Aplicacion Del Dioxido de Carbono PDF

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PEDRO RUIZ SALA
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
Dpto. de NUTRICION Y BROMATOLOGA II
APLICACION DEL DIOXIDO DE CARBONO
SUPERCRITICO AL PROCESADO DE
ALIMENTOS: NATA, SUBPRODUCTOS DEL
REFINADO DE ACEITES VEGETALES Y ZUMO
DE NARANJA
PEDRO RUIZ SALA

Madrid, 1996
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas
INSTITUTO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES
~ ,k c/. Juan de la Cierva, 3-28006 Madrid. Espaa
CSiflj Tel (34-1>562 2900- Telefax (34-1)5644853
GUILLERMO SANTA-MARA BLANCO, Dr. EN CIENCIAS QUMICAS,

INVESTIGADOR CIENTFICO DEL INSTITUTO DE FERMENTACIONES
INDUSTRIALES DEL C.S.I.C.
CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado Aplicacin el dixido de carbono

supercrtico al procesado de alimentos: nata, subproductos del refinado de aceites
vegetales y zumo de naranja, y que constituye la memoria que presenta D. Pedro Ruiz
Sala para optar al grado de Doctor en Farmacia, ha sido realizado en los laboratorios del
Departamento de Tecnologas Sectoriales bajo mi direccin.
Y para que as conste firmo el presente certificado en Madrid a diecisiete de octubre de

mil novecientos noventa y seis.
Guillermo Santa-Maria Blanco

Este trabajo ha sido realizado en el instituto de Fernentaciones industriales del Consejo Superior de
investigaciones Cientficas, bajo la direccin del Dr Guillermo Santa-Mara Blanco, investigador
Cientfico del CSJC, a quien agradezco su esfuerzo y espritu crtico en la realizacin de esta Tesis.
Tambin me gustara expresar mi agradecimiento:
A la Dra. Afaria Teresa Orzez Villanueva. del Departamento de Nutricin y Bromatologa JI de la

Facultad de Farmacia, por haber aceptado ser ponente de esta Tesis.
A la Dra. Carmen Polo Snchez, Directora del instituto de Fermentaciones industriale.~ donde se ha
realizado el presente trabajo experimental, por lasfacilidades con que he contado para el mismo.
/11 Aiinisterio de Educacin y Ciencia, por la concesin de una beca de Formacin del Personal
lnvestigado; lo que posibilit llevar a cabo esta Tesis DoctoraL
11 Dr. Agustn Ola,w Villn, Profesor de investigacin del cSJC, por su asesoramiento en jodo momento.
A las doctoras isabel Martnez Castro, M0 Carmen Gmez-Cordovs de la Vega y U0 Luisa Jimeno I-ferranz
por su asesoramiento durante algunasfases de este trabajo.
Al Dr. lviurat Balaban por aceptarme durante mi estancia en la Universidad de Florida. A Conan, tambin
a Diego, Pedro, AJercedes, Bridget y todas las personas que hicieron tan agradable el tiempo pasado en
Gainesville.
A Julin Pastot PO). haber sido tanta su imprescindible ayuda. A Ivaribel Jimnez, por su ayuda
desinteresada y por haberme presentado a sus padres
A mis compaeros A!ayte, Mag Al0 Carmen, Nieves, Elena, Toi, AIarta, Pepa, Mara, Ninj, Daniel, LoII,
Amado y a lodos los dems <le instituto de Fermentaciones industriales que me han dejado con un
imborrable bmen recuerdo.
Ai.y especialmente a Conchi y a Cristina, que siempre y en todo mo,nento han estado y estarn conmigo. A
Ricardo, Raquel, Jon, Juani, Susana, David, Lourdes, Esther y a todas las personas que inc han hecho
pasa buenos momentos durantes estos cuatro aos. A Alaria y a Federico, por ser tan encantadores y por
esas tardes inolvidables de los sbados frente al piano. A Carlos, estupendo compaero durante la
interminable SS. A Jacinto, que est conmigo en este ltimo ao de mi Tesis. A misfamiliares de Madrid,
por su apoyo, sobre todo en mis comienzos. A mifamilia, que me ha visto tan poco estos aos.
NDICE
ABREVIATURAS
Nomenclatura de los cidos grasos
Otros trminos
CAPTULO 1. INTRODUCCIN. EXTRACCIN CON FLUIDOS

SUPERCRTICOS 1
1,1. FLUIDOS SUPERCRITICOS 2

1. 1. 1. Definicin de fluido supercrtico 2
1.1.2. Propiedades de los fluidos supercrticos 4
1. 1.3. Principios de la extraccin supercrtica 7
1.2. APLICACIN A LOS ALIMENTOS DEL DIXIDO DE CARBONO

SUPERCRITICO 13
1.2. 1. Aplicacin de la extraccin con dixido de carbono supercrtico 13
1.2.1.1. Grasas vegetales y animales 14
1.2.1.2. Procesado de ctricos 16
1.2.2. Aplicacin de la extraccin a nivel industrial 17
1.2.2.1. Descafeinizacin del caf 17
1,2.2.2. Extraccin del lpulo 18
1.2.2.3. Extraccin de especias 18
1,2.3. Aplicaciones no convencionales del dixido de carbono supercrtico al
procesado de ctricos 19
1.2.4. Otras aplicaciones del dixido de carbono supercritico 20
21
OBJETIVOS
PLAN DE TRABAJO 22
CAPTULO 2. APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE

CARBONO SUPERCRTICO A LA MODIFICACIN DE GRASA LCTEA EN
2.1, INTRODUCCIN 24
2.1.1. Lpidos 24
2.l.1.l.cidosgrasos 24
2.1.1.1.1. cidos grasos saturados 25
2.1.1.1.2. cidos grasos monoinsaturados 25
2.1.1.1.3. cidos grasos poliinsaturados 26
2.1.1.1.4. cidos grasos ramificados 26
2.1.1.1.5. cidos grasos con otros grupos funcionales 27
2.1.1.2. Lpidos simples 27
2.1.1.2.1. Triglicridos y compuestos relacionados 27
2,1.1.2.2. Esteres de esteroles 28
2.1.1.2,3. Otros lpidos simples 29
2.1.1.3. Lpidos complejos 29
2.1. 1.3.1. Glicerofosfolpidos 29
2.1.1.3.2. Gliceroglicolpidos 30
2,1.1.3.3. Esfingolpidos 31
2.1.1.4. Composicin de la fraccin insaponificable 32
2,1.1.4.1. Monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos 33
2,1.1.4.2. Triterpenos 33
2.1.1.4.3. Carotenoides 34
2.1.1.4.4. Esteroides 34
2.1.2. Composicin de la leche 35
2.1.2.1. Composicin de la grasa lctea 36
2.1.3. Composicin de las leches de vaca, oveja y cabra 41
2.1.4. La grasa lctea y los trastornos cardiovasculares 43
2.1.4.1, Valor nutritivo de la leche 43
2.1.4.2, La grasa lctea y los trastornos cardiovasculares 44
2.1.5. Las posibilidades del uso de la grasa lctea modificada 46
2.1.5.1. Adicin de otras grasas 47
2.1.5.2. Fraccionamiento 48
2.1.5.3. Hidrogenacin 49
2.1.5.4. Interesterificacin 49
2.1.5.5. Biomodificacin 49
2.1,5.6. Aplicacin de la grasa lctea modificada SO
2.1.6. Tecnologas para la obtencin de productos bajos en colesterol 51
2.1.6.1. Mtodos microbiolgicos 51
2.1.6.2. Adsorcion 51
2. 1.6.3. Manipulacin de la alimentacin animal 52
2.1.7. Anlisis de los cidos grasos de los alimentos por cromatografla de gases 52
2.1.7.1. Preparacin de la muestra 53
2.1.7.2. Sistema cromatogrfico 55
2.1.8. Anlisis de los triglicridos por cromatografia lquida de alta eficacia 57
2.1.8.2, Anlisis cuali-cuantitativo 59
2.1.9. Espectroscopia de resonancia magntica nuclear de 3C de alta resolucin en
lpidos 62
2.1.9. i. Estudio de la grasa lctea 63
2.1.9.2. Estudio de aceites vegetales 65
2.1.9.3. Estudio de aceites de pescado 66
ESTIMACIN DE LA COMPOSICIN EN TRIGLICRIDOS DE LA GRASA LCTEA 67
2.2. MATERIALES Y MTODOS 67

2.2.1. Preparacin de la muestra 67
2.2.2. Anlisis de los triglicridos de grasa lctea por cromatografia lquida de alta
eficacia 68
2.2.3. Recogida de fracciones 69
2.2.4. Anlisis de los cidos grasos de triglicridos de fracciones de HPLC por
cromatografia de gases 69
2.2.4.1. Preparacin de la muestra 69
2.2.4.3. Anlisis cualitativo 71
2.2.4.4. Anlisis por cromatografia de gases acoplada a espectrometra de
masas (GC/MS) 72
2.2.4.5. Anlisis cuantitativo 73
2.2.5. Desarrollo de modelos matemticos 74
2.2.6. Estimacin de la composicin en triglicridos de la grasa lctea de leche de
oveja 78
2.2.7. Comparacin de la composicin en triglicridos de la grasa de leche de
oveja, cabra y vaca 79
2.3. RESULTADOS Y DISCUSIN 80

2.3.1. Anlisis de los cidos grasos de triglicridos de fracciones de HPLC por
cromatografia de gases 80
2.3.1.1. Anlisis cualitativo 80
2.3.1.2. Anlisis por GC/MS 80
2.3.1.3. Anlisis cuantitativo 86
2.3.2. Anlisis cualitativo de los triglicridos de la grasa de leche de oveja 87
2.3.2.1. Aplicacin de los modelos matemticos 87
2.3,2.2. Estimacin de la composicin en triglicridos de grasa lctea ovina
97
2.3.3. Comparacin de la composicin en triglicridos de la grasa de leche de
oveja, cabra y vaca 116
APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE CARBONO SIJPERCRTIcO A LA

MODIFICACIN DE GRASA LCTEA EN NATA 122

2.4.2. Descripcin del equipo de extaccin 122
2.4.3. Optimizacin del flujo de CO2 supercrtico 124
2.4.4. Optimizacin del volumen de CO2 supercrftico 125
2.4.5. Determinacin de la grasa de la nata 125
2.4.6. Medida de la humedad de la nata 125
2.4.7. Anlisis de colesterol por cromatografia lquida de alta eficacia 126
2.4.7.1. Obtencin de la fraccin insaponificable de la nata 126
2.4.7.2. Anlisis de colesterol por HPLC 127
2.4.8. Anlisis de triglicridos por cromatografia lquida de alta eficacia 127
2.4.9. Efecto de la presin y la temperatura en la extraccin de grasa de nata sin y
con adicin de bolas de vidrio 127

2.5.1. Optmizacin del flujo de CO2 supercrtico 128
2.5.2. Optmizacin del volumen de CO2 supercrtico 130
2.5.3. Efecto en la extraccin de grasa 130
2.5.4. Efecto sobre la humedad de la nata 135
2.5.5. Efecto sobre la extraccin de colesterol 137
2,5.6. Efecto sobre la extraccin de triglicridos 142
2.5.7. Selectividad del CO2 supercritico en la extraccin de colesterol 147
ANLISIS POR ESPECTROMETRIA DE 3C-RMN 149

2.6.1, Preparacin de la muestra y extraccin de la grasa de la nata 149
2.6.2. Anlisis de los extractos mediante espectrometra de resonancia magntica
nuclear de SC 149

2.7.1. Anlisis de los extractos mediante espectrometra de resonancia magntica
nuclear de 3C 150
CAPITULO 3. APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE

CARBONO SUPERCRTICO A LA MODIFICACIN DEL DESTILADO DE LA
DESODORIZACION DE ACEITES VEGETALES 163
3.1. INTRODUCCIN 164

3.1.1. Los aceites vegetales 164
3.1.2. El aceite de oliva 164
3.1.3. Aceites de semillas oleaginosas 165
3. .4. Desodorizacin del aceite de oliva 166
ANLISIS DE LOS COMPUESTOS DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE DEL DESTILADO

DE LA DESODORIZACIN DE ACEITES VEGETALES MEDIANTE CROMATOGRAFA
LQUIDA DE ALTA EFICACIA 168

3.2.2. Descripcin del equipo 169
3.2.3. Anlisis cualitativo 170
3.2.3.1. Eleccin de la columna 170
3.2.3,2. Eleccin de la fase mvil 171
3.2,3.3. Eleccin del gradiente 171
3.2.3.4. Eleccin de la temperatura de la columna 172
3.2.3.5. Anlisis estadstico 172
3.2,4. Anlisis cuantitativo 173
3.2.4.1. Estudio del detector. Anlisis estadstico 173
3.2.4.2. Linealidad de la respuesta 177
3.2.4.3. Clculo del factor de respuesta 177
3.2.4.4. Precisin del mtodo 178

3.3.1. Anlisis cualitativo 178
3.3.1.1. Anlisis estadstico en la eleccin de la columna y la fase mvil
178
3.3.1.2. Eleccin del gradiente 192
3.3.1.3. Eleccin de la temperatura de la columna 199
3.3.2. Anlisis cuantitativo 199
3.3.2.1. Anlisis estadstico en el estudio de la respuesta del detector.., 199
3.3.2.2. Linealidad de la respuesta 205
3.3.2.3. Factor de respuesta 212
3.3.2.4. Precisin del mtodo 212
ANLISIS POR ESPECTROMETRA DE 3C-RMN 214

APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE CARBONO SUPERCRTICO AL
DESTILADO DE LA DESODORIZACIN DE ACEITES VEGETALES 225
3.6.1. Descripcin del equipo extractor 225

3.6.2. Optimizacin en la preparacin de la muestra 225
3.6.3. Efecto de la presin y la temperatura en la extraccin del desfilado de la
desodorizacin de aceites vegetales 227

3.6.4. Modificacin del equipo de extraccin 228
3.7, RESULTADOS Y DISCUSIN 229

3.7.1. Optimizacin en la preparacin de la muestra 229
3,7.2. Modificacin del equipo extractor 229
3.7.3. Efecto de la presin y la temperatura en la extraccin de los compuestos de
la fraccin insaponificable del destilado de la desodorizacin de aceites
vegetales 237
CAPTULO 4. APLICACIN DEL DIXIDO DE CARBONO SUPERCRTICO A

LA INACTIVACIN DE PECTINESTERASA EN ZUMO DE NARANJA 247
4.1. INTRODUCCIN. LOS CTRICOS 248

4.1.1. Composicin de los ctricos 248
4,1.2. Sustancias pcticas 251
4.1.2.1. Estructura y composicin 252
4.1.2.2. Ocurrencia y propiedades 253
4.1.3. Enzimas pcticos 255
4.1.4. Pectinesterasas en ctricos 257
4.1.4.1. Isoenzimas 258
4.1.4.2. Estabilidad de los isoenzimas 259
4.1.4.3. Estabilidad de la turbidezy actividad pectinestersica 260
4.2.2. Efecto sobre el zumo de naranja del tratamiento con dixido de carbono en
condiciones supercrticas 261
4.2.3. Determinacin de la actividad pectinestersica 263
4.2.4. Medida de la turbidez 263
4.2.5. Medida del color 264
4.2.6. Efecto del almacenamiento sobre la turbidez y el color 266

4.3.1. Efecto del tratamiento con dixido de carbono supercrtico sobre la
inactivacin de la pectinesterasa de zumo de naranja 266
modificacin de la turbidez del zumo de naranja 268
modificacin del color del zumo de naranja 270
4.3.4. Modificacin de la turbidez y et color del zumo de naranja durante el
almacenamiento 278
CONCLUSIONES 281
BIBLIOGRAFA 283
ANEXOS 300
ABREVIATURAS
NOMENCLATURA DE
LOS CIDOS GRASOS
al = ante/so
alMa anleiso-margrico al- 17:0
aPd = anteiso-pentadecanoico al- 15:0
br = ramificado
Bu = Butrico 4:0
Ca Cprico 10:0
CI = Caprlico 8:0
Co = Caproico 6:0
= so
Ma = so-margrico -17:0
L = Linoleico 9c, 12c- 18:2
La = Lurico 12:0
Ln = Linolnico 9c, 12c, 15c-18:3
M = Mirstico 14:0
Ma Magaiico 17:0
Mi = Muistoleico 9c-14:l
O = Oleico 9c-l8: 1
P = Palmtico 16:0
Pa = Pairnitoleico 9c-16: 1
Pd = Pentadecanoico 15:0
5 = Esterico 18:0
V = irans-vaccnico 11t18:1
OTROS TRMINOS
3C-RMN = Resonancia magntica nuclear del 3C

DDG = Destilado de la desodorizacin de aceite de girasol
DDO = Destilado de la desodorizacin de aceite de oliva
FAME = ster metilico de los cidos grasos
FC = Fuerzas de cizallamiento
GC = Cromatografia de gases
HPLC = Cromatografa lquida de alta eficacia
MUFA = cido graso monoinsaturado
MS = Espectrometra de masas
NC = Nmero de carbonos
ND = Nmero de dobles enlaces
NEC = Nmero equivalente de carbonos
NP = Nmero de particin
PUFA = cidos grasos poliinsaturado
SC = Tratamiento con CO
2 supercrtico
TCN = Nmero terico de carbonos
TG = Triglicrido
TIC = Corriente total de iones
UFA = cidos graso insaturado
Captulo 1.
Introduccin.
Extraccin confluidos supercr(ticos
Captulo 1. introduccIn, Extraccitin confluidos superoriticos.
1.1- FLUIDOS SUPERCRTICOS
1.1.1- Definicin de fluido supercrtico
Se puede definir fluido supercrtico como aquel que est sometido a condiciones de
presin y temperatura por encima del punto crtico, siendo ste el punto designado por
una temperatura crtica (Te) y una presin crtica (P0), por encina del cual no puede haber
una liquefaccin al elevar la presin o vaporizacin al aumentar la temperatura. La figura

1.1. 1 respresenta un diagrama de fases donde se destaca la existencia de la regin
supercrtica sobre el punto crtico.
El punto critico es caracterstico de cada sustancia. La tabla 1. 1.1 recoge la temperatura y

presin crticas de varios de los solventes ms utilizados. La densidad en el punto crtico
se denomina densidad crtica (Pc).
Tabla 1.1.1. Condiciones crticas de varios solventes
Compuesto CCIF3 CO2 SE6 C51112 1120

0C) 28,8 31,1 45,5 196 347,2
T~ (
K (MPa) 21,48 7,20 3,80 3,29 21,48
Pc (gImL) 0,58 0,47 - 0,23 0,32
Las propiedades de los fluidos supercrticos son expresadas frecuentemente en trminos

reducidos ms que en absolutos. Un valor reducido se define como el cociente entre el
valor absoluto considerado y el valor correspondiente al punto crtico. Por tanto, si la
presin y temperatura reducidas (Pr y T~) son superiores a la unidad, la sustancia en
cuestin se haya sometida a condiciones supercrticas.
2
Captulo i. introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
o
0
\QX
PC
Pc s
GAS
Temperatura
Figura 1.1,1. Diagrama de fases slido-lquido-gas-tluido superertico. PT =

punto triple, PC = >unto crtico, Pc = presin crtica, Tc = temperatura
crtica.
3
A ..~J~S.
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercritlco&
1.1.2- Propiedades de losfluidos supereriticos
La figura 1.1 .2a resume las propiedades bsicas y de mayor utilidad de los fluidos
supercrticos. Los fluidos supercrticos poseen unas propiedades fsico-qumicas
intermedias entre las de los lquidos y los gases (tabla 1.1.2).
Tabla 1.1.2. Propiedades fisico-quimicas de los gases y los lquidos en

comparacin con las del dixido de carbono supercritico.
Densidad Viscosidad Coeficiente de Difusin

(g/mL) (g/cms) (cm2/s)
Gases (0,1-2) i03 (1-3) io4 0,1-0,4
CO 4
2 superertico T0, P0 0,47 3 x io~ 7 x 0
TQ,6P 3 2>< l&
0 1,0 1x10
Lquidos 0,6-1,6 (0,2-3) i02 (0,2-2) io-~
La densidad del fluido supercrtico es de 100 a 1000 veces mayor que la de un gas, y
comparable a la de un liquido. En consecuencia, las interacciones moleculares pueden ser
fuertes permitiendo acortar las distancias intennoleculares (Knowles y col., 1988). Como
resultado, las propiedades de solvatacin son similares a las de los lquidos, pero con
viscosidades significativamente ms bajas y coeficientes de difusin ms altos.
Al ser de 10 a 100 veces ms bajos los valores de viscosidad y de lO a 100 veces ms

altos los coeficientes de difusin respecto a los de los lquidos hacen que la transferencia
de masa de solutos en extracciones con fluidos supercriticos sea significativamente ms
alta que la de extracciones con lquidos (Schneider, 1978).
ii-lay que resaltar que la variacin de la densidad no es lineal respecto a la variacin de

temperaturas y presiones sobre el punto crtico. La figura 1. 1 .2b describe un diagrama de
fases con las variables reducidas. En puntos cercanos al crtico pequeas variaciones de la
4
Captulo 1. introduccin. Exlraccicin confluidos supercriticas.
poder solvente
variable
densidad buenas caractersticas

variable dinmicas
41
ty4
c compresibilidad
) c baja viscosidad
)
alt a muy baja

difusividad tensin superficial
propiedades de
tr an sp o rte penetrabilidad
Figura 1.1.2a. Caractersticas principales de los fluidos supercrticos.
5
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
presin a temperatura constante proporcionan grandes variaciones de la densidad. A

presiones distantes de la crtica el aumento de la densidad no es tan acusado.
1.1.3- Principios de la atraccin supercrftica
La extraccin con fluidos supercrticos es una tcnica que estudia las propiedades
solvatantes de un fluido por encima de su punto critico.
La habilidad de un fluido supercrtico para la solubilizacin de slidos fue ya sealada

por Hannay y Hogarth en 1879 al solubilizar sales metlicas en etanol en condiones
supercrticas. Sin embargo, hasta los aos cincuenta no aparecen estudios sobre
aplicaciones industriales, concretamente para eliminar las fracciones ligeras del residuo
de la destilacin del crudo, A partir de los 70, La aplicacin de los fluidos supercriticos a
la industria agroalimentaria es uno de los ms importantes centros de atencin por parte
de las investigaciones.
En comparacin con otros tipos de extraccin, las principales ventajas de la que utiliza
fluidos supercrticos son:
1. menores tiempos de extraccin,
2. uso, generalmente, de un fluido no txico, no inflamable o no colTosvo.
3. extraccin a temperaturas sin afectacin de compuestos termolbiles,
4, fcil separacin de los solutos del fluido supercritico. Esto no es posible en las
extracciones convencionales en muchos casos, lo que crea contaminaciones
indeseables del producto,
7
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
5. alta pureza del solvente,
6. posibilidad de realizar fraccionamientos,
7. posibilidad de seleccionar el tipo de extaccin eligiendo la polaridad del fluido,

su densidad y la utilizacin o no de modificadores,
8. bajo coste del solvente.
Las ventajas de la extraccin con fluidos supercrticos provienen de las propiedades antes
comentadas y de la compresibilidad. Segn McHugh y Krukonis (1986) los grandes
cambios de densidad del fluido y, en consecuencia, el poder de solvatacin, pueden ser
realizados mediante pequeos cambios en la presin a temperatura constante al haber una
gran compresibilidad si se trabaja a temperaturas prximas a la crtica.
Al depender la fuerza solvatante de un fluido supercrtico de su densidad, la posibilidad

de solvatacin de un finido supercrtico hacia una sustancia en particular puede ser
modificada fcilmente cambiando la presin de extraccin y, en menor medida, la
temperatura. Esto hace que la extraccin con fluidos supercrticos sea selectiva.
Adems, con la propiedad de que la transferencia de masa est mejorada, el uso de la

extraccin con fluidos supercrticos proporciona tiempos de extraccin ms breves y una
eficiencia de extraccin mejorada por una mejor penetracin en la matriz (Wright y col.,
1987).
Schneider (1978) descubri que el poder solvente de un fluido supercrtico no poda ser
explicado exclusivamente desde el aumento de densidad. El poder solvente de estos
fluidos depende de dos efectos:
8
- .1 .~ ~~~~trt ~.. .u~qy qrw ~ ~w,
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
- efecto de estado, que depende el estado fisico del fluido supercrtico y su

principal variable es la densidad,
- efecto qumico, que define la intexTelacin entre el fluido supercrtico y el soluto.

Es diferente para cada soluto y depende de su polaridad, propiedades cido-bsicas
y de la fomacin de puentes de hidrgeno.
En general, un incremento de la presin a temperatura constante produce un incremento

en la solubilidad del compuesto pero disminuye la selectividad (Zadow, 1988). El efecto
de la temperatura sobre la solubilidad es ms complejo, ya que sta puede aumentar,
disninuir o permanecer invariable con el aumento de temperatura a presin constante.
Este comportamiento viene dado por un factor predominante, que puede ser la presin de
vapor del soluto o la densidad del solvente. A bajas presiones, la solubilidad disminuye
levemente con el aumento de temperatura; a altas presiones, aumenta marcadamente. El
primer efecto se debe a la disminucin de la densidad, el segundo se debe a que hay un
importante aumento de la presin de vapor del soluto frente a la pequea variacin de la
densidad del solvente en esta zona de altas presiones. Con una densidad detenninada, la
solubilidad aumenta con la temperatura (Luque de Castro y col., 1994).
La estructura qumica del soluto tambin es un factor a tener en cuenta a la hora de

mejorar su selectividad, De modo esquemtico se pueden citar los siguientes grupos
funcionales de los solutos y su efecto beneficioso o adverso sobre su solubilidad en CO2
supercrtico:
aumentan la so/itbu/dad:
- msaturaciones,
- ramificaciones,
- esterificaciones,
- eterificaciones,
9
Capltulo 1. Introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
disminuyen la solubilidad:
- el aumento del peso molecular,
- aromaticidad,
- hidroxilos,
- carboxilos,
- halgenos,
- amnas,
- nitroderivados.
Se puede concluir que la eleccin de un fluido supercrtico depende de:
a.- la polaridad del soluto,
b. poder solvente y selectividad requeridos,

-
c.- estabilidad trmica del compuesto a extraer a la temperatura de operacin,
d.- limitaciones instrumentales, que se asocian a la presin crtica de algunos

fluidos,
e.- toxicidad del fluido superciltico.
Nonnalmente, el fluido supercrtico es utilizado a una temperatura poco mayor a su

temperatura crtica y a una presin significativamente mayor a su presin crtica
(Brignole y col., 1987).
Se ha estudiado una gran variedad de fluidos supercrticos para la extraccin que cubre
un amplio rango de temperatura y presin crticas, pesos moleculares y polaridad (Hoyer,
10
>. ~.r
Caplulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
1985). El dxido de carbono es el ms usado por tener una presin crtica moderada (7,2
MPa) y baja temperatura crtica (3 1 0C), siendo de eleccin para la extraccin de
compuestos termolbiles. Sin embargo, el CO
2 tambin tiene sus limitaciones, sobre todo
para la extraccin de compuestos polares. La tabla 1.1.3 lista una serie de fluidos
supercrticos usuales con sus ventajas e inconvenientes, El agua no es usada por las
dificultades tcnicas que supone trabajar a presiones por encima de su punto crtico.
Actualmente, un tema de gran inters es la correlacin y prediccin de equilibrios de

fases a alta presin. Ya se han descrito un gran nmero de diagramas de fases para
mezclas binarias (fluido supercrtico y compuesto slido o lquido) (Schneider, 1978),
aunque la prediccin de los equilibrios no est todava satisfactoriamente resuelta. Y, por
supuesto, mucho ms complejos son aquellos sistemas para mezclas ternarias. Aunque de
la misma forma que para los equilibrios lquido-lquido y lquido-slido, para los sistemas
ternarios o ms complejos se comprueba que los fluidos supercrticos son disolventes
especficos que permiten realizar una extraccin selectiva o un fraccionamiento.
Sin embargo, en 1982, Chrastil desarroll una ecuacin para predecir, en un sistema
binario, la solubilidad de un compuesto en un fluido supercrtico. Esta correlacin
emprica es a la vez de simple, relativamente fiable. Chrastil compar, asimismo, los
datos con los obtenidos experimentalmente en su laboratorio y con datos de la
bibliografia en una amplia variedad de compuestos y en un gran rango de presiones y
temperaturas, resultando haber acuerdo entre los resultados. La ecuacin es la que se
expone a continuacin:
C = pke<~~~ (1,1)
donde C = concentracin de un soluto en el fluido supercrtico (gIL),

p = densidad del fluido (g/L),
k = constante,
11
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12
Captulo 1. Introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
a = AH/R, siendo AH el calor de reaccin total y R la constante de los gases,

b = Ifl(Ma + kMh) + q-kln<Mb), siendo M~ y Mb los pesos moleculares del soluto y
del gas y q otra constante.
Otros autores han utilizado la ecuacin de estado de Peng-Robinson para predecir

equilibrios de fases de sistemas binarios con resultados satisfactorios (Sigmund y
Trebble, 1992).
1.2- APLICACIN A LOS ALIMENTOS DEL DIXIDO DE CARBONO

SUPERCR[TICO
.2.1- Aplicacin de la extraccin con CO2 supercrrtico
A continuacin se detallan los procedimientos de extraccin supercrtica aplicada en el

campo de los alimentos. Algunos investigadores realizan experiencias utilizando patrones
de compuestos o mezclas de stos, sin embargo, Nilsson y Hudson (1993) resaltan que
los datos obtenidos de esta manera poseen un bajo valor predictivo para un posterior
estudio con mezclas complejas, siendo entonces muy necesario realizar las experiencias
con muestras reales desde un principio.
Exlraccin comp/cia
Requiere condiciones de presin y temperatura mximas. La temperatura mxima de
operacin generalmente depender de las propiedades fisicoqumicas del sustrato a
extraer, mientras la presin mxima de operacin vendr limitada por el diseo del
equipo extractor,
13
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrltlcos~
Fraccionarnlenlo
Se lleva a cabo mediante una serie de pasos bajo diferentes condiciones de presin y
temperatura.
Desodorizacln
Las condiciones para la desodorizacin son menos fuertes que las utilizadas para la
extraccin completa o el fiaccionamiento ya que el objetivo es la extraccin de aquellos
compuestos ms solubles.
Muchos ejemplos de este tipo de aplicacin estn incrementndose en el campo de los

productos naturales, especialmente en el de la industria alimentaria. Aqu, el CO2 tiene
ms ventajas sobre otros solventes gaseosos o lquidos por las causas citadas
anteriormente.
El CO2 supercritico es preferible al lquido ya que las sustancias a ser extradas son
mucho ms solubles, la relacin de extraccin seria de 2,5 veces ms alta dada la mayor
difusividad en las condiciones supercrticas, y hay un mayor rango de posibles
temperaturas para operar.
1.2.1.1 Grasas vegetales y animales

