Cultivo in Vitro de Plantas Caserocomplt

Cultivo in vitro de plantas casero: mis experiencias
Hola, ahi van mis ltimas experiencias con el cultivo in vitro casero. Con este tema me
gustara aclarar que stas tcnicas no tienen porqu quedar relegadas nicamente a
los laboratorios, y animar a todos los que nos encantan la ciencia y las plantas a
ponerse con ello. Ah va..
Material:
-Pinzas
-Bistur
-Mechero
-Agua destilada
-Leja
-Botes de cristal o contenedores de polipropileno (PP5)
-pHmetro
-KOH (u otro producto para subir el pH)
-Bscula
-Agar
-Medio de cultivo (MS)
-Reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas)
-Azcar
-Olla a presin
-Pipeta o jeringa para medir pequeos volmenes.
-Jarra (para medir volmenes)
Y lo ms importante, una cmara que nos permita trabajar en un ambiente estril. Hay
varias opciones en ste punto:
-Glovebox: Es la opcin ms barata, por unos 20-40 euros podemos fabricarla, y por
un poco ms le podemos poner una bombilla UVC para esterilizar superficies
- Flowhood: La constru siguiendo un manual en internet. Sale un poco ms cara, ya

que cuenta con un filtro HEPA y un extractor adecuado para conseguir un flujo laminar,
pero te ofrece una comodidad digna de una cabina de laboratorio.
Tutorial de construccin: http://www.fungifun.org/English/Flowhood#construction
Medio de cultivo
El medio de cultivo utilizado es el Murashige & Skoog, y para el buen desarrollo de los
explantos el pH fue corregido a 5,8 con KOH (durante la esterilizacin desciende unos
0,3 puntos) se le aadieron 15 g/L de dextrosa y 10 g/l de agar. Adems, se le aadi
la siguiente concentracin hormonal:
-Kinetina (2 mg/l) ------- (Citoquinina)

-AIA (0,2 mg/l) ---------- (Auxina)
La concentracin hormonal ideal vara mucho entre especies. Para empezar utilic una
regla habitual para el cultivo de yemas que suele ser usar 10 veces ms citoquininas
que auxinas. Como el material vegetal era relativamente viejo us una concentracin
que me pareci bastante alta de citoquininas (2mg/L).
Esta concentracin hormonal favorecer la proliferacin celular y el consiguiente

crecimiento de los tejidos. Cuando las yemas hayan crecido lo suficiente, las cambiar
a otro medio con diferente concentracin para que enraicen.
Si quisieramos establecer un protocolo para optimizar la micropropagacin, habra que

probar distintos genotipos y distintas concentraciones hormonales para el mismo
medio, y despus quedarnos con la mejor.
Material vegetal
- Ramas de potos (Epipremnum aureum)

- Ramas de camo (Cannabis sativa)
Esterilizacin del medio

El medio de cultivo fue esterilizado en la olla a presin durante 40 minutos desde que
se alcanza la mxima presin.
Esterilizacin del material vegetal
Para esterilizar el material vegetal, segu las siguientes indicaciones:
-1 minuto sumergidas en alcohol 70%

-10 minutos sumergidas en agua destilada + leja al 15%
-3 lavados consecutivos de 5 minutos en agua destilada estril.
ste es el apartado ms delicado, ya que si te pasas con la leja o el tiempo, los

explantos se mueren, y si no llegas no acabas con todos los hongos/bacterias y tus
cultivos se contaminan.
Siembra
La siembra de los explantos se realiz en condiciones de esterilidad gracias a al flujo

laminar. Sembr explantos con y sin meristemos para observar las distintas
respuestas.
Mantenimiento
Fotoperodo 16/8 con un fluorescente de bajo consumo de 20W.

Re: Cultivo in vitro
Ahi van los resultados:
Vista general:
Potos:
Caamo:
Muy interesante Troncoton y sobre todo me parece excelente el link para poder
construir la campana de flujo laminar. Una pregunta veo que utilizas vasos de plstico,
son de plstico comun y corriente y cmo los esterilizas?
Hola Acourtia! Los vasos tienen que ser de polipropileno. Para asegurarnos, en la base
debe aparecer el siguiente smbolo:
PP significa Polipropileno, y el nmero creo que corresponde al espesor. Cualquier otra

indicacin que no sea PP5 (PET, LDPET, etc..) no resistir la temperatura de
esterilizacin (en la olla express 30-40 minutos).
Respecto a la cabina de flujo laminar funciona genial, y si le colocas un avance de

metacrilato y una lmpara UVC ya es la bomba Por unos 200-300 euros te cumple la
misma funcin que una de 5000, y hay incluso quien le pone contador de horasy todo..
Un saludo
hola , he leido mucho este tema ya que tambien soy aficionada a las orquideas , de
antemano te felicito y que bueno que nos compartas tu experiencia.... a ver si algun
dia dejo de leer tanto para dar manos a la obra.... me surgen algunas aun para iniciar
esta aventura in vitro...Muchisima suerteeeeeee
Hola Mileth, te animo a que te pongas con ello, la satisfaccin de ver como crecen y
evolucionan los explantos sin contaminarse es nica. Pronto empezar nuevos
experimentos con semillas de cactus y orqudeas. Cualquier cosa que quieras
preguntar no te cortes, intentar ayudar en lo que pueda
Un saludo
Buensimo este post!!

Y felicitaciones por el trabajo y los resultados!!!!
Y ya que dices que preguntemos...aqui van varias preguntas :
Los tallos de potos, uno (el brotado) se ve en la foto que tiene un nudo....los otros no?
Los recipientes de PP que usas son de esos rgidos de pared ms gruesa o son los de
pared fina (que son ms blandos)?
Cuanto tiempo tardaron en brotar as como se ve en las fotos?
Espero que sigas poniendo fotos para ver como van evolucionando!
Est excelente!!
Hola pelargonium! gracias por pasarte
En el cultivo in vitro hay multitud de tcnicas, todas ellas parecidas en el fondo pero
muy diferentes en los detalles. Me explico, lo que hace que un determinado tejido de
una especie muestre una respuesta concreta (medio de cultivo con concentracin
hormonal X), no lo hace igual ni para otro tejido de la misma especie, ni mucho menos
para otro tejido de una especie distinta.
Las fotos muestran la utilidad ms intuitiva, la micropropagacin por cultivo de yemas

de un solo nudo ("single node culture"), que bsicamente son esquejes muy pequeos
(sin hojas), que contienen una yema de crecimiento. ste caso es el ms sencillo ya
que no tienes que inducir la aparicin de brotes adventicios. En el caso del poto a los
8-10 da ya haba respuesta.
Tambin sembr algunos explantos sin "nudo" (unos ,pero tan solo uno ha
respondido:
ste mtodo es lo que se denomina "organognesis directa", y requiere una
concentracin hormonal diferente al anterior mtodo, y variable segn la edad de la
planta, el tipo de hormona e incluso la variedad. Aqui la cosa cambia, ya que tienes
que inducir brotes adventicios. De ste primer experimento podramos concluir que el
medio que he usado con la concentracin hormonal que puse arriba, funciona para la
propagacin de yemas pero no va tan bien para la organognesis directa.
Respecto a lo de los envases de plstico, valen todos en los que aparezca el smbolo de
PP5.
Pronto subir alguna foto ms actualizada.
Un saludo!
Ahi van algunas fotos actualizadas. Ya hay dos explantos sin nudo en los que estn
empezando a aparecer nuevos tallos:
Sensacional!!!!
Me hiciste dar ganas de probar... voy a ver si me animo...

(Se me va a contaminar todo seguro, pero bueno...quien no arriesga...jejeje)
Buensimo como te sali y es increible lo rpido que ocurri la organognesis. (cuanto

fue? 20 dias? algo as?)
En el potos (Epipremnum aureum) tambin se pueden usar pecolos o fragmentos de

hoja, pero dicen que demoran mucho ms.
Buensimo el post!!!!!
Gracial pelargonium!
Te recomiendo que pruebes con cotiledones e hipocotilos de tomate, de lo que he
probado es lo ms fcil de propagar, en 2-3 semanas estaban as:
Adems en tomate no es absolutamente necesario el uso de hormonas, ya que en
medios 0/0 se pueden regenerar tallos. Lo complicado ser conseguir las sales, aunque
puedes hacer tus pruebas con diferentes concentraciones de abono lquido + vitaminas
+ azcares. Si quieres intentarlo ms en serio te puedo decir donde lo venden por
internet. Por cierto, gracias a tu post me he dado cuenta de que estaba equivocado en
el nombre cientfico del poto, ya lo he editado
Trocoton Felicidades y muchisimas gracias, estos foros son fenomenos y muy

colaboradores todos
Hola!
hace un tiempo me consiguieron algo de medio MS y alguna hormona (BAP), y aqu

ANA se consigue en cualquier lugar con o sin vitamina B, que se vende como hormona
para enraizar.
Buensimos los tomates!
Vos te vas a reir pero lo que me pasa es que a veces no me motiva probar con cosas
que salen directo y facil de semilla, o con plantas tipo violeta africana como hacen
todos, pero que uno pone una hoja en agua sola y salen un monton de plantitas sin
agregar nada.
Obvio, ya se que hay que hacerlo para practicar, pero eso me saca las ganas!
Igual, ahora que mostraste tomates, ya le eche el ojo a unas semillas de tomates
enanos!!! , que son las plantas de tomate mas chicas que existen (que se pueden
tener hasta en el alfeizar de una ventana o sino en una pequea maceta colgante),
que son plantas chiquitas pero dan buenos tomates y de esas venden de a muy pocas
semillas.... ahi s valdra la pena!!
Vamos a ver que hago, ya me puse a hacer algunas pruebas! jejeje
Abrazos y que siga este post!!!
http://archivo.infojardin.com/tema/cultivo-in-vitro-de-plantas-casero-mis-experiencias.157549/
El cultivo in Vitro se hace en frascos cerrados y en condiciones controladas y estriles. El sustrato de cu
Qu materiales nos hacen falta para llevar a cabo el cultivo in Vitro?.
.- El medio de cultivo: sus componentes.
Estos elementos son bsicamente: agua, sales minerales, azcar, vitaminas, y en algunos casos hormonas vege
La adicin de extracto de levadura es muy beneficiosa pues proporciona vitaminas inusuales, algo de nitrgen
Se puede aadir tambin: leche de coco verde filtrada por un filtro normal de caf (20 ml por cada litro de med
es muy cido y hay que corregirlo despus, necesitando entonces de aparataje. Hay peachimetros muy econm
A tener en cuenta que:
La leche de coco suele ir mejor para germinacin o cultivo de tejidos y el pltano para el desarrollo de
La banana como aditivo funciona muy bien (que no est pasado, los entre verdes y amarillos son ideale
El agua preferiblemente destilada, pero se podra usar de lluvia siempre que est bien limpia.
Si se usa vermiculita como soporte, no se aade agar.
Obtencin de los elementos anteriores:
Cmo mezclamos todo esto?
Simplemente se disuelve todo en una parte del agua excepto el agar. Si se usa pltano debe hacerse papilla mu
una base fuerte (hidrxido sdico o potsico generalmente). Finalmente aadir el agar.
Esto se mete en el microondas y como el agar tarda en disolverse, para no calentar mucho la mezcla, sern nec
Una vez disuelto el agar se espera a que enfre un poco (bsicamente para uno evitar quemarse) sin que llegue
.- Cmara de esterilidad: caractersticas bsicas.
En cultivo in Vitro hablamos de esterilidad cuando no hay bacterias ni otros microorganismos: slo est vivo e
Se hace una caja de metacrilato de unos 40 cm de altura por 60 de ancho y 40 de profundidad, sin fondo, que s
En la parte frontal se hacen unos orificios adecuados para introducir las manos a los que se les acoplan unos g
La distancia entre agujeros y sobre todo el tamao de los mismos va a ser variable, dependiendo principalmen
cortarse en los brazos.
El modo de acoplar los guantes tambin se puede hacer de varias formas: Se pueden acoplar dos bolsas alarga
sobre la bolsa, pues son ms sensibles para trabajar. Estos se pueden tratar con alcohol simplemente pulveriza
fijndolos con cinta.
PROCESOS DE ESTERILIZACIN:
.- Esterilizacin de materiales y medios de cultivo
El medio de cultivo mezclado como anteriormente se indic en "Cmo mezclamos todo esto?" se vierte en lo
stos se introducen en la olla con la tapa del frasco floja pues si no se rompen (la olla por supuesto con agua, p
El resto de los materiales (pinzas, tarros de microondas, etc) puede ir sobre los frascos (nunca nadando en el a
tarros de microondas o envueltos en papel de aluminio.
Una vez que estn todos los materiales en la olla se cuecen 10 minutos (contados a partir de que empieza a her
A tener en cuenta que:

En el caso de usar vermiculita como soporte para el cultivo, se ponen tambin unos 3 cm de vermiculit
Algunos tarros para microondas no sirven. Tienen que tener la indicacin PP (polipropileno). En algun
.- Esterilizacin de Semillas y cpsulas:
Las semillas son muy pequeas por lo que se usan pequeos sobrecitos hechos con papel de filtro, para esteril
Cada sobrecito no debera contener ms volumen de semilla que el equivalente a tres o cuatro granos de arroz.
bolsitas.
Se esterilizan en leja al 20% (1 parte de leja y 4 de agua) durante 15-20 minutos, moviendo algo el sobrecito
veces en agua estril. Para este proceso, es necesario tener un frasquito con leja al 20% y cuatro frasquitos est
Si se usan cpsulas verdes, stas interiormente estn estriles (microbiolgicamente), por lo que se manejan si
semillas inmaduras que hay en el interior. Cada especie tiene diferentes tiempos de recoleccin como cpsula
.- Esterilizacin de la cmara de esterilidad:
La cmara de esterilidad la podemos esterilizar de dos maneras:

Duracin de la esterilizacin de la cmara:
Si la cmara est ms o menos estanca (que no entre aire) se podra trabajar toda la tarde. Sin embargo, es con
contaminacin a otros materiales. Una inmersin del material durante unos minutos es suficiente (en una parad
orqudeas.
SEMBRADO Y GERMINACIN
Se esterilizan las semillas y/o cpsulas en sobrecitos hechos de papel de filtro (para que entre la leja), segn h
En general, la germinacin es mejor en oscuridad, as que despus mejor guardar los frascos en una caja bien c
Despus de unos 15 das a un mes (a veces ms) se empiezan a ver las semillas engrosar y ms adelante forma
REPICADO
Cuando tienen aproximadamente medio cm ya han consumido casi todo el nutriente, por lo que se cambian al
Tambin se puede aplicar luz (y sera lo mejor) con 2 fluorescentes puestos a unos 30 cm de los frascos que es
PLANTADO EN SUSTRATO
Como norma general, cuando las plantas tienen unos 3-4 cm de alto (estn suficientemente desarrolladas), se p
Al principio se debe usar un sustrato menos poroso (puede ser vermiculita, abonada con abono lquido), y cub
Tambin los botellines de agua cortados por la mitad y puestos sobre la planta son ideales para evitar la deshid
Adems, se hace necesario un tratamiento con un funguicida, pues en esta etapa de adaptacin hay una fuerte
En laboratorio, con medios de cultivo ms controlados, la luz adecuada y aparataje se pueden obtener plantas e
Tengo que sealar que esta no es la forma en que se hace el cultivo in Vitro en un laboratorio. Para hacer culti
esterilidad. Esta corriente de aire estril se genera mediante un motor que hace pasar el aire normal a travs de
parte, adems de ser relativamente caras (si alguien se atreve le ayudo a conseguirlos).
Existen algunos aparatos de aire acondicionado para alrgicos que tienen sistemas de filtros para el polen que
reproduciendo sus hbridos a escala domstica.
MS INFORMACIN SOBRE EL TEMA PERO NO EN CASTELLANO:
FRMULAS CASERAS PARA SIEMBRA DE

TERRESTRES
La siembra de orqudeas terrestres presenta alguna dificultad aadida, a la ya complicada tarea
que nos traemos entre manos.
La testa que recubre en embrin es visiblemente ms oscura, entre marrn y negra. Es ms dura y
en ocasiones impermeable, por lo que la hidratacin en agua y azcar las 24 horas previas a la
siembra, no resultan efectivas.
Los diez minutos en la solucin esterilizante de agua y leja parece no afectarles lo ms mnimo.
Requiere medios de cultivo especficos y distintos a los de las epfitas. El ph tambin deber ser
diferente, ms alcalino.
Muchas veces me preguntais por frmulas sencillas para la siembra de estas semillas y por eso he
preparado una recopilacin de varias que se pueden preparar en casa sin grandes complicaciones.
Kawasara medium
Hyponex (fertilizante para hidroponia con macronutrientes) 3 g

Peptone 2 g
Banana 15 g
Miel 30 g
Sucrosa 20 g
Agar 1 5 g
Allan medium
Yeast extract 5 g
Peptone 3 g
Carbn activado 1 g
Glucosa 20 g
Agar 7 g
PDA (Potato Dextrose Agar)
Patata 200g
Glucosa 10g
Agar 10g
ZAK medium
Leche de coco 20ml

Sucrosa 10g
Agar 15g
Aadir todas las que pueda y sera muy interesante que enviarais comentarios con los resultados
que os den estas frmulas. Y que las vayamos comentando.
http://orquideoteca.blogspot.pe/2010/10/formulas-caseras-para-siembra-de.html
FRMULAS PARA EPFITAS Y TERRESTRES

Existen nmerosas frmulas para la elaboracin del medio de cultivo in vitro de semillas de orqudea. Algunas se
pueden preparar con ingredientes que encontrars fcilmente o que tendrs ya en tu cocina. Otras requieren
compuestos qumicos, por lo que resulta ms complicado su uso en cultivos caseros. Tambin puedes comprar
frmulas comerciales, listas con slo mezclarlas con agua.
Aqu os dejo algunas ordenadas por el grado de complejidad:
FRMULA PLTANO
100.0 g de pltano
10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina (Vitamina B1, 4 pastilllas de 0.3g)
900 ml de agua destilada
FRMULA TOMATE
250.0 g de tomate maduro

10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina
FRMULA PIA
200 ml de jugo de pia, dulce y madura
10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina
FRMULA ABONO
3 cc de abono DynaGro 7-9-5 o 10-5-5

12.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
2.0 g de carbn vegetal o carbn activado
5 tomates perita sin semillas
150.0 ml de agua de coco
40.0 g de banana
FRMULA TOMATE Y ZANAHORIA
100.0 ml de jugo de zanahoria

100.0 ml de jugo de tomate
10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina
FRMULA TOMATE Y PLTANO
40 g de pltano
10.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
1.2 g de Tiamina
FRMULA HAWAIANA
1.5g emulsin de pescado

1.0g peptona
12.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
1 litro de agua destilada
FRMULA KNUDSON "C"
1.0 g de Nitrato de Calcio

0.250 g de Fosfato monopotsico
0.250 g de Sulfato de Magnesio
0.500 g de Sulfato de Amonio
0.025 g de Sulfato de Hierro
0.0075 g de Sulfato de Manganeso
20.0 g de azcar
10.0 g de agar agar
FRMULA BURGEFF

0.250 g de Fosfato bipotsico
20.0 g de azcar o miel
12.0 g de agar agar
FRMULA LA GARDE
1.0 g de Sulfato de magnesio

1.0 g de Clorato de Calcio
0.500 g de Nitrato de Amonio
0.500 g de Carbonato de Amonio
0.050 g de Fosfato de Hierro
20.0 g de azcar
12.0 g de agar-agar
FRMULA JUVENAL MEYER
500 ml agua destilada.

500 ml de jugo de tomate
20 gr de azucar, miel, glucosa o dextrosa
14 gr de agar agar
2 gr de carbon activado en polvo
1 gr abono 30-10-10
FRMULAS COMERCIALES
M&S
Phytamax
FRMULA PARA ORQUDEAS TERRESTRES (Ms alcalino, menos sales)
MgSo4 150mg
Kh2Po4 150mg
Ca3Po4 90mg
FeSo4 18mg
Tryptone 3,5-4,0g
Nitsch Vit. 108mg
MES 1g
act. charcoal 1g
Agar 5-6g
sucrose 20g
trozos de patata (10 para 50ml de medio) de patata cortados 5x5x5mm
FRMULA COMERCIAL PARA TERRESTRES
TQPL orchid media
Es importante recordar que el PH adecuado del medio para semillas de orqudeas de epfitas tiene que ser en torno
a 5.6 (5.4 a 5.8) y que los medios que incluyen tomate tienen el PH correcto.
http://orquideoteca.blogspot.pe/2008/07/frmulas-para-epfitas-y-terrestres.html
Germinacion simbiotica in vitro

Esta publicacion e sparte d ela anterior, sera muy breve.
solo quiero mostrar que tambien se pueden germinar orquideas en frasco, utilizando medios
simples como musgo canadiense (peat moss), carbon y un frasco ordinario de vidrio.
en este caso arroje semillas de bletia purpurea a un pequeo terrario de helechos, pero al poco
tiempo se tornaron verdes y crecieron en grosor y altura.
hasta el momento solo se observan puntos verdes y manchones de bolas verdes pero asi empiezan
todas las orquideas.
saludos.
Publicado por james en 8:27 3 comentarios:
Etiquetas: bletia, protocormos, protocorms, seeds, semillas, simbiosis, simbiotic., terrario,terrari
un
jueves, 5 de diciembre de 2013
Germinacion simbitica de orquideas : mtodos caseros

bsicos y simples
Hace tiempo que tenia planeado publicar este pequeo articulo sobre la germinacion simbitica
de orqudeas y finalmente tuve tiempo.
Empecemos por el principio... que es la germinacin simbiotica?
es el proceso mediante el cual, una semilla de orquidea que haya caido bajo las condiciones
adecuadas de temperatura, sustrato, luz y humedad, logra encontrar un hongo adecuado para
establecer una simbiosis; que le permita germinar de manera natural.
Cualquier persona que tenga buena mano, es decir amplia experiencia en el cultivo de estas
plantas, sabe que tipo de condiciones son las mas favorables para su desarrollo.
Sin embargo, aqui la pieza clave es lograr cultivar el hongo para que establezca la simbiosis con
nuestras semillas.
De manera natural, las orquideas comienzan su vida cuando una semilla transsportada por el
viento llega hasta un pequeo manchn de musgos, helechos, tillandsias, cactus epifitos o las
raices de una orqudea ms grande.
es ahi en ese pequeo manchon de plantas, que se reunen las condiciones microambientales de
humedad, luz, temperatura y muy importante....el entramado del sustrato que es lo que
finalmente les permite sujetarse y quedar fijas en esa zona en particular. Ya que recordemos que
estas semillas no cuentan con un sistema de adhesion o fijacion propio; y por ello hasta la lluvia
mas suave puede llevarselas. de ahi la importancia de la estructura(entramado) del sustrato.
Bajo esas condiciones hay buena humedad, ventilacin suficiente y mucha materia orgnica para
el desarrollo de ciertos hongos y por ellos las semillas que caen en estos microhabitats pueden
establecer una simbisis con algn hongo y lograr su germinacin.
Sin mas preambulos pasemos a los mtodos de germinacion simbiotica (caseros bsicos y
simples)
La germinacin la podemos realizar sobre cualquier sustrato a base de celulosa, ya que

recordemos es la celulosa la materia prima que los hongos(simbiontes) degradan. los hongos al
degradar la celulosa liberan azucares y otros compuestos orgnicos que la semilla aprovecha para
conseguir su germinacin.
Como sustratos sugerimos toallas de papel, carton de huevos, cortezas no resinosas( encino,
fresno...) casi cualquier material hecho de celulosa.
Despus, vamos a humedecerlo ligeramente y a colocarlo dentro de algun recipiente de plstico

con cierre hermtico. esto para mantener la humedad ambiental y conservar hmedo el sustrato
durante la germinacin.
Una ves colocado el sustrato hmedo dentro del recipiente hermetico, procederemos
a espolvorear con ayuda de un colador muy fino; sobre la superficie del sustrato, una ligerisima
capa de humus o polvo de raices de orquideas secas y molidas. Esto lo hacemos con el fin de
inocular algunos hongos sobre el sustrato. pues son los que finalmente ayudaran a lograr la
germinacin.
semillas de orquidea, germinando sobre carton de huevo.

