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INSTITUTODEBIOTECNOLOGA
MtodosfisicoqumicosenBiotecnologa
Trabajodeinvestigacin
CROMATOGRAFADEFASEREVERSA
Presentan
M.enC.EdgarErnestoEsquivelSoto
Q.F.B.LidiaIreneLealGuadarrama
Cromatografadefasereversa
JUNIO2004
CUERNAVACA,MORELOS
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Cromatografadefasereversa
CONTENIDO
INTRODUCCIN
TEORADELACROMATOGRAFADEFASEREVERSA
Lafaseestacionaria
Retencindemodomixto
Lafasemvil
Elucinporgradiente
Parmetroscromatogrficos
Factordecapacidad
Eficiencia
Selectividad
Resolucin
Cromatografaporsupresininica
Cromatografasecuencial
Arreglopositivonegativo
Arreglonegativopositivo
Arreglonegativonegativo
Arreglopositivopositivo
APLICACIONESDELACROMATOGRAFADEFASEREVERSA
Purificacindebiomolculas
Purificacindeprotenasypptidosnaturales
Purificacindepptidosyprotenasrecombinantes
Purificacindepptidosobtenidospordigestionesenzimticas
Purificacindepptidossintticos
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Cromatografadefasereversa
Purificacindeoligonucletidossintetizadosqumicamente
Purificacinagranescala
Desalado
Anlisiscuantitativo
Normalizacinderea
Calibracinconestndarexterno
Calibracinconestndarinterno
Adicindeestndar
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Cromatografadefasereversa
ALGUNOSASPECTOSPARAELDESARROLLODEUNANLISISDE
CROMATOGRAFADEFASEREVERSA
Naturalezaqumicadelafaseestacionaria
Tamaoyformadepartcula
Tamaodelacolumna
VelocidaddeFlujo
Temperatura
Solventes
Desnaturalizacin
Gradientedeelucin
Acondicionamientodecolumna
Preparacindelasmuestras
Limpiezadelacolumna
Almacenamientodecolumna
Resolucindeproblemas
EQUIPODEHPLC
Sistemasparaeltratamientodelosdisolventes
Sistemasdebombeo
Sistemasdeinyeccindelamuestra
Columnas
Tiposderellenodelacolumna
Termostatos
Detectores
Detectoresdeabsorbancia
Detectoresdearreglosdediodos
Detectoresdeinfrarrojo
Detectoresdendicederefraccin
Detectordedispersindeluz(ELSD)
Detectoresdeespectrometrademasas
PROVEEDORES
COMENTARIOS
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Cromatografadefasereversa
BIBLIOGRAFA
INTRODUCCIN
Losavancesenelcampodelabiotecnologahanrequeridoelusodetcnicasmseficaces
para la separacin y purificacin de biomolculas. La cromatografa de lquidos ha
resultado ser una herramienta muy poderosa y eficiente para la separacin de mezclas
complejas tanto de compuestos de bajo peso molecular como de protenas y cidos
nucleicos.
ElsistemacromatogrficodefasereversafueintroducidoporHowardyMarlinen1950.
Hasta ese momento,lacromatografa delquidos seutilizababsicamenteparaseparar
compuestospolares,siendolafaseestacionariadeuncarcteraltamentepolarylafase
mvilpocopolar.Estoscientficosrevirtieronlapolaridaddelasfasesconelobjetivode
separarcidosgrasos.Asfuecomosurgilacromatografadefasereversa;aquellaenla
que la fase estacionaria es no polar y la fase mvil es polar. Entonces, a la primera
modalidaddecromatografaseleempezaconocercomocromatografadefasenormal.
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Cromatografadefasereversa
Enelpresentetrabajosepretendedarallectorunpanoramadelateorayaplicacionesdela
cromatografaenfasereversa,ascomoalgunasconsideracionesimportantesduranteel
desarrollodeestatcnicacromatogrfica.Ydadoquelacromatografadefasereversase
aplicaenequiposdealtaresolucin(HPLC),tambinseincluyeunaseccinenlaquese
describebrevementesufuncionamiento.
TEORADELACROMATOGRAFADEFASEREVERSA
Todaslasformasdecromatografadelquidossonprocesosdemigracindiferencial,donde
loscomponentesdelamuestrasonselectivamenteretenidosporunafaseestacionariay
eludos secuencialmente mediante el cambio de polaridad de la fase mvil. En la
cromatografadefasereversa(RPC)seutilizaun empaque hidrofbico,usualmenteun
grupofuncionaloctadecilouoctiloyunafasemvilpolar.
Lafaseestacionaria
Lafaseestacionariaparacromatografadefasereversaconsisteenunamatrizporosae
insolublealaqueselehanunidoqumicamentecompuestoshidrofbicos.Lossoportes
para casi todos los rellenos se preparan con slica rgida, formada por partculas
mecnicamenteresistentes,porosasyuniformes,condimetrosde3,5o10micras.
Lasuperficiedelaslicaestconstituidaporgrupossilanol(SiOH)qumicamentereactivos
queabarcanunasuperficiecercanaalos8mol/m2.(Figura1)
Si OH
Si
O
Si CH3
Si O Si (CH2)17 CH3
CH3
CH3
Si O Si CH2 CH3
CH3
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Cromatografadefasereversa
Figura1.Grupossilanollibresygrupossilanolderivatizados.
Laslicapresentalasventajasderesistirlaaplicacindealtaspresionessincontraerse,yde
noexpandirsealcontactoconlossolventes.Perotieneladesventajadeserqumicamente
inestable;aunpHmenorde3losligandosunidosalaslicapuedenserremovidosyaun
pHmayorde7.5,laslicasesolubiliza.
Adiferenciadelaslica,lasmatricesdepoliestirenosonmuyestablesinclusoenpHsque
vandesde1hasta12,locualpermitelavaryregenerarlacolumnaconhidrxidodesodio
que es el agente ms efectivo para la remocin de protenas fuertemente unidas a la
superficiedelafaseestacionaria.Adems,elpoliestirenotieneuncarcterhidrofbicoper
se(Figura2)porloqueyanorequiereserderivatizado,evitndoseaselinconvenientede
procesos ineficientes de unin de ligandos. Sin embargo, presenta la desventaja de
expandirsealcontactoconlossolventesorgnicostpicamenteempleadosenRPC.
CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH
CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2
CH
CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH
CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH
CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH
Figura2.Estructuraqumicadelasmatricesdepoliestireno.
Elacoplamientodelosligandosalaslicageneralmenteseefectausandoreactivosdetipo
clorotrialquilsilanos.(Figura3)Enestareaccin,notodoslosgrupossilanolreaccionanya
quelascadenasalquilogeneranunimpedimentoestricoqueprevieneladerivatizacin
completadetodoslosgruposdisponibles.Elrecubrimientodelasuperficieporsililacinse
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Cromatografadefasereversa
limitaa4moles/m2.Losgrupossilanolresidualesimpartenunapolaridadindeseableala
superficie,ysonresponsablesdelefectoderetencindemodomixto.Parareducireste
efecto,losgrupossilanolresidualessehacenreaccionarconcompuestoscloroalquilsilanos
mspequeoscomoelclorotrimetilyclorotrietilsilano.Aesteprocesoseleconocecomo
endcappingobloqueo.
