio ptico. Cuando se exa-
mina una clula completa o un corte de algn rgano con un
microscopio ptico estndar, el observador ve la muestra a
distintas profundidades si cambia la posicin del objetivo me-
diante la rotacin del tornillo de enfoque. Mientras lo hace,
distintas partes de la muestra entran y salen de foco. Sin em-
bargo, el hecho de que la muestra contenga diferentes enfo-
ques disminuye la capacidad para formar una imagen ntida
porque las partes de la muestra por arriba y por abajo del plano
de foco interfieren con los rayos de luz de la parte que est en
dicho plano. A finales del decenio de 1950, Marvin Minsky, 739
del Massachusetts Institute of Technology, invent un instru-
mento revolucionario llamado microscopio confocal que pro-
duce una imagen de un plano delgado situado dentro de una
muestra mucho ms gruesa. La figura 18.9a muestra un dia-
grama de los componentes pticos y los trayectos de luz en
una versin moderna de un microscopio ptico de barrido confocal
de fluorescencia. En este tipo de microscopio la muestra se
ilumina con un rayo lser con un enfoque fino que barre rpi-
damente la muestra a una sola profundidad, con lo que slo
ilumina un plano delgado (o corte ptico) dentro de la mues-
tra. Como se describe en la figura 18.9a, los microscopios con-
focales se utilizan con ptica fluorescente. Como se explic
antes, los fluorocromos presentes en una muestra absorben la
luz incidente de longitud de onda corta y la emiten de nuevo
en una longitud de onda mayor. La luz emitida por la muestra
se enfoca en un sitio del microscopio que contiene una aber-
tura puntual. Por lo tanto, la abertura y el plano iluminado son
confocales. Los rayos de luz emitidos por el plano iluminado
de la muestra pueden pasar por la abertura, mientras que el
paso de cualquier otro rayo de luz que pudiera emanar de un
plano superior o inferior al plano determinado se impide para
que no participe en la formacin de la imagen. En consecuen-
cia los puntos fuera de foco de la muestra se tornan invisibles.
A la computadora
Fotomultiplicador
Abertura puntiforme
Espejo dicroico

Figura 18.9 Microscopia de fluorescencia confocal con explora- Abertura de iluminacin

cin lser. (a) Los trayectos de la luz en un microscopio de fluores-
cencia confocal. La luz de longitud de onda corta (azul) proviene de
una fuente lser, pasa por una abertura diminuta y se refleja en un
espejo dicroico (un tipo de espejo que refleja ciertas longitudes de Lser
onda y transmite otras) hacia una lente del objetivo y se enfoca en
una mancha en el plano de la muestra. Los fluorocromos de la
muestra absorben la luz incidente y emiten luz de mayor longitud de
onda, la cual puede pasar por el espejo dicroico y enfocarse en un
plano que contiene una abertura puntual. Luego, la luz pasa a un
tubo fotomultiplicador que amplifica la seal y la transmite a una
computadora, la cual forma una imagen procesada digitalizada.
Cualquier rayo de luz emitido por arriba o debajo del plano ptico Lente del objetivo
de la muestra no pasa por la abertura diminuta, por lo que no contri-
buye a la formacin de la imagen. Este diagrama muestra la ilumi-
nacin de un solo punto en la muestra. Distintos sitios de la muestra
se iluminan mediante un proceso de barrido con lser. El dimetro
Muestra
18.1 El microscopio ptico

de la abertura puntual es ajustable. Mientras menor sea la abertura,

es ms delgado el corte ptico y mayor la resolucin, pero la seal es Plano focal
menos intensa. (b) Micrografas con fluorescencia confocal de tres (a)
cortes pticos separados, cada uno de 0.3 m de grosor, de un ncleo
de levadura teido con dos anticuerpos con marca fluorescente dis-
tinta. El anticuerpo fluorescente rojo ti el DNA dentro del ncleo
y el anticuerpo fluorescente verde ti una protena de unin con el
telmero que se localiza en la periferia del ncleo. (a: tomada de
Thierry Laroche y Susan M. Gasser, Cell 75:543, 1993, Cell
por Cell Press. Reimpresa con autorizacin de Cell Press
en el formato de reproduccin como libro de texto, va co-
pyright Clearance Center.) (b)
740 La figura 18.9b presenta micrografas de un solo ncleo
celular que se tomaron en tres planos distintos de la muestra.
Es evidente que los objetos fuera del plano de enfoque tienen
poco efecto en la calidad de la imagen de cada corte. Si se
desea, las imgenes de cortes pticos separados pueden alma-
cenarse en una computadora y fusionarse para reconstruir un
modelo tridimensional de todo el objeto.
Microscopio de fluorescencia
con sper resolucin
Las innovaciones ms recientes en la microscopia de fluores-
cencia caen en el campo de las tecnologas de sper resolu-
cin. En la pgina 734 se indic que el lmite de resolucin
del microscopio ptico se aproxima a 200 nm por las propie-
dades de difraccin de la luz. En los ltimos aos se desarro-
llaron varias tcnicas pticas complejas que permiten a los
investigadores localizar protenas con marcas fluorescentes en
resoluciones en dcimas de nanmetros. Muchas de estas tc-
nicas de sper resolucin se basan en el descubrimiento de que
una mutacin particular de polipptido GFP transforma la
protena en una molcula fotoactivable (PA-GFP, photoacti-
vatable molecule), y dicha GFP mutante sigue siendo no fluo-
rescente hasta que la luz violeta la activa. Estudios ulteriores
han ampliado el nmero de protenas fluorescentes fotoactiva-
bles que pueden usarse y ello ha permitido crear protenas
fotoconmutables cuya emisin fluorescente en una longitud
particular de onda puede activarse o desactivarse con pulsos
luminosos. Slo se describir en forma breve una de estas tc-
nicas, llamada STORM (stochastic optical reconstruction micros-
copy, microscopia de reconstruccin ptica estocstica), que
permite a los investigadores localizar una molcula fluores-
cente individual con una resolucin menor de 20 nm. En el
caso de esta tcnica, se ilumina la muestra que contiene uno o
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
Clatrina
Microtbulo
(a) (b)
Figura 18.10 Superacin del lmite de resolucin del microsco-
pio ptico. (a) Micrografa de fluorescencia convencional de una
porcin de una clula cultivada de mamfero con microtbulos mar-
cados en verde y las vesculas cubiertas con clatrina en rojo. Con este
nivel de magnificacin, la imagen se ve difusa. Adems, la superposi-
cin entre las dos marcas fluorescentes produce un color naranja, que
sugiere que ambas estructuras estn interconectadas. (b) Micrografa
STORM de sper resolucin de un campo similar que muestra los
ms fluorforos fotoconmutables con pulsos de luz de longi-
tud de onda adecuada, que acta al conmutar, es decir, acti-
var o desactivar la fluorescencia de las molculas marcadas.
Durante cada ciclo de iluminacin, muchas de las molculas
marcadas siguen estando oscuras, pero una pequea fraccin
de ellas es activada de manera aleatoria. Dichas molculas
fluorescentes activadas individualmente asumen la forma de
pequeas zonas o puntos, que dadas las propiedades de difrac-
cin de la luz, tienen algunos cientos de nanmetros de di-
metro. El centro de cada zona o punto, que representa el sitio
real del fluorforo particular que emite la luz, se puede cono-
cer con gran exactitud; el proceso comentado se repite varios
ciclos imagenolgicos y as se genera un gran nmero de coor-
denadas que representan el sitio de muchos de los fluorforos
en la muestra. El anlisis de las coordenadas permite a los in-
vestigadores reconstruir una imagen de sper resolucin del
campo de visin. El gran aumento en la resolucin que puede
obtenerse con la tcnica STORM de sper resolucin en
comparacin con una tcnica de fluorescencia convencional
resulta evidente si se compara la imagen de la figura 18.10a
con las figuras 18.10b y c.
18.2 | Microscopia electrnica
de transmisin
Las micrografas electrnicas que se muestran en este texto
fueron tomadas con dos tipos distintos de microscopios elec-
trnicos. Los microscopios electrnicos de transmisin (TEM)
forman imgenes con los electrones que se transmiten a travs
de una muestra, mientras que los microscopios electrnicos de
barrido (SEM) utilizan electrones que rebotan en la superficie
de la muestra. Todos los comentarios de esta seccin se refie-
(c)
microtbulos y las vesculas cubiertas con clatrina con buena resolu-
cin y separados entre s. (c) Vista magnificada de una porcin de la
imagen b. (Los comentarios de esta tcnica de sper resolucin y
otras ms se localizan en Nature 459:638, 2009; Ann, Rev. Biochem.
78:993, 2009; Cell 143:1047, 2010; J. Cell Biol. 190:165, 2010; y
J.Cell Sci. 124: 1607, 2011.) (Tomada de Mark Bates et al.,
cortesa de Xiaowei Zhuang, Science 317:1752, 2007; 2007.
Reimpresa con autorizacin de AAAS.)

(a)
Figura 18.11 Comparacin entre la informacin obtenida en las
imgenes tomadas con un microscopio ptico y uno electrnico
con una magnificacin comparable de 4 500 veces el tamao real.
(a) Fotografa del tejido muscular esqueltico que se impregn en
plstico, se cort a 1 m y se fotografi con un microscopio ptico
con una lente del objetivo para aceite de inmersin. (b) Corte adya-
cente al empleado para la parte a que se cort a 0.025 m y se exa-
min al microscopio electrnico con una magnificacin comparable
a la imagen en a. La imagen resultante presenta un aumento de dos
ren al uso del TEM; el de barrido se describe por separado en
la pgina 746.
El microscopio electrnico de transmisin puede propor-
cionar mucha mayor resolucin que el microscopio ptico.
Esto se ilustra con la comparacin de las dos fotografas de la
figura 18.11, que muestran imgenes de cortes adyacentes del
mismo tejido con la misma magnificacin, con un microsco-
pio ptico y con uno electrnico. Aunque la fotografa de la
figura 18.11a est casi al lmite de la resolucin del microsco-
pio ptico, la de la figura 18.11b es una micrografa electrnica
de muy baja potencia. El gran poder de resolucin del micros-
copio electrnico se deriva de las propiedades de las ondas de
los electrones. Como se indica en la ecuacin de la pgina 734,
el lmite de resolucin de un microscopio est en proporcin
directa con la longitud de onda de la luz: mientras mayor sea
la longitud de onda, es menor la resolucin. A diferencia de un
fotn de luz que tiene una longitud de onda constante, la lon-
gitud de onda de un electrn vara con la velocidad a la que la
partcula viaja, que a su vez depende del voltaje de aceleracin
aplicado en el microscopio. Esta relacin se define mediante la
ecuacin:
l 2150/V
donde, lambda () es la longitud de onda en ngstroms () y
V es el voltaje de aceleracin en volts. Los microscopios elec-
trnicos de transmisin estndar operan con un espectro de
voltaje de 10 000 a 100 000 V. A 60 000 V, la longitud de onda
de un electrn se aproxima a 0.05 . Si esta longitud y la aber-
tura numrica alcanzable con el microscopio ptico se sustitu-
yeran en la ecuacin de la pgina 734, el lmite de resolucin
sera de unos 0.03 . En realidad la resolucin alcanzable con
un microscopio electrnico de transmisin estndar es de unos
dos rdenes de magnitud menor que su lmite terico. Esto se
debe a la aberracin esfrica grave de las lentes que enfocan los
electrones, lo cual requiere que la abertura numrica de la
lente sea muy pequea (casi siempre entre 0.01 y 0.001). El
741
(b)
a uno en la resolucin. Ntese la diferencia en los detalles de las
miofibrillas musculares, las mitocondrias y el eritrocito contenido en
el capilar. Mientras que el microscopio ptico no puede proporcio-
nar ninguna informacin adicional a la de a, es posible que el mi-
croscopio electrnico brinde mucha ms informacin; por ejemplo,
puede producir imgenes de la estructura de membranas individua-
les dentro de una pequea porcin de una de las mitocondrias
(como en la fig. 5.22). (Cortesa de Douglas E. Kelly y M. A.
Cahill.)
lmite prctico de resolucin de los TEM estndar se halla
entre 3 y 5 . Por lo general el lmite real cuando se observa
una estructura celular est entre 10 y 15 .
Los microscopios electrnicos consisten sobre todo en
una columna alta, cilndrica y hueca por la que pasa el rayo de
electrones, y una consola que contiene un panel con discos que
controlan la operacin de la columna por medios electrnicos.
En la parte superior de la columna se encuentra el ctodo, un
filamento de alambre de tungsteno que se calienta para pro-
veer una fuente de electrones. Los electrones se extraen del
filamento caliente y se aceleran como un rayo fino mediante el
voltaje aplicado entre el ctodo y el nodo. El aire se bombea
para sacarlo de la columna antes de la operacin, lo que pro-
duce un vaco por el que los electrones viajan. Si no se extrajera
el aire, los electrones se dispersaran antes de tiempo por coli-
sin con las molculas de gas.
Tal como un rayo de luz puede enfocarse con una lente de
vidrio pulido, un rayo de electrones con carga negativa puede
enfocarse con lentes electromagnticas, las cuales se localizan
18.2 Microscopia electrnica de transmisin
en la pared de la columna. La fuerza de los magnetos se con-
trola mediante la corriente que se les suministra, que est de-
terminada por las posiciones de varios discos de la consola. La
figura 18.12 muestra una comparacin de los sistemas de len-
tesde un microscopio ptico y uno electrnico. Las lentes del
condensador de un microscopio ptico se colocan entre la
fuente de electrones y la muestra, y enfocan el rayo de electro-
nes sobre sta, que se sostiene en una pequea rejilla de metal
(3 mm de dimetro) y se inserta con pinzas en el sujetador de
la misma, que a su vez se inserta en la columna del microscopio.
Como las longitudes focales de las lentes de un microsco-
pio electrnico varan segn la corriente que se les aplique, una
lente del objetivo proporciona todo el espectro de magnifica-
cin que el instrumento alcanza. Como en el microscopio p-
tico, la imagen del objetivo sirve como el objeto para un sis-
tema de lentes adicional. La imagen que se obtiene del objetivo
de un microscopio electrnico slo tiene una magnificacin de
unas 100 veces pero, a diferencia del microscopio ptico, esta
742 Pantalla de visualizacin
con la imagen final
Lente
del ocular
o proyector
Imagen
intermedia
Lente del
objetivo
Muestra
Condensador
Lmpara Filamento
Microscopio electrnico
Microscopio ptico
Figura 18.12 Comparacin del sistema de lentes de un micros-
copio ptico y uno electrnico. (Reimpresa con autorizacin
de Alan W. Agar, Principles and Practice of Electron Mi-
croscope Operation, Elsevier/North-Holland, 1974. Con
autorizacin de Elsevier Ltd.)
imagen posee detalles suficientes para incrementarla 10 000
veces ms. Al modificar la corriente que se aplica a las diversas
lentes del microscopio, las magnificaciones varan desde 1 000
hasta 250 000 veces. Los electrones que pasaron por la mues-
tra se enfocan en una pantalla fosforescente situada en la base
de la columna. Los electrones que golpean la pantalla excitan
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
una cubierta de cristales fluorescentes que emiten su propia
luz visible que el ojo percibe como una imagen de la muestra.
La formacin de una imagen en el microscopio electr-
nico depende de la dispersin diferencial de los electrones por
las distintas partes de la muestra. Considrese un rayo de elec-
trones emitido por el filamento y enfocado en la pantalla. Si
no hubiera una muestra en la columna, el rayo de electrones
iluminara de manera uniforme la pantalla y se producira una
imagen brillante uniforme. Por el contrario, si se coloca la
muestra en el trayecto del rayo, algunos de los electrones gol-
pean tomos de la muestra y se dispersan. Los electrones que
rebotan de la muestra no pueden pasar por la abertura tan
pequea en el plano focal posterior de la lente del objetivo y
por tanto no participan en la formacin de la imagen.
La dispersin de los electrones por una parte de la mues-
tra es proporcional al tamao de los ncleos de los tomos que
la componen. Como el material insoluble de las clulas est
compuesto por tomos que tienen un nmero atmico hasta
cierto punto bajo (carbono, oxgeno, nitrgeno e hidrgeno),
el material biolgico tiene muy poca capacidad intrnseca para
dispersar los electrones. Los tejidos se fijan y tien con solu-
ciones de metales pesados (descritos ms adelante) para au-
mentar la dispersin electrnica y obtener el contraste necesa-
rio. Estos metales penetran en la estructura de las clulas y
forman complejos selectivos con diferentes partes de los orga-
nelos. Las partes de una clula que se unen con la mayor can-
tidad de tomos metlicos permiten el paso de menor canti-
dad de electrones. Entre menos electrones se enfoquen en la
pantalla en un punto determinado, ese punto es ms oscuro.
Las fotografas de la imagen se hacen al quitar la pantalla del
camino y permitir que los electrones golpeen una placa foto-
grfica en posicin por debajo de la pantalla. Como las emul-
siones fotogrficas tienen una sensibilidad directa a los elec-
trones, tanto como a la luz, una imagen de la muestra se
registra directamente en la pelcula. Como alternativa, la ima-
gen puede capturarse con una cmara de video CCD (pg.
738) empleada para vigilar el campo de visin. Aunque una
cmara de video proporciona una imagen instantnea sin la
necesidad de desarrollo qumico, esta imagen carece de la alta
resolucin excepcional que se obtiene con pelcula. La imagen
analgica captada en el filme se transforma en imagen digital
por medio de digitalizacin.
Preparacin de la muestra para la microscopia
electrnica
Como sucede con el microscopio ptico, los tejidos que se
examinarn con el microscopio electrnico deben fijarse, im-
pregnarse y cortarse. La fijacin del tejido para la microscopia
electrnica (fig. 18.13) es mucho ms crtica que para la mi-
croscopia ptica porque los cortes se someten a un escrutinio
ms intenso. Un fijador debe suspender la vida de la clula sin
alterar mucho su estructura. Con el nivel de resolucin del
microscopio electrnico, los daos relativamente menores,
como las mitocondrias hinchadas o el retculo endoplsmico
roto, se vuelven muy evidentes. Para obtener la fijacin ms
rpida y el menor dao celular, se fijan e impregnan fragmen-
tos muy pequeos de tejido (menos de 1.0 mm3). Los fijadores
son sustancias que desnaturalizan y a la vez precipitan las ma-
cromolculas celulares. Las sustancias con este efecto pueden
ocasionar coagulacin o precipitacin de materiales que no
tenan una estructura en la clula viva, lo que conduce a la
formacin de un artefacto. El mejor argumento de que una
estructura particular no es un artefacto es la demostracin de
su existencia en clulas fijadas de diversos modos o, an mejor,
sin fijacin alguna. Para visualizar clulas que no se fijaron, el
tejido se congela con rapidez y se emplean tcnicas especiales
para revelar su estructura (vase fijacin con fro y replicacin
por criofractura ms adelante). Los fijadores ms usuales para
la microscopia electrnica son el glutaraldehdo y el tetrxido
de osmio. El glutaraldehdo es un compuesto de cinco carbo-
nos con un grupo aldehdo en cada extremo de la molcula.
Los grupos aldehdos reaccionan con los grupos amino de las
protenas y establecen enlaces cruzados entre las protenas
para formar una red insoluble. El osmio es un metal pesado
que reacciona sobre todo con los cidos grasos, lo que permite
la preservacin de las membranas celulares.
Una vez que el tejido se fija, el agua se retira mediante
deshidratacin en alcohol y los espacios hsticos se llenan con
un material que soporta el corte del tejido. Las demandas de la
microscopia electrnica incluyen que los cortes sean muy del-
gados. Los cortes en cera para el examen con el microscopio
ptico rara vez son ms delgados de 5 m, mientras que los
cortes para la microscopia electrnica convencional son mejo-
 743
Lavado Lavado

Pequeo fragmento Tejido colocado

do en Etanol
Etanol Etanol
Etano
E ol Etanol
Etano
ol xido de
Infiltracin Tejido impregnado
de tejido (1 mm3) un segundo fijador
ador 70%
7 9
95% 100%% propileno
p en una solucin en un medio plstico
colocado en fijador (p. ej., OsO4) de medio impregnador contenido
(p. ej., glutaraldehdo) Deshidratacin
D hid
id t i de plstico (p. ej., resina en un recipiente
epxica no polimerizada)

Ultramicrtomo

Bloque
de tejido

Borde
de navaja

El bloque que contiene el tejido se recorta El plstico en el recipiente se polimeriza

a fin de prepararse para el corte en un bloque slido con el tejido
en el borde inferior del bloque
El tejido se divide en rebanadas de unos 100 nm
de espesor conforme el bloque se mueve
por el borde afilado de una navaja de vidrio o diamante.
Los cortes flotan en un espejo de agua
justo detrs del borde de la navaja

Gota de colorante
Rejilla a base de
metal pesado

Rejilla para microscopio electrnico Se tien los cortes

Vista en primer plano que contiene los cortes listos para teirse
de los cortes en un listn con metales pesados, colocados
que flota en el espejo de agua en un sujetador de rejilla y examinados
en el microscopio electrnico

Figura 18.13 Preparacin de una muestra para observacin en el microscopio electrnico.

res cuando tienen menos de 0.1 m (equivalente en grosor a casi siempre se realizan en tejidos impregnados con resinas

18.2 Microscopia electrnica de transmisin

cerca de cuatro ribosomas).
Por lo general los tejidos que van a cortarse para la mi-
croscopia electrnica se impregnan en resinas epxicas, como
1,4-butanediol diglicidil entre otras. Las secciones se cortan
con el paso del bloque plstico sobre un borde cortante muy
afilado (fig. 18.13) hecho de vidrio o una hoja de diamante
finamente pulido. Los cortes obtenidos flotan en la superficie
de un fondo de agua que se encuentra justo detrs del borde de
la navaja. Los cortes se recogen luego con la rejilla metlica
para especmenes y se secan sobre su superficie. Para teir el
tejido se deja que la rejilla flote sobre gotas de soluciones
demetales pesados, en especial acetato de uranilo y citrato de
plomo. Estos tomos de metales pesados se unen con las ma-
cromolculas y brindan la densidad atmica necesaria para
dispersar el rayo electrnico. Adems de las tinciones estndar,
los cortes de tejido pueden tratarse con anticuerpos marcados
con metal u otros materiales que reaccionan con molculas
especficas en el corte de tejido. Los estudios con anticuerpos
acrlicas, que son ms permeables a las grandes molculas que
las resinas epxicas.
Criofijacin y uso de muestras congeladas Las clulas y
los tejidos no tienen que fijarse con sustancias qumicas e im-
pregnarse con resinas plsticas para observarse con el micros-
copio electrnico. Una alternativa consiste en congelar con
rapidez las clulas y los tejidos. Justo como un fijador qumico
detiene los procesos metablicos y conserva la estructura bio-
lgica, lo mismo sucede con el congelamiento rpido, la crio-
fijacin. Como la fijacin en fro alcanza estas metas sin alterar
las macromolculas celulares, es menos probable que se for-
men artefactos. La principal dificultad con la criofijacin es la
formacin de cristales de hielo, que crecen hacia fuera desde
sitios donde se forman sus ncleos. El cristal de hielo, con-
forme crece, destruye el frgil contenido de la clula en la que
se forma. La mejor manera de evitar la formacin de cristales
de hielo es congelar la muestra con tanta rapidez que no haya
744 tiempo para que se formen los cristales. Es como si el agua se
congelara, pero permaneciera en su estado lquido. Se dice que
en tal estado el agua se encuentra vitrificada. Se usan varias
tcnicas para alcanzar dichas velocidades de congelacin ul-
trarrpidas. Las muestras ms pequeas casi siempre se su-
mergen en un lquido a muy baja temperatura (como propano
lquido, con punto de ebullicin a 42C). Es mejor tratar los
especmenes ms grandes con congelacin a alta presin. En
esta tcnica, la muestra se somete a presin hidrosttica alta y
se roca con chorros de nitrgeno lquido. La presin alta re-
duce el punto de congelacin del agua, lo que disminuye la
velocidad de crecimiento de los cristales de hielo.
Podra no creerse que un bloque congelado de tejido tu-
viera mucha utilidad para un microscopista, pero pueden prac- (a)
ticarse una cantidad sorprendente de tcnicas para visualizar
la estructura celular congelada en el microscopio ptico o elec-
trnico. Por ejemplo, despus de la preparacin adecuada, un
bloque congelado de tejido puede cortarse con un micrtomo
especial en forma similar a un bloque de tejido en parafina o
en plstico. Los cortes congelados (criosecciones) pueden pre-
pararse para su examen al microscopio ptico o al electrnico.
Los cortes congelados son muy tiles para estudios de enzi-
mas, cuya actividad tiende a desnaturalizarse con los fijadores
qumicos. Como los cortes congelados pueden prepararse con
mucha mayor rapidez que los cortes en parafina o plstico, los
patlogos los usan a menudo para examinar al microscopio
ptico la estructura de tejidos extirpados durante una inter-
vencin quirrgica. Como resultado, puede establecerse si un
tumor es maligno o no mientras el paciente an se encuentra
en la mesa de operaciones. (b)
Las clulas congeladas no tienen que cortarse para reve-
lar su estructura interna. La figura 1.11 muestra la imagen de Figura 18.14 Ejemplos de muestras con tincin negativa y som-
una regin perifrica delgada de una clula intacta que se bras metlicas. Micrografa electrnica de un virus cascabel de ta-
arrastr sobre la superficie de la rejilla del microscopio elec- baco despus de la tincin negativa con fosfotungstato de potasio (a)
trnico un instante antes y se congel rpidamente. A dife- o proyeccin de sombra con cromo (b). (Cortesa de M. K. Cor-
rencia de la microscopia electrnica estndar, la imagen de la bett.)
figura 1.11 tiene una calidad tridimensional porque se gener
con una computadora y no en forma directa con una cmara.
Para obtener la imagen, la computadora alinea una gran can-
tidad de imgenes digitales bidimensionales de la clula que de especmenes congelados, la replicacin por criofractura y el
se capturan mientras la muestra se inclina en ngulos defini- anlisis de partculas individuales.
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular

dos en relacin con el trayecto del haz de electrones. La re-

construccin computarizada tridimensional se llama tomo-
grama, y la tcnica se denomina tomografa crioelectrnica
(crio-ET).1 Esta tcnica fue desarrollada por Wolfgang Bau-
meister del Max-Planck Institute en Alemania y ha revolucio-
nado la forma en que pueden estudiarse las estructuras intra-
celulares de dimensiones nanomtricas en clulas no fijadas,
bien hidratadas y congeladas en un momento. La crio-ET
tambin puede usarse para examinar la organizacin tridi-
mensional de las estructuras presentes in vitro, como ejempli-
fica la reconstruccin de un polisoma aislado en el acto de la
traduccin que se muestra en la figura 11.52b. La crio-ET,
que puede alcanzar una resolucin de unos cuantos nanme-
tros, establece un puente importante entre los mundos celular
y molecular. En las pginas 745 y 759 se explican dos estrate-
gias ms que requieren el anlisis al microscopio electrnico
1
Esta tcnica es similar en principio a la tomografa axial computarizada que
emplea una multitud de imgenes de rayos X tomadas en ngulos diferentes
del cuerpo para generar una imagen tridimensional. Por fortuna la maquina-
ria que se utiliza en la tomografa radiolgica permite que la fuente de rayos
X y el detector roten mientras el paciente permanece quieto.
Tincin negativa El microscopio electrnico tambin es
adecuado para examinar partculas muy pequeas, como virus,
ribosomas, enzimas con mltiples subunidades, elementos del
citoesqueleto y complejos protenicos. Tambin pueden resol-
verse las formas de protenas individuales y cidos nucleicos
con el microscopio, siempre y cuando tengan el contraste sufi-
ciente con los elementos que los rodean. Una de las mejores
formas para hacer visibles estas sustancias es emplear tcnicas
de tincin negativa en las que los depsitos de metales pesa-
dos se acumulan en toda la rejilla de la muestra, excepto donde
hay partculas. Como resultado la muestra resalta en la panta-
lla por su brillantez relativa. Las figuras 2.39a y 18.14a pre-
sentan ejemplos de muestras con tincin negativa.
Modelo de sombra Otra tcnica para visualizar partculas
aisladas consiste en hacer que los objetos proyecten sombras.
La tcnica se describe en la figura 18.15. Las rejillas que con-
tienen las muestras se colocan en una cmara sellada, que
luego se evacua con una bomba de vaco. La cmara contiene
un filamento formado por un metal pesado (casi siempre pla-
tino) junto con carbono. El filamento se calienta a temperatu-
 Evaporacin 745
de metal del
alambre de platino
Cmara
vaca Muestra

Muestra
Rejilla de la Fren lquido
muestra

Nitrgeno
lquido
Soporte de muestra

Cubierta de campana

Navaja fra

Muestra
Figura 18.15 Procedimiento utilizado para la proyeccin de
sombras por medio de contraste en el microscopio electrnico. A
menudo este procedimiento se emplea para visualizar partculas pe-
queas, como los virus que se muestran en la figura previa. Con fre-
cuencia las molculas de DNA y RNA se hacen visibles por una
modificacin de este procedimiento que se conoce como formacin Borde de navaja
de sombras rotatorias, en el que el metal se evapora en un ngulo
muy bajo mientras se gira la muestra.

ras altas, lo que hace que se evapore y deposite una cubierta

metlica sobre las superficies accesibles dentro de la cmara.
Como resultado el metal se deposita en las superficies que
quedan frente al filamento, mientras que las superficies opues- Fractura
tas de las partculas y el espacio en la rejilla que queda bajo su
sombra quedan sin cubierta. Cuando la rejilla se observa en el
microscopio electrnico, las reas en sombra se ven brillantes
en la pantalla, en tanto que las regiones cubiertas con metal se
ven oscuras. Esta relacin se invierte en la placa fotogrfica, que
es el negativo de la imagen. La convencin para ilustrar espec-
menes sombreados es imprimir una imagen negativa en la que
la partcula se vea iluminada por una luz blanca brillante (co-
Grabado
rrespondiente a la superficie cubierta), con una sombra oscura
proyectada por la partcula (fig. 18.14b). La tcnica propor-
ciona un contraste excelente para materiales aislados y pro-
duce un efecto tridimensional.