Al final, espolvorearemos una fina capa de semillas de orqudea de nuestra eleccin.
la germinacion puede ser evidente en una semana, 15 das o varios meses....en algunas ocasiones
no logran germinar las semillas. es un proceso un tanto azharoso.
en los casos en los que si se logra la germinacin, observaremos protocormos verdes creciendo
sobre la superficie del sustrato.
Es importante no abrir los recipientes hermticos durante la germinacin, pues podria malograrse
el proceso.
a continuacion algunas fotos de los procesos exitosos.

espero sus observaciones y comentarios y visiten mi facebook: orquideas y mas
Plantula germinada en tronco de fresno

Plantula germinada en
Plantula germinada entre las raices de una cattleya
protocormos creciendo sobre carton de huevo.

notense los primordios apicales de lso protocormos
protocormos de epidendrum ibaguense, en carton de huevo y humus.
sembrados dentro de una charola para pan.

Publicado por james en 18:07 13 comentarios:
Etiquetas: fungus., germinacion, germination, hongo, micorriza, orquideas, orquids, seeds,semill
as, simbiotic, simbiotica
viernes, 19 de abril de 2013
http://cultivo-de-orquideas-en-casa.blogspot.pe/
TECNICA IN VITRO PARA GERMINAR LAS

SEMILLAS DE ORQUIDEA
Aqui explicare como plantar las semillas de las orquideas in vitro , en un medio de
cultivo casero que tambien explicare como se prepara el medio a como se hace para
plantar las semillas en los botes de cristal con el meido de cultivo
A CONTINUACION PONDRE LOS INGREDIENTES Y SUS CANTIDADES DE UNO

DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS QUE SE USAN PARA SEMBRAR SEMILLAS DE
ORQUIDEAS IN VITRO , ( mas tarde aadire las cantidades )
de tomate triturado o licuado , colado y sin semillas

platano en pure o licuado
agua destilada
azucar
1,2 mg de vitamina b1 ( tiamina ) buscarlo en farmacias o herbolarios
agar agar de venta en herbolarios )
y botes de cristal con tapa ( de los de conserva )
se pone todo a calentar en una olla menos el agar , cuando este empieze ha hervir ,
hecharle el agar y esperar un poco a que se desaga , despues pasarlo todo bien por la
batidora , para que se quede todo homogeneo y una vez hecho poner en los botes de
cristal de 1 a 2 cm del medio de cultivo en cada bote, y cerrar solo un poco los botes.
despues ponerlos al bao maria en una olla , ( como si fuera para hacer botes de
comida en conseva ) y cuando empieze a hervir contar 20 minutos . pasados ese tiempo
apagar el fuego y dejar que se enfrie , entonces sacar los botes y acabar de cerrarlos.
despues abra que esperar mas o menos una semana antes de sembrar las semillas ,
para ver que en los botes no hay ninguna contaminacion .
un dia antes de ir desinfectar las semillas para ponerlas en los botes , hay que cojer las
semillas y tenerlas 24 horas en remojo con agua y azucar . pero poner poca cantidas
como 2 o 3 granos de arroz porque pueden haver en cientos y miles de semillas sobre
todo si son polvo como las de phal
una vez pasado esa semana : hay que desinfectar las semillas si la capsula se coje seca y
abierta ( si la capsula se coje verde , solo abra que estirilizar la capsula por fuera ,
cojer un jeringa , 7 partes de agua destilada mezclada con 3 partes de agua oxigenada ,
y meter unas pocas semillas de las orquideas , y llenarla con la mezcla de agua
destilada y agua oxigenada, menear durante 2 o 3 minutos y dejar las semillas ahi
durante 15 minutos , pasados ese tiempo , poner en la punta de la jeringa un poco de
papel o un trozo de filtro de cafetera para poder sacar el agua sin que se salgan las
semillas, y lavar las semillas, solo con agua destilada 3 o 4 veces , sacar toda el agua de
la jeringa dejando una gota .
tambien se pueden esterilizar poniendo las semillas en un sobre de papel de filtro para
cafetera y poner el sobre en un bote con la mezcla de agua destilada con agua
oxigenada .
entonces cojer una olla , y poner un poco de agua a hervir y poner algo encima de el
para que pueda salir vapor de la olla, y hacer la siembre en el mismo vapor , para que el
medio no se contamine, ( se abre el bote en el vapor y se deja encima de algo, como una
vaporera o colador ) y entonces se hechan las semillas un poco repartidas sobre la
superficie , sin enterrarlas, se cierra el bote y ya estan plantadas , y se dejan los botes
en un sitio que tenga luz , pero no directa , y si nos se puede hacer un armario
poniendole una luz y un poco de calor, hay que darles luz a los botes unas 16 horas , y
8 horas de oscuridad
http://aficionalasplantas.blogspot.pe/2012/01/tecnica-in-vitro-para-semillas-de.html
Frmulas para hacer el medio para la germinacin de semillas de
orqudeas in vitro
Imprimir
Has pensado alguna vez en hacerte un medio casero para poder hacer germinar las semillas de
orqudeas?. Aqu te dejo, unas cuntas frmulas para realizarlas. Elige t el que mejor te
convenga:
Frmula de Knudson "C"

20.00 g de azcar
10.00 g de agar-agar
1 litro de agua destilada (agua sin cloro)
El pH debe estar alrededor de 4.8 - 5.0.
Frmula del pltano
100.00 g de pltano maduro hecho pur o licuado

15.00 g de azcar
4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg
Frmula del Tomate
250.00 g de tomate bien maduro y sanos. Hacer una pasta y colar en colador bien fino.
15.00 g de azcar
Frmula de la pia
200 ml de jugo de pia dulce y maduro

15.00 g de azcar
Frmula del Tomate con Zanahoria
100.00 ml de zumo de zanahoria

100.00 ml de zumo de tomate
15.00 g de azcar
Frmula del Tomate con Banana
40 g de banana hecha pur o licuada

20.00 g de azcar
Frmula del Profesor Burgeff

20.00 g de azcar o miel de abejas
Frmula de La Garde

20.00 g de azcar
Frmula usada en Hawai
1 1/2 cucharada de t de emulsin de pescado

1 cucharada de t de peptona
12 g de agar-agar
20 g de azcar
Frmula ms Casera

20.00 g de azcar
5 tomates pera sin semillas (aquellos bien chiquitos)
40.00 g de banana (mas o menos media banana)
Nota: En las frmulas con Tiamina, los comprimidos de vitamina B1 (conocido normalmente por
Benerva) pueden ser sustituidos por complejos polivitamnicos Teragram M o Supradyn.
En todos los casos con gelatina, primero se pesan y se dejan preparados los com
puestos qumicos con las cantidades correctas. Despus se pone a

calentar, el agua destilada dentro de una cazuela de vidrio, esmaltada o revestida de tefln.
Cuando est a punto de hervir (pero sin que esto ocurra) se aaden todos los dems componentes
y se mezclan utilizando una cuchara de madera o de plstico. Se revuelve un poco para que se
disuelvan todos los ingredientes, se apaga el fuego y se reparte el preparado en los frascos.
Cada frasco debe recibir en el fondo una cantidad de preparado de aproximadamente 1
centmetro (50 ml). Por cada litro de agua se preparan poco ms o menos 20 frascos. Se tapan los
frascos y se prosigue con la esterilizacin.
Todas la frmulas funcionan bien siempre que el pH se encuentre dentro de la faja cida de 4.8 a
5.0, no olvidar de medirlo siempre con la mezcla caliente. Nota: Las frmulas con tomate ya
tienen el pH adecuado. Una de las frmulas ms usadas es la de tomate con pltano.
Bueno, espero que os haya gustado, para cualquier consulta o sugerencia, podis escribirme
a: airegaizto@gmail.com
http://turrusta.blogspot.pe/2009/05/formulas-para-hacer-el-medio-para-la.html
Cultivo de semillas de orqudeas con agua de coco

Cultivo de semillas de orqudeas con agua de coco
Por Bil. Baldemar Murga Domnguez
Orqudeas Mineralia
Como sabrn, las semillas de orqudeas no tienen reservas alimenticias y para germinar en su
medio natural requieren de la asociacin simbitica con un hongo que les provea los
nutrientes. Mediante el cultivo in vitro se pueden germinar las semillas de orqudeas sin la
necesidad del hongo y con ello se pueden tener una gran cantidad de orqudeas. Este mtodo
casero elaboracin de un medio de cultivo in vitro de orqudeas requiere de la ayuda de "Don
Wilson Coco" (foto1).
Paso a paso:
Para elaborar este medio de cultivo, adems de agua de coco, se requieren este tipo
de sustancias para hacer un medio de cultivo. Estos ingredientes son relativamente baratos,
pero muy difciles de conseguir. Adems, es un poco laborioso hacer un mezcla exacta con
ellos, ya que las cantidades requeridas de algunos de estos ingredientes son mnimas. No
obstante, los medios que se obtienen con estas sustancias son muy funcionales (foto 2).
Foto 2. Ingredientes para un medio de cultivo. Fotografa de Baldemar Murga Domnguez
Si se quisiera hacer un medio de cultivo completamente artificial, esta sera la lista de

los 14 componentes qumicos que se necesitaran para hacer unos de los medios ms
recomendados para la germinacin in vitro de orqudeas (foto 3).
Foto 3. Lista de ingredientes. Fotografa de
Baldemar Murga Domnguez
Alternativamente, se puede utilizar un atajo y tomar como base un medio de cultivo ya

preparado y slo adicionarle los elementos necesarios para la germinacin de orqudeas. De
esta forma es ms prctica cuando se hace en casa, donde no se cuenta con tantos
materiales ni equipo especializado. El medio de cultivo que podemos usar como base es el
llamado Murashige y Skoog (referido como MS de aqu en adelante), el cual es muy eficaz
para la preparacin de un medio de cultivo para germinar orqudeas (foto 4).
Foto 4. Medio de cultivo base Murashige y Skoog
(MS).. Fotografa de Baldemar Murga Domnguez
Para preparar un medio de cultivo a partir de la base de MS slo se requiere

adicionalmente: azcar, agar, agua destilada, carbn activado, y un coco fresco (s el liquido
del interior de la cabeza de nuestro amigo Don Wilson Coco, jajaja). El coco deber ser fresco,
o verde, evite aquellos donde la carne del coco est blanca y dura. Utilice cocos donde la
carne apenas se est formando, que la carne tenga una textura gelatinosa y que es algo
transparente. El agua del coco se debe de colar antes de usar (foto 5).
Foto 5. Fotografa de Baldemar Murga Domnguez
Se toman 4.3 gramos (gr) del medio MS, junto con 20 gr de azcar, 850 ml de agua
destilada, se mezclan en un recipiente y se revuelven hasta que se disuelven los grumos (foto
6).
Ya que estn bien disueltos, el medio de cultivo MS y el azcar, se pesan 10 gr de

agar y se incorporan. Se vuelve a agitar para que el agar se disuelva bien, y a continuacin se
agregan los 150 ml del agua de coco fresco. Se agita bien hasta deshacer los grumos de agar.
Ya que se diluyeron bien el MS y la azcar se agregan 2 gr. de carbn activado, esto para
obscurecer el medio. De nuevo se agita bien para que no queden grumos y se mide el pH.
Este ltimo debe ser ligeramente cido, y medir entre 6 y 5, no ms y no menos de este
intervalo (foto 7).
Una vez que se termina de preparar el medio de cultivo, este se vierte en recipientes
limpios. De preferencia, los frascos no deben tener etiquetas y deben ser desinfectados con
una solucin de cloro para blanquear la ropa. Dependiendo del tamao del frasco, se colocan
unos 25 ml del medio de cultivo por frasco, o el equivalente para formar una capa de uno o
dos centmetros de grosor (foto 8).
Foto 8. Adicin de carbn activado. Fotografa de
Baldemar Murga Domnguez
Posteriormente al llenado de cada frasco, stos se tienen que tapar inmediatamente.

Para ello puede usar tapas de papel aluminio, pero tienen que sellar muy bien para evitar que
entre el aire y se contaminen (foto 9).
Cuando los frascos ya estn bien tapados (apretando bien los bordes) se tienen que
esterilizar (foto 12); para ello, se meten dentro de una autoclave, que en el hogar se puede
sustituir por una olla de presin o olla express, y se dejan en la olla al menos 35 minutos a
fuego lento, despus de que empieza a salir el vapor (foto 10 y 11).
Foto 10. Llenado de los frascos. Fotografa de Baldemar Murga Domnguez
Foto 11. Colocacin de los frascos en la olla de
presin. Fotografa de Baldemar Murga Domnguez
Las semillas se pueden sembrar una vez que el medio de cultivo est completamente
fro. Los frascos se puedes guardar en el refrigerador durante algunas semanas antes de
usarse.
Tambin consulte el siguiente enlace:
www.facebook.com/notes/asociacion-mexicana-de-orquideologia/consejos-para-el-cultivo-in-
vitro-de-orqudeas/740476465980043
Espero que con esta informacin puedan animarse a intentar el cultivo in vitro de sus semillas
de orqudeas. Esta actividad ayudar a tener ms plantas y disminuir el saqueo de plantas del
campo. Tambin les permitir crear sus propios hbridos en casa y tener una mayor variedad y
cantidad de plantas.
Autor del texto y fotografas: Baldemar Murga Domnguez

Edicin : Eduardo Prez Garca
https://www.facebook.com/notes/asociacion-mexicana-de-orquideologia/cultivo-de-semillas-de-
orqu%C3%ADdeas-con-agua-de-coco/804341579593531/
Cultivo de semillas en frascos.
Jorge Alejandro Paulete Scaglia
Las primeras etapas en el cultivo de semillas son las mas importantes y de ellas depende 80% del xito del la
siembra en los frascos.
Semillas
Las semillas pueden ser producidas por:
1. Self fecundacin de la flor con su propio polen.

2. Sib fecundacin entre dos flores distintas de la misma planta.
3. Cross fecundacin entre dos flores de dos plantas de la misma especie o entre plantas de dos o ms
gneros distintos (hibridacin);
Las semillas forman en la parte anterior de la flor (ovario) en una cpsula que se desarrolla durante unos
meses. Cuando madura, la cpsula se abre y las semillas son liberadas al viento. Desde el momento de la
fecundacin hasta la abertura de la cpsula pueden transcurrir entre 4 y16 meses, dependiendo de la especie.
Como muestra, tomemos una Cattleya comn en la cual la cpsula demora 11-12 meses en abrir. Cuando la
cpsula se abre, las semillas secas entran en contacto con el medio ambiente, momento en que son
contaminadas. Esta contaminacin no es capaz de daar las semillas, apenas hace que las mismas sean
portadoras de grmenes, hongos y bacterias. Podemos observar que las semillas secas pueden tener varios
colores que varia desde el blanco hasta el amarillo quemado. Generalmente es un color amarillo claro.
Los medios de cultivo donde son sembradas las semillas deben ser estriles, y en consecuencia, si ponemos
semillas contaminadas, el preparado ser capaz de reproducir hongos multicolores en 48 horas que daan el
medio de cultivo. Un frasco contaminado no sirve y su contenido debe ser eliminado.
Esterilizacin de las semillas.
Las semillas solamente pueden ser esterilizadas con productos qumicos, pues otro recurso las matara. El ms
fcil de conseguir, y que todos tienen en casa, es el cloro.
Normalmente el cloro est preparado a la concentracin del 2.2%, esta indicacin debe estar en el rtulo y
debe ser observada atentamente.
Para desinfectar las semillas se prepara una solucin con agua destilada y cloro, que al final tendr
concentracin entre 6% a 10%. Para hacerla, mezclamos 1 ml de cloro y 10 ml de agua destilada, lo que nos
da una concentracin aproximada de 7.5%.
Con la solucin preparada se toma un pequeo frasco con tapa (frasco de penicilina inyectable, un tubo de
ensayo pequeo o otro con capacidad de 5 ml) y se coloca una pequea cantidad de semillas en su interior,
las semillas restantes se guardan de nuevo en fro. Volcar unos 2 ml del cloro preparado sobre las semillas,
tapar y agitar por 8 minutos aproximadamente.
Se deja descansar el frasco por 1 minuto en posicin vertical. Durante este reposo se observar en el frasco
que una parte de las semillas se deposita en el fondo y una otra parte queda flotando; estas semillas que
flotan son semillas infrtiles y deben ser eliminadas.
Pasado el minuto de descanso, se retira lo ms que se pueda del cloro y las semillas flotantes, esto se puede
hacer con el auxilio de una jeringa sin aguja (la aguja se tapa con las semillas), cuidando de no mover
demasiado el frasco para evitar que las semillas del fondo se levanten.
Retirado el cloro se verter en el frasco 2 ml de agua destilada para lavar las semillas y reducir el exceso de
cloro restante. Agitar por un minuto puede ser suficiente. En un embudo, colocar un filtro de papel (filtro para
caf) y volcar las semillas en l.
Con una esptula de acero inoxidable (utensilio mdico como la de los dentistas), se recogen las semillas y se
siembran en los frascos. Cuando se preparan los frascos estriles, siempre queda adentro de ellos un poco de
agua condensada en las paredes del vidrio. Para facilitar la distribucin de las semillas sobre el medio de
cultivo, lo que se acostumbra hacer es inclinar el frasco a 45 para que el agua se acumule en la orilla del
fondo, y con la esptula cose coloca la semilla sobre el agua. Al regresar el frasco a la posicin correcta, las
semillas se distribuyen sobre el medio de cultivo. El procedimiento de la siembra debe hacerse dentro de la
cmara estril.
El trabajo con semillas verdes es mas fcil y requiere menos cuidados, ya que las semillas dentro de la cpsula
verde son 100% estriles y no se tienen que esterilizar. Para usar las semillas de una cpsula verde deben
tener por lo menos 8 meses de formacin para asegurar que sean frtiles. En este caso, se retira la cpsula
verde de la planta madre. Se prepara una solucin de cloro al 15% (1 ml de cloro en 5 ml de agua destilada =
15%). Con el auxilio de un cepillo de dientes, se lava el exterior de la cpsula y se repite el procedimiento dos
o tres veces para garantizar que est bien desinfectada. Ntese que la cpsula no debe estar abierta.
Terminado el trabajo, se toma un pequeo frasco con tapa, se coloca la mitad de la solucin con cloro, se
sumerge la cpsula y se cierra el frasco.
Se lleva el frasco a la cmara estril donde despus de agitarse un poco podr la cpsula ser retirada para
dejarse secar. Hasta ese momento la cpsula an no es abierta. Si se dispone de mas de una cpsula, se
lavarlas todas y y se llevan dentro del frasco una cantidad mayor, lo que facilita sembrar en frascos separados
ms de una planta; como las cpsulas estn cerradas, no hay peligro de que las semillas se mezclen y
confundan.
Adentro de la cmara estril y con auxilio de una hoja de bistur y de una tijera, abrimos la cpsula. Las
semillas podrn ser colocadas con la esptula adentro de los frascos directamente sin peligro de
contaminacin. Se puede colocar una mayor cantidad de semillas sobre el medio de cultivo, pues no se sabe
cuantas son frtiles. Las semillas quedarn como si fueran polvo sobre la gelatina. Una observacin: cada vez
que se use la esptula con otra cpsula, se debe lavar y secar para evitar que otro tipo de semillas sean
colocadas en el frasco. Cmo limpiar y lavar el instrumental se ver ms adelante. Despus de colocar las
semillas se cierra hermticamente el frasco, queda listo para el siguiente paso.
Las semillas sobrantes no deben ser tiradas a la basura, pueden secarse para aprovecharlas en un futuro. Para
secarlas, debemos colocar las cpsulas bajo una luz de 100W a una distancia de 30 centmetros y dejarlas
durante 2 horas. Despus se raspan las semillas sobre una hoja de papel y se guardan en fro.
Medios de cultivo.
Este medio es una gelatina qumica (o natural) que tiene la capacidad de hacer germinar las semillas de
orqudeas adentro de un frasco cerrado, semejante a lo que sucede en las matas, bosques o florestas. La
ventaja de usar un medio de cultivo es que todas las semillas frtiles pueden germinar, claro que con esto,
existe una seleccin natural, mucho mas controlada que la que ocurre naturalmente.
Los medios de cultivo fueron descubiertos hace varios aos y a medida que el tiempo fue pasando fueron
siendo mejorados, adaptados, transformados y cambiados. Al pasar los aos, ahora cada laboratorio y
cultivador tiene su propia frmula, pero analizando cada una de ellas llegamos a la conclusin de que todas
tienen partes comunes y son semejantes a las del Profesor Knudson.
Existen varias formulas y todas funcionan, algunas mejor que otras, y despus de un tiempo cada quien habr
optado por trabajar con una sola frmula.
Todas las frmulas llevan un producto llamado agar-agar, una gelatina vegetal sacada de una especie de alga
marina. Es fcilmente encontrado en farmacias homeopticas, en restaurantes o tiendas de productos para
comida china. Tambin puede ser conseguido en laboratorios que trabajen en bacteriologa o en centros que
trabajen condrosfilas (moscas de la fruta).
Frmulas
Frmula de Knudson C Frmula de pltano

1.000 g de Nitrato de Calcio 100.00 g de pltano maduro hecho pur o licuado
0.250 g de Fosfato monopotsico 10.00 g de agar-agar
0.250 g de Sulfato de Magnesio 15.00 g de azcar
0.500 g de Sulfato de Amonio 4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg
0.025 g de Sulfato de Hierro 900 ml de agua destilada
20.00 g de azcar
El pH debe estar alrededor de 4.8 5.0.
Frmula del Tomate Frmula del Anana (Pia)

250.00 g de tomate bien maduro y sanos. Hacer 200 ml de jugo de anana (pia) dulce y maduro
una pasta y colar en colador bien fino. 10.00 g de agar-agar
10.00 g de agar-agar 15.00 g de azcar
15.00 g de azcar 4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg
4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300 800 ml de agua destilada
mg
Frmula de Tomate con Zanahoria Frmula de Tomate con Banana

100.00 ml de jugo de zanahoria 40 g de banana hecha pur o licuada
100.00 ml de jugo de tomate 100.00 ml de jugo de tomate
10.00 g de agar-agar 10.00 g de agar-agar
15.00 g de azcar 20.00 g de azcar
4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300 4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg
mg 900 ml de agua destilada
Frmula del Profesor Burgeff Frmula de La Garde

1.000 g de Nitrato de Calcio 1.00 g de Sulfato de magnesio
0.250 g de Sulfato de Amonio 1.00 g de Nitrato de Calcio
0.250 g de Sulfato de Magnesio 1.00 g de Fosfato monopotsico
0.020 g de Sulfato de Hierro 1.00 g de Clorato de Calcio
0.250 g de Fosfato bipotsico 0.50 g de Nitrato de Amonio
0.250 g de Fosfato monopotsico 0.50 g de Carbonato de Amonio
20.00 g de azcar o miel de abejas 0.05 g de Fosfato de Hierro
12.00 g de agar-agar 20.00 g de azcar
1 litro de agua destilada (agua sin cloro) 12.00 g de agar-agar
Frmula usada en Hawai Frmula mas Casera

