TECNOLGICO NACIONAL DE MEXICO

INSTITUTO TECNOLGICO DE TUXTLA GUTIERREZ

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

LICENCIATURA EN INGENIERIA BIOQUMICA

B6B

MICROBIOLOGIA
Q.B.P AURA FLORES PREZ

TAREA INDIVIDUAL

INTEGRANTES: No. DE CONTROL

HERNNDEZ GMEZ LUIS ALEJANDRO 14270384
MONJARAZ PENN SAIDY 14270408

Tuxtla Gutirrez, Chiapas a 19 de Marzo del 2017

 AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS CON CAPACIDAD DE
DEGRADAR CELULOSA

INTRODUCCIN

Dentro de los microorganismos encargados de la degradacin de la celulosa,

principal componente de la pared celular de las plantas, se encuentran bacterias,
hongos y actinomicetos, aerobios, anaerobios, mesoflicos y termoflicos, los cuales
cuentan con la maquinaria enzimtica necesaria para dicho propsito, por tal razn,
su aislamiento e identificacin representa un importante recurso para lograr la
disminucin del impacto ambiental y la generacin de un sustrato fermentable cuya
utilidad podra estar entre la produccin de etanol, obtencion de cidos orgnicos,
edulcorantes, productos farmacuticos, alimentos, entre otros.

MARCO TEORICO

La celulosa es un importante constituyente carbonado de las plantas superiores y

probablemente el compuesto organico mas abundante en la naturaleza, debido a
que gran parte de la vegetacin que pasa a formar parte del suelo es celulosa, la
descomposicin de este carbohidrato tiene una importancia muy especial en el ciclo
biolgico del carbono. Consecuentemente los microorganismos del suelo que
catabolizan la hidrolisis del material vegetal (40-60% de residuos de plantas)
influencian el flujo de energa desde este punto y hasta la formacin de CO2 y su
liberacin a la atmosfera. Como las bacterias y hongos del suelo son
microorganismos mayormente involucrados en el ciclaje del material vegetal,
cambios en el nmero de estos pueden indicar modificaciones en el contenido de
materia orgnica del suelo. Cuando esto se corrobora con otros indicadores
ecolgicos (biomasa, especies encontradas) se obtiene informacin acerca del
estado del suelo y su productividad (Hendricks, et al, 1995). Como resultado, se ha
prestado gran atencin a los organismos que participan en la descomposicin de
esta sustancia (Alexander, 1980).

Estructuralmente, la celulosa es un carbohidrato compuesto por unidades de

glucosa unidad en una larga cadena lineal por enlaces en los tomos de carbono
1 y 4 de la molcula de este. La celulosa existe en las plantas superiores, en algas,
en muchos tipos de hongos y en los quistes de algunos protozoarios. El polisacrido
tiene una importante caracterstica, relativamente inusual de los polisacridos, esta
es su estructura cristalina, lo que genera regiones amorfas donde las fibras
contienen torceduras y espacios en sus microfibrillas lo cual permite la formacin de
microporos capilares lo suficientemente espaciosos para permitir la penetracin de
molculas relativamente grandes incluyendo, en algunos casos enzimas
celulolticas (Lynd, et al, 2002), Figura 1. Las microfibrillas estn estabilizadas por
enlaces de hidrogeno intra e intermoleculares y rodeadas por polisacridos
hemicelulsicos (manano y xilano)1 que se unen a la celulosa por puentes de
hidrogeno y enlaces covalentes, los cuales hacen extremadamente resistente a la
hidrolisis qumica y biolgica, as mismo, las regiones amorfas de la estructura
cristalina de la celulosa tienen una composicin heterognea caracterizada por una
variedad de enlaces por lo que esta parte es crucial para la biodegradacin de la
celulosa (Malherbe y Cloete, 2002).