CH3 CH3
CH3 CH3
Figura3.Alquilacindegrupossilanol.
Porlogeneral,elgrupoalquilodelsiloxanoenestosrecubrimientosesunacadenaC8(n
octilo)ounacadenaC18(noctadecilo).(Figura4)
CH3
A) O Si CH2 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura4.Ejemplosdegrupossiloxanos.A)Grupoalquilode2carbonos
B)Grupoalquilode8carbonosC)Grupoalquilode18carbonos.
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Cromatografadefasereversa
Puede considerarse que la RPC es un proceso de particin en donde los solutos estn
distribuidosentreunafaseestacionarianopolaryunafasemvilpolar.Lossolutosno
polarestiendenaadsorberseenlafaseestacionariaysemuevenatravsdelsistemams
lentamentequelossolutospolares.
Elmecanismoquesehapropuestoparaexplicarelmecanismoporelcualestassuperficies
retienenalossolutoseselsiguiente.Cuandounsolutosedisuelveenagua,lasfuerzasde
atraccinentrelasmolculasdeaguasedistorsionanoserompen.nicamentelossolutos
altamentepolaresoinicospuedeninteraccionarconlaestructuradelagua.Lossolutosno
polarescasinointeractanconestasestructurasycomoconsecuenciaabandonanlafase
mvil para adsorberse al hidrocarburo de la fase estacionaria. La fuerza motriz de la
retencinnoeslainteraccinfavorabledelsolutoconlafaseestacionaria,sinoelefectode
repulsindeldisolventeporelsoluto.
Lafasemvil
Laretencinhidrofbicadelsolutoenlafaseestacionariapuededisminuirseaadiendoun
disolventeorgnicoalafasemvilacuosa.Aldecrementarlapolaridaddelafasemvil,la
distribucindelossolutossecambiahacialafasemvil.
Lacantidaddemuestraqueseunealafaseestacionariadependedelaconcentracindel
ligandoinmovilizado,delaspropiedadesqumicasyfsicasdelamolculaquevaaser
adsorbidaydelapolaridaddelafasemvilyestacionaria.As,conformemenospolarsea
lafasemvil,menorserlaadsorcindelamuestraalafaseestacionaria.
Respectoa lascaractersticasqumicasdelligando,esdifcilpredecirqutipodecadena
hidrocarbonadasermejorparadeterminadaaplicacin.
Enprincipio,entremenospolarsealamolculaquesevaapurificar,serequerirunafase
estacionariamshidrofbica.Sinembargo,silamuestraresultasermuyafnalamatriz,la
elucinsedificultara.Asquedebehacerseunanlisiscuidadosodelamolculadeinters
ydeterminarlanaturalezaqumicadeloscontaminantesasociados.
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Cromatografadefasereversa
Laporosidaddelaspartculasdelafaseestacionariatambinesunfactorimportanteque
influyeenlacapacidaddeunin.Losporosgrandesfacilitanlainteraccindelsolutoconel
ligando.Cuandoserequieraunacapacidaddeuninmxima,deberescogerseunamatriz
que contenga poros suficientemente grandes, capaces de alojar todas las molculas de
inters.
Retencindemodomixto
Losgrupossilanolexpuestosenlasuperficiedelamatrizpuedenprovenirdeunend
cappingineficienteodeldeteriorodelascolumnas.Lasuperficiedelamatrizseerosiona
porelusodelacolumna,loqueresultaenlaexposicindelosgrupossilanol.Eluso
prolongadodesolucionesacuosastambinpuedeacelerarelenvejecimientodelacolumna.
El uso de fases mviles de bajo pH, suprime la ionizacin de los grupos silanol, sin
embargo,nohayqueolvidarqueunpHmenorde3puedehidrolisarlosligandosdela
matriz.
Elmecanismodeseparacinencromatografadefasereversasebasaenladistribucindel
solutoentrelafasemvilylaestacionaria.Laelucinoelarrastredelsolutomediantela
fasemvil,seiniciaconuneluyentedeelevadapolaridadcomoeselcasodeunasolucin
acuosa;aestafasemvilinicialseledenominafaseA.Hayquetomarencuentaquela
polaridaddelafasemvilAdebesersuficientementebajacomoparadisolveralsolutode
carcterhidrofbicoysuficientementealtacomoparapermitirqueelsolutoseunaala
matrizhidrofbica.
Elacetonitriloyelmetanolsonlossolventesmscomunespuestoqueambostienenbaja
viscosidad yno absorbenluz UV. El isopropanol es undisolvente conalto poder de
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Cromatografadefasereversa
elucin,sinembargo,noesdelosmsempleadosdebidoasuincrementadaviscosidadque
resultaenbajatransferenciademasadelsolutoentrelasfasesyelevacindepresinanen
bajosflujos.
Paradescribircuantitativamentelapolaridaddelosdisolventes,Synderdesarrollelndice
depolaridadP.(Tabla1)Enestaescala,losvaloresdepolaridadvarande10.2paraun
compuestomuypolarcomoelaguahasta2paralosmuypocopolares.Cualquierndice
depolaridadquesedeseeentreesoslmitessepuedeconseguirmezclandodosdisolventes
adecuados.Deestemodo,lapolaridadPABdeunamezcladedisolventesAyBestdada
por:
PAB=APA+BPB
Donde son las fracciones en volumen de cada solvente y P son los parmetros de
polaridaddecadasolvente.
Tabla1.ndicedepolaridaddeSnyder.
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Cromatografadefasereversa
Elucinporgradiente
Peroparasepararmezclasdeprotenas,generalmenteserequieredeungradientedeelucin
en el quelacomposicin de la fase mvil cambia atravs del anlisis comose indic
anteriormente.
Elgradientedeelucinserecomiendageneralmentepara:
Muestrasquetengantiemposderetencinsemejantes.
Muestrasdepesomolecularmayora1000.
Muestrasdeorigenbiolgico.
An cuandosepienseutilizarunaelucinisocrtica,esrecomendablehacerunprimer
anlisisporgradienteparadeterminarelporcentajedelsolventemsadecuado.
Encuantoalostiposdegradiente,loshaylineales,curvosyescalonadososegmentados.
(Figura5)
Lineal Curvo Segmentado
%B %B %B
Figura5.Formasdelosgradientesmscomunes
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Cromatografadefasereversa
Parmetroscromatogrficos
Elcomportamientoderetencindeuncompuestoreflejaladistribucindelsolutoentrela
fasemvilylaestacionaria.Laconcentracinencadafaseestdadaporelcoeficiente
termodinmicodereparticin.CuandoK=1,elsolutoseencuentraigualmentedistribuido
entrelasdosfases.