Replicacin por criofractura, y grabado por congela- 18.2 Microscopia electrnica de transmisin
miento Como ya se mencion, varias tcnicas de microsco-
pia electrnica se adaptaron para trabajar con tejidos congela-
dos. A menudo la ultraestructura de las clulas congeladas se Sombreado
observa con la tcnica de replicacin por criofractura, que se y replicacin
ilustra en la figura 18.16. Se colocan pequeos fragmentos de Capa de
tejido en un disco metlico pequeo y se congelan con rapidez. carbono
Luego el disco se monta sobre una placa fra dentro de una
cmara de vaco y el bloque de tejido congelado se golpea con Capa de metal
Rplica observada
el borde de una navaja. El plano de fractura resultante se ex- en el microscopio electrnico
tiende desde el punto de contacto y divide el tejido en dos
piezas, algo similar a la manera en que una hoja de hacha se- Figura 18.16 Procedimiento para la formacin de rplicas por
para en dos un trozo de madera. criofractura como se describe en el texto. El procedimiento de
Considrese lo que podra pasar cuando un plano de frac- congelacin y grabado es un paso opcional en el que una capa
tura se extiende por una clula que contiene diversos organe- delgada de hielo que cubre la muestra se evapora para revelar
informacin adicional de la estructura de la superficie de la muestra
los con distintas composiciones. Estas estructuras tienden a
fracturada.
causar desviaciones en el plano de fractura, ya sea hacia arriba
746 o abajo, lo que produce elevaciones, depresiones y crestas en la
cara de fractura que reflejan los contornos del protoplasma
atravesado. Por consiguiente las superficies expuestas por la N
fractura contienen informacin respecto al contenido de lac-
lula. El objetivo es hacer visible esta informacin. El proceso
de replicacin se logra al usar la superficie de fractura como un N.P. N.E.
molde en el que se deposita una capa de metal pesado. El me-
tal pesado se deposita en la superficie nueva expuesta del te-
jido congelado en la misma cmara en la que se fractur el
tejido. El metal se deposita en un ngulo para producir som-
bras que acenten la topografa local (fig. 18.17), como se des-
cribe en la seccin previa referente a proyeccin de sombras. G
G
Despus se deposita una capa de carbono sobre la capa de
metal para cimentar los parches de metal en una superficie V
slida. Una vez que se hizo el molde de la superficie, el tejido
que constituy el molde puede descongelarse, retirarse y des-
echarse; la rplica de metal-carbono es la que se coloca en la C.W.
rejilla para muestra y se visualiza en el microscopio electr-
nico. Las variaciones en el grosor del metal en las distintas
partes de la rplica producen variaciones en la cantidad de
electrones penetrantes que llegan a la pantalla de visualiza-
cin, lo que produce el contraste necesario en la imagen.
Como se explica en el captulo 4, los planos de fractura siguen
el trayecto de menor resistencia por el bloque congelado, lo Figura 18.17 Rplica de una clula de raz de cebolla por criofra-
que a menudo los lleva por el centro de las membranas celula- tura que muestra la envoltura nuclear (N.E.) con sus poros nucleares
(N.P.), el aparato de Golgi (G), una vacuola citoplsmica (V) y la
res. Por ello, esta tcnica es muy adecuada para examinar la
pared celular (C.W.). (Cortesa de Daniel Branton, Harvard
distribucin de las protenas integrales de membrana en su University.)
trayecto por la bicapa lipdica (como en las figs. 4.15, 7.30,
7.31 y 7.32). Tales estudios realizados por Daniel Branton y
otros investigadores tuvieron una parte importante en la for-
mulacin de la estructura de mosaico fluido de las membranas
a principios del decenio de 1970 (pg. 124).
La replicacin por criofractura por s misma es una tc-
nica en extremo valiosa, pero puede aportar an ms informa-
cin si se incluye un paso llamado grabado por congela-
miento (fig. 18.16). En este paso, la muestra congelada y
fracturada, que an permanece dentro de la cmara fra, se
expone al vaco a una temperatura alta por uno a unos cuantos
minutos, durante los cuales puede evaporarse (sublimarse) una
capa de hielo de la superficie expuesta. Luego de retirar parte
del hielo, la superficie de la estructura puede cubrirse con me-
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular

tal pesado y carbono para crear una rplica metlica que revela
las superficies externa e interna de las membranas celulares. El
desarrollo de tcnicas con grabado profundo realizado por John
Heuser, en las que se retiran mayores cantidades de hielo su-
perficial, permitieron una mirada fascinante de los organelos
celulares. Las figuras 18.18, 8.38 y 9.46 presentan ejemplos de
muestras preparadas con esta tcnica en los que puede verse
que las partes individuales de la clula sobresalen en relieve
contra el fondo. La tcnica brinda una resolucin muy alta y
puede usarse para revelar la estructura y la distribucin de los
complejos macromoleculares, como los del citoesqueleto, como
se supone que existen dentro de la clula viva.

Figura 18.18 Grabado profundo. Micrografa electrnica de axo-

18.3 | Microscopia electrnica
de barrido y microscopia
de fuerza atmica
La microscopia electrnica de transmisin (TEM) se explota
ms en el examen de la estructura interna de las clulas. En
cambio, el microscopio electrnico de barrido (SEM) se em-
nemas ciliares del protozoario Tetrahymena. Los axonemas se fijaron,
congelaron y fracturaron, el agua congelada de la superficie del blo-
que fracturado se evapor, lo que dej una porcin de los axonemas
en relieve, tal como se visualiza en esta rplica metlica. La flecha
indica una hilera distintiva de brazos de dinena. (Tomada de Ur-
sula W. Goodenough y John E. Heuser, J. Cell Biol. 95:800,
1982, fig. 3, fotografa de la derecha. Reimpresa con auto-
rizacin de the Rockefeller University Press.)

(a)
plea sobre todo para examinar las superficies de los objetos
cuyo tamao vara desde un virus hasta la cabeza de un animal
(fig. 18.19). La construccin y la operacin del SEM son muy
diferentes a las del TEM. El objetivo de la preparacin de la
muestra para el SEM es producir un objeto que tenga las mis-
mas propiedades de forma y superficie que en el estado vivo,
pero que carezca de lquido, ya que esto es necesario para ob-
servar la muestra al vaco. Como el agua constituye un porcen-
taje muy alto del peso de las clulas vivas y se encuentra rela-
cionada con todas las macromolculas, su extraccin puede
tener un efecto muy destructivo en la estructura celular.
Cuando las clulas slo se secan al aire, la destruccin se debe
sobre todo a la tensin superficial en las interfaces agua-aire.
Las muestras que se examinarn con el SEM se fijan, se pasan
por una serie de alcoholes y luego se secan en un proceso de
secado de punto crtico. El secado de punto crtico ofrece la ven-
taja de que cada solvente tiene una temperatura y una presin
crticas en las que la densidad del vapor es igual a la densidad
del lquido. En este punto no hay tensin superficial entre el
gas y el lquido. El solvente de las clulas se sustituye con un
lquido de transicin (por lo general dixido de carbono), que
se vaporiza a presin para que las clulas no se expongan a
ninguna tensin superficial que pudiera distorsionar su confi-
guracin tridimensional.
Una vez que la muestra se seca, se cubre con una capa
delgada de metal, lo que lo convierte en un blanco adecuado
para un rayo de electrones. En el microscopio electrnico de
transmisin, el rayo de electrones se enfoca mediante las lentes
del condensador para iluminar al mismo tiempo todo el
campo de visin. En el microscopio electrnico de barrido, los
747
(b)
Figura 18.19 Microscopia electrnica de barrido. Micrografas
electrnicas de barrido de (a) un bacterifago T4 (275 000) y (b)
la cabeza de un insecto (40). (a: tomada de A.N. Broers, B.J.
Panessa, y J.F. Gennaro, Science 189:635, 1975; 1975. Reim-
presa con permiso de AAAS; b: por cortesa de H.F. Howden
y L.E.C. Ling.)
18.3 Microscopia electrnica de barrido y microscopia de fuerza atmica
electrones se aceleran en un rayo fino que barre la muestra. En
el TEM, los electrones pasan por la muestra para formar una
imagen; en el SEM, sta se forma con los electrones que se
reflejan desde la muestra (se dispersan de regreso) o con los
electrones secundarios que la muestra emite despus de ser
golpeada por el rayo electrnico primario. Tales electrones
golpean un detector que se localiza cerca de la superficie de la
muestra.
La formacin de la imagen en el SEM es indirecta. Ade-
ms del rayo que explora la superficie de la muestra, otro rayo
electrnico explora al mismo tiempo la cara de un tubo de rayos
catdicos y produce una imagen similar a la que se observa en
una pantalla de televisin. Los electrones que rebotan de la
muestra y llegan al detector controlan la fuerza del rayo en el
tubo de rayos catdicos. Mientras ms electrones se recolecten
de la muestra en un punto determinado, ms fuerte es la seal
para el tubo y mayor la intensidad del rayo en la pantalla en el
punto correspondiente. El resultado es una imagen en la pan-
talla que refleja la topologa superficial de la muestra porque es
su topologa (grietas, colinas y orificios) lo que determina el
nmero de electrones reunidos de las diversas partes de la su-
perficie.
Como resulta evidente en las fotografas de la figura
18.19, un SEM puede proveer un alto grado de magnificacin
(desde cerca de 15 hasta 150 000 veces la de un instrumento
estndar). El poder de resolucin de un SEM depende del
dimetro del rayo electrnico. Los modelos ms nuevos son
capaces de alcanzar resoluciones menores de 5 nm, que se
emplean para localizar anticuerpos marcados con oro unidos
con la superficie celular. El SEM tambin proporciona una
748 profundidad de enfoque notable, unas 500 veces ms que el
microscopio ptico con una magnificacin correspondiente.
Esta propiedad da a las imgenes del SEM su calidad tridi-
mensional. A nivel celular, el SEM permite al observador
apreciar la estructura de la superficie externa de las clulas y
todos los procesos, extensiones y materiales extracelulares di-
versos que interactan con el ambiente.
Microscopia de fuerza atmica
Aunque no es electrnico, el microscopio de fuerza atmica
(AFM, atomic force microscope) es un instrumento de barrido
de alta resolucin cada vez ms importante en nanotecnologa
y biologa molecular. En el texto se presentan varias imgenes
obtenidas por AFM: las figuras 4.24a, 5.25, 7.32c, 9.7 y 9.52.
EL AFM opera mediante la exploracin de la superficie de la
muestra con una punta (sonda) aguda de tamao nanom-
trico. En un tipo de AFM, la sonda est unida con un dimi-
nuto haz oscilante (o mnsula) cuya frecuencia de oscilaciones
cambia cuando la punta encuentra variaciones en la topografa
de la muestra. Tales cambios en la oscilacin del haz pueden
convertirse en una imagen topogrfica tridimensional de la
superficie de la muestra. A diferencia de otras tcnicas para
determinar la estructura molecular, como la cristalografa con
rayos X y la crio-EM, que promedian la estructura de muchas
Detector de posicin
Haz del AFM
de lser
Extremo y elemento
voladizo del AFM
Muestra
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
Piezoactuador de direccin Z
Figura 18.20 Microscopia de fuerza atmica de alta velocidad.
El esquema seala los elementos bsicos de HS-AFM. El operador
coloca la muestra en un componente (el piezoactuador) unido a la
platina del microscopio (no se muestra). Las seales provenientes
del actuador hacen que el segmento voladizo oscile hacia arriba y
abajo, de modo que de manera intermitente el extremo del AFM
contacta la muestra a medida que rastrea la superficie de ella. Las
fuerzas que surgen entre la muestra y el extremo del AFM originan
deflexiones del extremo, que son detectadas por un haz lser que es
reflejado fuera de la superficie trasera del extremo del AFM. Los
movimientos de la posicin del rayo lser, que reflejan diferencias
topogrficas en toda la superficie de la muestra, son identificados
por un detector de posicin, y tal informacin se utiliza para elabo-
rar una imagen de la muestra. La sucesin de imgenes basadas en
AFM, propias del movimiento de la molcula de miosina V que se
seala en la figura 9.52 fue filmada a razn de 7 cuadros por se-
gundo. (Tomada de C. Veigel y C.P. Schmidt, Nature Revs.
Mol. Cell Biol. 12:166, 2011; copyright 2011. Nature Re-
views Molecular Cell Biology by Nature Publishing Group.
Reimpreso con autorizacin de Nature Publishing Group
en el formato de reproduccin como libro de texto de co-
pyright Clearance Center.)
molculas individuales, el AFM brinda una imagen slo para
cada molcula individual tal como est orientada en el campo
(fig. 5.25). Otra limitacin de la microscopia electrnica y de
las tcnicas cristalogrficas radiogrficas es que pueden gene-
rar slo imgenes estticas o instantneas. El AFM de alta
velocidad (HS-AFM, high-speed atomic force microscope) que se
seala esquemticamente en la figura 18.20, permite a los in-
vestigadores obtener imgenes seriadas rpidamente de una
macromolcula, de forma que su actividad pueda ser ras-
treada en tiempo real. La tcnica se ilustra elegantemente en
las micrografas de la figura 9.52, que muestran los pasos to-
mados por una sola molcula de miosina V en su trayectoria
por un filamento de actina. Un progreso extraordinario lo
constituye la posibilidad de contemplar la trayectoria din-
mica de una molcula individual, en el momento de realizar
sus actividades normales, en un campo que ha sido el estudio
de la estructura de tales molculas por ms de 50 aos.
La sonda de un AFM se utiliza ms que como un dispo-
sitivo de vigilancia; tambin se usa como un nanomanipula-
dor para empujar o jalar la muestra en el intento por medir
varias propiedades mecnicas. Esta capacidad se ilustra en la
figura 9.7, donde se muestra que un solo filamento intermedio
puede estirarse hasta varias veces su longitud normal. En un
protocolo diferente, la punta del AFM puede cubrirse con li-
gandos para un receptor particular y pueden hacerse medicio-
nes de la afinidad de ese receptor por el ligando en cuestin.
Por sus mltiples usos potenciales, el AFM se ha denominado
un laboratorio en una punta.
18.4 | Uso de radioistopos
Un rastreador es una sustancia que revela su presencia de una
forma u otra y por lo tanto, puede localizarse o vigilarse du-
rante el curso de un experimento. Segn la sustancia y el tipo
de experimento, un rastreador puede marcarse con fluorescen-
cia, con giro, densidad o radiacin. En cada caso un grupo
marcado permite detectar una molcula sin afectar la especifi-
cidad de sus interacciones. Por ejemplo, las molculas radiac-
tivas participan en las mismas reacciones que las no radiacti-
vas, pero su localizacin puede seguirse y es posible medir la
cantidad presente.
La identidad de un tomo (ya sea de hierro, cloro o de
algn otro elemento) y sus propiedades qumicas se identifi-
can mediante el nmero de protones que hay en su ncleo.
Todos los tomos de hidrgeno tienen un solo protn, los de
helio poseen dos, los de litio tienen tres, etc. Sin embargo, no
todos los tomos de hidrgeno, helio o litio albergan la misma
cantidad de neutrones. Se dice que los tomos con el mismo
nmero de protones y distinta cantidad de neutrones son
istopos uno del otro. An el hidrgeno, el elemento ms sim-
ple, puede existir como tres istopos distintos, segn la pre-
sencia de cero, uno o dos neutrones en el ncleo del tomo. De
estos tres istopos de hidrgeno, slo el que contiene dos neu-
trones es radiactivo, se trata del tritio (3H).
Los istopos son radiactivos cuando contienen una com-
binacin inestable de protones y neutrones. Los tomos que
son inestables tienden a romperse o desintegrarse, con lo cual
alcanzan una configuracin ms estable. Cuando un tomo se
desintegra, libera partculas o radiacin electromagntica que
puede vigilarse con los instrumentos apropiados. Los istopos
radiactivos se encuentran en toda la tabla peridica de los ele-
mentos y pueden producirse en el laboratorio a partir de ele- Cuadro 18.1 Propiedades de varios radioistopos 749
mentos no radiactivos. Muchas molculas biolgicas pueden usados en la investigacin biolgica
obtenerse en estado radiactivo, o sea, con uno o ms tomos
radiactivos como parte de su estructura. Smbolo y Tipo de partculas
peso atmico Vida media emitidas
La vida media (t1/2) de un radioistopo es una medida de
3
su inestabilidad. Entre ms inestable sea un istopo particular, H 12.3 aos Beta
11
mayor es la probabilidad de que un tomo determinado se C 20 min Beta
14
desintegre en un tiempo especfico. Si se comienza con un C 5 700 aos Beta
24
Na 15.1 h Beta, gamma
Curie2 de tritio, la mitad de esa cantidad de material radiac- 32
P 14.3 das Beta
tivo quedar despus de unos 12 aos (que es la vida media de 35
S 87.1 das Beta
42
este radioistopo). Durante los primeros aos de la investiga- K 12.4 h Beta, gamma
45
cin de la fotosntesis y otras vas metablicas el nico istopo Ca 152 das Beta
59
Fe 45 das Beta, gamma
del carbono disponible era 11C, cuya vida media es cercana a 60
Co 5.3 aos Beta, gamma
20 min. Los experimentos con 11C se realizaban con mucha 64
Cu 12.8 h Beta, gamma
65
prisa para poder medir la cantidad de istopo incorporado Zn 250 das Beta, gamma
131
antes que la sustancia desapareciera. La disponibilidad del 14C I 8.0 das Beta, gamma
en el decenio de 1950, un radioistopo con una vida media de
5 700 aos, se recibi con gran celebracin. Los radioistopos
de mayor importancia en la investigacin biolgica celular se
listan en el cuadro 18.1, junto con la informacin de su vida
media y la naturaleza de su radiacin.
Los tomos liberan tres formas principales de radiacin a la luz o los rayos X que activan la emulsin que cubre un
durante su desintegracin. Es posible que el tomo libere una fragmento de pelcula. Si la emulsin fotogrfica se pone en
partcula alfa, que consiste en dos protones y dos neutrones, y contacto con una fuente radiactiva, las partculas emitidas por
es equivalente al ncleo de un tomo de helio; una partcula la fuente dejan granos de plata negros y diminutos en la emul-
beta, que equivale a un electrn, adems puede existir radiacin sin despus del revelado fotogrfico. La autorradiografa se
gamma, que consiste en radiacin electromagntica o fotones. usa para localizar radioistopos dentro de cortes de tejidos
Los istopos ms usuales son los emisores beta, que se vigilan que se inmovilizaron en una laminilla o una rejilla para el
mediante una de dos metodologas diferentes: espectrometra microscopio electrnico de transmisin. Los pasos de la pre-
lquida por centelleo o autorradiografa. paracin de una autorradiografa microscpica ptica se
La espectrometra por centelleo lquido se usa para medir la muestran en la figura 18.21. La emulsin se aplica a los cortes
cantidad de radiactividad en una muestra dada. Esta tcnica se en la laminilla o la rejilla a manera de capa muy delgada y la
basa en la propiedad de ciertas molculas, llamadas fosforescen- muestra se coloca en un recipiente a prueba de luz para per-
tes o centelleantes, de absorber parte de la energa de una part- mitir que la emulsin se exponga por las emisiones. La canti-
cula emitida y liberarla en la forma de luz. Al preparar una dad de granos de plata que se forman es mayor entre ms
muestra para conteo por centelleo en lquido, se mezcla la tiempo permanece la muestra antes del revelado. Cuando la
muestra con una solucin de la sustancia fosforescente en una laminilla o rejilla revelada se examina al microscopio, la loca-
ampolleta de centelleo de vidrio o plstico. Esto coloca el ma- lizacin de los granos de plata en la capa de emulsin que
terial fosforescente y el istopo radiactivo en contacto muy cubre el tejido indica la localizacin de la radiactividad en las
estrecho, de modo que incluso los emisores beta ms dbiles clulas subyacentes. En la figura 8.3a se incluye una microgra-
pueden medirse de manera eficiente. Una vez hecha la mezcla, fa con microscopio electrnico.
la ampolleta se coloca en el instrumento de conteo, donde se
hace descender en un pozo cuyas paredes contienen un foto-
detector extremadamente sensible. Cuando los tomos radiac-
tivos contenidos en la ampolleta se desintegran, las partculas
18.5 | Cultivo celular
emitidas activan las molculas fosforescentes, que emiten des- En todo este libro se ha recalcado la tcnica de la biologa
tellos de luz, que se detectan por una fotocelda, y la seal se celular con la que se intenta comprender procesos particulares
amplifica en un tubo fotomultiplicador dentro del contador. mediante el anlisis en un sistema in vitro simplificado y con-
Despus de corregir tomando en cuenta el ruido de fondo, la trolado. La misma estrategia puede aplicarse al estudio de las
cantidad de radiactividad presente en cada ampolleta se ex- clulas porque tambin pueden extraerse de las influencias a
hibe en una grfica. las que estn sujetas dentro de un organismo multicelular
La autorradiografa es una tcnica muy amplia que se complejo. El aprendizaje de cmo cultivar clulas fuera de un
emplea para localizar los sitios que contienen un istopo es- organismo es uno de los logros tcnicos ms valiosos en todo
pecfico, ya sea en una clula, un gel de poliacrilamida o un el estudio de la biologa. Un vistazo a cualquier publicacin de
filtro de nitrocelulosa. Los experimentos de pulso y segui- biologa celular revela que la mayor parte de los artculos des-
18.5 Cultivo celular

miento que se presentan en la pgina 273 describen la impor-
tancia de la autorradiografa en los descubrimientos iniciales
de las actividades sintticas de las clulas. La autorradiografa
aprovecha la capacidad de una partcula emitida por un tomo
radiactivo para activar una emulsin fotogrfica, muy similar
2
Un Curie es la cantidad de radiactividad necesaria para causar 3.7 1010
desintegraciones por segundo.
cribe investigaciones realizadas en clulas cultivadas. Las razo-
nes de esto son muchas: las clulas cultivadas pueden obte-
nerse en grandes cantidades; casi todos los cultivos contienen
slo un tipo de clula; muchas actividades celulares distintas,
como la endocitosis, el movimiento celular, la divisin celular,
el trfico de membrana y la sntesis de macromolculas, pue-
den estudiarse en un cultivo celular; las clulas pueden dife-
renciarse en un cultivo, y las clulas cultivadas responden al
750 Figura 18.21 Pasos seguidos durante la realizacin de una auto-
radiografa con microscopio corriente.
Lavar y fijar Clulas
las clulas deshidratadas
y embebidas en Seccin
cera o plstico. plstica
Corte del Clulas
bloque de
cera o
Incubar las clulas Clulas Portaobjetos
plstico
en un compuesto en el fijador
radiactivo

Portaobjetos

Emulsin lquida

Corte
Vasija de inmersin

Almacenar los
Sumergir el portaobjetos
portaobjetos hasta
en emulsin sensible
que estn listos
a la radiacin en
para procesar
el cuarto oscuro
Revelar

Vista superior Vista lateral

Capa de
Granos de plata
emulsin

Corte Clula
Granos de plata
Granos de plata Portaobjetos
en el fondo
sobre la clula
Portaobjetos despus del procesamiento

tratamiento con frmacos, hormonas, factores de crecimiento
y otras sustancias activas.
Los primeros investigadores en cultivar clulas emplea-
ban medios que contenan una gran variedad de sustancias
desconocidas. El crecimiento celular se lograba con la adicin
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
Como son tan ricos en nutrimentos, los medios para cul-
tivo celular son un hbitat que invita al crecimiento de mi-
croorganismos. A fin de prevenir la contaminacin bacteriana
de los cultivos celulares, los expertos cultivadores de tejido
deben tomar medidas muy estrictas para mantener las condi-

de lquidos obtenidos de sistemas vivos, como linfa, suero san-
guneo, u homogeneizados de embrin. Se descubri que las
clulas necesitaban una variedad considerable de nutrimentos,
hormonas, factores de crecimiento y cofactores para mante-
nerse sanas y proliferar. Aun ahora la mayor parte de los me-
dios de cultivo contiene grandes cantidades de suero. La im-
portancia del suero (o los factores de crecimiento que contiene)
en la proliferacin de clulas cultivadas se muestra en las cur-
vas de crecimiento celular de la figura 16.4.
Uno de los principales objetivos de los cultivadores de
clulas es desarrollar medios definidos libres de suero que
mantengan el crecimiento de las clulas. Con un abordaje
pragmtico en el que se prueban combinaciones de varios in-
gredientes para comprobar su capacidad para sostener el creci-
miento y la proliferacin celulares, cada vez se cultivan con
xito ms clulas en medios artificiales que carecen de suero
u otros lquidos naturales. Como era de esperarse, la composi-
cin de estos medios qumicos es relativamente compleja;
consisten en una mezcla de nutrimentos y vitaminas, junto
con diversas protenas purificadas que incluyen insulina, factor
de crecimiento epidrmico y transferrina (que proporciona
hierro a la clula).
ciones estriles en su espacio de trabajo. Esto se logra con el
uso de guantes estriles y la esterilizacin de todos los sumi-
nistros y equipo, con el empleo de niveles bajos de antibiticos
en los medios, adems de la realizacin de las actividades bajo
una campana estril.
El primer paso en el cultivo celular es la obtencin de
clulas. En la mayor parte de los casos slo debe extraerse una
ampolleta de clulas congeladas cultivadas con anterioridad de
un tanque de nitrgeno lquido, descongelar la ampolleta y
transferir las clulas al medio de espera. Un cultivo de este tipo
se conoce como cultivo secundario porque las clulas provie-
nen de un cultivo previo. En un cultivo primario las clulas se
obtienen del organismo. Casi todos los cultivos primarios de
clulas animales se toman de embriones, cuyos tejidos se diso-
cian con ms facilidad en clulas que los tejidos de los adultos.
La disociacin se efecta con la ayuda de una enzima proteo-
ltica, como la tripsina, que digiere los dominios extracelulares
de las protenas que median la adhesin celular (cap. 7). Luego
el tejido se lava para eliminar la enzima y por lo general se
suspende en una solucin salina que carece de iones Ca2 y
contiene una sustancia, como tetraacetato de etilenediamina
(EDTA), que se une (quela) con los iones de calcio. Como se

(a)
Figura 18.22 Comparacin de la morfologa de clulas que cre-
cen en cultivos 2D y en cultivos 3D. (a) Fibroblasto humano que
crece en un sustrato plano cubierto con fibronectina en un cultivo
2D asume una forma muy aplanada con lamelipodios anchos. Las
adhesiones que contienen integrina se ven blancas. (b) El mismo
tipo de clula cultivada en una matriz 3D asume una conformacin
explica en el captulo 7, los iones de calcio desempean una
funcin clave en la adhesin celular y su eliminacin de los
tejidos facilita mucho la separacin de las clulas.
Las clulas normales (no malignas) pueden dividirse una
cantidad limitada de veces (por lo general 50 a 100) antes de
envejecer y morir (pg. 508). Por ello muchas de las clulas que
suelen usarse en los estudios con cultivo de tejido se someten
a modificaciones genticas que les permiten crecer por tiempo
indefinido. Las clulas de este tipo se conocen como lnea
celular y casi siempre crecen para formar tumores malignos
cuando se inyectan en animales de laboratorio susceptibles. La
frecuencia con la que una clula normal que crece en cultivo se
transforma de manera espontnea en una lnea celular de-
pende del organismo del que proviene. Por ejemplo, las clulas
de ratn se transforman con una frecuencia ms o menos alta;
las clulas humanas se transforman slo raras veces, si es que
sucede. Las lneas celulares humanas (p. ej., clulas HeLa) sue-
len derivarse de tumores humanos o de clulas tratadas con
virus o sustancias que causan cncer.
Varios laboratorios estn dejando atrs los sistemas de
cultivo bidimensional tradicionales, en los que las clulas cre-
cen sobre una superficie plana o una caja de cultivo, y se estn
orientando a los sistemas tridimensionales, en los que las clu-
las crecen en una matriz tridimensional consistente en mate-
riales extracelulares sintticos, naturales o ambos. Estos mate-
riales pueden adquirirse como productos que contienen
protenas y otros componentes derivados de membranas basa-
les naturales (fig. 7.4 y 7.8). Las clulas en el cuerpo no viven
en superficies planas y duras como plstico y por consiguiente,
se cree que las matrices tridimensionales brindan un ambiente
mucho ms natural para las clulas cultivadas. Por consi-
751
(b)
fusiforme no aplanada. La matriz de fibronectina extracelular
aparece en azul. La barra equivale a 10 m. (Tomada de Edna
Cukierman, Cell 130:603, 2007, fig. 1, reimpresa con autori-
zacin de Elsevier. Por cortesa de Kenneth M. Yamada,
National Institute of Dental and Craniofacial Research,
Nih.)
guiente, la morfologa y comportamiento de las clulas en es-
tos ambientes tridimensionales se parecen ms a las clulas
observadas en los tejidos del cuerpo. Esto se refleja en las dife-
rencias de la organizacin citoesqueltica, tipos de adhesiones
celulares, actividades de sealizacin y estados de diferencia-
cin de las clulas en los dos tipos de sistemas de cultivo. Ade-
ms, los sistemas de cultivo 3D tambin son ms adecuados
para estudiar las interacciones entre clulas porque les permi-
ten estar en contacto unas con otras en cualquier punto de su
superficie. La figura 18.22 muestra imgenes de fibroblastos
humanos cultivados en una superficie plana o en una matriz
tridimensional. La clula en la figura 18.22a est presionada
contra el sustrato, lo que crea una superficie superior (dorsal)
e inferior (ventral) muy poco natural con lamelipodios dema-
siado anchos y aplanados. En cambio, el mismo tipo de clula
en cultivo 3D (fig. 18.22b) tiene una estructura fusiforme t-
pica sin diferenciacin superficial evidente.
Muchos tipos distintos de clulas vegetales tambin pue-
den crecer en cultivo. En una tcnica, las clulas vegetales se
tratan con la enzima celulasa, que digiere la pared celular y li-
bera la clula desnuda o protoplasto. Entonces los protoplas-
tos pueden cultivarse en un medio qumico definido que pro-
mueve su crecimiento y divisin. En las condiciones adecuadas
18.5 Cultivo celular
las clulas pueden crecer en un cmulo indiferenciado de clu-
las llamado callo, en el que es posible inducir el desarrollo de
brotes de los que la planta puede regenerarse. En una tcnica
alternativa, con tratamiento hormonal puede hacerse que las
clulas del tejido de la hoja pierdan sus propiedades diferen-
ciadas y se transformen en material de callo. El callo puede
transferirse despus a un medio lquido para iniciar un cultivo
celular.