Figura 1 Forma cristalina de las microfibrillas de la celulosa

1
Son polisacridos constituidos por una cadena lineal de residuos de xilosa o manosa y diversas
ramificaciones y sustituciones en su cadena.
AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS CON ACTIVIDAD
CELULOLTICA

El muestreo para la obtencion de los microorganismos buscados se realizo a partir

de un compostaje, donde se tomaran de forma aleatoria sub muestras de 100g cada
una, al cabo de 4 semanas de almacenamiento las condiciones de la muestra sern:
pH = 8,6 y una temperatura de 50C (debido a la descomposicin de los residuos
que componen la composta). Las condiciones de la muestra son las ideales para el
crecimiento de bacterias termfilas que logran descomponer la celulosa. La
metodologa para el asilamiento y la seleccin de bacterias es la que se describe a
continuacin:

Aislamiento primario
1. Llevar 10 g de la muestra con 90 mL de agua estril
2. Agitar la muestra y filtrar con membrana millipor la solucin para eliminar
toda la materia orgnica
3. Del filtrado se toman 10 mL y se lleva a 90mL de Agua peptonada 0.1% (p/v).
4. Realizar diluciones seriadas de 10-1 a 10-5 en agua peptonada 0.1%(p/v)
5. A partir de las diluciones, Realizar una siembra en superficie en agar
Carboximetilcelulosa (CMC) al 1%(p/v)
6. Incubar a 45C por 48hrs
7. Transcurrido el tiempo de incubacin, adicionar rojo Congo 1%(p/v) como
revelador a las colonias presentes en el medio.
8. Luego de 15 min retirar el exceso adicionando NaCl 0.1M y reposar 15min
despus de.

El rojo Congo se asocia con la Carboximetilcelulosa y forma un color intenso que

evidencia la hidrolisis de polisacridos, color que se desvanece ante la actividad
despolimerizante de la endo glucanasa, facilitando de la misma manera, la
identificacin de los microorganismos con diferentes actividades celulolticas
(Teather y Wood. 1982). El rojo Congo tiene una alta afinidad frente a los
polisacridos y ha sido utilizado para el aislamiento y diferenciacin de varias
especies de microorganismos (Bly et al. 2006) (Berkhoff & Vinal. 1986).

Aislamiento secundario
9. A partir de los microorganismos obtenidos en el aislamiento primario se
seleccionaron los m.o. con mayor presencia de actividad celuloltica y se
realizaron Subcultivos por la tcnica de estra cruzada en agar CMC al
1%(p/v) de las colonias en cajas, llevando a incubacin y revelando bajo las
mismas condiciones del aislamiento primario.
 10. Se realizaron pruebas bioqumicas para la identificacin de las bacterias que
crecieron en los Subcultivos.

MEDIOS DE CULTIVO

Constituyentes habituales de los medios de cultivo

AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivo. El componente predominante en el agar bacteriolgico es un
polisacrido al que acompaan algunas impurezas y que se obtiene de
ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2 % en agua licua hacia los 100C
y se gelifica alrededor de los 40C, dependiendo de su grado de pureza. Con
la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado
como nutriente por las bacterias.

EXTRACTOS. Son extrados, con agua y calor, de ciertos rganos o tejidos

animales o vegetales (p.e.: carne, hgado, semillas...) y posteriormente
concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Se utilizan de forma
deshidratada.

PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados

y sales minerales que se obtienen por digestin enzimtica o qumica de
protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, casena). Son muy
ricas en pptidos y aminocidos.

SISTEMAS AMORTIGUADORES. Son incorporados al medio de cultivo para

mantener el pH dentro del rango ptimo de crecimiento bacteriano.

INDICADORES DE pH. Son compuestos que presentan una coloracin

diferente segn la acidez- basicidad del medio. Cada indicador presenta
colores diferentes adems de un rango propio de valor de pH al cual cambia
de color. Se aaden a menudo a los medios de cultivo para detectar
variaciones de pH.

AGENTES SELECTIVOS. Permiten el crecimiento de determinados

microorganismos e impiden el crecimiento de otros; p.e. sales biliares,
antibiticos, etc.
Medio de Cultivo Propuesto

Agar Agente gelificante.