CE
K =
CM
Factordecapacidad
Laraznderepartoorazndecapacidad,k,relacionaelequilibriodedistribucindela
muestradentrodelacolumna,esdecir,eslarelacindeltiempotranscurridoenlafase
estacionariacontraeltiempotranscurridoenlafasemvil. Matemticamentesedefine
comoelcocientedelosmolesdeunsolutoenlafaseestacionariaentrelosmolesenlafase
mvil:
CE V E
k '=
CM V M
Elfactordecapacidadpuedesercalculadoparacadapicousandolasiguienteecuacin:
t R t 0
k '=
t0
DondetReseltiempoderetencindelamuestrayt0eseltiempoderetencindeunsoluto
que no interacta con la fase estacionaria, tambin conocido como tiempo muerto. El
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Cromatografadefasereversa
tiempoderetencintranscurredesdelainyeccindelamuestrahastaqueelcompuesto
alcanzaeldetector.Elprimercomponenteeludodeberteneruntiempoderetencindel
dobledeltiempomuerto.
Dichodeotramanera,laraznderepartoeseltiempoadicionalqueunsolutorequierepara
eluir,encomparacinconunsolutonoretenido,paraelcualk=0.
Lafasemvilseleccionadadebedarvaloresdekqueestnenelrangode1a20.Valores
mayores de k generan tiempos de retencin largos que resultan en tiempo analtico
desperdiciado; y los valores menores que la unidad no proporcionan una resolucin
adecuadaentrelossolutos.
Lossolventesfuertesproveenpequeosvaloresde k,mientrasquelossolventesdbiles
danvaloresdekmsaltos.Sehavistoqueporcada2unidadesdediferenciaenelvalorde
polaridad de un mezcla de disolventes, el factor de capacidad k cambia un orden de
magnitud aproximadamente, lo que significa que la retencin del compuesto en una
columnaparticularpuedevariarsesimplementemediantelamodificacindelossolventes
delafasemvil
Eficiencia
Laeficienciadeunacolumnapuededeterminarseapartirdeunpicodelcromatograma
mediantelasiguienteecuacin:
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Cromatografadefasereversa
2
tR
N =5. 54
W 1/2
DondetReseltiempoderetencindelpicoyW1/2esanchodelpicomedidoalamitaddela
alturadelmismo.(Figura6)
tR
Altode
pico
Absorbancia
W1/2
Tiempo
Figura6.Determinacindelaeficienciadeunacolumnaenbaseaunpicodeuncromatograma.
Elnmerodeplatostericosalgunasvecesesreportadocomoplatospormetrodecolumna.
Enestaexpresin,laalturaequivalenteaunplatotericoHestdadaporlaecuacin:
L
H=
N
DondeLeslongituddecolumnayNeselnmerodeplatostericos.
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Cromatografadefasereversa
Selectividad
Laselectividadserefierealacapacidaddelmtodoparadistinguirlaspropiedadesdelos
componentesanivelmolecularyquepermitediferenciarlos.Esimportantedeterminarlas
caractersticasdelamolculaquenospermitirnsepararla,yaseapesomolecular,carcter
cidobase,polaridad,tamao,actividadbioqumica,ptica,etc.
LaselectividadfsicaeslaquepredominaenRPCporqueenestemtodoloscomponentes
sonseparadosdeacuerdoasuspolaridades.EstosignificaquelaRPCpuedeusarsepara
separargruposdecompuestosdeacuerdoasuestructuraqumica.Laspequeasdiferencias
en las estructuras moleculares de dos compuestos resultan en grandes diferencias de
adsorcinyporlotantopermitesuseparacinporRPC.
Laselectividad() esequivalentealaretencinrelativadelospicosdelamuestrayest
dadaporlasiguienteexpresin:
k '2 V2
= =
k '1 V1
Resolucin
Laresolucindeunacolumnaconstituyeunamedidacuantitativadesucapacidadpara
separardossolutos.
Losparmetrosquecontribuyenenlaresolucin(Rs)delospicossonlaselectividad(),
laeficienciaonmerodeplatostericos(N)yelfactorderetencink.(Figura7y8)
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Cromatografadefasereversa
Estosparmetrosserelacionanenunaecuacindelasiguientemanera:
1 k'
Rs= N
4 1k '
V2
V1
V2 V 2
Rs =
W 2 + W 1/ 2
W1 W2
Figura7.Determinacindelaresolucinenunpardepicosdeuncromatograma.
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Cromatografadefasereversa
B
A A B
B
95%A95%B 99%A99%B
Rs = 1 Rs= 1. 5
Figura8.Resolucindepicosendiferentescromatogramas.Enelsegundo
cromatogramahaymayorresolucinporquelospicosestnmsseparadosunodeotro.
Paramejorarlaresolucindeunacolumnasepuedenvariarcadaunodelossiguientes
parmetros:
Factordecapacidad: eselelementomsmanipulabledebidoaquedependedela
polaridaddelafasemvil.Paraunaresolucinptima, k debeestarenelintervalo
entre2y5.
Nmerodeplatostericos:losnmerosdeplatostericosseincrementanaumentando
lalongituddelacolumna.Sinembargo,unaconsecuenciaadversaesunincrementodel
tiemponecesarioparalaseparacin.La relacinentre N y Rs est definidapor el
cuadradodeN.Porejemplo,unincrementoenelnmerodeplatostericosNde100a
625aumentarlaresolucinporunfactorde2.5ynoporunode6.25.Otraformade
mejorar la resolucin consiste en reducir la altura de los platos lo cual puede
conseguirsedisminuyendoeltamaodepartculadelrellenoobajandolaviscosidaddel
disolvente.
Selectividad:implicamodificarlascaractersticasqumicasdelrellenodelacolumna.
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Cromatografadefasereversa
Cromatografaporsupresininica
Lacromatografadeparesinicosocromatografaporsupresininica esuntipode
cromatografadefasereversaqueseutilizaparalaseparacindeespeciesionizables.Se
recomiendaelusodeestetipodecromatografaespecialmenteparamolculascargadasde
granpesomolecularcomolasprotenasoloscidosnucleicos.
Enestemododecromatografa,seaadealafasemviluncompuestoinicoqueaportaun
contrainorgnicogrande;laconcentracindeestosagentesestenunrangode0.01%a
0.03%.
Elmecanismoexactodelacromatografadeparesinicosnosehaestablecidoclaramente,
sinembargo,existendosmodelosfundamentales.
Elprimeropostulaquelamolculadelsolutoformaunparinicoconelcontrainenla
fasemvilydeestamaneraaumentalahidrofobicidaddelamuestra.(Figura9)Elgrado
enelquelamuestraionizadayelcontrainformanelcomplejodeparinico,ascomola
fuerzadeunindelcomplejoconlafaseestacionaria,afectaaltiempoderetencindela
muestra.Alaumentarlaconcentracindelcontrain,aumentalaretencinhastaunlmite
quegeneralmenteestdadoporlasolubilidaddelcontrainenlafasemvil.
Luego,laelucindelosparesinicosseconsiguemedianteunafasemvilquecontenga
metanoluotrodisolventeorgnicomiscibleenagua.
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Cromatografadefasereversa
+ + + +
+
+ +
+
+
Agentes su p resores d eiones cargad os negativamente
Figura9.Supresindecargasdeprotenasydecidosnucleicos.