-
El rea ms investigada a nivel de planta piloto y escala semipreparativa es la extraccin

de aceites de origen vegetal (Hubert y Vitzthum, 1978; Stahl y col., 1980; Bulley y col.,
1984; Christianson y col., 1984; List y col., 1984; Taniguch y col., 1985; Dakovic- y col.,
1989; Polak y col., 1989).
Friedrich y List (1982) y Zhao y col. (1987) pusieron de manifiesto que el aceite obtenido
con CO2 supercrtico a partir de la soja y del salvado de arroz tema una serie de ventajas
en relacin al obtenido con un solvente orgnico como el hexano. As, observaron que el
14
Capitulo 1, introduccin. Extraccin confluidos supercrlticos.
contenido en hierro y fsforo era ms bajo, fundamentalmente debido a la baja

solubilidad de los fosfolpidos en el CO2 supercrtico frente a los triglicridos. Por otra
parte, el aceite era menos coloreado, lo que conleva la no necesidad de refinamiento.
Esto tambin era debido a la baja solubilidad de los carotenos y otros pigmentos. Otros
estudios se encaminan a la purificacin de lpidos polares, como el de Weidner y col.
(1993), que consiguen optimizar las condiciones en un sistema continuo en
contracorriente para el desengrasado de soja, de esta fonna obtienen un extracto oleoso
que no contiene lecitina, mientras que el residuo del aceite original est compuesto
prcticamente por ste fosfolipido. Compuestos antioxidantes, como los tocoferoles
tambin son objeto de estudio para la extraccin con fluidos supercrticos (Lee y col,,
1991, a partir de aceites de semillas) y pigmentos, como los caroteniodes a partir de
zanahorias (Barth y col., 1995; Vega y col., 1995). Estos ltimos realizaron extracciones
utilizando etanol como modificador para facilitar la extraccin de los carotenos, partiendo
de subproductos de industrias productoras de zumo de zanahoria.
En los ltimos aos, el desarrollo de nuevas tecnologas para intentar extraer el colesterol
de la grasa se justifica dado el papel que ste desempea en la aparicin de trastornos
cardiovasculares. Estos estudios se han realizado principalmente en huevo (Froning y
col., 1990; Hung y Unger, 1995), estudiando tambin la afectacin de las proteinas
(Amtfield y col., 1992) y grasa lctea, pero tambin en otros alimentos, como en poio
(Froning y col., 1994). Otros estudios se han encaminado hacia la obtencin de grasa
modificada de origen lcteo o marino para conseguir extractos y fracciones de diferente
composicin y caractersticas fisicas (Kaufmann y col., 1982; Shishikura y col., 1986;
Yamaguchi y col,, 1986; Hardardottir y Kinsella, 1988). Algunos de los trabajos estudian
la obtencin de grasa lctea modificada a partir grasa anhidra realizando diferentes tipos
de fraccionamiento, obteniendo resultados bastante similaies, en los que las fracciones
obtenidas a bajas densidades estaban enriquecidas en triglicridos de cadena corta y,
amenudo, media, mientras que las fracciones obtenidas a altas densidades eran ricas en
triglicridos de cadena larga por estar agotado el resto de triglicridos en el residuo. La
extraccin de colesterol alcanza su mximo rendimiento en las primeras fracciones (Arul
15
CapItulo 1. Introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
y col., 1987 y 1988; Bradley, 1989; Kankare y col., 1989; Haminam y col., 1991; Chen y
col., 1992a).
La obtencin de extractos ricos en cidos grasos poliinsaturados esenciales es otros de los

objetivos de los investigadores. Muchos de los trabajos realizados en este campo estudian
la extraccin selectiva de cidos docosahexanoico y eicosapentanoico a partir de aceites
de pescado (Byeung, 1993; Jungro, 1993; Mishiay col., 1993; Temelli y col., 1995).
Otros nuevos estudios sobre la utilidad de la extraccin con fluidos supercrticos se

encamina hacia el aprovechamientos de subproductos que sean ricos en compuestos de
inters, como lo es el escualeno en la industria de los cosmticos y los esteroles como
metabo]itos relacionados en la biosntesis de hormonas esteroideas. Bondioli y col., 1992;
1993) estudiaron el destilado de la desodorizacin de aceite de oliva (subproducto con
una fraccin mayor de material insaponificable que el aceite virgen) como posible fuente
de estos compuestos tras la realizacin de ensayos de extraccin con dixido de carbono
supercritico.
1 2.1.2- Procesado de ctricos
Eliminacin de amargos
Kinball (1987) utiliz el dixido de carbono supercrtico para la extraccin de triterpenos

amargos, principalmente la limonina de zumo de naranja. Utiliz temperaturas de 30 a 60
0C y presiones de 21,4 a 42,8 MPa, Los resultados concluyeron que la temperatura no
tena un efecto significativo en la extraccin de limonina, pero si era efectivo el aumento
de la presin. Tambin se extraa limoneno en bajas cantidades, pero no haba cambios de
pH, cido ascrbico, contenido en pulpa, aminocidos y porcentaje de cidos,
16
fui . ift. ~ 1. gIli#
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrit/cas.
Extraccin o concentracin de aceites esenciales de ctricos
Los aceites esenciales de ctricos son mezclas de mono y sequiterpenos, compuestos

oxigenados y un residuo no voltil (Temelli y col., 1988). Los aromas de limn fueron
extrados por Kalra y col, en 1987; utilizaron presiones entre 9,31 y 10,69 MPa y
temperaturas de 50, 60 y 80 0C. Observaron que un aumento de temperatura hizo
aumentar la extraccin de limoneno y citral selectivamente segn las condiciones, as, es
posible extraer selectivamente los componentes del limn y fraccionar los extractos.
Temelli en 1987 observ que, en general, los compuestos terpnicos eran ms solubles en
dixido de carbono que los compuestos oxigenados. Esta conclusin es razonable, ya que
los terpenos son compuestos apolares, tienen bajo peso molecular y alta presin de vapor,
siendo ms solubles en dixido de carbono superortico; por tanto, la mayor parte del
extracto es limoneno. Las condiciones pueden ajustarse a 70 0C y 8,3 MPa para
minimizar los compuestos del aroma perdidos por la extraccin.
Favati y col. en 1988 extrajeron carotenos y lutena de concentrados de protenas de hojas

por CO
2 supercritico. Se piensa que estos mtodos se pueden usar para la extraccin de
carotenoides de subproductos de naranjas.
1.2. 2- Aplicaciones de la atraccin a nivel industrial
1.2,2.1- Descafeinizacin del caf
Este proceso se est utilizando de forma comercial en Alemania desde 1978. El proceso,
segn Zosel (1978), consiste en una extraccin a partir de caf verde en remojo con CO2
0C que se recicla continuamente. En una torre de agua se produce la
a 16-22 MPa y 90
despresurizacin, donde se acumula la cafena en una operacin que dura 10 It La
cafena se recupera por destilacin. El contenido de cafena de los granos desciende
desde un 0,7-3% hasta un 0,02%. La cafena se extrae selectivamente, no se extraen
17
-. . p.. ,v. L,.4.~.,. .&..ta4
1a.S
~q~j L.wnqurn
Capitulo 1. introduccin. Extraccin con fluidos superoriticos.
sustancias que contribuyen al aroma del caf. Tambin se puede conseguir la

recuperacin del soluto por adsorcin sobre carbn activo.
1.2.2.2- Extraccin del lnulo
El lpulo es el ingrediente responsable de las caractersticas aromticas y el sabor amargo

de la cerveza. Sus constituyentes principales son las humulonas y lupulonas. Ambos son
cidos grasos insaturados con alrededor de 25 tomos de carbono y grupos carbonilo e
hidroxilo, se extraen bien con CO2 supercrtico. Para la extraccin las bolitas de lpulo
comercial no se someten a ningn tipo de preparacin a parte de la pulverizacin. En y
1983 se finaliz la construccin de una planta de extraccin supercrtica con una

capacidad de 5000 toneladas en Alemania.
1.2.2.3- Extraccin de especias
El uso de CO2 supercrtico se prefiere al de diclorometano, usado tradicionalmente.

Actualmente se llevan a cabo extracciones de pimienta negra, chillies y nuez moscada
para conseguir extractos que posean el aroma y las caractersticas ardientes de las
especias (Flubert y Vitzthum, 1978).
La piperina es el constituyente principal de la pimienta negra (98%) y responsable del

ardor de sta. Las extracciones de pimienta negra, seguidas de la transferencia de la fase
supercrtica a una celda de separacin en condiciones de presin y temperatura por
debajo del punto crtico producian un extracto que contena casi el 98% de la piperina.
4
fi
t/
18
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercriticos.
.2.3. Aplicaciones no convencionales del dixido de carbono supercrttico al

procesado de ctricos
Una solucin de dixido de carbono en agua causa la reduccin del pH, afectando los
enzimas y microorganismos. Entre los enzimas investigados pueden nombrase la cx-
amilasa, glucosa oxidasa, lipasa, catalasa (Taniguchi y col., 1987), polifenoloxidasa y
pectienesterasa (Zemel, 1989; Arreola, 1990). La turbidez es un importante atributo de
calidad del zumo de naranja y otros ctricos y se estabiliza al protegerla de la accin de la
pectinesterasa.
El tratamiento con dixido de carbono supercrtico se basa en la hiptesis de que ste

junto con el agua del zumo dan lugar a cido carbnico, bajando el pH temporalmente e
inactivando el enzima. Cuando la presin vuelve a ser la atmosfrica, el dixido de
carbono se separa del zumo, restaurndose el pH original (Balabon y Areola, 1991). De
esta forma podran evitarse temperaturas tan altas como en el tratamiento trmico
convenciOnal.
La calidad de un zumo tambin depende de los cambios de flavor causados por

inicroorganisnos que pueden desaxTollarse a pH bajos (Merteus y Knorr, 1992). Sin
embargo, al conseguir pH menores debido a la formacin de cido carbnico puede
limitarse de desarrollo de estas bacterias y hongos, pudiendo ser beneficioso su uso,
Kamihira y col, en 1987 encontraron un efecto esterilizante del dixido de carbono
supercrtico en Saccharomyces cerev/siae, Eseherichia coil, Staphylococcus aureus y
Aspergillus nger a 20,3 MPa y 35 0C cuando el contenido de agua fue de 70 al 90%. Los
microorganismos en seco no eran esterilizados cuando se trataban en las mismas
condiciones. Molin (1983) estudi el efecto inhibitorio de CO
2 al 100% de varios
microorganismos incluyendo el gnero Laclohacil/us y encontr que se endenteca la
velocidad de crecimiento.
k
19
.1 . .~.I..V ..~ ,Wj,!.uI.sM.,.a...... fi
1...
Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercrlIicos.
La calidad de un zumo tambin depende de otros atributos como el pH, estabilidad al

almacenamiento, slidos solubles totales (0Brix), acidez total, color, contenido de cido
ascrbico, flavor, aroma y apariencia. Estos atributos de calidad de un zumo pueden verse
afectados por el tratamiento por dixido de carbono supercrtico.
1.2.4- Otras aplicaciones del dixido de carbono supercritico
Por ltimo, algunas aplicaciones van encaminadas a la inactivacin de polifenoloxidasa

en crustceos (langosta y gamba) y patata, para evitar el cambio hacia colores
desagradables durante la conservacin (Chen y col., 1992b; 1993).
El desengrasado de alimentos para la obtencin de derivados ricos en protenas es otra de

las aplicaciones de la extraccin con CO
2 supercrtico. Maheshwari y col. (1995)
estudiaron varios mtodos para la eliminacin de compuestos que provocan olores
desagradables en concentrados de protenas de soja, siendo el supercrtico el que
proporciona mejores resultados, Wu y col. (1990, 1994) lo realizan en protenas y fibra
alimentaria de maz, y Temelli y col. (1995) utilizan el dixido de carbono supercrtico
para desengrasar las protenas de msculo de caballa. El desengrasado tambin se ha
aplicado a alimentos transformados como patatas fritas, salchichas, manteca de cacahute,
queso, galletas y hamburgesas (Sutter y col., 1994; Hopper y col., 1995; Webster, 1995).
20
JBJETIVOS
y
/
n el rea de la Tecnologa de los Alimentos, las novedosas tcnicas de extraccin que se
asan en el empleo de dixido de carbono supercrftico poseen claras ventajas sobre
quellas consideradas como convencionales, tanto por su inocuidad debida a las
nopiedades del fluido como por las amplias posibilidades de realizacin de extracciones
electivas de unos compuestos respecto a otros en matrices complejas. Con el fin de
~ontribuiral avance sobre la aplicacin de esta tcnica junto con el desarrollo de nuevos
ioductos de mayor calidad y el aprovechamiento de subproductos, se plantearon los
iguientes objetivos:
- disminucin del contenido en colesterol de la grasa de la nata mediante la

extraccin con CO2 en condiciones supercrticas,
- fraccionamiento de la grasa lctea de la nata, mediante la extraccin con CO2

supercrtico, para la obtencin de extractos lpdicos de diferente composicin
tiiglicrica que pueden ser utilizados en la elaboracin de distintos alimentos,
- aprovechamiento de los destilados de la desodorizacin de aceites de oliva y

girasol, subproductos del refinado de stos, para la obtencin, de modo selectivo
mediante a extraccin con CO2 supercrtico, de escualeno, producto de gran uso
a nivel industrial,
- mejora de la calidad de los zumos de naranja comerciales por inactivacin de la

pectinesterasa mediante el tratamiento con CO2 superortico.
21
Y 3
PLAN DE TRABAJO fi
El desarrollo del trabajo ha incluido las siguientes etapas:
- estimacin de la composicin en triglicridos de la grasa de leche de oveja, cabra

y vaca mediante cromatografia lquida de alta eficacia en combinacin con la
aplicacin de modelos matemticos y cromatografia de gases,
- aplicacin de la extraccin con CO2 en condiciones supercriticas a la extraccin
de colesterol y modificacin de la grasa presente en la nata,
- estimacin de las distintas familias de compuestos lipdicos por espectroscopia de

13C.
resonancia magntica nuclear del
- desarrollo y optimizacin de mtodos anliticos, cromatografia lquida de alta

eficacia, para la determinacin de los esteroles y escualeno, y su aplicacin al
anlisis de los destilados de la desodorizacin de aceites de oliva y girasol,
- aplicacin de la extraccin con CO

2 en condiciones supercriticas a la extraccin
de escualeno de los destilados de la desodoxizacin de aceites de oliva y girasol,
- tratamiento con CO2 en condiciones supercrticas del zumo de naranja para la

inactivacin de la pectinesterasa y estudio de la modificacin de la turbdez y el
color.
22
Cap/tulo 2.
Aplicacin de la extraccin con dixido de carbono
supercrftico a la mod<ficacin de grasa lctea en nata
Capitulo 2. Aplicacin o la extraccin de grasa lctea de nata.
2.1- INTRODUCCIN
21.1- Lpidos
No existe una definicin satisfactoria universalmente aceptada sobre la palabra lpido

En general se describen los lpidos como aquellos compuestos que son solubles en
disolventes orgnicos como cloroformo, teres y alcoholes, lo que incluye a los
esteroides, carotenoides, terpenos y cidos biliares junto a los cidos grasos y los
acilgliceroles. ltimamente se considera que este criterio de clasificacin es bastante
vago y sirve mejor para distinguir entre tpicos lpidos y los tpicos glcidos y protenas,
dejando bastantes casos de clasificacin dudosa.
Hay autores que definen los lpidos como los cidos grasos y sus derivados o sustancias
relacionadas biosinttica o funcionalmente (Christie, 1989, Gunstone y Herslt 1992).
Esta definicin incluye la mayora de los compuestos conocidos tradicionalmente como
lpidos, se incluyen los steres de esteroles, pero no los esteroles libres. Si tenemos en
cuenta esta segunda definicin podemos dividir los lpidos en dos grupos:
lpidos simples aquellos que tras la saponificacin dan como productos dos compuestos
por mol como mucho (cidos grasos, glicerol, etc), como son los triglicridos o los
steres de colesterol,
lpidos complejos si producen tres o ms compuestos por mol inicial tras la

saponificacin, como los fosfolpidos y glicolpidos. Fosfolpidos y glicolpidos pueden
dividirse tambin en glicero- y esfmgolpidos.
2.1.1.1- cidos 2rasos
Los cidos grasos son lpidos presentes en plantas, animales y microorganismos que
contienen cadenas de tomos de carbono unidas a un grupo carboxlico en un extremo.
24
. .1 t,aLA.A~atSIMSSIS
.4. vn r-~n<IC*rffr~rrs
Capitulo 2- Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
Pueden contener dobles enlaces (cis o srans), ramificaciones, otros grupos funcionales y
generalmente son de cadena par. Segn el nmero de insaturaciones se clasifican en
saturados, mono y poliinsaturados.
2.1,1.1.1- cidos grasos saturados
Existen en la naturaleza cidos grasos saturados de 2 a 36 tomos de carbono, siendo los

ms abundantes los de 14, 16 y 18 carbonos. Los cidos de cadena lineal siguen la
frmula:
CH4CHzL1COOH
Los cidos grasos saturados de 12 o ms tomos de carbono son slidos a temperatura

ambiente, con menos tomos se presentan en estado lquido.
2.1.1.1.2- cidos grasos monoinsaturados
Estos cidos grasos contienen un nico doble enlace en su estructura. Este doble enlace
puede estar en diferentes posiciones en la cadena carbonada y presentar las
configuraciones cs o rans. La frmula general se corresponde con la siguiente:
CHs(CHztCH#ZH(CHz)nCOOH
Los cidos c/s-monoenoicos con 18 carbonos o menos tienen puntos de fusin por debajo
de la temperatura ambiente, los ismeros trans poseen puntos de fusin algo superiores.
La presencia de insaturaciones provoca una mayor susceptibilidad a la oxidacin que los
cidos saturados.
it
25
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lactea de nata.
2.1.1.1.3- cidos grasos poliinsaturados
Estos cidos grasos poseen ms de un doble enlace en la cadena carbonada. Pueden

subdividirse en varias familias de acuerdo a su procedencia desde un precursor especfico
de su biosntesis. Cada una de estas familias contiene desde 2 hasta un mximo de 6
dobles enlaces separados por grupos metilnicos y una misma estructura terminal. Estas
familias son principalmente las de los cidos (n-9), (n-6) y (n-3), segn la posicin de la
ltima insaturacin respecto al final de la cadena. De especial importancia son los cidos
de la familia (n-3), como el cido ct-linolnico, por ser esenciales en la dieta animal y
humana. Por otra parte, se ha comprobado que los cidos de la familia (n-3) reducen el
ti
desarrollo de tumoraciones como el cncer de mama (Col Helln, 1988).
cido cx-linolnico
En general, los cidos grasos poliinsaturados son de bajo punto de fusin y son de ms
fcil deterioro por oxidacin o autooxidacin.
2.1.1.1.4- cidos grasos ramificados
Los cidos grasos ramificados se encuentran ampliamente distrubuidos en la naturaleza,

ti
pero como componentes minoritarios excepto en bacterias. Generalmente la ramificacin

ti
26
u
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
consiste en un solo grupo metilo en el penltimo (1w) o antepenltimo (ante so) tomo de
carbono.
OH
o
cido /so-pentadecanoico
o
cido ante/so-margrico
2.1.1.1.5-cidos grasos con otros grupos funcionales
De entre los hidroxicidos es particularmente importante el cido araquidnico y el grupo

de los eicosanoides por ser intermedios en la sntesis de prostanoides. Tambin existen
cidos grasos con grupos furanoides, ciclopropanos, ciclopentanos y ciclohexanos.
2.1.1.2-Lpidos simples
2.1,1.2.1- Trigilcridos y compuestos relacionados
Los triglicridos (o triacilgliceroles) son compuestos formados a partir de una molcula

de gliceol en la que cada gupo hidroxilo est esterificado por un cido graso. En la
27
3 ~. . . ..f. :9t.w.L~ ~v
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
naturaleza son biosintetizados por sistemas enzimticos, lo que determina que est
presente uno de los ismeros,
(a-l)cHoocR
R COO
(a 3) C H2000R
triacil-sn-glicerol
La mayora de grasas y aceites de animales y plantas consisten casi exclusivamente en

triglicridos. En aceites vegetales suele haber triglicridos compuestos por cidos grasos
insaturados, en grasas animales como el tejido adiposo predominan cidos de cadena
larga (16 y 18 carbonos) y en la grasa lctea cidos de cadena corta. Las grasas de
pescado y de mamferos marinos contienen en su fraccin triglicrica altas proporciones
de cidos grasos poliinsaturados de 20 y 22 tomos de carbono,
Los mono y diglicridos contienen uno y dos moles de cidos grasos por mol de glicerol
respectivamente, y frente a los triglicridos son minoritarios en la naturaleza. Aparecen
como intermedios en la biosntesis de triglicridos y otros lpidos, y tambin en la
hidrlisis de stos.
2.1.1.2.2- Esteres de esteroles

1
Los esteroles pueden esterificarse con los cidos grasos dando lugar a los steres de
esteroles. En las plantas se encuentran steres de f3-sitosterol, ergosterol, estigmasterol,
etc., y en animales predominan los steres de colesterol.
28
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata
2.1.1.2.3- Otros lpidos simples
Entre otros lpidos simples de menos inters en nuestro estudio podemos citar los
alquildiacilgliceroles y plasmalgenos neutros, y los steres de ceras,
Los alquildiacilgliceroles estn formados por sustitucin de un cido graso de un

triglicrido por una cadena alquilica mediante un enlace ter, Los plasmalgenos neutros
contienen un enlace vinilter con la configuracin cis y se han detectado en algunos
tejidos de origen animal en bajas cantidades.
CH2OCH=CHR
RCOOc!II
CII2OH
plasmalgeno neutro
Entre los steres de ceras ms comunes se encuentran aquellos formados por la

esterificacin de un cido graso con alcoholes grasos de longitudes similares, Se
encuentran tanto en vegetales como en animales y microorganismos, y con diferentes
funciones.
2.1.1.3- Lpidos complejos
2.1.1.3.1- Glicerofosfolpidos
Son compuestos con la estructura de l,2-diacil-sn-glicerol-3-fOsfatO o cido fosfatdico,

en los que al grupo fosfato se une un grupo polar. Se agrupan en familias dependiendo de
la base a la que est unido el resto de cido fosfrico. La fosfatidilcolina, comunimente
29
0 Lb ..iI < ~I .tnJ4S4IeII~eI~rdJ.lsIflfl
llamada lecitina, es el lpido ms abundante en las membranas de tejidos animales,

tambin aparece en membranas de vegetales y, en algunos casos, de microorganismos.
colina
CH 2000R _____________
RCOOCH o CH3
CH2 O P O CH2 CH2 N CH3

O CH3
diglicrido . fosfrico
fosfatidilcolina
Entre otros glicerofosfolpidos pueden citarse el fosfatidilglicerol, encontrado en

cloroplastos, difosfatidilglicerol (o cardiolipina), en las mitocondrias del tejido muscular,
fosfatidiletanolamina (o cefalina), fosfatidilserina y fosfatidilinositol. Cada clase de las
nombradas anteriormente tiene una composicin distintiva en cidos grasos segn el
tejido al que pertenezcan, aunque generalmente los cidos saturados se encuentran en
posicin sn-l y los insaturados en sn-2.
ti
2.1.1.3.2- Gliceroglicolipidos
Los tejidos vegetales son especialmente ricos en lpidos en los que los l,2-diacil-sn-
gliceroles estn unidos a un glcido en la posicin sn-3 mediante enlace glicosdico. Los
principales son el mono y digalactosildiacilglicerOl, el primero de ellos tambin se
encuentra en pequeas cantidades en el tejido nervioso de algunas especies animales y
ambos son importantes en la composicin de los cloroplastos.
30
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
1~II2OCOR L2OH
RCOOH
Oil
digalactosildiacilglicerol
2.1.1.3.3- Esfingolpidos
La caracterstica fundamental de estos lpidos es que estn formados por una base de
cadena larga (12 a 22 carbonos) hidroxilada, con un doble enlace trans en la posicin 4 y
unida a un cido graso, siendo la esfingosina la base ms abundante. Se encuentran en
animales, plantas y microorganisinos.
Las cerarnidas contienen un cido graso unido al grupo amino de la base mediante un
enlace amida y se encuentran en los tejidos como intermedios en la sntesis de
esfingolipidos complejos o de su degradacin. La esfmgomielina es una ceraniida que
incorpora fosforilcolina en su molcula y es uno de los lpidos ms importantes del tejido

nervioso de los animales, Los cerebrsidos son glicoesfmgolpidos ya que incorporan a la
estructura de la ceramida glucosa o galactosa y se encuentran principalmente entre los 1
lpidos del cerebro. Los ganglisidos son oligoglicosilceramidas muy complejas, itti
conteniendo cido silico, glucosa, galactosa y galactosamina y aparecen principalmente
en clulas ganglionares del sistema neivioso central. A
31
CapItulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
OH
es fin gos in a
o galactosa
12
011
NHt
0
o
CHON
OH
2
1
O
p/
. graso
/t
galactosilceramida
2. 1 1 .4- Composicin de la fiaccin insaponificable

.
En este grupo se incluye una serie de compuestos que no se consideran lpidos, pero que
se caracterizan por ser hidrocarburos o derivados oxigenados de stos, son liposolubles y
presentan afinidades marcadas con los lpidos.
De una parte, aparecen hidrocarburos saturados acclicos en pequea proporcin en la

fraccin insaponificable; sin embargo, la mayor parte de los compuestos pertenecen, por
su forma de originarse, a una serie de productos naturales que alcanza una extraordinaria
diversificacin estructural y en la cual se encuentran representantes de destacada
significacin biolgica. Es el grupo de los isoprenoides o poliprenos, que se pueden
considerar resultantes de la polimerizacin de un hidrocarburo bsico de 5 tomos de
carbono, el isopreno.
l
it2
Isopreno ~Ii~
A
32
La agregacin de grupos isoprnicos origina sustancias que reciben nombres relacionados

con la denominacin terpenos.
2.1.1.4.1- Monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos
Son sustancias que abundan especialmente en vegetales, sobre todo en esencias, ya que
suelen ser de elevada volatilidad, y en resinas y blsamos. El fitol es un diterpeno que
forma parte de la estructura de la clorofila, es constituyente de las vitaminas liposolubles
E (tocoferoles) y K, y est muy relacionado en su estructura con la de la vitamina A.
r4
HO.
c-tocoferol
2.1.1.4.2- Triterpenos
Estn constituidos por 6 unidades isoprenoides y se encuentran en aceites de pescado y

vegetales, resinas y saponinas.
Un triterpeno no cclico muy importante es el escualeno, que se asla fundamentalmente ti
del insaponificable de aceites de hgado de peces seos o cartilaginosos. Su importancia ti
reside en su papel de producto intermedio en la sntesis de los restantes triterpenos

cclicos y de los esteroides.
it
33
escualeno
2.1.1,4.3- Carotenoides
Los carotenoides son compuestos profusamente repartidos entre los vegetales, tambin se
encuentran en animales y microorganismos. Los carotenos (a, ~3y y~ poseen uno o dos
ciclos en los extremos de la molcula y su escisin por el doble enlace central da lugar a
la formacin de vitamina A.
~-caroteno
Existen muchos derivados oxigenados de los carotenoides, como la xantofila y el

licoxanteno, tambin se han descrito derivados cetnicos, cidos, aldehdos y epxidos.
2.1.1.4.4- Esteroides
El grupo de los esteroides comprende las sustancias naturales derivadas estructuralmente

del ciclopentanoperhidrofenantrenO. Estas sustancias engloban a compuestos como los
34
U r .
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
esteroles, cidos biliares, estrgenos, andrgenos, gestgenos, corticoides, vitaminas del

Y
grupo D, etc.
4
Los esteroles poseen una cadena lateral en el carbono 17 y un hidroxilo en 3, y muy

frecuentemente se encuentran esterificados con cidos grasos, Son compuestos fi
minoritarios pero se encuentran en casi todos los organismos. El colesterol se encuentra
en casi todas las grasas de origen animal.
HO
colesterol
Los esteroles presentes en organismos vegetales reciben el nombre genrico de

fitosteroles, como lo son el estigmasterol, campesterol, j3-sitosterol, etc.
21.2- Composicin de la leche
La leche es un sistema coloidal constituido por una solucin acuosa de lactosa, sales y
2
otros muchos elementos en estado de disolucin, en donde se encuentran las protenas en
estado de suspensin y la materia grasa en estado de emulsin. En la tabla siguiente se
muestran los valores aproximados en que se encuentran los componentes de la leche de >2> >2
vaca (Riel, 1991); la composicin exacta de una muestra de leche vara en funcin de
mltiples factores y nicamente se puede conocer mediante su anlisis.
2>
35
4
Componentes
mayoritarios:
Agua 86,9%
34
Materias grasas 3,9%
Protenas y sustancias nitrogenadas no proteicas 3,2%
Glcidos 5,1%
Sales 0,9%
Componentes
minoritarios:
Enzimas 4
Vitaminas
Pigmentos (carotenos, xantofilas, riboflavina)
Clulas diversas (clulas epiteliales, leucocitos,
bacterias, levaduras, mohos)
Otros elementos (dixido de carbono, oxgeno,
nitrgeno y otros gases)
Sustancias extraas
2.1,2.1-Composicin de la grasa lctea

2>34
La composicin de la grasa lctea es muy compleja y muy variable. Las variaciones en su

composicin se deben fundamentalmente a la especie de animal que se trate, raza, 322
ti>Jt
individuo, alimentacin, estacin del ao, edad y periodo de lactacin.
La materia grasa se encuentra en la leche formando glbulos esfricos suspendidos en la

fase acuosa del suero. El dimetro de stos varia entre 2 y 10 I.un. Un glbulo graso es
una masa de triglicridos envuelta en una membrana lipoproteica, membrana que posee
36
un espesor de cerca de 0,005 xm en el caso de un glbulo graso de 5 gm (Veisseyre,

1980). Segn Veisseyre (1980) y Riel (1991) los triglicridos ms insaturados y los que
tienen un peso molecular ms bajo, estn situados en el centro del glbulo,
probablemente porque son lquidos y as quedan retenidos por los glicridos slidos que
se localizan en la periferia. Los fosfolpidos, al ser anfifilos, estabilizan los glbulos y
estn en cantidad suficiente como para formar una capa mono-molecular en la superficie
de todos los glbulos grasos. La parte polar se orienta hacia la fase acuosa y el segmento
apolar hacia la fase lipdica. Las globulinas que tambin existen en las membranas y la 4~
carga total del glbulo graso, que es negativa, contribuyen a mantener la estabilidad del
glbulo en emulsin. Adems, la membrana contiene pequeas cantidades de mono y
JI
diglicridos, carotenoides, colesterol, metales (hierro, cobre, magnesio y zinc), agua
ligada y enzimas (fosfatasa alcalina y xantina oxidasa) La figura 2.1.2.1 representa, de
it
forma esquemtica, la composicin del glbulo graso.
1
,2
6/ti
4$
J2j
.3>-li
37
21
24
Figura 2.1.2.1. Estructura de un glbulo graso

1: triglicridos insaturados y de bajo peso molecular; 2: triglicridos slidos 3:
fosfolpidos; 4: lipoproteinas, enzimas, aglutininas; 5: cargas elctricas.
38
III. 4 hdwpectsttflws
Captulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
Segn Gunstone y col. (1986), la composicin del glbulo graso de la leche de vaca es la
siguiente:
Componente Lipdico Lpidos de Membrana Total en el Glbulo Graso

(%) (%
Carotenoides 0,45 ti.
Escualeno 0,61 ti. U

steres de Colesterol 0,79 tr >4
Triglicridos 53,4 97-98

cidos Grasos Libres 6,3 0,10-0,44
y.
Colesterol 5,2 0,22-0,41
22~
Diglicridos 8,1 0,28-0,59

Monoglicridos 4,7 0,016-0,038
Fosfoipidos 20,4 0,2-1,0
La composicin en cidos grasos de la grasa lctea (tanto los que constituyen los
triglicridos, que son la mayora, como los que se encuentran libres) es ms compleja que
la de los aceites vegetales. Este complejidad se debe a varios factores (Walstra y Jennes,
1984), que incluyen:
1
a) cidos grasos procedentes de la grasa de la dieta y que llegan a la glndula

mamaria a travs de la sangre y la linfa. En su mayoria son de 16 o ms tomos de
carbono,
J
b) cidos grasos sintetizados en la glndula mamaria. Son cidos de cadena corta y
inedia, mirsitco y parte de palmtico. Adems, las clulas mamarias de rumiantes poseen
una alta actividad desaturasa que insatura los cidos esterico y palmtico.
39
4
)
c) microorganismos en el rumen, que hidrogenan total o parcialmente cidos

/
grasos de 18 carbonos de los alimentos consumidos, por lo que introducen ismeros

posicionales y geomtricos de cidos grasos monoinsaturados y tambin cidos grasos
ramificados en el total de la composicin de cidos grasos. 4>
22>
Segn Gunstone y col. (1986) la grasa lctea es la mezcla grasa de origen natural ms
compleja debido a su composicin en cidos grasos y, por tanto, en triglicridos. Se han
caracterizado alrededor de 500 cidos grasos, siendo unos 15 mayoritarios y existen
U
numerosos ismeros mono y poliinsaturados y ramificados. 2
it
41
Los estudios de Breckenbridge y col. (1969), Marai y col. (1969) y Parodi (1982), sobre
la distribucin posicional en los triglicridos de los cidos grasos mayoritarios indican
que los cidos butrico y caproico se encuentran siempre en la posicin sn-3 del
triglicrido. Los cidos caprilico y cprico y los insaturados de 18 tomos de carbono se
unen preferentemente en la misma posicin que los anteriores, pero no exclusivamente.
Otros cidos grasos tambin tienen posiciones preferentes para la esterificacin, como los
cidos lurico y mirstico en la posicin sn-2 y palmtico y esterico en la posicin sn-l.
Coincidiendo con los datos apodados con Anifantakis (1986), este tipo de distribucin es
comn a casi todas las leches de mamferos, incluyendo las de oveja y cabra,
it4
La grasa lctea tambin contiene lecitinas, cefalinas, esfingomielinas y trazas de
cerebrsidos. El contenido total de estos compuestos en la leche es de alrededor de un
0,03%, es decir, aproximadamente un 1% de los lpidos totales en leche. La contribucin

de las lecitinas es del 60%, la de las cefalinas del 30% y la de las esfmgomielinas del Ii
10%. El contenido de la leche en cerebrsidos no supera el 0,002% (Riel, 1991).
itt
>21
$2
Los componentes insaponificables suponen un 0,4% de la masa de materia grasa.