752 18.6 | Fraccionamiento
del contenido de una clula
mediante centrifugacin
diferencial
La mayor parte de las clulas contiene una variedad de orga-
nelos distintos. Si se pretende estudiar una funcin particular
de las mitocondrias o aislar una enzima particular del aparato
de Golgi, es conveniente aislar primero el organelo relevante
en estado purificado. El aislamiento de un organelo particular
en gran cantidad suele lograrse mediante la tcnica de centri-
fugacin diferencial, que depende del principio de que, en
tanto sean ms densas que el medio circundante, las partculas
de diferente tamao y forma viajan hacia el fondo de un tubo
centrifugado a distintas velocidades cuando se colocan en un
campo de centrifugacin.
Para efectuar esta tcnica se procede primero a la rotura
mecnica de las clulas con un homogeneizador mecnico. Las
clulas se homogeneizan en una solucin amortiguada isot-
nica (que a menudo contiene sacarosa), lo que previene la ro-
tura de las vesculas de membrana por smosis. El homoge-
neizado se somete a una serie de centrifugaciones secuenciales
cada vez con mayor fuerza centrfuga. Los pasos de esta tc-
nica se explican en el captulo 8 y se ilustran en la figura 8.5.
Al principio el homogenizado se somete a fuerzas centrfugas
bajas por un periodo corto para que slo los organelos celula-
res ms grandes, como los ncleos (y cualquier clula completa
remanente), se sedimenten en una pastilla. Los organelos
citoplsmicos relativamente grandes (mitocondrias, cloroplas-
tos, lisosomas y peroxisomas) pueden separarse de la suspen-
sin con fuerzas centrfugas mayores (fig. 8.5). Los microso-
mas (fragmentos de membranas vacuolares y reticulares del
citosol) y los ribosomas de la suspensin se retiran en los pasos
subsiguientes. Este ltimo paso requiere la ultracentrfuga,
que puede generar velocidades de 75 000 revoluciones por mi-
nuto que producen fuerzas equivalentes a 500 000 veces la
gravedad. Una vez que los ribosomas se retiran, el sobrena-
dante consiste en la fase soluble de la clula y las partculas
demasiado pequeas para retirarse por sedimentacin.
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
Puesto que los pasos iniciales de la centrifugacin dife-
rencial no producen preparaciones puras de un organelo par-
Material resuspendido
de la pastilla
de 20 000 g
Lisosomas llenos
con Tritn
WR1339
Sacarosa (1.12 g/ml)
1 molar 65 000 g/2 h
Mitocondrias
Gradiente (1.18 g/ml)
de densidad
Sacarosa de sacarosa Peroxisomas
(1.23 g/ml)
2 molar
Figura 18.23 Purificacin de fracciones subcelulares por centri-
fugacin de equilibrio con gradiente de densidad. En este ejemplo
particular, el medio se compone de un gradiente de densidad conti-
nuo de sacarosa y los distintos organelos se sedimentan hasta que
llegan a un sitio en el tubo igual a su propia densidad, donde forman
bandas. La pastilla de 20 000 g se obtiene como se muestra en la fi-
gura 8.5.
ticular, casi siempre se requieren pasos adicionales. En muchos
casos se logra una purificacin adicional mediante centrifuga-
cin de una de las fracciones a travs de un gradiente de den-
sidad, como se muestra en la figura 18.23, lo que distribuye el
contenido de la muestra en varias capas de acuerdo con su
densidad. La composicin de varias fracciones puede determi-
narse con el examen microscpico o la medicin de las canti-
dades de protenas particulares conocidas como especficas de
organelos particulares.
Los organelos celulares aislados por centrifugacin dife-
rencial conservan un nivel notable de actividad normal, siempre
que no se expongan a condiciones desnaturalizantes durante el
aislamiento. Los organelos aislados con este procedimiento
pueden usarse en sistemas libres de clulas para estudiar una
gran variedad de actividades celulares, incluida la sntesis de
protenas unidas a la membrana (pg. 276), formacin de ve-
sculas de transporte (pg. 293), sntesis de DNA (pg. 559) y
el transporte de solutos y desarrollo de gradientes inicos (fig.
5.23).
18.7 | Aislamiento, purificacin
y fraccionamiento de protenas
En el curso de este libro se consideran las propiedades de
muchas protenas. La protena debe aislarse en un estado rela-
tivamente puro antes de poder obtener informacin de la es-
tructura o la funcin de una protena particular. Como la ma-
yor parte de las clulas contiene miles de protenas diferentes,
la purificacin de una sola especie puede ser todo un desafo,
en especial si la protena se encuentra en baja concentracin
en la clula. En esta seccin se revisan de manera breve slo
algunas de las tcnicas empleadas para purificar las protenas.
Por lo general la purificacin de una protena se realiza
mediante la eliminacin de los contaminantes por pasos. Es
posible que dos protenas sean muy similares en cuanto a una
propiedad, como la carga general, y muy distintas en otra,
como el tamao o la forma moleculares. Por consiguiente, la
purificacin completa de una protena determinada suele re-
querir el uso de tcnicas sucesivas que aprovechan las diferen-
tes propiedades de las protenas que se separan. La purifica-
cin se mide como un incremento en la actividad especfica,
que es el ndice entre la cantidad de esa protena y el total de
protena presente en la muestra. Debe emplearse algn rasgo
identificable de la protena especfica como prueba para iden-
tificar la cantidad relativa de esa protena en la muestra. Si la
protena es una enzima, puede recurrirse a su actividad catal-
tica como prueba para vigilar la purificacin. Una alternativa
consiste en basar las pruebas en criterios inmunolgicos, elec-
troforticos, microscpicos electrnicos u otros. Las medicio-
nes de la protena total en una muestra pueden hacerse con
varias propiedades, inclusive el nitrgeno total, que puede me-
dirse con gran precisin y es bastante constante en cerca de
16% del peso seco de todas las protenas.
Precipitacin selectiva
El primer paso en la purificacin selectiva debe ser uno que
pueda realizarse en una preparacin muy impura y pueda pro-
ducir un gran aumento en la actividad especfica. Por lo gene-
ral el primer paso aprovecha las diferencias en la solubilidad
entre las protenas mediante la precipitacin selectiva de la
protena deseada. Las propiedades de solubilidad de una pro-
tena dependen mucho de la distribucin de cadenas laterales
hidrfilas e hidrfobas en su superficie. La solubilidad de una
protena en una solucin determinada depende de un equili-
brio relativo entre las interacciones protena-solvente que la
mantienen en solucin y de las interacciones protena-pro-
tena que hacen que se agregue y precipite de la solucin. La
sal que ms se utiliza para la precipitacin selectiva de prote-
nas es el sulfato de amonio, que es muy soluble en agua y tiene
una gran fuerza inica. La purificacin se logra mediante la
adicin gradual de una solucin saturada de sulfato de amonio
al extracto crudo de protena. Conforme la adicin de la sal
contina, la precipitacin de las protenas contaminantes au-
menta y el precipitado puede desecharse. Al final se alcanza un
punto en el que la protena que se busca se separa de la solu-
cin. Este punto se reconoce por la prdida de actividad en la
fraccin soluble cuando se prueba con el ensayo particular que
se utilice. Una vez que la protena deseada se precipita, las
protenas contaminantes se dejan en la solucin, mientras que
la protena buscada puede disolverse de nuevo.
Cromatografa lquida en columna
Cromatografa es un trmino que designa varias tcnicas en
las que una mezcla de componentes disueltos se fracciona a su
paso por cierto tipo de matriz porosa. En las tcnicas de cro-
matografa lquida, los componentes en una mezcla pueden
unirse con una de dos fases alternativas: una fase mvil, con-
sistente en un solvente en movimiento, y una fase inmvil, que
es la matriz a travs de la cual se mueve el solvente.3 La fase
inmvil de los procedimientos cromatogrficos, que se descri-
ben ms adelante, consiste en materiales que se empacan en
una columna. Las protenas que van a fraccionarse se disuel-
ven en un solvente y luego se pasan por la columna. Los ma-
teriales que conforman la fase inmvil contienen sitios a los
que las protenas en solucin pueden unirse. Conforme las
todas las cargas individuales de sus aminocidos componentes. 753
Como la carga de cada aminocido depende del pH del medio
(fig. 2.27), la carga de cada protena tambin depende del pH.
Cuando el pH disminuye, los grupos con carga negativa se
neutralizan y los grupos con carga positiva se vuelven ms
numerosos. Lo contrario ocurre cuando el pH aumenta. Existe
un pH para cada protena en el que el nmero total de cargas
negativas es igual al de cargas positivas. Este pH es el punto
isoelctrico, en el que la protena es neutra. El punto isoelc-
trico de la mayor parte de las protenas est por debajo del
pH7.
La carga inica se usa como base para la purificacin en
diversas tcnicas, incluida la cromatografa con intercambio
inico. sta depende de los enlaces inicos de protenas con
un material matriz inerte, como la celulosa, que contiene gru-
pos con carga elctrica unidos por enlaces covalentes. Dos de
las resinas de intercambio inico ms usuales son la dietilami-
noetilcelulosa (DEAE) y la carboximetilcelulosa (CM). La
DEAE-celulosa tiene cargas positivas, por lo que se une con
molculas de carga negativa; es un intercambiador de aniones.
La CM-celulosa posee carga negativa y es un intercambiador
de cationes. La resina se empaca en una columna y se permite
que la solucin de protena pase por la columna en un amorti-
guador cuya composicin promueve la unin de algunas o to-
das las protenas con la resina. Las protenas se unen con la
resina en forma reversible y pueden desplazarse por el au-
mento en la fuerza inica del amortiguador (que agrega iones
para competir con los grupos cargados de las macromolculas
para sitios en la resina) o por el cambio de su pH. Las prote-
nas se extraen de la columna en orden, de la que tiene una
unin menos fuerte a la unida con mayor fuerza. La figura
18.24 muestra una representacin esquemtica de la separa-
cin de dos especies de protenas mediante la extraccin por
pasos de una columna de intercambio inico.

18.7 Aislamiento, purificacin y fraccionamiento de protenas

molculas de protena individual interactan con los materia-
les de la matriz, su progreso por la columna se retrasa. Por lo + +
tanto, mientras mayor sea la afinidad de una protena particu- Mezcla de +
+
protenas + +
lar por el material de la matriz, su paso por la columna es ms + + +
+ + + + +
cargadas + + + + + + + +
lento. Como las diferentes protenas de la mezcla tienen dis- () y () + + + + + + + + +
tinta afinidad por la matriz, se retrasan en diferente medida. + + + + + + + + + + + +
Conforme el solvente pasa por la columna y gotea del fondo, + + + + + + + + +
se recolecta como fracciones en una serie de tubos. Las prote- Perlas + + + + + + + + + + + +
de DEAE + + + + + + + + +
nas en la mezcla con la menor afinidad por la columna apare- celulosa + + + + + +
cen en las primeras fracciones que salen de la columna. La +
con carga +
resolucin de muchos procedimientos cromatogrficos mejor () +
+


en los ltimos aos gracias al desarrollo de la cromatografa +
lquida de alto desempeo (HPLC, high performance liquid chro-
Cantidad de protena

matography), en la que se usan columnas largas y delgadas, y la

fase mvil se obliga a pasar por una matriz apretada no com- +
presible compuesta por partculas muy pequeas (p. ej., 5 m
de dimetro) que est sometida a alta presin.

Cromatografa de intercambio inico Las protenas son

electrlitos polivalentes grandes y es improbable que muchas
1 Nmero de fraccin
protenas en una preparacin de pureza parcial tengan la misma
carga general. La carga general de una protena es la suma de Figura 18.24 Cromatografa por intercambio inico. Separacin
de dos protenas mediante DEAE-celulosa. En este caso, una resina
de intercambio con carga positiva se usa para unirse con la protena
3
La cromatografa lquida se distingue de la cromatografa gaseosa en que la con mayor carga negativa.
fase mvil est representada por un gas inerte.
754 Mezcla de
3 protenas
Perlas
porosas
Figura 18.25 Cromatografa de filtracin en gel. Separacin de
tres protenas globulares con diferente masa molecular, como se des-
cribe en el texto. Entre las protenas con forma bsica similar, las
molculas ms grandes se eliminan antes que las pequeas.
Cromatografa de filtracin en gel La filtracin en gel
separa protenas (o cidos nucleicos) con base en su tamao
efectivo (radio hidrodinmico). Como la cromatografa de in-
tercambio inico, el material de separacin consiste en cuentas
diminutas que se empacan en una columna a travs de la cual
la solucin de protena pasa lentamente. Los materiales que se
emplean en la filtracin por gel se componen de polisacridos
con enlaces cruzados (dextranos o agarosa) de distinta porosi-
dad, lo que permite que las protenas se difundan dentro y
fuera de las cuentas. La mejor forma de describir la tcnica es
con un ejemplo (fig. 18.25).
Supngase que se intenta purificar una protena globular
con una masa molecular de 125 000 daltones. Esta protena se
encuentra en solucin con dos protenas contaminantes con
forma similar, una mucho ms grande de 250 000 daltones, y
la otra mucho ms pequea, de 75 000 daltones. Un modo en
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
que la protena podra purificarse consiste en pasar la mezcla
por una columna de cuentas Sephadex G-150, que permite la
entrada de protenas globulares menores de 200 kDa. Cuando
la mezcla de protenas pasa por el lecho de la columna, la pro-
tena de 250 kDa es incapaz de entrar a las cuentas y perma-
nece disuelta en la fase solvente mvil. Como resultado la
protena de 250 kDa se extrae en cuanto el solvente de la co-
lumna (el volumen del lecho) termina de gotear. En cambio,
las otras dos protenas pueden difundirse a los intersticios en-
tre las cuentas y su paso por la columna se retrasa. Conforme
ms solvente pasa por la columna, estas protenas se mueven
hacia abajo y salen por el fondo, pero lo hacen a distintas velo-
cidades. Entre las protenas que entran a las cuentas, las espe-
cies ms pequeas se retrasan ms que las grandes. Por consi-
guiente la protena de 125 kDa se extrae en estado purificado,
en tanto que la protena de 75 kDa permanece en la columna.
Cromatografa por afinidad Las tcnicas descritas hasta
ahora utilizan las propiedades gruesas de una protena para
realizar la purificacin o el fraccionamiento. Otra tcnica de
purificacin llamada cromatografa por afinidad aprovecha
las propiedades estructurales nicas de una protena, lo que
Protena a purificar
(p. ej., receptor de insulina) Ligando
(p. ej., insulina)
Perla de agarosa
(a)
Mezcla de
protena que
se busca ( )
y
contaminante
( )
(b)
Figura 18.26 Cromatografa por afinidad. (a) Representacin es-
quemtica de las perlas de agarosa cubiertas con las que slo puede
combinarse una protena especfica. (b) Pasos del procedimiento cro-
matogrfico.
permite que una especie de protena se retire de manera espe-
cfica de la solucin mientras que las dems quedan en sta
(fig. 18.26). Las protenas interactan con sustancias especfi-
cas: enzimas con sustratos, receptores con ligandos, antgenos
con anticuerpos, etc. Cada uno de estos tipos de protenas pue-
den retirarse de la solucin si la mezcla de protenas se pasa a
travs de una columna en la que la molcula especfica de inte-
raccin (sustrato, ligando, anticuerpo, etc.) se une mediante
enlaces covalentes con un material inerte e inmovilizado (la
matriz). Si, por ejemplo, una preparacin impura de un recep-
tor para acetilcolina se pasa por una columna que contiene
cuentas de agarosa a la que se une un anlogo de acetilcolina,
el receptor se une de modo especfico con las cuentas siempre
que las condiciones en la columna sean adecuadas para promo-
ver la interaccin (pg. 172). Una vez que todas las protenas
contaminantes pasaron por la columna y salieron por el fondo,
las molculas del receptor para acetilcolina pueden desplazarse
de sus sitios de unin en la matriz mediante el cambio de la
composicin inica o el pH del solvente en la columna. Por lo
tanto, a diferencia de otros procedimientos cromatogrficos
que separan protenas con base en su tamao o carga, la croma-
tografa por afinidad puede lograr una purificacin casi total
de la molcula deseada en un solo paso.
Determinacin de las interacciones protena-pro-
tena Una de las maneras de aprender respecto a la funcin
de una protena consiste en identificar las protenas con las
que interacta. Se cuenta con varias tcnicas disponibles para
identificar qu protenas de una clula podran interactuar con
una protena determinada que ya se identific. Una de estas
 755
tcnicas acaba de describirse: la cromatografa por afinidad. Dominio de activacin del factor de transcripcin
Otra tcnica utiliza anticuerpos. Por ejemplo, considrese que Domino de unin con DNA
la protena A, que ya se identific y purific, es parte de un del factor de transcripcin Transcripcin
complejo con otras dos protenas en el citoplasma, las prote-
nas B y C. Una vez que la protena A se purifica, puede obte- Promotor Gen lacZ
nerse un anticuerpo contra esta protena y usarse como sonda (a)
para unirse y retirar la protena A de la solucin. Si se prepara
un extracto celular que contenga el complejo protenico A-B-
C y el extracto se incuba con el anticuerpo contra A, la unin
del anticuerpo con la protena A suele producir la coprecipita- X Dominio de unin con DNA fusionado con protena X
cin de otras protenas unidas con A, en este caso las protenas Sin transcripcin
B y C, que pueden identificarse en seguida. La coprecipitacin
de los fragmentos de DNA por el empleo de la tcnica ChIP
(b)
se ilustr en la figura 12.41.
La tcnica de uso ms frecuente para buscar interacciones
protena-protena es el sistema de dos hbridos de levaduras
que Stanley Fields y Ok-kyu Song de la Nueva York State Uni-
Domino de activacin fusionado con protena Y
verity en Stony Brook inventaron en 1989. Esta tcnica se ilus-
tra en la figura 18.27 y depende de la expresin de un gen re-
Y
portero, como la galactosidasa (lacZ), cuya actividad es fcil
de vigilar mediante una prueba que detecta un cambio de co- Sin transcripcin
lor en presencia de la enzima en una poblacin de clulas de
levaduras. La expresin del gen lacZ en este sistema se activa
por una protena particular (un factor de transcripcin), que (c)
contiene dos dominios, un dominio para unin con DNA y un
dominio de activacin (fig. 18.27a). El dominio de unin con
DNA media la unin con el promotor y el dominio de activa- Dominio de activacin
cin media la interaccin con otras protenas participantes en fusionado con protena Y
la activacin de la expresin del gen. Ambos dominios deben Dominio de unin con DNA
Y fusionado con protena X
estar presentes para que haya transcripcin. Para emplear esta X
tcnica se preparan dos tipos diferentes de molculas de DNA Transcripcin
recombinante. Una molcula de DNA contiene un segmento
de DNA que codifica el dominio de unin con DNA del fac-
tor de transcripcin unido con un segmento de DNA que (d)
codifica la protena carnada (X). La protena carnada es la
que se caracteriz y aquella para la que se buscan compuestos

18.7 Aislamiento, purificacin y fraccionamiento de protenas

potenciales de unin. Cuando este DNA recombinante se ex-
presa en una clula de levadura, la clula produce una protena
hbrida como la que se muestra en la figura 18.27b. La otra
molcula de DNA contiene una porcin del factor de trans-
cripcin que codifica el dominio de activacin unido con el
DNA que codifica una protena desconocida (Y). Estos DNA
(o cDNA como se les conoce) se preparan de los mRNA por
accin de la transcriptasa inversa como se describe en la p-
gina 774. Asmase que Y es una protena capaz de unirse con
la protena carnada. Cuando un DNA recombinante que co-
difica Y se expresa en una clula de levadura, la clula produce
una protena hbrida como la mostrada en la figura 18.27c.
Cuando se produce en una sola clula, ni la protena hbrida
que contiene X ni la que contiene Y son capaces de activar la
transcripcin del gen lacZ (fig. 18.27b,c). Sin embargo, si estas
dos molculas de DNA recombinante particulares se introdu-
cen en la misma clula de levadura (como en la fig. 18.27d), las
protenas X y Y pueden interactuar una con la otra para re-
constituir un factor de transcripcin funcional, un fenmeno
que puede detectarse por la capacidad de la clula para produ-
cir galactosidasa . Con esta tcnica los investigadores pueden
pescar protenas codificadas por genes desconocidos capaces
de interactuar con la protena carnada. La metodologa Y2H
es en particular idnea para la deteccin sistemtica de un
gran nmero de protenas, y su empleo en estudios protemi-
cos a gran escala (alto rendimiento) se expone en la pgina 62.
Dominio de unin con DNA Dominio de activacin
fusionado con protena X fusionado con protena Z
Z
X
Sin transcripcin
(e)
Figura 18.27 Uso del sistema de dos hbridos de levaduras. Esta
prueba para la interaccin entre dos protenas depende de que una
clula sea capaz de reunir dos partes de un factor de transcripcin.
(a) Las dos partes del factor de transcripcin (el dominio para unin
con DNA y el dominio de activacin), se ven aqu conforme el fac-
tor de transcripcin se une con el promotor de un gen (lacZ) que co-
difica la galactosidasa . (b) En este caso, una clula de levadura
sintetiz el dominio para unin con DNA del factor de transcrip-
cin unido con una protena X carnada. Este complejo no puede
activar la transcripcin. (c) En este caso, una clula de levadura sin-
tetiz el dominio de activacin del factor de transcripcin unido con
una protena Y desconocida pescada. Este complejo no puede acti-
var la transcripcin. (d) Una clula de levadura sintetiz las protenas
X y Y, lo que reconstituye un factor de transcripcin completo y per-
mite la expresin de lacZ, que es fcil de detectar. (e) Si el segundo
DNA codific una protena, por ejemplo, Z, que no pudo unirse con
X, la expresin del gen reportero no se habra detectado.
756 En aos recientes se ha adaptado para utilizar en clulas de Muestra con colorante
mamferos el procedimiento de dos hbridos, cuyos estudios rastreador cargado
en el pozo
iniciales se hicieron en levaduras. Hasta la fecha, los estu-
diosque utilizan el sistema de dos hbridos en clulas de ma-
mferos tienden a orientarse a las interacciones de protenas Placa de gel de
poliacrilamida colocada
especficas y no a la deteccin sistemtica de bibliotecas de entre dos placas de vidrio
protenas, a gran escala.
1