Elagentemsusadoparalasupresindecargasenprotenaseselcidotrifluoroacticoy
paraloscidosnucleicoseslatrietilamina.
ElmayorbeneficiodelospHsbajosusadosenlacromatografadesupresininicaesla
eliminacindelefectodemodomixtoquegeneraunincrementoeneltiempoderetencin
yunensanchamientodepicos.Peroalmismotiempo,elmtododesupresininicaest
limitado a un intervalo de pH de 3.0 a 7.5, debido a la inestabilidad de las fases
estacionariasfueradeesteintervalodepH.
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Cromatografadefasereversa
Cromatografasecuencial
Enestetipodecromatografalascolumnasseacoplandemanerasecuencial,esdecir,se
conectaunacolumnadespusdeotra.Deestamaneraloscompuestosaanalizarinteractan
demaneraindependienteconcadasoporteylosmecanismosderetencinsondiferentesen
cadacolumna.
Laconsideracinmsimportanteeneldiseodeacoplamientodecolumnasinvolucrala
compatibilidad de la fase mvil con cada columna. El eluyente debe facilitar la unin
selectivadeloscompuestosdeintersenunaoambascolumnas.
Lascolumnaspuedenacoplarsedemaneraqueloscontaminantesquedenretenidosenla
primeraoenlasegundacolumna.Estamodalidadesempleadamsfrecuentementeparala
purificacindeprotenas.Acontinuacinserevisanlostiposdeacoplamiento.
Arreglopositivonegativo
Generalmentelasprotenasestnpresentesenmuybajasconcentracionesenlasmuestras
biolgicas,asquelaestrategiams eficientees utilizarunacolumnaqueretengaala
protenaylaconcentre.
Arreglonegativopositivo
Lacolumnainicialretienealoscontaminantes,mientrasquelasegundacolumnauneala
protenadeinters.Enestearreglo,laprimeracolumna(llamadanegativaporqueno
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Cromatografadefasereversa
retienealaprotenaocomponentedeinters)generalmenteseremueve,luegoseprocedela
elucin de la protena de la segunda columna (positiva) sin que los contaminantes
interfieranpuestoquefueroneliminadosalretirarlaprimeracolumna.
Unadelasdesventajasdeestearregloesquelaprimeracolumnadebeuniralamayorade
loscompuestoscontaminantes.
Arreglonegativonegativo
Arreglopositivopositivo
Eselarregloquegeneralamayorselectividadpueslaprotenaesretenidatantoen la
primeracolumnacomoenlasegunda,asquedealgunamaneralaprotenasesometeados
pasosdepurificacin.Laprotenaseunealacolumnainicialyloscontaminantespasande
largo.Cuandolaprotenaeluyedelaprimeracolumnapasaalasegundadondeesretenida.
Enestecasoserequieredeunsegundoprocesodeelucinparaliberaralaprotena.
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Cromatografadefasereversa
APLICACIONESDELACROMATOGRAFADEFASE
REVERSA
Lacromatografadefasereversafuedesarrolladaen1950yfueideadaparalaseparacin
depequeasmolculasorgnicas. Mstarde,conlaaparicindenuevossoportesparala
faseestacionariaynuevosdetectores,seconvirtienunaherramientaindispensableparala
separacindebiomolculascomoprotenas,pptidosyoligonucletidos.
Purificacindebiomolculas
Enlaactualidad,laRPCseusademanerageneralizadaparasepararlossiguientesgrupos
debiomolculas:
Protenasypptidosdeorigennatural
Protenasypptidosrecombinantes
Pptidosobtenidospordigestinenzimtica
Pptidossintetizadosqumicamente
Oligonucletidossintticos
Purificacindeprotenasypptidosdeorigennatural
Hay varios puntos a considerar cuando se utiliza la RPC para purificar molculas
provenientesdemezclasbiolgicascomplejas.Enprimerlugar,siunaprotenaopptidose
vaautilizarenestudiosfuncionales,debemosasegurarnosquelaactividadbiolgicase
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Cromatografadefasereversa
mantienedespusdecadapasodepurificacin.Estenoesunproblemacrticocuandose
tratadepptidosoprotenaspequeas,perolasprotenasgrandestiendenadesnaturalizarse
bajolascondicionesdelaRPC.
Laeleccinadecuadadelmediodefasereversaylascondicionesdeelucin,incluyendoel
tiempodeexposicinacondicionespotencialmentedesnaturalizantes,deberoptimizarsea
findemantenerlaintegridadfuncionaldelamolcula.Adems,lapresenciadeproteasas
enlasmuestraspuededificultarlapurificacindepolipptidos,porloqueesaconsejable
trabajar conagilidaddurantelas primeras etapasdepurificacinafinde minimizar el
tiempodecontactoentrelasproteasasylamuestra.Unamaneradeevitarladegradacinde
protenasesadicionandoalasolucinamortiguadorainhibidoresespecficosdeproteasas.
Purificacindepptidosyprotenasrecombinantes
Ladificultadparaaislarpptidosoprotenasdesusfuentesnaturales,sepuedesuperara
travs de la produccin de stas con tcnicas recombinantes. Los polipptidos
intracelularessonmsdifcilesdepurificar,yaqueesnecesariolisarlasclulasparasu
obtencin. En cambio, las protenas o pptidos secretados al medio son relativamente
fcilesdepurificaryengeneral,nosonsusceptiblesalasproteasasintracelulares.
Lapurificacindepptidosrecombinantesdelmedioextracelularpuededificultarseporlos
volmenes tangrandes que seobtienenporlo queserequieredeunpasoinicial para
concentrar la muestra. Este inconveniente se puede resolver si se une al pptido una
secuenciaterminalespecficacomoprotenaA,glutatintrasferasa,opoliaminocidos,lo
que permitir una purificacin cromatogrfica por afinidad. Una vez concentrado y
purificadoelpptidoser necesarioremoverelasa atravs demtodos enzimticos o
qumicos.LapurificacindepptidosrecombinantespuedemonitorearsemedianteRPC,
anlisis de amino cidos, mapeo de eptopes, bioensayos o electroforesis en gel de
poliacrilamida.
Purificacindepptidosobtenidospordigestionesenzimticas
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Cromatografadefasereversa
La digestindeunaprotenaconproteasas,usualmentetripsina,generaunamezcla de
pptidosquepuedenserseparadosporRPCparaobtenerunmapapeptdicodelaprotena.
Incluso puede asignarse la posicin de los puentes de disulfuro al comparar los
cromatogramasdeunadigestinendondelospuentesdedisulfuropermanezcanintactosy
los cromatogramas de otra digestin en donde los puentes de disulfuro hayan sido
reducidosconmercaptoetanol.
Purificacindepptidossintticos
Lospptidosconmenosde20aminocidos,engeneral,sepuedenobtenerconunalto
gradodepureza usandosolamenteRPC.Parapurificarmicrogramosdemuestrapodra
utilizarseunempaqueconpartculasde5 m,perosiserequierencantidadesmayores
sernecesarioutilizarunamatrizde15a30m.