Cuantitativamente, los esteroles son los compuestos ms importantes, principalmente el
colesterol y sus precursores, el ergosterol y el 7-dehidrocolesterol. La exposicin de estos
1>2
40
ltimos a los rayos ultravioleta los transforma en vitaminas del grupo D. Tambin se
encuentra en la leche lanosterol y escualeno.
Adems del colesterol de la fraccin lipdica, tambin hay colesterol en la fase acuosa de
la leche en forma de proteino-colesterol y formando complejos en la membrana de los
glbulos grasos. Tiene papel emulsionante y se le atribuyen propiedades antilipolticas de
ji
la leche, jI>
Los tocoferoles son sinnimos de vitamina E, siendo el mayoritario de la leche el a-

tocoferol. Desde el punto de vista tecnolgico, son antioxidantes naturales especialmente
tiles para prevenir la oxidacin de los fosfolpidos.
21.3- (omposicin de las leches de vaca, oveja y cabra
La produccin de leche de oveja y cabra es de gran importancia en algunos paises donde 2
las condiciones climticas no son favorables para el mantenimiento del ganado vacuno.
La produccin mundial de leche de estas especies se sita en tercer y cuarto lugar tras la
leche de vaca y la de bfala. Sin embargo, en algunos paises del rea mediterrnea la
1
produccin de leche de estas especies ha revalorizado su importancia econmica como
resultado de una mayor aceptacin a nivel mundial de los productos derivados de stas.
Este creciente inters ha sido evidente si tenemos en cuenta que los estudios realizados
sobre leche de oveja y cabra se han duplicado en la ltima dcada, An as, los datos
disponibles sobre la composicin de estas leches son pocos si los comparamos con los
que se poseen de leche de vaca, de mayor inters comercial y considerando tambin la
limitacin geogrfica de la produccin de leche de oveja y cabra y su contexto tradicional
al que se han asociado.
41
.1 Ir. .~IIflb tSr ~li.~r.tS~qiSaA.aSflsS.i~sfl
.~.u u Ji>v~rvrwtwy~
A pesar de la baja produccin de leche de oveja y cabra a nivel mundial, son de gran 41
importancia en las regiones del Mediterrneo (Le Jaouen y Toussaint, 1993), Oriente
itti?,
Prximo, India y Europa del Este. La produccin de leche de estas especies est 3
encaminada fundamentalmente a la elaboracin de quesos, pero en algunos paises se
utiliza tambin pa;a producir yogures, mantequilla y leche fennentada, y la leche de cabra 4~ii
It
tambin se consume directamente como tal, Otros productos que van aquiriendo cada vez 3
ms importancia son aquellos encaminados a sustituir la leche de vaca por leche de cabra
en los casos de aparicin de alergias a sus protenas o de malnutricin (Desjeux, 1993,
Hachelaf y col, 1993; Razafindrakoto y col, 1993). 1
2)
Este aumento del estudio de la leche de oveja y cabra ha dado como fruto trabajos que
renen los ltimos datos aportados, como los de Ramos y Jurez (1981, 1982, 1986a y b, y
=1
ti>
y 1993), Jurez y Ramos (1984, 1986), Anifantakis (1986), Boyazoglu (1989), Yener
(1989) y Mann (1994). En ellos se compara la composicin de la leche de estas especies
con la de vaca y la aplicacin para la obtencin de productos derivados.
Tal como seala Haenlein (1995), la composicin de la leche de oveja y cabTa vara
dentro de un rango muy amplio debido a las diferencias genticas entre especies, entie
razas de una misma especie e incluso entre individuos de una misma raza, adems de
otros factores ya citados anteriormente, como oculTe en el caso de la leche de vaca. ti
fi
3,
y
Remeuf (1993) descubri que variantes genticas de cabra conducan tambin a diferente
cantidad de grasa en la leche, Sin embargo, se coincide en indicar el mayor valor nutritivo
U
<1
.21
de la leche de oveja por tener mayor cantidad de grasa, protenas, minerales y slidos
341
totales que la leche de vaca y cabra, siendo el mismo el contenido de lactosa. La leche de
22
cabra tiene, por lo general, una composicin ms semejante a la de vaca. Segn la

bibliografia consultada por Jurez y Ramos (1984), la composicin de la leche de oveja y
cabra es la siguiente:
42
III
Oveja Cabra
Slidos totales 15,8-23,4 11,33-18,68
ti
Lpidos 4,54-12,60 2,84-7,78
l
Protenas 4,3-6,77 2,64-5,30
Lactosa 4, 19-5,25 3,91-6,30
Cenizas 0,79-0,95 0,77-0,95 it
Segn los estudios de Anifantakis (1986) y Ramos y Jurez (1993), al comparar las
leches de vaca, oveja y cabra, se vio que destaca un mayor contenido de los cidos
caproico, caprlico, cprico y lurico en las de cabra y oveja (20-25% frente a 10-12% de
la leche de vaca) y de palmtico, esterico y oleico en la de vaca.
21.4. La grasa lctea y los trastornos cardiovasculares u

2,1.4.1- Valor nutrutivo de la leche it
it
La leche es un alimento nutricionalmente muy completo, sobre todo en la edad de it

crecimiento, ya que aporta protenas de alto valor biolgico y calcio, y tambin es rico en
vitaminas A y B. Se puede decir que es un alimento de muy alto valor nutricional y de un
bajo coste econmico (Juansolo, 1992).
Sin embargo, tras el estudio de Vzquez-Martnez (1992), respecto a la evolucin del

consumo de eche y derivados en Espaa hay que decir que experiment un espectacular
aumento entre 1964 y 1980, descendiendo a partir de entonces. En 1987 el consumo de
leche en Espaa fue de 125,5 kg/ao/perSona y continu descendiendo hasta 109,3
kgao/persona en 1990. Una de las causas de este descenso en el consumo es que se
considera que la leche entera y sus derivados son alimentos con alto contenido en grasas
43
saturadas y colesterol, tipo de grasas que se recomiendan limitar en su consumo por su

relacin con la aparicin de trastornos cardiovasculares (Cos Blanco, 1992).
2. 1.4.2- La grasa lctea y los trastornos cardiovasculares
La leche de vaca es popularmente conocida como un alimento con una importante

4
cantidad de colesterol, si bien, no se tiene en cuenta que normalmente la leche de mujer ji 3
2
tiene una cantidad mayor (Paul y Southgate, 1978) y que esto ltimo se puede relacionar
con que el organismo del lactante pueda metabolizar el colesterol de modo ms efectivo
(Mott, 1986).
Adems de lo dicho anteriormente acerca del colesterol, la grasa lctea se considera

tambin una grasa saturada, lo que incurre en un uso abusivo de este trmino. El
porcentaje en que se encuentran los cidos grasos saturados en la grasa de vaca est
g
alrededor de un 60% del total, lo que significa que ms de un tercio de los cidos grasos
son insaturados. Se puede aadir que es muy importante conocer la diversidad de cidos
grasos saturados que presenta la grasa lctea, encontrndose longitudes de cadena desde 2
21
a 20 carbonos. Los cidos grasos de cadena corta y media (2 a 12 tomos de carbono) se
digieren ms rpidamente que los de cadena larga y se absorben por un mecanismo
diferente, pasando directamente a la sangre, evitndose el paso por el hgado y siendo
tu
adems fuente de energa de ste (Sickinger, 1975). Por tanto, no contribuyen al aumento
it?
de la concentracin de lpidos en la sangre.
$1
Los efectos adversos de los cidos grasos saturados se deben fundamentalmente a que
favorecen la elevacin de la concentracin de colesterol en la sangre. En esta
>34]
consideracin tambin se suele descuidar el hecho de que solamente dos de estos cidos
grasos producen este efecto de forma significativa (mirstico y palmtico). Recientes
estudios han demostrado que el cido esterico no produce estos efectos (Bonanome y
44
Grundy, 1988). En resumen se puede concluir que solamente el 34% de los cidos grasos
de la grasa lctea tienen actividad hipercolesterolemiante.
vi~
Los cidos grasos monoinsaturados se encuentran aproximadamente en un 32% del total,
siendo el cido oleico el mayoritario. En un principio se pens que estos cidos no
elevaban los niveles sanguneos de colesterol, pero que tampoco contribuan a hacerlos
disminuir. Recientes estudios han reevaluado el efecto sobre el colesterol en sangre de
ellos (Mattson y Grundy, 1985; Orundy, 1986; Mensink y Katan, 1987; Baggio y col.,
1988; Grundy y col., 1988). Estos estudios han podido concluir que las dietas ricas en
cidos grasos monoinsaturados inducen menores niveles plasmticos de colesterol y LDL
que dietas altamente saturadas,y no producen variaciones en la trigliceridemia y en los
niveles de las HDL. En comparacin con dietas pobres en grasas y ricas en glcidos se
observ que producan menores valores de colesterolemia y mayores de HDL. En
conclusin, los beneficios que aportan dietas que contienen cidos grasos
monoinsaturados parecen ser: en primer lugar disminuyen los niveles plasmticos de
colesterol y LDL, incluso cuando la dieta es altamente energtica. No disminuyen los
~k
niveles de HDL, lo que puede ser ventajoso, ni elevan los de triglicridos totales, lo que
.34
s ocurre con dietas ricas en glcidos. Finalmente, se oxidan con ms dificultad que los
1
cidos grasos poliinsaturados (Gua, 1989).
II
E. .
En lo referido a los cidos grasos poliinsaturados, hay que decir que la grasa lctea es 12
algo pobre debido a la hidrogenacin que sufren en el ruinen por los micTorganismos. No 2I > .
itt
se puede decir que la leche sea una de las fuentes ms importantes de cidos grasos
esenciales. Sin embargo, no se puede por ello negar que la leche en s es uno de los
alimentos ms importantes de la dieta.
Se dice normalmente que la leche es un alimento con alta concentracin de colesterol,

aunque contribuye modestamente al colesterol total ingerido en la dieta (slo 55 mg/da
de un total de 500 a 1000 mg/da). Junto a esto hay que considerar que el colesterol
ingerido con los alimentos es solamente uno de los factores que influyen en la
45
W u. ~as~q~ ~r&!I1W4tWpV
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata
concentracin de colesterol plasmtico (Beynen y col., 1987). Sin embargo, esto est en
entredicho y hay diversidad de opiniones sobre la incidencia del colesterol de la dieta
sobre los niveles plasmticos.
2.1.5- Lasposibilidades del uso de la grasa lctea mod~flcada
Histricamente, la grasa lctea ha sido muy utilizada, ya como leche en s, nata o

mantequilla. Sin embargo, ha habido una gran disminucin en su consumo, sobre todo en
los paises occidentales, y es por esto que se estn tomando medidas para que los
consumidores no rechacen los productos lcteos que contengan toda su grasa. Todos los
productos de carcter graso que se ofrecen en el mercado estn siendo menos consumidos
y coincide, adems, que la mantequilla es el ms caro de ellos.
La causa fundamental por la que se rechaza la mantequilla y la grasa lctea en general es

por el contenido en cidos grasos saturados considerados hipercolesterolemiantes y
tambin por su contenido en colesterol. Estos dos factores han hecho que este alimento
sea tambin apartado de las dietas que aconsejan los mdicos.
El flavor y la textura de la mantequilla son considerablemente mejores que los de otras

grasas, como las margarinas, que se usan como sustitutos; pero sus propiedades fisicas y
reolgicas, especialmente la poca capacidad para untarse a la temperatura del frigorfico,
hacen, tambin, que la mantequilla sea poco atractiva para los consumidores.
Para aquellos que demandan productos de buena calidad, de origen natural y buen sabor,
la mantequilla seguira siendo esencial en la dieta, pero otras veces el consumidor se
decanta por productos de mezcla de mantequilla con aceites vegetales parcialmente
hidrogenados para procurar una mayor untabilidad. Sin embargo, estas mezclas,
realizadas segn la tecnologa de las margarinas, presentan algunos problemas en el
sentido tecnolgico y tambin cientfico. Los productos bajos en grasa presentan ms
46
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lactea de nata.
problemas y se relacionan con la inestabilidad de la emulsin y el consiguiente

favorecimiento del crecimiento de microorganismos.
Es muy dificil que un nico mercado de grasa lctea pueda compensar el descesnso del
consumo de sus derivados. Al contrario, parece que la solucin se encuentra en aumentar
el espectro de productos, en la diversificacin. Para que esto se pueda llevar a cabo es
necesario conocer a fondo la estructura de la grasa lctea y establecer las propiedades de
los componentes que la forman. Este proceso ha sido ya llevado con xito en la fraccin
proteica de la leche y sera deseable que se consiguiesen los mismos resultados con la
grasa lctea.
Unas de las propiedades ms valoradas de la grasa lctea son sus caractersticas

organolpticas, mucho ms apreciadas que las de otras grasas y aceites comestibles para
la elaboracin de productos de confitera, bollera y para untar. Sin embargo, en contra de
estas ventajas encontramos inconvenientes que hacen que se modifique esta grasa para su
consumo y se estudien nuevos mtodos de modificacin. Entre los inconvenientes
podemos citar los anteriormente dichos y el precio, que encarece an ms las formas
procesadas de la grasa lctea.
La complejidad de la composicin de la grasa lctea hace posible que pueda ser

modificada y fraccionada para obtener nuevos derivados con caractersticas fisicas y
organolpticas diferentes y de gran inters. Los mtodos de modificacin son los citados
a continuacin.
2.1.5.1- Adicin de otras grasas
La mezcla de dos o ms grasas est ampliamente difndida en la produccin de

margarinas y otras grasas comestibles. Esta prctica es barata y puede realizarse en las
47
industrias lcteas. El mayor inconveniente es la modificacin de los caracteres

organolpticos, que no son preferidos frente a los de la grasa lctea original.
2,1.5.2- Fraccionamiento
El fraccionamiento por cristalizacin se usa ampliamente y puede separar la grasa lctea

en fracciones ms o menos slidas (Deffense, 1993). Existen tres mtodos que se utilizan
a gran escala:
1. El fraccionamiento mediante disolventes consiste en la cristalizacin de la grasa a

partir de disoluciones en disolventes como hexano o acetona. Se obtienen buenas
separaciones, pero el proceso es costoso y slo se ha demostrado rentable en el
fraccionamiento de manteca de cacao. Tambin tiene el inconveniente de la completa
eliminacin de los disolventes, con la consecuente prdida de los aromas naturales.
2. El fraccionamiento mediante detergentes se realiza por cristalizacin de la grasa

fundida al adicionar soluciones detergentes acuosas. Una centrifugacin separa la
fase acuosa junto con los cristales de la fase oleosa. El gran inconveniente de este
mtodo es la total eliminacin de los residuos de detergente.
3. En el fraccionamiento en seco la grasa se cristaliza por enfriamiento progresivo y se

separa por filtracin a vacio a partir de la grasa fundida. Este mtodo no emplea
reactivos qumicos, siendo uno de los ms adecuados, aunque es poco selectivo. El
mtodo Tirtiaux es utilizado a escala industrial. Este mtodo es muy utilizado y es
capaz de producir desde 1 hasta 5 fraccines en la grasa lctea anhidra, pero su
principal inconveniente es el tiempo de espera para que se complete la nucleacin y
crecimiento de los cristales, que est entre 8 y 12 h (Tirtiaux, 1976).
48
Cap u/o 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
2.1.5.3- Hidrogenacin
La hidrogenacin es particularmente til para elaborar grasas semislidas a partir de

aceites vegetales. La hidrogenacin se ha usado en la grasa lctea para mejorar el 2]1
2>~
mantenimiento de su calidad, si bien, presenta el inconveniente de la formacin de -1
ismeros irans.
2.1.5,4- Interesterificacin
La interesterificacin es el resultado de un reordenamiento al azar de los cidos grasos de

una grasa, producindose una nueva mezcla de triglicridos, y variando sus propiedades
fisicas. Aplicada sobre la grasa lctea, la interesterificacin proporciona una mayor
dureza, punto de fusin y contenido en grasa slida, Esta tcnica posee poco inters
porque se realiza al azar,
2.1.5.5- Biomodificacin
La adicin de enzimas para la modificacin de las grasas constituye un mtodo de

reciente uso. Normalmente se utilizan lipasas para la modificacin de aceites vegetales,
ya que los costes son altos para su aplicacin a la grasa lctea. Kemppinen y KaIo (1993)
utilizan lipasa de Pseudornonas fluorescens para la modificacin de la grasa lctea y
posteriormente realizan un fraccionamiento. La interesterificacin enzimtica tiene tajos
rendimientos. ltimamente se estudia el empleo del dixido de carbono supercrtico para
la obtencin de triglicridos estructurados.
49
~I3; < .
:z
2.1.5.6- Anlicacin de la grasa lctea modificada
Conseguir mantequillas ms fciles de untar cuando se encuentran a la temperatura del

frigorfico ha sido una de las primeras aplicaciones. Las mezclas con aceites vegetales
han sido las soluciones ms ampliamente utilizadas; si a esto aadimos que los aceites
vegetales pueden someterse a diferentes grado de hidrogenacin obtenemos una
diversidad de productos segn sus propiedades fisicas. Para obtener productos
enteramente de origen lcteo se 0pta por fraccionar la grasa en tres fracciones y utilizar
las de mayor y menor punto de fusin, Tambin se puede usar la mantequilla hidrogenada
totalmente para mezclarla con aceite de girasol y as obtener un producto bastante
consistente rico en cidos grasos poliinsaturados.
Las fracciones de alto punto de fusin se suelen utilizar en productos de bollera,

beneficindose de la consistencia de esta grasa y de su aroma y sabor. Las fracciones
liquidas a temperatura ambiente pueden utilizarse para dar consistencia ms suave a la
mantequilla y para mejorar la reconstitucin de la leche en polvo.
Las fracciones provenientes de la grasa lctea pueden utilizarse tambin en confitera.

Una aplicacin importante es la sustitucin por grasa lctea de la manteca de cacao (ms
cara) en la fabricacin del chocolate. La grasa lctea hidrogenada o las fracciones slidas
pueden ser utilizadas para evitar que los chocolates con leche sufran una separacin en
dos fases por romperse la emulsin. Se ha observado que hasta un 25% de la grasa de
algunos chocolates es de origen lcteo.
Sin embargo, el alto precio de la grasa lctea es un obstculo para el uso de sus procesos
de modificacin. Este problema se podra superar si pueden obtenerse productos de mejor
calidad,
50
.1 ~q ~
Cap(tu/o 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
2.1.6- Tecnologas para la obtencin de productos bajos en colesterol
2.1.6.1- Mtodos microbiolgicos
Algunos microorganismos como los gneros Arthrobacter, Bacillus, Brevibacierium,

Corynebacicriurn, ]vlycobacteriurn, Nocardia, Serrat/a y Slrepton2yces pueden convertir
el colesterol en productos inocuos como son el dixido de carbono y el agua (Aihara y
col., 1988). Estos mtodos an no estn totalmente desanollados para su uso. En las
condiciones estudiadas, la oxidacin del colesterol no es completa y se producen
elevados contenidos de xidos de colesterol, que se consideran ms aterognicos que el
propio colesterol. Existen otros microorganismos, como Eubacterum, que reducen el
colesterol a coprostanol, metabolito inocuo, pero la aplicacin de stos mtodos a los
alimentos no es satisfactoria (Beitz y col., 1990).
2.1.6.2- Adsorcin
El colesterol puede ser adsorbido a partir de grasa lctea anhidra utilizando carbn activo,
pudindose eliminar hasta un 95% del colesterol.
Otra tcnica, propuesta tambin en 1989 (annimo), consiste en la formacin de

complejos insolubles con saponinas.
La 13-ciclodextrmna es un oligosacrido cclico de siete unidades de glucosa. Su afinidad

por molculas apolares o de polaridad media permite la formacin de fuertes complejos
de inclusin con el colesterol. Bayol y col. (1988), Cully y col. (1990) y Roderbourg y
col. (1990) han conseguido extraer el colesterol de lpidos o aceites, nata y yema de
huevo mediante B-ciclodextrinas con xito. Oakenfiill y Sidhu (1992) describen un
mtodo utilizado en Australia que discurre a bajas temperaturas, habiendo una mnima
afectacin de los compuestos y prdida de compuestos voltiles. Cuando este proceso se
51
~. .:O:fV~~f~M~P, E
leva a cabo en huevos o productos lcteos (leche o nata) se llega a eliminar hasta un 80-
0% del colesterol total.
ji
2.1.6.3- Manipulacin de la alimentacin animal
2]
la habido intentos de alterar los niveles de colesterol en huevos y sangre de gallina por
aedio de la manipulacin de la dieta o de aditivos de la alimentacin animal. Esto it
ncluye el aumento de las cantidades de protena, adicin de salvado de avena, pectinas,
ornas, escleroglucanos, cido nicotnico, grandes cantidades de vitaminas A, C, etc.. En

~ mayora de los casos los resultados no han sido los esperados. Sim y Bragg (1977)
bservaron que la adicin de fitosteroles en la dieta de las gallinas contribua a rebajar el
olesterol sanguneo, pero elevaba el contenido en el huevo, debido a que su efecto
nticolesterolemiante era causado por una inhibicin de la absorcin del colesterol de la ji
.ieta, pero no tena efectos sobre el metabolismo del colesterol. El colesterol no puede
>12
educirse en ms de un 15% nicamente mediante la dieta, lo que hace necesario emplear

tras mtodos (Saijpaul y col., 1994). 1~
22>
2.1. 7- Anlisis de los cidos grasos de los alimentos por cromatografa de gases
a croinatografia of.rece unas grandes posibilidades de separacin y posterior

dentificacin de los cidos grasos; ms concretamente, la cromatografa de gases ha sido
~tcnica cromatogrfica que ms ha avanzado en los ltimos aos en el anlisis de los it
cidos grasos.
:1 anlisis de los cidos grasos puede dividirse en dos pasos sucesivos, que son la
reparacin de la muestra y la posterior separacin cromatogrfica.
52
2. 1.7.1. Preparacin de la muestra
La preparacin de la muestra est encaminada hacia la formacin de derivados voltiles a

la temperatura del mtodo cromatogrfico, puesto que la mayora de los cidos grasos no
son voltiles, sera imposible llevar a cabo la separacin. Tambin, la muestra ha de ser
preparada para conseguir la hidrlisis de los cidos grasos de los compuestos a los que
estn esterificados, principalmente el glicerol. Los derivados voltiles ms comunmente
utilizados son los steres metlicos, por su gran sencillez y rapidez de la preparacin. Sin
embargo, presentan inconvenientes para el anlisis cuantitativo cuando los compuestos
fonnados son extremadamente voltiles, tal es el caso de los steres metlicos de los
cidos grasos de cadena corta como el butrico, caproico, caprlico, etc.. Otro
inconveniente del uso de steres metlicos se refiere al anlisis cuantitativo de los cidos
grasos insaturados (especialmente los poliinsaturados), ya que stos se oxidan fcilmente
en el manejo de la muestra y se destruyen en el inyector por la alta temperatura necesaria
mencionado,
para los steres
una rpida metlicos
volatilizacin de los ycidos
(Shantha grasos son
Napolitano, los derivados
1992). ms lotiles
Pese a todo y
antes ~~111
tambin ms utilizados cuando los inconvenientes se superan (por ejemplo, con un patrn 4 ti
1?
interno).
Existen otros mtodos para la volatilizacin de los cidos grasos que pueden proporcionar
mejores resultados cuando stos se requieren. Pueden citarse los steres de butilo para
reducir la volatilidad de los steres de los cidos grasos de cadena corta, que pueden
mejorar los factores de respuesta en un valor de 0,3 (Iverson, 1986). Otros mtodos se
utilizan para el anlisis de cidos grasos libres y esterificados por separado (Martnez-
Castro y col., 1986; de la Fuente y col., 1993).
El anlisis cromatogrfico en s de los steres metlicos puede hacer variar los resultados
de un anlisis cuantitativo, que estn en funcin de que la esterificacin haya sido
cuantitativa antes de inyectar la muestra en el cromatgrafo de gases. Los factores a tener
en cuenta para una reaccin cuantitativa son principalmente los reactivos utilizados y el
53
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa /ctea de nata,
tiempo necesario que ha de transcurrir para la esterificacin completa. A esto hay que
aadir que el mtodo utilizado puede hacer variar la composicin de los cidos originales
durante la reaccin, aparecer nuevos ismeros geomtricos y posicionales, y artefactos
que lleven a confusin en el anlisis cualitativo de los cidos. Algunos estudios
realizados (Sheppard e Iverson, 1975, Bannon y col, 1982a y b) concluyen que no hay un
mtodo ideal entre todos los propuestos, pero que a la vez son todos igualmente
apropiados si se realizan correctamente.
Varios investigadores han indicado que los reactivos que se fundamentan en la utilizacin
de bases de alcalinos son los ms indicados para un mejor anlisis de cidos grasos por
cromatografa de gases (Bannon y col,, 1982a; 1982b; Craske y Bannon, 1987; Craske y
col., 1988). El mtodo de la potasa metanlica es muy empleado para la
transesterificacin de los acilgliceroles en steres metlicos. El empleo de este reactivo A1~ 1>
tiene la ventaja de la rapidez y sencillez y de que la reaccin puede transcurrir a
temperatura ambiente, en tales condiciones la reaccin transcurre cuantitativamente en 20 1

mm, siempre que no haya una gran cantidad de cidos (Utrilla y col., 1976) y sin fi
4 .k
problemas de isomerizacin. El colesterol y los esfingolpidos necesitan condiciones ms
drsticas para la isomerizacin (Christie, 1982). La reaccin ha de llevarse en medio

anhidro, normalmente heptano, para evitar la hidrlisis de los metilsteres y la
3??
consecuente liberacin de los cidos grasos, ya que esto resultada en una cuantifiacin [>2?>
por defecto y a temperatura ambiente para que no haya conjugacin de las insaturaciones.
En cualquier caso, el mtodo establecido ha de seguirse estrictamente para conseguir una

reproducibilidad y repetividad de ste. Se tendr en cuenta la temperatura de los
disolventes de extraccin, la agitacin manual o con instrumentos como un generador de
ultrasonidos o un vorex y cualquier paso en el mtodo que suponga una variacin en la
solubilidad o volatilizacin de los compuestos. La adecuacin del mtodo deber
probarse primero con patrones de cidos grasos de cadena corta o insaturada, que son los
que ofrecen resultados ms variables y ms difciles de reproducir.
54
2.1.7.2. Sistema cromatogrfico It
La eleccin de la polaridad de la fase estacionaria de una columna capilar de slice

fundida es un factor importante de cara a obtener una buena resolucin de los picos y una
fcil y rpida identificacin de stos en anlisis de rutina. Sin embargo, no constituye ste
un factor decisivo, como ocurre en las columnas de relleno, ya que, independientemente
de la polaridad de la fase los resultados suelen ser bastante satisfactorios cuando el resto
de condiciones del anlisis se han optimado. El nmero de las diversas fases estacionarias
es bajo silo comparamos con la mayor diversidad de fases para las columnas rellenas,
este hecho se debe a que cubre todas las necesidades de los anlisis de los cidos grasos
(Sidisky y Ridley, 1991). Se debe considerar que, silos resultados lo permiten, son
preferibles las fases de menor polaridad, ya que suelen ser de ms larga vida y ms
resistentes que las de mayor polaridad, como pueden ser las metilsiliconas.
La elucin de los steres metlicos en las columnas con fases apolares sigue un orden de
acuerdo con el punto de ebullicin, eluyendo en primer lugar los steres de menor punto
de ebullicin y por ltimo los que lo poseen mayor. Los derivados insaturados eluyen
justo antes de los saturados de misma longitud.
La gran desventaja de las fases apolares es la mala resolucin en la separacin de cidos

insaturados; por ejemplo, la elucin de los cidos oleico, linoleico y linolnico puede
verse solapada entre s, lo mismo puede ocurrir con cidos de 20 y 22 carbonos en la
cadena. Esto hace preferible utilizar fases de mayor polaridad, sobre todo teniendo en
cuenta la gran importancia que tienen estos cidos en la composicin de los alimentos y
de la leche entre ellos. Las fases estacionarias que actualmente cuentan con ms inters
son las de polaridad intermedia, como los polietilenglicoles. Su aplicacin destaca para el
anlisis de alimentos de origen marino, dada la gran resolucin que ofrecen en la
separacin de los distintos ismeros de cidos grasos insaturados (Ackman, 1986).
55
En las fases polares o de polaridad media el orden de elucin es por punto de ebullicin
cuando se trata de cidos grasos de cadena saturada lineal, posteriormente eluyen los
cidos insaturados de igual longitud por orden ascendente de nmero de insaturaciones.
Los cidos con dobles enlaces conjugados eluyen despus de sus correspondientes no
conjugados. Los cidos ramificados eluyen a tiempos ms cortos que sus
correspondientes lineales, tanto ms cuanto ms cerca del carbono col est la
ramificacin, y para ramificaciones iguales (Ackman, 1986).
El sistema de deteccin ms ampliamente utilizado es el FID (flame ionization detector) o

de ionizacin de llama. Existen otros tipos de detectores ms completos,pero los datos
que se aportan pueden ser innecesarios e insuficientes; tal es el caso de la espectrometra
de masas, que slo con gran experiencia permite diferenciar ismeros insatu.rados en lo
que se refiere a la posicin y configuracin del doble enlace y adems posee una menor
sensibilidad que el detector de ionizacin de llama.
Respecto a la grasa lctea y sus derivados hay que resaltar que, quizs, son las grasas que
ms variedad de compuestos presentan; siendo las que suponen un mayor reto para el
anlisis de los lpidos que contienen. Los cidos grasos van desde 2 hasta 26 tomos de
carbono, saturados, mono y poliinsaturados, con ismeros cis y (ram conjugados o no, y
cidos lineales y ramificados. Para muestras en las que solamente sea nesesario
identificar y cuantificar los cidos grasos esterificados, como triglicridos en su mayora,
se prefiere utilizar columnas de polaridad intennedia, dando muy buenos resultados (De
Jong y Badings, 1990). Christie (1989) resalta que la importancia econmica de la grasa
lctea ha sido en parte importante causante del avance producido en el anlisis de sus
componentes. As, ha sido posible la identificacin de 437 cidos grasos diferentes,
siendo unos pocos de ellos de inters nutricional y nicamente entre 20 y 30 de ellos son
de mayor inters para los analistas. Tambin seala que pueden presentarse problemas de
cara a la buena separacin de los compuestos, pero las mayores dificultades aparecen en
la cuantificacin. Los problemas son un conjunto de los mencionados anteriormente y son
56
1
principalmente: una transesterificacin completa sin prdidas de compuestos, la
1~
introduccin de la muestra en la columna evitando discriminaciones en las prdidas de
compuestos en la divisin de flujo y recomienda que la programacin de temperatura sea Kl
tal que los componentes de la muestra emerjan a intervalos de tiempo aproximadamente

iguales.
2.1.8- Anlisis de los trigilcridos por cromatografa lquida de alta eficacia
La tnica de HPLC en fase inversa no acuosa tiene una serie de ventajas en el anlisis de
triglicridos sobre otras tcnicas cromatogrficas. Estas ventajas hacen cada vez ms del
HPLC la tcnica de eleccin en el anlisis de los triglicridos y son las siguientes
(Hamilton, 1986):
(a) existe la posibilidad de separar los triglicildos sin necesidad de

formar derivados ni de que se descompongan por causa de altas temperaturas,
como ocurre en los anlisis por cromatografa de gases;
(b) se cuantifican de modo ms sencillo que en cromatografa en capa

fina;
(c) una vez separados, los componentes de la mezcla pueden recogerse

para contrnuar con anlisis posteriores.
El anlisis de los triglicridos de la grasa lctea supone el mayor reto en lo que se refiere
al anlisis de triglicridos ya que es la muestra de origen natural ms compleja. Patton y
Jensen (1975) ya sealaron que debido a la compleja composicin de los cidos &asos de
la grasa lctea, prodran existir 64 x 106 especies distintas de triglicridos. Si
consideramos solamente alrededor de 20 de los cidos grasos ms abundantes podra
57
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
haber 8000 especies moleculares de triglicridos incluyendo los ismeros posicionales.