1 1/2 cucharada de t de emulsin de pescado 3 cc de abono DynaGro 7-9-5 o 10-5-5
1 cucharada de t de peptona 12.00 g de agar-agar
12 g de agar-agar 20.00 g de azcar
20 g de azcar 2.000 g de carbn vegetal o carbn activado
1 litro de agua destilada 5 tomates perita sin semillas (aquellos bien chiquitos)
Nota: En las frmulas con Tiamina, los comprimidos de vitamina B1 (conocido normalmente por Benerva)
puede ser substituido por complejos polivitamnicos Teragram M o Supradyn.
En todos los casos con gelatina, primero se pesan y se dejan preparados los compuestos qumicos con las
cantidades correctas. Despus se pone el agua destilada adentro de una olla de vidrio, esmaltada o revestida
de tefln a calentar. Cuando est a punto de hervir (pero sin que esto ocurra) se colocan todos los
componentes adentro y se mezcla utilizando una cuchara de madera o de plstico. Se revuelve un poco para
que se disuelvan todos los productos, se apaga el fuego y se reparte el preparado en los frascos.
Cada frasco debe recibir en el fondo una cantidad de preparado de aproximadamente 1 centmetro (50 ml).
Por cada litro de agua se preparan poco mas o menos 20 frascos. Se tapan los frascos y se prosigue con la
esterilizacin.
Todas la frmulas funcionan bien siempre que pH se encuentre dentro de la faja cida de 4.8 a 5.0, no olvidar
de medirlo siempre con la mezcla caliente. Nota: Las frmulas con tomate ya tienen el pH adecuado. Una de
las frmulas ms usadas es la de tomate con pltano.
Preguntas y respuestas.
P. El cloro que comercialmente se consigue para limpiar baos, tiene una concentracin de 2.2%, por lo tanto
no sirve por que se requiere una concentracin de 7.5%, esto quiere decir que debemos conseguir cloro puro
y combinarlo con agua destilada para lograr esta concentracin? o cuando hablas de combinar 1 ml de cloro
con 10 ml de agua destilada, te refieres al cloro que usamos para limpiar baos ?
R. La concentracin de 7.5% o de 15% son hechas a partir del cloro usado para limpiar baos, que ya tiene la
concentracin de 2.2% del producto. En caso de que quieras usar cloro puro (granulado que comercialmente
tiene el nombre de hipoclorito de calcio o hipoclorito de sodio), tendrs que colocar 10 gramos en 140 ml de
agua destilada. El resultado ser el mismo.
P. Cmo bajas el PH en medios sin tomate?
R. El bajar y subir es un poco complicado, como tienes dos extremos hay que hacer referencia, as, para dejar
el medio de cultivo con un pH ms alcalino se agregan algunas gotas de soda (hidrxido de sodio). Pero si se
quiere el medio de cultivo mas cido, se colocan algunas gotas de limn o de vinagre.
P. Cul es el mejor sistema para medirlo?
R. El mejor sistema para medir el PH es hacerlo con papel colorimtrico aquel que cambia de color en
contacto con el producto. El medidor electrnico es cosa para profesionales o para aquellos que vayan a
dedicarse exclusivamente a trabajar con este tipo de material.
P. Existe algn beneficio de trabajar con las semillas secas?, de lo contrario tendra sentido trabajar con ellas
si el proceso con las semillas verdes es similar y se pueden colectar con mayor anterioridad (3 meses antes).
R. En verdad no hay ni beneficios ni perjuicios. Lo que ocurre es que muchas personas no saben sobre el
asunto de las semillas en cpsula verde. Siempre cremos que era necesario dejar madurar las semillas para
poder usarlas, lo que se descubri no es todo verdad. Debes tener el siguiente pensamiento: las semillas
sern verdes para el que las trabaja la primera vez, para los que usen las semillas despus de abierta la
cpsula, tendrn que ser tratadas como semillas secas. La ventaja de las semillas verdes es para quien haga el
primer planto ya que ste ganar ms tiempo para la siembra.
P. Puedo cortar las cpsulas de la orqudea a partir del mes 8?
R. S, de 8 meses en adelante es el momento correcto. En este periodo muchas semillas ya estn totalmente
desarrolladas.
P. Si corto la cpsula verde de la orqudea, sta la puedo almacenar por algn tiempo antes de abrirla? si es
as hasta cuanto tiempo la puedo almacenar? o es necesario retirar las semillas y almacenarla dentro de la
heladera..?
R. Si cortas la cpsula verde, puedes almacenarla antes de que la misma abra (se puede guardar en un lugar
seco y con sombra o adentro del refrigerador). Puede estar guardada algunas semanas sin que se abra. No es
necesario sacar las semillas.
P. Hasta cunto tiempo puedo almacenar las semillas en la heladera? o estas resisten durante un tiempo
ilimitado?
R. Ya se hicieron pruebas y duran hasta 2 aos en buenas condiciones, despus de esto, van perdiendo su
poder de germinacin.
Esterilizacin
La esterilizacin se puede hacer de 2 formas distintas, una de ellas profesional con auxilio de un autoclave, y
la otra casera con auxilio de una olla de presin.
Como el proceso es en forma casera, se usar la olla de presin. Esta debe tener las siguientes caractersticas:
1. Ser lo suficientemente alta para que quepa parado un frasco de 20 cm, (aceitunas, mayonesa, miel).
2. Debe tener en el fondo un plato de fierro (puede ser de aluminio o similar), de modo a que los frascos no
toquen el fondo de la olla.
3. Generalmente las ollas con estas caractersticas son las de 17 , 20 o 24 litros, tambin llamadas ollas de
presin de hotelera (industriales); sta olla se cierra por afuera y no colocando la tapa por adentro,
como suele ocurrir en las ollas comunes.
Se vierte agua en la olla en cantidad suficiente para que toque discretamente el fondo de los frascos.
Se colocan tantos frascos como sea posible, cada frasco con su medio de cultivo bien cerrado y se pone la olla
al fuego alto.
Cuando la vlvula de seguridad empieza a silbar, significa que la olla tiene una presin de 15 psi. Se deja que
la salida de presin por la vlvula sea constante, se baja el fuego y desde ese momento se cuentan 15
minutos, no ms ni menos. Completado el tiempo, se apaga el fuego y se deja enfriar por 20 minutos, no se
debe enfriar la olla bajo el chorro de agua.
Los frascos deben ser retirados de la olla y colocados en un lugar fuera del alcance de personas y nios,
donde reposarn por 2 o 3 horas hasta que el medio de cultivo se convierta en gelatina. Se recomienda que
los frascos sean colocados sobre una toalla o madera para evitar un cambio brusco de temperatura en la parte
del fondo. La contaminacin del medio de cultivo solamente ocurrir si no se hace la esterilizacin en un
perodo de 24 horas.
Pasado el tiempo de enfriamiento, en el fondo debe haber una gelatina consistente, las paredes de los frascos
tendrn agua condensada y a veces quedar un poco de agua sobre la gelatina.
Para los que sean mas cuidadosos, se aconseja dejar las primeras veces los frascos reposando de 2 a 4
das. Cualquier contaminacin ser detectada en este periodo. Si transcurridos esos das, todo sigue en orden,
todo estar listo para colocar adentro de los frascos las semillas para que germinen (el tiempo de germinacin
depende de la especie, variando de 20 a 50 das, en algunos casos hasta 5 meses).
Cmaras estriles
Las medidas para ambas son las mismas pero notaremos que una de ellas tiene la parte correspondiente al
visor, inclinada; esto se hace para permitir una mejor visualizacin sobre lo que se va a trabajar. En ambos
casos el ambiente interno debe ser estril y ambas cmaras son estticas (no tienen flujo laminar). Las
medidas de las cmaras estriles estticas son prcticamente las mismas o muy parecidas.
Al no disponer de ventilacin interna (flujo laminar) hay una mayor probabilidad de contaminacin en el
interior de la cmara, de esta manera y despus de muchos estudios, se determin el tamao ideal de la
cmara.
Para mantener el ambiente interno estril, es aconsejable dejar adentro de la cmara un pequeo pote con
solucin de esterilizacin al 15%. Su funcin ser la de evaporar gradualmente la solucin y saturar el interior
con gases de cloro. Esto asegura que ningn microbio, hongo u otra bacteria pueda sobrevivir.
Antes de utilizar la cmara por primera vez, se debe pulverizar el interior con una solucin de cloro al 15%
durante 15 das antes de usarla. Es lo aconsejable para evitar perder los primeros frascos que se trabajen.
Nada impide utilizarla apenas se construya, pero los riesgos de contaminacin aumentan al 80% de
probabilidad.
https://microplanta.wordpress.com/2007/01/12/cultivo-de-semiilas-en-frascos/
PRIMERAS EXPERIENCIAS DE CULTIVO IN VITRO DE

SEMILLAS DE ORQUIDEA
Cultivo In vitro paso a paso (15 marzo 2008)
1- Ingredientes
2- Preparacin de los ingredientes

3- Medio mezclado
4 - Limpieza de los frascos y las tapas
5- Frascos con el medio
6- Olla a presin para esterilizar los frascos

7- Soporte para que los frascos no toquen el fondo
8- Frascos colocados y listos para esterilizar

LA FRMULA:
Frmula de Tomate con pltano
40 g de pltano hecho pur o licuada

10.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
1.2 g de Tiamina (4 pastillas B1 - Benerva)
PASOS A SEGUIR:
Preparar los ingredientes por separado ( machacar y cortar).

Calentar el agua.
Mezclar todo bien
Verter en los frascos bien limpios
Presentar las tapas sin apretar, poner papel de aluminio por encima
Poner los frascos en la olla y cuando suene el vapor, 20 minutos
Cuando se enfrie, tapar bien.
Y a esperar con los dedos cruzados unos das.
http://orquideoteca.blogspot.pe/2008/07/primeras-experiencias-de-cultivo-in.html

orqudeas in vitro
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convenga:

20.00 g de azcar
Frmula del pltano

15.00 g de azcar
Frmula del Tomate
15.00 g de azcar
Frmula de la pia

15.00 g de azcar

15.00 g de azcar

20.00 g de azcar

Frmula de La Garde

20.00 g de azcar

12 g de agar-agar
20 g de azcar
Frmula ms Casera

20.00 g de azcar

http://turrusta.blogspot.pe/2009/05/formulas-para-
hacer-el-medio-para-la.html
Recetas de medio de cultivo In-vitro para orqudeas

Al responderle a Orchiloco en el post de ayuda con cultivo invitro:
http://www.infojardin.com/foro/showthread.php?t=4787
se me vino a la mente una idea. El que todos los foreros compartamos nuestras
recetas de medios de cultivo y nuestras experiencias con ellos.
Tambin sera bueno contar nuestros mtodos de cultivo asimbitico (in-vitro,

meristemal) para que se vaya construyendo un mini manual de cultivo en el foro y del
foro.
Mi Receta: (bueno, la que us, ya que no es ma)
3 tomates maduros cortados en trozos

1 banano (pltano) maduro cortado en trozos
900 ml agua
100 ml agua de coco
4 tabletas de tiamina 300 mg (vitamina b1)
Grenetina o gelatina sin sabor
Bascamente, mezclar todo en la licuadora hasta que quede bien reducido y uniforme,
menos la grenetina que esta se pone al ltimo para controlar el espesor de la mezcla.
Esta receta me alcanz para poner algo as como un cm de medio a 25 frascos, los
cuales esterilic en horno precalentado a 200C y horneados por 20 min. Despus hice
el simulacro de la siembra sobre olla con agua para generar vapor. Ninguno de estos
frascos se ha contaminado.
Saludos, espero que siguan este post.

Re: RECETAS de medio de cultivo In-vitro para Orquideas!!!
Para beneficio de todos, aqui estan otras formulas que encontre.
Formula de Plantano
-100g. de platano hecho pure o licuado

-10g. de agar agar
-15g. de azucar
-1.2g. de tiamina
-900ml. de agua destilada
Formula de Tomate
-250g. de tomate maduro y sanos, hacer pure y colar en un colador muy fino
-10g. de agar agar
-15g. de azucar
-1.2g. de tiamina
Formula de la Pia
-200ml. de jugo de pia dulce y madura

-10g. de agar agar
-15g. de azucar
-1.2g tiamina
Formula de Tomate y Platano
-40g. de platano hecho pure

-100ml. de jugo de tomate
-10g. de agar agar
-20g. de azucar
-1.2g tiamina
ara seguir el hilo agrego algunas cosas mas:
Frmula del tomate con zanahoria:

*100.0 ml de jugo de zanahoria
*100.0 ml de jugo de tomate
*10.0 gr de agar-agar
*1.2 g de tiamina
*800 ml de agua destilada
se prepara igual que como samsagaz77 puso al principio
las formulas que mas se recomienda usar son las que tienen tomate, ya que este
equilibra el ph (acidez)
Re: RECETAS de medio de cultivo In-vitro para Orquideas!!!
SIEMBRA ARTESANAL
METODOS:
*humedecer muy bien el sustrato de la planta madre (si es traida de la naturaleza)

esparcir las semillas, regar por inmercin de la 3/4partes de la maceta, no se riega por
arriba para que las semillas no se vayan. este es un metodo poco efectivo, nacen
pocas plantas.
*En una bandeja de plstico transparente con tapa (ac en Argentina biene el pollo al
spiedo en este tipo de bandejas). Se pone como sustrato leca y perlita (previamente
hervidos para esterilizarlos) luego se los pone en agua con fertilizante equilibrado (15-
15-15), dejar escurrir para que se vaya el excedente se agua, colocar en la bandeja y
sembrar. tapar bien.
*con un recipiente igual al anterior usar como sustrato un pedazo madera con corteza
previamente hervido y pasado por la siguiente preparacin:
-1litro de agua
-100 grs de tomate pelado pasado por agua hirviendo y sin semillas.
-una cucharada de azucar
-algunas puntas de la planta madre (si es traida de la naturaleza)
Esparcir las semillas y tapar. el tomate aporta nutrientes y equilibra el ph. las raices
aportan micorrizas (hongos)
*en un fraco de vidrio bien limpio colocar musgo de floreria, el cual tiene que hervirce
3 o 4 veces cambiando el agua cada vez. Apretar bien para eliminar el exceso de agua,
introducir algunas puntas de raices de 3 cm aprox. tapar por 15 dias con la tapa del
frasco, con un vidrio o papel de film para que prospere la micorriza, destapar, esparcir
las semillas y tapar (metodo mas eficaz)
*tambien esta el cultivo in vitro sobre el cual hay mucha info muy buena en el post de
Monstera y de Silvia Grillo.
Sigo lleyendo mi cuadernito de orquideas y si encuentro algo mas lo cuelgo, espero

que les sirva.
http://archivo.infojardin.com/tema/recetas-de-medio-de-cultivo-in-vitro-para-orquideas.5420/
PROPAGACIN IN VITRO DE ORQUDEAS
POR: GLORIA INS MORALES

LUIS EDUARDO VANEGAS
DIOMAR GMEZ ORTEGA
JHON ALEXANDER CANO
LORENA ALEXANDRA RAMREZ
GUSTAVO ACOSTA
DIRECTOR BIOTECNOLOGA I
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESPECIALIZACIN EN BIOTECNOLOGIA AGRARIA
BOGOT D.C
NOVIEMBRE 2009
TABLA DE CONTENIDO
Pg.
JUSTIFICACIN 4
OBJETIVOS...........................................................................................................
.. 4
GENERALES..........................................................................................................
.4
ESPECIFICOS.........................................................................................................
4
1 INTRODUCCION................................................................................................ 5
1.1
Definicin............................................................................................................
6
1.2. Generalidades............................................................................................ 6
1.3 Breve resea histrica.......................................................................................
6
1.4 Ventajas de esta tcnica................................................................................. 7
1.5 Aplicaciones prcticas desde el punto de vista ecolgico................................8
2 REQUERIMIENTOS PARA UN LABORATORIO............................................9

2.1
Infraestructura...................................................................................................
9
2.1.1 rea de preparacin.................................................................................. 9
2.1.2 rea de transferencia.................................................................................. 9
2.1.3 rea de incubacin...................................................................................... 9
2.1.4 rea de crecimiento..................................................................................... 9
2.1.5 rea de cuarentena y de control fitosanitario...........................................10
2.2 Equipo para el laboratorio............................................................... 10
2.2.1 rea de preparacin................................................................................... 10
2.2.2 rea de lavado y esterilizacin................................................................ 10
2.2.3 rea de transferencia.................................................................................. 10
2.2.4 rea de incubacin..................................................................................... 10
2.2.5 rea de exanimacin................................................................................... 10
2.2.6 rea de crecimiento in vivo.........................................................................10
2.3 Vidriera.......................................................................................................
10
2.4
Instrumental......................................................................................................
10
2.5
Fungibles..........................................................................................................
10
2.6
Reactivos.........................................................................................................
10
3. METODOS DE ASEPSIA Y DESINFECCIN.......................................... 11

3.1 Control preventivo de la Contaminacin Microbiana............................... 11
3.1.1 El investigador........................................................................................ 11
3.1.2 El rea de trabajo................................................................................... 11
3.1.3 Instrumental............................................................................................. 11
3.1.4 El exterior de los recipientes de cultivo.................................................. 11
3.1.5 Los tejidos.................................................................................................
11
3.2 Esterilizacin...................................................................................................
12
3.3 Preparacin del explante...................................................................... ... 12
3.4 Procedimientos de esterilizacin................................................................ 13
3.4.1 Calor seco........................................................................................ 13
3.4.2 Vapor bajo presin (autoclave)........................................................... 14
3.4.3 Calor hmedo a 100C....................................................................... 14
3.4.4 Filtracin............................................................................. .................. 15
3.5 Limpieza de los Recipientes de Vidrio....................................................... 15
4. RECONOCIMIENTO DE EXPLANTES Y DISECCIN............................. 16

4.1 Lmina foliar.................................................................................................
16
4.2 Punta radicular..............................................................................................
17
4.3 Siembra de embriones................................................................................. 17
4.4 Meristemo........................................................................................... 17
4.5 Cultivo de Callos......................................................................................... 18
5. ELABORACION DE STOCKS Y MEDIOS DE CULTIVO............................. 19

5.1 Mediciones.....................................................................................................
19
5.2 Elaboracin de stocks....................................................................... 20
5.3 Elaboracin del medio de cultivo inorgnicas............................ 21
5.3.2 Compuestos orgnicos............................................................................ 21
5.3.2.1 Carbohidratos...................................................................................... 21
5.3.2.2 Sustancias hormonales........................................................................ 22
5.3.2.3 Amino cidos y amidas.......................................................................... 23
5.3.2.4 Otros compuestos orgnicos................................................................ 24
5.3.2.5 Complejos naturales............................................................................... 24
5.3.2.6 Carbn activado..................................................................................... 28
5.4 Medios de cultivo......................................................................................... 29
5.4.1Medio de cultivo gelificado............................................................................. 29
5.4.2 Medio liquido agitado................................................................................. 29
5.4.3 Medio blanco........................................................................................... 29
6. FASE DE ENDURECIMIENTO DE ORQUIDEAS............................................ 30

6.1 FASE DE ACLIMATACIN.......................................................................... 30
6.2 FASE DE INVERNADERO............................................................................ 30
6.3 ADAPTACIN DE PLANTAS OBTENIDAS................................................. 31
6.4 FASE DE CAMPO........................................................................................ 31
7. CONCLUSIONES 49
BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................
50
JUSTIFICACIN
La mayora de especies existentes en los bosques el caso de orqudeas, estn sufriendo un
proceso de disminucin de su poblacin debido a la tala y quema de los bosques, as como la
extraccin de su habitad natural, como es el caso de la orqudea.
Es depredada y comercializadas ilegalmente y si no hacemos nada para evitarlo pueden llegar a
desaparecer. Pero esto se puede llegar a solucionar aplicando tcnicas de propagacin in Vitro a
partir de semillas, siempre y cuando aseguremos su reproduccin en cantidades adecuadas y las
plantas propagadas serian distribuidas a viveros. Por tal motivo, planteamos un objetivo de
desarrollar un protocolo para la propagacin in Vitro partir de semillas, evaluando medios en fase
de germinacin, multiplicacin y enraizamiento.
OBJETIVOS
GENERAL
Por medio de la tcnica de cultivo de tejidos, lograr mantener bajo condiciones ex-situ una
representacin de material vegetal, que se mantendr como Banco de Germoplasma. Desde este
punto de vista se pretende rescatar, conservar y propagar diferentes especies vegetales de
orqudeas, que atiendan a una problemtica intrnseca como baja germinacin, tiempos de
germinacin, grado de depredacin o problemas de carcter fitosanitario, que impidan su
propagacin natural por va sexual y/o mtodos convencionales.
ESPECIFICOS
1. Profundizar en el manejo de instrumentos, equipos, reactivos, soluciones, nutricin y todo lo
pertinente con el crecimiento y desarrollo de las plantas in vitro.
2. Identificar los factores ambientales que inciden en el desarrollo de las plantas in vitro.
3. Estudiar procesos fisiolgicos de crecimiento, desarrollo, diferenciacin, absorcin y nutricin
de una forma ms directa, cuando estos procesos son difciles de detectar por las metodologas
tradicionales y de igual manera su cuantificacin y evaluacin.
4. Propagar por medio de cultivos de tejidos vegetales diferentes especies de orqudeas.
1. INTRODUCCION
Desde hace miles de aos el hombre ha domesticado animales y plantas con relativo xito; ya que
no toda la naturaleza, con su biodiversidad ha sido sometida y solo un porcentaje muy pequeo,
es el que ha sido manipulado por el hombre para su sustento alimentario y necesidades varias
tales como: fibras y materiales para la elaboracin de todas sus manufacturas, que luego van a
formar piezas ms elaboradas como textiles, vivienda, herramientas, medicinas y en fin todo lo
que el hombre puede imaginar en su mente creadora.
En los ltimos siglos, el desarrollo ha sido ms rpido, es as como inicialmente pasa de

recolector nmada a agricultor; y a partir de ese momento hasta hace aproximadamente 100 aos
su sistema tradicional de propagacin de plantas era copiado de la naturaleza; esto por semilla
(sexual); y en forma ms tcnica la asexual (estacas, bulbos, tubrculos, etc.).
Ya con nuevas herramientas y tecnologas el hombre descubri que las plantas podan
reproducirse o multiplicarse en un tiempo ms rpido y en mayor nmero; con ventajas evidentes
que hicieron crecer el cultivo de tejidos vegetales, como una rama de la biotecnologa.
La inmensa diversidad de plantas con potencial ornamental existente en nuestro pas est siendo
actualmente mal aprovechada, siendo una de las razones, el desconocimiento de tcnicas
alternativas de micropropagacin. La tala como actividad extractiva y la prdida de dichos
hbitats llega a tal punto que actualmente muchas de nuestras especies nativas se encuentran en
inminente peligro de extincin. Una alternativa para la solucin de este problema lo constituye el
recurrir a la reproduccin artificial, la cual se puede llevar a cabo de manera rpida, eficiente y
segura mediante la propagacin in vitro.
Colombia se posiciona como uno de los 19 pases megadiversos del mundo. Alberga ms de 50.000
especies de flores, primero en variedad de orqudeas (Parques Nacionales Naturales de Colombia,
2009).
El cultivo de tejidos es usado para la rpida propagacin de orqudeas, y es usada industrialmente

en Tailandia, Singapur, Malasia, Indonesia y otros pases (Arditti, 1993, citado por Rodrguez y
col., 2001).
1.1 DEFINICION
El cultivo de tejidos vegetales es un grupo de tcnicas por medio de las cuales se pueden obtener
plantas, a partir de una porcin vegetal con crecimiento activo de una planta donante; a esta
porcin se le denomina explante; su tamao generalmente es pequeo (ocasionalmente
microscpico) y su manipulacin debe ser bajo condiciones de laboratorio asptico e inoculado en
medios de cultivo apropiados, bajo condiciones ambientales controladas. (Pachn, 2008)
1.2 GENERALIDADES
El explante luego de ser tomado de la planta donante se desinfecta, para ser inoculado en un
medio de cultivo que contenga; agua, minerales, fuente energtica, fitorreguladores, vitaminas,
Agar y reductores osmticos. Estos ingredientes pueden estar presentes o no, dependiendo del
objeto de investigacin, lo mismo que compuestos y cantidades pueden variar.
El explante sembrado inoculado en el medio de cultivo, es llevado a incubacin; la incubacin

se hace para que el explante crezca y se multiplique, dando origen a nuevos brotes
morfognesis, que posteriormente sern cortados para de nuevo sembrarlos en otro medio de
cultivo con nuevos componentes; estos pequeos brotes eventualmente emitirn races y
posteriormente sern microplantas; la incubacin debe tener condiciones de temperatura
adecuada intensidad lumnica ptima y un fotoperodo ideal para cada especie incubada. Luego
que estas microplantas han enraizado son llevadas a cmaras donde son adaptadas
paulatinamente a condiciones ambientales. Este proceso se le llama endurecimiento y sus
rganos que anteriormente tenan un comportamiento hetertrofo van cambiando a auttrofos,
siendo funcionales sus races, sus tallos y hojas, para posteriormente ir a invernadero o a campo y
a si completar un ciclo cerrado volviendo a su lugar de origen. (Pachn, 2008)
1.3 BREVE RESEA HISTORICA
Los primeros ensayos en cultivo de tejidos fueron realizados por Sacks (1860) y Knops (1861),
quienes observaron que los principales nutrientes de las plantas superiores eran sustancias
inorgnicas, y prepararon una solucin que los contena, conformando as el primer medio
nutritivo. Posteriormente en 1898 Haberlandt realiz un cultivo de clulas aisladas de tres
gneros de monocotiledneas: Erithronium, Ornithogalum y Tradescantia sin xito; a
consecuencia propuso la teora de la totipotencialidad: todas las clulas tienen la capacidad para
formar plantas completas.
Las tcnicas de cultivo asptico han estado presentes en el estudio del crecimiento y desarrollo
de plantas. El papel de los fitoreguladores de crecimiento surgi en gran parte de estos estudios.
Los primeros cultivos aspticos con resultados positivos fueron aquellos que se hicieron utilizando
explantes de punta de raz. Un poco ms tarde fue posible obtener cultivos de callos derivados de
explantes provenientes de rganos de almacenamiento de plantas o de la regin del cambium de
las especies madereras.
Estos cultivos crecieron lentamente y el estimulo a la divisin celular estaba vinculado
generalmente a la adicin de Auxinas, tales como el cido indol actico (AIA) o el cido
naftalenactico (ANA), a un medio de sales minerales, sucrosa y algunas vitaminas. Se tuvo un
mayor avance cundo se descubri que la adicin de agua de coco al medio de cultivo aumentaba
notablemente la divisin celular, pues se sabe que esta agua contiene auxinas, citoquininas,
giberelinas y alcoholes de azcar como el mio-inositol.
La iniciacin y desarrollo de embriones a partir de tejidos somticos en plantas cultivadas fue

estudiado primero por Stewar (1958) y Reinert (1958-1959) en cultivos de Dacus carota
(zanahoria). Desde 1958, las investigaciones de la embriognesis somtica en zanahoria han sido
extensas, y el nmero de especies que han producido embriones somticos se ha incrementado.
Tisserat et al. (1979) reportaron embrignesis somtica en 32 familias, 81 gneros y 132 especies.
Una de las estrategias de conservacin de los recursos fitogenticos son los bancos de
germoplasma ex situ. Cerca de 400 diferentes especies de plantas han sido en la actualidad
probadas en su habilidad para multiplicacin va propagacin in vitro. Muchas de ellas tienen
como unidad de propagacin meristemos vegetativos ubicados en meristemos de tallos y races.
Este cultivo asptico se ha convertido en un procedimiento comn para rescatar embriones que
en condiciones naturales no se habran podido desarrollar, por poseer un embrin muy pequeo
formado por una masa de clulas; el embrin es totalmente dependiente de azcar exgena para
germinar. Otro caso es cuando se forman inhibidores de la semilla; en este caso los embriones
germinan slo despus de un perodo de letargo. (Pachn, 2008)
Rodrguez y col., (2001) reportan que Oceoclade maculata, fue la especie que ms demor en
germinar (24 semanas), evolucion diferente al resto de las especies, pues sus semillas formaron
callos verdes que dieron lugar a las plantas. De las especies estudiadas sta era la nica terrestre
y otros estudios han referido que las orqudeas con sta forma de vida, germinan y se desarrollan
in vitro ms lento que las epfitas.
Estos resultados permiten conocer por primera vez los resultados para la germinacin asimbitica
in vitro de las cuatro especies estudiadas, se logr la germinacin de todas en los dos medios de
cultivo utilizados , aunque se debe recalcar que el carbn activado adicionado favoreci la
germinacin de tres de las cuatro especies.
1.4 VENTAJAS DE ESTA TCNICA
Nmero ilimitado de nuevas plantas (miles).