Purificacindeoligonucletidossintetizadosqumicamente
Lasntesisdefaseslidaautomatizadaesunprocedimientocomnmenteutilizadopara
generaroligonucletidosde20a30paresdebasesdelargo.
Losprincipalescontaminantessonsecuenciastruncadasjuntoconpequeascantidadesde
oligonucletidosquedifierenenlasecuencia.Laseparacinentrelassecuenciascompletas
delasincompletassepuedesimplificarsilapurificacinsellevaacabousandogrupos
protectores 5 tritilo que poseen tres anillos de benceno; de esta manera slo los
oligonucletidoscompletostendrnlahidrofobicidadsuficienteparapermaneceranclados
alafaseestacionaria.
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Cromatografadefasereversa
Purificacinagranescala
Hayesencialmentetresetapasenlapurificacindeunabiomolculaapartirdeextractoso
muestrasnaturales:lacaptura,purificacinintermediayelpulido.
Lafaseintermediadepurificacinseenfocaensepararalamolculablancodelamayora
de las impurezas como protenas, pptidos, cidos nucleicos, endotoxinas y virus. La
capacidad de resolver componentes similares es de suma importancia en esta etapa de
purificacindadoqueloscontaminantespresentescompartencaractersticasfuncionalesy
estructuralesconlamolculablanco.
Elpulidoeselltimopasoparalaobtencindeunproductopuro,esteprocedimientose
utiliza para remover el resto de los contaminantes e impurezas, de tal manera que el
productofinalpuedaserobtenidopuroparasuposterioruso.Loscontaminantesenesta
etapasonamenudomuysimilaresalamolculablanco.Losmscomunesincluyena
variantesestructuralesyconformacionalesdelapropiamolcula.
Desalado
Ladesalacinesunprocedimientoderutinaenellaboratorioyconsisteenlaseparacinde
contaminantesdebajopesomoleculardelasbiomolculasdemayorpesomolecular.Aeste
procedimientoenocasionestambinseledenominacambiodebuffer.Lastcnicasno
cromatogrficasparadesalarincluyenalaultrafiltracinyaladilisis.
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Cromatografadefasereversa
Una vez que se ha procesado toda la muestra, el soluto se eluye usando volmenes
pequeosdefasemvildebajapolaridad,tpicamenteacetonitrilo.Sielsolventeutilizado
es voltil, ste puede ser removido por evaporacin y la muestra residual podr ser
resuspendidaenelvolumendeseadodeotrosolventeosolucin.
Anlisiscuantitativo
Losinstrumentoscromatogrficosestnequipadosconintegradoreselectrnicosdigitales,
loscualespermitenunaprecisaestimacindelasreasdepico.
Haycuatrotcnicasprincipalesparalacuantificacin:normalizacinderea,calibracin
conestndarexterno,estndarinternoylaadicindeestndar.
Normalizacinderea
Elreadelospicossereportacomounporcentajedereatotal.(Figura10)statcnicaes
muy empleada para estimar las cantidades relativas de impurezas en una muestra; la
desventajaesqueasumequetodosloscomponentestienenelmismonivelabsorcinala
longituddeondaquesemonitorea.
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Cromatografadefasereversa
93%
2.8%
2.2%
0.8% 1.2%
Tiempo
Figura10.Ejemplodenormalizacinderea.
Calibracinconestndarexterno
Implicaprepararsolucionesdelestndarconunaconcentracinconocida.Seinyectael
mismovolumendecadasolucinyseconstruyeunacurvadecalibracinenfuncindela
concentracinylasreasdepico.Laconcentracindelosestndaresdebeserparecidaala
concentracinqueseesperaparalasmuestras.Lasmuestrasdeconcentracindesconocida
sepreparan,inyectanyanalizandelamismamanera.Laconcentracindelasmuestrasse
obtieneapartirdelacurvadecalibracin.
Consisteenlaadicindeuncompuestodiferentealanalitoacadaunadelasolucionesque
sevanaanalizar.Seanalizansolucionesdemuestradediferentesconcentracionesalasque
sehaaadidolamismacantidaddeestndarinterno.
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Cromatografadefasereversa
Requerimientosparaunestndarinterno:
Tenerbuenaresolucin(Rs>1.25)
Factordecapacidadsimilaralcompuestoproblema
Elcompuestoqueseutilicecomoestndarinternonodebeestarpresenteen la
muestraoriginal
Quetengaaltogradodepureza
Adicindeestndar
Estemtodoseusaparaanlisisdetrazas.Diferentescantidadesdelanalitoquesedesea
medirseadicionanalasolucinproblema,lacualcontieneunaconcentracindesconocida
deanalito.Alacuantificacintotalselerestaelvalordelacantidadadicionada;deesta
manerasepuedecalcularlaconcentracindesconocida.
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Cromatografadefasereversa
Enlasiguienteseccinsetratarnalgunasconsideracionesquehayquetomarencuentaen
laaplicacindelacromatografadefasereversaparalaseparacindebiomolculascomo
eslaseleccindecolumna,lafasemvil,lascondicionesdeelucin,preparacindelas
muestras,manejodelascolumnas,ascomolaresolucindeproblemasmscomunes.
Naturalezaqumicadelafaseestacionaria
Paralaseparacindeprotenasgrandeshayunapreferenciaausarslicasconligandosn
butiloynoctilosobrelosalquilosnoctadeciloyaquelasbiomolculasnosoncapacesde
intercalarseenlascapasnalquilolargascomolohacenlasmolculaspequeas;adems,
nosegeneraunaadsorcintanfuertedelasprotenasenlascadenasalquilopequeasypor
consiguienteserequieremenorcantidaddesolventesorgnicosparalaelucin,locual
disminuyeelriesgodedesnaturalizacindelaprotena.
Tamaoyformadepartcula
Laaccesibilidaddelamuestraalamatrizdependeengranmedidadeltamaodeporo.Los
empaquescontamaosdeporomenoresde300armstrongsseusanparalaseparacinde
pptidos y oligonucletidos. Generalmente se recomiendan tamaos de poro de 300
armstrongs o mayores para la separacin de protenas porque como se mencion
anteriormente,losporosgrandesgeneranmejorresolucinparabiomolculasmslargas.
Eltamaodelapartculatambindifiereentreunaseparacinanalticayunapreparativa.
Lasseparacionesanalticassedesarrollanencolumnasconpartculasde3a5micras,las
preparativas conpartculas de10a30micrasylas separaciones agranescalautilizan
partculasde40a50micras.Elinconvenienteesqueamayortamaodepartcula,la
columnasevuelvemsfrgilyportantosereducesutiempodevida.
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Cromatografadefasereversa
Respectoalaformadelaspartculas,lascolumnasconempaquedepartculasirregulares
son menos caras que las partculas esfricas y son ms comnmente empleadas en
aplicacionesdegranescala.