,
Es por esto por lo que una muy buena separacin por HPLC no consiga a veces ~
separaciones de especies nicas, sino, ms bien, de molculas de triglicridos semejantes
(Christie, 1987).
Los primeros estudios que establecieron las bases de la investigacin tal como se lleva a
cabo actualmente en lo referido a separacin de triglicridos por HPLC en fase inversa no
acuosa fueron realizadas por Wada y col. (1977, 1978). En estos estudios se pueden
destacar dos contribuciones:
(a) la caracterizacin individual de cada especie molecular de triglicrido por

medio de lo que se denomin nmero de particin (NP), siendo,
NP=NC-2XND (2.1)
donde NC nmero de carbonos del triglicrido, exceptuando los del glicerol,

ND nmero de dobles enlaces,
(b) el establecimiento de una relacin entre el NP de cada triglicrido y el

factor de capacidad k de cada uno de los picos del cromatograma.
De este modo dedujeron que los triglicridos eluyen en orden ascendente de NP y que
para triglicridos con un mismo NP eluyen primero los de mayor ND.
El nmero equivalente de carbonos (NEC) fue defmido por Herslf y col. (1979) segn la
siguiente ecuacin:
NEC=NC-aXND (2.2)
siendo a un valor prximo a 2 dependiente del sistema cromatogrfico.
58
1>
An as, aparecen pares criticos de triglicridos que poseen los mismos NEC y ND,
constituyendo un problema en la identificacin de las especies. Las mezclas complejas de
triglicridos, cuyo intervalo de NEC es amplio, son difciles de analizar por mtodos
isocrticos, por lo que generalmente se realizan mediante gradiente de polaridad
(Robinson y Macrae, 1984; Barrn y col., 1990).
2.1.8. 1. Sistema cromatogrfico
El detector de masa o de luz difundida ha sido introducido recientemente en el anlisis de

triglicridos. Se basa en la evaporacin de la fase mvil y la medida de la luz reflejada y
refractada por las partculas slidas de soluto que se forman, La ventaja principal de este
detector es que se puede utilizar con gradientes de polaridad, hecho que no era posible
con el detector de ndice de refraccin y complicado con el ultravioleta, si bien, la
sensibilidad es menor que la del detector UV (Christie, 1991).
La composicin de la fase mvil puede variar segn el tipo de triglicridos que se vayan a
analizar y segn otras condiciones cromatogrficas, como puede ser el tipo de detector a
emplear. Generalmente se utilizan disolventes no acuosos (Barrn y Santa-Mara, 1987).
En lo que se refiere a la fase estacionaria influye la polaridad de la fase, tamao de
partcula y longitud de columna. De las columnas estudiadas, las de octadecilslice son
las de mejores resultados (Goiffon y col., 1981; Podhala y Tregard, 1982; Deffense,
1984; Barrn y col., 1987).
2.1.8.2. Anlisis cuali-cantitativo
Una dificultad a la hora del anlisis cualitativo de la muestra se debe a que existen pocos
triglicridos mixtos en estado puro que puedan ser utilizados como patrones para la
59
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa /ctea de nata.
identificacin. Para realizar esta identificacin de las especies moleculares de

triglicridos separados por HPLC se han estudiado relaciones entre el tiempo de retencin
y el nmero de particin (Wada y col., 1977; 1978), el nmero equivalente de carbonos
(Herslf y col., 1979, Frede, 1986), y la longitud de cadena equivalente (Goiffon y col.,
1981), segn la cual existe una relacin lineal entre el logk y las longitudes e
insaturaciones de cada cido graso integrante de cada triglicrido, cumplindose que:
logk=K+CMIA c<~ d~ + C15l8 cdfldB + Cicle CdCdc (2.3)
siendoK la ordenada en el origen,

A, B y C los cidos grasos componentes del triglicrido,
/a longitud de cadena de cada cido graso,
d el nmero de dobles enlaces de cada cido graso,
ci,, los coeficientes de cada variable independiente,
El mtodo de EI-Hadmy y Perkins (1981) se basa en el clculo del TCN (nmero terico
de carbonos). ste puede ser determinado para cualquier triglicrido a partir de la
regresin lineal del logk frente al NC de su correspondiente triglicrido saturado por
interpolacin de su logk. De este modo cualquier triglicrido saturado posee un TCN
coincidente con su NC y con su NEC. El factor U se utiliza para calcular el TCN de *
triglicridos insaturados y se calcula experimentalmente a partir de la diferencia en el NP

de patrones insaturados y sus correspondientes saturados tras la interpolacin de su logk.
El proceso se lleva a cabo con el clculo de las siguientes ecuaciones:
log k = a + bNPt~, (2.4)
log k = a + bNPt~~, (2.5)
~Uj NP;, -NIj~0~, (2.6)
60
rtwrr~ 19Sm
4
3
TCN= NPJ, Xu,. (2.7)
1>
*
siendo NP = NC para triglicridos saturados; en el caso de insaturados se obtiene
experimentalmente por interpolacin.
Otros trabajos, como el de Takahashi y col. (1988), proponen las siguientes ecuaciones
para la estimacin de los triglicridos:
logk MB = 2/3 logk u.,~, + 1/3 logk 8DB (2.8)
logk ABC = 1/3 logk t~AA + 1/3 logk 888 + 1/3 logk ~c~ (2.9)
siendo A, B y C los cidos grasos que componen un triglicrido.
La complejidad de la composicin en triglicridos de la grasa lctea hace que la

resolucin cromatogrfica y eJ anlisis cualitativo sean ms difciles que en otras grasas y
aceites. Por ello se realizan acoplamientos entre dos o ms tcnicas analticas como son
HPLC y OC (BalTn y col, 1990, Maniongui y col., 1991).
En este trabajo se ha conseguido una mejor estimacin de la composicin en

trglcridos de la grasa lctea por combinacin de HPLC y OC, y de modelos
matemticos basados en el clculo del NEC (a partir de NC y ND,y de NC y ND
de cada cido graso integrante de cada triglicrido), y del propuesto por Takahashi
y col. (1988).
G1
Cap/tu/o 2. Ap/bodn a la extraccin de grasa lctea de nata,
21.9- Espectroscopia de resonancia magntica nuclear de 3C de alta resolucin

en lpidos
La resonancia magntica nuclear ha tenido un uso muy Initado en el anlisis de grasas y

aceites naturales hasta recientemente, probablemente debido a la carencia de informacin
bsica de la materia y al elevado coste de los equipos.
El uso de la RMN de protn (H) ha sido muy limitado por aportar un nmero pequeo
de seales, dando poca informacin, aunque existen trabajos que utilizan su mayor
sensibilidad para la determinacin de compuestos minoritarios, como los diglicridos en
aceites vegetales y la combinacin con la 3C-RMN para realizar correlaciones
heteronucleares bidimensionales {Sacchi y col., 1991). Otros trabajos se basan en la
mejor y rpida cuantificacin de la ~I-l-RMNpara cuantificar los mono-, di- y
triglicridos por separado a pesar de que puede haber solapamiento de seales o en una
tpida caracterizacin de extractos lipdicos (Sparling y col., 1989; Sze y Jardetzky,
1990; Pollesello y col, 1991). Sin embargo, la 3C-RMN est adquiriendo importancia,
los equipos actuales llegan a ser de 300 MHz o mejores y, a pesar de su coste, son ms
asequibles, y su mayor resolucin es una herramienta ms til para la caracterizacin de
mezclas de triglicridos (1-lenderson y col., 1994).
En la tabla 2,1.9 se presentan los desplazamientos qumicos de los grupos funcionales

ms comunes en lpidos (Pretsch y col,, 1976; Levy y col,, 1980).
Tabla 2.1.9. Desplazamientos qumicos ms comunes en lpidos.
Grupo Funcional 8(ppm)

H
3C-C 0-30
C-C~C 0-30
C-C=C 10-40
C-CI-12-C 10-70
20-100
62
Capitulo 2. Aplicacin a la exfraccin de grasa lctea de nata.
tabla 2.1.9 (contuniacin

C-0H2-COX (X:C,O,N> 30-60
C-CH2-O 58-92
CH2-O-P-O 60-80
80-160
C-COX (X:C,O,N) 165- 180
C-COOH 175-185
(continuacin)
Se poseee actualmente cada vez ms informacin sobre los desplazamientos qumicos

usando especies moleculares individuales, como el linolenato de metilo representado en
la figura 2.1.9, Esto se puede aplicar a espectros ms complejos de muestras naturales
(Gunstone, 1993a; 1993c; 1994), aunque la optimizacin de los parmetros de
adquisicin y procesado de los espectros para reducir et tiempo de las experiencias, y la
comparacin de los resultados con los obtenidos por los mtodos de rutina an estn en
las primeras fases (Sacchi y col., 1992).
2.1.9.1- Estudio dela grasa lctea
La grasa lctea tiene como caracterstica el contener cidos grasos de cadena corta, que
producen seales de RMN muy caractersticas y diferentes a las de los cidos de cadena
media y larga, adems de que su solapamiento suele ser menor, Utilizando los datos de
las intensidades puede saberse la composicin molar porcentual de los cidos butrico,
caproico, caprlico, monoinsaturados, poliinsaturados, y diferenciar la presencia de
ismeros t y ttans, Existen tablas que aportan datos de desplazamiento qumico de los
carbonos Cl-C3 y wl-w3 (que son los ms definitorios a la hora de distinguir los cidos
grasos de cadena corta) y de otros carbonos de inters en grasa lctea como son los
olefinicos y allicos (Gunstone, 1993b). Este mismo trabajo realiza un anlisis de
diferentes grasas animales, vegetales y frmulas infantiles para detectar adiciones de
63
) it
CapItulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
TMS
12
>1r~
CDCI3
1
JI
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
~(ppnt)
Figura 2.1.9. Espectro de 3C.RMN del linolenato de metilo en CDCI3 con TMS como
patrn interno (Cliristie, 1990). DespazilmidlitOS qumicos: C1, 174,16; C-16, 131,92;
C-9, 130,24; C-12/13, 128,29; C.10, 127,8; C.15,127,18; -O-CH3, 51,36; C-2, 34,11;
C-7,29,63; C-415/6, 29,21 a 29,18 C-s, 27,25; C-11, 25,68; C-t4, 25,58; C-3, 24,99; C-17,
20,60; C-18, 14,29.
64
Caplu/o 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
grasa lctea, aceites lnricos, grasa parcialmente hidrogenada y cidos poliinsaturados,

sin embargo presenta los resultados de manera semicuantitativa.
2.1,9.2- Estudio de aceites vegetales
Los compuestos de mayor inters y sencillez de identificacin y cuantificacin son los

cidos grasos insaturados tras la asignacin de los carbonos olefinicos, alilcos y
divinilmetilnicos. Tamben se pueden cuantificar los cidos grasos libres separadamente
de los esterificados y los compuestos de la fraccin insaponificable. La mayorfa de los
estudios se han realizado para detectar mezclas de aceites de oliva vrgenes y refinados
(Sacch y col., 1990), determinacin de diglicridos (Sacchi y col., 1991), distribucin
posicional de los cidos grasos de los triglicridos de aceite de oliva (Saech y col.,
1992), que pretende utilizar la RMN para detectar mezclas de aceites de oliva virgen con
aceites esterificados sintticamente evitando procedimientos qumicos para la preparacin
de la muestra. El trabajo de Zamora y ccl, (1994) consisti en la caracterizacin de la
fraccin insaponificable de aceites de oliva y orujo de ojiva, aportando datos sobre los
desplazamientos qumicos del escualeno, esteroles y alcoholes triterpnicos. Los mtodos
de resonancia pueden ser muy tiles para usarlos como referencia en mtodos
enzimticos de rutina, pero no como mtodos de rutina debido a la duracin de las
experiencias y, sobre todo, al coste requerido de los equipos.
Otros estudios se encaminan a la caracterizacin de aceites ricos en cidos grasos de uso

en fabricacin de pinturas, plsticos, sntesis qumica o estudios metablicos, como el
trabajo de Neff y col. (1993) para la caracterizacin de ceites de semillas de Vernonia
galarnensis y Crepis alpina, ricos en cidos vernlico y crepnico respectivamente.
65
CapItulo 2, Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
2.1.9.3- Estudio de aceites de pescado
Los aceites de pescados ms estudiados han sido los de salmn (Aursand y col., 1993) y
atn (Sacchi y col., 1993), ya que son ricos en cidos eicosapentaenoico y
docosahexaenoico, cidos grasos poliinsaturados de la familia (n-3). Estos cidos grasos
presentan seales con desplazamientos qumicos caractersticos en las regiones olefinicas
y carbonlicas, y al presentarse en alta cantidad pueden ser cuantificados y comparados
satisfactoriamente con mtodos convencionales de anlisis como la OC. Sacchi y col.
(1993) adems realizan una caracterizacin del aceite del atn y cuantifican los cidos
grasos libres, la distribucin posicional ct-~ de los cidos grasos poliinsaturados
esterificados a glicerol y la concentracin de fosfolpidos.
p
si
Ii
1>
1<
66
VV. u;cflT.:us?.u.uIiu,wPwnnI
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de traa
ESTIMACIN DE LA COMPOSICIN EN TRIGLICRIUOS DE LA GRASA

LCTEA
2.2- MATERIALES Y METODOS
221- Preparacin de la muestra
La leche cruda de oveja fue proporcionada por el Complejo Agropecuario de la

Zomunidad de Madrid situado en Aranjuez.
a extraccin de la nata se lleva a cabo calentando la leche en un bailo de agua a 3 5-40

>C darante 20-30 mm. Posterionnente, la nata se separa por centrifugacin a 20 0C
lurante 30 mm a 3000 r.p.m.. Los tubos que contienen la leche centrifugada se ponen en
ma bao de hielo hasta que la nata se ha solidificado, recogindose y guardndose en
..ongelador a -20 0C hasta su posterior anlisis.
~a extraccin de los triglicridos se llev a cabo segn un trabajo de Barrn y col.

1990). Un gramo de nata se deposita en un matraz al que se aade el disolvente de
~xtraccin ii-hexano (Panreac), conteniendo BHT (Fluka) como antioxidante en urna
~oncentracinde 0.1 mg/mL, en una relacin de 10/1 (mL/g). La mezcla se homogeniza
rn un bao de ultrasonidos y se introduce en un embudo de decantacin, al que se aade
sanol (Panreac)-agua destilada (80:20, vol/vol) en una relacin 3/2 respecto al volumen
Le ii-hexano utilizado. La mezcla se agita enrgicamente y se deja reposar hasta la
.ompleta separacin de las fases. La inferior, hidroalcohlica, se lava dos veces con ti-
iexano. Los lavados con hexano se aaden a la fase orgnica inicial.
4a fraccin orgnica se filtra con papel Wathman LPS y se concentra a sequedad en

orriente de nitrgeno. El residuo triglicrico (alrededor de 0,50 g) se redisuelve en 2 ml
.e hexano y se filtra a travs de membrana de tamao de poro 0,2 .mm. Se inyectan 10 j.it
67
>3

1>
de la disolucin para el anlisis por cromatografla lquida de alta eficacia. Para la

recogida de fracciones a la salida de la columna se inyectaron volmenes de 20 gL,
2.22- Anlisis de triglicridos de grasa lctea por cromatografa lquida de alta

eficacia
El mtodo de cromatografia lquida de alta eficacia utilizado para el anlisis de los

triglicridos se bas en uno previamente desarrollado por Hierro y col. (1992) y Hierro
(1994). El sistema cromatogrfico utilizado consisti en dos bombas modelo 125
(Beckman), un inyector Rheodyne modelo 7125 con un bucle de carga de l0.tL, se
utilizaron dos columnas de acero inoxidable de 25 cm y 15 cm x 4,6 nun de di. rellenas

con Spherisorb ODS-2 de 3 hm de dimetro (Phase Separations, Synita) conectadas en
serie y termostatizadas en un bao de agua a una temperatura de 30 0C. Se utiliz un
detector de masa (ACS 750/14, The Arsenal) con una temperatura en el evaporador de 45
0C y 138 kPa de presin de aire. El aire a presin era proporcionado por un compresor
(Mr Control) y posteriormente secado por dos trampas de agua. Los vapores formados en
el detector eran eliminados mediante un extractor. La deteccin de patrn de tributirina
para el estudio del NEC se realiz bajando la temperatura del evaporador del detector
hasta 20 0C.
La fase mvil consisti en una elucin en gradiente desde O a 70% (vol/vol) de acetona en
acetonitrilo (ambos de grado HPLC) en dos etapas: un inicial aumento lineal de 0,70/o/min
en acetona durante 50 mm seguido de elucin isocrtica durante los siguientes 20 mlii, y
un segundo aumento lineal de 0,7%/mm de acetona en acetonitrilo seguido tambin de
una elucin isocrtica de 42 mm hasta el final del anlisis. El flujo empleado> fue de 0,9
mL/mm y la presin de 17,2 MPa. El gradiente y la adquisicin de datos provenientes del
detector se controlaron con el programa System GoId (Beckman) a travs de una interfase
modelo 406 (Beckman).
68
a
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa /ctea de nata.
~
223-Recogida de fracciones 1
La recoleccin de fracciones a la salida del sistema cromatogrfico fue necesaria para
realizar un posterior anlisis de cidos grasos tras la separacin por HPLC, con el fm de
identificar las especies moleculares mayoritarias de triglicridos. El carcter destructivo
del detector de masa hizo necesario la toma de fracciones en un punto anterior a ste y su
cronometracin basndose en inyecciones previas, puesto que no es posible [a
adquisicin de datos.
Las fracciones se recogieron cada 40 s a la salida de la columna a partir del minuto 14 (ya
que anteriormente a este tiempo no hay todava elucin de compuestos), de tal forma que
no hubo recogida de ms de un pico cromatogrfico estrecho por fraccin y que picos
anchos pudieron ser recogidos en fracciones sucesivas.
En total se recogieron 227 fracciones de I-IPLC conteniendo triglicridos disueltos en la

fase mvil. Estas fracciones se guardaron en congelador hasta su anlisis por
cromatografia de gases.
2.2. 4- Anlisis de los cidos grasos de triglicridos de fracciones F-IPLC por

cromatografa de gases
2.2.4.1- Preparacin de la muestra
Los triglicridos separados mediante HPLC y recogidos en fracciones se hidrolizaron

para analizar sus cidos grasos constituyentes como steres metlicos (FAME).
69
Capitulo 2. AplicacIn a la extraccin de grasa lctea de nata, jjdt
~I
i1~1~1 f1:
1
Los triglicridos contenidos en las diferentes fracciones se depositaron en viales de fondo 1

cnco de 1 mL de capacidad para favorecer la concentracin de la muestra y se llevaron
a sequedad por evaporacin de la acetona y acetonitriilo mediante una corriente de
nitrgeno.
La preparacin de la muestra fue una modificacin de los mtodos descritos por Utrilla y
col. (1976) y Barrn y col. (1990>. El mtodo se basa en la formacin de steres metlicos
de los cidos grasos, derivados voltiles en las condiciones de anlisis. Las
modificaciones realizadas tuvieron como fines una mayor concentracin de la muestra en
el disolvente de inyeccin y alargar el tiempo de inyeccin hasta 100 mm. En el vial
cnico conteniendo los txiglicridos se adicionaron 20 hL de n-heptano (MerlO y 10 uL
de KOI-1 2N en metanol. La mezcla se agit en ultrasonidos durante 1 mm. Se inyect 0,1
pL de la fase heptnica conteniendo FAME tras 20 niin.
La tripelargonina se utiliz como patr interno ya que sta no era detectada en los anlisis
de las muestras.
2.2.4.2- Sistema cromatogrfico
El anlisis de los cidos grasos de los triglicridos de las fracciones recogidas se realiz
en un crornatgrafo de gases HRGC 5160 Mega Series (Carlo Erba) equipado con un
detector de ionizacin de llama (FID) y un inyector con posibilidad de divisin de flujo
(sp/ii/spliI/ess).
Se utiliz una columna de slice fundida de 24 m x 0,23 mm de di. recubierta con SP-
1000 (Supelco), cuyo espesor de fase era de 0,25 p.m. Como gas portador se utiliz N2 a
0C, detector a
40 kPa de presin. Las condiciones fueron las siguientes: inyector a 275
250 0C, temperatura inicial de la columna 40 0C mantenidos durante 4 mm, seguida de
70
1v >1
>3
una rampa de temperatura de 10 0C/min hasta alcanzar los 150 0C, y otra de 2 0C/min
hasta 200 C y esta temperatura se mantuvo durante 60 niin hasta el final del anlisis. Los
cromatogramas y los resultados se procesaron mediante un integrador Spectra-Physics
modelo Data Jet.
La duracin del anlisis permiti la buena separacin de los cidos grasos de la muestra
ya que la mayor sensibilidad del equipo utilizado permiti la deteccin de cidos grasos
minoritarios como los ramificados, los de cadena impar y los ismeros de linoleico y
linolnico.
La pequea cantidad en la que se encontraban los triglicridos a la salida de la colunma

del HPLC hizo necesaria la inyeccin sin divisin de flujo (splless) y su mantenimiento
durante 20 s para permitir la entrada de la totalidad de la muestra en la columna. Tras este
tiempo el flujo de split fue de 40 mL/mm.
2.2.4.3-Anlisis cualitativo
La identificacin de los cidos grasos que constituan los triglicridos de las distintas
fracciones de HPLC se llev a cabo mediante la comparacin de los tiempos de retencin

con los obtenidos en el anlisis de una mezcla de patrones de cidos grasos. La
identificacin de cidos grasos ramificados, de cadena impar y los insaturados
minoritarios no fue posible con patrones y se recurri a la bibliografa existente (Antila y
Kankare, 1983; De Jongs y Badings, 1990).
Los paflones utilizados tenan una pureza de aproximadamente del 99% y fueron los
siguientes:
- esteres metlicos de los cidos butrico, caproico, caprlico, cprico, lurico,

mirstico, palmtico, esterico, oleico, linoleico y araquidico (PolyScience Corporation),
71
1
Cap(tu/o 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
1>~
- steres metlicos de los cidos lrans-vaccnico y a-linolnico (Sigma Chemical).
2.2.4.4- Anlisis por cromatografia de 2ases acoplada a esuectrometria de masas

(OC/MS
Para el anlisis por OC/MS se inyectaron muestras de triglicridos de grasa de leche de

oveja con el fin de confirmar la identificacin de cidos grasos de asignacin dudosa. Sin
embargo, algunos estudios, como el de Christie (1989) indican que no siempre los
derivados metlicos son indicados para la identificacin mediante la MS, adems insiste
en que sta sea la tcnica espectroscpica ms dependiente de la experiencia del
investigador para la identificacin de estructuras moleculares y que no hay reglas estrictas
en la rotura de las molculas. Christie tambin seala que, en el caso de la elucidacin de
cidos grasos insaturados, no se forman iones que sirvan de indicacin para la
localizacin o estereoqumica de los dobles enlaces en los ismeros de posicin,
debindose a una posible migracin de stos cuando se forma el ion molecular y dando
numerosos productos intermedios y consiguientemente iones muy diversos. En el caso de
los cidos poliinsaturados, sus espectros ofrecen iones con varias intensidades, pero no
puede decirse que sirvan para la interpretacin de la posicin de los dobles enlaces.
Nonnalmente, se considera que la ventaja de la CC/MS se debe a que aporta datos sobre
los pesos moleculares de los compuestos junto a los de los tiempos de retencin, lo que se
puede considerar bastante satisfactorio. La dificultad en la identifiacin se extiende
tambin a los cidos grasos de cadena ramificada, y sobre todo a la hora de discernir
entre ismeros SO y anletw.
La preparacin de la muestra consisti en la extraccin de triglicridos por el mtodo

descrito en el apartado 2.2.1 y posterior formacin de los steres metlicos de los cidos
grasos segn el apartado 2.2.4.1.
72
)
El equipo utilizado fue un cromatgrafo de gases 5890 Series II acoplado a un

espectrmetro de masas 5971A, ambos Hewlett-Packard. Las condiciones del mtodo de
inyeccin fUeron las mismas utilizadas en el apartado 2.2.4.2 excepto que el gas portador
utilizado fue helio.
2.24.5- Anlisis cuantitativo
La cuantificacin de los cidos grasos se realiz siguendo la tcnica del patrn interno. Se
utiliz tripelargonina como patrn debido a que sta no se encontraba en cantidades
detectables en las muestras inyectadas y a que era el compuesto de estructura ms
semejante a los cidos grasos de cadena corta, y por tanto ms voltiles, presentes en la
eche (butrico, caproico y caprlico).
Asimismo, tambin se observ que se producan menores respuestas de los cidos grasos
insaturados, por lo que se decici utilizar otro patrn interno para su cuantificacin. Se
tom el propio cido palmtico de la muestra como padrn interno de estos compuestos
ya que en la zona de elucin prxima no era posible utilizar ningn compuesto
inexistente en la muestra sin que coeluyese con los ya presentes. Adems, el cido
palmtico es el ms abundante en la leche, por lo que quedaba asegurada su presencia en
la mayora de fracciones de HPLC y prcticamente no sufra modifiaciones durante la
preparacin de la muestra o inyeccin, por lo que se consider que tena un factor de
respuesta (Fr) de 1 respecto al cido pelargnico.
Del mismo modo, se asign al patrn interno y resto de cidos grasos presentes en la
muestra (cidos grasos de cadena media y larga saturados lineales y ramificados) un Fr =
1.
73
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nato.
Para el clculo del factor de respuesta de los cidos grasos de cadena corta o insaturada
se prepararon soluciones patrones de los siguientes compuestos en las siguientes
cantidades:
- 150 ig/mL de tripelargonina y tripalmitina,