Nmero grande de plantas homogneas o iguales a la planta donante, ya que el explante es de
carcter somtico y su informacin gentica es homocigota 2n diploide, y no sexual n. haploide.
El tiempo de regeneracin de una planta es ostensiblemente menor.
Si sembramos una planta en el campo debemos esperar que esta crezca, y produzca semillas,
para luego sembrarlas nuevamente; pueden ser meses y hasta aos (sexualmente); otra va no
muy corta es la asexual tomando partes del vegetal como estacas enraizarlas y obtener nuevas
plantas, para ello debemos esperar que la planta crezca lo ideal y los tallos sean lo
suficientemente fuertes vigorosos y de buen tamao, que nos garanticen su enraizamiento; esto
requiere un poco menos de tiempo, si se comparan estos dos sistemas tradicionales con el cultivo
de tejido vegetal, encontramos que se pueden regenerar mayor cantidad de plantas y en menor
tiempo, factor importante cuando ciertas plantas muestran algn grado de dificultad en su
propagacin natural.
Sanidad de las plantas propagadas por este mtodo: son de calidad certificada, ya que en cada
uno de los pasos de la propagacin, se hace una seleccin del material, con el fin de producir
nicamente material sano, y eliminar el material contaminado.
Mejoramiento gentico: con fines de obtener plantas ms resistentes al ataque de plagas y

enfermedades, as como plantas tolerantes a sequas, salinidad, heladas y muchas ms
condiciones adversas que en la naturaleza estn presentes e inciden en el vegetal.
Como se puede ver esta tcnica requiere de laboratorios especializados, con controles de
contaminacin muy estrictos; adems equipos adecuados que son costosos, pero que a largo plazo
y con una produccin continua de material vegetal se puede salvar su inversin. (Roca &
Mroginski, 1993)
1.5 APLICACIONES PRCTICAS DESDE EL PUNTO DE VISTA ECOLGICO.

Los ecosistemas tropicales tienen vital importancia por su riqueza y amplia biodiversidad, ya que
en ellos estn ubicadas la gran mayora de especies con un potencial aun sin determinar en
aspectos tales como el alimenticio, medicinal y otros.
Es deber de los pases que poseen esta riqueza velar por su conservacin, preservacin y
proteccin; por medio de una estrategia multidisciplinaria que involucre al estado y a la
sociedad; y que sea realmente eficaz en los objetivos antes propuestos.
El Cultivo de Tejido Vegetal pretende atenuar en parte este problema desde dos puntos de vista:
1. Propagacin de especies altoandinas, que presenten algn grado de dificultad en su
propagacin natural (sexual) y que se encuentren en peligro de extincin.
2. Preservacin: una de las estrategias en cultivo de tejido vegetal es la de actuar como Banco de
Germoplasma ya sea activo o bsico de material vegetal, que por otros sistemas no seria viable.
Ej: Semillas recalcitrantes o plantas que no producen semillas sexual viable.
Adicionalmente un banco de germoplasma para especies cuyas semillas son especiales, por su
tamao y reservas alimenticias como en el caso de orqudeas; es de vital importancia la
tecnologa in vitro para su preservacin y propagacin.
De igual manera sucede con ciertas especies de helechos cuya reproduccin es a partir de esporas
que presentan singulares condiciones para su germinacin.
Sin ser una tcnica de clonacin donde se tiende a la homocigosis se garantiza la variabilidad
gentica ya que el explante es almacenado de tipo sexual o zigtico.
2. REQUERIMIENTOS PARA UN LABORATORIO
2.1 Infraestructura
2.1.1 rea de preparacin. Se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, pero
debe proveer tambin un espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plstico, y los
reactivos qumicos, este ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparacin de los
medios. El rea de lavado debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua
fra y una fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada.
(Roca & Mroginski, 1993)
2.1.2 rea de transferencia. En esta rea del laboratorio se realiza el trabajo de excisin,
inoculacin y trasferencia de los explantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo
demanda los ms altos niveles de limpieza ambiental, se recomienda la instalacin de gabinetes
de flujo horizontal o vertical de aire filtrado o bajo presin, o la construccin de cuartos de
trasferencia. (Roca & Mroginski, 1993)
2.1.3 rea de incubacin. Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o

cmaras de crecimiento; stas pueden ser ms eficientes en cuento al control ambiental, pero
son ms costosas. El rea de incubacin o crecimiento in vitro debe proporcionar un buen control
de la temperatura (2028C), la iluminacin (variable, segn las necesidades: 1000 a 5000 lux) y
la humedad relativa (70% - 80%) (Roca & Mroginski, 1993).
2.1.4 rea de crecimiento. Las plantas que se regeneran en el rea de incubacin se pueden
acondicionar o aclimatar y luego trasplantar en macetas, bandejas o camas apropiadas. Estas
operaciones se pueden llevar a cabo en tinglados, casas de malla o invernaderos, dependiendo las
condiciones climticas del lugar donde est ubicado el laboratorio y de los requerimientos de
aislamiento de los materiales por razones fitosanitarias (Roca & Mroginski, 1993).
2.1.5 rea de cuarentena y de control fitosanitario. Cuando la funcin del laboratorio es la
produccin de materiales elites de sanidad certificada, se hace necesario contar con un rea para
la recepcin de las muestras o plantas destinadas a la limpieza clonal, generalmente protegida
contra insectos. Esta rea de cuarentena debe estar separada del resto del laboratorio pero
cercana al rea de control fitosanitario (Roca & Mroginski, 1993)
2.2 Equipo para el Laboratorio
2.2.1 rea de preparacin: Refrigerador, balanzas (una macrobalanza y una balanza analtica de
precisin), potencimetro, placa elctrica con agitador magnticos.
2.2.2 rea de lavado y esterilizacin: Autoclave manual o automtico (grande o de mesa),

destilador, gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plstico de varios tamaos,
recipientes de plstico grandes, estufas para esterilizacin y secado.
2.2.3 rea de trasferencia: Gabinete de flujo laminar; microscopio de diseccin con luz
incidente, e instrumentos de diseccin: cuchillas No. 10 y No. 11, mangos para cuchillas, agujas
de diseccin, pinzas, tijeras. Tambin se necesitan frascos con alcohol, mechero de alcohol,
mscaras, guantes, marcadores a prueba de agua, bandejas y recipientes para basuras.
2.2.4 rea de incubacin: Un cuarto con temperatura, iluminacin y humedad relativa
controladas; estanteras con iluminacin para los cultivos, bandejas, termmetros de mxima y
mnima, y gradillas para tubos de varios tamaos.
2.2.5 rea de examinacin: Microscopio estereoscopio, microscopio compuesto, lentes de
aumento, y elementos pticos complementarios.
2.2.6 rea de crecimiento in vivo: Macetas, suelo, bandejas, cmaras de alta humedad.
2.3 Vidriera.
Vasos de precipitado (100 ml, 600 ml, 5000 ml), balones de fondo plano aforados (100 ml, 500 ml,
1000 ml), micropipetas (20ml, 50ml, 100ml, 1000ml), pipetas (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml), frascos
Erlenmeyer (125, 250 y 500 ml), tubos de ensayo, cajas Petr, botellas de vidrio de diferentes
tamaos.
2.4 Instrumental: Pinzas largas y cortas, mangos de bistur nmero 3 y 4, tijeras.
2.5 Fungibles: Alcohol, algodn, papel absorbente, mechas para mechero, jabones de manos,
pisos, hipocloritos, papel aluminio, papel vinipel, cinta para enmascarar.
2.6 Reactivos. El listado se encuentra en los anexos en los componentes del medio de cultivo.
3. METODOS DE ASEPSIA Y DESINFECCIN
3.1 Control preventivo de la Contaminacin Microbiana

Uno de los requisitos bsicos para el xito de la tcnica de cultivo de tejidos es mantener los
cultivos libres de microorganismos contaminantes.
Las siguientes son las fuentes de donde proceden los contaminantes; cada una requiere diversas
medidas de prevencin:
3.1.1 El investigador. El investigador es una fuente primaria de contaminacin. El uso de batas de
laboratorio y de guantes, la proteccin del cabello, la boca y la nariz reducen la contaminacin.
Las mscaras son necesarias sobre todo cuando se trabaja en un laboratorio sin flujo laminar de
aire. Es esencial que el investigador se lave bien las manos y los brazos (lavndolos con agua y
jabn luego enjuagndolas con alcohol al 70%) antes de iniciar una sesin de trabajo. (Roca &
Mroginski, 1993)
3.1.2 El rea de trabajo. Los contaminantes ms comunes son aqu las bacterias y las esporas de
hongos que habitan en el ambiente. La utilizacin de cabinas o cuartos adaptados con un sistema
de flujo laminar de aire, el cual penetra a travs de filtros a prueba de microbios, permite
mantener la asepsia durante el trabajo. Si el rea de trabajo carece de estas instalaciones, se
hace necesario limpiar las paredes y las mesas con desinfectantes y trabajar en lo posible durante
cortos perodos de tiempo. (Roca & Mroginski, 1993)
3.1.3 Instrumental. Los instrumentos de trabajo se deben esterilizar antes de usarlos. Se debe
tener en cuenta, sin embargo, que los instrumentos inicialmente estriles pueden contaminarse
con microbios del aire, de superficies vegetales mal desinfectadas, de las manos o de la
exhalacin del investigador. (Roca & Mroginski, 1993)
Lo ms aconsejable es trabajar con varios juegos de las mismas herramientas y mantener la
asepsia de las que se han usado, colocando los instrumentos en alcohol etlico al 70% de 2 a 3
minutos y flamendolos luego cuidadosamente. La exposicin excesiva a la llama (flameo) hace
que el metal pierda temple y se oxide; adems, se propicia la acumulacin en el metal de
materia orgnica carbonizada difcil de remover. Por lo tanto, se debe alternar el flameo hecho
despus de la inmersin de los instrumentos en alcohol, con la colocacin de los mismos contra la
corriente de aire de la cabina de trabajo para mantener su esterilidad mientras que el alcohol
residual se evapora. tambin se aconseja el uso de bactoincinerador. (Roca & Mroginski, 1993)
3.1.4 El exterior de los recipientes de cultivo. Existe la posibilidad que, durante el tiempo
transcurrido entre la esterilizacin de los recipientes con los medios de cultivo y el momento de
usarlo, se localicen en su exterior ciertos contaminantes, de tal manera que se mantenga estril
slo el interior de los tubos; por lo tanto, se debe flamear obligatoriamente la boca de cada tubo
antes y despus de sembrar el explante. (Roca & Mroginski, 1993)
3.1.5 Los tejidos, Pueden llevar contaminadores en su superficie o en su interior, o en ambas
partes. Los que lleva el explante sobre su superficie se pueden eliminar mediante la desinfeccin,
pero los que se encuentran dentro del tejido son difciles de eliminar. En este ltimo caso puede
ser til la inclusin de fungistticos o bacteriostticos en el medio de cultivo; el sulfato de
gentamicina, la penicilina y el sulfato de estreptomicina (10 a 50 mg/litro), son algunos de los
productos de amplio espectro que se pueden usar. El tratamiento de las plantas donantes del
explante por medio de altas temperaturas (35 a 40C) tambin es efectivo para la obtencin de
segmentos de tejido libres de bacterias y hongos sistmicos. (Roca & Mroginski, 1993)
3.2 Esterilizacin
La esterilizacin es el proceso mediante el cual el material, sitio o superficie se libera
completamente de microorganismos vivos o esporas. Se dice que tales materiales o sitios son
estriles o se han esterilizado. En la terminologa mdica se utiliza generalmente la palabra
asepsia para designar la condicin en la que estn ausentes los microorganismos patgenos;
quienes trabajan en el cultivo de tejidos de plantas utilizan la palabra asptico como sinnimo de
estril. (Roca & Mroginski, 1993)
La desinfeccin se limita generalmente al proceso de destruccin de los microorganismos
mediante mtodos qumicos; la esterilizacin se refiere a menudo al mtodo fsico para la
destruccin de los microorganismos. Se utiliza la palabra axnico para las preparaciones que est
libres de virus, viroides o micoplasmas. (Roca & Mroginski, 1993)
3.3 Preparacin del explante

Generalmente se considera que los tejidos de las plantas intactas y sanas son aspticos
internamente y que la principal tarea de limpieza del material para explantes est limitada a la
esterilizacin superficial. Si esta generalizacin se justifica o no, es debatible, pero en esta breve
discusin se supone que tal es el caso. Por tanto, no trataremos de discutir los medios utilizados
para la eliminacin de virus, viroides, micoplasmas o, incluso, de microorganismos endgenos.
La solucin de hipoclorito de sodio (NaOCl), en concentraciones de 1% a 3% es una de las

preparaciones ms tiles como germicida y agente oxidante. Sirve para la esterilizacin
superficial de materiales de todo tipo, siempre y cuando no se produzca lesiones debido a su
accin blanqueadora. Durante muchos aos se ha utilizado el NaOCl como un esterilizante
superficial de los tejidos de las plantas (Wilson, 1915). Se supone que tiene la ventaja de que se
enjuaga ms fcilmente de las superficies despus de la esterilizacin y as se eliminan los
residuos oxidantes indeseables. A causa de la indeseable alcalinidad de cualquier hipoclorito
residual, en algunas situaciones podra ser til un enjuague rpido con agua acidulada (HCl en
una solucin muy diluida y en cantidad suficiente para neutralizar cualquier exceso de bases).
Como esterilizante superficial tambin se utiliza la solucin de bicloruro de mercurio (HgCl2). Sin
embargo, este producto es altamente txico y se debe utilizar con mucha cautela; generalmente,
basta con una solucin acuosa entre 0.1% a 1.5% (p/v) y una exposicin de 3 a 10 minutos para
que la esterilizacin tenga efecto. El problema principal del bicloruro de mercurio no slo es su
naturaleza altamente venenosa y corrosiva, sino la dificultad para removerlo mediante el
enjuague; a pesar de esto, tiene su valor en la esterilizacin (Yao et al., 1981).
Algunos desinfectantes comnmente usados para la esterilizacin de explantes:
DESINFECTANTE
CONCENTRACION
TIEMPO DE EXPOSICION
Hipoclorito de calcio
9 10%
5 30 min.
Hipoclorito de sodio
0.5 5%
5 30 min.
Perxido de hidrgeno
3 12 %
5 15 min.
Alcohol etlico
75 95 %
seg. min.
Nitrato de plata
1%
5 30 min.
Agua bromada
1 2%
2 10 min.
Cloruro mercrico
0.1 1%
2 10 min.
Antibiticos
4 50 mg/l
30 60 min.
Cloruro de benzalkonio
0.01 0.1%
5 20 min
3.4. Procedimientos de esterilizacin
El Calor es uno de los agentes que se utiliza con ms frecuencia en la esterilizacin. Se puede
usar en forma de llama directa, de calor hmedo (vapor) o de calor seco (aire caliente); cuando
se utilizan. Ocasionalmente se puede usar agua caliente pero no hirviendo.
Como es bien conocido, el xito en el logro de esterilidad en cualquier preparacin depende de

muchos factores, como son la naturaleza de la sustancia que se esteriliza, el volumen contenido
en cada unidad, el tamao del recipiente y el nmero de unidades que se pueden manejar en una
sola operacin. Por consiguiente, no se pueden dar instrucciones especficas relacionadas con el
mtodo de esterilizacin que se utiliza para una preparacin individual; en contraposicin, se
presentan sugerencias generales relacionadas con los procedimientos de esterilizacin.
3.4.1 Calor seco. Los recipientes de vidrio secos que se utilizan para operaciones estriles se
pueden esterilizar por medio de aire caliente; para el efecto se colocan en una estufa de aire
caliente a una temperatura mnima de 170 C, preferiblemente durante dos horas, pero nunca
menos de una hora. El algodn (debidamente envasado) a menudo se esteriliza por intervalos ms
largos, ya que tiende a contener esporas altamente resistentes; puesto que tanto el algodn
como el papel toman un color marrn a temperaturas de 190 C o superiores, para estos
materiales se debe usar una temperatura menor de 170 C, mantenindose bajo ella por lo
menos durante una hora.
Es obvio que todos los materiales esterilizados mediante calor seco debern estar limpios, e
incluso libres de trazas de materia orgnica. (Roca & Mroginski, 1993)
3.4.2 Vapor bajo presin (autoclave). El vapor bajo presin es muy eficiente para destruir todas
las formas de bacterias y hongos y sus esporas, y es el mtodo ms utilizado para esterilizar
diferentes materiales incluyendo los medios de cultivo (siempre y cuando no contengan
componentes termolbiles). (Roca & Mroginski, 1993)
La autoclave ms utilizada actualmente en el laboratorio es el de 25 litros. Al utilizarlo, es
necesario extraer todo el aire antes de empezar el proceso de esterilizacin ya que, a presiones
iguales, la temperatura de una mezcla de aire y vapor no es tan alta como la de vapor puro; la
extraccin del aire se logra al permitir que el vapor expulse el aire del aparato, antes de cerrar
la vlvula correspondiente. La temperatura dentro de la autoclave se regula mediante la presin
y es directamente proporcional a sta; la presin se lee en un manmetro que forma parte de la
autoclave. (Roca & Mroginski, 1993)
Para esterilizar los materiales relacionados con el cultivo de tejidos se acostumbra usar una
presin de 15 psi durante 20 minutos; a esta presin la temperatura del vapor es
aproximadamente 121 C, suficiente para matar virtualmente todas las formas de vida en cinco
minutos. Sin embargo, se debe recalcar que el tiempo de exposicin requerido depender tanto
del tipo del material que se va a esterilizar como de su cantidad. Si se desea que la esterilizacin
sea completa, el calor debe penetrar en cada porcin de la materia; ninguna sustancia es estril
si queda en ella un organismo viable o espora. La siguiente es una gua para presiones variables:
10 psi (115.5 C) durante 30 minutos
Para las operaciones mayores se recomienda colocar detectores de esterilizacin en diferentes
puntos dentro del autoclave o dentro de la masa de material que se trata, para asegurarse que
todas las partes han alcanzado la temperatura deseada. (Roca & Mroginski, 1993)
3.4.3 Calor hmedo a 100 C. Con este mtodo probablemente sea suficiente una sola exposicin
de 15 minutos al calor vivo (100C) para matar todas las formas vegetativas microbianas. Sin
embargo, as no se matan necesariamente todas las formas de esporas y puede ser prctico, por
consiguiente, efectuar la esterilizacin intermitente, siempre y cuando se disponga de cierto
equipo. En este caso, la exposicin puede ser de 30 a 60 minutos y se repite diariamente durante
tres das consecutivos, conservando el material a la temperatura del cuarto o en una incubadora
entre una exposicin y otra. Tericamente la primera exposicin destruye todas las formas
microbianas; durante las prximas 24 horas, generalmente germinan las esporas convirtindose
en formas vegetativas que mueren en la segunda exposicin; la tercera exposicin es
simplemente un medio de prevencin para destruir las esporas vivas que hayan podido tener una
germinacin lenta. (Roca & Mroginski, 1993)
A veces el procedimiento se modifica utilizando temperaturas inferiores a la del agua hirviendo y
aumentando el nmero de las exposiciones hasta cuando haya una seguridad razonable de
esterilidad. Se utilizan temperaturas de 60 a 80 C y se repiten sucesivamente las exposiciones
durante 4 a 7 das. (Roca & Mroginski, 1993)
Este mtodo del calor hmedo a 100 C, conocido como mtodo de Koch se utiliza en la
esterilizacin de medios que contiene componentes capaces de soportar la exposicin a
temperaturas de vapor vivo, pero no a las temperaturas mayores que tiene el vapor bajo presin.
No obstante, este mtodo no est exento de problemas; las esporas pueden no desarrollarse en
las soluciones no nutritivas como el agua corriente, por lo cual se recomienda reemplazarlo,
cuando sea posible, por el mtodo de filtracin; sin embargo se ha mencionado, incluso en este
caso, como una alternativa cuando no se dispone de las instalaciones o medios para esterilizar
por filtracin. (Roca & Mroginski, 1993)
En trminos generales, los medios para el cultivo de tejidos de plantas son bastante ricos en
componentes que pueden servir de sustente a los microorganismos y existe la posibilidad de que
los contaminantes aparezcan durante los intervalos sucesivos.
3.4.4 Filtracin. La esterilizacin de lquidos va acompaada rutinariamente de la filtracin a

travs de filtros especiales a prueba de hongos y bacterias. Es claro que los filtros y otros
aparatos se deben esterilizar antes de tratar de utilizarlos para remover los contaminantes de un
lquido. (Roca & Mroginski, 1993)
Obviamente el tamao del poro es el principal factor en la capacidad de retencin de bacterias
de estos filtros; otros factores que afectan la penetrabilidad del filtro por los microorganismos
son el pH, la carga elctrica del material filtrado, la temperatura, la presin y la duracin del
procedimiento de filtracin as como el efecto de la absorcin de protenas y otras sustancias en
el filtro; tambin puede haber contaminacin en el filtrado a causa de una presin excesiva en el
filtro de fugas de las lneas al vaco cuando se utiliza presin negativa. (Roca & Mroginski, 1993)
En el mercado se encuentra una amplia gama de aparatos de filtracin entre los cuales est el
Millipore. Se encuentran disponibles adems los filtros desechables que, aunque costosos,
pueden ahorrar tiempo y son pre-esterilizados.
3.5 Limpieza de los Recipientes de Vidrio
La limpieza de los recipientes de vidrio y otros utensilios es de importancia vital en el trabajo de

cultivo de tejidos vegetales. Nunca se debe utilizar jabn; cuando sea posible, se deben adoptar
detergentes que se laven y enjuaguen fcilmente. Se debe utilizar agua caliente con el
detergente, enjuagar luego con agua caliente sola, hacerlo despus con agua desionizada y
finalmente con agua destilada. (Roca & Mroginski, 1993)
Bajo circunstancias especiales puede ser necesario exponer los recipientes de vidrio a soluciones
limpiadoras de cido crmico, durante varias horas. Pero es necesario reconocer que sera
imposible remover los iones de cromato residuales y que stos a su vez seran dainos o txicos
para las clulas y tejidos de las plantas (Richards, 1936; Henry et al., 1946; Butler et al., 1954).
Adicionalmente, las soluciones limpiadoras son peligrosas y se deben utilizar con cautela para
evitar quemaduras y problemas de contaminacin ambiental. Los residuos de iones de cromo se
podran remover lavando con detergente, pero el proceso de limpieza se volvera ms intensivo
en el uso de recursos humanos.
4 RECONOCIMIENTO DE EXPLANTES Y DISECCIN