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Reservorio superior con amortiguador
La electroforesis es otra tcnica que se utiliza con frecuencia
para fraccionar protenas; depende de la capacidad de molcu- Electrodo negativo
las cargadas para migrar cuando se colocan en un campo elc- (ctodo)
trico. La separacin electrofortica de protenas casi siempre
se realiza por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), El colorante de
en la que las protenas son impulsadas por una corriente que se rastreo muestra
aplica a travs de una matriz gelatinosa. La matriz se compone la extensin del
movimiento
de polmeros de una pequea molcula orgnica (acrilamida) electrofortico
que establece enlaces cruzados para formar un tamiz molecu-
Electrodo positivo
lar. Puede formarse un gel de poliacrilamida como una losa (nodo)
delgada entre dos placas de vidrio o como un cilindro dentro
2 Reservorio inferior
de un tubo de vidrio. Una vez que el gel se polimeriza, la losa con amortiguador
(o tubo) se suspende entre dos compartimientos que contie-
nen un amortiguador en el que se sumergen electrodos opues-
tos. En un gel en forma de losa, la muestra concentrada que + _
contiene las protenas se coloca en ranuras sobre el borde su-
perior del gel, como se muestra en el paso 1 de la figura 18.28.
La muestra de protena se prepara en una solucin que con- Fuente de poder
tiene sacarosa o glicerol, cuya densidad impide que la mezcla
se combine con el amortiguador en el compartimiento supe-
rior. Luego se aplica voltaje entre los compartimientos del
Ms
amortiguador y la corriente fluye por la losa, lo que hace que grande
las protenas se muevan hacia el electrodo con carga opuesta
(paso 2). Por lo general la separacin se efecta con amorti-
guadores alcalinos, lo que ocasiona que las protenas tengan
una carga negativa y las obliga a migrar hacia el nodo de
carga positiva en el extremo contrario del gel. Despus de la
Ms
electroforesis, la losa se retira de las placas de vidrio y se tie pequea
(paso 3).
El movimiento relativo de las protenas por un gel de
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular

poliacrilamida depende de la densidad de carga (carga por uni-

dad de masa) de las molculas. Mientras mayor sea la densidad
de carga, la protena se impulsa con ms fuerza por el gel y por
lo tanto, la migracin es ms rpida. No obstante, la densidad
de carga es slo un factor importante en el fraccionamiento
por PAGE; el tamao y la forma tambin influyen. La poli-
acrilamida forma un tamiz molecular con enlaces cruzados
que enreda las protenas que pasan por el gel. Entre mayor sea
la protena, ms se enreda y migra con ms lentitud. La forma
tambin es un factor importante, porque las protenas globu-
lares compactas se mueven ms rpido que las protenas fibro-
sas alargadas de masa molecular similar. La concentracin de
acrilamida (y el agente de los enlaces cruzados) que se emplea
para hacer el gel es otro factor importante. A menor concen-
tracin de acrilamida, menos enlaces cruzados se forman en el
gel y la migracin de una molcula protenica determinada
puede ser ms rpida. Un gel que contiene 5% de acrilamida
podra ser til para separar protenas de 60 a 250 kDa, en
tanto que el gel con 15% de acrilamida permitira separar pro-
tenas de 10 a 50 kDa.
El progreso de la electroforesis se sigue al observar la
migracin de un tinte rastreador cargado que se mueve justo
Solucin de tincin en charola 3 Gel
Figura 18.28 Electroforesis en gel de poliacrilamida. Las mues-
tras de protena suelen disolverse en una solucin de sacarosa cuya
densidad impide que la muestra se mezcle con el amortiguador y
luego se carga en los pozos con una pipeta fina como se muestra en
el paso 1. En el paso 2 se aplica una corriente directa al gel, lo que
ocasiona que las protenas se muevan en la poliacrilamida en carriles
paralelos. Cuando se realiza en el detergente SDS, como casi siem-
pre sucede, las protenas se mueven como bandas a velocidades in-
versamente proporcionales a su masa molecular. Una vez que la
electroforesis se completa, el gel se retira del marco de vidrio y se
tie en una charola (paso 3).
por delante de las protenas ms rpidas (paso 2, fig. 18.28).
Despus que el tinte rastreador se movi a la localizacin de-
seada, la corriente se corta y el gel se retira de su recipiente. Por
lo general el gel se tie con azul Coomassie o tincin de plata
para revelar la localizacin de las protenas. Si las protenas
tienen marca radiactiva, su localizacin puede reconocerse al
presionar el gel contra un fragmento de pelcula para rayos X
a fin de producir una autorradiografa o el gel puede rebanarse
en fracciones y las protenas individuales aislarse. Una alterna-
tiva consiste en transferir las protenas del gel por un se-
gundoprocedimiento electrofortico a una membrana de ni-
trocelulosa para formar una mancha (pg. 763). Las protenas
se absorben en la superficie de la membrana en las mismas
posiciones relativas que ocupaban en el gel. En una inmuno-
transferencia (Western blot), las protenas en la membrana se
identifican por su interaccin con anticuerpos especficos.
SDS-PAGE La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
suele llevarse a cabo en presencia del detergente con carga
negativa sulfato de dodecilo sdico (SDS), que se une en
grandes cantidades con todos los tipos de molculas de pro-
tena (pg. 133). La repulsin electrosttica entre las molcu-
las unidas de SDS hace que las protenas se desplieguen de
manera similar a un bastn, lo que elimina las diferencias en
la forma como factor para la separacin. El nmero de mol-
culas de SDS que se unen con una protena es casi proporcio-
nal a la masa molecular de la misma (cerca de 1.4 g de SDS
por gramo de protena). Por consiguiente, cada especie de
protena, sin importar el tamao, tiene una densidad de carga
equivalente y se impulsa por el gel con la misma fuerza. Sin
embargo, como la poliacrilamida tiene muchos enlaces cruza-
dos, las protenas ms grandes se retienen en mayor medida
que las pequeas. Como resultado, las protenas se separan
por SDS-PAGE con base en una sola propiedad: su masa
molecular. Adems de separar las protenas de una mezcla, la
tcnica SDS-PAGE puede usarse para determinar la masa
pH
7.45 7.3 7.2 7.1 7.0 6.8 6.55 6.3 6.1 6.0 5.9
90
80
70
60
Peso molecular 103
50
40
30
20
15
Figura 18.29 Electroforesis bidimensional en gel. Gel de polia-
crilamida bidimensional de protenas cromosmicas no histonas de
la clula HeLa marcadas con [35S]metionina. Con esta tcnica pue-
den resolverse ms de mil protenas diferentes. (Tomada de J. L.
Peterson y E. H. McConkey, J. Biol. Chem. 251:550, 1976.
1976 The american Society for Biochemistry and Molecu-
lar Biology.)
molecular de varias protenas mediante la comparacin de las 757
posiciones en las bandas con las producidas por protenas de
tamao conocido. En las pginas 146 y 173 se muestran ejem-
plos de SDS-PAGE.
Electroforesis bidimensional en gel En 1975 Patrick
OFarrell, de la California University, en San Francisco, desa-
rroll una tcnica llamada electroforesis bidimensional en gel
para fraccionar mezclas complejas de protenas con el uso de
dos propiedades diferentes de las molculas. Primero, las pro-
tenas se separan en un gel tubular segn su punto isoelctrico
(pg. 753) mediante una tcnica llamada enfoque isoelctrico.
Tras la separacin, el gel se retira y se coloca arriba de una losa
de poliacrilamida saturada con SDS para someterla a SDS-
PAGE. Las protenas se mueven hacia el gel de la losa y se
separan de acuerdo con su masa molecular (fig. 18.29). Una
vez separadas, las protenas individuales pueden retirarse del
gel y digerirse en fragmentos peptdicos susceptibles de anali-
zarse mediante espectrometra de masa. La resolucin de esta
tcnica es suficiente para distinguir la mayor parte de las pro-
tenas de una clula. Por su gran poder de resolucin, la elec-
troforesis bidimensional en gel es ideal para detectar cambios
en las protenas presentes en una clula en distintas condicio-
nes, en diferentes etapas de desarrollo o del ciclo celular o en
distintos organismos (fig. 2.48). Sin embargo, la tcnica no es
adecuada para diferenciar entre protenas que tienen una masa
molecular elevada, que son muy hidrfobas o de las que hay
muy pocas copias en la clula.
Medicin y anlisis de protenas
Uno de los mtodos ms sencillos y usuales para identificar la
cantidad de protena o cido nucleico presente en una solu-
cin determinada es medir la cantidad de luz de una longitud
de onda especfica que absorbe esa solucin. El instrumento
empleado para efectuar esta medicin es el espectrofotme-
tro. La solucin se deposita en un recipiente especial de cuarzo
18.7 Aislamiento, purificacin y fraccionamiento de protenas
con lados planos (se usa cuarzo porque, a diferencia del vidrio,
no absorbe la luz ultravioleta) llamado cubeta, que se coloca en
el haz de luz del espectrofotmetro. La cantidad de luz que
pasa por la solucin sin ser absorbida (es decir, la luz transmi-
tida) se mide en fotoceldas del otro lado de la cubeta.
Dos de los 20 aminocidos incorporados en las protenas,
la tirosina y la fenilalanina, absorben la luz del espectro ultra-
violeta, con una absorbancia mxima cercana a 280 nm. Si las
protenas en estudio tienen un porcentaje tpico de estos ami-
nocidos, la absorbancia de la solucin en esta longitud de
onda proporciona una medida de la concentracin de pro-
tena. Una alternativa es emplear varias pruebas qumicas,
como la tcnica de Lowry o de Biuret, en las que la protena
en solucin participa en una reaccin que produce un com-
puesto coloreado cuya concentracin es proporcional a la con-
centracin de protena.
Espectrometra de masa Como se explica en la pgina 71,
el campo emergente de la protemica depende mucho del
anlisis de las protenas mediante espectrometra de masa. Los
espectrmetros de masa son instrumentos analticos que se
usan sobre todo para medir las masas de molculas, determi-
nar frmulas qumicas y estructura molecular, y para identifi-
car sustancias desconocidas. Los espectrmetros de masa rea-
lizan estas tareas mediante la conversin de sustancias de una
758 muestra en iones gaseosos con cargas positivas, que se aceleran Se forman iones positivos
a travs de un tubo curvo hacia una placa con carga negativa en la descarga elctrica
(fig. 18.30). Cuando los iones pasan por el tubo, se someten a Detector Rayo de iones +
un campo magntico que los separa unos de otros de acuerdo positivos
con su masa molecular [o, de manera ms precisa, segn su
proporcin entre masa y carga (m/z)]. Los iones golpean un N
detector electrnico que se localiza al final del tubo. Los iones S
ms pequeos viajan ms rpido y golpean el detector con ms El rayo se divide
rapidez que los iones ms grandes. La informacin del detec- en varios haces, Imn cuya
cada uno con potencia
tor se convierte en una serie de picos del ndice m/z ascen- iones de la misma puede
dente (como en la fig. 2.49). masa variarse
Aunque los espectrmetros de masa han sido el instru-
mento favorito de los qumicos durante muchos aos, hace
apenas unos 10 aos que los bilogos descubrieron sus sor- Figura 18.30 Principios de operacin de un espectrmetro de
prendentes poderes analticos. Ahora, con la espectrometra de masa. (Tomada de J. E. Brady, J. Russell y J. R. Holum, Che-
masa (MS), los bioqumicos pueden identificar a las protenas mistry 3era. ed.; copyright 2000, John Wiley and Sons, Inc.
que componen algn tipo de clula, organelo o complejo pro- Reimpresa con autorizacin de John Wiley and Sons, Inc.)
tenico en cuestin de horas. Para realizar este anlisis las pro-
tenas suelen digerirse con tripsina y los pptidos resultantes
se ionizan con suavidad y se convierten en gases por uno de
dos procedimientos. El desarrollo de estas tcnicas de ioniza-
cin de pptidos fue clave para adaptar la MS al estudio de las 18.8 | Identificacin
protenas. En un procedimiento, llamado desorcin ionizada
asistida por matriz (MALDI, matrix-assisted laser desorption io-
de la estructura de protenas
nization), la muestra de protena se aplica como parte de una y complejos multisubunitarios
matriz cristalina que se irradia con un pulso de lser. La ener- La cristalografa por rayos X (o difraccin de rayos X) utiliza
ga del lser excita la matriz y la energa absorbida convierte cristales de protena que se bombardean con un fino haz de
los pptidos en iones gaseosos. En un procedimiento alterna- rayos X (fig. 18.31). La radiacin que se dispersa (difracta) por
tivo, la ionizacin de electroaerosol (ESI, electrospray ionization), los electrones de los tomos de la protena golpea un detector
se aplica un potencial elctrico a una solucin peptdica, lo que sensible a los electrones situado detrs del cristal. El patrn de
hace que los pptidos se ionicen y el lquido se roce como un difraccin que el cristal produce depende de la estructura in-
fino aerosol de partculas cargadas que entran al espectrme- terna de la protena; la gran cantidad de molculas en el cristal
tro. Como acta sobre las molculas en solucin, la ESI es refuerza las reflexiones y ocasiona que se comporte como si
adecuada para ionizar pptidos preparados con protenas frac- fuera una molcula gigante. Las posiciones e intensidades de
cionadas mediante una tcnica de cromatografa lquida que se los reflejos, como los de la placa fotogrfica de la figura 2.33,
usa con mayor frecuencia. pueden relacionarse en forma matemtica con las densidades
Una vez que las masas moleculares de los pptidos en la electrnicas dentro de la protena porque son los electrones de
muestra se conocen, la protena completa puede identificarse los tomos los que produjeron esas reflexiones. La resolucin
mediante la bsqueda en una base de datos como se describe obtenida por la difraccin de los rayos X depende de la canti-
en la pgina 72. Si la protena no se identifica sin ambigeda- dad de manchas que se analice.
des, uno o ms de los pptidos generados mediante digestin
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular

con tripsina4 pueden fragmentarse en un segundo paso para

someterlos a otra ronda de espectrometra de masa. La tcnica
bifsica en cuestin (llamada MS en tndem o MS/MS) ge-
nera la secuencia aminocida de los pptidos, que despus po- Pelcula fotogrfica 3
dr ensamblarse en el grupo de protenas del cual provinieron. 2
MS/MS es tan potente que es posible digerir mezclas comple-
1
jas de cientos de protenas desconocidas, someterlas a la espec- Haz de rayos X
trometra de masas y conocer la identidad de cada una de las 0
protenas de la mezcla. MS/MS tambin se ha usado para
identificar las modificaciones postraducionales especficas que Fuente 1
aparecen en una protena particular, en un conjunto especfico de rayos X Cristal
incidentes 2
de situaciones fisiolgicas.
3
Rayos X difractados

Figura 18.31 Anlisis por difraccin de rayos X. Diagrama de la

4
La fragmentacin se logra dentro de un espectrmetro de masa mediante la
colisin de los pptidos con un gas inerte. La energa del choque rompe los
enlaces peptdicos para producir una coleccin aleatoria de fragmentos del
pptido original. La secuencia de aminocidos de cada fragmento, y por lo
tanto, del pptido original, puede determinarse si se busca en una base de da-
tos que contenga las masas de los fragmentos tericos con todas las secuen-
cias posibles de aminocidos que pueden formarse a partir de las protenas
codificadas por ese genoma.
difraccin de rayos X por tomos de un plano de un cristal en una
placa fotogrfica. La serie ordenada de los rayos dentro del cristal
produce una serie repetitiva de ondas circulares superpuestas que se
dispersan e intersectan la pelcula. Como sucede con la difraccin de
la luz visible, las ondas forman un patrn de interferencia que re-
fuerzan unas a otras en algunos puntos de la pelcula y se cancelan
entre s en otros puntos.
 La mioglobina fue la primera protena cuya estructura se
identific por difraccin de rayos X. La protena se analiz de
modo sucesivo con 6, 2 y 1.4 , con periodos de aos entre
cada identificacin completa. Si se considera que los enlaces
covalentes miden entre 1 y 1.5 de largo, y los enlaces noco-
valentes tienen entre 2.8 y 4 de longitud, la informacin
reunida para una protena depende de la resolucin lograda.
Esto se ilustra con una comparacin de la densidad electrnica
de una pequea molcula orgnica en cuatro niveles de resolu-
cin (fig. 18.32). En la mioglobina, una resolucin de 6 fue
suficiente para mostrar la manera en que la cadena polipept-
dica se pliega y la localizacin de la fraccin hem, pero no para
mostrar la estructura dentro de la cadena. Una resolucin de
2 permiti separar los grupos de tomos unos de otros,
mientas que con 1.4 se reconocieron las posiciones de los
tomos individuales. A la fecha se han determinado las estruc-
turas de varios cientos de protenas con resolucin atmica
(1.2 ) y unas cuantas con resolucin de apenas 0.66 .
Con los aos, la tecnologa de difraccin de rayos X me-
jor mucho. Max Perutz tard 22 aos en resolver la estruc-
tura de la hemoglobina (fig. 2.38b), una tarea que en la actua-
lidad requerira unas pocas semanas. En la mayor parte de los
estudios actuales: (1) se generan haces de rayos X intensos y
muy enfocados con sincrotrones (pg. 100), que son acelera-
dores de partculas de alta energa que producen rayos X como
producto intermediario y (2) las placas fotogrficas se sustitu-
yeron por detectores electrnicos muy sensibles (instrumentos
unidos por carga o CCD) que proporcionan una lectura digi-
tal de los datos de la difraccin. El uso de estos instrumentos
junto con computadoras cada vez ms potentes permite a los
investigadores reunir y analizar datos suficientes para recono-
cer la estructura terciaria de casi todas las protenas en cues-
tin de horas. Como resultado de estos avances la cristalogra-
fa con rayos X se aplica al anlisis de estructuras moleculares
cada vez ms grandes. Es probable que la mejor forma de
ilustrar esto sea con el xito obtenido en la identificacin de la
estructura del ribosoma, que se explica en el captulo 11. En la
mayor parte de los casos, como sucedi con el estudio del ri-
bosoma, el principal desafo en este campo es obtener cristales
tiles.
Aunque la cristalografa por rayos X es ideal para identi-
ficar la estructura de protenas solubles que se prestan a la
cristalizacin, puede ser muy desafiante en el estudio de es-
tructuras complejas con mltiples subunidades, como los ribo-
Resolucin 6-A Resolucin 2-
(a) (b)
Figura 18.32 Distribucin de densidad electrnica de una pe-
quea molcula orgnica (dicetopiperacina) calculada con varios
niveles de resolucin. Con la resolucin ms baja (a) slo puede
distinguirse la naturaleza anular, mientras que la resolucin ms alta
(d) revela la densidad electrnica alrededor de cada tomo (indicada
por las lneas de contorno circular). (Modificada de D. Hodgkin.
somas o los proteasomas, o para protenas de membrana, de las 759
que es difcil obtener los cristales tridimensionales necesarios
para el anlisis. A menudo el anlisis estructural de estos tipos
de muestras se realiza con una tcnica alternativa que aprove-
cha la ventaja del inmenso poder de resolucin del microsco-
pio electrnico y las tcnicas de procesamiento de imagen
basadas en la computadora.
Existen dos mtodos generales para el estudio de partcu-
las individuales al microscopio electrnico. En una estrategia,
las partculas se colocan en una rejilla de microscopio electr-
nico, se aplica tincin negativa y se secan al aire (como se ex-
plica en la pgina 744). En la otra tcnica, que se conoce como
criomicroscopia electrnica o crio-EM, las partculas se colocan
en una rejilla y se congelan con rapidez en estado hidratado
con nitrgeno lquido sin fijacin ni tincin. Para los estudios
de mayor resolucin, el uso de muestras con tincin negativa
casi se sustituy ya por partculas hidratadas congeladas, que
tienen una probabilidad mucho menor de generar artefactos y
son ms adecuadas para estudiar rasgos internos de la estruc-
tura de la partcula. En ambos casos, las rejillas se colocan en
la columna del microscopio y se toman fotografas de las par-
tculas. Cada fotografa es una imagen bidimensional de una
partcula individual en la orientacin que asume cuando des-
cansa en la rejilla. Cuando se promedian las imgenes bi-
dimensionales de decenas de miles de muestras distintas en
todas las orientaciones concebibles mediante un anlisis com-
putarizado de alto poder puede generarse una reconstruccin
tridimensional de la partcula con una resolucin cercana a 10
. Con esta resolucin, los investigadores pueden seguir a
lacadena polipeptdica de una protena e incluso identificar la
18.8 Identificacin de la estructura de protenas y complejos multisubunitarios
localizacin de las cadenas laterales voluminosas de aminoci-
dos. En la figura 2.58 se ilustra un modelo de ribosoma euca-
ritico con base en la tcnica de crio-EM; en la figura 8-40c se
incluye un modelo de vescula cubierta con clatrina y en la fi-
gura 11.33 se seala un modelo de una partcula U1 snRNP.
La tcnica anterior, conocida como reconstruccin uniparti-
culada, tambin es til para captar imgenes de una estructura
como un ribosoma, en fases diferentes de un proceso din-
mico, como la etapa de alargamiento de la sntesis protenica.
Con esta tcnica se han revelado varios de los cambios princi-
pales en la conformacin que ocurren despus de cada paso de
la traduccin.
Adems, las estructuras de resolucin atmica determi-
nadas por cristalografa de rayos X pueden ajustarse en las re-
Resolucin 1.5- Resolucin 1.1-
(c) (d)
Reimpresa con autorizacin de Nature 188:445, 1960;
copyright 1960, Nature by Nature Publishing Group. Reim-
presa con autorizacin de Nature Publishing Group en el
formato de reproduccin como libro de texto, de copyright
Clearance Center.)
760
Figura 18.33 La combinacin de datos de microscopia electr-
nica y cristalografa de rayos X proporciona informacin sobre
interacciones entre protenas y sobre la estructura de complejos mul-
tisubunitarios. La reconstruccin basada en micrografas electrnicas
de un filamento de actina-ADF se muestra en gris. Las estructuras
obtenidas por cristalografa de rayos X de alta resolucin de mon-
meros individuales de actina (rojo) y molculas de ADF (verde) se
ajustaron en la estructura determinada por EM, con menor resolu-
cin. (Tomada de Edward H. Egelman, University of Vir-
ginia, J. Cell Biol. 163:1059, 2003 fig. 2a. Reimpresa con
autorizacin de the Rockefeller University Press.)
construcciones de microscopia electrnica de menor resolu-
cin para mostrar la forma en que interactan las molculas
individuales que constituyen un complejo multisubunitario y
cmo podran trabajar juntas para realizar una actividad espe-
cfica. En la figura 18.33 se muestra la estructura terciaria de
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
un filamento compuesto de actina y ADF (un miembro de la
familia de la cofilina, pg. 373). Las estructuras de las dos
protenas se determinaron mediante estudios separados de
cristalografa de rayos X y luego se ajustaron en un modelo de
microscopia electrnica de un filamento de actina-ADF. La
reconstruccin mostrada en la figura sirvi como base para un
mecanismo propuesto, mediante el cual las protenas de la fa-
milia de la cofilina pueden inducir el corte y la despolimeriza-
cin de un filamento de actina (pg. 378).
El anlisis al microscopio electrnico de muestras conge-
ladas tambin es til en el estudio de protenas de membrana,
como el receptor nicotnico para acetilcolina (Va experimen-
tal del cap. 4). Este tipo de anlisis requiere que las protenas
de membrana estn muy compactadas a temperaturas muy
bajas (p. ej., 195C) en disposiciones cristalinas bidimensio-
nales dentro del plano de la membrana. Dicha tcnica ofrece
una ventaja sobre los estudios cristalogrficos de rayos X
delas protenas de membrana, ya que la protena permanece
durante todo el proceso dentro de su membrana natural, en
lugar de extraerse en detergente y cristalizarse en un ambiente
no membranoso. Las estructuras ilustradas en la pgina 174
se obtuvieron de la combinacin de imgenes de alta resolu-
cin de microscopia electrnica, hechas de diferentes molcu-
las protenicas, en ngulos diversos en relacin con el haz de
electrones. Esta tcnica se conoce como cristalografa electr-
nica.
18.9 | Fraccionamiento
de cidos nucleicos
Cualquier mtodo de fraccionamiento sistemtico debe ex-
plotar las diferencias entre los miembros de una mezcla con
fines de separacin. Las molculas de cido nucleico pueden
diferir entre s en tamao global, composicin de bases, topo-
loga y secuencia de nucletidos. Por lo tanto, los mtodos de
fraccionamiento para cidos nucleicos se basan en estas carac-
tersticas.
Separacin de DNA por electroforesis
en gel
De las diversas tcnicas empleadas en el fraccionamiento de
protenas descritas antes, una de ellas, la electroforesis en gel,
tambin se usa mucho para separar cidos nucleicos con masa
molecular diferente (o sea, longitud del nucletido). Las mo-
lculas pequeas de RNA o DNA de unos cuantos cientos de
nucletidos o menos casi siempre se separan por electroforesis
en gel de poliacrilamida. Las molculas ms grandes tienen
problemas para pasar por la poliacrilamida de enlaces cruza-
dos y por lo general se fraccionan en geles de agarosa, que son
ms porosos. La agarosa es un polisacrido extrado de un alga
marina; se disuelve con un amortiguador caliente, se vierte en
un molde y se gelatiniza con el simple descenso de tempera-
tura. La separacin de molculas de DNA mayores de 25 kb
suele hacerse mediante la tcnica de electroforesis en campo
con pulsos en la que la direccin del campo elctrico en el gel
se cambia en forma peridica, lo que ocasiona que las molcu-
las de DNA se reorienten durante la migracin.
Despus de la electroforesis, los fragmentos de DNA en
el gel se visualizan empapando el gel en una solucin de colo-
rante como bromuro de etidio. ste se intercala en la doble
hlice y hace que las bandas de DNA presenten fluorescencia
cuando se observan con radiacin ultravioleta (fig. 18.34). La
sensibilidad de la electroforesis en gel es tan alta que es posible
separar molculas de DNA o RNA que difieren por un solo
nucletido, una caracterstica que dio origen a un mtodo in-
valuable para la secuenciacin del DNA (pg. 771). Dado que
la rapidez de migracin por un gel tambin puede ser afectada
por la forma de la molcula, es posible usar la electroforesis
para separar molculas con diferente conformacin, como for-
mas circular y lineal o relajada y superenrollada (fig. 10.12).
Separacin de cidos nucleicos
por ultracentrifugacin
La experiencia indica que la estabilidad de una solucin (o
suspensin) depende de los componentes. La crema flota so-
bre la leche cruda, un precipitado fino se asienta en forma
gradual en el fondo del recipiente y una solucin de cloruro de
sodio permanece estable por tiempo indefinido. Muchos fac-
tores determinan si un componente se asienta o no en un
medio lquido, stos incluyen el tamao, forma y densidad de
 fondo de un tubo de centrfuga. Las partculas ms grandes se 761
sedimentan ms rpido que las pequeas de forma y densidad
Clula similares. La tendencia de las molculas a concentrarse du-
rante la centrifugacin se contrarresta por los efectos de la
difusin, que ocasiona que las molculas se redistribuyan de
modo ms uniforme (aleatorio). El desarrollo de las ultracen-
DNA
trfugas permiti generar fuerzas centrfugas de hasta 500 000
veces la fuerza de la gravedad, que son lo bastante grandes para
contrarrestar los efectos de la difusin y hacen que las macro-
Digestin por enzima
de restriccin Fragmentos de DNA
molculas se sedimenten hacia el fondo de un tubo de centr-
fuga. La centrifugacin se realiza en un ambiente casi de vaco
para minimizar la resistencia por friccin. Las molculas de
Hendidura Direccin del movimiento DNA (y RNA) se someten a anlisis extensos mediante tcni-
de los fragmentos de DNA Electroforesis en gel
de mezcla cas que usan la ultracentrfuga. Para el presente propsito, se
de fragmentos durante la electroforesis
de restriccin Solucin amortiguadora consideran dos tcnicas de centrifugacin usadas en el estudio
de cidos nucleicos, que se ilustran en la figura 18.35.

Fragmentos de DNA Sedimentacin por velocidad La rapidez con que una

separados por tamao molcula dada se mueve en respuesta a la fuerza centrfuga es
despus de la
electroforesis su velocidad de sedimentacin. Como esta ltima cambia con la
fuerza centrfuga, una molcula dada se caracteriza por un
Placa de gel Electrodo Cable coeficiente de sedimentacin, que es la velocidad de sedimen-
de agarosa positivo elctrico Suministro
de energa tacin dividida entre la fuerza. En todo el libro se ha aludido
Electrodo
negativo El gel se retira del aparato de electroforesis despus al valor S de diversas macromolculas y sus complejos. La
de separar los fragmentos de DNA por tamao unidad S (o Svedberg, en honor al inventor de la ultracentr-
(los fragmentos ms cortos migran ms rpido)
fuga) equivale a un coeficiente de sedimentacin de 1013 s.
Como la velocidad con la que una partcula se mueve por una
Los fragmentos de DNA columna de lquido depende de varios factores, incluida la
se separan por tamao
forma, la determinacin de los coeficientes de sedimentacin
(a) no proporciona por s sola la masa molecular. Sin embargo,
mientras se trate del mismo tipo de molcula, el valor S pro-
porciona una buena medida del tamao relativo. Por ejemplo,
los tres RNA ribosmicos de E. coli, a saber las molculas de
5S, 16S y 23S, tienen longitudes de 120, 1 600 y 3 200 nucle-
tidos, respectivamente.
En la sedimentacin por velocidad (o por zona de velocidad),
las molculas de cido nucleico se separan segn la longitud
del nucletido (fig. 18.35a). La muestra que contiene la mez-
cla de molculas de cido nucleico se coloca con cuidado como
una capa sobre una solucin que contiene una concentracin
creciente de sacarosa (u otra sustancia adecuada). Este gra-
diente preformado aumenta la densidad (y la viscosidad)
desde la superficie al fondo. Cuando se someten a grandes
(b) fuerzas centrfugas, las molculas se mueven por el gradiente a
una velocidad determinada por su coeficiente de sedimenta-
Figura 18.34 Separacin de fragmentos de restriccin de DNA cin. A mayor coeficiente de sedimentacin, ms lejos se 18.9 Fraccionamiento de cidos nucleicos
por electroforesis en gel. (a) El DNA se incuba con una enzima de mueve la molcula en un periodo determinado de centrifuga-
restriccin, que lo corta en fragmentos (pg. 764). La mezcla de cin. Como la densidad del medio es menor que la de las
fragmentos se introduce en una ranura o foso en una placa de aga- molculas de cido nucleico, aun en el fondo del tubo (alrede-
rosa y se aplica corriente elctrica. Las molculas de DNA con carga dor de 1.2 g/ml para la solucin de sacarosa y 1.7 g/ml para el
negativa emigran hacia el electrodo positivo y se separan por ta- cido nucleico), estas molculas continan su sedimentacin
mao. (b) Todos los fragmentos de DNA que estn presentes en un siempre que el tubo se centrifugue. En otras palabras, la cen-
gel pueden revelarse mediante la inmersin del gel en una solucin trifugacin nunca alcanza el equilibrio. Despus de un periodo
de bromuro de etidio para luego observar el gel con luz ultravioleta.
prescrito, el tubo se retira de la centrfuga, su contenido se
(B:Phillipe Plailly/Science Photo Library/Photo Resear-
chers, Inc.) fracciona (como se muestra en la fig. 18.35c) y se determinan
las posiciones relativas de las diversas molculas. La presencia
de la sacarosa viscosa impide que el tubo se mezcle a causa de
la conveccin o la manipulacin, lo que permite que las mo-
lculas con valor S idntico permanezcan en su sitio en la
la sustancia, as como la densidad y viscosidad del medio. Si un forma de una banda. El valor S de los componentes descono-
componente de una solucin o suspensin es ms denso que el cidos puede establecerse si estn presentes molculas marca-
medio, la fuerza centrfuga determina que se concentre en el doras con un coeficiente de sedimentacin conocido. Las figu-
762 Figura 18.35 Tcnicas de sedimentacin de cido nucleico. (a) Solucin
Separacin de molculas de DNA de diferente tamao por la veloci- de sacarosa Muestra
dad de sedimentacin. El gradiente de densidad de la sacarosa se es-
tablece dentro del tubo (paso 1) al permitir que una solucin de
Sacarosa al 5%
sacarosa de concentracin cada vez mayor drene por la pared del
tubo. Una vez que el gradiente se forma, la muestra se coloca con 1 2 3

cuidado en la parte alta del gradiente (pasos 2 y 3), y el tubo se so- Sacarosa al 20%
mete a centrifugacin (p. ej., 50 000 rpm durante 5 h) como se ilus-
tra en el paso 4. Las molculas de DNA se separan con base en su
Molculas pequeas
tamao (paso 5). (b) Separacin de las molculas de DNA por sedi- de DNA 5 4
mentacin de equilibrio con base en las diferencias en la composi-
cin. La muestra de DNA se mezcla con la solucin de CsCl (paso Molculas medianas
1) y se somete a centrifugacin prolongada (p. ej., 50 000 rpm du- de DNA
rante 72 h). El gradiente de CsCl se forma durante la centrifugacin Molculas grandes
(paso 2) y las molculas de DNA forman bandas en regiones de de DNA
densidad equivalente (paso 3). (c) El tubo del experimento b se pun- (a)
ciona y se permite que el contenido gotee a tubos sucesivos, lo que
fracciona el contenido del tubo. Se mide la absorbancia de la solu-
cin en cada fraccin y se grafica como se muestra.