- 10, 15, 50, 75, 100, 150, 225 y 300 ng/mL de tributirina, tricaproina, tricaprilina,
trioleina, trilinoleina y trilinolenina.
Las soluciones se inyectaron 5 veces y se procedi al clculo del factor de respuesta y la

desviacin estndar relativa. El factor de respuesta se defmi como:
F~ (2.10)
siendo:
F~ el factor de respuesta del compuesto i,
Q la concentracin del compuesto /,
Gp, la concentracin del patrn interno,
A1 el rea del compuesto /,
A~, el rea del patrn interno.
2.2.5- Desarrollo de modelos matemticos
Se inyectaron en el HPLC y por quintuplicado soluciones de los siguientes patrones:

tributirina, ticaproina, tricaprilina, tripelargonina, tricaprina, trilinolenina, trimiristoleina,
trilaurina, 1 ,2-dilauroil-3-miristina, tritridecanoina, 1 ,2-dinristoil-3 -laurina, trilinoleina,
dimiristol-3 -palmitina, tripentadecanoina, 1 ,2-dipalmitol-3-miristina, trioleina, 1,2-

dioleoil-3 -palmitina, 1 ,2~dipalmitol-3-Olena~ tripalmitina, 1,2-dioleol-3 -estearina, 1-
74
... y Ir~-.
estearol-2-oleol-3-palmitina, 1 ,2-diestearol-3-miristina, trimargarina, 1,2-diestearoil-3 -
olena, 1 ,2-diestearol-3 -palmitina y triestearina.
La inyeccin de estos patrones permiti el clculo del factor de capacidad (k) a partir de
sus tiempos de retencin (tr) y el tiempo muerto (to).
A partir de estos datos y del nmero de carbonos, NC. y nmero de dobles enlaces, ND,
de cada triglicrido arriba indicado se realiz un anlisis de regresin lineal mltiple
(ecuacin 12) mediante el programa IR de BMDP (Statistical Software Inc.).
Posterionnente se calcul el NEC de los triglicridos puros utilizados como patrn
(ecuacin 14) y por ltimo se realiz otro anlisis de regresin lineal de logk en funcin
del NEC (ecuacin 15) (iR BMDP). Los clculos a seguir fueron los siguientes:
13 (2.11)
logk=a+bNC+CNII (2.12)
o <2.13)
a
NEC=NC+a>ND (2.14)
logk%d+eNECEJt (2.15)
siendo EE el error estndar de la regresin.
Se puede estimar el k de un triglicrido dado y viceversa, el NEC que corresponde a un

pico.
75
Debido a que al realizar un anlisis de regresin siempre se produce un error (EE) se

decidi calcular un NEC mximo y un NEC mnimo que delimitaran un intervalo para un
valor de k:
NEQ~ Iogk~~d~EE; (2.16)

e
NECniat = ogk d+EE; (2.17)

e
Se aplicaron tambin los modelos desarrollados por Takahashi y col. (1988), lo que
oblig a la inyeccin de patrones de triglicridos heterogneos y homogneos. Se
utilizaron los tiempos de retencin de los patrones en el anlisis por regresin lineal (IR
BMDP) para conseguir el cumplimiento de las siguientes ecuaciones:
logk A.AB = 2/3 logk ~j~ + 1/3 logk BBB, (2.18)
logk ABC = 1/3 logk MA + 1/3 logk BBB + 1/3 logk ~ (2.19)
Los patrones utilizados fueron los recogidos en la tabla 2.2,4.5.
76
41
~4 3
41
Captulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
Tabla 2.2.4.5. Triglicridos puros utilizados como patrones para el

desarrollo de los modelos de Takahashi y col. (1988).
_____ AAA BBB CCC

LaLaM LaLaLa MMM
MMLa MMM LaLaLa
LL0 LLL 000
MMO MMM 000
MMP MMM PPP
AAB PPM PPP MMM
OOP 000 PPP
PPO PPP 000
008 000 Sss
SSM SSS MMM
SSO SSS 000
sSP SSS PPP
ABC OPS 000 PPP SSS
Los triglicridos del aceite de soja estn perfectamente caracterizados (Barrn, 1989), ya
que posee nicamente 14 especies moleculares detectables mediante el mtodo de HPLC
utilizado. De los 12 triglicridos heterogneos, 4 poseen los tres cidos grasos distintos.
Por tanto, se realizaron inyecciones de aceite de soja, del mismo modo que la inyeccin
de patrones, para obtener ms datos que proporcionaran mejores resultados.
Tambin se desarroll el mtodo de Goiffon y col. (1981) para el clculo de la longitud

de cadena equivalente. De este modo se pretendi obtener el mayor nmero de modelos
posibles que apoyasen y facilitasen la estimacin de los triglicridos.
Se inyectaron mezclas de patrones de FAMEs (PolyScience Corporation) en el HPLC con

el fin de establecer una relacin entre los tiempos de retencin de estos steres y de los
triglicridos y sus constantes moleculares mediante el programa lR (BMDP) de regresin
77
0

lineal mltiple, Los patrones se disolvieron en acetona y se inyectaron pci triplicado cada
una de las disoluciones siguientes:
- FAMEs de C4:0, C6:0, C7:0, C8:0, C9:0, CLO:0, C1l:0, C12:0 y C14:0,
- FAMEs de C16:0, C1S:O, CE:! (O), C18:2 (L), C18:3 (Ln), C20:0 y C22:O
disueltos al 10% en etilbenceno,
- mezclas de ambas disoluciones,
Se intercal un detector UV (LDC Analytical) a 210 un entre la columna de HPLC y el

detector de masa para mejorar la deteccin de los FAMEs ms voltiles. Sin embargo, fue
necesario el uso del detector de masa para la deteccin de los FAMEs de mayor peso
molecular porque el gradiente de acetona produca una fuerte deriva de la lnea base en el
detector Uy.
2.26- Estimacin de a composicin en triglicridos de la guiso de leche de

oveja
La composicin en triglicridos se estim segn una modificacin del mtodo descrito

por Barrn y col. (1990), basado en el clculo del NEC a partir de los kW de los picos
cromatogrficos de HPLC y en la composicin molar en cidos grasos en cada fraccin
recogida a la salida de la columna y analizada por OC y teniendo en cuenta que las tres
posiciones de los cidos grasos en el glicerol son equivalentes, hecho que se justifica
porque el anlisis por HPLC no separa ismeros de posicin (Bailey, 1951; Hersldf y
Kindmark, 1985; Perrin y Prvot, 1986).
Para el tratamiento de los datos en la estimacin de la composicin los triglicridos se

cre un programa informtico en lenguaje QuickBasic (Anexos 1 y II), en el que a partir
de los datos de reas de los cidos grasos presentes en cada fraccin y los NEC
78
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa (dciea de nala,
1~
correspondientes a cada tiempo se obtuvieron los triglicridos posibles en mayor

proporcin en cada fraccin.
22.7- Comparacin de la composicin en triglicridos de la grasa de leche de

oveja, cabra y vaca.
La leche cruda de vaca (1 muestra de 250 mt) para el estudio de comparacin fue
proporcionada por la granja diplomada La Chirigota, en Villanueva del Pardillo
(Comunidad de Madrid); la leche cruda de cabra (1 muestra de 250 mt) se obtuvo de la
granja Queseras Ibricas, en Fuenlabrada (Comunidad de Madrid). La leche oveja se
obtuvo segn se explica en el apartado 2.2.1.
La fraccin triglicrica de la leche de las tres especies animales se extrajo del modo
indicado en el apartado 2,2.1 y posteriormente se realiz un anlisis por HPLC segn se
ha indicado previamente en el apartado 2.2.2.
La aplicacin del programa de desconvolucin de picos permiti que stos fueran

agrupados de acuerdo con sus constantes moleculares. Las especies moleculares se
agruparon segn su NEC en NEC =34; 34 <NEC =40y NEC > 40.
7.9
2.3- RESULTADOS Y DISCUSIN
2.3.1- Anlisis de los cidos grasos de triglicridos de fracciones de HPLC por

cromatografa de gases
2.3.1.1- Anlisis cualitativo
El anlisis de los cidos grasos de la grasa lctea por cromatografia de gases permiti la
separacin e identificacin de 43 especies moleculares distintas (figura 2.3.1.1). Con
estos resultados se destaca el gran nmero de distintos cidos grasos constituyentes de los
triglicrides de la grasa de la leche, hecho que dificulta la identificacin de estos ltimos.
Los cidos grasos mayoritarios son los de cadena saturada par junto con oleico y
linoleico, pero tambin se detectaron cidos grasos de cadena impar, tanto saturados
como insaturados, ramificados, e ismeros de los cidos oleico, linoleico y linolnico.
Suponiendo que los cidos grasos se esterificaran al azar a la molcula de glicerol, las
especies posibles sedan 433 79.507.
2.3.1.2-Anlisis yor GC/MS
Los resultados obtenidos inediente el anlisis de los cidos grasos por CC/MS sirvieron
para confirmar la identificacin de algunos cidos grasos de asignacin dudosa, en
especial los cidos de 19 y 20 carbonos y los insaturados de 18. El ion molecular del
espectro de masas nos aport informacin sobre los pesos moleculares de los diferentes
compuestos, de este modo se pudo averiguar sin ninguna duda el nmero de carbonos y
de insaturaciones de los cidos antes mencionados. Sin embargo, no fue posible
determinar la posicin de los dobles enlaces en la cadena hidrocarbonada ni su isomeria
cis-lrans.
80
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cd ~ t
C) ~ C~
u ~

81
4;~ r%~
La utilizacin de helio como gas podador en el mtodo desarrollado, que utiliza

nitrgeno, produjo una disminucin de los tiempos de retencin y por ello la resolucin
empeor; no obstante, el nmero de picos y su orden de elucin no vari.
En la figura 2.3. 1.2a se presenta un cromatograma de la corriente total de iones (TIC)

obtenido mediante el anlisis OC/MS, en l aparecen los steres metlicos de los cidos
grasos. En la mayora de los casos fue posible la completa caracterizacin de los
compuestos, gracias a la comparacin con patrones, sin embargo, en el resto solamente
pudo obtenerse infonnacin de sus nmeros de carbonos y de dobles enlaces. En las
figuras 2.3.1.2b y 2.3.1.2c se ofrece una ampliacin de la TIC entre los 30 y 50 mm del
anlisis GC/MS y las corrientes de los iones 268, 284, 292, 312, 310 y 294,
correspondientes respectivamente a los iones moleculares de los steres metlicos de los
cidos C16: 1 (el segundo de ellos corresponde al cido palmitoleico), C17:0 (ramificados
y lineal, respectivamente), linolnico, nonadecanoico, nonadecenoico, y C18:2 (el
segundo colTesponde al cido linoleico). Esto nos ha permitido asignar los tiempos de
retencin de compuestos con distinto peso molecular.
82
Captula 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
o
-O
o
-d
40 u
0
o
ca
o
o
o ca
o
o
ca
o
u
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42
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.0
83
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41?
4
Ahu3ndpncln Cap4$fy 2. A4licacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
1 .Se-07
1.4 0-4-07
1 .2o-07
1 e-.-07
6000000
6000000
4000000
2000000
44.00 46.00
32.00 34.00 36.00
Ion 268
Abundancia
e coco
76000
70000
e ecco
coceo
Sao 00
50000
46000
.40000
26000
acoco
26000
SL4..
20000 1
46000
icaco
6000] 1
Tiempo ....>0 $400 36,00 asco 40.00 4~.O0 44.00 46.00 40.00
Ion 284
Abundancia
200000 -
-. 0 0000.
,00000.
1 70000 -
100000 -
1 60000 -
1.40000 -
1 30000 -
120000 -
-, 1 0000
100000.
00000 -
60000
70000.
00000-
00000-
.40000-
30000
20000
Tiempo
10000
-4o-
-
32:00 3-4.00
J[
30.00 30.00 .0.00
.00 40,00 .40.00
fs
84
Figura 2.3.I.2b. Corriente de los iones 268 y 284 por OC/MS
2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata
-7wunoancIa
1 .6e>~07
1.40+07
1 .2o-.-O7
1 04-07
8000000
6000000
4000000
2000000
o 42.00
32.00
Ion 292
Abundancia
= 0000
$0000
1 0000
1 0000
0000
liempo .40
Abundancia Ion 312

acoco
~ 1
1 0000 -~
0000 ] 00 -4000 <40O~

Tiempo -~ 33,00 3<4 OC> 30 00 OS.00 .40.00 .43.00
Abundancia Ion 310 A

30000
$0000
10000
<0000
0000
Tiempo ...*0
33 00 3-400 30300 SS.0o -40.00 .42.00 .00 .40.00 S.00
Ion 204
Abundancia
160000
1-40000
130000
120000
110000
100000
00000
00000
70000
00000
60000
40000
00000
20000
0000
Tiempo -4 32.00 34.00 30.00 3fl.O0 40.00 42.00 44.00 40.00 40.00
85
Figura 2.3.1 .2c. Corriente de los iones 292, 312, 310 y 294 por OC/MS
.

2.3.1.3- Anlisis cuantitativo
En todos los casos se inyectaron los patrones por quintuplicado. Los resultados de los
clculos del factor de respuesta segn se indic en el apartado 2.2.4.5 y sus desviaciones
estndar relativas, que hacen referencia a la precisin del mtodo de anlisis, fueron los
siguientes:
cido Graso F CV(%

Butrico 4,20 5,38
Caproico 2,10 3,34
Caprlico 1,61 1,93
Oleico 1,09 4,00
Linoleico 1,15 4,05
Linolnico 1,15 4,28
En la tabla 2.3.1.3 se ofrecen los porcentajes en que se encuentran los cidos grasos de
los triglicridos mayoritarios estimados en la grasa total de la leche de oveja. Los
resultados del anlisis de la grasa de oveja demostraron que los cidos mayoritarios son el
palmitico, mirstico y oleico por este orden, pero tambin es importante la cantidad en la
que se encuentran los cidos de cadena corta y media (4 a 12 carbonos). El cido
vaccnico se encuentra en una concentracin mayor a la de otros cidos insaturados como
el miristoleico, palmitoleico y linollico, siendo el tercer cido insaturado en importancia
por su proporcin. Tambin es de destacar la alta concentracin en que se encuentran los
cidos grasos de cadena impar (sobre todo lineal, pero tambin ramificada) en
comparacin con otros tradicionalmente considerados en la estimacin de la composicin
de la grasa lctea, como es el cido linolnico.
86
)
y
Tabla 2.3.1.3. Porcentajes de los cidos grasos mayoritarios.
c. Graso c. Graso o/o
Bu 7,36 PS 1,03
Co 6,50 alMa 0,18
CI 4,07 Ma 0,31
Ca 8,55 Ma 0,34
La 7,82 5 6,75
M 16,05 o 10,52
MI 1,08 y 1,36
aiPd 0,23 L 1,82
Pd 1,29 Lii 0,14
P 24,62
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Ramos y Jurez (1986b).
Posteriormente se procedi a la inyeccin de las 227 fracciones recogidas a la salida de la
columna de HPLC para la cuantificacin de los cidos grasos. Los datos que se
obtuvieron se procesaron el programa de estimacin segn el apartado 2.3.3 para obtener
las posibles molculas de triglicrdos presentes en cada fraccin.
2.3.2- Anlisis cualitativo de/os triglicridos de/a grasa de leche de oveja
2.3.2.1- Aplicacin de modelos matemticos
El tiempo muerto del anlisis HPLC se calcul a partir del volumen muerto estimado a
partir de la ecuacin (20), ya que las sustancias que apenas sufren retencin en las
columnas no son detectables debido a su volatilizacin a las temperaturas de anlisis del
evaporador:
87
f~ t
= ~kteta>oi ~>Agw 11% (2.20)

P Metano) PAgita
Siendo:
Yo el volumen muerto, ni la masa de la columna con metanol o

to el tiempo muerto, agua,
~el flujo, p la densidad.
El volumen muerto te de 2,54 mL, que con el flujo de 0,9 mt/mm del mtodo de HPLC
dieron un tiempo muerto dc 2,82 mm.
Los resultados obtenidos para la ecuacin (2.12) tomando datos de todos los patrones de
triglicridos proporcionaron valores bajos del coeficiente de determinacin (r2):
log/c = -0,34074 + 0,04 176NC 0,0699ND, - ?=0,9390; (2.21)
y una no adecuada distribucin de los residuos (figura 2.3.2. la), por lo que no se pudo
asumir que la regresin fuese lineal.
La aplicacin del modelo de Takahashi y col, (1988) ofreci los siguientes resultados:
logk ~ 0,15451 + 0,6287 logk%~+ 0,2770 logkBBB, =0,9961; (2.22)
logk,nc= 0,17554 + 0,6002 logk~+0,0342 logkBEB+O,2629 logk~cc,

= 0,9992. (2.23)
En la primera de las regresiones (2.22) los resultados de los ceoficientes son semejantes a
los esperados (2/3 para el primero y 1/3 para el segundo) y el coeficiente de
determinacin es prximo a la unidad. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los
88
Capitulo 2, Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata.
+
0,1
+ +,
0,0
o
u
O
++*
-0,1 ++
+
-0,2
* +
-0,3
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
Valores previstos de logW
Figura 2,3.2.la. DIstrIbucIn de residuos obtenida al utilizar Lodos los patrones de triglicridos
0,06
0,04
0,02
0,00
1
+
-0,02
t
-0,04
.0,06
+
.0,08
.0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
Valores provistos de io
8k
Figura 2.3.2.ld, DistribucIn de residuos tras el au,lisi5 de los patrones que eluyen durante
el ,rinser gradiente e socrtico
0,04
0,02
0,00
-0,02
-0,04
-0,06
1,40 1,45 1,50 1,55 1,60 1,65 1,70 1,75 1,80
Valores provistos de iogk
Figura 2.3.2.le. Distribucin de los residuos tras el anlisis ~lelos patrones que eluyen durante 89
el segundo gradiente e [socrtico
patrones de triglicridos homogneos que pudieron utilizarse fueron tan slo 6 para 12
triglicridos heterogneos y que no pudieron conseguirse datos para tiempos anteriores al
minuto 75 (t, del LaLaM). Los resultados tras la aplicacin de los datos a la segunda
ecuacin (2.23) no fueron los deseados, los coeficientes deberan ser todos semejantes a
1/3; el hecho de tener un coeficiente de determinacin tan elevado es slo una
consecuencia de haber utilizado un nico patrn heterogneo (OPS).
La figura 2.3. l.2b muestra un cromatograma de aceite de soja. Al ampliar los datos
disponibles con la utilizacin del aceite de soja, los resultados fueron:
IogkAn 0,12801 + 0,6257 logk~~ + 0,2962 logk88n, ~2 = 0,9971; (2.24)
logkABC = 0,01969 + 0,1393 logk&v, + 0,3931 logkBBB 0,4433logkccc,

2=zO,9961. (2.25)
r
Estos resultados no mejoraron los anteriores. De este modo se demostr que el modelo de
Takaihashi y col. no se adecuaba al mtodo cromatografico utilizado en este estudio y se
vio imposibilitado su uso para la estimacin de los triglicridos de la grasa lctea.
La figura 2.3.2. lc muestra un cromatograma de FAMEs por HPLC con sus tiempos de
retencin y con los registros para los dos detectores utilizados. Se puede observar que el
orden de elucin es idntico al de los triglicridos a pesar de que la retencin sea menor.
En primer lugar se obtuvo una ecuacin lineal que relacion la retencin croinatogrfica
de los FAMEs con sus constantes moleculares, dando buenos resultados:
logk = -0,47750 + 0,07356NC 0,1558ND,? = 0,9934.

- (2.26)
90
Captula 2, Aplicacin a la extraccin de grasa lactea de nota.
o
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N Cfl E
4-
o
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00.<0
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N
o
91
u r ~ &f~9U~fm
~
Posterionnente se realizaron regresiones entre los factores de capacidad de los FAMES y

los triglicridos segn la siguiente ecuacin:
logk <i~o = alogk FAMEI + hlogk FAME2 + clogk FAME3, (2.27),
procediendo del siguiente modo:
logkFAME = -0,468 + 0,0732NCpAMp 0,1S8NDFAME; (2.28)

-
logkTci = l,l6l3logkFAMEI + l,ll4SlogkFAME2 + OlogkFa,4E3; (2.29)
pero los resultados no fueron satisfactorios debido a que los FAMEs ehifan durante el
primer gradiente, y los triglicridos lo hacan durante todo el mtodo (para el estearato de
metilo t. = 24,24 mm, eluyendo durante el primer gradiente, para la SSS t. = 160,90,
eluyendo en el segundo isocrtico). Adems, ya que exista una repetin de datos para el
caso de triglicridos homogneos y heterogneos (del tipo AAB) se produca una
desestimacin de unas variables por otras debido a las fuertes correlaciones entre estas
variables, consideradas corno independientes.
La aplicacin del mtodo de Ooiffon y col. (1981) dio como resultado el siguiente:
Iogk 0,71627 + 0,01 91/~~ 0,0428d

- + 0.0224/n -0,051 id + 0,0164/c 0,0272d0, -
20,9722. (2.30)
r
El mayor inconveniente que presentan estos resultados es semejante a los obtenidos de

los FAMEs, se trata de que muchas veces se producen fuertes correlaciones entre las
variables coincidentes dependiendo de las constantes moleculares de los triglicridos
utilizados en la regresin.
93
Por el contrario, si los valores del logk de los patrones utilizados se relacionan con el NC
y ND poi separado en dos grupos, se obtienen valores altos del coeficiente de
determinacin y el anlisis de los residuos (figuras 2.3.2. id y e) permite asegurar que la
regresin es lineal, del tipo de la representada en la ecuacin (2.12). El primero de estos
grupos colTesponde a los triglicridos que eluyen durante el primer gradiente y primer
isocrtico (antes del minuto 70), y que son tributirina, tricaproina, tricaprilina,
tripelargonina, tricaprina, trilinolenina, triiniristolena y trilaurina. El segundo grupo de
triglicridos conesponden al resto de los patones utilizados. La figura 2.3.2. lf representa
un cromatograma de HPLC de los triglicridos utilizados como patrones, con sus
correspondientes tiempos de retencin y el mtodo de gradiente utilizado.
Los clculos realizados para el NEC de triglicridos que eluian antes de los 70 niin
fueron los siguientes:
logk z0,81 130+ 0,06025NCO,1280ND (2.31)
a = 0,1280 =2,12; (2.32)

0,06025
NEc=Nc2,I2ND; (2.33)
Iog k = 0,81143 + 0,06025NEC 0,0289;r2 = 0,9967 (2.34)
togk + 0,811430,0289 (2.35)

0,06025
NECflJQX Iogk + 0,81143+0,0289; (2.36)

0,06025
94
Ql
-r-.
o
06091 SSS
a.>
o .4-.
61814 SSd -Ql
sogtt sso
55w
ottu 500 cid ci
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Ql
1
o
95
r u -
siendo: k ~ el factor de capacidad en el tiempo en que comienza a tomarse

una
fraccin (t),
1
~ ~ el factor de capacidad en el tiempo en que se termina de tomar
una
fraccin (t2 t] + 40 s).
Los resultados para el segundo grupo de triglicridos fueron:
Iogk =0,72097+ 0,01919NC0,04121ND; (2.37)
0,04121
a = =2,15; (2.38)
0,019 19
NEC=NC-2,15ND; (2.39)
2 = 0,9699 (2.40)
logk = 0,720930,O19l9NEC0,0151; r
NEC,,, !ogk+0,720930,0151 (2.41)

0,01919
NEC,~ Iogk +0,72093+0,0151 (2.42)

0,01919
Estos ltimos resultados fueron los nicos vlidos de entre los propuestos por otros
autores en la bibliografia. La inadecuacin de los modelos invalidados se debe a que se
propusieron para sistemas isocrcticos de separacin, condiciones en las que se podra
haber obtenido buenos resultados en lo que se refiere a la adecuacin de los modelos; sin
embargo (tal como ocurre en los estudios llevados a cabo por otros investigadores en
sistemas isocrticos de elucin), los resultados en la separacin cromatogrfica de los
triglicridos no son tan buenos como los conseguidos en el sistema de gradientes
utilizado en el presente estudio, con la consecuente estimacin de un nmero bajo de
96
Capitulo 2. Aplicacin o la extraccin de grasa lctea de nata,
especies moleculares. Al realizar la modelizacin tras dividir el cromatograina en dos

tramos se consigui que estos modelos fueran vlidos y perfectamente aplicables, y
sumado al sistema cromatogrfico que pernti la obtencin de un gran nmero de picos,
se logr la estimacin de un gran nmero de especies moleculares de triglicridos con
gran garanta La aplicacin de los anlisis por OC de las fracciones de I-IPLC mejor los
resultados al obtenerse la composicin en cidos grasos de cada fraccin y, de este modo,
realizar la estimacin tambin en funcin de las cantidades en que se encuentran cada uno
de los triglicridos en cada fraccin, no slo en funcin de su presencia.
2.3.2.2- Estimacin de la composicin en triglicridos de grasa lctea ovina
La aplicacin de las ecuaciones anteriores (2.35, 2.36, 2.41 y 2.42) redujo el nmero de
triglicridos posibles en cada una de las 227 fracciones recogidas a la salida de la
columna de I-IPLC a aquellos con adecuados parmetros moleculares (NEC) para cada
pico en su tiempo de retencin correspondiente.
Adems, el anlisis por OC de los cidos grasos presentes en cada fraccin tambin
redujo drsticamente el nmero de especies moleculares estimadas para cada pico, y en
algunos casos imit la posibilidad incluso a un nico triglicrido. La composicin en
triglicridos de cada fraccin se calcul a partir del porcentaje molar de los principales
cidos grasos en cada fraccin, teniendo en cuenta que las especies ms probables que se
consideraron fueron aquellas que se encontraron en porcentajes altos (normalmente
mayores a 0,0 1%, dependiendo del nmero de cidos grasos encontrados en cada
fraccin) y que sus NEC se incluyeron entre los limites de NEC de cada fraccin
teniendo en cuenta el error estndar de las regresiones como los valores de NECrn y
NECmx (ecuaciones 2.35, 2.36, 2.41 y 2.42).
El los anexos 1 y II se muestran los programas desarrollados en QuickiBasic para la

estimacin de la composicin en triglicridos que eluyen antes y despus de los 70 mm
9,7
.
> y ~ffj~~i>R ..
Cap~ulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa ldctea de nata.
respectivamente. Estos programas realizan una seleccin de los triglicridos adecuados

para la estimacin de entre todos los posibles. Para ello aplica las ecuaciones 2,33 y 2.39
para el clculo del NEC de cada triglicrido, posteriormente calcula el NEC<,, y NECO,X
de cada fraccin y selecciona los triglicridos de NEC comprendido en el intervalo. Tras
esta pulmera seleccin, el programa calcula los procentajes molares en que se encuentra
cada triglicrido a partir de los datos del anlisis de GC y reduce el nmero de
triglicridos a los que se encuentran en %mol> 0,01.
A continuacin se detallan, paso a paso, los procesos seguidos para la estimacin de la

composicin en triglicridos de la grasa lctea en tres tramos del cromatograma de HPLC,
mostrando cada uno de ellos una dificultad creciente. La figura 2.3.2.2a muestra el
cromatograma de los triglicridos indicando las zonas que se describen como ejemplos de
demostracin:
A) en primer lugar, cuando fre posible, se utilizaron os tiempos de retencin de

triglicridos puros para la identificacin. Este es el caso ms sencillo, y pudo realizarse
para la estimacin de la trioleina (000). El tiempo de retencin de la trioleina usada
como patrn (123,9 mm) pudo hacerse corresponder con el tiempo de retencin de un
pico que apareca durante los minutos 122 y 123, ptimamente resuelto respecto de los
anterior y posterior. No obstante, tras realizarse los anlisis de las fracciones por OC y el
clculo del NEC adecuado al tiempo de retencin, la asignacin qued confirmada. El
anlisis de cidos grasos correspondi al de las fracciones 164 - 165. La tabla 2.3.2.2a
rene los resultados obtenidos en cada paso para la asignacin de la trioleina:
primeramente se exponen los resultados obtenidos en el anlisis por GC en cada fraccin,
seguidamente se calcula el nmero de triglicridos posibles (si se considera que los
cidos grasos se distribuyen al azar e independientemente de que tengan NEC adecuado o
no al tiempo colTespondiente), por ltimo se ofrecen los triglicridos resultantes tras las
limitaciones que los reducen nicamente a aquellos con NEC apropiado y en porcentajes
molares superiores a 0,0 1% (resultados ofrecidos por el programa del anexo II).
98
~AMk~A,ot4flnld4eePont~wd4*tflo4we*1hz?.
Tabla 2.3.2.2a. cidos grasos mayoritarios y triglicridos estimados en las fracciones

correspondientes a la elucin de la trioleina.
N0 Fraccin cidos Grasos Triglicridos Posibles Triglicridos

Mayoritarios (ng Estimados
inyectados)
164 Ca (1,1); La (0,8); M 512 000
(2,0); P (28,6); 8 (2,1); 00V
0(36,4); V (1,1); L SOL
(2,1)
165 Ca (1,3); La (1,2); M 729 000

(4,2);Pd(2,9);P 00V
(40,5); 5 (4,8); 0 SOL
(49,2); V (4,3); L (1,5)
Tabla 2.3.2.2b. cidos grasos mayoritarios y triglicridos estimados en las fracciones

correspondientes a la elucin de NP = 52.

inyectados)
Ca (0,6); La (0,4); M 343 PdSS
192
(1,2); Pd (0,5); P (3,2); SSO
5 (1,4); 0 (0,6) PSs
1728 PsS
193 Bu (17,6); Co (23,7); Cl
(12,0); Ca (25,7); La
(17,7); M (36,5); Pd
(3,4); P (53,5); Ma
(1,0); 8 (12,9); 0
(29,7); L (2,6)
nd o
194 *
nd o
195 *
100
fi
~
Tabla 2.3.2.2b (continuacin).

inyectados)
196 Crn:i (8,8); La (0,6); 512 SSO
C
13:o (2,9); C13;i (1,3); Pss
M (1,4); P (2,6); 5
(0,6); 0 (0,9)
197 Bu (1,1); Co (1,6); Cl 1000 PdSS
(2,0); Ca (5,8); La sso
(3,3); M (8,0); Pd (0,7);
P (16,1); 5 (7,0); 0 Pss
(1,0)
198 Bu (3,1); Co (4,0); Cl 5832
(4,0); Ca (8,9); Cmi
(2,1); La (5,4); Cuo
(8,4); M (10,5); Pd
(1,1); P (16,6); 5 (5,0);
0 (13,0); V (1,0); L
(2,1); Ci9:o (0,7); Ln
(0,9); o/cC182 (0,5);
C20:o (0,2)
199 Bu (1,0); Co (2,3); Cl 1728
(12,3); Ca (2,0); La
(2,0); M (3,4); P (5,7);
5 (2,0); 0 (3,4); L
(0,7); C190 (0,2); Ln
(0,1)
200 Bu (1,0); Co (3,5); Cl 2197 SSO
(10,1); Ca (2,9); La PSS
(5,3); M (7,8); 5 (4,6);
O (3,9); Y (0,2); L
(1,0); Cig:o (0,2); Lxi
(0,1); doCg:2 (0,1)
201 Ca (0,3); La (0,3); M 216 SSO
(0,8); P (3,3); 5 (2,7); 0
(0,9)
202 M (1,1); P (4,0); 5 64 SSO
(2,3); 0 (1,2)
101
c~fiflllmO2.2AAfiRe&*tw1JqC$E2YaeL45ht#er~&flAtfld1Se qaS.
Tabla 2.3.2.2b (continuacin).

inyectados)
203 Co (0,4); Cl (0,2); Ca 512 Sso
(1,0); La (0,4); M (0,9); Pss
P (2,6); 5 (1,7); 0(0,8)
no detectados.
Tabla 2.3.2.2c. cidos grasos mayoritarios y triglicridos estimados en las fracciones

correspondientes a la elucin de NP 46.
N Fraccin cidos Grasos Triglicridos Posibles Triglicridos

inyectados )
Co (0,8); Ca (1,4); La 4913 73
151 (2,0); M (5,3); Pd
(1,0); aPd (1,2); Pd
(1,8); P (5,1); Pa (1,6);
Ma (0,6); alMa (0,6);
Ma (0,5); 5(1,4); O
(8,3); V (0,2); L (1,7);
o/cC
182 (0,5)
1728 53
152 Ca (1,2); La (1,0); M
(3,6); Pd (0,3); WPd
(0,3); Pd (1,0); P (9,4);
Pa (1,6); 5 (1,2); 0
(10,8); L (3,7); o/cC182
(1,4)
43
153 Co (0,6); Cl (1,2); Ca 2197
(1,3); La (1,8); M
(21,1); Pd (1,5); P
(15,1); Pa (2,6); 5 (1,0);
0 (22,4); Y (0,5); L
(4,6); doCg;2 (1,3)
102
guftn2.Mnhiwzr~YhnhtWfJdih4fermfrff&fe nata:
Tabla 2.3.2.2c (continuacin).