4.1 Lmina foliar. Cultivo de hojas
Los requerimientos nutricionales y ambientales de un rgano, as como diferenciacin y
funcionamiento de tejidos especializados, en la actualidad pueden ser explorados con ms
veracidad. Se ha practicado el cultivo in vitro de rganos muy inmaduros, como son las secciones
de hojas; estos experimentos se han realizado en helechos y angiospermas (Steeves y Sunex,
1972). El objetivo de estos cultivos ha sido el conocer hasta dnde se llega en el desarrollo
normal de dicho rgano en condiciones in vitro y qu propiedades del medio contribuyen a su
desarrollo. Con este cultivo se ha logrado cierto xito. Sin embargo an se tienen grandes
incgnitas o interrogantes sobre los nutrientes y los estmulos hacia el rgano in Situ y lo que
puede ser dado y asimilado en el cultivo in vitro.
Los primordios de hoja requieren de un medio nutritivo muy simple para completar su desarrollo.
Se puede lograr un crecimiento satisfactorio en un medio consistente en una solucin balanceada
de sales minerales y una fuente de carbohidratos (usualmente sacarosa del 2 al 3%). El medio con
Agar se ha usado preferentemente para primordios grandes, pero el crecimiento y supervivencia
de primordios muy pequeos se ven favorecidos por el medio lquido. Las hojas se cultivan
usualmente en luz, con un ciclo luz oscuridad, pues las anormalidades morfogenticas
sobrevienen durante el cultivo en oscuridad. (Pachn, 2008)
Las hojas que crecen en cultivo desde el primordio hasta la madurez tienen una forma tpica,
pero disminuyen en tamao y frecuentemente muestran una reduccin en su complejidad
morfolgica. La reduccin en el tamao es el resultado de un decremento en el nmero celular y
no en el tamao de las clulas. (Pachn, 2008)
Se ha tenido poco xito cuando se ha querido aumentar el tamao de las hojas en cultivo, aun
adicionando al medio sustancias complejas de composicin desconocida.
El cultivo de primordio foliar posibilita la evolucin de los efectos de varios nutrientes, factores
de crecimiento y cambios de las condiciones ambientales en el desarrollo de hojas bajo
condiciones diferentes .a las complejidades que se encuentran en la planta per se. (Pachn,
2008)
El cultivo de hojas se ha usado tambin en la propagacin masiva; por ejemplo: en el cafeto se
emplean secciones de hojas con la finalidad de obtener embriones somticos va formacin de un
callo intermediario. Tambin se han hecho experimentos con secciones de hojas de violeta
africana para obtener brotes y posteriormente enraizarlos para una multiplicacin clonal rpida.
(Pachn, 2008)
4.2 Punta radicular:
Para el establecimiento de un cultivo de races de tomate las semillas se esterilizan y se colocan

para su germinacin en una caja de Petr con papel filtro hmedo en condiciones de oscuridad y a
25C. Cuando las races hayan emergido y tengan entre 2 y 4 cm de longitud, se cortan pices de
1 cm de largo y cada uno de ellos se siembra en un medio de cultivo liquido de White. Los
explantes generalmente flotan sobre la superficie del medio y el incubarlos a 25 C en oscuridad
se elongan y emergen races laterales del eje principal. Pude establecerse un clon de races
aisladas a partir de un cultivo de raz, cortando secciones del eje principal de la raz, cada
seccin con cuatro o cinco races laterales jvenes. Las secciones se transfieren individualmente
a un medio de cultivo nuevo, donde sus races se elongan para producir nuevas races laterales.
Los pices de races laterales obtenidas (de 1 cm de longitud) se pueden cortar para establecer
cultivos similares al inicial. (Pachn, 2008)
4 3 SIEMBRA DE EMBRIONES
La regeneracin de plantas por embriognesis somtica a parir de explantes de hoja se logra en
caf por medio de la induccin de embriones somticos, utilizando cultivo primario para la
proliferacin de callo y un cultivo secundario, en medio lquido para la formacin de estos
embriones, ocho semanas ms tarde. La regeneracin de plantas se logra en otras ocho semanas.
(Pachn, 2008)
Desde 1920 se demostr que a veces es posible estimular el crecimiento de ciertos embriones en
cultivos aspticos, cuando en otros medios no se puede lograr. En algunos casos, embriones con
reservas alimenticias pobremente desarrolladas no germinan porque dependen de fuentes
externas de alimentacin, como las semillas de orqudeas. Otro ejemplo de embriones que
fracasan en su germinacin es el caso en los cuales se forman inhibidores de la semilla; en este
caso los embriones germinan slo despus de un periodo de letargo. El cultivo asptico se ha
convertido en un procedimiento rutinario para rescatar embriones que normalmente no se
habran desarrollado como plantas.
4.4 MERISTEMO
En los primeros estadios del desarrollo embrionario vegetal la divisin celular tiene lugar en todo
el organismo, pero a medida que el embrin se desarrolla y se transforma en una planta adulta la
adicin de nuevas clulas se restringe a ciertas partes de la misma, que el resto de la planta se
especializa en otras actividades especficas. Estos grupos de clulas que retienen su actividad
embrionaria durante toda la vida de la planta se denominan meristemos (Esau, 1976). Los
meristemos incluyen meristemos de raz, de tallo (principales y laterales) e intercalares, as
como tambin el engrosamiento de meristemos primarios y meristemos secundarios, como lo son
el felgeno y el cambium. El meristemo apical de tallo da lugar a diversos tipos de clulas,
tejidos y rganos; reconoci que esta regin indiferenciada daba origen al crecimiento de la
planta (Esau, 1976).
La organizacin ms actualizada y aceptada de pices meristemticos de acuerdo con la filotaxia,
la simetra bilateral, la determinacin de modelos vasculares en races y brotes, y la dominancia
y autodeterminacin del meristemo en cuanto a control de desarrollo, es la de Wardlaw (1965),
quien sugiere una organizacin apical con cinco regiones que pueden ser comunes para pices de
todos los grupos:
a) Regin distal (meristemtica).

b) Regin subdistal (primordios de hoja).
c) Regin inorgnica (tejidos internos).
d) Regin subapical (elongacin de axis, diferenciacin del tejido vascular, elongacin de los
entrenudos).
e) Regin de maduracin (estabilizacin morfogentica).
Mediante la tcnica de cultivo de tejidos vegetales podemos estudiar diferentes fenmenos

morfogenticos que nos ayuden a entender cules son los factores fundamentales que intervienen
en la morfognesis y diferenciacin de partes aisladas de la planta, que estn fuera de las
influencias correlativas del resto de la misma. Se pueden cultivar varios tipos de tejidos, como
protoplastos, callos, nucelas, vulos, primordios florales y meristemos apicales y laterales
(Walkey, 1978). De estos tejidos, los meristemos apicales han sido los inculos ms efectivos para
la produccin de plantas completas en una amplia gama de cultivos econmicamente importantes
(Quak, 1977; Walkey, 1978).
Si se cultivan en un medio adecuado, los meristemos pueden regenerar plntulas completas ms

rpidamente que los tejidos de otras fuentes; las plantas regeneradas usualmente retienen las
caractersticas, genticas de los progenitores, lo que se debe a la naturaleza diploide de las
clulas meristemticas (Murashige, 1974). El estudio detallado in vitro de los requerimientos
nutricionales, hormonales y ambientales nos ayuda a entender los mecanismos reguladores que
controlan la diferenciacin de las plantas. De aqu la gran importancia de los meristemos de la
planta, pues se encuentran asociados con clulas altamente diferenciadas, adems de que el
meristemo da origen a diversos tipos de clulas, tejidos y rganos para formar a una planta
completa; tambin se perpeta a s mismo, produciendo clulas que retienen su actividad
meristemtica.
4.5 CULTIVO DE CALLOS
Se puede definir el callo como un tejido obtenido por medio del aislamiento de rganos o tejidos
diferenciados los cuales posteriormente son llevados a una desdiferenciacin celular,
presentando estas clulas una proliferacin continua, acelerada y de apariencia desorganizada,
que da origen a una masa amorfa de tejido. Esta masa celular puede presentar varios tipos
morfolgicos, los cuales varan segn la apariencia externa, textura y composicin celular.
Algunos callos son masas celulares compactas y duras, con clulas ntimamente ligadas, mientras
otras forman tejidos esponjosos con una gran cantidad de espacios intercelulares. (Roca &
Mroginski, 1993)
La coloracin de este tejido tambin varia, aun derivando de la misma especie (se puede
presentar callos que carecen de pigmentacin, mientras que otros pueden ser de diferentes tonos
amarillo, verde, caf, o rojo). El tipo y grado de pigmentacin esta marcadamente influenciado
por factores nutricionales y ambientales, y se manifiesta por la presencia de clorofila, carotenos,
xantocianinas, etc. (Roca & Mroginski, 1993)
La induccin del callo a partir de una porcin vegetal sucede cuando el inculo ya estril se pone
en contacto con un medio de cultivo que induzca y mantenga un crecimiento y una divisin
celular continuas. (Roca & Mroginski, 1993)
Dependiendo del inculo, la proliferacin del callo se puede iniciar casi a partir de cualquier
rgano vegetal (hoja, raz, polen, embriones, semillas, etc.) o sus partes. En general, los callos
derivados de embriones y plntulas tienen un mayor potencial para la morfognesis. Tambin es
importante el estado fisiolgico y la edad de la planta donadora del callo, siendo recomendable
utilizar plantas jvenes y con crecimiento activo, aunque se pueden obtener buenos resultados
con plantas adultas, como sucede con la obtencin de embriognesis somtica a partir del callo
proveniente de rboles de sndalo de 20 a 25 aos de edad. (Roca & Mroginski, 1993)
5. ELABORACION DE STOCKS Y MEDIOS DE CULTIVO
5.1 MEDICIONES
Las concentraciones utilizadas en cultivo de tejidos son referenciadas en:
a) Miligramos por litro: mg/l partes por milln: PPM: es la cantidad de miligramos de un soluto
disueltos en un litro de solucin.
b) Molaridad: o concentracin molar es el nmero de moles de soluto contenidos en un litro de

solucin y se designa as: M = moles de soluto
litro de solucin
c) Normalidad: es el nmero de equivalentes gramo (o peso gramo equivalente) de soluto
contenidos en un litro de solucin:
N = equivalentes gramo
Litro de solucin
Equivalentes gramo = peso molecular nmero de grupos H+ o OH-

d) Doble dilucin: a partir de una solucin concentrada obtener una ms diluida. Una de las
formulas ms utilizadas para hacer estas soluciones es: Vi X Ci = Vf X Cf, donde:
Vi: volumen inicial

Ci: Concentracin inicial
Vf: Volumen final
Cf: Concentracin final
5.2 ELABORACION DE STOCKS
Preparacin de soluciones madre: Las soluciones madre de sales inorgnicas se deben preparar
combinndolas de modo que no precipiten. La solucin salina madre de Murashige y Skoog se
prepara de la manera siguiente:
COMPUESTO
CONCENTRACION (mg/100ml)
Nitrato de amonio
16500
Nitrato de potasio
19000
Sulfato de magnesio
3700
Sulfato de manganeso
220
Sulfato de zinc
86
Sulfato cprico
0.25
Cloruro de calcio
4400
Yoduro de potasio
8.3
Cloruro de cobalto
0.25
Fosfato monobsico de potasio
1700
Acido brico
62
Molibdato de sodio
2.5
Sulfato ferroso
278.1
Acido etilendiaminotetractico
373.1
Los compuestos orgnicos que son relativamente insolubles en agua requieren de un codisolvente.
El dimetil sulfxido, en cantidades mnimas, se usa muy frecuentemente; la concentracin
ptima es de 0.5%. Las citocininas son bases dbiles, por tanto deben disolverse en cido diluido;
las auxinas son cidos dbiles y deben disolverse en base diluida. Generalmente se usan 0.3 ml de
NaOH 1N o HCl 1N por cada l0 mg de citoquinina o auxina.
Las soluciones madre deben mantenerse en refrigeracin o a temperatura ambiente si se conoce
su estabilidad. Las soluciones de hierro deben guardarse en frascos mbar.
Las sustancias que se agregan en grandes cantidades al medio, como sacarosa y agar, no
necesitan ser disueltas y conservadas como soluciones madre; debern pesarse y aadirse
directamente al medio de cultivo.
Para ajustar el pH se emplearn soluciones 1.0 N de NaOH y 1.0 N de HCl.
5.3 Elaboracin del medio de cultivo
El xito que se obtenga en el cultivo de tejidos vegetales depende en gran parte del uso de un
medio nutritivo adecuado, como tambin del empleo de tejidos viables, incubacin, calidad de
reactivos, etc. Las necesidades nutricionales, varan con la especie, naturaleza del tejido, estado
fisiolgico, mtodo de cultivo y tipo de organognesis a estudiar. La nutricin mineral in vitro,
esta en funcin de las dimensiones del explante, la naturaleza del tejido, la actividad
metablica, la frecuencia de trasplante y la composicin del medio.
Los principales componentes del medio de cultivo se pueden clasificar en:
5.3.1 Sales inorgnicas: Mezcla de macronutrientes y micronutrientes. Se han llevado a cabo
muchas investigaciones con el fin de optimizar las necesidades de plantas especficas, lo cual ha
trado como consecuencia la formulacin de varias mezclas salinas.
Los macronutrientes son molculas requeridas en mayores proporciones; los macroelementos

necesarios son: nitrgeno, fsforo, azufre, potasio, magnesio y calcio.
Los micronutrientes son molculas requeridas en menores cantidades. Los principales
microelementos son: Hierro, cobre, zinc, manganeso, molibdeno y boro.
La frmula de Murashige y Skoog (1962) ha demostrado que es el medio adecuado para una gran
variedad de especies, as como para diferentes partes de una planta. Esta frmula contiene
grandes cantidades de macronutrientes; tambin contiene una alta concentracin de nitrgeno
en forma de NH4, NO3 y KNO3.
5.3.2 Compuestos orgnicos: Se clasifican en tres grupos: Carbohidratos, sustancias hormonales y

vitaminas.
5.3.2.1 Carbohidratos: La sacarosa es la fuente de carbono ms ampliamente usada, y se emplea
a una concentracin de 2 a 3%; sin embargo, en ciertas especies se emplean concentraciones muy
elevadas (5 a 12%). Ocasionalmente se emplea la glucosa en cultivos de monocotiledoneas, as
como la fructosa y el almidn para otras especies.
5.3.2.2 Sustancias hormonales Auxina: el nombre auxina (del griego auxein, crecer) fue dado a la
sustancia reguladora de crecimiento producida en el pice del coleptilo de avena. Sin embargo,
en la actualidad se sabe que las auxinas estn universalmente presentes en las plantas
superiores. Se piensa que la auxina AIA cido indol-3-actico es la principal en las plantas
superiores, aunque existen otras sustancias que tienen actividad auxnica. En muchos casos, estas
otras sustancias son indoles, muy relacionados qumicamente con el AIA. Las concentraciones
varan de especie a especie, pero generalmente las auxinas se usan en una concentracin de 0.1
a 10.0 mg/l. A continuacin se muestran las auxinas ms ampliamente usadas: (Roca & Mroginski,
1993)
Acido 3-indolactico (AIA) (muy termolbil)
Acido 3-indolbutrico (AIB)
Acido naftalenactico (ANA)
Acido 4-clorofenoxiactico (CPA)
Acido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)
Acido 4-amino-3,5,6-triclooropicolnico (Tordn, producto comercial, M. R.)
Citoquininas. El nombre genrico de las citocininas es empleado para aquellas sustancias
qumicas que pueden estimular principalmente la divisin celular o citocinesis. Casi todas las
citocininas conocidas, tanto naturales como sintticas son derivados de la adenina, en los cuales
el grupo amino lleva determinados sustituyentes en la posicin 6. Adems, aunque son bastante
diferentes de la adenina, las fenil-ureas tambin presentan actividad citocininica. Los rangos ms
usados comnmente estn entre 0.03 a 30.0 mg/l. (Roca & Mroginski, 1993)
Citocininas ms comunes:
N6 bencil aminopurina (BAP)
N6 dimetil alil aminopurina (2iP)
N6 furfuril aminopurina (cinetina)
N6 (4-hidroxi, 3-metil, 2-butenil) adenina (zeatina)
Las giberelinas son un grupo de reguladores de crecimiento formadas de diterpenos, los cuales
estn compuestos por cuatro unidades de isopreno, por lo comn formando tres anillos, adems
de presentar un puente de lactona. (Roca & Mroginski, 1993)
En la naturaleza existen muchas giberelinas, a las que se le designa como giberelina, GA1, GA2,
GA3 y as sucesivamente, llegando ms all de la cuarenta.
Etileno: La presencia de bajas concentraciones (0.1ml/l) de gas etileno en la atmsfera, no han
presentado efectos marcados sobre la divisin celular, aunque parece tener leve influencia en
clulas no diferenciadas bajo una concentracin crtica; los efectos sobre la morfognesis no han
sido del todo esclarecidos ya que presenta reacciones tanto inhibitorias como estimuladoras.
Entre los antagonistas del etileno se han reportado el dixido de carbono, los iones de plata,
agente quelatinantes como el EDTA, la acetilcolina y la amino-etoxy-vinilglicina. (AVG). (Roca &
Mroginski, 1993)
Poliaminas: Estos compuestos son cationes que contienen dos o ms grupos amino. Los ms
abundantes y fisiolgicamente ms activo estn putrescina (NH2-(CH2)4-NH2), cadaverina (NH2-
(CH2)5-NH2), espermidina (NH2-(CH2)3-NH(CH2)4-NH2), espermina (NH2-(CH2)3-NH(CH2)4-
NH(CH2)3-NH2). Estos compuestos se encuentran en concentraciones milimolares. Sus funciones
son: promover la divisin celular, estabilizar las membranas, estabilizar protoplastos aislados,
promover el desarrollo de algunos frutos, estimular la floracin, minimizar el estrs hdrico de
diversos tipos de clulas, regular procesos de embriognesis y senescencia. (Roca & Mroginski,
1993)
Acido abscsico: Es otro compuesto de origen natural, el cual es sintetizado en los cloroplastos y
plastidios y se encuentra en un gran nmero de plantas.
El cido abscsico esta relacionado con la regulacin de los promotores del crecimiento;
generalmente tiene un efecto inhibidor por que su actividad es frecuentemente contraria a la de
los promotores.
En las plantas esta involucrado en la induccin de dormancia y regulacin de la apertura
estomtica. En condiciones in vitro se ha observado que tiene un moderado efecto inhibitorio en
la formacin de callo; una influencia benfica en la morfognesis y un efecto inhibitorio en el
crecimiento de embriones somticos y zigticos. Esta inhibicin del crecimiento de embriones
puede ser utilizada para el almacenaje de embriones y estudios de produccin de semillas
artificiales o de bancos de germoplasma. (Roca & Mroginski, 1993)
Vitaminas: La nica vitamina que ha demostrado tener importancia en cultivos de clulas y

rganos es la tiamina, utilizada en concentraciones de 0.1 a 1.0 mg/l. El meso-inositol (myo-
inositol) puede actuar sobre la proliferacin del tejido y eventualmente sobre la activacin de la
organognesis; la concentracin empleada es 100 mg/l. Las vitaminas ms utilizadas son: cido
ascrbico, cido nicotnico, biotina, riboflavina, piridoxina, glicina. (Roca & Mroginski, 1993)
5.3.2.3 Aminocidos y amidas: Los requerimientos de aminocidos y/o amidas se pueden

determinar rpidamente por medio de la adicin de un hidrolizado proteico. Cualquier efecto
positivo puede ser investigado por una adicin posterior de una mezcla de aminocidos y amidas
en lugar del hidrolizado. As, un aminocido o amida especficos pueden detectarse por un
proceso de eliminacin. Los aminocidos y amidas que han demostrado tener efectos benficos
son la L-arginina, cido L-asprtico, L-asparagina, cido L-glutmico y L-glutamina. La L-serina
juega un papel muy importante en la iniciacin de embriones haploides en cultivos de anteras; la
L-tirosina es crtica en la formacin de tallos de cultivos de callos. (Roca & Mroginski, 1993)
5.3.2.4 Otros compuestos orgnicos. La adenina o el sulfato de adenina frecuentemente favorece

la formacin de tallo in vitro. Su concentracin vara de 40 a 160 mg/l.
Las bases nitrogenadas (cido citidlico y guanlico) promueven el crecimiento de cultivos de
callos, usndose en una concentracin de 100 mg/l.
Cuando se agrega jugo de naranja, el aumento en el crecimiento de algunos callos es atribuible,
parcialmente, al cido ctrico. Este cido, junto con ascrbico, se emplea para evitar la oxidacin
de ciertos inculos. El cido mlico, en una concentracin de 100 mg/l, se emplea en algunos
medios para el cultivo de embriones. (Roca & Mroginski, 1993)
5.3.2.5 Complejos naturales. Muchas preparaciones de composicin indefinida han sido

empleadas para enriquecer los medios de cultivo; frecuentemente se han empleado como ltima
alternativa despus de que todos los ingredientes definidos del medio han fallado en el
establecimiento de cultivo de clulas y rganos. Ejemplos de estas preparaciones son las
siguientes:
Pulpa de pltano 150 g/l
Endospermo de coco 10 a 20%
Emulsin de pescado 1 cu/l
Extracto de malta 500 mg/l
Jugo de naranja 3 a 30%
Hidrolizado proteico 30 a 3 000 mg/l (casena, lactoalbmina, peptona y triptona)
Jugo de tomate 30%
Extracto de levadura 50 a 5 000 mg/l
Frmulas para hacer el medio para la germinacin de semillas de orqudeas in vitro
Frmula de Knudson "C" 1.000 g de Nitrato de Calcio0.250 g de Fosfato monopotsico0.250 g de