Tamaodelacolumna
Laresolucindebiomolculasdealtopesomolecularenlasseparacionesdefasereversa,
es menos sensible al largo de la columna que la resolucin de molculas orgnicas
pequeas,detalmaneraqueloscidosnucleicos,protenasypptidoslargospuedenser
purificadoseficientementeencolumnascortas.Elincrementarellargodelascolumnasen
generalnoincrementalaresolucinsignificativamenteyspodradaaralasprotenas
porque la prdida deactividad biolgica es proporcional al tiempo deresidencia de la
protenaenlacolumna.
Porotraparte,lasseparacionesanalticasgeneralmenteusancolumnasde100a250mmde
largo x 4 mm de dimetro; y las separaciones preparativas requieren columnas con
dimetrosmsanchos,porejempo,de9mmaproximadamente.
VelocidaddeFlujo
Lavelocidaddeflujoesunfactorimportanteparalaresolucindemolculaspequeas,ya
que la tendencia de las molculas a difundirse disminuye al incrementar el flujo,
produciendopicosmsangostosyporlotanto,mejoralaresolucin.Lasprotenastienen
menordifusibilidadquelasmolculaspequeas,porloqueseobtieneunabuenaeficiencia
anconflujosbajos.
Temperatura
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Cromatografadefasereversa
oligonucletidos.Dadoqueeltransportedemasasensolucinentrelafasemvilylafase
estacionariaesunprocesocontroladopordifusin,incrementarlatemperaturadisminuyela
viscosidaddelsolventeyestogeneralmentefavorecelatransferenciademasasyporlo
tanto, mejora la resolucin. En cambio, cuando las protenas se desnaturalizan por un
incrementodelatemperatura, laestructuradestassedesdoblaytienemssitios de
interaccinconlafaseestacionaria,porlotantoseincrementaeltiempoderetencin.
Solventes
Todoslossolventes,solucionesamortiguadoras,sales,ascomoelaguausadaparapreparar
la fase mvil, deben serde altapureza qumica, libre de iones metlicos as como de
partculassuspendidas. LapurezaqumicaesimportanteenRPCpreparativapuestoque
cualquiercontaminanteenlafasemvilpuedeproducirpicosindeseables,ycontaminarla
biomolculapurificada.
Los solventes usados para preparar la fase mvil o la fase mvil ya preparada deben
desgasificarseenunbaodeultrasonidopor10a15minutosparaprevenirlaformacinde
gasqueafectaralaestabilidaddelacolumna.Tambinpuedendesgasificarseutilizando
vacoyburbujeandohelio.
Desnaturalizacin
Lasinteraccionesdelasprotenasconlossolventesorgnicos,engeneral,conduceacierta
prdidadelaestructuraterciariaquepuedegenerarvariosestadosconformacionalesycada
estado a su vez puede interactuar de manera diferente con la fase estacionaria. El
desdoblamientopuedeexponerlosresiduoshidrofbicosdelaprotenaconelconsecuente
incrementodelaretencin,loquepuedegenerarinsuficienterecuperacindelaprotena.
Loscomplejosenzimticosyprotenasdecomponentesmltiplessonmslbilesaperder
actividadquelospptidospequeos.Ahorabien,elprocesodedesnaturalizacinpresenta
unacinticalentaypuedereducirseesteprocesodisminuyendoeltiempoquelaprotena
permanece en la columna. En caso de que ocurriera cierta desnaturalizacin, la
conformacinpodraregenerarsealreincorporarlaprotenaasuscondicionesnativas.En
casodequeunaprotenaopptidofuerapurificadaconelfindedeterminarsuestructura
primaria,ladesnaturalizacinnoseraunproblema.
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Cromatografadefasereversa
Gradientedeelucin
Laretencindelasprotenasdisminuyeexponencialmentealadicionaralafasemvilun
modificadororgnico.Estecomportamientodelasprotenasobligaalusodeelucionescon
gradienteparalaseparacindemezclasproteicas.
Cuandosepretendesepararporprimeravezloscomponentesdeunamezclacompleja,se
usaungradientegruesoparaunaseparacininicial,queservirparaajustarlaformadel
gradiente hasta llegar al punto ptimo. Esto usualmente implica la disminucin de la
pendientedelgradienteenellugardondeeluyenloscomponentesdeseadosydelaumento
delapendienteantesydespusdeesepunto.
La eleccin de la pendiente del gradiente depender de que tan prximos eluyan los
componentescontaminantesdelamolculablanco.Porlogeneral,cuandodisminuimosla
pendiente del gradiente incrementamos la resolucin, pero tambin aumentamos los
tiemposderetencin.
LosgradientesenRPCsiempreprovienendeunacondicindealtapolaridad(fasemvilA
altamenteacuosa)aunadebajapolaridad(fasemvilBconaltocontenidodesolvente
orgnico). Los gradientes o pendientes de gradiente se reportan usualmente como el
incrementoenelporcentajedelafasemvil Bporunidaddetiempo(%B/min) opor
unidaddevolumen(%B/ml).
Ungradientetpicovade0%Ba100%Ben10a30volmenesdecolumna.Conunflujo
de1ml/minparaunacolumnade1ml,correspondeungradientede3a10%B/min.
Acondicionamientodecolumna
Elacondicionamientodecolumnadeberealizarsesiemprequeseuseunacolumnapor
primeravez,despusdeunalmacenamientoprolongado,ycadavezquesedeseecambiarla
fasemvilparaunanlisis.
El acondicionamiento se lleva a cabo usando la misma fase mvil que la del anlisis
cromatogrfico.Elprocedimientogeneralparaelacondicionamientodelascolumnasesel
siguiente:
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Cromatografadefasereversa
2. Correr2a3volmenesdecolumnadeungradientelinealde100%faseBa100%
faseA.Nodebecambiarsedemaneraabruptalafasemvilporqueexisteelriesgo
dequelacolumnasedae.
3. EquilibrarconfaseAhastaquetodaslassealesdemonitoreoseanestables.
Cadavezquesecambielafasemvil,esimportantecorrerunblancoparacorroborarla
ausenciadeimpurezasyanalizarlaestabilidaddelsistema.
DespusdehaberequilibradolacolumnaconlafasemvilA,elsegundopasoesaplicarla
muestra a la columna. Enseguida se procede a eluir con la misma fase mvil A. La
molculadeintersdeberunirsealamatrizylossolutosindeseadossernarrastradospor
lafasemvil.
Preparacindelasmuestras
La muestra debe disolverse en la fase mvil que se emplear para hacer el anlisis
cromatogrfico. Si la muestra no es completamente soluble en la fase mvil, puede
adicionarsecidofrmico,acticooalgunasal;esteprocedimientomejoralasolubilidady
noafectalaseparacin,siempreycuandoestosagentesseencuentrenenbajoporcentaje.
Todaslasmuestrasdebencentrifugarsea10,000rpmpor10minutosantesdelainyeccin
ofiltrarseatravsdeunamembranade0.22micrasparaeliminarpartculas.
NoserecomiendaalmacenarlasfasesmvilesacuosasdepHneutropormsde3das
porqueexisteelriesgodecrecimientomicrobianoyademslamuestrapodraoxidarse.