1 2 3

ras 11.13 y 11.17 muestran los resultados experimentales

obtenidos mediante la centrifugacin con gradiente de densi- 1.65 g/ml CsCl
dad de sacarosa. Molculas de DNA ricas en AT

Molculas de DNA ricas en GC

Centrifugacin de equilibrio En el otro tipo de tcnica de
centrifugacin, la centrifugacin de equilibrio (o isopcnica) (fig. 1.75 g/ml CsCl
18.35b), las molculas de cido nucleico se separan segn su (b)
densidad de flotacin. Por lo general en este procedimiento se
utiliza una solucin muy concentrada de la sal del metal pe-
sado cesio. El anlisis se inicia con la mezcla del DNA con la
solucin de cloruro de cesio o sulfato de cesio en el tubo de
lacentrfuga para luego someter el tubo a centrifugacin pro-
longada (p. ej., dos a tres das con fuerzas altas). Durante la 1.65 g/ml CsCl
centrifugacin los iones pesados de cesio se dirigen despacio
Molculas de DNA ricas en AT
hasta el fondo del tubo y forman un gradiente de densidad
continuo en toda la columna de lquido. Despus de cierto Molculas de DNA ricas en GC
tiempo la tendencia de los iones de cesio a concentrarse hacia
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular

1.75 g/ml CsCl

el fondo del tubo se contrarresta con la tendencia contraria
para redistribuirse por difusin, y el gradiente se estabiliza.
Conforme el gradiente de cesio se forma, las molculas indivi-
Absorbancia (O.D.) a 260 nm

duales de DNA se impulsan hacia abajo o se mueven por flo-

tacin hacia arriba en el tubo, hasta que llegan a una posicin
con una densidad de flotacin equivalente a la propia, mo-
mento en el que ya no experimentan ms movimiento. Las
molculas condensidad equivalente forman bandas angostas
dentro del tubo (fig. 18.41). Esta tcnica es lo bastante sensi-
ble para separar molculas de DNA con diferente composi-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
cin de bases (como se ilustra en la fig. 18.35b) o las que tie-
Fondo Nmero de fraccin Arriba
nen distintos istopos de nitrgeno (15N contra 14N, como se
(c)
muestra en la fig. 13.3b).

18.10 | Hibridacin de cido complementaria pueden formar un hbrido de doble cadena.

nucleico
La hibridacin de cido nucleico comprende varias tcnicas
relacionadas basadas en la observacin de que dos molculas
de cido nucleico de cadena sencilla con secuencia de bases
Considrese una situacin en la que se tiene una mezcla de
cientos de fragmentos de DNA de longitud y composicin
general de bases idnticas que slo difieren unos de los otros
por su secuencia de bases. Por ejemplo, asmase que uno de los
fragmentos de DNA constituye una porcin del gen para la
globina beta y el resto contiene genes no relacionados. La
nica manera de distinguir entre el fragmento que codifica el
polipptido globina beta y todos los dems es realizar un ex-
perimento de hibridacin molecular con molculas comple-
mentarias como sondas.
En el presente ejemplo la incubacin de la mezcla de
fragmentos de DNA desnaturalizados con una cantidad exce-
siva de mRNA para globina beta llevara a los fragmentos de
globina a formar hbridos DNA-RNA bicatenarios, mientras
los dems fragmentos de DNA son monocatenarios. Los h-
bridos DNA-RNA podran separarse de los fragmentos de
cadenas sencillas en varias formas. Por ejemplo, la mezcla po-
dra pasarse por una columna de hidroxiapatita bajo condicio-
nes inicas en las que los hbridos se unieran con las sales de
fosfato de calcio de la columna, mientras que las molculas
deDNA sin hibridar pasaran sin unirse. Entonces los hbri-
dos de la columna podran liberarse mediante el incremento
en la concentracin del amortiguador de lavado.
Los experimentos que usan hibridacin de cidos nuclei-
cos requieren la incubacin de dos poblaciones de cidos nu-
cleicos complementarios de cadena sencilla en condiciones
(fuerza inica, temperatura, etc.) que promuevan la formacin
de molculas de cadena doble. Segn el tipo de experimento
realizado, las dos poblaciones de molculas en reaccin po-
dran estar presentes en solucin, o una poblacin podra in-
movilizarse, por ejemplo, por la localizacin dentro de un cro-
mosoma (como en la fig. 10.19).
En muchos casos una de las poblaciones de cidos nuclei-
cos de cadena sencilla que se emplea en el experimento de
Gel electrofortico
Fragmento de DNA
Peso
Placa
de vidrio
Membrana
de
nitrocelulosa
Amortiguador
de transferencia
Gel electrofortico Procesamiento de manchado
que contiene segmentos (blotting) para transferencia
fraccionados de DNA. del DNA del gel a la
El DNA es de una sola membrana de nitrocelulosa
cadena (desnaturalizado)
por el tratamiento
con lcalis
Figura 18.36 Identificacin de la localizacin de fragmentos de
DNA especficos en un gel por el mtodo Southern blot. Como se
describe en la figura, los fragmentos fraccionados de DNA se desna-
turalizan y transfieren a una membrana de nitrocelulosa, que se in-
cuba con sondas de DNA (o RNA) con marca radiactiva o
fluorescente. El sitio de los fragmentos hibridados se conoce auto-
hibridacin se encuentra dentro de un gel. Considrese una 763
poblacin de fragmentos de DNA que se prepararon a partir
de DNA genmico y se fraccionaron por electroforesis en gel
(fig. 18.36). Para llevar a cabo la hibridacin, el gel se trata a
fin de hacer al DNA monocatenario; ste se transfiere enton-
ces del gel a una membrana de nitrocelulosa y se fija en la
membrana por calentamiento a 80C en vaco. El procedi-
miento por el que se transfiere DNA a la membrana se deno-
mina transferencia (manchado). Una vez que el DNA se une, la
membrana se incuba con una sonda de DNA (o RNA) de
cadena sencilla y con marca radiactiva capaz de formar hbri-
dos con un grupo complementario de fragmentos. Luego
laradiactividad libre se elimina y la localizacin de la sonda
unida se determina por autorradiografa, como se muestra en
la figura 18.36. El experimento recin descrito mostrado
endicha figura se conoce como mtodo Southern (en honor
de Edwin Southern, su creador). Con el mtodo de transfe-
rencia de Southern pueden identificarse uno o unos cuantos
fragmentos de restriccin de DNA que contienen una secuen-
cia particular de nucletidos, aun si el gel contiene miles de
fragmentos no relacionados. La figura 10.18 presenta un
ejemplo de transferencia por Southern. Las molculas de
RNA tambin pueden separarse por electroforesis e identifi-
carse con una sonda marcada de DNA despus de transferirse
a una membrana. La figura 11.35 ilustra un ejemplo de este
procedimiento, llamado mtodo Northernblot.
Las sondas de DNA pueden etiquetarse de varias mane-
ras. Una sonda radiactiva incorpora un istopo radiactivo
(como 32P) en uno o ms sitios de la molcula. La presencia de
Sondas marcadas de DNA o RNA
Membrana de Autorradiografa
nitrocelulosa
Pila de
tollas
de papel
Gel
electro-
fortico
Esponja
18.10 Hibridacin de cido nucleico
Membrana Incubar la membrana Autorradiografa
de nitrocelulosa con sondas marcadas que muestra
con fragmentos de DNA o RNA la localizacin
de DNA adsorbidos para permitir la de los fragmentos
despus de tratamiento hibridacin, luego de DNA complementarios
con calor que fija lavar y preparar la de la sonda marcada
el DNA en la membrana autorradiografa
radiogrficamente (o con microscopia si las sondas fueron marcadas
con tincin fluorescente). Durante el procedimiento de transferencia
(blotting), la accin capilar atrae el amortiguador hacia arriba a las
toallas de papel. Conforme el amortiguador se mueve por el gel elec-
trofortico, disuelve los fragmentos de DNA y los transfiere a la su-
perficie de la membrana adyacente.
764 la sonda se detecta por autorradiografa, como se muestra en la
figura 18.36. Las sondas tambin pueden etiquetarse con fluo-
rforos y detectarse por fluorescencia. Otra etiqueta de uso
comn es la biotina, una molcula orgnica pequea que
puede unirse de manera covalente al esqueleto de DNA. La
biotina es detectada por la protena avidina (o por estreptavi-
dina), que se une a ella con fuerza. La avidina misma, debe
marcarse para la deteccin, por ejemplo con un fluorforo
como se muestra en las figuras 10.19 y 10.20.
La hibridacin de cido nucleico tambin puede propor-
cionar una medida de la similitud en la secuencia de nucleti-
dos entre dos muestras de DNA, como podra obtenerse de
dos organismos distintos, por ejemplo. Entre ms distante sea
la relacin evolutiva entre las dos especies, mayor es la diver-
gencia en sus secuencias de DNA. Si los DNA purificados de
las especies A y B se mezclan juntos, se desnaturalizan y se
permite que forme hlices de nuevo, un porcentaje de las ca-
denas dobles de DNA se forman con cadenas de DNA de las
dos especies. Como contienen bases discrepantes, estas cade-
nas dobles son menos estables que las formadas con cadenas
de DNA de la misma especie y la inestabilidad se refleja en la
menor temperatura en la que se disuelven. Cuando se permite
que DNA de distintas especies, formen de nuevo hlices do-
bles en diferentes combinaciones, la temperatura de fusin
(Tm, pg. 400) de las cadenas dobles hbridas proporciona una
medida de la distancia evolutiva entre los organismos. Dos
tipos importantes ms de protocolos de hibridacin de cidos
nucleicos se describen con detalle en el texto: la hibridacin in
situ en la pgina 402 y la hibridacin en microarreglos de cDNA
en la pgina 515.
18.11 | Sntesis qumica
de DNA
En el anlisis de hibridacin es necesario el uso de molculas
de cido nucleico monocatenarias como sondas. Otras tcni-
cas fundamentales para la manipulacin y el anlisis de DNA
en el laboratorio tambin requieren de molculas de cido
nucleico monocatenarias cortas, u oligonucletidos. La snte-
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
sis qumica de DNA y RNA es, por lo tanto, una tecnologa de
apoyo clave para muchos procedimientos.
El desarrollo de tcnicas qumicas para la sntesis de po-
linucletidos con una secuencia de bases especfica fue ini-
ciado por H. Gobind Khorana a principios del decenio de
1960 como parte de un intento de descifrar el cdigo gentico.
Khorana y col. siguieron depurando sus tcnicas, y una dcada
despus de su trabajo inicial con el cdigo, tuvieron xito en
sintetizar un gen de tRNA para tirosina bacteriana, incluida la
regin promotora no transcrita. El gen, que totalizaba 126
pares de bases, fue ensamblado a partir de ms de 20 segmen-
tos, que se sintetizaron de forma individual y luego se unieron
por medios enzimticos. Estos genes artificiales se introduje-
ron luego en clulas bacterianas que portaban mutaciones para
este tRNA, y el DNA sinttico fue capaz de restablecer la
funcin hasta entonces deficiente. El primer gen sintetizado
por medios qumicos que codificaba una protena de tamao
promedio, el interfern humano, se ensambl en 1981, en un
esfuerzo que requiri la sntesis y el ensamblaje de 67 frag-
mentos distintos para producir un solo dplex de 514 pares de
bases el cual contena seales de inicio y trmino reconocidas
por la RNA polimerasa bacteriana.
Las reacciones qumicas que unen nucletidos se han au-
tomatizado, y en la actualidad la sntesis de oligonucletidos se
realiza mediante mquinas controladas por computadora co-
nectadas a depsitos de reactivos. El operario teclea en la com-
putadora la secuencia de nucletidos deseada y mantiene una
dotacin de los materiales en el instrumento. El oligonucle-
tido se ensambla un nucletido a la vez desde el extremo 3 al
5 de la molcula, hasta un total de alrededor de 100 nucleti-
dos. Es posible incorporar en las molculas modificadores como
biotina y fluorforos. Si se requiere una molcula de doble ca-
dena, se sintetiza como dos cadenas complementarias que pue-
den unirse entre s por hibridacin. Las molculas sintticas de
mayor longitud se elaboran en segmentos que se unen, como se
ilustra en el experimento sealado en la pgina 19.
18.12 | Tecnologa de DNA
recombinante
En los ltimos 30 aos se realizaron grandes avances en el
anlisis de los genomas eucariotas. Este progreso comenz
cuando los bilogos moleculares aprendieron a construir mo-
lculas de DNA recombinante, que son molculas que con-
tienen secuencias de DNA derivadas de ms de una fuente. El
DNA recombinante puede usarse en diversas formas. Para
empezar se considera una de las aplicaciones ms importantes:
el aislamiento del genoma de un segmento particular de DNA
que codifica un polipptido determinado. No obstante, es ne-
cesario considerar primero una clase de enzimas cuyo descu-
brimiento y uso han hecho posible la formacin de molculas
de DNA recombinante.
Endonucleasas de restriccin
Durante el decenio de 1970 se encontr que las bacterias con-
tenan nucleasas que reconocan secuencias cortas de nucle-
tidos dentro de un DNA doble y dividan la columna central
de DNA en sitios especficos en ambas cadenas de la hlice
doble. Tales enzimas se conocen como endonucleasas de res-
triccin tipo II o slo enzimas de restriccin. Reciben este nom-
bre porque en las bacterias funcionan para destruir el DNA
viral que pudiera entrar a la clula, lo que restringe el creci-
miento de los virus. La bacteria protege su propio DNA del
ataque ltico mediante la metilacin de las bases en los sitios
susceptibles, una modificacin qumica que bloquea la accin
de la enzima.
Se han aislado enzimas de varios cientos de organismos
procariotas distintos que, en conjunto, reconocen ms de 100
secuencias de nucletidos diferentes. Las secuencias que la
mayor parte de las enzimas reconoce miden cuatro a seis nu-
cletidos de largo y se caracterizan por un tipo particular de
simetra interna. Considrese la secuencia particular recono-
cida por la enzima EcoR1:
3 CTTAAG 5
5 GAATTC 3
Se dice que este segmento de DNA tiene simetra rotatoria
doble porque puede girarse 180 sin que la secuencia de bases
cambie. Por lo tanto, si la secuencia se lee en la misma direc-
cin (3 a 5 o 5 a 3) en cualquiera de las cadenas se encuen-
tra el mismo orden de bases. Una secuencia con este tipo de
simetra se llama palndromo. Cuando la enzima EcoR1 ataca
este palndromo, rompe cada cadena en el mismo sitio de la
secuencia, indicado con las flechas entre los residuos A y G.
Los puntos rojos sealan las bases metiladas de esta secuencia
que protegen el DNA del hospedador contra el ataque enzi-
mtico. Algunas enzimas de restriccin cortan enlaces opues-
tos entre s en ambas cadenas, lo que produce extremos romos,
mientras que otras, como EcoR1, hacen cortes escalonados.
El descubrimiento y la purificacin de las enzimas de
restriccin son invaluables en los avances logrados por los bi-
logos moleculares durante los ltimos aos. Puesto que es muy 765
frecuente que una secuencia particular de cuatro a seis nucle-
tidos se produzca por casualidad, cualquier tipo de DNA es
susceptible a la fragmentacin por estas enzimas. El uso de las
enzimas de restriccin permite disecar el DNA del genoma
humano, o de cualquier otro organismo, en un conjunto bien
definido de fragmentos especficos. Una vez que el DNA de
un individuo particular se digiere con una de estas enzimas, los
fragmentos obtenidos pueden seccionarse con base en su lon-
gitud por electroforesis en gel (como en la fig. 18.37a). Las
diferentes enzimas separan la misma preparacin de DNA en
conjuntos distintos de fragmentos y los sitios dentro del ge-
noma que las diversas enzimas separan pueden identificarse y

ORIGEN ORIGEN Figura 18.37 Construccin de un

mapa de restriccin del genoma circu-
lar pequeo del virus tumoral de
DNA del polioma. (a) Autorradiogra-
fas de fragmentos de DNA marcados
Hpall - 1 con 32P que se sometieron a electrofo-
Hpall - 2 resis en gel. El gel del lado izquierdo
muestra el patrn de los fragmentos de
Hpall - 3 DNA obtenidos despus de la diges-
Hpall - 4 tin completa del genoma de polioma
con la enzima HpaII. Para determinar
B cmo se renen estos ocho fragmentos
A para conformar el genoma intacto es
Hpall - 5 necesario tratar el DNA de tal manera
C que se genere superposicin de frag-
Hpall - 6
mentos que puede producirse me-
D diante el tratamiento del genoma
Hpall - 7 intacto con una segunda enzima que
Hpall - 1+F
E divide la molcula en sitios diferentes
Hpall - 1+G o por el tratamiento del genoma con la
H
I misma enzima en condiciones distin-
Hpall - 2 K tas en las que el DNA no se digiera
por completo como sucedi en el gel
Hpall - 3 J de la izquierda. Las dos muestras de la
Hpall - 8 derecha representan ejemplos de di-
gestiones parciales del genoma del po-
Hpall - 4 lioma con HpaII. El gel central
muestra los fragmentos generados por
AZUL la digestin parcial del DNA circular
sper helicoidal y el gel de la derecha
muestra los fragmentos HpaII forma-
dos despus que el genoma circular se 18.12 Tecnologa de DNA recombinante
convierte en una molcula lineal por
(a)
accin de EcoR1 (una enzima que slo
hace un corte en el crculo). (b) Mapa
EcoR I 25 50 75 de restriccin del genoma de polioma
alineado con base en la divisin hecha
HpaII HpaII HpaII con HpaII. Se ilustran los ocho frag-
HpaII 2 6 HpaII 1 HpaII 3 5 HpaII 4 8 7 mentos de la digestin completa junto
con el DNA en la parte superior. Los
C L fragmentos superpuestos de la diges-
D I M tin parcial se muestran en su disposi-
F H cin ordenada por debajo del mapa.
B J (Los fragmentos L y M migran al
fondo del gel en la parte a, lado dere-
A A
cho.) (Tomada de Beverly E.
E E
Griffin, Mike Fried y Allison
G G
Cowie, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 71:2078, 1974.)
(b)
766 ordenarse en un mapa de restriccin, como el que se muestra
en la figura 18.37b.
Formacin de DNA recombinante
Los DNA recombinantes pueden formarse de varias maneras.
En el mtodo que se muestra en la figura 18.38 las molculas
de DNA de dos fuentes distintas se tratan con una enzima de
restriccin que hace cortes escalonados en la cadena doble
de DNA. Los cortes escalonados dejan colas cortas de una
sola cadena que actan como extremos adherentes que pue-
den unirse con una cola complementaria de una cadena en
otra molcula de DNA para restaurar una molcula de cadena
doble. Uno de los fragmentos de DNA que formarn la mo-
Plsmido Cromosoma
bacteriano humano
La misma enzima de restriccin
corta ambos tipos de DNA
A AATT
A A
TT A A
A
TT
TT
El fragmento de DNA humano se une con el plsmido
por los extremos adherentes; las muescas
se sellan por accin enzimtica
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
Plsmido
Figura 18.38 Formacin de una molcula de DNA recombi-
nante. En este ejemplo una preparacin de plsmidos bacterianos se
trata con una enzima de restriccin que hace un solo corte dentro de
cada plsmido bacteriano. Dicha enzima se utiliza para fragmentar
una preparacin de DNA genmico humano en pequeos fragmen-
tos. Como se trataron con la misma enzima de restriccin, el DNA
del plsmido dividido y los fragmentos de DNA humano tienen ex-
tremos adherentes. Cuando estas dos poblaciones se incuban juntas,
las dos molculas de DNA se unen en forma covalente entre s y
luego se sellan tambin en forma covalente con la ligasa de DNA,
para formar una molcula de DNA recombinante.
lcula recombinante es un plsmido bacteriano como es el
caso mostrado en la figura 18.38. Los plsmidos son pequeas
molculas circulares de DNA de cadena doble que se separan
del cromosoma bacteriano principal. El otro fragmento de
DNA de la figura 18.38 se obtiene de clulas humanas des-
pus del tratamiento con la misma enzima de restriccin em-
pleada para abrir el plsmido. Cuando los fragmentos de
DNA humano y el plsmido tratado se incuban juntos en
presencia de DNA ligasa, los dos tipos de DNA se unen entre
s mediante enlaces de hidrgeno por sus extremos adherentes
y luego se ligan para formar recombinantes de DNA circulares,
como en la figura 18.38. Paul Berg, Herbert Boyer, Annie
Chang y Stanley Cohen, de la Stanford University y de la Ca-
lifornia University, en San Francisco, formaron las primeras
molculas de DNA recombinante con este mtodo bsico en
1973, con lo que marcaron el nacimiento de la ingeniera ge-
ntica moderna.
Con el procedimiento recin descrito se produce una gran
cantidad de molculas recombinantes distintas, cada una de
las cuales contiene un plsmido bacteriano con un DNA hu-
mano incorporado en su estructura circular (fig. 18.39). Su-
pngase que se tiene inters en aislar un solo gen del genoma
humano, por ejemplo, el que codifica la insulina. Como el
objetivo es obtener una preparacin purificada del tipo de
DNA recombinante que contiene el fragmento que codifica la
insulina, dicho fragmento debe separarse de todos los dems.
Esto se hace mediante un proceso llamado clonacin de DNA.
Se regresar a la investigacin del gen de la insulina despus
de describir la metodologa que permite la clonacin de DNA.
Clonacin de DNA
La clonacin de DNA es una tcnica que produce grandes
cantidades de un segmento de DNA especfico. El segmento
de DNA que se clona se une primero con un DNA vector, que
es un vehculo para transportar el DNA extrao a una clula
hospedadora adecuada, como la bacteria E. coli. El vector con-
tiene secuencias que le permiten replicarse dentro de la clula
hospedadora. A menudo se utilizan dos tipos de vectores para
clonar DNA dentro de hospedadores bacterianos. En una de
las tcnicas el segmento de DNA que va a clonarse se intro-
duce en la clula bacteriana mediante la unin de ste con un
plsmido, como se describi antes, para luego inducir a la c-
lula bacteriana a captar el plsmido del medio. En una tcnica
alternativa el segmento de DNA se une con una porcin del
genoma del virus bacteriano lambda (), que luego se permite
que infecte un cultivo de clulas bacterianas para producir
gran cantidad de virus, cada uno de los cuales contiene el seg-
mento ajeno de DNA. De cualquier manera una vez que el
segmento de DNA est dentro de una bacteria, se replica
junto con el DNA bacteriano (o viral) y se reparte en las clu-
las hijas (o partculas virales producidas). Por lo tanto, el n-
mero de molculas de DNA recombinante aumenta en pro-
porcin con el nmero de clulas bacterianas (o progenie viral)
que se forman. De un solo plsmido recombinante o genoma
viral dentro de una sola clula bacteriana pueden formarse
millones de copias del DNA en un periodo corto. Una vez que
la cantidad de DNA se amplific lo suficiente, el DNA re-
combinante puede purificarse y usarse en otros procedimien-
tos. Adems de proporcionar un medio para amplificar la can-
tidad de una secuencia de DNA particular, la clonacin
tambin es til para aislar una forma pura de cualquier seg-
mento de DNA en una poblacin grande y heterognea de 767
molculas de DNA. Se comenzar con la descripcin de la
clonacin de DNA en plsmidos bacterianos.
Cromosoma
de E. coli
Clonacin de DNA eucariota en plsmidos bacteria-
Plsmido
nos El DNA ajeno que va a clonarse se inserta primero en el
plsmido para formar una molcula de DNA recombinante.
Los plsmidos que se utilizan para la clonacin de DNA son Gen de resistencia
a antibitico
versiones modificadas de los que se encuentran en las clulas
bacterianas. Como sus contrapartes naturales de las que pro-
vienen, estos plsmidos contienen un origen de replicacin y
uno o ms genes que convierten a la clula receptora resistente
a uno o ms antibiticos. La resistencia a los antibiticos per- Purificar Purificar DNA
mite a los investigadores seleccionar las clulas que contienen DNA humano del plsmido
el plsmido recombinante.
Como lo demostraron Avery, Macleod y McCarty por
primera vez (pg. 422), las clulas bacterianas pueden captar
DNA de su medio. Este fenmeno establece la base para la
clonacin de plsmidos en las clulas bacterianas (fig. 18.39).
En la tcnica ms usual los plsmidos recombinantes se agre- Tratar con EcoR1
para cortar el DNA
gan a un cultivo bacteriano que se trat antes con iones de humano y el bacteriano
calcio. Cuando se someten a un breve choque de calor, tales en fragmentos
bacterias se estimulan para que capten DNA del medio. Por lo
general slo un pequeo porcentaje de clulas es competente
para captar y retener una de las molculas de plsmido recom-
binantes. Una vez que se capta, el plsmido se replica en forma
autnoma en la clula receptora y se pasa a la progenie durante Unir fragmentos
en DNA
la divisin celular. Las bacterias que contienen un plsmido recombinantes
recombinante pueden seleccionarse de entre otras mediante el con DNA ligasa
crecimiento de las clulas en presencia del antibitico al que es
resistente el gen en el plsmido.
Esta descripcin se inici con el objetivo de aislar un pe- Poblacin de plsmidos
que contienen segmentos
queo fragmento de DNA que contiene la secuencia para el diferentes de DNA humano
gen de la insulina. Hasta este punto se ha formado una pobla- Incubar clulas de E. coli
cin de bacterias que contienen muchos plsmidos recombi- bajo condiciones
nantes distintos, muy pocos de los cuales albergan el gen que en las que capten los
se busca (como en la fig. 18.39). Uno de los mayores beneficios plsmidos del medio.
Cultivar clulas en un medio
de la clonacin del DNA consiste en que, adems de producir E. coli sin plsmido
que seleccione las
grandes cantidades de molculas particulares de DNA, per- que contienen un
mite separar los diferentes DNA de una mezcla. Antes se plsmido recombinante
mencion que las bacterias que contienen plsmidos pueden
seleccionarse entre aquellas sin plsmidos mediante el trata-
miento con antibiticos. Una vez que esto se realiza, las clulas
que tienen el plsmido pueden crecer a bajas densidades en
cajas de Petri de manera que la progenie de cada clula (un
clon de clulas) permanece separada de la progenie de otras 18.12 Tecnologa de DNA recombinante
clulas. Como una gran cantidad de plsmidos recombinantes
diferentes estaban al principio en el medio, las distintas clulas
colocadas en la caja contienen diferentes fragmentos de DNA Gen de insulina ? ? ? Gen de RNA ?
ajenos. Una vez que las clulas que contienen varios plsmidos ribosmico
crecen en colonias separadas, el investigador puede buscar en Figura 18.39 Ejemplo de clonacin de DNA con plsmidos
las colonias las pocas que contienen el gen que busca, en este bacterianos. El DNA se extrae de clulas humanas, se fragmenta
caso el gen de insulina. con EcoR1 y los fragmentos se insertan en una poblacin de
Las cajas de cultivo que contienen colonias bacterianas (o plsmidos bacterianos. Se cuenta con tcnicas para prevenir la
placas de fagos) se revisan para detectar la presencia de una formacin de plsmidos que carecen del inserto de DNA ajeno. Una
secuencia de DNA particular con tcnicas combinadas de cha- vez que la clula bacteriana capt un plsmido recombinante del
pado de rplica e hibridacin in situ. Como se ilustra en la figura medio, la clula da origen a una colonia de clulas que contienen la
18.40a, el chapado de la rplica permite preparar muchas cajas molcula de DNA recombinante. En este ejemplo la mayor parte de
con representantes de las mismas colonias bacterianas en el las bacterias contiene DNA de eucariotas con funcin desconocida
(marcados como ?), mientras que uno contiene una porcin del
mismo sitio preciso de cada caja. Una de las placas rplica se
DNA que codifica RNA ribosmico y otro contiene DNA que
usa luego para localizar la secuencia de DNA que se busca (fig. codifica insulina.
18.40b), un procedimiento que requiere que las clulas se des-
768

Figura 18.40 Localizacin de una colonia bacteriana que con-

tiene una secuencia deseada de DNA por rplica en placa e hibri-
dacin in situ. (a) Una vez que las clulas bacterianas se colocaron
en placas en medios de cultivo y que proliferaron, la caja se invierte
sobre un trozo de papel filtro y se permite que algunas de las clulas
de cada colonia se adsorban al papel. Se inoculan placas de cultivo
vacas al presionarlas contra el papel filtro a fin de reproducir rpli-
Papel filtro
estril o terciopelo cas de las placas. (b) procedimiento para revisar las clulas de una
placa de cultivo en busca de las colonias que contengan el DNA re-
combinante de inters. Los cultivos se pueden rastrear con sondas
marcadas con elementos radiactivos o fluorescentes. Una vez que las
colonias relevantes se identifican, las clulas pueden retirarse de la
placa original y cultivarse por separado para obtener grandes canti-
(a) dades de los fragmentos buscados de DNA.