inyectados)
154 Ca (1,8); La (2,1); C
130 4913 75
(0,5); M (1,2); M
(26,9); iPd (0,4); wPd
(0,5); Pd (3,7); P
(22,5); Pa (6,2); Ma
(1,4); 5 (3,9); 0 (36,3);
Y (2,7); L (3,1); Lxi
(1,3); etcCs;2 (0,9)
155 Cl (6,8); Ca (1,2); Coi 729 10
(1,7); La (1,2); M (6,3);
Pd (1,2); P (4,1); 5
(0,3); 0(2,1)
156 Co (2,5); CI (0,8); Ca 6859 48
(1,5); La (11,7); M
(58,4); Pd (0,6); aPd
(1,3); Pd (0,9); P
(62,5); Pa (2,2); Ma
(0,3); a/Ma (0,6); Ma
(0,1); 5(10,1); 0
(45,1); Y (3,4); L (6,0);
Ln (0,4); e/cC182 (2,0)
157 Cl (5,4); Ca (1,0); La 343 6
(6,9); M (29,2); P
(18,3); 5 (1,5); 0(8,8)
158 Ca (0,8); La (3,0); M 512 18
(11,8); P (10,1); Pa
(1,0); 5 (1,3); 0 (1,3);
Y (0,6)
159 Cl (2,4); Ca (0,7); La 343 6
(2,0); M (4,9); P (7,8);
5 (0,4); 0 (0,7)
103
Tabla 2.3.2.2c (continuacin).
inyectados)
160 Bu (1,8); Co (1,8); Cl 9261 66
(1,1); Ca (7,2); La
(14,5); M (46,7); Pd
(3,2); aiPd (5,4); Pd
(4,8); P (75,6); Pa (1,1);
Ma (2,0); alMa (1,7);
Ma (1,1); 5 (22,0); 0
(21,4); Y (0,5); L (1,5);
Ln (0,2); o/cC
182 (0,3);
C2o:o (0,7)
161 Ca (6,6); La (5,7); M 3375 70
(19,2); Pd (1,4); WPd
(1,5); Pd (1,9); P
(32,8); Pa (0,4); Ma
(0,7); alMa (0,7); Ma
(0,4); 5 (12,1); 0(5,2);
Y (0,8); Lxi (0,9)
162 Co (0,7); Cl (0,6); Ca 4096 82
(2,1); La (1,1); M (4,5);
iPd (0,5); aPd (0,8); Pd
(2,4); P (7,8); Ma
(0,3); alMa (0,4); Ma
(0,7); 5 (2,9); 0 (16,8);
Y (1,2); L (0,8)
163 Ca (0,9); La (1,4); M 2744 86
(8,4); Pd (1,3); aPd
(2,6); Pd (6,8); P
(17,2); Ma (1,3); alMa
(1,6); Ma (1,8); 5 (3,8);
O (47,6); Y (2,2); L
<1,0)
104
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa /4oteo de nata.
La trioleina es el triglicrido que se presenta en mayor porcentaje molar, siendo el 00V

minoritario y eluyendo en la cola del anterior (el enlace trans prolonga el tiempo de
retencin). Posteriormente eluye el SOL porque la acumulacin de dobles enlaces en
unos cidos (como el linoleico) y la presencia de cidos saturados (como el pahuitico)
provoca un aumento en el tiempo de retencin respecto a otros triglicridos con igual
NEC pero con igual ND en cada cido graso (000). La mejora de la eficacia de las
columnas de HPLC (n0 platos/m 160.369 en la columna de 15 cm, columna de 25 cm:
161.364) confinn los resultados anteriores al aparecer tres picos donde antes exista
nicamente uno. La figura 2.3.2.2b muestra el segmento de cromatograma
correspondiente a estos triglicridos donde se separaran los tres triglicridos tras mejorar
la eficacia de la separacin.
B) en segundo lugar se describe el desarrollo de la estimacin llevada a cabo para los

triglicridos de NP = 52. Estos triglicridos eluyen en el cromatograma de HPLC durante
los minutos 143 a 151, tal como se muestra en la figura 2.3.2.2a, y se recogieron en las
fracciones 192 a 203. En primer lugar se analizaron los FAMEs de cada fraccin por GC
y se obtuvieron las reas resultantes tras la integracin. La figura 2.3 .2.2c corresponde al
cromatograma obtenido por OC de los FAMEs de la fraccin 201, recogida desde los 147
mm 20 s hasta el minuto 148. La tabla 2.3.2.2b incluye los resultados de los cidos grasos
mayoritarios para cada fraccin, el nmero de triglicridos posibles y los triglicridos
finales, resultantes de la seleccin llevada a cabo en funcin de que tengan el NEC
apropiado y que a la vez posean un %mol >0,0 1 (aplicacin del programa del anexo II).
El anlisis de la fracciones 194 y 195 no dio cantidades cuantificables de FAMEs; las

fracciones 198 y 199 s las dieron, pero los tiiglicridos posibles no estuvieron dentro del
intervalo de NEC adecuado para el tiempo de elucin. Las primeras fracciones resultaron
contener un triglicrido de NP 51, el PdSS, que apareci como un pequeo pico
anterior al SSO. Se estim que el 55V era un pequeo pico que elula posteriormente al
SSO, ya se ha citado anteriormente que los dobles enlaces rrans retardan el tiempo de
retencin respecto a los cis (El-Hadmy y Perkins, 1981; Laakso y Kallio, 1993), si bien,
105
4
a
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de graXa 4ctea de nata.
099
o,
1~
o
tyss
o
60
o
5-
oo
99 61,
o,
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o
st s
o
4-
o
d
e
en
uU
107
~r~w
-j dr
Capitulo 2 Aplicacin a la ex/mocin de grasa lclea <le naln.
esto no se pudo comtemplar a la hora del clculo del NEC por no disponer de patrones
con este tipo de insaturacin. De los picos mayoritarios de NP = 52 en el crornatograma
de HPLC, el SSO eluye antes que el PSS por poseer menor NEC. La estimacin de los
cuatro triglicridos se adecu perfectamente a los picos que aparecieron en el
cromatograina, tal como se ve en la figura 2.3.2.2a.
C) en ltimo lugar exista el problema de que en la identificacin de algunos picos se

mostraba de fonna clara que ciertas especies podan corresponder a ms de una fraccin.
Teniendo en cuenta el orden de elucin junto a una representacin de la probabilidad de
encontrar un triglicrido especifico en una fraccin especfica fue posible tambin la
asignacin de los picos. Es el caso de la asignacin de los triglicridos con NP 46, cuyo
proceso se detalla a continuacin. La figura 2.3.2.2a muestra la seccin de cromatograma
correspondiente a los triglicridos con NP = 46. Este es el ms complejo de los casos
presentados, ya que las fracciones son de composicin muy variada en cidos grasos, lo
que aumenta el nmero de especies posibles de triglicridos. El nmero de especies
moleculares de triglicridos tambin es mayor porque, con los cidos grasos descritos,
son mayores las combinaciones posibles que posean 45 < NEC =46. Los tiempos de
retencin de estos triglicridos se sitan entre los 116 y 122 mlii, que corresponde con las
fracciones 151 a 163. El cromatograma de la figura 2.3.2.2d se corresponde con la
composicin en cidos grasos de la fraccin 154, en l aparece un mayor nmero de
cidos grasos diferentes y en mayor cantidad que en el cromatograma de la fraccin 201
(figura 2.3.2.2c). La tabla 2.3.2.2c, tal como las tablas anteriores, muestra los resultados
obtenidos en cidos grasos mayoritarios, triglicridos totales posibles y triglicridos
finales resultantes de la estimacin en cada una de las fracciones. El nmero de
triglicridos resultantes tras una primera estimacin fue muy elevado, por lo que hubo
que reducir este nmero por medio de aumentar e] %mol mnimo permitido 0,1%. La
tabla 2.3.2.2d rene los triglicridos que, fmalmente, se consideraron en la estimacin.
108
09 29
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60 62
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109
Tabla 2.3.2.2d. Triglicridos finales con NP = 46 en cada fraccin para la estimacin y

su NEC correspondiente.
N0 Fraccin Triglicrido (NEC)

151 LOO (45,41), POL (45,56), MOO (45,71), PPaO (45,71), MOV (45,71),
PPL (45,71), MSL (45,71), MPO (45,85), MPY (45,85), LaSO (45,85),
MPP (46), MMS (46), LaPS (46)
152 LOO, SLL (45,41), POL, MOO, PPaO, PPL, MSL, MPO, LaSO, MPP,
MMS, LaPS
153 LOO, POL, MOO, PPaO, MOY, PPL, MSL, MPO, MPY, LaSO, MPP,
MMS
154 LOO, POL, PSLn (45,56), MOO, PPaO, MOV, PPL, MSL, MPO, MPV,
LaSO, MPP, MMS, LaPS
2
155 MOO, MPO, MPP
156 LOO, POL, MOO, PPaO, MOY, PPL, MSL, MPO, MPV, LaSO, MPP,
MMS, LaPS
157 MOO, MPO, LaSO, MPP, MMS, LaPS
158 MOO, PPaO, MOY, MPO, MPY, LaSO, MPP, MMS, LaPS 1
159 MOO, MPO, MPP, MMS, LaPS
160 POL, MOO, PPaO, MOY, PPL, MPO, MPY, LaSO, MPP, MMS, LaPS
161 PSLn, MOO, MPO, MPY, LaSO, MPP, MMS, LaPS, CaSS (46)
162 LOO, POL, MOO, MOY, PPL, MSL, MPO, MPY, LaSO, MPP, MMS,
LaPS, CaSS
163 LOO, POL, MOO, MOY, PPL, MPO, MPV, LaSO, MPP, MMS, LaPS
La figura 2.3.2.2 (e y 1) muestran una representacin de la probabilidad de encontrar los

16 triglicridos de NP = 46 resultantes, realizada a partir de los %mol obtenidos para
cada una de las especies moleculares en cada fraccin. Esta figura muestra que puede
existir ms de un mximo para cada triglicrido. La asignacin se realiz siguiendo un
orden creciente de NEC. Sin embargo, existen especies con igual NEC, por lo que la
asignacin realiz en base a los porcentajes molares y a criterios de elucin que no
pudieron valerse de un desarrollo matemtico. Un segundo anlisis realizado en columnas
con la eficacia mejorada demostr que el nmero de triglicridos estimados se adecuaba
al nmero de picos en este nuevo anlisis, adems, el orden asignado fue conecto porque
110
se correspondi el valor de rea de cada pico con el %mol aproximado de cada

triglicrido. El tratamiento de desconvolucin de los picos (mediante el programa
PeakFit, Jandel Scientific) contribuy a la confirmacin de la existencia de los
triglicridos estimados y a proporcionamos las reas corregidas. El resultado obtenido
tras la ordenacin de los triglicridos segn su tiempo de retencin, la asignacin de cada
uno de ellos a un pico del cromatograma y la representacin del trazado de las gaussianas
.21~
por la desconvolucin de los picos se muestra en la figura 2.3.2.2g. Se observ que en el
primer anlisis por HP.LC el nmero de especies (16) no se corresponda con el nmero
de picos debido a la baja eficacia, pero tras la mejora de sta se obtuvo un nmero de
picos mayor y se observ tambin que algunos triglicridos aparecan como hombros
visibles de otros picos y se pudo realizar la desconvolucin de un modo ms satisfactorio
y sencillo. El triglicrido que primero eluye es el LOO, su NEC es el menor (45,41) y
todos sus cidos grasos son insaturados, por lo que adelantan su elucin respecto a otros
triglicridos con igual NEC pero con un cido saturado (SLL). El POL eluye antes que el
PSLn por la misma razn, y son el tercero y cuarto en eluir, respectivamente, por tener en
NEC mayor a los anteriores (45,56). En tercer lugar eluyen los triglicridos de NEC =
45,71: MOO, PPaO, MOY, PPL y MSL por este orden, segn las razones antes dichas.
Se asign la elucin del PPaO antes que el MOV por tener el mximo %mol en un tiempo
anterior. El MOV eluye posteriormente al MOO por la retencin que provoca el enlace
rans, adems de que lo corrobora la distribucin de los porcentajes molares de cada uno.
Estas mismas explicaciones son las que ordenan la elucin de los triglicrdos de NEC =
45,85 y que es, respectivamente: MPO, MPY y LaSO; adems, el LaSO posee el mayor
tiempo de retencin debido a que los cidos grasos saturados de mayor NC contribuyen
en modo ms marcado a aumentar los tiempos de retencin que los cidos grasos
saturados de menor NC contribuyen a reducirlo. El orden asignado a los triglicridos
saturados (NEC = 46) es el siguiente: MPP, MMS, LaPS y CaSS. Indudablemente, el
MPP es el triglicrido mayoritario y esto se refleja claramente en los resultados de los %
molares. El ltimo pico en eluir es el CaSS, sus dos restos de cido esterico provocan un
aumento en la retencin muy importante; este efecto es menos patente cada vez en el
LaPS, MMS y MPP, siendo el MPP el triglicrido saturado de ms pronta elucin.
113
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea
J
Se identificaron 181 especies moleculares de triglicridos; 79 de ellas fueron saturadas,

44 monoinsaturadas y 58 poliinsaturadas. La mayora de las especies insaturadas
contuvieron un solo cido graso insaturado (61), 41 contuvieron dos, y 5 tuvieron los tres
cidos grasos insaturados. Adems, se identificaron 10 tiiglicridos de NC impar, bien
lineales, bien ramificados. Las especies estimadas quedan recogidas en la tabla 2.3.2.2e.
De las 181 especies moleculares, 151 se haban previamente citado en la bibliografa

sobre componentes de la grasa lctea por Barrn y col. (1990), Bornaz y col,, (1992) y
1
Myher y col. (1993). Las otras treinta especies restantes han sido descritas por primera
vez en este anlisis.
Debido al hecho de que la identificacin de triglicridos se bas no solamente en la

estimacin del NEC sino tambin en el anlisis por OC de fracciones obtenidas tras una
separacin por HPLC, algunas de las especies descritas previamente por otros autores no
se encontraron en este estudio. Este es el caso del estudio llevado a cabo por Bornaz y
5
col. (1992), que describi la identifiacin de 26 especies moleculares que contenan cido
inolnico. Sin embargo, nuestro estudio solamente ha permitido poner de manifiesto
nueve de ellas, ya que contenan otros cidos grasos que se encontraron en mayores
cantidades. El resto de especies no se ha mostrado en los resultados por encontrarse en un
porcentaje menor al 0,01% del total de triglicridos en cada fraccin.
Nuestros resultados coinciden con los de Myher y col. (1993) en la identificacin de

triglicridos con cidos grasos de cadena impar (NC = 15 y 17), tanto lineales como
ramificados; esto se debe principalmente a la mejora de los anlisis de los steres
metilicos de cidos grasos por OC. Inclusive, en este estudio ha sido posible la
diferenciacin entre ismeros isa y an/ciso, no slo en el anlisis OC de los cidos
grasos, sino tambin en la estimacin de las especies moleculares de los triglicridos. Los
cidos tridecanoico y nonadecanoico fueron analizados por OC, pero no se incluyeron en
114
Tabla 2.3.2.2. Triglicridos estimados en grasa lctea de oveja,

NPIco N lico NPko Ir TG
15,658 1Bssflssp 63,140 I3uPO 102,663
2 16,602 CoCoM BuPV CaMS
BuCIM 48 64,758 CoMP 76 103,922 CoSS
3 17,592 EluCoP CaCa? 77 105,654 OLL
4 19,017 I3uBiuS 49 65,084 BuPP OOLn
5 21,282 BuCaL BuMS SLLn
BLICIO 50 66,858 CoPdO PaOL.
6 22,614 I3uCaM BuaIMaO PLL
7 23,045 BmuCIP BuMaO POLo,
8 23,927 RuCoS Hs,MaO 78 06,976 MOL
9 26,805 CoCIO 51 67,890 LaLaL 79 108,222 MPaO
10 27,632 Bu CaO CaLaM LaOO
11 28,112 CoCIP CILaP MIPO
12 29,017 I3uUM CoLaS MPL
13 29,329 BuCal 52 71,308 OnOto 80 109,040 MMO
14 29,908 3uCIS 53 71,958 CO!. LaPO
15 31,033 IluUPd 54 72,470 CcOO 81 110,317 MMI
16 33,300 CoMiL 55 73,279 CoSL taP?
17 34,008 BuML Ca MI, 82 1,485 LsMS
18 34,258 CoCaO CI?!. 83 112,727 CoPS
19 34,782 BuLoO 56 75,253 CoPO 84 14,098 0185
BuMIP RuSO 85 15,205 LOO
20 35,393 CICaM 57 76,827 OlMO SLL
CoLaM OlLaS PO!.
21 36,213 CoCal CaMPa 86 116,833 lSL,
22 37,427 BuMM 58 77,800 LaLaM 87 117,232 MOO
fluLal OaMM 88 118,050 PPaO
23 38,242 RuCaS 59 79,345 CIMP MOV
24 41,992 CaLa La CoPP 89 119,204 PL
25 42,344 CoOLu, BssIS MSL
BsOL OaLaP MPO
CIM[1a 60 81,592 CaPaO MP,?
26 42,922 CaCaL 61 83,021 0100 90 20,220 USO
CIL4L 62 84,705 UML 91 121,571 MPP
27 44,349 CoML CaPL MMS
I3uPL 63 85,931 LaLaO LaPS
28 45,006 CICaO 64 87,193 CaMO CaSS
29 45,983 CoLnO OaMV 92 [23,374 000
30 46,495 BuMO 65 88,462 CIPO 93 123,883 LOS
IlssPIa CoSO 94 125,013 roo
31 48,725 IluMiS 66 90,191 LoLaP 95 125,831 SL?
32 49,650 NI. LaMM 96 127,079 PO
33 51,119 CaLaLa CoMP 97 27,975 MSO
34 51,962 CaCaM CaLaS PPv
35 52,596 CILaM dM5 98 29,358 pl,
36 53,191 CICIS CII, MPS
37 54,027 CICaP 67 91,679 CoPS 99 31,123 LaSS
38 54,619 Coto1 RuSS 100 32,587 800
CoMM CaPd 101 33,421 soy
39 55,908 CoCaS 68 93,723 OaOO 102 34,924 So
40 55,421 BsMP LOL 103 135,978 PS,
BuLaS 69 95,348 LaPL 104 137.041 N.I.
41 57,425 I3uciPdI MML 105 138,014 PS
I3uPdl CaSL 106 139,829 MSS
CoCaN 70 96,852 LaMO 107 143,005 PLISE
42 59,550 CIOL, 71 97,712 CaPO 108 144,391 SSO
CoOL 72 98,925 0180 109 145,142 Ssv
43 59,746 CaML MMII 110 148,111 SS
73 99,827 MMM 111 60,683 SSS
44 60,449 BuOO
45 60,817 BuOV LaMP
46 62,248 CoPL 74 101,043 CalP
CoMO LataS
= triglierido; Nl. = no idenlilicado.
115
CapIndo 2. Aplfroetdn chi tutUn & nata Mc$ea de nata.
la estimacin de triglicridos debido a las bojas cantdsdes en que se encontraron en el

contenido total de la grasa lctea.
Igualmente al estudio de Barrn y col (1990). se tuvo en cuenta cl cido trans-vaccnico

por encontrarse en un 1,36% en cl anlisis de cidos grasas en la fi-accin triglicrica
total. Sin embargo, hay que resaltar que en el estudio antes mencionada solamente se
describen 116 especies moleculares de triglicidos, en lugar dc las 185 de nuestro
estudio, debido a que tan solo consideraron 14 cidos rasas para la realizacin de los
clculos de los triglcndos a causa de la menor sensibilidad de su anlisis por OC.
2..?. 4- ComparacIn de la composicin en olgllcdrldn de la grasa de leche de

oveja, cabra y vaco.
La figura 2.3.4a rene los cromatogramas de uiglicridos dc leche de yuca, oveja y cabra
y como se puede observar, las diferencias son solamente cuantitativas Expresados en
porcentajes de rea, los resultados son los recogidos en la tabla 2.3.4. La figura 2.3.4b
mt,estras los resultados reFerentes al NEC y tambin al grado de saturacin de los
triglicridos.
Tabla 2.3.4. reas (%) de los triglicridos de la grasa de leche de yuca, oveja y
cabra en funcin de su NEC.
NEC S34 34 < NEC S 40 NEC 40 Total
Yuca 10,83 25.16 64,01 lOO
Oveja 18,23 32,84 48,93 loo
33,96
Cabra 15,21 100
La leche de vaca es la que pasee la mayor proporcin de triglicndos de NEC > 40,
seguido de la leche de cabra y la de oveja respectivftffiflltC Sin embargo, la leche de
116
Cap tu/o 2. AplIcacin a la extrafy,{p 1{e grasa lctea de rial
fi~
W
It
175
o 25 50 75 100 125 150
OVEJA
150 175
125
0 25 50 75 100 tiempo (ruin)
CABRA
o 25 75 100 125 150 175

117
F~gwra 2.3,4a. CroflIatogTaIflfiS de IIPLC de irIglIcrslOS de leche de vaca, oveja y cabra.
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata
oveja es la ms enriquecida en triglicridos de NEC =40, delante de la de cabra y la de

vaca, por este orden. En cualquiera de las tres especies, la grasa lctea posee mayor
proporcin de triglicridos de NEC > 40 que del resto de triglicridos, la menor
proporcin de triglicridos est cuando stos son de NEC =34, tambin para las tres
especies animales. Estas diferencias entre las proporciones de triglicridos segn su NEC
son ms patentes para la leche de vaca y menores para la leche de cabra y oveja
respectivamente; en esta ltima existe una mayor equiparacin de las proporciones de
triglicridos en funcin de sus NEC.
Los triglicridos saturados son los mayoritarios en la grasa lctea de las tres especies
animales. Entre las leches de las tres especies, es la de vaca la que posee una menor
proporcin respecto a la de cabra y oveja, siendo entre estas dos ltimas la proporcin
muy semejante. Los triglicridos monoinsaturados se encuentran en mayor proporcin en
la leche de vaca, teniendo la leche de oveja valores menores pero cercanos; la leche de
cabra posee la menor proporcin de estos triglicridos. Los triglicridos poliinsaturados
estn en la leche de cabra en la mayor proporcin (siendo incluso mayor a la de
triglicridos monoinsaturados), con un porcentaje ligeramente menor en la leche de vaca;
la leche de oveja es la que menos proporcin de triglicridos poliinsaturados posee. En
las leche de vaca y oveja, existen ms cantidad de triglicridos monoinsaturados que
pollinsaturados, al contrario de lo que ocurre en la leche de cabra.
Estos resultados pueden explicarse basndose en la composicin en cidos grasos de la

grasa lctea de estas especies (Ramos y Jurez, 1986). La leche de oveja es ms rica en
cidos grasos de cadena corta (NC =8) y poliinsaturados, y la leche de vaca lo es en
cidos grasos saturados de cadena larga (NC =16). Se confirm que la leche de vaca
posea la mayor cantidad de triglicridos insaturados, debido a la mayor cantidad de cido
oleico; mientras que las cantidades fueron inferiores en leche de oveja y cabra, aunque
semejantes entre ellas (55,31, 51,12 y 5 1,13%, respectivamente).
119
En la figura 2.3,4c se muestran los porcentajes de triglicridos en funcin de su NEC,

segn sean de leche de vaca, oveja y cabra, y de acuerdo a su grado de saturacin. La
leche de vaca posee el mayor porcentaje de triglicridos de NEC> 40 poliinsaturada, sin
embargo, la leche de cabra es la ms rica en triglicridos de 34 < NEC = 40
poliinsaturada. Estos resultados estn en concordancia con las cantidades relativas de
cidos grasos de cadena corta, media (8 < NC =12) y larga y sus diferentes
combinaciones para dar lugar a triglicridos en las tres especies animales.
120
u
t u ~
y ~
j
Capitulo .2. 4ad o le ntmcds de msa Ida de >u&
APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIX[DO DE CARBONO

SUPERCRITICO A LA MODIFICACIN DE GRASA LCTEA EN NATA
k!1
2.4- MATERIALES Y MTODOS
4
7,
24.1- PreparacIn de la muestra
Se utiliz leche cruda de oveja proporcionada por Queseras Campo Real en Campo Real,
Ji
(Madrid).
4
1
La obtencin de la nata a partir de la leche se realiz segn los mtodos detallados en el
~1
apartado 2.2.1
1*
2.4.2- 1)escrlpcin del equipo de extraccin
Las extracciones se llevaron a cabo utilizando un extractor de fluidos supereriticos

sempreparativo LDC Analytical que fue modificado previamente en el laboratorio
(Hierro, 1994). La figura 2.4.2 muestra un dagrama de este equipo de extraccin.
El dixido de carbono liquido es impulsado por medio de una bomba de velocidad

variable cuya cabeza se encuentra enfriada a 11 0C mediante un bao criogtnico para
mantener el CO
2 en estado lquido. El CC)2 a la salida de la bomba se calienta
previamente a la entrada al interior de la celda de extraccin (55 mL de capacidad). Esta
celda de extraccin posee una camisa calefactora controlada mediante una sonda
termopar.
El CO2 supercrtico. que contiene el extracto lipdico, es despresurizado tras la salida de

la celda a su paso por un restrictor variable, la despresurizacin causa el cambio a CO2
en estado gaseoso. separndose el extracto y recogindose en un erlenmeycr a presin
12.2
Capitulo 2. Ap#arMn o o exlmccft$n de <msa Jata de nOW
/1 30~>9
~12<si. Mil
o
o
1
0
t.i ~ i~ 1 6
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J
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UOGVI uvwauJ.NI a
b.
3.
E
eL
ti
23
Capliulo 2. AplIcacin a la exftwcch$n de *nta lctea de nola.
atmosfrica. Se evitaba la formacin de nieve carbnica en el restrictor calentndolo con

tina resistencia.
Las extracciones se realizan en modo dinmico, controlndose el volumen de CO2 y flujo
para que se mantengan constantes. Las extracciones se realizaron por duplicado.
Se utilizaron 10 g de nata por extraccin. La cantidad de grasa extraida se obtuvo por

pesada del extracto. La cantidad de nata residual se obtuvo por diferencia entre la inicial
y el extracto. Posteriormente se realizaron los anlisis por HPLC de colesterol y
trigliciidos de la nata antes y despus de su tratamiento con CO2 supercrtico. Tambin
se calcul la humedad de Las natas antes y despus de su tratamiento.
2.4,3- Optimizacin delflujo de CO2 supercrlflco
Este estudio junto con el de la optimizacin del volumen de CO2 se realizaron con leche
de oveja anteriormente estudiada en el punto 2.2.1, cuyo contenido en colesterol de la 1
nata fue de 2,2 mg /g.
El flujo ptimo de CO2 se cakul en base a conseguir un mayor rendimiento de la

extraccin de colesterol. El control se hizo variando el recorrido del mbolo de la bomba
para conseguir flujos entre 0,50 y 3 lJmin medidos a presin atmosfrica.
0C, condiciones adecuadas para la

Las extracciones se realizaron a 21,4 MPa y 40
extraccin de colesterol. El volumen de CO
2 en cada extraccin fue de 400 L.
Posteriormente se realizaron los anlisis de colesterol por HPLC.
24
CapItulo 2, Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nal
2.4.4- Optimizacin del volumen de CO2 supercr(tko
Se calcul el volumen necesario para extraer un mximo de colesterol. Las condiciones

0C manteniendo el flujo ptimo obtenido
de extraccin fueron de 17,9 MPa y 40
previamente.
Se estudiaron volmenes de CO
2 de 100 a 700 L medidos a presin atmosfrica.
Posteriormente se analiz por HPLC el colesterol extrado.
2.4.5- Determinacin de la grasa de la nata
La grasa de la nata previamente a la extraccin con CO2 se determin por extraccin

slido-lquido, utilizando 75 mL de una mezcla de cloroformohnetanol (2:1) en un
Soxhlet durante 1 h para extraer la grasa contenida en 1 g de nata, Despus se evapor el
disolvente en atmsfera de N2 y se determin la grasa gravimtricamente por pesada del
residuo.
Tras la extraccin con CO2 supercrtico, el peso del extracto corresponda al de la grasa
extrada.
2.4.6- Medida de la humedad de la nata
El agua contenida en la nata poda actuar como modificador en la extraccin de la grasa;

es por esto que se decidi analizar la humedad de la nata original y del residuo tras la
extraccin con CO2 supercrftico. Adems, el agua puede ser coextraida con los
componentes lipdicos mediante un proceso de arrastre de vapor, por lo que su contenido
en la nata tratada podra variar con las condiciones de extraccion.
125
Capitulo 2, AplicacIn a la extraccin de grasa Mc/ea de nata.
La medida de la humedad de la nata se realiz a partir de 400 mg de muestra siguiendo el

mtodo oficial de la AOAC (1990), en estufa a 100 0C. Se calcul la humedad en
porcentaje por diferencia con el peso al cabo de h.
2.4. 7- lndlistv de colesterol por cromatografio lquida de alta eficacia
2,4.7.1- Obtencin dc la fraccin insaDonificable de la nata
La separacin de la fraccin insaponificable de la grasa de la nata es necesaria para el

anlisis de colesterol por HPLC, puesto que los componentes mayoritarios, tos
triglicridos, interfieren en el anlisis (Hurst y col., 1983).
A 1 g de nata (tratada o no con CO

2 supercrtico) se le aaden 50 mL de KOH metanlica
2N preparada en el da. En ese momento tambin se aaden 400 .tL de estigmasterol
(patrn interno) de una solucin de 2,5 mg/mL de hexano para conseguir una
concentracin de 1 mg/g nata. Esta mezcla se pone a calentar a reflujo durante 30 njin.
La solucin restante se lleva a un embudo de decantacin, y el matraz se lava con das

porciones de 25 mL de agua destilada que tambin se llevan al embudo. Se afladen 10 mi
de una solucin de NaC al 10% para facilitar la separacin de las fases y se extrae con
dos porciones de lOO tuL de ter etlico/ter de petrleo (1:1). Se recogen las fases
0C. Despus, esta fraccin se
etreas y se llevan a sequedad con un rotavapor a 30
redisuelve en 5 mL de ter de petrleo, se pasa por un filtro de 0,2 gm y se inyectan 20
en el HPLC.
126
Capitulo 2. AplIcacin a Ja extraccin de grasa hielen de nata.
si
2.4.7.2- Anlisis de colesterol por {PLC
El sistema croniatogrfico utilizado consisti en una bomba modelo 6000A (Waters

Assoc.), un inyector Rheodyne modelo 7125 con un bucle de carga de 20 iL, un horno
para la columna (Kariba Instruments) y un detector ultravioleta de longitud de onda
vajiable 3100X (LDC Analytical), conectados a un sistema de adquisicin dc datos
System GoId (Beckman) a travs de una interfase modelo 406 (Beckman). Se utiliz una
columna Spherisorb ODS-2 (Phase Separations) dc 5 pm de dimetro de parifeula y 4,6
mm x 20 cm de tamao mantenida a una temperatura constante de 45 0C.
} 40
Los anlisis de realizaron en condiciones isocrticas a un flujo de 2 mL/mm y deteccin
en Uy a 205 nm. La fase mvil fue hexano/isopropanol en la proporcin 99,9:0,1.
24.8- Andilsis de triglictEridos por cromatografa lquida de alta eficacia
La extraccin de los triglicridos de la grasa de la nata (tanto tratada con CO