Limpiezadelacolumna
Serecomiendalimpiarlacolumnaperidicamente,especialmentecuandosedetecteuna
elevacinenlapresinoprdidaderesolucin.Hayqueconsiderarquelaprdidade
resolucindebidoalensanchamientodelospicospuededebersealapresenciadegrupos
silanolenlasuperficiedelaslicaoinclusoaladisolucindelamatrizdebidoaluso
frecuentedefasesmvilesconpHporarribade7.
Unprocedimientocomndelimpiezaes:
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Cromatografadefasereversa
Paracolumnasdepoliestireno,unprocedimientoefectivodelimpiezaesequilibrarcon
variosvolmenesdecolumnaempleandohidrxidodesodio0.5M.Elhidrxidodesodio
esunagentedelimpiezamuyefectivo.
Almacenamientodelacolumna
Lascolumnasdefasereversahechasabasedeslicanodebenalmacenarseensoluciones
acuosasdebidoalainestabilidaddelaslicaencondicionesacuosas.Lascolumnasdeben
almacenarseensolventesorgnicoscomometanollibredeTFA.
Resolucindeproblemas
Acontinuacinsepresentanalgunassolucionesparalosproblemasmscomunesdurante
eldesarrollodeunanlisisporcromatografadefasereversa.
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Cromatografadefasereversa
Precipitacindeprotenasenla Reemplaceelfiltrodelafase
columna. mvil,laprecolumna,y/ola
columna.
Enamboscasoslimpiey
regenerelacolumna.
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Cromatografadefasereversa
Laconcentracindelamuestra Limpieyregenerelacolumna.
esdemasiadoalta. Disminuyaelvolumendecarga
delamuestra.
Solucin
Causa
Sntoma DisminuyaelpHparasuprimir
Haygrupossilanollibresenla laionizacindelosgrupossilanol
Laresolucinesmenor superficiedelafaseestacionaria. ocambiedecolumna.
aloesperado. Disminuyaelflujodeelucin.
Lavelocidaddelflujoesmuy
alta.
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Cromatografadefasereversa
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Cromatografadefasereversa
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Cromatografadefasereversa
EQUIPODEHPLC
LatcnicadefasereversaeseltipodecromatografamsampliamenteutilizadaenHPLC
quesonlassiglasdelinglsHighPerformanceLiquidChromatography.Lacromatografa
delquidosdealtaresolucinutilizapresioneselevadasparahacerpasarunflujodefase
mvilatravsdeunacolumnaempacadaconpartculasmicromtricas.Sinlaaplicacinde
presinseraprcticamenteimposiblequeeleluyentepasaraatravsdelacolumna.
Dadaslascaractersticasdeunacolumnadecromatografadefasereversa,serequerirde
unequipodeHPLCpararealizarlaseparacin.Asqueesrelevantecomentardeforma
generalcmoestconformadoesteequipo.
UnequipodeHPLCbsicamentedebecontarconunsistemadebombeoqueimpulseel
flujodelafasemvilatravsdelacolumna,unacolumnaquesepareloscomponentesde
lamuestra,undetectorquemidaalgunacaractersticadedichoscomponentesconformevan
saliendodelacolumnayunprocesadorqueconviertalasealelectrnicadeldetectorenun
cromatograma.
Lafigura11muestraunesquemadeuncromatgrafodelquidosdealtaresolucintpico;
enseguidaseexplicarbrevementecadaunodeloscomponentes.
Fuent e de helio
regulada
Vlvulad e s alid a
A m o r t ig uad o r d e puls ac io ne s
Vlvulad e d r e naj e
Bomba
Vlvulad e e nt r ad a
Filt r o
Al det ect or Re g ulad o r d e
Transduct or de
c o nt r apr e s i n
presin
Co lum na
Vlvulad e iny e c c i n
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Cromatografadefasereversa
Figura11.Diagramaquemuestralaspartesmsimportantesqueintegranuncromatgrafodelquidosde
altaresolucin.
Sistemasparaeltratamientodelosdisolventes
Los recipientes que contienen los solventes amenudo se equipan con un sistema para
eliminarlosgasesdisueltos,comooxgenoynitrgeno,queinterfierenformandoburbujas
enlossistemasdedeteccin.
Undesgasificadorpuedeconsistirenunsistemadebombeoporvaco,dispositivospara
calentaryagitarlosdisolventesosistemasdedifusinquepermitenarrastrarlosgases
disueltosfueradelasolucinmediantefinasburbujasdeungasinertedebajasolubilidad.
Para poderhacerelucionesporgradiente,losequiposdeHPLCmodernoscuentancon
recipientes conectados a una mezcladora, lo que permite variar la relacin de los
disolventesenformaprogramadaymodificarlosvaloresdemaneralinealoexponencial.
Sistemasdebombeo
LasbombasutilizadasenelHPLCsonmuypotentesyprecisas.Elflujodebeserlibrede
pulsacionesyconuncaudalquepuedavariarentre0.1y10ml/min,lapresinpuedeser
hasta de 6000psi (lbs/in2) y todos los componentes deben ser resistentes a la corrosin.
Existentrestiposdebombas:bombasrecprocas,bombasdejeringaybombasdepresin
constanteoneumtica.
Labombasrecprocassonlasmsusadas,el90 % delosequiposdeHPLCmodernos
cuentanconestesistemadebombeo.Eldisolventeesexpulsadodeunacmaraporel
movimientodevaivndeunpistnaccionadoporunmotor.Lasbombasrecprocastienen
ladesventajadequeproducenunflujoconpulsacionesquesemanifiestacomoruidoenla
lneabasedelcromatograma.Entrelasventajasdeestasbombassepuedencitarsupequeo
volumeninterno(35a400l),susaltaspresionesdesalida(porencimadelas10,000psi),
su fcil adaptacin a la elucin con gradiente y sus caudales constantes que son
prcticamente independientes dela contrapresindelacolumna yde laviscosidad del
disolvente.Comounapartemsdelsistemadebombeoesta elrestrictor colocadoala
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Cromatografadefasereversa
salidadelabomba.Cualquierdiferenciaentrelasealyunvalorpreestablecido,seutiliza
paraaumentarodisminuirlavelocidaddelmotordelabomba.
Sistemasdeinyeccindelamuestra
Amenudo,elfactorlimitanteenlaprecisindelasmedidasencromatografadelquidos
porHPLC,eslareproducibilidadconquesepuedeintroducirlamuestraenlacolumna.El
problemaseagravaporelensanchamientodebandaqueacompaaalasobrecargadelas
columnas.Porello,losvolmenesqueseempleanhandesermuypequeos,de20 l
hasta500l.Adems,sehadepoderintroducirlamuestrasindespresurizarelsistema.
Elmtodomsampliamenteutilizadoparalaintroduccindelamuestrautilizadispositivos
enformadebucle,quepuedenintroducirlamuestraapresionesdehasta7000psiconuna
precisinaceptable.
Columnas
Comoseexplicenlaprimerapartedeestetrabajo,laseparacindeloscomponentesdela
muestraseproduceenlacolumna.