Caja de cultivo con colonias

bacterianas (o placas de fagos) Posicin del
que contienen DNA recombinante hbrido marcado

Transferir clulas Destruir clulas Incubar con

Colonia bacteriana representativas a Colonia y tratar para DNA desnaturalizado sonda marcada
la membrana bacteriana desnaturalizar el DNA adherido a con elementos
de nitrocelulosa y hacer que el DNA la membrana radiactivos
mediante tcnica monocatenario se adhiera o fluorescentes
(b) de rplica en placa al filtro en su sitio

truyan y el DNA se fije en la superficie de una membrana de

nylon o nitrocelulosa. Una vez que el DNA se fija, se desnatu-
raliza como preparacin para la hibridacin in situ, durante la
cual la membrana se incuba con una sonda de DNA de cadena
sencilla marcada que contiene la secuencia complementaria de
la que se busca. Despus de la incubacin, la sonda que no
form hbridos se lava de la membrana y la localizacin de los
hbridos marcados se identifica mediante autorradiografa.
Los representantes vivos de los clones identificados pueden
encontrarse en sitios correspondientes en las placas origina-
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular

lesy es posible cultivar estas clulas para obtener colonias ms

Figura 18.41 Separacin del DNA del plsmido del cromosoma
bacteriano principal mediante centrifugacin de equilibrio con
CsCl. Puede verse que este tubo de centrifugacin contiene dos
bandas, una de DNA del plsmido que tiene un segmento de DNA
ajeno que se clon dentro de las bacterias y la otra contiene DNA
cromosmico de estas mismas bacterias. Los dos tipos de DNA se
separaron durante la centrifugacin (fig. 18.35b). El investigador
retira el DNA del tubo con aguja y jeringa. El DNA del tubo se
hace visible con el compuesto de unin al DNA bromuro de etidio,
que produce fluorescencia bajo luz ultravioleta. (Ted Speigel/
Corbis.)
grandes, lo que sirve para amplificar el plsmido de DNA re-
combinante.
Tras alcanzar la amplificacin deseada, se cosechan las
clulas, se extrae el DNA y el DNA de plsmido recombi-
nante se separa con facilidad del cromosoma mucho ms
grande por medio de varias tcnicas, entre ellas la centrifuga-
cin de equilibrio (fig. 18.41). Los plsmidos recombinantes
aislados pueden tratarse luego con la misma enzima de restric-
cin que se emple en su formacin, lo que libera los segmen-
tos clonados de DNA del resto del DNA que sirvi como
vector. Entonces el DNA clonado puede separarse del pls-
mido por centrifugacin.
Clonacin de DNA eucariota en genomas de fagos Otro
vector de clonacin importante es el bacterifago lambda, que
se muestra en la figura 18.42. El genoma de lambda es una
molcula lineal de DNA de cadena doble de unas 50 kb de
largo. La cepa modificada que se utiliza en la mayor parte
delos experimentos de clonacin contiene dos sitios de divi-
sin para la enzima EcoR1, la cual fragmenta el genoma en
tres segmentos grandes. De manera conveniente toda la infor-
 bacteriano en el sitio de infeccin. Cada placa contiene millo- 769
Mutante
cuyo DNA
nes de partculas de fago, cada una con una sola copia del
contiene dos mismo fragmento de DNA eucariota.
sitios EcoR1 El fragmento lambda es atractivo como vector de clona-
cin por muchas razones: (1) el DNA se empaca bien en una
Extraer DNA, forma en la que es fcil de almacenar y extraer, (2) todo fago
tratar con que contenga un DNA recombinante es capaz de infectar una
EcoR1 clula bacteriana y (3) una sola caja de Petri puede contener
ms de 100 000 placas diferentes. Luego que las placas de fa-
gos se forman, el fragmento particular de DNA que se busca
se identifica mediante un proceso similar de rplica en placa e
1 2 3
hibridacin in situ descrito en la figura 18.40 para la clonacin
de los plsmidos recombinantes. La clonacin en bacteria
Separar (como BAC) o en levadura (como YAC) de DNA de mayor
fragmentos,
descartar el
tamao se explica en la pgina 774.
segmento
intermedio
18.13 | Amplificacin enzimtica
1 3
de DNA por reaccin
Intercalar con
fragmentos en cadena de la polimerasa
de eucariota
En 1983 Kary Mullis de Cetus Corporation concibi una nueva
( )
tcnica que ahora se emplea mucho para amplificar fragmen-
tos especficos de DNA sin la necesidad de clulas bacterianas.
DNA recombinante Esta reaccin se conoce como reaccin en cadena de la poli-
merasa (PCR, polymerase chain reaction). Muchos protocolos
Empaque de DNA
recombinante
diferentes de PCR se usan para una multitud de aplicaciones
en una cabeza en las que es posible amplificar desde uno hasta una gran po-

18.13 Amplificacin enzimtica de DNA por reaccin en cadena de la polimerasa

de fago
Infectar bacteria
hospedadora
Prado Placa de clara
bacteriano de fagos
Caja de cultivo
Figura 18.42 Protocolo para la clonacin de fragmentos de
DNA eucariota en un fago lambda. Los pasos se describen en el
texto.
macin esencial para la infeccin y la lisis celular est conte-
nida en los dos segmentos exteriores, por lo que el fragmento
dispensable del centro puede reponerse con un fragmento de
DNA de hasta unas 25 kb. Las molculas de DNA recombi-
nante pueden empacarse en cabezas de fagos in vitro y estas
partculas de fago creadas por ingeniera gentica pueden
usarse para infectar bacterias hospedadoras. (Las molculas de
DNA de fago que carecen del inserto son demasiado cortas
para empacarse.) Una vez en la bacteria, el DNA eucariota se
amplifica junto con el DNA viral y luego se empaca en una
nueva generacin de partculas virales que se liberan cuando la
clula se destruye. Las partculas liberadas infectan nuevas c-
lulas y pronto se ve una mancha clara (o placa) en el prado
blacin de DNA relacionados. La amplificacin por PCR es
fcil de adaptar a los moldes de RNA si primero se les con-
vierte en DNA complementarios, con transcriptasa inversa.
La figura 18.43 muestra el procedimiento bsico que se
utiliza en la PCR. La tcnica emplea una polimerasa de DNA
termoestable llamada polimerasa Taq, que al principio se aisl
de Thermus aquaticus, una bacteria que vive en manantiales
calientes a temperaturas mayores de 90C. En el protocolo
ms sencillo, una muestra de DNA se mezcla con una alcuota
de polimerasa Taq y los cuatro desoxirribonucletidos, junto
con un gran exceso de dos fragmentos sintticos cortos de
DNA (oligonucletidos) que son complementarios de las se-
cuencias de DNA en los extremos 3 de la regin del DNA
que va a amplificarse. Los oligonucletidos sirven como ceba-
dores (iniciadores) (pg. 550) a los que se agregan los nucle-
tidos durante los pasos siguientes de replicacin. Luego la
mezcla se calienta a unos 95C, que es lo bastante caliente
para hacer que las molculas de DNA de la muestra se separen
en sus dos cadenas componentes. A continuacin la mezcla se
enfra a unos 60C para permitir que los cebadores se unan
con las cadenas del DNA blanco y la temperatura se eleva de
nuevo a 72C para que la polimerasa termoflica agregue nu-
cletidos al extremo 3 de los cebadores. Conforme la polime-
rasa extiende el cebador, copia de manera selectiva el DNA
blanco y forma nuevas cadenas de DNA complementario. La
temperatura se eleva de nuevo, lo que hace que las cadenas de
DNA recin formadas y las originales se separen. En seguida
se enfra la muestra para permitir que los cebadores sintticos
de la muestra se unan de nuevo con el DNA blanco, que ahora
est presente en una cantidad dos veces mayor que la original.
Este ciclo se repite una y otra vez, y en cada ronda se duplica
la cantidad de la regin especfica del DNA que est flan-
queado por los cebadores unidos. Pueden generarse billones
de copias de esta regin especfica en unas cuantas horas con
770
La mezcla de reaccin contiene DNA blanco
la secuencia de DNA blanco
que va a amplificarse, dos 1 copia
cebadores (P1 y P2) y P1 P2
polimerasa resistente al calor
Polimerasa resistente al calor
La mezcla de reaccin se
calienta para separar cadenas
de DNA blanco. El enfriamiento
posterior permite que los
cebadores se unan con las
Primer ciclo

secuencias complementarias Nueva cadena de DNA

de DNA blanco

La polimerasa extiende las cadenas

complementarias a partir
de los cebadores

2 copias
idnticas
El primer ciclo de sntesis
produce dos copias de
la secuencia de DNA blanco

Las cadenas separadas de DNA

se unen con cebadores
Segundo ciclo

Cadenas nuevas
de DNA extendidas
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular

4 copias
El segundo ciclo de sntesis idnticas
produce cuatro copias de
la secuencia de DNA blanco

Figura 18.43 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Como se explica en el texto, el procedimiento emplea la poli-
16
merasa de DNA resistente al calor, cuya actividad no se elimina cuando la temperatura se eleva para separar dos cadenas de
la doble hlice. Con cada ciclo de duplicacin, las cadenas se separan, los segmentos de flanqueo (cebadores) se unen con los
extremos de la regin seleccionada y la polimerasa copia el segmento intermedio. etc.

un generador de ciclos trmicos que cambia la temperatura de la
mezcla de reaccin en forma automtica para permitir que
ocurra cada paso del ciclo.
Aplicaciones de la PCR
Amplificacin de DNA para clonacin o anlisis Desde su in-
vencin, la PCR ha encontrado muchos usos. Puede generar
muchas copias de un fragmento de DNA especfico antes de
clonarlo, lo que constituye un mtodo eficiente si la secuencia
objetivo se conoce con suficiente detalle para que sea posible
especificar la secuencia de nucletidos de dos cebadores com-
plementarios. Esto reviste especial utilidad en casos en que el
DNA original es muy escaso, dado que la PCR puede generar
grandes cantidades de DNA a partir de muestras diminutas,
como la que hay en una sola clula. La PCR se ha usado en
investigaciones criminales para generar cantidades de DNA a
partir de una mancha de sangre seca en la ropa de un sospe-
choso o an del DNA presente en parte de un solo folculo
piloso dejado en la escena de un crimen. Con este fin se selec-
cionan regiones del genoma para amplificar que sean muy po-
limrficas (esto es, que varen con gran frecuencia en la pobla-
cin), de modo que no haya dos individuos que tengan los
mismos fragmentos de DNA valorados (como en la figura
10.18). Este mismo procedimiento puede usarse para estudiar
fragmentos de DNA de fsiles bien conservados que pueden
tener millones de aos de antigedad. La actividad de la poli-
merasa de DNA en la PCR tambin se emplea en la secuen-
ciacin de DNA (seccin 18.14).
Pruebas para la presencia de secuencias de DNA especficas Su-
pngase que se desea determinar si una muestra de tejido con-
tiene o no un virus dado. Podra responderse a esto mediante
una hibridacin Southern (pg. 763) o mediante la PCR. En
este ltimo caso, se asla cido nucleico de la muestra y se
aaden cebadores PCR complementarios al DNA viral, junto
con los otros reactivos de la PCR. Entonces se permite que
proceda la reaccin. Si el genoma viral est presente en la
muestra, los cebadores PCR se hibridarn con l y la PCR
generar un producto. Si el virus no est presente, los cebado-
res PCR no se hibridarn y no se generar producto. As, en
esta aplicacin, la PCR misma sirve como el sistema de detec-
cin.
Comparacin de molculas de DNA Si dos molculas de DNA
tienen la misma secuencia de bases, generarn los mismos
productos de PCR en reacciones con cebadores idnticos.
sta es la premisa para ensayos rpidos en que se compara la
similitud de dos muestras de DNA, por ejemplo DNA gen-
mico de aislados bacterianos. La PCR se realiza en las mues-
tras usando varios cebadores, que pueden estar diseados en
forma especfica o generarse al azar. Los productos se separan
por electroforesis en gel y se comparan. Cuanto ms similares
las secuencias de los genomas bacterianos, ms similares sern
sus productos PCR.
Cuantificacin de plantillas de DNA o RNA La PCR tambin
puede usarse para determinar cunto de una secuencia espec-
fica de nucletidos (DNA o RNA) est presente en una
muestra mixta. En un mtodo para esta PCR cuantitativa se
usa la unin de un colorante especfico para DNA bicatenario
a fin de cuantificar la cantidad de producto bicatenario que se
genera. La rapidez de acumulacin de producto es proporcio-
nal a la cantidad de plantilla presente en la muestra.
Otro mtodo utilizado se denomina faros moleculares.
Se trata de oligonucletidos indicadores cortos con un fluoro-
cromo unido a un extremo y una molcula supresora al otro y
que se hibridan a la mitad de la secuencia blanco por amplifi-
car. Mientras el oligonucletido corto est intacto, el fluoro-
cromo y el supresor estn lo suficientemente cerca para que la
fluorescencia se suprima. Cuando la polimerasa de DNA sin-
tetiza una nueva cadena de DNA complementaria a la planti-
lla, su actividad de exonucleasa (pg. 557) degrada el oligonu-
cletido indicador. Por lo tanto, el fluorocromo se separa del
supresor y emite fluorescencia. La cantidad de fluorocromo
que se libera en un ciclo de PCR dado es directamente pro-
porcional al nmero de molculas de plantilla que la polime-
rasa copia.
18.14 | Secuenciacin de DNA 771
Para 1970 ya estaba identificada la secuencia de una larga lista
de protenas, aunque an no se lograba progreso alguno en la
secuenciacin de nucletidos en el DNA. Varias razones ex-
plicaban este estado de las cosas. A diferencia de las molculas
de DNA, los polipptidos tienen longitudes definidas y mane-
jables; una especie determinada de polipptido poda purifi-
carse con facilidad; se dispona de varias tcnicas para dividir
el polipptido en varios sitios a fin de producir fragmentos
superpuestos, y la presencia de 20 aminocidos diferentes con
propiedades muy diversas haca que la separacin y la identifi-
cacin de la secuencia de los pptidos pequeos fuera una ta-
rea simple. A mediados del decenio de 1970 se produjo una
revolucin en la tecnologa para la secuenciacin del DNA.
Para 1977 se public la secuencia completa de nucletidos de
un genoma viral completo, el de X174, de 5 375 nucletidos
de largo. Este hito en la biologa molecular se produjo en el
laboratorio de Frederick Sanger, quien identific la primera
secuencia de aminocidos de un polipptido (insulina) 25
aos antes. Para 2001 se public el borrador de la secuencia
del genoma humano (que equivali a unos tres mil millones de
pares de bases) que fue el producto de aos de investigacin
decientos de cientficos.
Dichos avances en la secuenciacin de DNA fueron po-
sibles gracias a desarrollos en varias reas: mtodos molecula-
res para la secuenciacin de DNA, instrumentacin suscepti-
ble de automatizarse, computadoras ms potentes y fciles de
adquirir, y software para anlisis de datos. La clave inicial fue
el desarrollo de mtodos para determinar la secuencia de frag-
mentos de DNA. Este avance en s fue posible por el descu-
brimiento de enzimas de restriccin y el desarrollo de tecnolo-
gas de clonacin, que aportaron los medios necesarios para
crear un fragmento de DNA definido en cantidades suficien-
tes para ejecutar los procedimientos bioqumicos necesarios.
Cerca de 1980 tuvo una enorme aceptacin como el m-
todo ms indicado, el de secuenciacin de DNA creado por
Sanger y A.R. Coulson, del Medical Research Council de Cam-
bridge, Inglaterra. Una vez que se cont con PCR, la secuen-
ciacin de Sanger-Coulson y PCR se fusionaron en una tc-
nica de secuenciacin, que combina los aspectos bioqumicos
del primer mtodo con los ciclos repetitivos del segundo; tal
mtodo recibi el mtodo de secuenciacin cclica, y se utiliz
ampliamente en la secuenciacin del genoma; sus fases bsicas
se sealan en la figura 18.44. No se usa ya la secuenciacin de
Sanger-Coulson en los principales proyectos de este tipo con
DNA, pero su importancia histrica como tcnica utilizada en
todos los estudios primeros de secuenciacin del genoma in-
cluido el Proyecto del Genoma Humano y la elegancia de su
metodologa bioqumica, hacen de l un instrumento til para
18.14 Secuenciacin de DNA
el aprendizaje en la biologa molecular.
Este procedimiento inicia con una poblacin de molcu-
las plantilla idnticas, ya sea un producto PCR o un fragmento
de DNA clonado. El DNA plantilla se mezcla con un cebador
que es complementario al extremo 3 de una cadena de la re-
gin por secuenciar. La mezcla de reaccin tambin contiene
la polimerasa de DNA termoestable Taq, los cuatro precurso-
res trifosfato de desoxirribonuclesido (dNTP) y una baja
concentracin de precursores modificados llamados trifosfatos
de didesoxirribonuclesido (ddNTP). Cada ddNTP (ddATP,
ddGTP, ddCTP y ddTTP) se modific por la adicin de un
colorante fluorescente de distinto color a su extremo 3.
772 Figura 18.44 Secuenciacin de DNA.
5' G G ACATG AG CT 3' (a) Pasos bsicos en la identificacin de la
secuencia de un pequeo fragmento hi-
3' CCTG TACTCG A 5'
pottico mediante la tcnica de Sanger-
1 DNA desnaturalizado Coulson (didesoxi), como se describen en
el texto. (b) Carriles de gel en que las mo-
3' CCTG TACTCG A 5'
lculas hijas con marca fluorescente se se-
pararon. El color de la banda se
Oligonucletido GGA cebador determina por la identidad del didesoxi-
+ DNA polimerasa
nucletido en el extremo 3 de la cadena
+ dATP, dGTP, dCTP, dTTP
2 + Cuatro ddNTP, cada uno de DNA. (c) La secuencia de nucletidos
marcado con un colorante en la cadena plantilla se interpreta en una
fluorescente distinto computadora que lee de abajo hacia
3' CCTG TACTCG A 5' arriba en el gel, usando como entrada la
3 intensidad y la longitud de onda de la luz
5' G G
GAA 3'
fluorescente. La computadora genera un
ddGTP d d AT P ddCTP d d TTP electroferograma que muestra la intensi-
dad y el color de la fluorescencia detec-
4
tada, junto con la interpretacin de la
GGAC ATG G G ACA G G AC G G ACAT secuencia de DNA. (b,c: tomada de Le-
GGAC A T GAG GG ACATGA G G ACATG AGC G G A CATG A G CT roy Hood y David Galas, Nature
421:445, 2003, fig. 1c y 1d. reimpresas
con autorizacin de Macmillan Pu-
blishers Ltd.)
5
CATG AG CT
(b)
CATG AGC
CATG AG
CATGA
CATG
CAT
CA
C
(a) (c)

La reaccin de secuenciacin da comienzo, como la PCR, tesis y desnaturalizacin se repite muchas veces, generando
cuando la mezcla se calienta a una temperatura que hace que una gran poblacin de cadenas de DNA hijas que hasta ahora
las dos cadenas plantilla se desnaturalicen (fig. 18.44a, paso 1). incluye molculas en las cuales se incorpor un ddNTP en
Despus, la reaccin se enfra de modo que el cebador pueda cada posicin. Por ejemplo, por cada A en la cadena plantilla
hibridarse con el DNA plantilla (paso 2). Debe hacerse notar habr una cadena hija que termine en un ddTTP en esa posi-
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular

que, en comparacin con lo que ocurre en la PCR, slo est
presente un cebador, as que slo una de las dos cadenas de
DNA plantilla puede hibridarse con un cebador. En el paso 3,
la polimerasa Taq agrega al extremo del cebador el dNTP
complementario a la molcula plantilla, lo cual hace que se
sintetice una nueva cadena de DNA complementaria. De vez
en cuando, la polimerasa inserta un ddNTP en vez de un
dNTP. Los didesoxirribonucletidos carecen del grupo hi-
droxilo en sus posiciones 2 y 3. Una vez que estos nucleti-
dos se incorporan al extremo de una cadena creciente, la falta
de OH 3 imposibilita a la polimerasa para que agregue otro
nucletido, lo que causa la terminacin de la cadena (fig.
18.44, paso 4). Como el ddNTP est presente en una concen-
tracin menor en la mezcla de reaccin que el dNTP corres-
pondiente, la incorporacin del ddNTP es infrecuente y alea-
toria; puede incorporarse cerca del principio de una cadena,
cerca de la parte intermedia de otra o hasta el final de la ter-
cera cadena. En cualquier caso, cuando el ddNTP se incor-
pora, el crecimiento de la cadena cesa en ese punto.
Una vez que se completa la fase de extensin de la cadena,
la temperatura vuelve a elevarse para desnaturalizar las nuevas
molculas de DNA bicatenarias. El ciclo de hibridacin, sn-
cin. Cuando todos los ciclos se completan, los productos de
reaccin se separan por electroforesis en gel en capilares muy
finos (fig. 18.44, paso 5).
La electroforesis de alta resolucin en gel separa frag-
mentos cuya diferencia reside slo en un nucletido de largo,
de modo que cada banda sucesiva en el gel contiene molculas
que rebasan por un nucletido la de la banda previa. Cada
ddNTP fue marcado con un colorante fluorescente particular,
razn por la cual el color de la banda (tal como la capta un
detector de lser automatizado) revela la identidad del nucle-
tido terminal de cada molcula hija (fig. 18.44b). Por esa ra-
zn, el orden de los colores corresponde a la secuencia de bases
de la molcula que sirve de plantilla (fig. 18.44c).
Desde 2005, aproximadamente, se ha producido una re-
volucin en la tecnologa de secuenciacin del DNA, orien-
tada a lograr la secuenciacin de genomas humanos y de otros
seres, en forma rpida y barata. Los costos de la secuenciacin
de cantidades masivas de DNA han cado mucho en los lti-
mos aos y para 2012 ya era posible obtener la secuencia de
una persona determinada por un costo cercano a 5 000 dla-
res, varios rdenes de magnitud menor al costo algunos aos
antes.
 Este progreso fue posible por el desarrollo de estrategias
totalmente nuevas para la secuenciacin del DNA. Se conoci
a la primera de las nuevas estrategias como secuenciacin para-
lela masiva (o secuenciacin de la segunda generacin) y ha
predominado en los intentos de secuenciacin genmicos en
los ltimos aos. A diferencia de las fases de secuenciacin del
proyecto original del Genoma Humano, las tecnologas de
secuenciacin paralela masiva no necesitan clonar los segmen-
tos del genoma en levaduras o bacterias. En vez de ello se
preparan directamente los fragmentos a partir del genoma en
su totalidad y cada uno es amplificado ms adelante hasta
formar una poblacin abundantsima. A semejanza de la tc-
nica de Sanger-Coulson, las tcnicas de secuenciacin paralela
masiva se basan en la sntesis de DNA dependiente de poli-
merasa, pero no utiliza la terminacin prematura de la cadena
ni necesita separacin de cadenas por medio de electroforesis,
lo cual limita el nmero de muestras que pueden ser estudia-
das simultneamente. En vez de ello, logran la identificacin
directa de nucletidos individuales a medida que son incorpo-
rados por las polimerasas, en tiempo real. Se cuenta con diver-
sos instrumentos y cada uno realiza una variante de la secuen-
ciacin de DNA automatizada rpida. En todos los casos
comentados, se inmoviliza un nmero extraordinariamente
grande de molculas de DNA (incluso 109 en promedio) en una
superficie, para ser incubados con la DNA polimerasa enpre-
sencia de los 4 NTP diferentes. Se utilizan diversas estrategias
para identificar los nucletidos que son incorporados de ma-
nera secuencial en cada una de las cadenas complementarias,
conforme son sintetizadas en un nmero masivo de plantillas
paralelas de DNA.
Las cadenas sintetizadas en todas estas plataformas son
relativamente cortas (longitud menor de 100 bases), en com-
paracin con los secuenciadores originales que utilizaban m-
todos electroforticos (longitud aproximada 800 bases). Los
secuenciadores nuevos tambin ms fcilmente caen en erro-
res en comparacin con los instrumentos utilizados en la pri-
mera generacin de intentos. Sin embargo, un enorme nmero
de copias de cada cadena de DNA es leda simultneamente,
al grado que se alcanza enorme precisin al conocer la secuen-
cia ms abundante generada. Los segmentos cortos sintetiza-
dos (llamados lecturas) constituyen un problema cuando los
investigadores intentan conocer la secuencia genmica de
DNA de una nueva especie, porque puede ser muy difcil en-
samblar un gran nmero de lecturas breves en molculas de
DNA largusimas que aparecen en un cromosoma eucaritico.
En consecuencia, estas tecnologas de secuenciacin de DNA
son ms idneas para estudiar genomas individuales de una
especie como la humana, en la que los investigadores tienen ya
un genoma de referencia, en el cual pueden colocar un frag-
mento particular de DNA. A pesar de tales obstculos, se ha
logrado ensamblar con los instrumentos mencionados geno-
mas de especies nuevas como los de los pandas. Otro pro-
blema con el empleo de secuenciadores paralelos masivos es
que los datos no pueden ser separados en genomas haploides
maternos y paternos o sus haplotipos (pg. 419); ello puede
limitar su utilidad en aplicaciones de la medicina genmica.
En los ltimos aos, se han introducido en el mercado
instrumentos nuevos de secuenciacin de DNA, conocidos a
menudo como los de la tercera generacin. En forma de grupo,
tales instrumentos utilizan estrategias mecansticas muy dis-
tintas para conocer las secuencias de nucletidos, aunque mu-
chos de ellos actan en molculas nicas de DNA (que eli-
mina la necesidad de amplificacin del DNA), generan
lecturas largas (1 000 nucletidos) y operan con menor costo 773
y mayor rapidez que los instrumentos de la segunda genera-
cin. Nos ocuparemos brevemente de un par de tales estrate-
gias de secuenciacin. En un caso, la secuenciacin se logra al
tirar de cada molcula de DNA de modo que atraviese un
orificio pequesimo o nanoporo e identifique cada nucle-
tido, uno cada vez, al pasar por el orificio. La identificacin de
nucletidos se basa en las diferencias de propiedades inicas
de los cuatro nucletidos que se detectan, conforme cada uno
pasa, uno tras otro a travs del nanoporo. Con el gran nmero
de nanoporos que operan simultneamente es posible la se-
cuenciacin muy rpida. Otros secuenciadores de la tercera
generacin actan por la tcnica de secuenciacin por snte-
sis. Con el instrumento en cuestin, un sistema de deteccin
basado en laser identifica nucletidos marcados con fluores-
cencia a medida que son incorporados por una sola DNA
polimerasa que se desplaza a lo largo de la cadena de DNA. Se
hace una vigilancia simultnea de cientos de miles o ms de
tales reacciones en cadenas de DNA diferentes y por ello se
generan cantidades impresionantes de datos durante lapsos
breves de incubacin (corridas).
Una vez determinada la secuencia de nucletidos de un
segmento de DNA, es posible emplear diversas herramientas
de software para analizarla. Por ejemplo, la secuencia de ami-
nocidos codificada por el DNA puede determinarse y com-
pararse con otras secuencias de aminocidos conocidas para
obtener informacin acerca de la posible funcin del polipp-
tido. La secuencia de aminocidos tambin aporta indicios
respecto a la estructura terciaria de la protena, en particular
las partes del polipptido que podran actuar como segmentos
que cruzan la membrana de protenas integrales de mem-
brana. La secuencia de nucletidos misma tambin puede
compararse con otras conocidas. Tales comparaciones son ti-
les para evaluar la relacin o historia evolutiva de las secuen-
cias de DNA, para identificar el fragmento de DNA que
acaba de secuenciarse, o para comparar las caractersticas ge-
nmicas de diversos organismos o individuos.
18.15 | Genotecas de DNA
A menudo la clonacin de DNA se usa para producir genote-
cas de DNA, que son colecciones de fragmentos de DNA
clonados. Pueden crearse dos tipos bsicos de genotecas de
DNA: genotecas genmicas y genotecas de cDNA. Las primeras se
producen de un DNA total extrado de ncleos y contienen
todas las secuencias de DNA de la especie. Una vez que dispo-
nen de una genoteca genmica de una especie, los investiga-
dores pueden utilizar esta coleccin para aislar secuencias es-
pecficas de DNA, como las que contienen el gen para la
insulina humana. Por otro lado, las genotecas de cDNA provie-
18.15 Genotecas de DNA
nen de copias de DNA de una poblacin de RNA. Por lo ge-
neral las genotecas de cDNA se producen a partir de RNA
mensajeros presentes en una clula particular, por lo que co-
rresponden a los genes que estn activos en ese tipo de clula.
Genotecas genmicas
Primero se examinar la produccin de una biblioteca gen-
mica (catlogo genmico o genoteca). En una tcnica, el DNA
genmico se trata con una o dos enzimas de restriccin que
774 reconocen secuencias de nucletidos muy cortas en condicio-
nes de baja concentracin enzimtica, de manera que slo un
pequeo porcentaje de los sitios susceptibles se divida. Dos
enzimas usuales que reconocen secuencias de cuatro nucleti-
dos son HaeIII (reconoce GGCC) y Sau3A (reconoce GATC).
Se esperara que hubiera un determinado tetranucletido por
casualidad con una frecuencia tal que cualquier segmento de
DNA de tamao considerable sea sensible a la fragmentacin.
Una vez que el DNA se digiere en forma parcial, el material
digerido se fracciona por electroforesis en gel o centrifugacin
con gradiente de densidad y los fragmentos de tamao ade-
cuado (p. ej., 20 kb de largo) se incorporan en las partculas de
fago lambda. Estos fagos se emplean para generar el milln de
placas necesarias para asegurar la representacin de cada seg-
mento individual de un genoma de mamfero.
Como el DNA se trata con enzimas en condiciones en las
que la mayor parte de los sitios susceptibles no se dividen, para
fines prcticos el DNA se fragmenta al azar. Una vez que los
fagos recombinantes se producen, pueden almacenarse para
usarlos ms adelante y, como tal, constituyen una coleccin
permanente de todas las secuencias de DNA presentes en el
genoma de la especie. Siempre que un investigador desee ais-
lar una secuencia particular de la genoteca, las partculas de
fago pueden cultivarse en bacterias y las diversas placas (cada
una originada por la infeccin de un solo fago recombinante)
revisarse para detectar la secuencia mediante hibridacin in
situ.
El uso de DNA dividido al azar tiene una ventaja en la
construccin de una genoteca porque genera fragmentos su-
perpuestos que pueden ser tiles en el anlisis de regiones del
cromosoma que se extienden en ambas direcciones de una
secuencia particular, una tcnica conocida como marcha de cro-
mosomas. Por ejemplo, si se asla un fragmento que contiene la
regin codificadora de un gen para globina, ese fragmento
particular puede marcarse y usarse como sonda para buscar en
la genoteca genmica fragmentos con los que se superponga.
El proceso se repite luego con nuevos fragmentos como son-
das marcadas en pasos de deteccin sucesivos, mientras se asla
en forma gradual una parte cada vez ms larga de la molcula
de DNA original. Esta tcnica permite estudiar la organiza-
cin de secuencias vinculadas en una regin extensa de un
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
cromosoma.
Clonacin de fragmentos ms largos de DNA en vecto-
res de clonacin especializados Ni los vectores plsmi-
dos ni los fagos lambda son adecuados para la clonacin de
DNA mayores de 20 a 25 kb de largo. Se han desarrollado
varios vectores que permiten a los investigadores clonar seg-
mentos mucho ms grandes de DNA; uno de los ms impor-
tantes es el cromosoma artificial de levadura (YAC, yeast ar-
tificial chromosome), que puede aceptar segmentos de DNA
ajeno de hasta 1 000 kb (un milln de pares de bases). Como
su nombre lo indica, los YAC son versiones artificiales de un
cromosoma normal de levadura. Contienen todos los elemen-
tos de un cromosoma de levadura que se requieren para repli-
car la estructura durante la fase S y separarla entre las clulas
hijas durante la mitosis, inclusive uno o ms orgenes de repli-
cacin, telmeros en los extremos de los cromosomas y un
centrmero al que las fibras del huso pueden unirse durante la
separacin del cromosoma. Adems de estos elementos, los
YAC se construyen para que contengan: (1) un gen cuyo pro-
ducto codificado permita a las clulas que contienen el YAC
seleccionarse entre las que carecen de tal elemento y (2) el
fragmento de DNA a clonar. Como otras clulas, las levaduras
pueden captar DNA de su medio, lo que proporciona el medio
para introducir los YAC a las clulas.
En los ltimos aos los laboratorios participantes en la
identificacin de la secuencia de los genomas dependen mu-
cho de un vector alternativo de clonacin, el cromosoma arti-
ficial bacteriano (BAC, bacterial artificial chromosome), que
tambin puede aceptar grandes fragmentos de DNA (de hasta
500 kb). Los BAC son plsmidos bacterianos especializados
(factores F) que contienen un origen bacteriano de replicacin
y los genes necesarios para regular su propia replicacin. Los
BAC tienen ventaja sobre los YAC en proyectos para identifi-
car secuencias a alta velocidad porque pueden clonarse en E.
coli, que capta con facilidad el DNA exgeno, tiene un tiempo
de generacin extremadamente corto, pueden cultivarse en
grandes densidades en medios simples y no corrompen el
DNA clonado por recombinacin.
Los fragmentos de DNA clonados en YAC y BAC casi
siempre son mayores de 100 kb de largo. Los fragmentos tan
grandes suelen producirse mediante tratamiento de DNA con
enzimas de restriccin que reconocen secuencias de nucleti-
dos muy largos (siete a ocho nucletidos) que contienen dinu-
cletidos CG. Como se seala en la pgina 531, los dinucle-
tidos CG tienen funciones especiales en el genoma de los
mamferos, y se supone que por eso no aparecen tan a menudo
como se esperara que sucediera por casualidad. Por ejemplo,
la enzima de restriccin Not1 que reconoce la secuencia de
ocho nucletidos GCGGCCGC, por lo general divide el
DNA de mamferos en fragmentos con varios cientos de miles
de pares de bases de largo. Los fragmentos de esta longitud
pueden incorporarse en YAC o BAC y clonarse dentro de le-
vaduras o bacterias hospedadoras.
Genotecas de cDNA
Hasta este punto la descripcin se limit a la clonacin de
fragmentos de DNA aislados del DNA extrado, es decir, frag-
mentos genmicos. Cuando se trabaja con DNA genmico,
por lo general se busca aislar un gen o una familia de genes
particulares entre cientos de miles de secuencias no relaciona-
das. Adems el aislamiento de los fragmentos genmicos per-
mite estudiar diversos temas, entre ellos: (1) secuencias regu-
ladoras que flanquean la porcin codificadora del gen, (2)
secuencias intermedias no codificadoras, (3) varios miembros
de una familia de mltiples genes que a menudo estn muy
cercanos en el genoma, (4) la evolucin de las secuencias de
DNA, inclusive su duplicacin y recombinacin como se ve en
comparaciones del DNA de diferentes especies y (5) el inter-
calado de elementos genticos transferibles.
A diferencia del DNA genmico, la clonacin de cDNA
tambin es importante en el anlisis de la expresin gentica y
el corte y empalme alterno. Para producir genotecas de cDNA
se asla una poblacin de RNA mensajeros y se utiliza como
plantilla para que la transcriptasa inversa forme una poblacin
de hbridos DNA-RNA, como se muestra en la figura 18.45a.
Los hbridos DNA-RNA se convierten en una poblacin de
cDNA bicatenario mediante cortes en el RNA con la RNAasa
H y la sustitucin con DNA por efecto de la DNA polimerasa
I. El cDNA bicatenario se combina despus con el vector de-
seado (en este caso un plsmido) y se clona como se muestra
en la figura 18.45b. Aunque las poblaciones de RNA mensa-
 Figura 18.45 Sntesis de cDNA para clonacin en un plsmido. 775
Poli(A)
(a) En este mtodo de formacin de cDNA, un cebador corto
5' 3' poli(dT) se une con el poli(A) de cada mRNA que se transcribe por
accin de la transcriptasa inversa (que necesita el cebador para ini-
mRNA
Recombinar ciar la sntesis de DNA). Una vez que el hbrido DNA-RNA se
el cebador poli(dT) forma, se producen muescas en el RNA mediante la RNAasa H y se
con la cola poli(A) agrega la DNA polimerasa I para digerir el RNA y sustituir el
del mRNA DNA, justo como ocurre durante la replicacin de DNA en una c-
lula bacteriana (pg. 557). (b) Para preparar cDNA de extremos ro-
mos para la clonacin se agregan un pequeo fragmento de poli(G)
Hacer copia
de DNA con Cebador a los extremos 3 del cDNA y un segmento complementario de
transcriptasa inversa poli(C) a los extremos 3 del DNA plsmido. Los dos DNA
se mezclan y se permite que formen recombinantes, que se sellan
y usan para transformar las clulas bacterianas en las que
DNA se clonan.

Tratar el hbrido con RNAasa H,

que hace una muesca en el RNA
y deja grupos 3'-OH libres
jero suelen contener miles de mensajes diferentes, puede haber
3'-OH 3'-OH especies individuales en cantidades (abundancia) muy distin-
tas. Como resultado una genoteca de cDNA debe contener
DNA alrededor de 1 milln de clones diferentes de cDNA para ase-
gurar la representacin de los mRNA raros. Adems la trans-
Agregar DNA polimerasa I, criptasa inversa no es una enzima muy eficiente y tiende a
que usa los fragmentos caerse del RNA plantilla antes de terminar el copiado. En
de RNA como cebadores consecuencia a veces resulta difcil obtener una poblacin de
y sustituye el RNA con DNA
cDNA de longitud completa. Como sucede con los experi-
mentos que emplean fragmentos de DNA genmico, los clo-
nes deben identificarse para aislar una secuencia particular de
una poblacin heterognea de molculas recombinantes.
cDNA bicatenario El anlisis de cDNA clonado tiene varias funciones. Por
(a) lo general es ms fcil estudiar una poblacin diversa de

18.16 Transferencia de DNA a clulas eucariotas y embriones de mamfero

cDNA que la poblacin correspondiente de mRNA, de ma-
nera que las molculas de cDNA pueden usarse para aprender
acerca de la diversidad y abundancia de mRNA presentes en la
clula, el porcentaje de mRNA que dos tipos distintos de c-
lulas comparten o la variedad de mRNA sujetos a empalme
+ alterno generados a partir de una transcripcin primaria espe-
cfica. Una sola molcula de cDNA clonada y amplificada
cDNA DNA de plsmido tambin es muy til. En tareas ms prcticas es posible identi-
Agregar la enzima ficar la secuencia del cDNA con facilidad para tomar un atajo
dGTP desoxinucleotidil transferasa dCTP en la determinacin de la secuencia de aminocidos de un
en presencia
de dGTP o dCTP
polipptido; los cDNA marcados se usan como sondas para
detectar secuencias complementarias entre clones recombi-
nantes, y como carecen de intrones, los cDNA tienen ventaja
GGGG CCCC sobre los fragmentos genmicos cuando se pretende sintetizar
GGGG CCCC protenas eucariotas en cultivos de clulas bacterianas.

Mezclar, permitir 18.16 | Transferencia de DNA

que se forme DNA
recombinante, ligar a clulas eucariotas
y embriones de mamfero
En las secciones previas se explic la forma en que los genes
eucariotas pueden aislarse, modificarse y amplificarse. En esta
seccin se consideran algunas de las formas en que los genes
pueden introducirse a las clulas eucariotas, donde casi siem-
pre se transcriben y traducen. Una de las estrategias ms usua-
les para alcanzar este objetivo es incorporar el DNA en el ge-
noma de un virus que no est en replicacin y permitir que el
Bacteria en la que puede
clonarse el DNA virus infecte una clula. La transferencia de genes mediada
(b) porvirus se conoce como transduccin. Segn el tipo de virus
776 que se utilice, el gen de inters puede expresarse en forma
transitoria durante un periodo de horas o das, o integrarse de
modo estable en el genoma de la clula hospedadora. La inte-
gracin estable suele realizarse por medio de retrovirus modi-
ficados, que contienen un genoma de RNA que se transcribe a
la inversa en DNA dentro de la clula. La copia del DNA se
inserta despus en el DNA de los cromosomas del hospe-
dador. Los retrovirus se utilizan en muchos de los intentos
recientes de teraputica gnica para transferir un gen a las c-
lulas de un paciente que carece de ese gen. En general estas
pruebas clnicas no tienen mucho xito a causa de la baja efi-
ciencia de infeccin de los vectores virales actuales.
Se cuenta con varios procedimientos para introducir
DNA desnudo en clulas cultivadas, un proceso llamado
transfeccin. Lo ms frecuente es que las clulas se traten con
fosfato de calcio o DEAE-dextrano, ya que ambos forman un
complejo con el DNA agregado que promueve su adherencia
con la superficie celular. Se estima que slo una de cada 105
clulas capta el DNA y lo incorpora de manera estable a los
cromosomas. Aunque no se sabe por qu este pequeo por-
centaje de clulas de la poblacin es competente para transfec-
tarse, las que se transfectan casi siempre captan varios frag-
mentos. Una manera de seleccionar las clulas que captaron el
DNA ajeno es incluir un gen que permita a las clulas trans-
fectadas crecer en un medio determinado en el que las clulas
no transfectadas no sobreviven. Como las clulas transfectadas
suelen captar ms de un fragmento, es necesario que el gen
que se emplea para la seleccin no se localice en el mismo
fragmento de DNA que el gen cuya funcin se est investi-
gando (denominado transgn).
La electroporacin y la lipofeccin son dos procedimien-
tos ms para transfectar clulas. En la electroporacin, las clu-
las se incuban con DNA en ampolletas especiales que contie-
nen electrodos que aplican un pulso elctrico breve. La
aplicacin de corriente ocasiona que la membrana plasmtica
se vuelva permeable por cierto tiempo a las molculas de
DNA, algunas de las cuales llegan hasta el ncleo y se integran
en los cromosomas. En la lipofeccin, las clulas se tratan con
DNA que se une con lpidos de carga positiva (liposomas ca-
tinicos) capaces de fusionarse con la bicapa lipdica de la
membrana celular y llevar el DNA al citoplasma.
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
Una de las formas ms directas de introducir genes ajenos
a una clula es la microinyeccin directa de DNA en el ncleo
celular. Los ncleos de los oocitos y huevos son muy adecua-
dos para esta tcnica. Por ejemplo, los oocitos de Xenopus se
usan desde hace mucho para estudiar la expresin de genes
ajenos. El ncleo del oocito contiene toda la maquinaria nece-
saria para la sntesis de RNA; cuando se inyecta DNA ajeno
en el ncleo, se transcribe con facilidad. Adems las molculas
de RNA sintetizadas a partir de las plantillas inyectadas se
procesan en forma normal y se transportan al citoplasma,
donde se traducen en protenas que pueden detectarse por
medios inmunolgicos o en virtud de su actividad especfica.
Otro blanco favorito para el DNA inyectado es el ncleo
de un embrin de ratn (fig. 18.46). El objetivo de estos expe-
rimentos no es vigilar la expresin del gen en la clula inyec-
tada, sino vigilar que el DNA se integre en los cromosomas
del huevo a fin de que pase a todas las clulas del embrin y
subsecuentemente al adulto. Los animales que se modificaron
mediante ingeniera gentica para que sus cromosomas con-
tengan genes extraos se llaman animales transgnicos y son
un medio para vigilar cundo y dnde se expresan los genes
particulares en el embrin (como en la figura 12.34), adems
Figura 18.46 Microinyeccin de DNA en el ncleo de un huevo
de ratn recin fertilizado. El huevo se mantiene en su sitio con
una pipeta de succin que se muestra a la derecha, mientras que la
pipeta de inyeccin que penetra el huevo se muestra a la izquierda.
(Tomada de Thomas E. Wagner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 78:6377, 1981.)
de identificar el impacto de las copias adicionales de genes
particulares en el desarrollo y la vida del animal.
Animales y plantas transgnicos En 1981 Ralph Brins-
ter, de la Pennsilvania University, y Richard Palmiter, de la
Washington University tuvieron xito en la introduccin de un
gen para la hormona de crecimiento de la rata en los huevos
fertilizados de ratn. El DNA inyectado se construy para que
tuviera la porcin codificadora del gen para la hormona de
crecimiento de la rata en una posicin justo siguiente a la re-
gin promotora del gen de ratn para la metalotionena. En
condiciones normales la sntesis de metalotionena se intensi-
fica mucho despus de la administracin de metales, como el
cadmio o el cinc, o bien de hormonas glucocorticoides. El gen
de la metalotionena tiene un promotor potente y se esperaba
que la colocacin del gen de la hormona de crecimiento en
direccin 3 de ste, permitiera la expresin del gen despus
del tratamiento del ratn transgnico con metales o glucocor-
ticoides. Como se ilustra en la figura 18.47, esta expectativa se
cumpli del todo. En el aspecto prctico los animales transg-
nicos constituyen un mecanismo para crear modelos animales,
que son animales de laboratorio que expresan una enfermedad
humana particular a la que en condiciones normales no esta-
ran sujetos. Esta estrategia se ilustra con los ratones transg-
nicos con un gen que codifica una versin mutante de la pro-
tena precursora amiloide humana (APP). Como se explica en
la pgina 68, estos ratones desarrollan sntomas neurolgicos y
de comportamiento que recuerdan los de la enfermedad de
Alzheimer y son un recurso importante en el desarrollo detra-
tamientos para esta terrible enfermedad. Los animales trans-
gnicos tambin se desarrollan como parte de la biotecnologa
agrcola. Por ejemplo, los cerdos que nacen con genes ajenos
para la hormona del crecimiento incorporados en sus cromo-
somas crecen con mucho menos grasa que los animales testigo
que carecen de los genes. La carne de animales transgnicos
tiene menos grasa porque el exceso de hormona de creci-
miento estimula la conversin de nutrimentos en protena en
lugar de grasa.
 Semillas 777

Plsmido Ti

Caja de cultivo

+ Permitir que las

DNA ajeno semillas germinen

Brote

Punta de brote

Plsmido Ti
recombinante Cortar punta de brote
con meristemo
Figura 18.47 Ratones transgnicos. Esta fotografa muestra un
par de hermanos de la misma camada a las 10 semanas de edad. El
ratn ms grande se desarroll de un huevo inyectado con DNA que
contena el gen de la hormona de crecimiento de la rata, que se co-
loc en direccin 3 del promotor de metalotionena. El ratn ms
Introducir en bacteria
grande pesa 44 g; el ms pequeo, el testigo no inyectado, pesa 29 g. Punta del brote
Agrobacterium tumefaciens
El gen GH de rata se transmiti a los descendientes que tambin
crecieron ms que los testigos. (Cortesa de Ralph L. Brinster, Transformar
de un trabajo publicado en R. D. Palmiter, et al., Nature, las puntas
300:611, 1982. Reimpresa con autorizacin de Macmillan de los brotes
Publishers Ltd.) +

18.16 Transferencia de DNA a clulas eucariotas y embriones de mamfero

Brotes transformados

Las plantas tambin son una opcin ideal para la ingenie-

ra gentica. En la pgina 229 se indic que pueden cultivarse
plantas completas a partir de clulas vegetales individuales en
Transferir las puntas de los brotes
cultivo. Esto brinda la oportunidad de modificar su composi-
a un medio para enraizar
cin gentica mediante la introduccin de DNA en los cro-
mosomas de clulas cultivadas que despus pueden crecer
hasta plantas maduras. Una forma de introducir genes ajenos
consiste en incorporarlos en el plsmido Ti de la bacteria Agro-
bacterium tumefaciens. Fuera del laboratorio, esta bacteria vive
en relacin con plantas dicotiledneas, donde induce la for-
macin de masas tumorales llamadas agallas. Durante una
infeccin, una seccin del plsmido Ti llamada regin T-DNA Transferir a la tierra
pasa de la bacteria a la clula vegetal. Esta parte del plsmido
se incorpora en los cromosomas de la clula vegetal e induce a
la clula a proliferar y proveer nutrimentos a la bacteria.
El plsmido Ti puede aislarse de bacterias y unirse con
genes ajenos para producir un plsmido recombinante que las
clulas vegetales dicotiledneas no diferenciadas en cultivo
captan, inclusive las clulas de zanahorias y tabaco. La figura
18.48 muestra el uso de los plsmidos Ti recombinantes para
introducir DNA extrao en las clulas del meristemo en la
punta de los brotes nuevos. Luego los brotes pueden enrai- Figura 18.48 Formacin de plantas transgnicas con el plsmido
zarse y crecer hasta formar plantas maduras. Dicha tcnica, Ti. El transgn se incluye en el DNA del plsmido Ti, que se rein-
llamada transformacin T-DNA, se utiliza para transformar troduce en la bacteria hospedadora. Las bacterias que contienen el
clulas vegetales con genes derivados de bacterias que codifi- plsmido recombinante se usan luego para transformar clulas vege-
can toxinas para matar insectos, lo que protege las plantas de tales, en este caso las clulas del meristemo en el extremo superior
de una punta disectada de la raz. Los brotes transformados se trans-
los insectos depredadores.
fieren a un medio de seleccin, donde desarrollan races. Las plantas
Se dispone de otros procedimientos para introducir genes enraizadas pueden transferirse a tierra.
ajenos en las clulas de las plantas monocotiledneas. En una
778 de las estrategias ms exticas, las clulas vegetales pueden
servir como blancos para pelotillas microscpicas de tungs-
teno cubiertas con DNA que se disparan con una pistola de
genes. Esta tcnica se emplea para modificar el material ge-
ntico de varios tipos distintos de clulas vegetales.
Las dos actividades ms importantes que los genetistas
botnicos podran mejorar con la ingeniera gentica son la
fotosntesis y la fijacin de nitrgeno, ambas funciones
bioenergticas vitales. Cualquier mejora significativa en la
eficiencia fotosinttica implicara grandes aumentos en la pro-
duccin de cosechas. Se espera que sea posible disear una
versin modificada de la enzima fijadora de CO2 menos sus-
ceptible a la fotorrespiracin (pg. 229). La fijacin de nitr-
geno es una actividad que realizan ciertos gneros de bacterias
(p. ej., Rhizobium) que viven en relacin simbitica con ciertas
plantas (p. ej., soya, cacahuate, trbol, alfalfa y chcharos). Las
bacterias se encuentran en protuberancias o ndulos legumino-
sos, localizados en las races, donde retiran N2 de la atmsfera,
lo reducen hasta amoniaco y entregan el producto a las clulas
de la planta. Los genetistas buscan una forma de aislar los
genes bacterianos que participan en esta actividad e introdu-
cirlos en los cromosomas de las plantas no leguminosas que en
la actualidad dependen mucho del fertilizante agregado para
obtener sus compuestos de nitrgeno reducido. Una alterna-
tiva sera alterar el genoma de la planta o la bacteria para que
puedan desarrollarse nuevos tipos de relaciones simbiticas.
18.17 | Determinacin de la
funcin de los genes eucariotas
por eliminacin o desactivacin
(silenciamiento) gnica
Hasta hace muy poco los investigadores descubrieron nuevos
genes y aprendieron acerca de su funcin mediante la detec-
cin de mutantes que presentaban fenotipos anormales (vase
pg. 277 respecto al estudio de la secrecin de protenas). La
existencia de los genes se evidenci slo a travs del proceso de
mutacin. Este proceso de aprendizaje de los genotipos me-
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
diante el estudio del fenotipo mutante se conoce como gen-
tica de avanzada. A partir del desarrollo de tcnicas para la
clonacin de genes y la identificacin de la secuencia del DNA
los investigadores han podido identificar y estudiar los genes
en forma directa sin conocer nada acerca de la funcin de su
protena codificada. Esta condicin se ha vuelto muy usual en
los ltimos aos con la identificacin de la secuencia de geno-
mas enteros y la identificacin de miles de genes cuya funcin
an se desconoce. En los dos ltimos decenios los investigado-
res desarrollaron la gentica inversa, que es un proceso para
determinar el fenotipo (o sea la funcin) con base en el cono-
cimiento del genotipo. El enfoque bsico de la gentica in-
versa es eliminar la funcin de un gen especfico y luego deter-
minar el efecto de la eliminacin en el fenotipo. Primero se
considera cmo introducen los investigadores mutaciones es-
pecficas en genes in vitro, y luego se exponen dos tcnicas
ampliamente usadas para eliminar la funcin gnica in vivo.
Mutagnesis in vitro
Como resulta evidente en todo este libro, el aislamiento de
mutantes naturales tiene una participacin de gran importan-
cia en el descubrimiento de la funcin de los genes y sus pro-
ductos. Sin embargo, las mutaciones naturales son fenmenos
raros y no es factible usar estas mutaciones para estudiar
laparticipacin de residuos de aminocidos particulares en la
funcin de una protena determinada. En lugar de esperar a
que aparezca un organismo con un fenotipo inusual para iden-
tificar la mutacin causante, los investigadores pueden mutar
el gen (o sus regiones reguladoras relacionadas) en la forma
deseada y observar el cambio fenotpico resultante. Tales tc-
nicas, denominadas colectivamente mutagnesis in vitro, re-
quieren que el gen (o al menos el segmento gnico) por mutar
se haya clonado.
Un procedimiento desarrollado por Michael Smith, de la
University of British Columbia, se denomina mutagnesis di-
rigida (SDM, site-directed mutagenesis) y permite a los inves-
tigadores hacer cambios especficos muy pequeos en una se-
cuencia de DNA, como la sustitucin de una base por otra, o
la delecin o insercin de una cantidad muy pequea de bases.
Por lo general la SDM inicia con la sntesis de un oligonucle-
tido de DNA que contiene el cambio deseado, se permite que
este oligonucletido se hibride con un preparado monocate-
nario de DNA normal, y luego el oligonucletido se utiliza
como cebador para la DNA polimerasa. La polimerasa alarga
el cebador mediante la adicin de nucletidos complementa-
rios del DNA normal. El DNA modificado puede clonarse
entonces y determinar el efecto de la alteracin gentica intro-
duciendo el DNA en una clula hospedadora adecuada. Los
cientficos suelen usar SDM para responder a interrogantes
muy puntuales acerca de la funcin de un gen o una protena.
Por ejemplo, podran cambiar un aminocido por otro para
obtener indicios acerca del cometido de ese sitio especfico en
el funcionamiento global de una protena. De manera alterna-
tiva, podran introducir cambios en la regin reguladora de un
gen y determinar el efecto en la expresin gnica. Si el objetivo
de la mutagnesis dirigida a un sitio es simplemente suprimir
el funcionamiento de un gen, pueden usarse mtodos menos
especficos. Por ejemplo, si se corta una secuencia gnica en un
sitio de restriccin, se usa DNA polimerasa para convertir las
regiones monocatenarias de los extremos adherentes en DNA
bicatenario y se vuelven a ligar esos extremos, es posible des-
truir el marco de lectura de una protena. En otros casos po-
dra eliminarse del gen un fragmento de restriccin completo.
Crear una mutacin in vitro es slo un aspecto de la ge-
ntica inversa. Para estudiar el efecto de una mutacin artifi-
cial en un fenotipo, es necesario sustituir el gen normal por el
alelo mutado en el organismo en cuestin. El desarrollo de
una tcnica para introducir mutaciones en el genoma murino
abri la puerta para los estudios de gentica inversa en mam-
feros, y literalmente revolucion el estudio del funcionamiento
gnico de este grupo taxonmico.
Ratones con inactivacin gnica
En muchas partes de este libro ya se describieron los fenotipos
de ratones que carecen de una copia funcional de un gen par-
ticular. Por ejemplo, se indic que los ratones que carecen de
una copia funcional del gen p53 siempre desarrollan tumores
malignos (pg. 677). Estos animales, llamados ratones con
inactivacin (bloqueo) gnica, pueden aportar informacin
nica de la base gentica de la enfermedad humana, as como
un mecanismo para estudiar las diversas actividades celulares
en las que el producto de un gen particular pudiera participar.
 Masa celular Clulas del trofoectodermo Monocapa de clulas En el decenio de 1980, Mario Capecchi, de la Utah Uni- 779
interna en reposo versity, Oliver Smithies, de la Wisconsin University, y Martin
(contiene
clulas ES) Evans, de la Cambridge University, desarrollaron los diversos
procedimientos empleados para generar ratones con inactiva-
cin gnica. El primer paso es aislar un tipo inusual de clula
Se disocian clulas que tenga virtualmente poderes ilimitados para diferenciarse.
del blastocisto
y se cultivan clulas ES Estas clulas, denominadas clulas madre ambrionarias (pg.
Blastocisto 21), se encuentran en el blastocisto de los mamferos, que es
Clulas ES
una etapa temprana del desarrollo embrionario comparable a
la etapa de blstula de otros animales. El blastocisto de un
mamfero (fig. 18.49) se compone de dos partes distintas. La
Transfeccin de clulas capa externa constituye el trofectodermo, que da origen a la
con DNA que contiene mayor parte de las membranas extraembrionarias caractersti-
el gen mutante X
cas de un embrin de mamfero. La superficie interna del tro-