2 supercrftico
corno no) y su posterior anlisis por HPLC se realizaron segn se detalla en los apanados
2.2.1 y 2.2.2 respectivamente.
2.4.9- Efecto de la presin y la temperatura en la extraccin de grasa de nata sin

y con adicin de bolas de vidrio
Los lO g de nata se sometieron a la extraccin con CO2 supercrftico con las siguientes
condiciones de presin y temperatura:
0C.
- temperaturas de 40, 50 y 60
- presiones de 8,3; 9,7; 14,5; 17,2; 19,3; 24.1; 29,0 y 33,8 MPs.
127
CapItulo 2. AplicacIn a lo extraccin de grasa lcteo de nota.
El volumen de CO2 de cada extraccin fue de 350 L y el flujo medido a presin
atmosfrica de 1,5-2 L/min. Las extracciones se realizaron en cada condicin por

duplicado.
Posteriormente, y a la vista de los resultados, se realiz una segunda serie de duplicados

afladiendo 100 bolitas de vidrio de 4 mm de dimetro como dispersantes de la nata para
aumentar la superficie de contacto con el CO2 y evitar la formacin de canales
preferenciales.
2.5.1- Optimizacin delflujo de CO2 supercrftlco
La variacin de la potencia de la bomba entre porcentajes del 30 y 100% del recorrido

total del mbolo proporcionaron flujos comprendidos entre los 0,4 y 3 L/min, medidos a
presin atmosfrica. La figura 2.5.1 muestra la variacin de la cantidad de colesterol
extrado respecto a la variacin del flujo proporcionado por la bomba. Como se puede
observar se alcanza un mximo de colesterol extrado a flujos comprendidos entre 1,5 y
2,2 L/min, siendo los valores mayores obtenidos en los anlisis de 1,65 y 1,75 mg/g nata.
Se concluy que la mayor extraccin de colesterol se produca consiguiendo flujos de

CO2 entre 1,5 y 2 L/min. FLujos inferiores producan extracciones menores de colesterol
debido a la lenta renovacin de CO2 y su consiguiente mayor grado de saturacin de
colesterol, a 0,48 Llmin se produjo la menor extraccin con 0,42 mg colesterol extraido/g
nata. Flujos superiores a 2 L/min eran demasiado altos para un buen intercambio de
colesterol entre la nata y el CO2, la extraccin descendi hasta 1,10 mg/g con el flujo de
2,94 L/nin.
128
CnInctnrnI nv*rn <~ ~,
1~gg <u/o 2. AplIcacIn a la extraccIn de gPOSd lctea de nola
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0
flujo de Dldxdo de Carbono (L/min)
Figura 2.5.1, Influencia del flujo de dixido de carbono en la extraccin de colesterol
Colesterol Extrado de Nata (rng/g)

1 00
4;
0,80 JI
0,60
0,40
0,20
0,00
loo 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 100
Volumen de Olxido de Carbono (L)
Figura 2.5.2. InfluencIa del volumen de dixido de carbono en la extraccin de colesterol
29
rr
Capitulo 2, Aplicacin a la extraccin de gras lctea de nata.
2.5.2- Optimizacin del volumen de CO2 supereritico
Se observ que, en las condiciones estudiadas, la extraccin de colesterol aumentaba

conforme lo haca el volumen de CO2 hasta llegar a los 600 L (figura 2.5.2). A partir de
este volumen la extraccin de colesterol llega a un mximo, tras el que un aumento de
volumen no produce una mayor cantidad de colesterol extrada, siendo este mximo de
0,96 mg/g nata.
Se eligi realizar las siguientes extracciones con volmenes de 350 L de CO2. Volmenes
superiores alargan excesivamente la duracin de la extraccin (ms de 4 h), no siendo
viable la realizacin del estudio planteado. Adems, tiempos prolongados de extraccin
conducen a la extraccin mxima de todos los compuestos de la grasa lctea, siendo la
extraccin selectiva de colesterol menor respecto a la de los triglicridos. Estas
conclusiones se vieron corroboradas por los resultados posteriores de extraccin de grasa
total, colesterol y la selectividad conseguida (apartados 2.5.3, 2.5.5 y 2.5,7).
As pues, las siguientes extracciones se realizaron con un flujo de 1,5-2 L C02/min

consumiendo 350 L.
2.5.3- Efecto en la atraccin de grasa
La muestra de nata de la que se parti tena un contenido en grasa del 69%.
En las tabla 2.5.3 a y b se indican las masas de extracto obtenidas para cada condicin de
presin y temperatura y para extracciones realizadas sin y con presencia de bolas de
vidrio respectivamente. Tambin se indica la solubilidad de la grasa en cada extraccin
expresada como mg grasa/L CO2. En las figuras 2.5.3 a y b se representa la cantidad de
130
CapItulo Aplicacin a la extraccin dc rasttlfteafle nd/4
Cupuiu 2. u pkusu u ~ tWn,n.J tgttS$4 JJS<3X flA;
Tabla 2.5.3a. Masa y solubilidad de la grasa extrada sin bolas de vidrio.
Temperatura1
40 50 60
Presin2 Extracto3 Solubilidad4 Extracto Solubilidad Extracto Solubilidad
8,3 0,14 0,40 0,14 0,40 0,03 0,09
9,7 0,5 1,43 - - 0,02 0,06
14,5 2,53 7,23 0,58 .66 0,29 0,83
17,2 3,47 9,91 1,59 4,54 1,48 4,23
19,3 3,62 10,34 3,57 10,20 2,12 6,06
24,1 4,41 12,60 3,77 10,77 5,79 16,54
29,0 3,62 10,34 4,95 14,14 5,97 17,06
33,8 5,18 14,80 4,64 13,26 6,07 17,34
temperatura en oc, 2 presin en MPa, 3niasa de extracto en g, 4salubiiidad expresada como mg grasa
extraida/L CO
2
<3
Tabla 2.5.3b. Masa y solubilidad de la grasa extrada con bolas de vidrio. ~0
Temperatura
40 50 60
2 Extracto3 Solubilidad Extracto Solubilidad Extracto Solubilidad
Presin 0,20 0,04 0,11
8,3 0,05 0,14 0,07 1
0,08 0,23 0,15 0,43 0,16 0,46 1

9,7
ji
14,5 2,36 6,74 0,75 2, 4
13,06 2,09 5,97 1,37 3.9,
17,2 4,57 4..
4,46 12,74 2,96 8,46 3,05 8,71

19,3
4,60 3,14 5,17 4,77 4,63 13.23
24,1
14,57 5,71 16,31 5,73 16,37 2
29,0 5,10
5,83 5,25 15,00
33,8 5,81 16,60 5,54
temperatura en 0c, 2 1niasa de extracto en & 4scbibikdad expresada como mg grasa
presin en MPa,
cxtra.da/L CO
2 It
128 131
SI
grasa no extrada, estimada por diferencia entre el contenido de grasa de la muestra sin
tratar y la cantidad de grasa extrada.
Observando los resultados se aprecia que la solubilidad y el rendimiento de la extraccin

aumentan confonne aumenta la presin en el rango estudiado de presiones y
temperaturas. El efecto de la temperatura vara dependiendo de la presin a la que se ha
realizado la extraccin.
Los ensayos realizados a presiones menores a 20 MPa ofrecieron mayores valores de

solubilidad cuando la temperatura era de 40 0C, siendo semejante la solubilidad de la
grasa para las extracciones a 50 y 60 0C. Este hecho se debe a que el factor ms
importante en el aumento de la solubilidad de la grasa es el aumento de la densidad del
CO
2 supereritico, que se produce al disminuir la tempratura a la que se somete el fluido.
Los resultados coinciden con los expuestos para el estudio realizado con leche en polvo
(Hierro, 1994) en condiciones semejantes y en mantequilla (Chen y col., 1992a).
Los ensayos realizados a presiones mayores de 20 MPa conducen a resultados de

solubilidad diferentes segn se hayan realizado con o sin bolas de vidrio. El rendimiento
conseguido en los primeros ensayos, sin bolas de vidrio, es menor a las temperaturas de
0C que a 60 0C. Este comportamientO se debe a que a la mayor temperatura la
40 y 50
nata presenta un estado ms fluido, menos compactado, facilitando la difusin del CO
2 y,
por tanto, la transferencia de masa. Los segundos ensayos, realizados con bolas de vidtic~
0C. Fueron
dieron lugar a rendimientos semejantes entre si y la extraccin anterior a 60
los mayores rendimientos que se pudieron conseguir en todas las extracciones realizadas.
Estos resultados mostraron defmitivamente la efectividad de la adicin de un soporte
slido, como las bolas de vidrio, para conseguir una mejor dispersin de la nata, aumentar
la superficie de contacto con el CO
2 e impedir la formacin de canales preferenciales,
como ocurra en la primera serie de extracciones realizadas, donde los resultados flieron
menos satisfactorios. El efecto del aumento de superficie de contacto con el CO2 coincide
con el conseguido por Snyder y col. (1984) para la obtencin de aceite de soja a partir de
133
grano entero, copos o harina. Estos autores no slo resaltan la importancia de aumentar la
superficie, sino tambin la de impedir la compresin de la muestra con el aumento de la
presin, que dara lugar a aparicin de canales preferenciales y zonas inaccesibles al
fluido. De este modo, las bolas de vidrio constituyen un soporte que aumenta la superficie
de la nata y, a la vez, es slido, inerte y resistente a la presin.
En estas condiciones de presin mayor a 20 MPa se observ que el efecto de la densidad

sobre la solubilidad de la grasa era contrarrestado por el efecto de la presin de vapor de
los compuestos extrados. A estas presiones el efecto del aumento de la presin de vapor
sobre la solubilidad adquiere ms importancia que el efecto de la disminucin de la
densidad del CO2 al aumentar la temperatura, contrariamente a como ocurri a presiones
0C
menores a 20 MPa. Este hecho produce que el rendimiento de la extraccin a 60 y 50
se iguale al conseguido a 40 0C. Shishikura y col. (1986) observaron que la extraccin de
los lpidos disminua al aumentar la presin utilizando mantequilla, mientras que la
extraccin aumentaba de forma lineal en el caso de la grasa anhidra, suponiendo la
presencia de agua como la causa de las diferencias encontradas. Sin embargo, estos
resultados difieren de los obtenidos en el presente trabajo, siendo intermedios entre los de
grasa anhidra y mantequilla en el estudio antes mencionado. Los resultados distintos
pueden suponer que el signo de la emulsin es tambin un factor a tener en cuenta a la
hora de elegir un sustrato para la extraccin. Los resultados tambin difieren de los
obtenidos por Yu y col. (1992) con grasa anhidra, la extraccin de grasa fue siempre
menor a 60 0C que a 40 0C incluso a las ms altas presiones (31 Mpa).
En la tabla 2.5.3c se indican las densidades de CO

2 supercritico que existen en las
diferentes condiciones de presin y temperatura calculadas segn la modificacin de
Pitzer sobre la ecuacin de los gases ideales (Pitzer, 1955; Pitzer y col., 1955).
134
a
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccin de grasa Iatea de nata,
Tabla 2.5.3c. Densidades de CO2 supercrltico en las condiciones de estudio (SP-
SolverrM, Program Iseo, Inc.).

Densidad (g/mL)
Presp}MPa) 40
0C 50 0C &o 0C
0,34 0,24 0,20
8,3
0,56 0,35 0,27
9,7
0,78 0,69 0,58
14,5
17,2
19,3
0,82
0,84
0,75
0,78
0,67
0,72
11

0,88 0,83 0,78

24,1
0,91 0,87 0,83
29,0
0,94 0,90 0,86
33,8
4
~4I~
Teniendo en cuenta nicamente las densidades de cada extraccin en la variacin de la
4:
solubilidad de la grasa se observa que, se produce un rpido aumento de la solubilidad a
partir de 0,62 gImL para la temperatura de 60 0C, 0,69 g/mL para 50 0C y 0,78 g/mL para
40C, siendo este aumento semejante en las tres temperaturas, aunque la solubilidad a 60
il~
es mayor a una densidad constante debido al aumento de la presin de vapor de los
componentes del extracto, que se suma al efecto de la densidad (figura 2.5.3c). Los
resultados de Yu y col., (1992) difieren con los del presente estudio en resaltaz una
densidad tras la cual se experimentaba un rpido aumento de la densidad y que es de 0,5
g/mL para 40 oc y 0,6 para 60 0C, no observndose en el estudio influencia del aumento
de la presin de vapor al aumentar la temperaturas incluso a densidades altas.
2.5.4- Efecto sobre la humedad de la nata
El contenido de agua de la nata una vez tratada con CO

2 supercritico tambin es
dependiente de la presin y temperatura de las extracciones, La humedad de la nata varia
135
Capitulo 2 Aplicacin a la extraccIn de grasa lctea de nata,
en parte debido a que se extrae junto con el CO2 y en parte porque la fraccin grasa de Ja
nata es mucho ms soluble en el fluido supercrtico, influyendo en el porcentaje de agua.

Los resultados de las medidas quedan reflejados en la grfica 2.5.4.
0C la disminucin de la humedad
La extraccin por arrastre est confirmada porque a 60
esmayorquea400Cy5o0C.
A las densidades de 0,20 y 0,24 gImL existe una extraccin importante de agua que hace
que los porcentajes en el residuo sean inferores a los de la nata original (28%). Esta
humedad se mantiene hasta densidades cercanas a 0,60 g/mL o desciende levemente, este
hecho puede explicarse porque, si bien hay una extraccin de agua, hay una pequea pero
progresiva disminucin del contenido de grasa en la nata. Densidades superiores
producen un rpido aumento de la solubilidad de la grasa, y la nata con tan bajo
contenido en grasa da como resultado un aumento de la humedad hasta un .50%.
Los resultados se asemejan a los obtenidos por Snyder y col. (1984) a partir de soja, es
decir, que la humedad de los residuos va aumentando con la presin. La causa es la
extraccin mayor de compuestos lipdicos por ser stos ms solubles en CO
2 supercrftico.
2. 5,5- Efecto sobre la extraccin de colesterol
La nata de partida tena un contenido de colesterol de 2,20 mg/g.
Los resultados de las extracciones con CO2 supercritico sobre la concentracin de

colesterol resultante en las natas tratadas quedan reflejados en las tablas 2.5.5 a y b. Las
figuras 2.5.5 a y b representan el efecto de la presin y la temperatura sobre la
disminucin de la concentracin del colesterol, El las primeras extracciones, realizadas
sin bolas de vidrio se obtuvo un bajo rendimiento en general para todas las presiones y
temperaturas estudiadas, con excepcin de las realizadas a 33,8 MPa. El contenido en
137
449j
CapItulo 2. AplicacIn a la exfrtxtdn t nne Man & nata

4~ A~t WUCWC O Mi cxuiati SM #~F~U PMIM~
Tabla 2.5.Sa. Concentracin de colesterol en la nata sin bolas de vidrio tras el

tratamiento con CO2 supereritico.
trscln de colesterol ~~WC

0C so 0C
Presin (MPs) 40 60 C
8,3 2,27 2,02
2,14
9,7 2,42 2,01 2,37
14,5 2,04 1.95 1,68
l7,2 1,93 1,98 1,54
19,3 1,77 1,70 1,40
24,1 1,70 1,69 1,50
29,0 1,64 1,74 .43
33,8 - 0,76 0,86
Tabla 2.5.5b. Concentracin de colesterol en la nata con bolas de vidrio tras cl

tratamiento con CO
2 superertico 339
K,1
de colesterol (mg/e) 4
Concentracin
0C 50W 60 C
Presin (MPs) 40
8,3 1,92 1,61 1.29
9,7 1,77 1,64 1,10
14,5 1,12 1,52 1,07

17,2 0,96 0,70 0,71
19,3 0,63 0,72 0,66
24,1 0.59 0,54 0,64
29,0 0,62 0.61 0,61
33,8 O~59 0,61 0,57
35 138
colesterol tras el tratamiento a 9,7 MPa es superior o igual al de 8,3 MPa en las tres
temperaturas, pudindose explicar por haber una menor cantidad de agua en la nata. Se
observa que a presiones entre 14,5 y 29,0 MPa el aumento en la extraccin de colesterol
es casi inexistente, pero a 33,9 MPa hay un brusco aumento en el que se extrae el 65%
del colesterol de la nata de partida. La solubilidad del colesterol es generalmente mayor a
60 C que a las otras temperaturas por el efecto del aumento de la presin de vapor ya
comentado anteriormente.
En el caso de las extracciones realizadas con bolas de vidrio se puede observar que el
rendimiento de la extraccin de colesterol aumenta sensiblemente en comparacin con los
ensayos anteriores, sobre todo a partir de 14,5 MPa, y se mantiene para presiones
mayores. Estos resultados muestran claramente la necesidad de dispersar la nata en un
soporte slido para aumentar el contacto entre las fases y la transferencia de masa por el
aumento de la dispersin del CO2 en la muestra a tratar. El rendimiento llega a ser de un
75%. Estos resultados mejoran otros obtenidos anteriormente por Yu y col. (1992)
utilizando grasa anhidra, mediante los que consigui en las condiciones de mayor
0C) un rendimiento del 20%.
extraccin de colesterol (31 MPa y 40
Los resultados mejoran los obtenidos por Shishilwra y col. (1986), ya que, utilizando
mantequilla, observaron una gran disminucin del rendimiento en la extraccin de grasa a
partir de 20 MPa y 40 0C, y un enriquecimiento en triglicridos de cadena larga, con lo
que el rendimiento en la extraccin de colesterol fue muy bajo a partir de esta presin y
los extractos se empobrecieron en colesterol. El estudio llevado a cabo con grasa anhidra
proporcion un mejor rendimiento en la extraccin de grasa y de colesterol, con lo que la
selectividad conseguida fue baja. En el presente trabajo se obtuvieron residuos con
niveles intermedios de grasa y de colesterol.
El efecto de la densidad del CO

2 y la temperatura de tratamiento se representa en las
figuras 2.5.5 c y d (sin y con presencia de bolas de vidrio respectivamente). En ambos
0C son siempre los que producen una mayor
casos se aprecia que los tratamientos a 60
140
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nata,
solubilidad del colesterol en el fluido supercrftico (excepto a 0,20 y 0,27 g/mL y 60 0C en

las extracciones sin bolas). De esta forma se destaca que, si bien la densidad es un factor
a considerar, la temperatura es un factor determinante para la extraccin de colesterol. De
hecho, el mayor rendimiento se alcanza ya a 60 0C con una densidad (0,67 g/mL) menor
que a 50 0C (0,75 g/mL), y an menor que a 40 0C (0,82 g/mL). Este comportamiento es
semejante al que se produce en el caso de la extraccin de la fraccin grasa total
(apartado 2.5.3).
2. 6- Efecto sobre la extraccin de triglicridos
Los extractos obtenidos se consideraron compuestos por triglicridos casi en su totalidad.

De esta forma se puede considerar la variacin de la cantidad de extracto obtenido como
la variacin en la extraccin de triglicridos. Tras los anlisis por HPLC de los
triglicridos no extrados, se calcularon las cantidades relativas de triglicridos
atendiendo a:
- NEC =34 (triglicridos de cadena corta e insaturados de cadena media o larga),

- 34 <NEC =40 (triglicridos de cadena media e insaturados de cadena larga),
- NEC > 40 (triglicridos de cadena larga, sean saturados o insaturados).
Aparte de las diferencias ya discutidas en el apartado 2.5.3 sobre el rendimiento de la

extraccin entre las realizadas sin o con bolas no se encontraron otras diferencias. Las
cantidades relativas de triglicridos de distinto NEC y grado de saturacin fueron las
mismas para las extracciones sin y con bolas para cada condicin de presin y
temperatura.
En la tabla 2.5.6 se muestran las cantidades relativas de triglicridos segn su NEC,

temperatura y presin. Se observa que para las tres temperaturas de estudio los extractos
142
Captulo 2. Aplicacin a 4 extraccin de grasa lctea de nata
ti it <fl00 QN a en
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140 43
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Capitulo 2. AplicacIn a la extraccin de grasa lctea de nata.

de presiones menor y mayor (8,3 y 33,4 MPa) tienen una composicin similar a la
fraccin triglicrica de la nata de partida (24,53% NEC =34; 38,93% 34 <NEC =40;
NEC > 40)con la nica diferencia de la masa de extracto total obtenida. nicamente a
presiones intermedias se consigue mejorar la selectividad de la extraccin, al aumentar la
extraccin de triglicridos de NEC =40 y disminuir la de los de NEC> 40. La mxima
selectividad de la extraccin se consigue a 17,2, 19,3 y 24,1 MPa a las temperaturas de
40, 50 y 60 0C respectivamente. mejorndose la selectividad conseguida al aumentar la
temperatura. Estos resultados nos indican claramente la influencia positiva de la
temperatura en el aumento de la solubilidad de triglicridos con menor punto de fusin
(insaturados y de cadena corta y media) por aumento de su presin de vapor; si bien, con
las presiones ms elevadas mejora la extraccin de los triglicridos de mayor punto de
fusin. Las figuras 2,5.6a y b representan respectivamente el crornatograma de
triglicridos de la nata de partida o control y tras el tratamiento a 24,1 MPa y 60 0C.
9)
En la grfica 2.5.6c puede verse la influencia de la densidad en la selectividad de la gi~s

extraccin de los distintos tipos de triglicridos. Existe una densidad (0,8 g/mL) alrededor 2
de la cual se alcanza un mximo en la selectividad de la extraccin de triglicridos con
NEC <40 independientemente de la temperatura de tratamiento, aunque sta contribuye

a mejorar esta selectividad segn se ha comentado anteriormente. A densidades menores
o mayores se pierde la selectividad por aumento de la extraccin de triglicridos con
NEC > 40.
Estos resultados difieren en parte con los obtenidos en investigaciones anteriores de grasa
lctea realizada por otros autores. Chen y col. (1992a), estudiando la grasa lctea anhidra,
obtienen resultados semejantes en lo referido a la variacin de la solubilidad de los
triglicridos totales respecto a la presin y temperatura, observando que la extraccn
mejoraba al aumentar la presin y disminuir la temperatura, excepto a presiones altas, en
las que la temperatura produca poca influencia, explicndose este comportamiento por el
balance entre el efecto de la densidad del CO
2 y el efecto de la presin de vapor de los
144
0 20 40 so so 100 120 140 160
tiempo (mm)
o 20 40 60 80 100 120 140 160
tiempo (mm)
Figura 2.5.6a: trigllcrldos de la nata control, b: triglcrldos de nata

tratada a 24,1 MPa y 60 C
145
CapItulo 2. Aplicacin a la extraccIn de grasa lctea de nata.
triglicridos. Shukla y col. (1994) realizaron un tratamiento a 40 0C y 24,1 MPa

utilizando grasa anhidra, obteniendo un extracto rico en triglicridos de alto NC y ND, lo
que difiere con los resultados de esta investigacin (aumento de la extraccin de
trglicridos de NEC =40), si bien existen triglicridos insaturados de alto NC con NEC
=40. Las diferencias encontradas pueden ser debidas a que la nata contiene agua y
adems es una emulsin de signo O/A.
2.5. 7- Selectividad del CO

2 superertico en la extraccin de colesterol
Majewski y col. (1994) definieron el coeficiente de selectividad del CO2 supercrtico para
la extraccin de colesterol basndose en la coextraccin del colesterol y los triglicridos.
El colesterol, tericamente menos soluble en el CO2 supercritico que los triglicridos,
posee una alta afinidad por los triglicridos de cadena corta y media. Refirindose a la
concentracin de colesterol y cidos grasos en los sustratos antes y tras su tratamiento,
definieron el coeficiente de selectividad de la siguiente manera:
re/acion colesterol acdos grasos NC < 14 en control

Selectividad = // NC ~ (2.43)
~,
Los cidos grasos de menos de 14 tomos de carbono son los de cadena corta y media.
Del mismo modo se pueden realizar los clculos con triglicridos de NEC < 42,
constituyndose la ecuacin de la manera indicada:
relacion colesterol / trigliceridos NEC < 42 en control

Selectividad =
relacion colesterol / trigliceridos NEC c 42 en residuo (2.44)
La figura 2.5.7 representa los resultados obtenidos del clculo de la selectividad. La

0C cuando la densidad es menor a 0,7 g/mL, es decir,
mejor selectividad se produce a 60
la selectividad mejora si se reduce la densidad. La selectividad empeora con la
147
Capitulo 2. AplicacIn a la extraccin de grasa flotea de natfli
disminucin de temperatura y los mximos se consiguen a densidades de 0,8 y 0,9 g/mL

para 50 y 40 0C respectivamente. Los resultados coinciden con los de Majewski y col.
(1994) sobre los estudios con grasa lctea anhidra en que a presin adecuada para
conseguir la mejor selectividad a 60 0C est entre 15 y 17,5 MPa. Los resultados difieren
en que en su estudio la selectividad es mejor a 50 que a 60 0C, pero sealan que no es
cierto que estos resultados puedan ser fiables totalmente. Los resultados tambin
concuerdan con los de Yu y col. (1992), donde la mayor selectividad se consigui a
presiones menores de 15 MPa cuando la temperatura fue de 60 0C (la densidad era menor
de 0,6 g/rnL); la disminucin de temperatura hasta los 40 0C produjo que la selectividad
alcanzada fuera menor que a 60 0C, si bien el mximo tambin se alcanz en el mismo
intervalo de presiones (la densidad fue menor de 0,8 gImL), al contrario que lo obtenido
por lvlajewski y col. (1994) en el mismo sustrato.
148
Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa lctea de nota.
ANLISIS POR ESPECTROMETRIA DE 3C-RMN
2.6.1- Preparacin de la muestray extraccin de grasa de nata
La nata, de leche cruda de oveja procedente del Complejo Agropecuario Comunidad de

Madrid en Aranjuez, se obtuvo del mismo modo a la del apartado 2.2.1.
Las extracciones se realizaron en modo dinmico con un volumen de CO

2 de 360 L en las
siguientes condiciones:
presiones de 13,8, 17,2, 20,7 y 24,1 MPa,

0C.
temperaturas de 40 y 60
2.6.2- Anlisis de los extractos mediante espectrometria de resonancia

magntica nuclear del C
Se pesaron 100 mg de los extractos obtenidos y se disolvieron en cloroformo para su

filtracin en papel 1 PS (Whatman). Posteriormente se evapor el disolvente mediante una
corriente de N
2 y el extracto seco se redisolvi en cloroformo deuteraclo para su anlisis.
13C. Los valores de los

El equipo utilizado fue un Varian XL-300 de 75 MHz en
desplazamientos qumicos se expresaron un unidades 5 (ppn. Los espectros se realizaron
por triplicado.
149
2. 7. 1- Anlisis de los extractos mediante resonancia magntica nuclear del 3C
El espectro obtenido a partir de la grasa lctea antes de los tratamientos se encuentra

representado en la figura 2.7,la, Las figuras 2.7.lb, c y d son ampliaciones de las
regiones carbonlica, olefinica y saturada respectivamente. Se observa la baja sensibilidad
de la tcnica espectroscpica ya que solamente es posible la deteccin de los compuestos
mayoritarios, en este caso los triglicridos. No fue posible la deteccin de colesterol.
Sin embargo, pudo realizarse un anlisis de distribucin posicional de los cidos grasos
que componen los triglicridos, detectndose cidos grasos de cadena corta unidos
nicamente en la posicin a (o a) En la tabla 2.7.1 se detallan los desplazamientos
qumicos colTeSpOndientes a cada seal y el grupo funcional que se ha asignado.
Tabla 2.7.1. Desplazamientos quimicos y grupos funcionales asignados tras el anlisis

por 13C-RMN de los triglicridos de la grasa lctea de oveja.
5 (ppm) Carbono correspondiente

173,220 Ca a.g. saturados
173,185 Cl cza.g. insaturados
173,018 Clcz(Bu)
172,820 Cl~ a.g. saturados
172,784 Cl 1~ a.g. insaturados
131,959 HC (Ln)
130,315 HC<V)
130,220 HCC(L,Lfl)
130,025 H& (O, E)
129,715 HCIO)
128,312 HC=(Ln)
50
Captulo 2. Aplicacin a la exfraccin de grasa lctea de nata.
tabla 2.7.1 (continuacin)

128,280 HC (Ln)
128,137 HC=(L)
127,954 HC= (L)
127,780 HC=.(Ln)
127,181 HC=(Ln)
68,972 HC-O- (ji)
62,129 H2C-O-(c~)
3 5,943 C2a (Bu)

34,242 C2ji
34,073 C2a
32,6 18 C}12-CH trans
32,592 CH2-CH trans
31,956 o3
31,814 w3n-7(V)
31,684 w3 (Cl)
31,553 w3 csn-6
31,280 w3 (Co)
29,8-28,9 -(CH2)0-
27,254 CHrCH CIS
27,202 CH2-CH eL
2 5,668 =CH-CHrH& (Cl 1 de L y Ln)
25,568 t~CH~CHz-HC (C14 de Ln)
24,936 C3ji
24,903 C3ct
24,565 C3 (Co)
22,775 0)2(L)
22,700
22,305 w2 (Co)
20,600 w2 (Ln)
151
tabla 2.7. 1 (continuacin)

18,369 w2 C3 (Bu)
14,252 ml (Ln)
14,093 col
14,000 ml (L)
13,862 ml (Co)
13,602 col (Bu)
cidos grasos
Los datos obtenidos permiten la cuantificacin de los cidos grasos de cadena corta de
forma separada del resto de cidos grasos; esto mismo es posible con los cidos grasos
poliinaturados. Tambin es posible cuantificar los cidos grasos (ram separadamente de
los cis.
Se calcul un nmero de carbonos medio a partir de las integrales de los extractos

analizados de la fonna siguiente:
(CH, +CH, +CH= + 1) x3

NC-~ COZ] (2.45)
La relacin de carbonos insaturados frente a saturados:
1= S CH2 +CH,
(2.46)
Tambin se calcularon los porcentajes molares de:
- cido butrico, a partir de m2 (C3),