LamayoradelascolumnasparaHPLCseconstruyencontubosdeaceroinoxidablede
dimetrointernouniforme.Estaclasedetubosmidenentre10y30cm.Eldimetrointerno
delascolumnasesamenudode4a10mmylostamaosdelaspartculasdelosrellenos
mscomunesson3,5y10m.
Para aumentar la vida de la columna analtica se coloca delante una precolumna que
eliminalamateriaensuspensinyloscontaminantesdelosdisolventes.Lacomposicin
delrellenodelaprecolumnadebesersemejantealdelacolumnaanaltica;sinembargo,
eltamaodelapartculaesporlocomnmayorparaminimizarlacadadepresin.
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Cromatografadefasereversa
Tiposderellenodelacolumna
Elrellenopuedeserdedostiposdepartculasporosasopediculares.Elltimoconsisteen
bolasdevidrioodepolmero,noporosasyesfricasconunosdimetroscaractersticosde
30a40 m.Enlasuperficiedeestasbolassedepositaunacapadelgadadeslice.El
rellenopedicularseutilizaampliamenteenprecolumnasynoparacolumnasanalticas.
LosrellenosdepartculasporosasparaHPLCestnformadospormicropartculasporosas
con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible para un tamao
determinado. La slice es el material ms comnmente empleado para este tipo de
columnas,debidoaquesepuedenproducirpartculascondimetrosmuyuniformes.
Termostatos
Enmuchasaplicacionesnosenecesitauncontrolestrictodelatemperaturaylascolumnas
trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, si se controla la temperatura de las
columnasseobtienenmejorescromatogramas.Lamayoradelosaparatosllevahornosque
controlan la temperatura en las columnas. Otra forma de controlar con precisin la
temperaturaescolocandolascolumnasencamisasconaguaqueprovengadeunbaode
temperaturaconstante.
Detectores
LosdetectoresencromatografadelquidoscomoHPLCsondedostiposbsicos.Los
detectoresbasadosenunapropiedaddelafasemvilquerespondenacambiosenelndice
derefraccin,laconstantedielctricaoladensidad,lascualessemodificanporlapresencia
delosanalitos.Porcontraste,losdetectoresbasadosenunapropiedaddelsolutoresponden
aalgunadelaspropiedadesdelamuestracomoeslaabsorcinenUV,fluorescencia,
actividadptica,etc.Algunosdeestosdetectoressedescribenacontinuacin.
Detectoresdeabsorbancia
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Cromatografadefasereversa
Sonlosdetectoresmsempleadosyaquetantolasprotenascomoloscidosnucleicos
absorbenluzdeestaregin.Laslongitudesdeondatpicamentemonitoreadasson:
210220 nm: corresponde a la absorcin de la unin peptdica. Se usa
principalmenteparamonitorearpptidosquecarecendeaminocidosaromticos.
228nmparaHis
240nmparaCys
254nmparaPhe
250260nmparamediroligonucletidos
280nmparaTrpyTyr
Losdetectoresdeabsorbanciaultravioletamssimplessonlosfotmetrosdefiltroscon
unalmparademercuriocomofuente.Ladesventajaquepresentanestosaparatosesqueel
efluentenosepuedemonitorearavariaslongitudesdeondaalmismotiempo.
Afindereducirelensanchamientodebanda,elvolumendeunacubetadeflujo(enforma
deZ)paramedirabsorbanciahadeserlomenorposible.Laslongitudesdelacubetavan
de2a10mm(Figura12)demodoquelosvolmenesselimitanporlocomnde1a10
l.Ademslapresinnodebesermayordeunos600psi.puesexisteelriesgoderomperla
cubetadeldetector.
De la columna
Vent anas de
cuarzo
Al desecho
Figura12.Esquemadelacubetadeundetectordeabsorbancia.
Detectoresdearreglosdediodos
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Cromatografadefasereversa
Estetipodeinstrumentospermitenhacerbarridosadistintaslongitudesdeondadecada
uno de los componentes separados. De esta manera, se generan una coleccin de
cromatogramasadiferenteslongitudesdeondadecadapico.
Mediantelosarreglosdediodossepuededeterminarlamejorlongituddeondaalaque
debemonitorearseelcompuestodeinters.
Detectoresdefluorescencia
LosdetectoresdefluorescenciaparaHPLCsonsemejantesendiseoalosfluormetrosy
espectrofluormetros.Lafluorescenciasedetectapormediodeundetectorfotoelctrico
colocadoperpendicularmenterespectoalhazdeexcitacin.Unaventajadelosdetectores
deflorescenciaessualtasensibilidad,unastresrdenesdemagnitudmayoralaobtenida
pormtodosdeabsorbancia.
Detectoresdeinfrarrojo
Detectoresdendicederefraccin
Estosdetectorestienenladesventajadenosertansensiblescomolamayoradelosotros
detectores, por ejemplo, son dos a tres veces menos sensible que un detector de
absorbancia. Adems son muy inestables a los cambios de temperatura por lo que se
requiereunestrictocontroldesta.
Detectordedispersindeluz(ELSD)
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Cromatografadefasereversa
atemperaturacontroladadondetienelugarlaevaporacindelafasemvil,loqueorigina
unasfinaspartculasdelcompuestoproblema.Lanubedepartculasdeanalitopasaatravs
deunhazdelserymedianteunfotodiododesiliciosedetectalaradiacindispersada
perpendicularmentealflujo.
Unadelasmayoresventajasdeestetipodedetectoresquepuedeemplearsepara casi
todoslossolutosnovoltilesyesmssensiblequeeldetectordendicederefraccin.
Detectoresdeespectrometrademasas
Laespectrometrademasaseselmtododedeteccinmsrecienteycadavezsegeneraliza
mssuuso.
Lamuestraalsalirdelacolumnaesionizada.Luegolosionesseseparandeacuerdoasu
relacincarga/masa.
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Cromatografadefasereversa
PROVEEDORES
Acontinuacinsepresentanlosnombresydireccioneselectrnicasdelosproveedoresms
importantesdecolumnasyequiposcromatogrficos.
Compaa Pginadeinternet
ABI http://www.appliedbiosystems.com/
Alltech http://www.alltechweb.com/
Beckman http://www.beckman.com/
BioRad http://www.biorad.com/
Merck http://chrombook.merck.de/chrombook/index.jsp?j=1
J&WScientific http://www.chem.agilent.com/cag/cabu/jandw.htm
J.T.Baker http://www.jtbaker.com/chromatography/
PerkinElmer http://las.perkinelmer.com/
VWR http://www.chromatography.co.uk/products/Default.htm
Waters http://www.waters.com/
Whatman http://www.whatman.com/
Otraspginasdeinternetdeinters
http://www.rpi.edu/dept/chemeng/BiotechEnviron/IONEX/be_index.htm
http://www.separationsnow.com/basehtml/SepH/1,1353,30000home00,00.html
http://ntri.tamuk.edu/fplc/rev.html
http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/rphplc.htm
http://www.nestgrp.com/protocols/vydac/rpcbuffernote.shtml
http://www.biocompare.com/jump/2105/ReversePhaseChromatography.html
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Cromatografadefasereversa
COMENTARIOS
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