Clulas ES transfectadas
(heterocigotas para
el gen mutante X)
Cultivo de clulas
en medio selectivo
Inyeccin de clulas ES
transfectadas con X/
en el blastocisto hospedador
Ratn quimrico con pelaje pigmentado
de negro (a/a) y pardo (A/a) Blastocisto quimrico que contiene
una masa celular interna
con ambos tipos de clulas
Para determinar si las clulas
germinativas provienen de
clulas ES inyectadas, se
aparea el ratn quimrico
con un miembro de la cepa negra
18.17 Determinacin de la funcin de los genes eucariotas por eliminacin o desactivacin (silenciamiento) gnica
fectodermo est en contacto con un cmulo de clulas llamado
masa celular interna que se proyecta hacia la cavidad espaciosa
Clulas ES (blastocele). La masa celular interna da origen a las clulas que
El hospedador es
forman el embrin. La masa celular interna contiene las clu-
homocigoto recesivo las madre ambrionarias, que se diferencian en todos los tejidos
para el color de pelaje diversos de que se compone el mamfero.
negro (a/a)
Las clulas primordiales primarias pueden aislarse de
blastocistos y cultivarse in vitro bajo condiciones en las que las
clulas crecen y proliferan; se transfectan despus con un frag-
mento de DNA que contenga un alelo mutante no funcional
del gen que va a eliminarse, as como genes de resistencia a
antibitico que pueden usarse para seleccionar las clulas que
incorporaron el DNA alterado en su genoma. De las clulas
que captan el DNA, alrededor de una por cada 104 experi-
mentan un proceso de recombinacin homloga en la que el
DNA sustituye a la secuencia DNA homloga.5 Mediante
este procedimiento se producen y seleccionan las clulas ma-
dre ambrionarias que son heterocigticas para el gen en cues-
tin con base en su resistencia antibitica. En el siguiente paso
varias de estas clulas donadoras se inyectan en el blastocele de
un embrin de ratn receptor. En el protocolo descrito en la
figura 18.49, el embrin receptor se obtiene de una cepa negra.
El embrin inyectado se implanta en el oviducto de una hem-
bra que se prepar con hormonas para llevar el embrin a
trmino. Mientras el embrin se desarrolla en su madre susti-
tuta, las clulas madre ambrionarias inyectadas se unen con
lamasa celular interna propia del embrin y contribuyen a la
formacin de tejidos embrionarios, inclusive las clulas germi-

Ratn no quimrico con pelaje pardo (A/a), heterocigoto
para el gen X (X/). Se producen ratones con inactivacin gnica
apareando dos de estos heterocigotos, y seleccionando homocigotos X/.
Figura 18.49 Formacin de ratones con inactivacin gnica. Los
pasos se describen en el texto.
Los ratones con inactivacin gnica son resultado de una serie
de procedimientos experimentales que se muestran en la fi-
gura 18.49.
5
En fecha reciente se ha utilizado otra tcnica para la eliminacin gnica,
para as obtener ratas con genes inactivados. En este caso, se actu en un gen
especfico del genoma de la rata por medio de la inyeccin, en el cigoto del
animal (embrin de una etapa) de mRNA que codificaba un tipo de enzima
llamada nucleasa de dedos de cinc (ZFN; zinc-finger nuclease). Las ZFN son
enzimas restrictivas artificiales producidas en el laboratorio por la fusin de
un gen que codifica un dominio de unin de DNA de dedo de cinc (pg.
520) con un dominio de corte de DNA. ZFN secciona las dos cadenas de
DNA en una secuencia especfica de nucletidos que se conoce por medio de
una secuencia de aminocidos de la enzima, con bioingeniera gentica. Las
protenas pueden ser adaptadas de modo que ataquen un conjunto grande
de secuencias especficas, y de este modo se pueden utilizar para la inactiva-
cin de prcticamente cualquier gen del genoma. La misma secuencia de
DNA blanco aparece en los alelos materno y paterno, razn por la cual la
inyeccin de un preparado con una de estas enzimas al interior de la clula,
borra ambas copias del gen blanco y as genera inactivacin homocigota
sin tener que recurrir a un intermediario heterocigoto como ocurre con el uso
de la recombinacin homloga que se muestra en la figura 18.49. En fecha
reciente, una clase de protenas artificiales llamadas nucleasas efectoras de
TAL (o TALEN, TAL effector nucleases) se obtuvieron como endonucleasas
que pueden ser biomodificadas genticamente para actuar en cualquier se-
cuencia de DNA especfica. Es muy pronto para saber si las nucleasas men-
cionadas tendrn o no uso amplio en la formacin de inactivaciones, pero ya
se han convertido en importantes instrumentos de edicin gnica.
780 nales de las gnadas. Estos ratones quimricos pueden reco-
nocerse porque su pelaje tiene caractersticas de las cepas do-
nadora y receptora. Los ratones quimricos se aparean con un
miembro de una cepa endogmica negra para saber si las clu-
las germinales contienen la mutacin de eliminacin gnica.
La descendencia ser heterocigtica para el gen en todas sus
clulas si las clulas germinales contienen la mutacin por eli-
minacin. Los heterocigticos pueden reconocerse por la co-
loracin parda de su pelaje. Despus estos heterocigticos se
aparean entre s para producir descendientes homocigticos
para el alelo mutante. Estos son los ratones con inactivacin
gnica que carecen de una copia funcional del gen. Cualquier
gen del genoma, o cualquier secuencia de DNA para el caso,
puede modificarse de cualquier manera que se desee usando
este mtodo experimental.
En algunos casos la delecin de un gen particular puede
conducir a la ausencia de un proceso particular, lo que propor-
ciona evidencia convincente de que el gen es esencial para ese
proceso. Sin embargo, a menudo la delecin de un gen que se
cree participa en un proceso esencial causa poca o ninguna
alteracin en el fenotipo del animal. Tales resultados pueden
ser difciles de interpretar. Por ejemplo, es posible que el gen
no participe en el proceso que se estudia o, como casi siempre
sucede, que la ausencia del producto del gen se compense con
el producto de un gen distinto. La compensacin de un gen
por otro puede verificarse con la produccin de ratones que
carecen de los dos genes en cuestin (es decir, doble inactiva-
cin gnica).
En otros casos, la ausencia del gen conduce a la muerte
del ratn en etapas tempranas del desarrollo, lo que tambin
hace difcil identificar la participacin del gen en la funcin
celular. Los investigadores a menudo pueden salvar este pro-
blema mediante una tcnica que permite la anulacin de un
gen particular en slo uno o varios tejidos deseados, mientras
que el gen se expresa en el resto del animal. Estas inactivacio-
nes condicionales, como se les llama, permiten a los investigado-
res estudiar la participacin del gen en el desarrollo o funcin
del tejido afectado. Un objetivo actual del International Knoc-
kout Mouse Consortium es generar inactivaciones condicionales
de todos los genes del genoma murino.
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular
RNA de interferencia
Los ratones con inactivacin gnica representan una estrategia
invaluable para aprender sobre la funcin gnica, pero la gene-
racin de estos animales es laboriosa y costosa. En los aos
recientes, una nueva tcnica del campo de la gentica inversa
alcanz un uso difundido. Como se explica en la pgina 457,
el RNA interferente (RNAi) es un proceso en el que se de-
grada un mRNA especfico por la presencia de un pequeo
siRNA bicatenario cuya secuencia est contenida dentro de la
secuencia del mRNA. Es posible estudiar las funciones de
genes en una planta, nematodo o mosca de la fruta mediante
la simple introduccin de un siRNA en uno de estos organis-
mos por varios medios para examinar el fenotipo del orga-
nismo que resulta de la deficiencia del mRNA correspon-
diente. La identificacin de las funciones de los genes al nivel
celular, en lugar de al nivel del organismo, puede hacerse me-
diante el estudio de los efectos de estos mismos siRNA en las
actividades de las clulas cultivadas. Con estas estrategias, los
investigadores pueden reunir informacin sobre las funciones
de grandes cantidades de genes en un periodo relativamente
corto. Como se explica en la pgina 457, el RNAi es til para
estudiar la funcin gnica en clulas de mamferos mediante la
incubacin de las clulas con pequeos dsRNA encapsulados
en lpidos o mediante la modificacin gentica de las clulas
para que produzcan los siRNA ellas mismas. Una vez dentro
de la clula, el siRNA gua la degradacin del mRNA blanco
y deja a la clula incapaz de producir protena adicional codi-
ficada por ese gen. Cualquier deficiencia del fenotipo de la
clula puede atribuirse a una disminucin marcada en la can-
tidad de protena que se investiga. Como ocurre con las elimi-
naciones gnicas, la ausencia de un fenotipo despus del trata-
miento con un siRNA no siempre significa que el gen en
cuestin no participa en un proceso particular, ya que otro gen
podra compensar la ausencia de la expresin del gen blanco.
Tambin existen bibliotecas que contienen miles de siRNA,
o vectores con DNA que codifica estos RNA, para el estudio
de la funcin gnica en diversos organismos modelos y en se-
res humanos. Los investigadores que usan estas bibliotecas
pueden estudiar los efectos de la eliminacin de la expresin
de un gen en cualquier proceso celular. Por ejemplo, debe ser
posible identificar a los genes que participan en el ensamble
del huso mittico mediante el tratamiento de las clulas con
un conjunto de siRNA de todo el genoma para luego revisar a
todas las clulas tratadas al momento de la divisin celular y
detectar la presencia de un huso mittico anormal. La figura
18.50 muestra una galera de imgenes de clulas cultivadas de
Drosophila en la metafase de la mitosis. Cada una de las clulas
mostradas en esta galera fue tratada con un siRNA dirigido
contra un gen diferente en el genoma de Drosophila. En este
estudio se valoraron ms de 14 000 siRNA distintos, de los
cuales cerca de 200 hicieron que las clulas tratadas tuvieran
un huso anormal en metafase. Ms de la mitad de los siRNA
que afectaron el ensamble del huso mittico se dirigan contra
genes cuya participacin en la formacin de esta estructura se
desconoca hasta el momento, lo que aport nueva informa-
cin sobre las funciones de estos genes. Las imgenes de la
figura 18.51 muestran los efectos de un solo siRNA que se
dirige contra un gen con participacin conocida en el ensam-
ble del huso mittico y otras actividades durante la mitosis. En
este caso, las clulas de mamfero cultivadas que se observan a
la derecha fueron transfectadas con un siRNA dirigido contra
los mRNA que codifican la cinasa Aurora B (pg. 596). La
eliminacin consecuente de esta enzima alter mucho la se-
gregacin cromosmica.
18.18 | Uso de anticuerpos
Como se explica en el captulo 17, los anticuerpos (o inmuno-
globulinas) son protenas que se producen en los tejidos linfoi-
des como respuesta a la presencia de materiales extraos, o
antgenos. Una de las propiedades ms atractivas de los anti-
cuerpos y que los hace tan tiles para los investigadores en
biologa es su especificidad notable. Una clula puede conte-
ner miles de protenas diferentes y aun as una preparacin de
anticuerpos se une slo con las molculas seleccionadas dentro
de la clula que tienen una pequea parte que se adapta a los
sitios para unin de antgeno de las molculas de anticuerpo.
A menudo pueden obtenerse anticuerpos que distinguen entre
dos polipptidos que difieren slo en un aminocido o en una
sola modificacin posterior a la traduccin (como en la pgina
527).

Figura 18.50 Determinacin de la funcin gnica por RNA in-
terferente. La figura muestra una galera de imgenes por inmuno-
fluorescencia de clulas cultivadas de Drosophila que se incubaron
con varios siRNA de cadena doble. Las clulas mostradas se acumu-
laron en metafase por un tratamiento separado que bloque el
avance hacia la anafase. Durante el estudio se examinaron ms de 4
millones de clulas. Fue posible someter a deteccin a una gran can-
tidad de clulas mediante la seleccin computarizada de las im-
genes de clulas que estuvieran en metafase para luego elegir y
ensamblar las imgenes en paneles como el que se muestra en esta
fotografa. As, poda buscarse la presencia de husos mitticos anor-
males, ya fuera por observadores humanos o por anlisis compu-
tarizado con programas diseados para detectar caractersticas
especficas de un huso anormal. (Un estudio de mayor tamao del
mismo tipo se public en Nature 464:721, 2010.) (Por Cortesa
de Gohta Goshima y Ronald D. Vale.)
Desde hace mucho tiempo los bilogos aprovechan los
anticuerpos y desarrollan una gran variedad de tcnicas que
los utilizan. En general se cuenta con dos estrategias distintas
para la preparacin de molculas de anticuerpo que interac-
tan con un antgeno determinado. En la estrategia tradicio-
nal, un animal (por lo general un conejo o una cabra) se in-
yecta varias veces con el antgeno y tras un periodo de varias
semanas se extrae sangre que contiene los anticuerpos desea-
dos. La sangre entera se trata para eliminar las clulas y los
factores de coagulacin a fin de producir un antisuero, que
puede someterse a prueba para cuantificar su ttulo de anti-
cuerpos y del que pueden purificarse las inmunoglobulinas.
781
Tubulina DNA
Figura 18.51 Determinacin de la funcin gnica por interfe-
rencia del RNA. (Izquierda) Una clula de mamfero cultivada no
tratada en la metafase de la mitosis. (Derecha) El mismo tipo de c-
lula se trat con un dsRNA de 21 nucletidos diseado para inducir
la destruccin de los mRNA que codifican la cinasa Aurora B, una
protena participante en el punto de comprobacin del huso en me-
tafase. Los cromosomas de esta clula se encuentran adyacentes al
huso mittico, lo que sugiere la ausencia de interacciones entre el ci-
netocoro y el microtbulo. (Tomada de Claire Ditchfield et
al., J. Cell Biol. 161:276, 2003, fig. 8d. Reimpresa con autori-
zacin de the Rockefeller University Press.)
Aunque este mtodo para producir anticuerpos an est en
uso, tiene ciertas desventajas inherentes. A causa del meca-
nismo de sntesis de anticuerpos, un animal siempre produce
diversas especies de distintas inmunoglobulinas, es decir, in-
munoglobulinas con diferentes regiones V en sus cadenas po-
lipeptdicas, aun cuando se enfrentan con una preparacin
purificada del antgeno. Se dice que un antisuero que contiene
varias inmunoglobulinas que se unen con el mismo antgeno
es policlonal. Como las inmunoglobulinas tienen estructuras
demasiado similares para fraccionarse, resulta imposible obte-
ner una preparacin de una sola especie purificada de anti-
cuerpo con esta tcnica.
En 1975 Cesar Milstein y Georges Khler, del Medical
Research Council, en Cambridge, Inglaterra, realizaron un con-
junto trascendental de experimentos que condujo a la prepara-
cin de anticuerpos dirigidos contra antgenos especficos.
Para comprender su trabajo es necesario divagar un poco.
Dado un clon determinado de clulas productoras de anti-
cuerpos (que provienen de un solo linfocito B), se sintetizan
anticuerpos con sitios idnticos para combinacin con antge-
nos. La heterogeneidad de los anticuerpos producidos cuando
se inyecta un solo antgeno purificado a un animal se debe al
hecho de que se activan muchos linfocitos B distintos, cada
uno con anticuerpos unidos con la membrana con afinidad
por una parte diferente del antgeno. Surgi una pregunta im-
portante: era posible resolver este problema y obtener una
18.18 Uso de anticuerpos
sola especie de molcula de anticuerpo? Considrense por
unmomento los resultados de un procedimiento en el que un
animal recibe una inyeccin de un antgeno purificado, se es-
pera un periodo de varias semanas para que los anticuerpos
seproduzcan, se extraen el bazo u otros rganos linfoides, se
prepara una suspensin de clulas nicas, se aslan las clulas
que producen el anticuerpo deseado y esas clulas particulares
se cultivan como colonias separadas para obtener grandes can-
tidades de esta inmunoglobulina particular. Si se siguiera este
procedimiento, se obtendra una preparacin de molculas de
anticuerpo producidas por una sola colonia (o clon) de clulas,
782 que se conoce como anticuerpo monoclonal. Sin embargo,
como las clulas productoras del anticuerpo no crecen ni se
dividen en cultivo, fue necesario introducir alguna manipula-
cin adicional para obtener anticuerpos monoclonales.
Las clulas de mieloma maligno son un tipo de clula
cancerosa que crece con rapidez en cultivo y produce grandes 1 Ratn inmunizado
con el antgeno Clulas de mieloma en cultivo.
cantidades de anticuerpos. No obstante, las clulas de mie- Las clulas son mutantes
loma son poco tiles como herramientas analticas porque no HGPRT e incapaces de
Se extrae el bazo crecer en medio HAT
se forman como respuesta a un antgeno particular. En lugar
de eso se desarrollan a partir de una conversin aleatoria de un
linfocito normal al estado maligno y, por lo tanto, producen el
anticuerpo que el linfocito particular sintetizaba antes de vol- 2

verse maligno.
Milstein y Khler combinaron las propiedades de estos Suspensin
dos tipos de clulas: el linfocito normal productor de anticuer- de clulas
esplnicas
pos y la clula de mieloma inmortal. Lograron esta hazaa
mediante la fusin de los dos tipos de clulas para producir
3
clulas hbridas, denominadas hibridomas, que crecen y pro-
liferan de manera indefinida, y tambin producen grandes
Fusin de clulas
cantidades de un solo anticuerpo (monoclonal). El anticuerpo en polietilenglicol
producido es el que el linfocito normal sintetizaba antes de
fusionarse con la clula de mieloma. Agregar clulas al medio
El procedimiento para la produccin de anticuerpos mo- de seleccin HAT
noclonales se ilustra en la figura 18.52. El antgeno (ya sea en
forma soluble o como parte de una clula) se inyecta en el ra-
tn para inducir la proliferacin de clulas especficas forma- 4

doras de anticuerpo (paso 1, figura 18.52). Tras un periodo de

varias semanas, el bazo se extrae y se separa en clulas indivi- Las clulas hbridas (hibridomas)
duales (paso 2), y los linfocitos productores de anticuerpo se crecen, en tanto que las clulas
no fusionadas mueren
fusionan luego con una poblacin de clulas de mieloma ma-
ligno (paso 3), lo que hace las clulas hbridas inmortales, ca- 5
paces de una divisin celular ilimitada. Para seleccionar las
clulas hbridas (hibridomas) entre las clulas no fusionadas se Probar sobrenadante en el que crecen
coloca la mezcla celular en un medio en el que slo puedan las clulas en busca del anticuerpo
sobrevivir los hbridos (paso 4). Despus los hibridomas cre- deseado. Luego cultivar clulas que
producen este anticuerpo
cen como clones en pozos separados (paso 5) y se revisan en
forma individual para detectar la produccin de anticuerpo
contra el antgeno en estudio. Las clulas hbridas que contie-
nen el anticuerpo apropiado (paso 6) pueden clonarse in vitro 6
o in vivo (como clulas tumorales en un animal receptor), de
modo que sea posible preparar cantidades ilimitadas del anti-
Captulo 18 Tcnicas en biologa celular y molecular

cuerpo monoclonal. Una vez que los hibridomas se producen,
pueden almacenarse por tiempo indefinido congelados y man-
tenerse alcuotas disponibles para los investigadores en todo el
mundo. Una de las caractersticas ms importantes de esta
metodologa es que no se comienza con un antgeno purifi-
cado para obtener un anticuerpo. De hecho, el antgeno para el
que se busca el anticuerpo monoclonal puede ser un compo-
nente menor de toda la mezcla. Cuando se tiene la prepara-
cin de molculas de anticuerpo, obtenidas ya sea por tcnicas
inmunolgicas convencionales o mediante la formacin de
hibridomas, pueden usarse como sondas muy especficas en
varias tcnicas analticas. Por ejemplo, los anticuerpos son ti-
les en la purificacin de protenas. Cuando se agrega un anti-
cuerpo purificado a una mezcla cruda de protenas, la protena
especfica que se busca, se combina de manera selectiva con el
anticuerpo y se precipita de la solucin. Los anticuerpos tam-
bin pueden emplearse en conjunto con varios tipos de proce-
dimientos de fraccionamiento para identificar una protena
particular (antgeno) entre una mezcla de protenas. Por ejem-
plo, en una prueba con el mtodo Western blot primero se frac-
ciona una mezcla de protenas por electroforesis bidimensio-
nal (como en la fig. 18.29). Luego las protenas fraccionadas se
Cultivar clonas de clulas que producen
anticuerpo contra el antgeno inyectado
Figura 18.52 Formacin de anticuerpos monoclonales. Los pa-
sos se describen en el texto. El medio HAT se llama as porque con-
tiene hipoxantina, aminopterina y timidina. Este medio permite el
crecimiento de las clulas con una fosforribosilo transferasa de hi-
poxantina-guanina (HGPRT), pero no apoya el crecimiento de c-
lulas que carecen de esta enzima, como las clulas de mieloma
mltiple sin fusionar que se usaron en este procedimiento.
transfieren a una hoja de filtro de nitrocelulosa, que se incuba
con una preparacin de anticuerpos marcados con radiactivi-
dad o fluorescencia. La localizacin en el filtro de la protena
especfica unida con el anticuerpo se establece mediante la
localizacin de la radiactividad o la fluorescencia.
Adems de su empleo en investigacin, los anticuerpos
monoclonales son de gran utilidad en la medicina diagnstica
en estudios para conocer la concentracin de protenas espec-
ficas en la sangre y la orina. En un ejemplo, los anticuerpos
mencionados constituyen la base de algunas pruebas de emba-
razo para practicar en el hogar, que identifican la presencia de
una protena (gonadotropina corinica) que aparece en la
orina unos cuantos das despus de la concepcin. Los anti-
cuerpos monoclonales tambin son muy tiles como agentes
teraputicos en seres humanos (pg. 688). Los esfuerzos por
desarrollar hibridomas humanos que produzcan anticuerpos
monoclonales no han tenido xito hasta ahora. Para sortear
este problema los ratones se pueden modificar mediante inge-
niera gentica para que los anticuerpos que producen sean
ms parecidos a los humanos en cuanto a la secuencia de ami-
nocidos. Ya se aprobaron varios de estos anticuerpos mono-
clonales humanizados para el tratamiento de diversas enfer-
medades. En fechas recientes se han modificado a los ratones
con ingeniera gentica para que su sistema inmunitario sea de
naturaleza humana. Estos animales producen anticuerpos
con estructura humana por completo.
El primer anticuerpo totalmente humano (adalimimab),
aprobado para el tratamiento de la artritis reumatoide (pg.
726), fue producido por una tcnica muy distinta; se utilizan
bacterifagos en vez de hibridomas como base para la produc-
cin de anticuerpos monoclonales. Esta tcnica se conoce
como exhibicin bacterifaga (en fago); aqu, se generan miles
de millones de partculas fgicas distintas, cada una porta un
gen que codifica una molcula de anticuerpo humano que
posee una regin variable nica (pg. 712). Diferentes fagos de
esta vasta biblioteca codifican diferentes anticuerpos, esto es,
anticuerpos con diferentes regiones variables. En cada caso, el
gen para anticuerpo se fusiona con un gen que codifica una de
las protenas de la cubierta viral, de modo que cuando el fago
se ensambla dentro de una clula hospedadora, la molcula de
anticuerpo se exhibe en la superficie de la partcula viral. Su-
pngase que se tiene una protena (antgeno) que se piensa
podra ser un buen blanco para un anticuerpo teraputico
dado. El antgeno se purifica y se permite que interacte con
una muestra de cada una de las partculas fgicas que consti-
tuyen la biblioteca fgica. Aquellos fagos que se unen al ant-
geno con alta afinidad pueden identificarse, y se les permite
que se multipliquen dentro de una clula hospedadora apro-
piada. Una vez que se ha amplificado de este modo, el DNA
que codifica el gen de anticuerpo puede aislarse y usarse para
transfectar una clula de mamfero apropiada. Las clulas mo-
dificadas por ingeniera gentica entonces se multiplican en
grandes cultivos para producir cantidades teraputicas del an- 783
ticuerpo. La produccin de anticuerpos en clulas de mam-
fero cultivadas es una empresa costosa, y se est intentando
con la alternativa de las fbricas vivas. Entre las posibilidades
para esta finalidad se encuentran cabras, conejos y clulas de la
planta del tabaco.
Una revisin rpida de esta obra revela muchas microgra-
fas que muestran la localizacin inmunitaria de una protena
particular dentro de una clula tal como se observa en el mi-
croscopio ptico o el electrnico. La localizacin inmunitaria
de protenas dentro de una clula depende del uso de anticuer-
pos que se prepararon de manera especfica contra esa pro-
tena particular. Una vez preparadas, las molculas de anti-
cuerpo se unen (conjugan) con una sustancia que las hace
visibles al microscopio, pero no interfiere con la especificidad
de sus interacciones. Para usar el microscopio ptico, los anti-
cuerpos casi siempre se unen en complejos con pequeas mo-
lculas fluorescentes, como la fluorescena o rodamina, para
generar derivados que se incuban luego con clulas o secciones
de clulas. Los sitios de unin se visualizan con el microscopio
de fluorescencia. Esta tcnica se denomina inmunofluores-
cencia directa. A menudo es preferible realizar la localizacin
de antgenos con una variacin de esta tcnica llamada inmu-
nofluorescencia indirecta. En sta, las clulas se incuban con
un anticuerpo no marcado y se permite que formen complejos
con el antgeno correspondiente. La localizacin de la pareja
antgeno-anticuerpo se revela en un segundo paso con una
preparacin de anticuerpos con marca fluorescente cuyos si-
tios de combinacin estn dirigidos contra las molculas de
anticuerpos empleadas en el primer paso. La inmunofluores-
cencia indirecta produce una imagen ms brillante porque
muchas molculas del anticuerpo secundario pueden unirse
con un solo anticuerpo primario. La inmunofluorescencia in-
directa tambin tiene una ventaja prctica: el anticuerpo con-
jugado (fluorescente) es fcil de obtener en el mercado. La
inmunofluorescencia proporciona una claridad notable debido
a que las protenas unidas con el anticuerpo se revelan a la
vista; todos los materiales no marcados permanecen invisibles.
La localizacin de los antgenos con el uso del microscopio
electrnico se logra con anticuerpos que se marcaron con ma-
teriales electrodensos, como la protena con hierro ferritina o
partculas de oro. La figura 8.23c,d muestra un ejemplo de esta
tcnica.
18.18 Uso de anticuerpos