Extracto de levadura Fuente de Nitrgeno, Carbono, Vit., y Cofactores
NaCl Balance osmtico
MgSO4 SO4-2: Cadena transportadora de electrones y Mg: Cofactor
NH4H2PO4 Formacin de los primeros aminocidos, protenas, etc.
Extracto de madera Celulosa cristalina Polisacrido fuente de energa
Agua destilada
Ajuste a pH neutro (7.5 8.6)

Cabe aclarar que uno de los medios ms utilizados para este tipo de organismos es
el agar CMC (Carboximetilcelulosa) y segn la bibliogrfica tambin se utilizan
medios a base de extractos vegetales (Agar Extracto de aserrn).

Condiciones de la descomposicin

Temperatura: Cada una de las variedades de organismos celulolticos es

afectada en forma diferente por la temperatura. Los mesofilos dominan en
temperaturas moderadas mientras que la micro flora termoflica puede
degradar la celulosa por arriba de los 45C. Debido a los cambios en la
composicin de la flora inducidos por la temperatura, el calor aumenta la
velocidad de transformacin del sustrato a causa del efecto directo de esta
sobre la accin enzimtica (Alexander, 1980).

Aireacin: La aireacin tambin rige la composicin de la flora activa. A

causa del proceso anaerbico, el metabolismo de la celulosa es reducido
significativamente en medios deficientes de oxigeno en comparacin con los
medios aireados (Alexander, 1980).

pH: En medios con pH entre neutro y alcalino, muchos microorganismos son

capaces de crecer y liberar enzimas apropiadas para la hidrolisis del
polisacrido; bajo condiciones acidas la desaparicin de la celulosa se debe
principalmente a los hongos filamentosos. Aunque el proceso es rpido a pH
menor a 5 y ocasionalmente debajo de 4. (Howard, et al., 2003).

Enzimas implicadas en la degradacin de la celulosa

El mecanismo ampliamente aceptado para explicar la hidrolisis enzimtica de la

celulosa involucra la accin enzimtica de tres enzimas: endo 1,4 glucanasa (
1,4 glucano glucanohidrolasa), exo 1,4 celobiohidrolasa y la 1,4 Glucosidasa
(Lymar, et al., 1995; Zhang, et al., 2006).
La endo 1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces 1,4 glucosidicos
intermoleculares accesibles de cadenas de celulosa para producir oligosacridos de
varias longitudes. La exo 1,4 celobiohidrolasa cliva2 los extremos no reductores
del sustrato, generando unidades de celobiosa o glucosa y por ltimo la 1,4
Glucosidasa, completa el proceso hidroltico convirtiendo los fragmentos de
celobiosa a glucosa o removiendo glucosa desde los extremos no reductores de
pequeos celoligosacaridos (Lymar, et al., 1995; Zhang, et al., 2006).

Evaluacin de la actividad Enzimtica

La actividad enzimtica de las enzimas puede ser medida de dos formas bsicas:

1. medicin de la actividad individual de cada celulasa (endoglucanasas,

exoglucanasas, y Glucosidasa).
2. Medicin de la actividad total de las celulasas (Zhang, et al., 2006).

1.1. Endoglucanasas

Las endoglucanasas como ya se haba mencionado actan al azar sobre los

enlaces y su actividad es con frecuencia medida sobre celulosa soluble con alto
grado de polimerizacin, como es el caso de CMC. La accin de las endoglucanasas
sobre este sustrato celulsico se caracteriza por la disminucin de la viscosidad
realizando clivajes intermoleculares (Zhang, et al., 2006). Adems la tasa de
hidrolisis est condicionada a la habilidad de las endoglucanasas para actuar en las
regiones amorfas de las matriz cristalina de la celulosa y crear nuevos extremos
reductores en los cuales las exoglucanasas puedan actuar (Malherbe y Cloete,
2002).

La medicin de la actividad de endoglucanasas puede ser basada en la reduccin

de la viscosidad del sustrato y/o en el incremento de extremos reductores que se
determina por tcnicas que permitan medir azucares reductores. Sin embargo, la
actividad de las exoglucanasas tambin incrementa el nmero de extremos
reductores por lo cual, es recomendable que la actividad de las endoglucanasas sea
medida por ambos mtodos (viscosidad y extremos reductores) (Lynd, et al., 2005).