Sulfato de Magnesio0.500 g de Sulfato de Amonio0.025 g de Sulfato de Hierro0.0075 g de Sulfato
de Manganeso20.00 g de azcar10.00 g de agar-agar1 litro de agua destilada (agua sin cloro)El pH
debe estar alrededor de 4.8 - 5.0.
Frmula del pltano100.00 g de pltano maduro hecho pur o licuado10.00 g de agar-agar15.00 g
de azcar4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg900 ml de agua destiladaFrmula del
Tomate250.00 g de tomate bien maduro y sanos. Hacer una pasta y colar en colador bien
fino.10.00 g de agar-agar15.00 g de azcar4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg900
ml de agua destiladaFrmula de la pia200 ml de jugo de pia dulce y maduro10.00 g de agar-
agar15.00 g de azcar4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg800 ml de agua
destiladaFrmula del Tomate con Zanahoria 100.00 ml de zumo de zanahoria100.00 ml de zumo
de tomate10.00 g de agar-agar15.00 g de azcar4 comprimidos de Tiamina (vitamina B1) de 300
mg800 ml de agua destiladaFrmula del Tomate con Banana 40 g de banana hecha pur o
licuada100.00 ml de zumo de tomate10.00 g de agar-agar20.00 g de azcar4 comprimidos de
Tiamina (vitamina B1) de 300 mg900 ml de agua destiladaFrmula del Profesor Burgeff 1.000 g de
Nitrato de Calcio0.250 g de Sulfato de Amonio0.250 g de Sulfato de Magnesio0.020 g de Sulfato de
Hierro0.250 g de Fosfato bipotsico0.250 g de Fosfato monopotsico20.00 g de azcar o miel de
abejas12.00 g de agar-agar1 litro de agua destilada (agua sin cloro)Frmula de La Garde 1.00 g de
Sulfato de magnesio1.00 g de Nitrato de Calcio1.00 g de Fosfato monopotsico1.00 g de Clorato
de Calcio0.50 g de Nitrato de Amonio0.50 g de Carbonato de Amonio0.05 g de Fosfato de
Hierro20.00 g de azcar12.00 g de agar-agar1 litro de agua destilada (agua sin cloro)Frmula
usada en Hawai 1 1/2 cucharada de t de emulsin de pescado1 cucharada de t de peptona12 g
de agar-agar20 g de azcar1 litro de agua destiladaFrmula ms Casera 3 cc de abono DynaGro 7-
9-5 o 10-5-512.00 g de agar-agar20.00 g de azcar2.000 g de carbn vegetal o carbn activado5
tomates pera sin semillas (aquellos bien chiquitos)150.00 ml de agua de coco40.00 g de banana
(mas o menos media banana)800 ml de agua destilada
(www.turrusta.blogspot.com)
En todos los casos con gelatina, primero se pesan y se dejan preparados los com puestos qumicos
con las cantidades correctas. Despus se pone a calentar, el agua destilada dentro de una
cazuela de vidrio, esmaltada o revestida de tefln. Cuando est a punto de hervir (pero sin que
esto ocurra) se aaden todos los dems componentes y se mezclan utilizando una cuchara de
madera o de plstico. Se revuelve un poco para que se disuelvan todos los ingredientes, se apaga
el fuego y se reparte el preparado en los frascos. (www.turrusta.blogspot.com)

frascos y se prosigue con la esterilizacin.Todas la frmulas funcionan bien siempre que el pH se
encuentre dentro de la faja cida de 4.8 a 5.0, no olvidar de medirlo siempre con la mezcla
caliente. Nota: Las frmulas con tomate ya tienen el pH adecuado. Una de las frmulas ms
usadas es la de tomate con pltano. (www.turrusta.blogspot.com)
PARTES DE UNA ORQUIDEA
Tomado de http://turrusta.blogspot.com/2009/05/formulas-para-hacer-el-medio-para-la.html
El hidrolizado protico se emplea principalmente como fuente de aminocidos. La pulpa de

pltano y la emulsin de pescado se usan principalmente en los medios para cultivo de orqudeas,
mientras que el endospermo de coco, extracto de malta y extracto de levadura tienen un uso ms
general.
5.3.2.6 Carbn activado

Sus efectos se pueden resumir as:
- Efecto favorable sobre rizognesis debido al oscurecimiento del medio.
- Efecto favorable por la absorcin de metabolitos fitotxicos que estaran siendo liberados al
medio de cultivo por los tejidos (fenoles y sus oxidados, hidroxiquinonas, cido-para-
hidrobenzico).
- Promueve la embriognesis.
- Adsorcin de etileno que inhibe el crecimiento y la diferenciacin de las plntulas y
protocormos.
- Previene el crecimiento de callo.
- Contribucin de minerales en forma de impurezas la cual estara enriqueciendo el medio de
cultivo.
- Adsorcin de sustancias producidas durante la esterilizacin en el medio de cultivo, como el
hidroximetil-furfural, resultado de la deshidratacin de las hexosas que afectan el desarrollo y
crecimiento de las plntulas (Len M., 1995).
5.4 Medios de cultivo
5.4.1 Medio de cultivo gelificado. El agar es el material de soporte ms ampliamente usado en el

cultivo de tejidos, pues provee al medio de un excelente gel hmedo que sirve como soporte al
inculo. Sin embargo, fisiolgicamente no es inerte, puesto que es una fuente de cantidades
variables de sustancias inhibidoras como estimulantes del crecimiento. Otros agentes gelificantes
usados algunas veces en lugar del agar, son la poliacrilamida y la silicagel. Cuando se usa medio
lquido, el papel filtro usado como puente o plataforma, es muy frecuente, as como la fibra de
vidrio. (Roca & Mroginski, 1993)
La concentracin del agar en el medio de cultivo vegetal vara de 0.6 a 1 %. Los problemas de
mala gelificacin se deben principalmente al empleo de un pH bajo, cuando el gel queda muy
firme se debe a un pH elevado. Se deben evitar periodos prolongados a altas temperaturas de la
autoclave para impedir el deterioro del agar. (Roca & Mroginski, 1993)
5.4.2 Medio liquido agitado. La agitacin siempre se realiza en un plano horizontal, en tambores
o rotores para matraces o en tubos de cultivo. Cuando se requiere una agitacin ms vigorosa,
como cuando se necesita mantener clulas en suspensin, se debe emplear agitadores giratorios.
Medio liquido estacionario. Los tejido que se recomienda cultivar en medios lquidos son
particularmente aquellos que se decoloran rpidamente despus del corte (escisin). Si no se
emplean materiales de soporte y el cultivo debe permanecer estacionario, se recomienda vaciar
el medio de cultivo en una capa delgada dentro de los matraces o frascos. Si se emplean tubos de
ensayo, estos deben tener cierta inclinacin (45) y contener una mnima cantidad de medio (10
a 20 ml). (Roca & Mroginski, 1993)
5.4.3 Medio blanco. Consiste en un medio compuesto por agua, azcar y agar. No contiene
ninguno de los nutrientes ni fitorreguladores. Es utilizado para casos de desintoxicacin de
explantes; tambin puede ser utilizado para pruebas de ensayo en desinfeccin de material
vegetal para evitar el gasto de sales nutritivas y sustancias de crecimiento, que pueden ser de un
elevado costo. (Roca & Mroginski, 1993)
6. FASE DE ENDURECIMIENTO Una de las etapas que reviste gran importancia dentro de la tcnica
de propagacin in vitro es el trasplante de las plntulas al suelo, as como la adaptacin de stas
al medio ambiente, lo cual se ha llevado a cabo con xito en varias especies a travs de
numerosos intentos.
Deben considerarse algunos factores importantes para la aclimatacin de plntulas al medio
ambiente, ya que las condiciones difieren mucho en la fase de laboratorio y las de invernadero y
campo, siendo necesario, que sean sometidas a un tratamiento de aclimatacin para evitar la
prdida de muchos propgulos, valiosos al ser trasplantados al suelo. Podemos considerar tres
fases secuenciales para lograr una buena respuesta: aclimatacin, invernadero y campo
6.1 FASE DE ACLIMATACIN

Durante la fase de aclimatacin los cultivos debern ser colocados durante una o dos semanas
bajo un ambiente controlado, donde la intensidad lumnica deber ser de 10000 lux; tanto la
temperatura como el fotoperiodo sern regulados de acuerdo con las necesidades de cada
cultivo.
La plntula dentro del tubo de ensayo se encuentra bajo condiciones de esterilidad y con alta
humedad relativa, la cual deber reducirse eliminando el papel parafilm (si se usa) unos cinco
das antes del trasplante al suelo, lo que dar a la planta mayor tolerancia a la baja humedad
relativa del medio ambiente, facilitndole su posterior adaptacin a condiciones auttrofas,
donde tendr que regular adecuadamente sus procesos de absorcin, traslocacin y transpiracin
de agua.
6.2 FASE DE INVERNADERO
Una vez efectuada la fase de aclimatacin las plantas pueden ser transportadas y trasplantadas al
invernadero, donde sern sembradas en un sustrato, proporcionndoseles un buen sistema de
drenaje y aireacin para evitar el desarrollo de hongos y bacterias.
Algunas mezclas de sustrato que han dado buenos resultados en varias especies (papa, clavel,
violeta africana, etc.), consisten de tierra y hojas en descomposicin, mezclada en partes iguales
con materiales cuya reaccin es neutra, como son la agrolita (material de origen volcnico con
capacidad de absorcin de agua y sin capacidad de intercambio) y la vermiculita, (mineral. de
mica, compuesto por un silicato de hierro, aluminio y magnesio hidratados; posee propiedades de
intercambio catinico y alta capacidad de absorcin de agua). (Pachn, 2008)
Los sustratos pueden estar constituidos por otro tipo de materiales de sostn como en el caso del
pino, donde se utiliza para su transporte un sustrato constituido en un 70% de corteza de pino,
25% de musgo y un 5% de cenizas. (Pachn, 2008)
Antes de efectuar el trasplante es recomendable que el sustrato sea esterilizado en una
autoclave a una temperatura de 121 C por 30 a 60 minutos (dependiendo de la cantidad), lo
cual reducir la incidencia de patgenos, particularmente aquellos que causan la pudricin de la
raz. (Pachn, 2008)
Las plantas deben tener de dos a tres nudos y un sistema radicular desarrollado para poder ser
trasplantadas al suelo. Se colocan en macetas de PVC o vasos de unicel que contengan el sustrato
ya esterilizado. Para realizar el trasplante los tubos de ensayo se destapan totalmente y se sacan
las plantas, debiendo lavarse cuidadosamente con agua desionizada, de manera que no quede
agar adherido en las races. Las plantas son colocadas en las macetas, cuidando que la raz no sea
daada; una vez sembradas se riegan y se cubren con una bolsa de polietileno, que se podr
eliminar a los 15 das. (Pachn, 2008)
Las plntulas no sobreviven a trasplantes bruscos; los reguladores del crecimiento y los
compuestos orgnicos debe ser gradualmente reducidos y la intensidad lumnica gradualmente
incrementada. La actividad fotosinttica durante las primeras etapas de la planta bajo
condiciones in vitro no es necesaria, ya que a la planta se le suministran los elementos bsicos
para su desarrollo mediante un medio nutritivo, encontrndose as en un estado heterotrfico y
pasando a un estado autotrfico al ser trasplantados al suelo. (Pachn, 2008)
En el invernadero se recomienda tener un estricto control fitosanitario, particularmente en
aquellos casos donde el objetivo fundamental es la obtencin de plantas libres de patgenos.
(Pachn, 2008)
6.3 ADAPTACIN DE PLANTAS OBTENIDAS

La etapa de adaptacin a invernadero puede tener una duracin de cuatro a ocho meses,
dependiendo de la respuesta particular de las plantas.
6.4 FASE DE CAMPO El trasplante al campo se recomienda realizarlo en das nublados y teniendo
el suelo una humedad a capacidad de campo. En algunas especies, como la yuca, se recomienda
cortar las hojas ms largas de la planta, con objeto de disminuir la transpiracin.
La metodologa del trasplante al campo estar en funcin del tipo de cultivo con el cual se est
trabajando; sin embargo, se recomienda que una vez efectuado el trasplante se aplique al suelo
fertilizante comercial segn anlisis de suelo.
El establecimiento de las plantas a condiciones de campo dura de uno a dos meses. Es necesario
mencionar que las condiciones de adaptacin pueden presentar algunas variantes, de acuerdo con
el cultivo de que se trate.
ORQUIDEAS, DESCRIPCIN Y MORFOLOGIA

Las Orqudeas son plantas ornamentales muy vistosas que pertenecen a la familia botnica de las
Orchidaceae, comprenden aproximadamente 25.000 (algunas fuentes informan de 30.000)
especies, y quiz otros 60.000 hbridos y variedades producidas por horticultores. Estas especies
se pueden encontrar en la mayor parte del mundo, pero son particularmente abundantes en las
regiones tropicales. Sus caractersticas ms sobresalientes quizs sean su complejidad floral, sus
interacciones con los agentes polinizadores y sus simbiosis con hongos para formar micorrizas.
DescripcinHierbas terrestres o epfitas, ocasionalmente trepadoras, algunas veces saprfitas,
ocasionalmente micoparsitas. Perennes (raramente anuales), se dice que las orqudeas pueden
llegar a ser eternas, en la naturaleza, su vida est ligada a la vida del rbol que las alberga; se
conocen plantas recolectadas a mediados del siglo pasado que todava estn creciendo y
floreciendo saludables en muchas colecciones. No crecen ms de 50 cm.
Los tallos son rizomas o cormos en las especies terrestre, las especies epfitas muchas veces
engrosadas en la base y formando pseudobulbos que sirven para almacenar agua y nutrientes y
que por lo general estn recubiertos por vainas o brcteas membranosas que se secan con la
edad. A veces con races tuberosas en las especies terrestres o areas en las especies epfitas,
donde las races tpicamente poseen una epidermis esponjosa, absorbente de agua, compuesta
por muchas capas de clulas muertas, llamada velamen. Las especies adaptadas a perodos de
sequa tienen hojas carnosas que cumplen la funcin de reserva en pocas de escasez. Pelos
variados.En lo referente a su tallo, las orqudeas se dividen en dos grandes grupos, las de
crecimiento "simpodial" (por ejemplo Cattleya, Dendrobium, Laelia, etc.), y las de crecimiento
"monopodial" que producen nuevas hojas alternadamente sobre un tronco con un meristema
comn (por ejemplo Ascocentrum, Phalaenopsis, Vanda, etc.). Las plantas de crecimiento
simpodial estn formadas por un rizoma rastrero, que es en realidad el tallo de la planta, donde
se producen las races. Las orqudeas de crecimiento monopoidal poseen crecimiento erecto
desde cada brote, se van aadiendo hojas en el pice y el tallo se va desarrollando tambin en
consonancia.Las races, muy desarrolladas, en las epfitas cuelgan en el rbol verdes y gruesas.
Siempre presentan micorrizas en sus races. Las races de las epfitas tienen una doble funcin,
son las estructuras que se encargan de captar los nutrientes que la planta necesita y funcionan
como elementos de fijacin.
Del rizoma nacen las hojas, simples y de margen entero, generalmente alternas, espiraladas,
dsticas o verticiladas, muchas veces plicadas, basales o a lo largo del tallo, a veces reducidas,
usualmente con venacin paralela, usualmente envainadoras en la base.
Sin estpulas.Las inflorescenciasson indeterminadas, a veces reducidas a una nica flor, terminal
o axilar. Inflorescencias en espiga, o en racimo, o en pancula.
Ninguna familia de plantas tiene una gama de flores tan diferentes. Bien conocidas son las
variaciones estructurales de las flores que facilitan la polinizacin por una determinada especie
de insecto, pjaro o murcilago.
Las flores pueden surgir, dependiendo del gnero y la especie, de la base de la hoja, del rizoma o
de algn entrenudo del pseudobulbo.
Las flores en general son hermafroditas (raramente unisexuales), en general cigomorfas (de
simetra bilateral), usualmente resupinadas (es decir, las partes florales giran 180 durante el
desarrollo), muchas veces conspicuas, epginas.
Disposicin de los ptalos (P) de una flor de orqudea: spalos (S) - labelo (L)En la gran mayora
de los gneros, las flores estn formadas por tres elementos externos llamados spalos, dos
laterales y uno dorsal, y tres elementos internos llamados ptalos, el inferior modificado en un
labio o "labelo" de tamao mayor y color ms intenso que los dems. A veces son interpretados
como 6 ptalos en dos verticilos en lugar de 3 spalos y 3 ptalos (Judd et al. 2007, Simpson
2005). Las piezas separadas o conadas en la base.
Los spalos, o 3 tpalos externos, son separados a conados, usualmente petaloideos, imbricados.
A veces los 2 spalos laterales se encuentran fusionados en un solo elemento llamado
"sinspalo".Los ptalos, o 3 tpalos internos, estn siempre separados, a veces punteados o
variadamente coloreados. El llamado "labelo" es el ptalo medio, es de tamao mayor que los 2
ptalos laterales, a menudo es trilobulado o de una forma inusual, y con chichoncitos o crestas
carnosos o un espoln basal, y muchas veces con un patrn de colores diferente que los dems.El
androceo usualmente con 1 o 2 estambres (a veces 3), si es uno solo es derivado del estambre
medio del verticilo externo ancestral y usualmente con dos estaminodios vestigiales derivados de
los estambres laterales de un verticilo interno ancestral, en Apostasioideae o Cypripedioideae,
hay 2 o 3 estambres frtiles, cuando son dos, son derivados de los dos estambres laterales del
verticilo interno ancestral, cuando tres, son derivados de stos ms el estambre medio del
verticilo externo. El androceo es adnato al estilo y al estigma, formando una "columna" (tambin
llamada "ginostemo" o "ginostegio"). Las anteras son de dehiscencia longitudinal o modificada,
bisporangiadas, ditecas. El conectivo de la antera muchas veces modificado en un "oprculo" que
cubre la antera hasta la polinizacin.
Polen en ttradas en la mayora de las especies, en msulas en algunas, en mnadas en
Apostasioideae y Cypripedioideae. Usualmente (en todas salvo Apostasioideae y la mayora de
las Cypripedioideae) agrupado en 2 o 4 (o pueden ser 1-12) masas suaves a duras llamadas
"polinias", que son derivadas del microsporangios individuales o de la fusin de productos o
subdivisiones de los microsporangios. La polinia junto con un tallito pegajoso (derivado de la
antera o del estigma) forman en conjunto el "polinario", la unidad de transporte durante
la polinizacin.
Gineceo formado por 3 carpelos connados, nfero, con el ovario unilocular a trilocular,
placentacin usualmente parietal, pero ocasionalmente de placentacin axilar.
Estilo y estigma altamente modificados, el estilo es solitario y terminal y es el mayor componente
de la "columna", con una porcin del estigma formando un lbulo alargado usualmente no
receptivo, llamada "rostelo", posicionada sobre la regin estigmtica, y una porcin del rostelo
que puede formar una plataforma pegajosa, llamada "viscidio". El "viscidio" est adjuntado al
tallito del "polinario".
vulos numerosos por carpelo (a veces del orden de millones), con una pared del megaesporangio
delgada, antropos, usualmente bitgmicos.
A veces no hay nctar, pero tpicamente est presente, y cuando se produce, los nectarios son
variables en posicin y tipo. Por ejemplo, se encuentran en una espuela del labio, o en los pices
de los spalos, o en los septos del gineceo.
El fruto es una cpsula loculicida, que se abre mediante 3 o 6 ranuras longitudinales (a veces 1
sola), raramente una baya.
Las semillas son diminutas y numerosas. El tegumento crustoso o membranoso, sin fitomelaninas,
con slo la capa externa persistente, los tejidos internos colapsados. Las semillas son muchas
veces membranosas y aladas, posiblemente funcionando en dispersin por viento, y sin albmina,
el endosperma abortando muy temprano en el desarrollo. Embrin muy pequeo.
Ecologa Las orqudeas conforman la familia ms extensa del reino vegetal, con alrededor de
20.000 especies divididas en unos 800 gneros distribuidos por todo el mundo. Solamente existen
dos ambientes en la tierra donde no prosperan estas plantas, los polos y los desiertos de arena.
Son ms diversas en las regiones tropicales, donde frecuentemente son epfitas.
Su capacidad para adaptarse es notable, ya que pueden crecer tanto a nivel del mar como en los
pramos elevados. Muchas viven sobre los rboles (epfitas), otras lo hacen sobre las rocas
(litfitas), otras sobre la tierra y algunas especies se desarrollan incluso en ambientes
subterrneos. A pesar de lo que mucha gente cree, no son parsitas, ya que no se alimentan del
rbol donde viven, sino que lo usan como medio de soporte y como vehculo para alcanzar la luz
del sol. Algunas slo miden unos pocos centmetros y otras pueden tener el porte de un rbol.
Sus flores pueden ser tan diminutas que resulta imposible observarlas a simple vista, mientras
que otras llaman poderosamente la atencin.
Por lo general, las especies florecen una sola vez al ao, siempre por la misma fecha,
determinada por factores ambientales como disminucin o elevacin de la temperatura,
incremento de las horas de luz, cambios de estacin, variaciones en la humedad ambiental, etc.
Las flores pueden permanecer abiertas desde un da (Sobralia) hasta ms de tres meses
(Paphiopedilum, Phalaenopsis). Los hbridos producidos por el hombre pueden florecer dos o ms
veces al ao.
Las flores de orqudea son de formas extremadamente variadas y atraen una amplia variedad de
insectos (abejas, avispas, moscas, mariposas, polillas) as como a pjaros, murcilagos o sapos
para la polinizacin. Algunas atraen visitantes generalistas, pero muchas estn bastante
especializadas, atrayendo slo a una o unas pocas especies como polinizadores. Polen, nctar, o
fragancias florales pueden ser empleadas como recompensadores de la polinizacin, mientras que
algunas flores (por ejemplo Cypripedium) manipulan a sus polinizadores y no proveen ninguna
recompensa, y algunas especies de Ophrys y Cryptostylis mimetizan la forma y el olor de las
hembras de abeja, avispa, o mosca, y son polinizadas cuando los machos tratan de aparearse con
la flor (fenmeno llamado "pseudocopulacin"). Generalmente, el labelum funciona como una
plataforma de aterrizaje y provee seales visuales o tctiles que orientan al polinizador. La
polinia se adjunta al cuerpo del polinizador, y muchas veces es depositada en el estigma
(usualmente una depresin en la parte de abajo de la columna) de la siguiente flor visitada. El
gnero Coryanthestiene un labelo como un bolsillo que se llena con un fluido secretado por la
columna, una abeja que cae en este fluido debe viajar a travs de un tnel, forzando la
deposicin del polinario en su cuerpo. La transferencia de polen dentro de la polinia es una
aparente adaptacin para asegurar la fertilizacin de muchos del tremendo nmero de vulos. En
algunas especies la polinizacin es un evento bastante poco comn, y las flores pueden
permanecer funcionales y vistosas por muchos das, con el marchitamiento del perianto
ocurriendo rpidamente despus de la fertilizacin.Angraecum sesquepedale Thouars (de
Madagascar) es conocida por tener un spur de 45 cm. de largo, esta orqudea es polinizada por
una polilla con una proboscis de ese largo, un hecho que Charles Darwin haba predicho antes del
descubrimiento de la polilla.
La mayora de las especies es de fecundacin cruzada, pero se sabe que ocurre
autofecundacin.Las pequeas semillas, que son como polvo, son dispersadas por el viento y
requieren nutrientes provistos por un hongo micorrcico para poder germinar.
Taxonoma Segn Judd et al. 2007, consta de 788 gneros con 19.500 especies. Los gneros ms
representados son Pleurothallis (1120 especies), Bulbophyllum (1.000 especies), Dendrobium (900
especies), Epidendrum (800 especies), Habenaria (600 especies), Eria (500 especies), Lepanthes
(460 especies), Maxillaria (420 especies), Oncidium (420 especies), Masdevallia (380 especies),
Stelis (370 especies), Liparis (350 especies), Malaxis (300 especies), Oberonia (300 especies),
Encyclia (235 especies), Eulophia (200 especies), Angraecum (200 especies), Taeniophyllum (170
especies), Phreatia (160 especies), Polystachya (150 especies), Calanthe (150 especies), Vavilla
(100 especies), y Catasetum (100 especies).
La familia Orchidaceae se subdivide en 6 subfamilias (nmeros estimados de gneros y especies
por el sistema de clasificacin APG:
Spiranthoideae - (desgajada de Orchidoideae)Apostasioideae - 2 gneros y 16 especies del Sureste
AsiticoCypripedioideae - 5 gneros y 130 especies de las regiones templadas del mundo, pocas
en la Amrica tropical;Vanilloideae - 15 gneros y 180 especies en la franja tropical y subtropical
hmeda del globo, y en los Estados Unidos de AmricaOrchidoideae - 208 gneros y 3.630
especies distribuidas en todo el mundo, excepto en los desiertos ms secos, en el crculo polar
rtico y en la Antrtida;Epidendroideae - ms de 500 gneros y cerca de 20.000 especies
distribuidas en las mismas regiones de Orchidoideae, si bien incluyen algunas especies
subterrneas del desierto australiano.
Historia La familia Orchidaceae debe su nombre a una modesta especie del gnero europeo
"Orchis" palabra que en griego significa "testculo" (nombre usado por la primera vez
de Teofrasto), dada la semejanza entre sus pseudobulbos y las partes del animal.
La orqudea es una flor que desde tiempos inmemoriales ha despertado las ms inimaginables
pasiones en los hombres. Ya en la antigua Grecia se le atribuan propiedades curativas y
afrodisacas. Existen escritos chinos de 1.500 aos de antigedad donde se hace referencia al
cultivo de las orqudeas. Pero su verdadero descubrimiento como flor de gran valor ornamental y
el comienzo de su calvario ocurri en los albores del siglo XIX, cuando por casualidad llegaron a
Europa las primeras plantas de Cattleya labiata (especie brasilea), muy parecida a la flor
nacional de Venezuela, la Cattleya mossiae. Durante muchos aos los recolectores profesionales
provenientes en su mayora de Francia e Inglaterra se dedicaron a saquear sin misericordia los
bosques americanos para satisfacer el gusto de las damas y la avaricia de los coleccionistas de la
poca por nuevas y raras especies, a tal punto que muchas de ellas ya se consideran extintas en
la naturaleza.
Evolucin En el ao 2007 cientficos identificaron restos fosilizados de una antigua abeja extinta
que trasladaba polen de orqudeas en su espalda, los anlisis indicaron que las orqudeas
aparecieron hace entre 76 y 84 millones de aos, millones de aos antes de que el hombre
habitara el planeta,[22] las orqudeas ya reinaban en l junto a los dinosaurios. Los restos ms
antiguos han sido encontrados en el Monte Bolca cerca de Verona (Italia).
PRCTICA.
Cultivo de meristemos apicales de clavel (Dianthus caryophyllus L. ) (Pachn, 2008)
Objetivos
Observar la situacin y morfologa del meristemo apical de clavel.
Llevar a cabo la escisin del domo meristemtico con uno o dos primordios de hoja, e inocularlo
en el medio de cultivo.
Observar el desarrollo del meristemo y su diferenciacin en una planta completa.
Materiales y mtodos
Se utilizarn esquejes de clavel de una misma variedad.
El medio de cultivo es el de Shabd y Murashige (1977), en donde las sales inorgnicas son las de
Murashige y Skoog (1962), complementadas con NaH2PO4.H2O en 0.170 mg/l, 0.4mg/l de tiamina
HCl, 100 mg/l inositol, 3% de sacarosa, 1 mg/l de cinetina, 0.3 mg/l de AlA, (cido indolactico)
(en las etapas 1 y II) y 0.65% de agar. El pH se ajustara a 5.7 0.1 con HCl 1N y/o NaOH 1N.
En la etapa III se utilizar el mismo medio de cultivo que en las etapas I y II sin reguladores de
crecimiento y con las sales inorgnicas a la mitad de su concentracin.
Una vez que ha sido preparado el medio de cultivo y disuelto el agar, se vierte el medio en tubos
de ensaye de 150 X 25 mm. En cada tubo se vertern 20 ml de medio y se taparn con tapones de
polipropileno, esterilizndose a 1 kg/cm2 de presin durante 15 minutos en la autoclave y a una
temperatura de 121C.
Para proporcionar una mayor superficie de contacto con el medio de cultivo y facilitar la
siembra, los tubos se inclinarn 45 , antes que solidifique el medio.
Desinfestacin. A cada esqueje se le eliminan las hojas inferiores del tallo hasta dejar el 4 y 5
par de hojas expandidas en la pared superior del mismo, cercanas al meristemo, quedando un
tallo de 5 cm de longitud.
Se sumergen los tallos en alcohol etlico al 70% durante 2 minutos. Al trmino de este tiempo se
pasan a una solucin de hipoclorito de calcio al 4% durante 15 minutos. Posteriormente se
introducen en una solucin de hipoclorito de sodio al 0.5% durante 10 minutos.
Se enjuagan tres veces con agua destilada esterilizada, tratando de eliminar todos los residuos
del hipoclorito usado previamente.
Se colocan en una solucin antioxidante1, quedando listos para la diseccin. 1 La solucin
antioxidante se prepara con 100 rng/1 de cido ascrbico y 150 rng/l de cido ctrico.
Diseccin y extraccin del meristemo. La desinfestacin, extraccin y siembra del meristemo se
deben efectuar dentro de la cmara de flujo laminar de aire. La extraccin del meristemo se
hace con ayuda de un microscopio estereoscpico. Las pinzas, escalpelo y agujas se flamean en
alcohol al 80% antes de que se utilicen en la extraccin.
El tallo se sujeta de la base con ayuda de las pinzas de diseccin. Manipulado el escalpelo se
eliminan las hojas expandidas hasta dejar al descubierto el domo meristemtico.
El meristemo puede llevar uno o dos primordios de hoja; si lleva ms primordios, se deben
eliminar.
Despus que se ha despejado el meristemo, se hace con el bistur un corte tajante en la base del
meristemo, de manera que de un solo corte quede liberado el meristemo, para evitar, al
mximo, el dao en las clulas de la base.
El domo meristemtico se coloca en la punta de la aguja de diseccin y se introduce en el tubo
de ensaye que contiene el medio de cultivo.
La base del meristemo tiene que quedar "sentada" sobre la superficie del medio de cultivo del
tubo de ensaye. El tubo se tapa con el tapn de polipropileno y se transfiere al cuarto de
incubacin.
Se colocar un meristemo por tubo de ensaye, con las condiciones ambientales siguientes:
Etapas I y II :
Intensidad luminosa 1 000 a 2 000 lux
Temperatura 22 2C
Fotoperiodo 16/8 horas de iluminacin
Humedad relativa 80 a 90%
Etapa III:
Intensidad luminosa 8 000 a 10000 lux
Temperatura 27 2 C
Fotoperiodo l0/8 horas de iluminacin
Solucin de Knop (1884). Frmula de fertilizacin para clavel, para plantas madre y las obtenidas
por cultivo in vitro de meristemos y pices de tallo:
Fosfato de potasio (KH2P04) 125 a 200 mg/1
Nitrato de potasio (KN03) 125 a 200 mg/1
Sulfato de magnesio (MgS04 .7H2O) 125 a 200 mg/1
Nitrato de calcio (Ca(N03)2 4H2 0) 500 a 800 mg/1
PRCTICA. CULTIVO IN VITRO DE SECCIONES DE HOJA DE VIOLETA AFRICANA (Saintpaulia