2
Propiedad que presentan determinados materiales de dividirse fcilmente ante un efecto
mecnico siguiendo unos planos determinados de debilidad siempre en concordancia con la
simetra material
1.2. Exoglucanasas

Las enzimas clivan los extremos accesibles de la molcula de celulosa para liberar
glucosa o celobiosa. La celulosa microcristalina (Avisel) es un sustrato adecuado
para la medicin de la actividad por tener un bajo grado de polimerizacin y una
baja accesibilidad (Zhang, et al., 2006).

1.3. Glucosidasa

La Glucosidasa hidroliza la celobiosa soluble y otras celodextrinas con un grado

de polimerizacin superior a 6 y la posterior produccin de glucosa. La tasa de
hidrolisis disminuye con el incremento en el grado de polimerizacin del sustrato. La
actividad de esta puede ser medida usando celobiosa, la cual no es hidrolizada por
endo ni exoglucanasas (Lynd, et al., 2005).

2. Celulasas Totales

El sistema de celulasas hidroliza sinrgicamente la celulosa cristalina. La evaluacin

de la actividad de las enzimas celulolticas es con frecuencia evaluada usando
sustratos insolubles los cuales incluyen: Papel filtro Whatman No.1 y celulosa
microcristalina. La heterogeneidad de la celulosa insoluble y la complejidad del
sistema de celulasas causa problemas en la medicin de la activad total y por ende
la tasa de hidrolisis en corto tiempo disminuye provocando la desactivacin de las
celulasas (Zhang, et al., 2006).

Curva de Crecimiento de la actividad enzimtica

Metodo de azucares reductores (DNS)

Fundamento

El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-cidodinitrosaliclico

para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra, seguido de la
determinacin espectrofotomtrica a 540nm de los azcares reductores. Esta
tcnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una
fermentacin o para cuantificar los productos de una reaccin enzimtica.

Procedimiento

Para evaluar la actividad enzimtica de las cepas, se realizaran inoculaciones en

tubos con caldo CMC 1%(p/v) y tambin con el medio propuesto, adicionando 10%
de inoculo de cada cepa que se logro identificar, incubando a 45C durante 18 - 24
hrs.
Las muestras tomadas, cada hora durante ese tiempo, fueron inmediatamente
centrifugadas por 20 min y 120 rpm, a partir de los sobrenadantes obtenidos se tomo
un volumen de 0.5 mL, al cual se adiciono 0.5mL de DNS, esta mezcla se someti
a ebullicin por 5 min; transcurrido ese tiempo, la mezcla se llevo a un recipiente
con hielo durante 5 min y posteriormente se adiciono 5 mL de agua destilada. Esta
solucin fue leda en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm y
sensibilidad media, para registrar la absorbancia generada, dicha absorbancia se
debe de reemplazar en la ecuacin de la lnea recta que arroja la curva patrn, la
cual se debe de realizar previamente para la obtencin de la concentracin de
glucosa residual en cada hora de muestreo (Miller. 1959).

Determinacin de actividad celuloltica mediante la tcnica de Somogyi

Nelson

Fundamento:

El mtodo de Somogyi-Nelson, altamente reproducible, determina azcares

reductores presentes en concentraciones muy bajas (20 - 180 g/ml), razn por la
cual se lo escogi para determinar el porcentaje de azcares reductores presentes
en el medio

Un azcar reductor agregado al reactivo de Smogyi, va a producir un precipitado

de cobre reducido, en la forma de hidrato cuproso y oxido cuproso, que va a tener
un color rojo o amarillo, en su medio bsico (pH 9). En estas condiciones se oxidan
en su medio cido (pH 1.2 2.0) el arsenato y molibdato del reactivo de Nelson,
dando origen a la formacin de molibdeno azul, coloracin que se mantiene estable
por 24-36 horas y que puede leerse mediante un espectrofotmetro a 520nm para
la determinacin de la concentracin (Nelson, 1944; Somogyi, 1952; Gonzales
& Castellanos, 2003).