ionantha) (Pachn, 2008)
Objetivos
Familiarizar al lector, de una manera sencilla, accesible y comprensible, con la tcnica de cultivo
in vitro de hojas.
Observar los diferentes estados de desarrollo y la formacin de rganos, tales como brotes y
races, en respuesta al desarrollo de las secciones de hoja de violeta africana.
Demostrar el potencial morfogentico del tejido de hoja en esta especie vegetal.
Material y mtodo
Se utilizaran hojas jvenes de violeta africana, que no estn daadas de la lmina y que se vean
sanas; tambin se utilizaran pecolos.
El medio de cultivo consiste en las sales de Murashige y Skoog (1962), suplementadas con
NaH2P04.H2O, 0.170 mg/l; sacarosa, 30 g/l; tiamina, 0.4 mg/l; inositol, 100 mg/l; AlA (cido
indolactico) 0.1 mg/l; cinetina, 10 mg/l; sulfato de adenina, 80 mg/l, y agar, 0.8%. El pH se
ajustar a 5.7 0.1 con NaOH 1N y/o HCl lN (etapas l y II). En la etapa III se utilizar el mismo
medio de cultivo que en las etapas I y II, sin reguladores del crecimiento y con las sales
inorgnicas a la mitad de su concentracin.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado, se vierte en frascos Gerber, con un volumen
de 30 ml de medio por frasco; se tapan los frascos con papel aluminio y se esterilizan en
autoclave a 15 psi de presin durante 15 minutos, a una temperatura de 121C.
Desinfestacin. Lavado en solucin jabonosa al 1%, tratando de lavar cuidadosamente el haz y el

envs.
Enjuague con agua de la llave.
Inmersin en alcohol etlico al 70% durante 10 segundos.
Inmersin en solucin de hipoclorito de calcio al 2% durante 15 minutos.
Inmersin en solucin de hipoclorito de sodio al 0.5% durante 15 minutos.
Cuatro enjuagues con agua destilada esterilizada, tratando de eliminar los residuos del
hipoclorito.
Preparacin del inculo. Para la lmina foliar se coloca la hoja de violeta africana en una caja de
petri estril y se elimina todo el margen de la hoja junto con el pecolo; en esta zona se corta
una seccin en forma de tringulo, donde se incluya tejido de ambas partes. Posteriormente se
elimina la nervadura central; se corta la lmina en secciones de 1 cm2.
Para el pecolo
Se eliminan las porciones daadas y se cortan cilindros de 2 mm de ancho.
La desinfestacin, preparacin y siembra del inculo se debern efectuar dentro de la cmara de
flujo laminar de aire.
Se colocan cinco secciones por frasco de cultivo. Las secciones se siembran de manera que entre
en contacto con el medio de cultivo.
Despus de sembradas las secciones de hoja, se tapa el frasco con papel aluminio, se levantan las
puntas del papel aluminio hacia la boca del frasco con la finalidad de no interferir la luminosidad
(tambin pueden utilizarse tapas de polipropileno). Las condiciones ambientales son las
siguientes:
Etapa I: establecimiento del cultivo asptico;
Etapa II: multiplicacin de propgulos.

Intensidad luminosa 1000 a 2000 lux
Temperatura 25 2 C
Etapa III: enraizamiento de las plntulas.

Temperatura 25 2 C
Humedad relativa 80 a 90%.
PRCTICA. CULTIVO IN VITRO DE SEMILLAS DE ORQUDEAS(Pachn, 2008)

Objetivos
Observar los diferentes estados de desarrollo y la formacin de rganos, tales como brotes y
races, en respuesta al desarrollo de las semillas de orqudeas.
Demostrar el potencial morfogentico de las semillas en esta especie vegetal.
Material y mtodo
Se utilizaran cpsulas maduras con aristas cerradas, que no estn daadas y que se vean sanas.
El medio de cultivo consiste en las sales de Murashige y Skoog (1962), suplementadas con
NaH2P04.H2O, 0.170 mg/l; sacarosa, 30 g/l; tiamina, 0.4 mg/l; inositol, 100 mg/l; AlA (cido
indolactico) 0.1 mg/l; cinetina, 10 mg/l; sulfato de adenina, 80 mg/l, y agar, 0.8%. El pH se
ajustar a 5.7 0.1 con NaOH 1N y/o HCl 1N (etapas l y II). En la etapa III se utilizar el mismo
medio de cultivo que en las etapas I y II, sin reguladores del crecimiento y con las sales
inorgnicas a la mitad de su concentracin.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado, se vierte en frascos Gerber, con un volumen
de 30 ml de medio por frasco; se tapan los frascos con papel aluminio y se esterilizan en
autoclave a 15 psi de presin durante 15 minutos, a una temperatura de 121C.
Desinfestacin. Lavado superficial en solucin jabonosa al 1%, tratando de lavar cuidadosamente.
Enjuague con agua de la llave.
Limpiar el exterior de la cpsula con alcohol etlico al 70%.
Cortar los extremos de la cpsula y sumergir en solucin de hipoclorito de sodio al 4% - 7%
durante 5 a 10 minutos.
Cuatro enjuagues con agua destilada esterilizada, tratando de eliminar los residuos del
hipoclorito.
La desinfestacin, preparacin y siembra del inculo se debern efectuar dentro de la cmara de
flujo laminar de aire.
Se abre la cpsula con un bistur, y se vierten las semillas en el medio de cultivo.
Despus de sembradas las semillas, se tapa el frasco con papel aluminio, se levantan las puntas
del papel aluminio hacia la boca del frasco con la finalidad de no interferir la luminosidad
(tambin pueden utilizarse tapas de polipropileno). Las condiciones ambientales son las
siguientes:
Etapa I: establecimiento del cultivo asptico.
Etapa II: multiplicacin de propgulos.
Intensidad luminosa 1000 a 2000 lux

Temperatura 25 2 C
Etapa III: enraizamiento de las plntulas.

Temperatura 25 2 C
Humedad relativa 80 a 90%.
CULTIVO IN VITRO DE VARAS DE PHALAENOPSIS I
Haremos cortes con un bistur o sucedneo altamente afilado (cuidando de hacerlos en las varas y
no en nuestros dedos).
Los cortes tienen que ser limpios de manera que las estacas no queden aplastadas.
Antes de realizar cualquier corte hay que esterilizar la cuchilla. Pasarla por el fogn es una buena
opcin. Mucho cuidado si usais tambin alcohol. Jugar con alcohol y fuego es peligroso!!!La
medida es aproximadamente 1 cm por encima del nudo y 1.5 cm por debajo. El corte inferior lo
realizaremos en diagonal.
Eliminar la pielecilla que recubre ya yema y dejarla expuesta.
Esterilizar con leja o agua oxigenada rebajadas en agua de la misma manera que las
semillas. (ver esterilizacin)
Colocar las estacas clavadas en el interior de un frasco esterilizado y con medio igual que el que
usamos para la siembra. (ver medios de cultivo)
Las ventajas, respecto a plantar las estacas en sustrato ordinario, son que no hay que
preocuparse de la humedad, abonos, ventilacin ya que en el frasco tienen todo lo que
necesitan.El mayor inconveniente es que hay que cambiar las estacas de frasco cada vez que el
medio se pone oscuro debido a las exudaciones fenlicas
CULTIVO IN VITRO DE VARAS DE PHALAENOPSIS II. EXUDACIONES FENLICAS

No todas las varas sirven. Algunas, das o semanas despus de que las estacas estn en el medio,
se secan. Claro, que esto tambin pasa cuando las dejamos en la planta. A veces de las yemas
salen varas nuevas o keikis y otras veces en cambio se consumen. Seguro que hay una explicacin
cientfica, pero para mi y para muchos se debe a un fenmeno llamado capricho vegetal.
Para aumentar las posibilidades de xito hay que escoger varas que hayan perdido todas las flores
y se mantenga turgentes.
Como ya comentamos en la primera entrada de cultivo de varas, uno de los problemas ms
grandes que nos encontramos en el cultivo in vitro de varas de Phalaenopsis son las exudaciones
de compuestos fenlicos, que provienen de los cortes y se depositan en el medio haciendo que se
oscurezca.
1. Se observa claramente el oscurecimiento del medio, e la zona de contacto de las estacas con
el medio.
2. Estacas repicadas a medio nuevo.
Cuando el medio queda ennegrecido el crecimiento se ralentiza e incluso puede morir el tejido.
Podemos hacer varias cosas para minimizar estas exudaciones, algunas pasan por tratar el tejido
antes de ponerlo en el medio, otras son reactivas y buscan ir eliminndolas segn salen. Nosotros
buscamos una solucin efectiva, pero sobre todo econmica y sencilla.
Enumeraremos unas cuantas y comentaremos los pros y los contras:-Cambio de medio. Es el que
hemos escogido en nuestro intento, puede no ser el ms efectivo, pero s el de ejecucin ms
simple. Abrimos el frasco en la caja estril y cambiamos las estacas a un medio fresco y
listo.Cada cunto tiempo? Pues depender de lo rpido que salga la mancha y lo oscura que sea,
se supone que cada vez que se cambia tarda ms en degradarse el medio.
-Usar carbn activado en el medio ayuda, pero al tener la mezcla color oscuro, puede impedirnos
controlar y detectar las cantidades de sustancia excretados por la planta
-Sumergir las estacas un par de horas en agua destilada con unas gotas de agua oxigenada antes
de utilizarlas, podemos hacerlo no supone ningn inconveniente, de todas maneras hay que
esterilizarlas.
-Hay quien dice que mantener los cultivos frescos y en la oscuridad los primeros das, reduce
mucho las exudaciones, no se si ser cierto, el mayor inconveniente es que para que crezca algo
en el frasco se necesita luz y calorcito.
-Otras tcnicas hablan del tratamiento de los tejidos antes de diseccionar la planta, pero son ms
complicadas y requieren de un laboratorio no tan domstico.
3.Varias semanas despus de estar en el medio nuevo, vuelven a estar el medio ennegrecido.
FASE DE ENDURECIMIENTO DE ORQUIDEAS (Pachn, 2008)
Este material debe poseer una serie de caractersticas que son bien particulares como: muy
buena porosidad y baja densidad, que permitan retener la mayor cantidad de agua pero sin
encharcamientos; estos sustratos pueden ser de una sola fuente o mezcla de varias fuentes. Un
sustrato ideal es conformado por lombricompuesto, icopor y carbn de madera en proporciones
1:1:1 volumen; tambin puede usarse corteza de pino ptula, capacho de coco (esterilizado al
horno por 3 horas a 120 C y sumergido en agua por 24 horas); estos sustratos, cuando el
transplante es de plntulas jvenes de aproximadamente 3-7 centmetros, debe ser particulado
en un tamao entre 0,4 0,7 cm. de dimetro y depositado en recipientes plsticos o de icopor
con buen drenaje.
El primer riego se hace con bastante agua hasta humedecer completamente el sustrato y luego se
hace cada 3-4 das con agua lluvia preferiblemente. Las races deben quedar sin agar adherido y
lavadas con agua tibia, estas no soportan encharcamiento, ya que su gran porosidad permite
retener bastante agua, y un exceso causa pudricin.
Hay que tener especial cuidado de no fracturar races ni raicillas estas son delicadas ; las plantas
se deben mantener en un lugar bien aireado y protegidas de los rayos solares directos; esto se
logra con polisombra que retenga entre 30 y 40% de radiacin. En cuanto a la temperatura se
deben evitar las grandes diferencias da-noche mnimo 15C mximo 25C bajo invernadero en
sitios fros.
Se hace la fertilizacin foliar cada 15 das con productos comerciales diluidos a una cuarta parte
de su concentracin. Ej: Wuxal 2cm/L
CONCLUSIONES
Durante la germinacin, el tejido calloso se forma a partir del embrin hinchado y aparecen los
rizoides que lo diferencian en el protocormo con brotes y races bien diferenciadas.
La presencia de protenas reguladoras durante estas fases puede ser indispensable para que se d
el desarrollo.
El paso del callo a la diferenciacin del protocormo es el ms crucial en la regeneracin in vitro,
desde que se observ que la formacin del protocormo era considerablemente menor que la
callognesis, para ambos tipos de semillas, especialmente en las inmaduras.
Las semillas de cpsulas inmaduras suelen germinar ms rpido y en mayores proporciones que las
mismas semillas obtenidas de cpsulas maduras, confirmndose entonces que aparte de la
influencia de los factores externos, la callognesis y la formacin de protocormos estn tambin
influenciados por el genotipo
BIBLIOGRAFIA
Arditti, J. 1992. Orchid Biology Reviews and Perspectives II. Irvine California.
Dixon, R. A. 1987. Plant Cell Culture a practical approach. 2. Edition IRL, Press, Vol 1 and 2.
Oxford.
George, E. F., Puttock, D. J. M. y George, H. J. 1997. Plant Culture Media. Vol. I and II
Formulations and uses Edington England.
Hurtado, D. y Merino, M. E. 1997. Cultivo de tejidos vegetales. Editorial Trillas. Mxico.

Mrgara, J. 1988. Multiplicacin vegetativa y cultivo in vitro. Los meristemos y la
organognesis. Ediciones Mundi Prensa. Madrid
Murashige, T, y Skoog F. 1962. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco
tissue culture. En: Phisiologa Plantarum. 15; 473-497.
Prez Ponce, J. 1998. Propagacin y Mejora gentica de plantas por biotecnologa. Instituto de
Biotecnologa de las Plantas IBP, Santa Clara.
Pierik, R L. M. 1990. In vitro culture of higher plants. Netherlands.
Roca, W. y Mroginski. L. A. 1993. Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y

Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT. Cali.
Rosenberg, J. L. 1999. Qumica general. Teora y 611 problemas resueltos. Serie Schaum.
McGraw Hill. Mxico.
Salisbury, F. y Ross, W. 1994. Fisiologa vegetal. Grupo editorial iberoamerica. Mxico.
Snchez, J. I. 1990. Manual de cultivo de tejidos vegetales y la micropropagacin. Bogot.
Shuttleworth, F. y Zim, H. 1989. A golden guide Orchids. The american orchid society, New
York.
Taiz, L. y Zeiger, E. 1998. Plant physiology. Sinauer Associates, Inc., Publishers. Sunderland,
Massachussets.
Rodrguez L., Valles J.R., Gonzlez R., Alvarado K., Telles E., Daz A. y Snchez E. 2001.
Germinacin asimbitica in vitro de semillas de cuatro especies de orqudeas cubanas. En:
Biotecnologa vegetal Vo 1 No 2:115-116, mayo-agosto.
Len Martnez M. A. 1995. Conservacin de especies peruanas de orqudeas utilizando tcnicas
de cultivos de tejidos in vitro. Universidad Nacional Agraria La Molina. Facultad de Ciencias. Lima
Per. 85p. http://www.scribd.com/doc/22293214/Conservacion-de-Especies-Peruanas-de-
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Parques Nacionales Naturales de Colombia. Fecha de actualizacin Noviembre 2009.

http://www.parquesnacionales.gov.co/PNN/portel/libreria/php/frame_detalle.php?h_id=5274
Pachn, R. 2008. Memorias seminario taller en cultivo in vitro de orqudeas como estratgia de
conservacin. Jardn botnico Jos Celestino Mutis. Bogot, Colombia.
http://turrusta.blogspot.com/2009/05/formulas-para-hacer-el-medio-para-la.html
Judd, W. S.; C. S. Campbell, E. A. Kellogg, P. F. Stevens, M. J. Donoghue (2007), Orchidaceae

Plant Systematics: A Phylogenetic Approach, Third edition., 273-274, Sunderland, Massachusetts:
Sinauer Associates. ISBN 978-0-87893-407-2.
Simpson, Michael G. (2005), Orchidaceae Plant Systematics., 171-177, Elsevier Inc.. ISBN 0-
12-644460-9 ISBN-13 978-0-12-644460-5.
Watson, L.; Dallwitz, M. J.. Orchidaceae (en ingls). The families of flowering plants:
descriptions, illustrations, identification, and information retrieval. Version: 1st June 2007..
Consultado el 2007-11-04.
Publicado por Propagacin invitro de orquideas en 18:53 5 comentarios:

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orqudeas in vitro
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convenga:

20.00 g de azcar
Frmula del pltano

15.00 g de azcar
Frmula del Tomate
15.00 g de azcar
Frmula de la pia

15.00 g de azcar

15.00 g de azcar

20.00 g de azcar

Frmula de La Garde

20.00 g de azcar

12 g de agar-agar
20 g de azcar
Frmula ms Casera

20.00 g de azcar

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ESTERILIZACIN DE SEMILLAS DE ORQUDEA.