Procedimiento

Para la determinacin de azcares reductores, se realizaran inoculaciones en tubos

con caldo CMC 1%(p/v) y tambin con el medio propuesto, adicionando 10% de
inoculo de cada cepa que se logr identificar, incubando a 45C durante 18 - 24 hrs,
se tomar una muestra cada hora, en las cuales se adicionaron 0,5 mL de tolueno
y 20 mL de buffer acetato pH 5,5, dejando reposar 20 min a 30 C. Una vez cumplido
este tiempo se centrifugaron las muestras a 8.000 rpm, 20 min en bao de hielo a 4
C (Deng y Tabatabai, 1994). Del sobrenadante obtenido a partir de la centrifugacin
se tomaron 200 L y se mezclaron con 200 L del reactivo de Somogyi I y 50 L del
reactivo Somogyi II. La mezcla se homogeniz durante 1 min con el uso de un
agitador vortex, para posteriormente someterla a 90 C en bao mara durante 20
min. El enfriamiento se realiz mediante la inmersin de los tubos en agua fra
durante 5 min. Finalmente se adicionaron 250 L del reactivo de Nelson y 700 L
de agua desionizada. La lectura de absorbancia se realiz a 595 nm 24 h despus
de terminado el procedimiento (Rodrguez, 2000).

Otras tcnicas que se pueden utilizar:

Determinacin de actividad celuloltica mediante la tcnica Fluorognica

Para la deteccin de la actividad enzimtica extracelular las muestras de suelo se

mezclaron en una relacin 5:1 con agua desionizada. La tcnica se realiz mediante
el procedimiento descrito por Boscker y Cappenberg (1994), con una concentracin
de 4-metilumbeliferil -glucosa de 2 M. La fluorescencia generada se midi en un
Fluormetro, a una longitud de onda de excitacin de 360 nm y una longitud de onda
de emisin de 455 nm. La conversin a sustrato hidrolizado se realiz mediante la
comparacin con la curva patrn, utilizando el fluor- 500 Agron. Colomb. 26(3)
2008 geno 4-metilumbeliferona base (MUF). La actividad de -glucosidasas se
define como mol MUF liberado por g de suelo y hora. Para el anlisis de los
resultados se utiliz el programa estadstico JMPin versin 4.0 para Windows;
mediante el test Kruskal Wallis se determinaron diferencias significativas entre los
tratamientos evaluados a travs del tiempo y, finalmente, se aplic un ndice de
correlacin de Pearson para establecer la similitud entre los mtodos MUF y SN.
DIAGRAMA DE FLUJO
Extraer una muestra de
composta
A partir de las
diluciones realizar
siembra en superficie
en agar CMC
Incubar a 45 por 48h,
adicionar Rojo Congo 1% (p/v),
esperar 15 min agregar NaCl
0.1M y reposar 15min ms.
Aislamiento primario
Se pesaron 10g y se
llevaron a 90mL de agua
estril Agitar y filtrar con membrana
millipor
Diluciones seriadas Tomar 10mL de filtrado
x10-6 agua peptonada y llevar a 90mL de agua
peptonada 0.1% (p/v)
Aislamiento secundario
Subcultivos por la tcnica de estra cruzada
en agar CMC al 1%(p/v) de las colonias,
incubar a las mismas condiciones.
Realizar pruebas
bioqumicas
Actividad enzimtica
 Actividad enzimtica

DNS Somogyi Nelson

Realizar inoculaciones en tubos con

caldo CMC

Incubar a 45C durante 18 a 24 h,

tomas muestras cada hora

0.5 mL de Tolueno
+ 20 mL de Buffer
Centrifugar por acetato pH 5.5,
20 min a Reposar 20 min a
120rpm 30C

Tomar 0.5mL + Centrifugar por

0.5mL DNS, ebullir 20 min a 8,000
por 5min, y llevar rpm a 4C
a bao de hielo
por 5 min 200 L
sobrenadante +
Adicionar 5 mL 200 L R. de
de agua dest. Somogyi I + 50
L R. Somogyi II
Leer la solucin
a 540 nm

Adicionar 250 L de
Someter a 90C en bao
Leer la solucin a 595 R. de Nelson y 700 L
Mara por 20 min y luego
nm despus de 24h de agua desionizada
bao de agua fra por 5 min
del procedimiento
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