Hay dos mtodos sencillos para esterilizacin de las semillas de orqudea:
LEJA: Solucin de agua destilada con un 10% leja (de la de uso domstico, que suele llevar un 5% de NaOCl
aproximadamente) y 1 gota de jabn lavavajillas. Dejar entre 5 y 10 minutos dependiendo de las semillas. (Incluso
ms si son terrestres) Si son oscuras observar el color y dejarlas plidas, pero no blancas. Aclararlas 3 o 4 veces
con agua estril.
9 partes agua + 1 parte leja + 1 gota jabon ___ 5 a 10 minutos
Ventajas: Para las semillas ms resistentes a la germinacin es ms efectiva.
Desventajas: Es ms fcil pasarse y quemar las semillas.
AGUA OXIGENADA: Solucin de agua destilada con un 30% de agua oxigenada agitar fuertemente durante 15m,
no hace falta aclararlas tanto, si quedan restos de agua oxigenada hay que dejar los frascos a la luz natural para que
se descomponga.
3 partes de agua oxigenada + 7 partes de agua destilada ___15 minutos
Ventajas: No hay que tener tanto cuidado en aclarar bien y no hay riesgo de quemarlas.
Desventajas: Algunas semillas quedan esterilizadas, pero no germinan.
Cantidad de solucin suficiente para la esterilizacin. Semillas de Serapia cordigera tras ser agitadas en la frmula con leja.
- Semillas de 3 tipos diferentes de orqudea, en solucin con agua oxigenada (no es necesaria tanta cantidad de lquido) Se observa
la gran variabilidad de las semillas.
Trataremos el tema de la flotabilidad de algunas semillas y cmo evitarlo en una proxima entrada.
http://orquideoteca.blogspot.pe/2008/08/esterilizacin-de-semillas-de-orqudea.html
FRMULA PLTANO
100.0 g de pltano
10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
FRMULA TOMATE

10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina
FRMULA PIA

10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina
FRMULA ABONO

12.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
40.0 g de banana

10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina
40 g de pltano
10.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
1.2 g de Tiamina
FRMULA HAWAIANA

1.0g peptona
12.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
FRMULA KNUDSON "C"

20.0 g de azcar
10.0 g de agar agar
FRMULA BURGEFF

12.0 g de agar agar
FRMULA LA GARDE
20.0 g de azcar
12.0 g de agar-agar

14 gr de agar agar
1 gr abono 30-10-10
FRMULAS COMERCIALES
M&S
Phytamax
MgSo4 150mg
Kh2Po4 150mg
Ca3Po4 90mg
FeSo4 18mg
Tryptone 3,5-4,0g
Nitsch Vit. 108mg
MES 1g
act. charcoal 1g
Agar 5-6g
sucrose 20g
TQPL orchid media

Ms adelante trataremos la germinacin de orqudeas terrestres ms a fondo (temperaturas de germinacin,

fotoperiodos...)
CULTIVO IN VITRO DE VARAS DE PHALAENOPSIS I

Utilizaremos varas en las que se hayan marchitado las flores.
Haremos cortes con un bistur o sucedneo altamente afilado (cuidando de hacerlos en las varas y no en nuestros
dedos).
Los cortes tienen que ser limpios de manera que las estacas no queden aplastadas.
Antes de realizar cualquier corte hay que esterilizar la cuchilla. Pasarla por el fogn es una buena opcin. Mucho
cuidado si usais tambin alcohol. Jugar con alcohol y fuego es peligroso!!!
La medida es aproximadamente 1 cm por encima del nudo y 1.5 cm por debajo. El corte inferior lo realizaremos en
diagonal.
Eliminar la pielecilla que recubre ya yema y dejarla expuesta.

Esterilizar con leja o agua oxigenada rebajadas en agua de la misma manera que las
semillas. (ver esterilizacin)
Colocar las estacas clavadas en el interior de un frasco esterilizado y con medio igual que el que usamos para la
siembra. (ver medios de cultivo)
Las ventajas, respecto a plantar las estacas en sustrato ordinario, son que no hay que preocuparse de la humedad,
abonos, ventilacin ya que en el frasco tienen todo lo que necesitan.
El mayor inconveniente es que hay que cambiar las estacas de frasco cada vez que el medio se pone oscuro
debido a las exudaciones fenlicas.
PRXIMAMENTE CULTIVO DE VARAS DE PHALAENOPSIS II. EXUDACIONES FENLICAS.
http://orquideoteca.blogspot.pe/2008/12/prximamente-cultivo-in-vitro-de-varas.html
CULTIVO DE VARAS DE PHALAENOPSIS II.

EXUDACIONES FENLICAS.
Como no poda ser de otra manera, en el cultivo de varas nos encontramos muchas piedras en el camino.
No todas las varas sirven. Algunas, das o semanas despus de que las estacas estn en el medio, se secan. Claro,
que esto tambin pasa cuando las dejamos en la planta. A veces de las yemas salen varas nuevas o keikis y otras
veces en cambio se consumen. Seguro que hay una explicacin cientfica, pero para mi y para muchos se debe a un
fenmeno llamado capricho vegetal.
Para aumentar las posibilidades de xito hay que escoger varas que hayan perdido todas las flores y se mantegan
turgentes.
Como ya comentamos en la primera entrada de cultivo de varas, uno de los problemas ms grandes que nos
encontramos en el cultivo in vitro de varas de Phalaenopsis son las exudaciones de compuestos fenlicos, que
provienen de los cortes y se depositan en el medio haciendo que se oscurezca.
1. 2.
1.Se observa claramente el oscurecimiento del medio, e la zona de contacto de las estacas con el medio.
2.Estacas repicadas a medio nuevo.
Cuando el medio queda ennegrecido el crecimiento se ralentiza e incluso puede morir el tejido.
Podemos hacer varias cosas para minimizar estas exudaciones, algunas pasan por tratar el tejido antes de ponerlo
en el medio, otras son reactivas y buscan ir eliminndolas segn salen. Nosotros buscamos una solucin efectiva,
pero sobre todo econmica y sencilla.
Enumeraremos unas cuntas y comentaremos los pros y los contras:
-Cambio de medio. Es el que hemos escogido en nuestro intento, puede no ser el ms efectivo, pero s el de
ejecucin ms simple. Abrimos el frasco en la caja estril y cambiamos las estacas a un medio fresco y listo.
Cada cunto tiempo? Pues depender de lo rpido que salga la mancha y lo oscura que sea, se supone que cada
vez que se cambia tarda ms en degradarse el medio.
-Usar carbn activado en el medio ayuda, pero al tener la mezcla color oscuro, puede impedirnos controlar y detectar
las cantidades de sustancia excretados por la planta.
-Sumergir las estacas un par de horas en agua destilada con unas gotas de agua oxigenada antes de utilizarlas,
podemos hacerlo no supone ningn inconveniente, de todas maneras hay que esterilizarlas.
-Hay quien dice que mantener los cultivos frescos y en la oscuridad los primeros das, reduce mucho las
exudaciones, no se si ser cierto, el mayor inconveniente es que para que crezca algo en el frasco se necesita luz y
calorcito.
-Otras tcnicas hablan del tratamiento de los tejidos antes de diseccionar la planta, pero son ms complicadas y
requieren de un laboratorio no tan domstico.
3.
3.Varias semas despus de estar en el medio nuevo, vuelven a estar el medio ennegrecido.
Publicado por Monstera
Etiquetas: cultivo varas, in vitro, Phalaenopsis
http://orquideoteca.blogspot.pe/2009/01/cultivo-de-varas-de-phalaenopsis-ii.html
CMARA ESTRIL, FABRICACIN, USO Y OTRAS

TCNICAS.
El espacio ideal para manipular las semillas y los frascos y evitar la contaminacin es la cmara de
flujo laminar. Aunque para los aficionados al bricolaje, no es muy complicada de construir, hay
otros artilugios ms econmicos y menos elaborados, que nos pueden dar un nivel de esterilidad
alto, con muy buenos resultados.
Los ms simples son:
- Trabajar sobre el vapor generado por una olla con agua colocada sobre los fogones. El vapor de
agua proporciona un espacio estril.
Ventajas: bajo coste. Los materiales estn en cualquier cocina.
Inconvenientes: Trabajar sobre una olla caliente, puede ser incomodo. Hay riesgo de quemarse,
si no se tiene suficiente cuidado.
-Trabajar en el espacio estril que proporciona una vela o un quemador encendido,

aproximadamente un plato mediano con la vela colocada en el centro.
Ventajas: bajo coste.
Inconvenientes: el espacio estril no es muy grande.
-Caja o cmara estril, es una imitacin muy simplificada y adaptada a los materiales de que
dispongamos, de una cmara de flujo laminar. Se puede construir con una caja con tapa (o sin) y
unos guantes de plstico.
Existen muchsimas versiones, la adaptacin depende de la imaginacin y la habilidad del
constructor.
Hay quien la cierra completamente dejando exclusivamente el agujero para entrar los brazos y
quien deja el frontal abierto para poder manipular mejor los instrumentos en el interior de la caja.
Ventajas: Si est bien construida se puede controlar bien la contaminacin.
Inconvenientes: Para guardarlo es un trasto de tamao considerable, hay que comprar los
materiales.
Como ya hemos mencionado en otras ocasiones, usar guantes, mantener los utensilios limpios y
utilizar leja rebaja las posibilidades de que nuestros cultivos se contaminen.
Llegados a este punto, cada uno debe decidir que opcin le conviene ms segn se ajusta al uso
que le va a dar.
Etiquetas: in vitro
http://orquideoteca.blogspot.pe/2008/07/cmara-estril-fabricacin-uso-y-otras_23.html

FRMULA PLTANO
100.0 g de pltano
10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
FRMULA TOMATE

10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina
FRMULA PIA

10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina
FRMULA ABONO

12.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
40.0 g de banana

10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina
40 g de pltano
10.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
1.2 g de Tiamina
FRMULA HAWAIANA

1.0g peptona
12.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
FRMULA KNUDSON "C"

20.0 g de azcar
10.0 g de agar agar
FRMULA BURGEFF

12.0 g de agar agar
FRMULA LA GARDE

20.0 g de azcar
12.0 g de agar-agar

14 gr de agar agar
1 gr abono 30-10-10
FRMULAS COMERCIALES
M&S
Phytamax
MgSo4 150mg
Kh2Po4 150mg
Ca3Po4 90mg
FeSo4 18mg
Tryptone 3,5-4,0g
Nitsch Vit. 108mg
MES 1g
act. charcoal 1g
Agar 5-6g
sucrose 20g
TQPL orchid media
Ms adelante trataremos la germinacin de orqudeas terrestres ms a fondo (temperaturas de germinacin,

fotoperiodos...)
ESTERILIZACIN DE LOS FRASCOS.

Se puede hacer de varias maneras:
AUTOENCLAVE. El mtodo ms fiable, pero no est al alcance de todos.
HORNO O MICROONDAS. En horno convencional precalentado a 150-180 C y dejar 25 minutos. En

microondas slo lo podremos hacer en caso de que nuestros frascos no tengan tapa metlica.
OLLA A PRESIN. Frascos con la tapa floja y el medio colocado dentro de la olla bien cerrada. Cuando se
empiece a oir el pitido de la olla, bajar el fuego y esperar 20 minutos ms antes de apagar.
Hay que tener cuidado con los cambios bruscos de temperatura, pueden hacer que los frascos revienten. Ejemplo: la
superficie sobre la que vas a colocar los frascos est fra. Solucin coloca un pao de cocina.
No cerrar los frascos completamente durante la esterilizacin, pueden explotar.
Para manipularlos, mejor espera a que se enfren o usa guantes de los que se usan para el horno. Tener una tapa
de cerezas confitadas marcada al fuego en la palma de la mano tiene que doler mucho
Si ves que algo va a explotar corre.

Etiquetas: in vitro
http://orquideoteca.blogspot.pe/2008/08/esterilizacin-de-los-frascos.html
PREGUNTAS FRECUENTES SOBRE CULTIVO IN VITRO

- Qu puedo hacer para evitar la contaminacin?
Evidentemente, una cocina no es un laboratorio, pero eso no quiere decir que no se pueda conseguir la esterilidad
mnima requerida para hacer un cultivo casero. Para intentarlo hay que limpiar bien la superficie de trabajo y los
utensilios. Descarta lod frascos con tapas oxidadas o rayadas. Usar guantes. Usar leja (importante no hacer
mezclas raras con otros productos de limpieza, puede ser peligroso) y ropa vieja, hay quien que tiene manchas
hasta en los calcetines. En general con ser un poco cuidadoso basta.
- Agar en polvo o en tiras?

El Agar agar es un alga, no es difcil de encontrar en herboristeras, pero a veces no hay donde escoger. En polvo es
ms fcil de disolver, en tiras tendrs que usar el brazo elctrico o trocearla bien y esperar a que est bien
mezclada.
- Qu puedo hacer para que la textura del medio sea la adecuada?

Respeta las cantidades de los ingredientes de las frmulas. Usa el brazo elctrico para que no
queden grumos y recuerda ir removiendo el medio mientras lo vas repartiendo en los frascos, ya
que si no el agar se va hacia el fondo y en los ltimos frascos quedar un medio duro y en los
primeros lquido.
Es importante que esto no pase, ya que, por lo general, si el medio es muy duro, las races no
penetrn y crecern hacia arriba y si s muy lquido hay peligro de hundimiento.
- Cunto medio pongo en cada frasco?

Aproximadamente 1 o 1'5 cm bastan para la siembra de semillas.
- Pueden reventar los frascos mientras los esterilizo?

S, por eso hay que dejar las tapas un poco flojas durante el poceso de esterilizacin en la olla a
presin. Cundo esten frios y abras la olla aprietas bien las tapas antes de sacarlos. Si los
manipulas mientras estn calientes, ten cuidado, queman ms de lo que parece, a veces el medio
burbujea en el frasco.
No pongas los frascos calientes en superficies fras, si no tienes ms espacio pon un trapo entre el
tarro y la superficie.
- Me han quedado restos de medio en las paredes del frasco!

No pasa nada.
- Mis frascos tienen lquido encima del medio, pasa algo?

Un poco de lquido es normal, si es demasiado se puede quitar en el momento de poner las
semillas.
- Cuntos das tengo que esperar hasta sembrar?
Puedes sembrar en cuanto esten fros, pero habitualmente se espera unos das para descartar los
frascos que se contaminan ( si lo haces con cuidado, no tiene por que contaminarse ninguno).
Normalmente si resisten 5 o 6 das sin contaminacin, los puedes usar tranquilo, aunque no quiere
decir que no te puedas llevar una sorpresa desagradable en cualquier momento.
http://orquideoteca.blogspot.pe/2008/07/cmara-estril-fabricacin-uso-y-otras.html
CONSTRUCCIN DE ARMARIO CULTIVO INTERIOR -

FRASCOS
Al emprezar a acumular frascos por los luagres ms recnditos de la casa, se nos plantea un nuevo reto.
Dnde colocar los frascos y en qu condiciones?
Para resolverlo de una manera sencilla y bastante econmica aprovechando cualquier pequeo espacio se puede
hacer un armario de cultivo interior. El que os presento a continuacin es slo un ejemplo, pero como se puede ver
ms abajo los resultados son espectaculares.
1- Balda en armario donde se han colocado paredes de carton pluma.
Materiales:
-Porta fluorescente y fluorescente Sylvana GROLUX 18w
-Papel reflectante Mylar Diamond
-Cartn pluma
-Cinta americana para unir todo (incluso la tapa)
-Temponizador sencillo
2- Materiales colocados.
3- Con los frascos dentro y en funcionamiento.

- Luz de 07.00 a 22.00 horas
4 - Vista cerrado (nadie dira lo que hay dentro)
PRIMEROS RESULTADOS:
Estas 2 fotos corresponden a frascos con semillas de Phalaenopsis hbrida de un mes y una semana de crecimiento.
- Foto izquierda encima de la nevera.

- Foto derecha en el armario de crecimiento.
Etiquetas: in vitro
http://orquideoteca.blogspot.pe/2008/08/construccin-de-armario-cultivo-interior.html
KEIKI
Keiki es beb en hawaiano. Cuando hablamos de orqudeas nos referimos a pequeas plantas
que salen en las varas florales y caas de algunas especies. Las ms propensas son las
Phalaenopsis, los Dendrobiums y los Epidendrums, pero tampoco es infrecuente en otras como los
Oncidiums y los Gramatophylum.
Los keikis sern idnticos a la planta madre, a diferencia de la reproduccin por semillas que
puede dar variaciones.
La planta puede producirlos espontneamente. En algunas ocasiones, en plantas muy daadas o
debilitadadas, el keiki es el ltimo intento de la planta por perpetuarse antes de morir.
Tambin se pueden provocar con hormonas o de manera mecnica.
En siguientes entradas hablaremos de los keikis de las diferentes especies, como inducirlos y
cuidarlos.
Multikeiki en vara de Phalaenopsis, inducido con hormonas.

Etiquetas: keiki
http://orquideoteca.blogspot.pe/2009/02/keiki.html
KEIKIS DE PHALAENOPSIS
Ahora que ya sabemos qu son los keikis y de qu orqudeas podemos obtenerlos, vamos a
centrarnos en las Phalaenopsis.
En algunas ocasiones despus de la floracin, de las yemas que estaban latentes en los nudos,
empiezan a crecer pequeos abultamientos en los que pronto se distingue una hojita. Si tienes esa
suerte, slo debes cuidar la planta madre y tener paciencia, mucha paciencia. Es probable que en
un ao tenga un buen tamao y races. Si es as la podrs separar.
Cuando los keikis aparecen de manera espontnea en las Phalaenopsis a veces es debido a que
la planta madre est en las ltimas e intenta una maniobra desesperada por reproducirse.
Que no cunda el pnico! no slo salen por ese motivo, pero si lo fuera, le daremos nuestros
mejores cuidados (sin pasarse, ya que el exceso de cuidados y riegos es una de las principales
causas de mortalidad en las Phalaenopsis ) y esperaremos.
Normalmente los keikis empiezan a crecer con el calor, pero si por ms que miremos los nudos no
vemos nada de nada, podemos provocarlos de varias maneras:
-Destapar el nudo escogido, es decir, quitar la pielecilla y exponer la yema a la luz. En algunas
ocasiones esto puede ser suficiente para que brote, aunque a veces lo que brota es vara y no keiki.
-Si queremos estar seguros de que brotar hay que aadir hormonas a la maniobra. Para los que
no tenemos conocimientos de qumica, existen frmulas preparadas como el keikiboost y el
keikigrow. Slo hay que poner un poco (si ponemos demasiado, saldr un callo, un abultamiento
amorfo, aunque esperando lo suficiente se definira en varas y keikis) encima de la yema con un
palillo.
Ms de uno o dos keikis por planta puede ser excesivo, recordemos que la planta hace un gran
esfuerzo para generarlos y mantenerlos.
Sean naturales o provocados, los keikis hay que dejarlos crecer hasta que tienen un mnimo de
tres hojas y tres races de tres centmetros cada una. Esto se conoce entre los aficionados como la
regla del 3x3x3. Una vez alcanzado este tamao ya se puede independizar.
La manera menos peligrosa de hacerlo es cortar la vara un poco por debajo de la corona del keiki ,
sin hacer ningn corte o herida en la corona o las races.
Llegados a este punto podemos tratar la planta como adulta y ponerla en maceta o montada.
Pero qu pasa si a nuestro keiki no le salen races? Lo mejor es esperar, al final le acaban
saliendo.
Si ests desesperado y no puedes esperar puedes probar varias cosas:
(Antes de comenzar, os tengo que decir que aunque las que vienen a continuacin parezcan
tcnicas un poco sdicas, las he probado varias veces y en ningn caso se ha daado la planta.)
-Con una aguja desinfectada se pincha la parte baja del keiki y en lo sucesivo se humedece a
diario con una solucin de agua y Tahtso (abono con vitaminas que favorecen la aparicin de
races y el crecimiento)
-Con una cuchilla desinfectada se rasca la parte baja del keiki y se aplica keikiroot (otro producto a
base de hormonas que sirve para provocar races)
Recuerda que hacen falta altas dosis de un ingrediente ms: PACIENCIA.
http://orquideoteca.blogspot.pe/2009/02/keikis-de-phalaenopsis.html
KEIKIS DE DENDROBIUM
Obtener keikis de Dendrobium es relativamente fcil y rpido, desde luego, mucho ms que de
Phalaenopsis.
Hay dos maneras:
-La primera consiste en regar el Dendrobium en la poca en que tiene el crecimiento ralentizado,
que suele coincidir con el fro.
Algunos Dendrobiums necesitan que se les restringa totalemente los riegos en invierno para volver
a florecer despus, si no se hace as en vez de flores, la planta dar Keikis.
-Si queremos que nuestra planta florezca y tambin obtener keikis, deberemos seleccionar caas
viejas, que hayan perdido las flores (no importa si tambin han perdido las hojas) y las cortaremos.
Las olvidaremos recostadas en un poco de musgo hmedo (no mojado) o las meteremos en un
recipiente cerrado con arlita o musgo tambin hmedos.
Pasado un tiempo despertarn algunas yemas, de las que crecern Keikis.
Los Keikis hay que dejarlos crecer a ms grandes sean cuando los independicemos mejor. Otro
factor a tener en cuenta para decidir cuando ha legado ese momento son las races, cantidad y
calidad. A ms raices ms posibilidades de sobrebvivir.
Es mejor dejar el keiki en un trozo de caa, en vez de arrancarlo o cortarlo en su base.
A la hora de montarlo o ponerlo en maceta, basta con rodear las races con un poco de musgo y
dejar un buen drenaje en el fondo.

http://orquideoteca.blogspot.pe/2009/07/keikis-de-dendrobium.html

Cultivo in Vitro de Plantas Caserocomplt

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Cultivo in vitro de plantas casero: mis experiencias

- Flowhood: La constru siguiendo un manual en internet. Sale un poco ms cara, ya

-Kinetina (2 mg/l) ------- (Citoquinina)

Esta concentracin hormonal favorecer la proliferacin celular y el consiguiente

Si quisieramos establecer un protocolo para optimizar la micropropagacin, habra que

- Ramas de potos (Epipremnum aureum)

Esterilizacin del medio

Esterilizacin del material vegetal

Para esterilizar el material vegetal, segu las siguientes indicaciones:

-1 minuto sumergidas en alcohol 70%

ste es el apartado ms delicado, ya que si te pasas con la leja o el tiempo, los

La siembra de los explantos se realiz en condiciones de esterilidad gracias a al flujo

Fotoperodo 16/8 con un fluorescente de bajo consumo de 20W.

Ahi van los resultados:

PP significa Polipropileno, y el nmero creo que corresponde al espesor. Cualquier otra

Respecto a la cabina de flujo laminar funciona genial, y si le colocas un avance de

Re: Cultivo in vitro

Buensimo este post!!

Y ya que dices que preguntemos...aqui van varias preguntas :

Cuanto tiempo tardaron en brotar as como se ve en las fotos?

Re: Cultivo in vitro

Hola pelargonium! gracias por pasarte

Las fotos muestran la utilidad ms intuitiva, la micropropagacin por cultivo de yemas

Pronto subir alguna foto ms actualizada.

Re: Cultivo in vitro

Me hiciste dar ganas de probar... voy a ver si me animo...

Buensimo como te sali y es increible lo rpido que ocurri la organognesis. (cuanto

En el potos (Epipremnum aureum) tambin se pueden usar pecolos o fragmentos de

Re: Cultivo in vitro

Trocoton Felicidades y muchisimas gracias, estos foros son fenomenos y muy

Re: Cultivo in vitro

hace un tiempo me consiguieron algo de medio MS y alguna hormona (BAP), y aqu

Vamos a ver que hago, ya me puse a hacer algunas pruebas! jejeje

Abrazos y que siga este post!!!

Qu materiales nos hacen falta para llevar a cabo el cultivo in Vitro?.

.- El medio de cultivo: sus componentes.

A tener en cuenta que:

Obtencin de los elementos anteriores:

Cmo mezclamos todo esto?

.- Cmara de esterilidad: caractersticas bsicas.

.- Esterilizacin de materiales y medios de cultivo

A tener en cuenta que:

.- Esterilizacin de Semillas y cpsulas:

.- Esterilizacin de la cmara de esterilidad:

La cmara de esterilidad la podemos esterilizar de dos maneras:

MS INFORMACIN SOBRE EL TEMA PERO NO EN CASTELLANO:

FRMULAS CASERAS PARA SIEMBRA DE

Hyponex (fertilizante para hidroponia con macronutrientes) 3 g

PDA (Potato Dextrose Agar)

Leche de coco 20ml

FRMULAS PARA EPFITAS Y TERRESTRES

250.0 g de tomate maduro

3 cc de abono DynaGro 7-9-5 o 10-5-5

FRMULA TOMATE Y ZANAHORIA

100.0 ml de jugo de zanahoria

FRMULA TOMATE Y PLTANO

1.5g emulsin de pescado

FRMULA KNUDSON "C"

1.0 g de Nitrato de Calcio

1.0 g de Nitrato de Calcio

1.0 g de Sulfato de magnesio

FRMULA JUVENAL MEYER

500 ml agua destilada.

FRMULA PARA ORQUDEAS TERRESTRES (Ms alcalino, menos sales)