- cido caproico, a partir de m3,
152
- acido caprlico, a partir de m3,

- carbonos trans en el total de insaturados a partir de los carbonos allicos,
- acidos linoleico y linolnico en el total de cidos grasos insaturados, expresado
como cido linoleico.
Los resultados obtenidos se presentan en las figuras 2.7.1 (e - k). Se observa que, a
temperatura constante, conforme aumenta la presin hay un aumento en el nmero de
carbonos medio del extracto por aumento progresivo de la densidad (figura 2.7. le), lo
que se traduce en un aumento de la extraccin de triglicridos de alto peso molecular. La
disminucin de la temperatura produce una mayor extraccin de estos triglicridos por
aumento de la densidad a una presin constante a partir de 17,2 MPa. Por el contrario, a
la menor presin del estudio (13,8 MPa), el aumento de la temperatura produce un
aumento de la extraccin de triglicridos de mayor peso molecular; esto se debe a que el
aumento de la temperatura conduce a un evidente favorecimiento de la extraccin por
arrastre de aquellos triglicridos de mayor punto de fusin, estos triglicridos son ms
dificiles de extraer si la temperatura es baja (40 0C), ya que las condiciones de baja
presin del tratamiento producen una densidad baja, con poca capacidad para extraer los
triglicridos de mayor NC nicamente por efecto de la solubilizacin en el fluido. A las
presiones intermedias, 17,2 y 20,7 MPa, la mayor densidad a 40 0C que a 60 0C es ya
suficiente para que se extraigan los triglicridos de mayor peso molecular en mayores
cantidades, ya que a estas presiones pequeas variaciones de presin conducen a grandes
variaciones de densidad. A 24, 1 MPa, la presin es tan alta que no existen apenas
diferencias de densidad entre 40 y 60 C, el nmero medio de carbonos se iguala en las
dos temperaturas por verse favorecida la extraccin de los triglicridos de mayor NC con
el aumento de su presin de vapor a 60 0C.
Se observa en la figura 2.7. lf que el aumento de densidad al aumentar la presin y a

temperatura constante produce un aumento de la extraccin de los triglicridos
insaturados, excepto a la presin de 24,1 MPa, en corcondancia con el aumento -de los
triglicridos de mayor NC (figura 2.7. le) porque la mayor parte de los triglicridos
153
CapItulo 2. AplicacIn a/a extrt&2cin de grasa lctea-de nata.
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Capitulo 2. Aplicacin a la extraccin de grasa flotea de ntq,
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insaturados son de alto NC. La mayor densidad conseguida a 40 0C y 24,1 NIPa produce
un aumento de la extraccin de triglicridos saturados de cadena larga, por lo que la
relacin i/s disminuye. A 60 0C estas variaciones son apenas apreciables.
El mayor porcentaje molar de cido butrico (figura 2,7. lg) conseguido a mayores
temperaturas y menores presiones supone que los triglicridos que contienen ste cido
graso (el de menor NC) son los ms fcilmente extraibles conforme las densidades
empleadas son menoresa temperatura constante, contribuyendo, adems, de modo
importante el efecto del aumento de su presin de vapor al utilizar tempertaras mayores
(60 0C). A las dos presiones intermedias estudiadas se produce un descenso en la
extraccin de butrico por aumento de la extaccin de triglicridos que contienen cidos
caproico y caprlico, que se recupera en parte a 24,1 MPa. Los cidos caproico y caprlico
se extraen en mayor proporcin en condiciones intermedias de presin (17,2 y 20,7 MPa)
a 40 0C (figuras 2.7.1 h e i) contrariamente a la extraccin de butrico, condiciones en las
que hay una mayor extraccin de triglicridos de cadena inedia. El efecto producido a 60
0C y 13,8 MPa es el mismo que ocurre en la variacin del NC medio.
En general se observa una mayor solubilidad de triglicridos con insaturaciones cts que
irans a presiones bajas, hecho que produce que los extractos tengan una composicin
enriquecida en cidos cts respecto al control. Este resultado puede explicarse ya que los
enlaces cis producen menores puntos de fusin que los trans en las molculas,
favoreciendo su extraccin. El aumento de la densidad al aumentar la presin produce el
efecto contrario, apareciendo extractos ricos en cidos trans-insaturados respecto al
control. El efecto del aumento de la temperatura en el aumento de la presin de vapor de
aquellos triglicridos menos voltiles, los que poseen enlaces Irans, es evidenciable a
presiones de 13,8 MPa, donde la densidad tan baja es poco eficaz para una buena
extraccin, y a 24,1 MPa, donde la densidad a 40 y 60 0C muestra apenas diferencias.
Los cidos grasos poiinsaturados forman parte de triglicridos de bajo NEC y se extraen
de forma ms selectiva a las menores presiones y 60 0C en comparacin con los cidos
160
grasos monoinsaturados, debido a que las menores condiciones de densidad favorecen la

extaccin selectiva de aquellos triglicridos de menor punto de fusin, como son los
PUFAs.
Los resultados que se refieren a la variacin en la extraccin de los triglicridos segn su

NC concuerdan con los aportados anteriormente en los trabajos realizados sobre la
composicin de grasa lctea y su extraccin con CO2 supercrtico, teniendo en cuenta que
los sustratos utilizados en los anteriores trabajos son mantequilla (con el signo contrario
de emulsin) y grasa anhidra. Esto mismo ocurre con los resultados que se refieren a la
extraccin diferencial segn sean los triglicridos saturados o insaturados.
Los resultados referentes a la extraccin de triglicridos con insaturaciones en cts o trans

son los primeros realizados, igualmente a los que se refieren a la extraccin de los cidos
grasos de cadena corta y los PUFAs, y no han podido ser contrastados con otros
resultados de la bibliografia, ya que los estudios realizados por otros investigadores
solamente analizan las diferencias entre la extraccin de triglicridos saturados o
insaturados debido a que los mtodos de anlisis empleados generalmente (OC) no
distinguen entre ismeros geomtricos. Por la misma razn, el resto de resultados no son
totalmente comparables, ya que la nata es un sustrato que no ha sido utilizado para la
extaccin con CO2 supercrtico, la nica referencia es el trabajo de Hierro (1994).
3C-RtvliN han sido

Las mayores ventajas del anlisis de extractos por espectrometra de
la sencillez en la preparacin de la muestra, la posibilidad de realizar un anlisis de
mezclas complejas sin previa purificacin de la muestra y la consecuentemente rpida
obtencin de resultados, y que sea un mtodo no destructivo. Por contra, inconveniente
ha sido la baja sensibilidad que impide la deteccin de compuestos minoritarios, como el
colesterol, que sin embargo es cuantificable por HPLC. La espectrometra de 3C-RIVIN
ha podido ser utilizada como complemento al anlisis de triglicridos por HPLC. Resulta
una tcnica de eleccin para cuantificar parmetros, que para el HPLC son ms
complejos de averiguar, muy tiles a la hora de establecer la influencia de las condiciones
161
de extraccin supercrtica (presin y temperatura) sobre la grasa lctea: influencia sobre

la extraccin de los cidos de cadena corta (separadamente butrico, caproico y caprilico),
influencia sobre la extraccin de triglicridos con distinta isomeria geomtrica, y con
diferente grado de saturacin. En este sentido, la RMN aporta datos novedosos sobre los
resultados de la extraccin con dixido de carbono supercritico sobre la grasa de la nata.
162
Captulo 3.
Aplicacin de la atraccin con dixido de carbono
superertico a la modificacin del destilado de la
desodorizacin de aceites vegetales
Capitulo 3. AplIcacin al destilado de la desodorizacin de aceItes vegetales.
3.1- INTRODUCCION
3.1.1- Los aceites vegetales
Los aceites vegetales son productos naturales y, como tales, contienen muchas clases de
compuestos diferentes. Los triglicridos son los componentes mayoritarios, constituyendo
ms del 95% del aceite. Sin embargo los componentes minoritarios son tambin de gran
importancia, tanto para evaluar la calidad del aceite, procedencia o adulteraciones
posibles como por ser de inters en la industria qumica, alimentaria o cosmtica, como
los tocoferoles, esteroles, escualeno, etc.
3.1.2- El aceite de ojiva
El aceite de oliva es el procedente nicamente de los frutos del olivo (Oleo curopaca)
con exclusin de los aceites obtenidos por disolventes, o de orujo de aceituna refmado, o
por procedimientos de reesterificacin y de toda mezcla con aceites de otra naturaleza.
Este aceite es de gran importancia econmica en los paises mediterrneos,
particularmente en Espaa.
Dentro del aceite de oliva, a nivel comercial, se distinguen varios tipos (Madrid, 1986,
C.O.J., 24-11-1995):
Aceite de oliva virgen. Aceite obtenido del fruto del olivo nicamente por procedimientos
mecnicos o por otros medios fisicos en condiciones, especialmente tnnicas, que no
produzcan la alteracin del aceite, que no hayan tenido ms tratamiento que el lavado, la
decantacin, la centrifugacin y el filtrado. No se considerar apto para el consumo
humano el aceite de oliva virgen lampante.
Aceite de oliva refinado. Aceite de oliva obtenido del aceite de oliva virgen mediante
164
y .
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales
tcnicas de refinado que no provoquen modificaciones de la estructura gliceridica inicial,
Aceite de oliva (antes aceite puro de oliva o 100% puro de oliva). Aceite constituido por
una mezcla de aceite de oliva virgen apto para el consumo en la forma en que obtiene y
de aceite de oJiva refinado.
Aceite lampante es aquel de sabor defectuoso o de acidez superior al 3%, por lo que no se
considera comestible.
Aceite de orujo de oliva refinado es el aceite obtenido por tratamiento con disolventes de
los orujos de oliva, con exclusin de los aceites obtenidos por procedimientos de
reesterificacin y de toda mezcla con aceites de otra naturaleza.
3.1.3- Aceites de semillas oleaginosas
Son los aceites obtenidos de las semillas oleaginosas expresamente autorizadas de

acuerdo con las normas establecidas en la reglamentacin y sometidas a refinacin
completa previamente a su utilizacin como aceites para consumo humano (Madrid,
1986). A nivel mundial, estos aceites se consumen y producen en mayor cantidad que el
de oliva, si bien, en Espaa no tienen tanta importancia socioeconmica.
Entre otros, podemos citar e] aceite refinado de girasol, mafz, pepita de uva, crtamo
(producidos enteramente en Espaa), soja, cacahute, colza, algodn y mezclas de dos o
ms de ellos.
Los aceites de semillas no suelen comercializarse sin refinar, porque suelen proceder de
una extraccin con disolventes (como el hexano) y, en menor medida, de una extraccin
mecnica.
165
1
Capitulo 3. Aplicacin a~ destilado de Ja desodorizacin de aceites vegetales
3.1.4- Desodorizacin del aceite de oliva
El aceite de oliva necesita ser refinado cuando no es de buena calidad, lo que sucede
cuando se extrae de aceitunas tratadas de forma poco adecuada. Actualmente, la cantidad
de aceite de oliva sometido a refinacin ha disminuido debido a la mejora de los mtodos
de recoleccin, almacenamiento, procesado y otros factores. Sin embargo, el aceite de
oliva que tiene que ser refinado se suele someter a varas o a todas de las operaciones
siguientes:
- eliminacin de sustancias resinosas,

- neutralizacin de los cidos grasos libres,
- desodorizacin,
- decoloracin.
La desodorizacin es el proceso de eliminacin de las sustancias responsables de los

malos olores y sabores (aldehdos y cetonas sobre todo). Este proceso se lleva a cabo a
baja presin (3-5 mm Hg) y a alta temperatura (180-250 0C). La desodorizacin se suele
aplicar a aceites viejos que han desarrollado malos olores por oxidacin. El aceite de
oliva fresco rara vez necesita ser desodorizado. Con la desodorizacin se eliminan
tambin los residuos de plaguicidas (Kiritsakis, 1992). En los ltimos aos se ha
extendido mucho el uso de la llamada refinacin fisica del aceite de oliva, que consiste
en suprimir la etapa de neutralizacin separando los cidos grasos libres (con e] resto de
materias voltiles y algo de aceite neutro arrastrado) en el curso de la desodorizacin con
vapor de agua. Los productos arrastrados son principalmente cidos grasos, glicridos y
compuestos insaponificables, encontrndose estos ltimos en proporcin mucho ms alta
que en el aceite de partida. Este hecho aumenta el inters por el estudio del subproducto
obtenido, pudindose revalorizar, y que, adems, se produce en cantidades cada da
mayores a medida que se extiende la utilizacin de la refmacin fisica (Martnez-Moreno
y Serra-Masa, 1980).
166
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales.
El inters del destilado de la desodorizacin radica principalmente en la elevada

proporcin de compuestos insaponificables que posee. De ellos, el escualeno es el ms
abundante, seguido, en mucha menor cantidad de compuestos esterlicos, pudindose
utilizar el destilado como fuente de estos compuestos. El escualeno es un hidrocarburo
presente en abundancia en algunos aceites de pescado y normalmente se usa como agente
humectante o emoliente en cosmtica, adems de poseer inters por ser precursor en la
biosntesis del colesterol (Bondioli y col., 1993). Una razn que imita el uso del
escualeno en cosmtica es la incertidumbre de su disponibilidad como resultado de
convenios de proteccin de los animales marinos que son su fuente primaria de
obtencin. Este hecho ha aumentado el inters hacia el aprovechamiento de aceites
vegetales y, sobre todo, de los subproductos de su elaboracin, ya que son relativamente
abundantes, ms baratos y ricos en este compuesto. Otros compuestos presentes en el
destilado tambin son de inters, como el ~-sitosterol y estignasterol, que se ha visto que
poseen actividad sinrgica hipoglucemiante (Jamaluddin y col., 1994).
La metodologa analtica de los esteroles en grasas, aceites y alimentos en general se basa

normalmente en la extraccin de la materia insaponificable, aislamiento de la fraccin de
esteroles por cromatografia en capa fina y separacin de los componentes de la fraccin
por cromatografa gaseosa. Este mtodo es el oficial segn la legislacin espaola para
esteroles en grasas y aceites (B.O.E. nm. 274, 15 de noviembre de 1985). Otros mtodos
incluyen la utilizacin de una columna de cromatografia lquida preparativa sustituyendo
la saponificacin (Worthington y Hitchcock, 1984), o se basan en el acoplamiento LC-
GC (Grob y col., 1992; Artho y col., 1993; Seorns, 1996) o en la sustitucin del
anlisis mediante OC por el de HPLC utilizando detectores de varacin del ndice de
refraccin o UV (Cortesi y col., 1977; Holen, 1985). La desventaja que presenta el uso de
los detectores de ndice de refraccin o ultravioleta (X entre 205 y 210 tun) en el anlisis
de esteroles por HPLC es que no permiten hacer gradientes y por lo tanto es dificil
conseguir un mtodo que permita separar mezclas de un gran numero de esteroles. Para
167
1
aumentar la resolucin sera necesario el empleo de gradiente de fase mvil. Por ello en
este apartado se estudi inicialmente la aplicacin del detector de masa, utilizado ya en el
anlisis de otros componentes lipdicos como los triglicridos. Adems, el detector de
masa se puede utilizar para cuantificar escualeno junto con un nmero amplio de
esteroles.
Los anlisis de escualeno siguen los mismos mtodos que los ms comunes para el
anlisis de la fraccin esterlica, es decir, la separacin mediante cromatografa de gases
tras la saponificacin y la preseparacin por croxuatografla en capa fina, como es el
utilizado por Bondioli y col, (1993) para el anlisis de los extractos de DDO obtenidos
mediante extraccin con CO2 supercrtico. Otros mtodos ms recientes para el anlisis
en alimentos de escualeno utilizan la cromatografa de fluidos supercrticos (Staby y col.,

3C-RMN (Zamora y col., 1994), y el acoplamiento LC-GC
1994), la espectroscopia de
directo (Grog y col., 1992; Artho y col., 1993; Sefiorns, 1996).
ANLISIS DE LOS COMPUESTOS DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE

DEL DESTILADO DE LA DESODORIZACIN DE ACEITES VEGETALES
MEDIANTE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA
3.2.1- Preparacin de a muestra
Las muestras de destilado de la desodorizacin de aceite de oliva y girasol provinieron

del Instituto de la Grasa (C.S.I.C., Sevilla) y se mantuvieron en congelador hasta el
momento de su uso.
A 1 g de destilado se le aaden 50 mL de KOH metanlica 2N preparada en el da. Esta

mezcla se pone a calentar a reflujo durante 30 miii. La solucin restante se lleva a una
168
.
Capitulo 3. Aplicacin al desfilado de la desodorizacln de aceites vegetales.
ampolla de decantacin, y el matraz se lava con dos porciones de 25 nL de agua

destilada que tambin se llevan al embudo. Se aaden 10 mL de una solucin de NaC al
10% y se extrae con dos porciones de 100 mL de ter etlico/ter de petrleo (1:1). Se
recogen las -fases etreas, se concentran con un rotavapor hasta un volumen aproximado
de 5 mL y se filtran con papel separador de fase Wathman 1PS para eliminar restos de
fase hidroalcohlica; posteriormente se llevan a sequedad con el rotavapor. El residuo
obtenido se redisuelve en 1 mL de acetona para el anlisis de los esteroles. De la
disolucin anterior se reservan 0,5 mL y se llevan con acetona a un volumen final de 5
mL para el anlisis de escualeno.
3.2.2- Descripcin del equipo
El sistema cromatogrfico utilizado consisti en dos bombas modelo 125 (Beckman), un

inyector Rheodyne modelo 7125 con un bucle de carga de 20 gL, se utilizaron varias
columnas de acero inoxidable (para la optimizacin del anlisis cualitativo, apartado
3.2.3.1) de 4,6 mm de di. rellenas con Spherisorb ODS-2 de tamao de partcula variable
(Phase Separations, Syinta) en un bao de agua para el control de la temperatura. El
detector de masa fue un ACS 750/14 (Ihe Arsenal) con una temperatura en el evaporador
de 45 0C y 172 kPa de presin de aire, condiciones que se variaron para la realizacin del
anlisis cuantitativo. El aire a presin fue proporcionado por un compresor (Air Control)
y posteriormente secado por dos trampas de agua. Se utilizaron balas de aire para
alcanzar presiones de 276 kPa en el evaporador durante el estudio del detector, ya que el
compresor solamente proporcionaba presiones mximas de 210 kPa. Los vapores
formados eran eliminados por medio de un extractor. Los datos eran adquir dos a travs
de una interfase modelo 406 (Beckman) hasta un System Goid (Beckman).
La fase mvil consisti en eluciones en isocrtico o gradiente de metanol, etanol o so-

propanol en acetonitrilo, todos de grado HPLC (apartado 3.2.3.2). El flujo empleado fre
169
a
Capitulo .3. AplIcacin al destilado de la clesodorizacln de aceites vegetales.
de 1,5 mL/mm. Los mtodos de elucin de la fase mvil fueron controlados mediante el
programa System GoId (Beckman).
3.2.3- AndlisiLv cualitativo
La optimizacin en el anlisis cualitativo se llev a cabo para identificar los picos de las
muestras y para conseguir, en anlisis de corta duracin, una buena resolucin entre los
compuestos que facilitara la posterior cuantificacin. Para ello, se combinaron distintas
condiciones de longitud de columna y tamafio de partcula, tipo y proporcin de
modificador, temperatura de la columna y elucin isocrtica o con gradiente de polaridad.
Posteriormente se realiz un estudio estadstico de los factores de capacidad (k) y
resolucin (R) de pares crticos.
El anlisis cualitativo se llev a cabo inyectando por triplicado soluciones metanlicas de

desmosterol, ergosterol, lanosterol, fucosterol, colesterol, estigmasterol, cainpesterol, 13-
sitosterol y escualeno (Sigma Chemical) en concentraciones de 10 mg/mL.
3.2.3.1- Eleccin de la columna
Para es estudio del tipo de columna se utilizaron las tres que se disponan en el
laboratorio, que presentaban tres longitudes diferentes y dos tamaos de partcula:
- 7,5 cm longitud, 3 ~tmtamao de partcula

-1.5 5
-20 3
1.70
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegetales.
3.2.3.2- Eleccin de la fase mvil
La fase mvil estuvo constituida por acetonitrilo y un modificador de la polaridad. El

orden de polaridad de los eluyentes a la temperatura de estudio (45 0C) fue el siguiente:
acetonitrilo > metanol> etanol> iso-propanol.
Como estimacin de la polaridad del modificador se utiliz la constante dielctrica (e)

medida a temperatura ambiente a la hora de realizar los clculos en la obtencin de los
resultados. Las constantes son las siguientes:
- acetonitrilo, E 37,50;
=
- metanol, e = 32,63;
- etanol, e = 24,30;
- so-propanol, e = 18,30,
En primer lugar se realizaron estudios en elucin isocritica utilizando cada uno de los
modificadores en proporciones de O a 100%.
3.2.3.3- Eleccin del gradiente
La eleccin de gradiente se llev a cabo utilizando la columna de 20 cm. Se realizaron

gradientes de metanol en acetonitrilo de:
- 1, 2, 3, 4 y 5%/mm a partir del 0%,
- 4,5%/mm a partir del 10%,
- 4%/mm a partir del 20%.
171
3.2.3,4- Eleccin de la temperatura de la columna
Se estudi la resolucin en funcin de la temperatura de la columna Para ello se

program la temperatura del bao de agua a 35, 45 y 55 oc. Este estudio se realiz
utilizando la columna de 20 cm y un gradiente de metanol en acetonitrilo del 30/o/mrn,
3.2.3.5- Anlisis estadstico
Los resultados sobre tiempos de retencin de los patrones en cada una de las condiciones
estudiadas se utilizaron para establecer ecuaciones que relacionaran el k con las variables
del sistema cromatogrfico. En los casos en los que aparecieron pares crticos, la
utilizacin nicamente de k para la valoracin de los resultados careca de consistencia,
por lo que se decidi tener en cuenta la anchura de los picos calculando la resolucin y
establecer, as, las mejores condiciones de ehicin. La decisin del clculo de la
resolucin se debi principalmente a que el acetonitrilo de la fase mvil produca un
distanciamiento de los k, favoreciendo la separacin; sin embargo, tambin se favoreca
la fonnacin de colas en los picos, producindose solapamientos que podran dificultar la
cuantificacin. La resolucin se calcul a partir de la anchura del pico en la base,
inidindose sta de forma manual, ya que el programa informtico disponible (Suitability
de System GoId) no apreciaba la formacin de colas. En los casos en los que los picos
aparecieron solapados se utiliz el programa Peakfit de Jandel Scientific, versin V3. liB
para la descomposicin en gaussianas y posterior medida de las anchuras. La resolucin
se calcul segn la ecuacin:
Vr
WbI + Wbj (3.1)
2
siendo:
R la resolucin,
172
1
~3
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales.
A/r la variacin en los tiempos de retencin del par critico 1 y 2,

Wb la anchura en la base de los picos 1 y 2.
Las ecuaciones que relacionan /6 y 1? con las variables del mtodo de separacin se
obtuvieron mediante los programas iR y 9R de regresin lineal mltiple de I3MDP. El
programa 9R tiene la ventaja sobre el IR de que posee menores valores de tolerancia y
ofrece unos segundos resultados alternativos tras eliminar los puntos anmalos o hiera de
rango. Adems, da los valores de error de estimacin y prediccin.
3.24- Anlisis cuantitativo
3.2.4.1- Estudio del detector. Anlisis estadstico
El detector de masa posee amplias posibilidades aplicado al anlisis de compuestos

1?
ji
lipdicos, compuestos para los que el detector de indice de refraccin y el ultravioleta no
permiten la utilizacin de gradientes de polaridad. En la mayora de los casos, las razones
que conducen al uso de este detector son: tu
1
- la necesidad de utilizar gradientes de elucin para poder separar los componentes
de mezclas complejas, como son algunas grasas naturales, 1
y 41
- las fases mviles ms convenientes para estas separaciones absorben en la regin ?
U.v,
- los compuestos a analizar absorven poco a longitudes de onda superiores a 200
un.
Este detector puede ser utilizado con cualquier disolvente o mezclas de stos, siempre
que sean suficientemente voltiles y sobre todo, en relacin a los solutos, que no se
73
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales.
volatilicen en las condiciones del evaporador. En la figura 3.2.4.1 se muestra un esquema

del funcionamiento del detector. La fase mvil con compuestos ya separados es
nebulizada por medio de la entrada de aire a presin, que es factor determinante en el
tamao de las gotas formadas. Esta nebulizacin favorece la posterior volatilizacin en el
evaporador, que se mantiene a una temperatura a la que se volatilice la fase mvil, pero
no los solutos. Finalmente, los compuestos a detectar quedan formando pequeas
partculas slidas que provocan la desviacin de un haz de luz (principalmente por
reflexin y refraccin, Charlesworth, 1978), la luz dispersada se detecta en un
fotomultiplicador y es directamente proporcional a la masa de soluto. Adems de la
volatilidad del soluto, tambin influyen en la deteccin su estructura qumica y la
cantidad inyectada, ya que son otros factores que detenninan el tamao y nmero de
partculas formadas en el proceso de deteccin.
Se ha descrito por varios investigadores que la respuesta del detector de masa no es lineal
y que adems depende fuertemente de la temperatura del evaporador y, en menor medida,
de la presin del aire en el nebulizador y la cantidad inyectada (Charlesworth, 1978;
Macrae y Dick, 1981; Macrae y col., 1982; Stolyhwo y col., 1983, 1984, 1985 y 1987;
Mourey y Oppenheimer, 1984; Perrin y Prevot, 1984; Oppenheimer y Mourey, 1985;
Warner y Mounts, 1990; Hopia y col., 1992; Dreux y col., 1996). Sin embargo, a pesar de
las variaciones que se puedan producir en las respuestas, se puede asumir que, en un
rango de cantidades de soluto, el rea del pico (A) se relaciona con la masa (ni) mediante
la siguiente relacin exponencial:
A =anit (3.2)
donde a y x son coeficientes dependientes del tamao de las gotas, concentracin y

naturaleza del soluto, presin del evaporador y extractor, y temperatura del evaporador.
174
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorzacin de aceites vegaiaies.
Aire a
Fase
mvil
4.
NEBULIZACIN ~ presin
o
oz 00000
-4
y oc
o
*
Fuente
de luz
DETECCIN Fo t orn u Iti pl ica do r
Figura 3.2.4.1. Esquema de un detector de masa
175
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegetales.
-I
La transformacin logartmica de la ecuacin anterior, sin embargo, muestra ya una

dependencia lineal entre los logaritmos de A y m:
logA=xlogm+loga; (3.3)
Los valores de x encontrados en la bibliografa se encuentran entre 0,9 y 1,8, siendo

correctos todos ellos al entrar dentro del intervalo terico establecido 0,66-2,0, si bien, la
respuesta ser ms prxima a la linealidad con valores de .x ms cercanos a la unidad.
Charlesworth (1978) realiza un estudio profundo del detector y concluye que, para
concentraciones elevadas y dependiendo del resto de condiciones, la respuesta pasa de
exponencial a sigmoidal, encontrndose un pequeo intervalo intermedio de
concentraciones donde la respuesta es lineal.
En el presente trabajo se deci estudiar la temperatura del evaporador y presin del aire
para optimizar la relacin rea/masa segn los modelos propuestos. Las temperaturas y
presiones mximas y mnimas vinieron dadas por las limitaciones del detector y
compresor, y por el aumento en exceso del nivel de mido basal.
Las condiciones estudiadas fueron las siguientes:

- se inyectaron por triplicado disoluciones de 10 y 20 .tg de ergosterol, colesterol,
estigmasterol y escualeno en acetona,
- las temperaturas del evaporador estudiadas fueron de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 60, SOy 96 0C a una presin de 172 kPa,
- se estudiaron temperaturas de 25, 45, 60, 80 y 96 0C a las presiones de 103, 207
y276kPa.
Los resultados se procesaron mediante el programa 9R del BMDP para conseguir que las
respuestas de los distintos patrones fueran los ms semejantes y elevadas posibles.
176
Captula 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites wgetales,
3.2.4.2- Linealidad de la respuesta
Se inyectaron por duplicado dos disoluciones de ergosterol, colesterol, estigmasterol y

escualeno en las cantidades de 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 30 y 40 gg, y 85 pg de escualeno.
Una vez establecidas la condiciones de presin y temperatura del detector se obtuvieron

las ecuaciones que relacionaron la respuesta con la cantidad inyectada (la adecuacin a la
linealidad era menos satisfactoria si los ensayos se realizaban en condiciones no
optimizadas del detector de masa). La lunealidad de Ja respuesta se calcul segn el
modelo descrito en el apartado anterior. Las operaciones se realizaron mediante el
programa 9R de regresin lineal simpie del BMDP.
1W
3.2.4.3- Clculo del factor de resnuesta
En el clculo del factor de respuesta se decidi utilizar ergosterol como patrn interno, ya
que no se presentaba en la muestras de destilado de la desodorizacin de aceite de oliva
1]
ni girasol, y se resolva bien respecto a los compuestos de inters de las muestras y otros
componentes no identificados. t
Se inyectaron por duplicado dos soluciones con cada una de las siguientes cantidades:
- 10 .tg de ergosterol,
- 2,5; 5; 10; 20; 30 y 40 gg de colesterol, estigmasterol y escualeno.
liJado que el anlisis cuantitativo con el factor de respuesta se basa en el clculo por
mnimos cuadrados, es decir, regresin lineal, se transformaron los parmetros en una
171
-~rrt
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodo zac On de aceites vegeto/es
forma logartmica que garantiza la relacin lineal simple entre la respuesta y la cantidad
inyectada:
log4 logC~, ; (3.4)

logAs, IogC,
.
siendo:
2r1 el factor de respuesta del compuesto 1,
C, la concentracin del compuesto /,
Gp la concentracin del patrn interno,
A, el rea del compuesto /,
A~
1 el rea del patrn interno.
3.2.4.4- Precisin del mtodo
La precisin de todo el mtodo analtico, incluido el proceso de preparacin de muestra,

se estim analizando por duplicado 5 hidrlisis de un mismo destilado de oliva,
adicionando 1 mg de ergosterol como patrn interno, y se calcul la desviacin estndar
relativa.
3.3.1- Anlisis cualitativo
3.3. 1. 1- Anlisis estadstico en la eleccin de la columna y la fase mvil

1
Los resultados de k obtenidos tras la inyeccin de los patrones permitieron el estudio de
la variacin del logk de cada uno de ellos frente al tipo de columna utilizada, tipo de
178
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodonizacin de-aceites- vegetales.
modificador y porcentaje en el que se encontraba en la fase mvil. En el caso del so-

propanol, no se pudo hacer el estudio con la columna de 20 cm y 3 ~Im porque las
mezclas con acetonitrilo daban presiones excesivamente altas; los mismo ocurra con el
etanol, En el caso de la columna de 7,5 cm prcticamente no hay separacin con
porcaentajes superiores al 2% por lo que no se ha tenido en cuenta. Las ecuaciones
obtenidas son las siguientes:
A- Metanol, columna de 7,5 cm, 3 I~m:

logk 1,76 0,00 193%MeOH; = 0,986 1;
- Desmosterol: = -
- Ergosterol: logk = 1,83 0,00282%MeOl-I;

-
9 = 0,9816;
- Lanosterol: log/c = 1,91 - 0,00266~%MeOH; 9 = 0,9891;
logk 1,94 0,00315~%MeOH; = 0,9880;

- Fucosterol: = -
logk 1,96 0,00327.%MeOH; 19 = 0,9933;

- Colesterol: = -
logk 2,01 0,00356~%MeOH; 19 = 0,993 8;

- EstigmasterOl = -
logk 2,02 0,00355~%MeOH; 19 = 0,9836;

- Campesterol: = -
logk 2,08 0,0037P%MeOH; 19 = 0,9889;

- p-Sitosterol: = -
B- Metanol, columna delS cm, 5 gm:

19 = 0,9309;
- Desmosterol: logk 1,11- 0,00272%MeOH;
logk 1,14- 0,00293.%MeOH; = 0,9229;
- Ergosterol:
logk 1,24- 0,00302%MeOH; 19 = 0,9823;
- Lanosterol:
logk 1,27- O,00339~%MeOH; = 0,9446;
- Fucosterob
logk 1,29- 0,0036 l~%MeOH;
19 = 0,9669;
- Colesterol: 19 = 0,9800;
EstigmasterOl logk 1,34- 0,00378%MeOH;
logk 1,36- 0,00376~%MeOH; = 0,9085;
- CampesteroL
logk 1,40- 0,00383~%MeOH; 19 = 0,9729;
- p-Sitosterol:
C- Metanol, columna de 20 cm, 3 gm: 2

logk 1,78 0,00228~%MeOH;
-
r = 0,9537;
-ErgosteroL
179
Capalo .3, Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegnales.
- Lanosterol: logk 1,85 O,00230%MeOH;

-
=0,9851;
- Fucosterol: ogk = 1,89- O,00255%MeOH; = 0,9563;
- Colesterol: logk = 1,91 0,00282%MeOH;
-
= 0,9814;
Estigmasterol: logk = 1,95 0,00300%MeOH;
-
-
19 = 0,9838;
- Campesterol: logk = 1,96- 0,00292~%MeO1q; =0,9779;
- frSitosterol: ]ogk = 2,00- 0,00313%MeOH; =0,9841;
D- Etanol, columna de 15 cm, 5 gm:

- Desmosterol: logk= 1,11 0,00788%EtOll-1;
- ~0,9668;
- Ergosterol: logk= 1,14- 0,00806%EtOH; =0,9651;
- Lanosterol: logk= 1,23 0,00883~%EtOH;
- = 0,9898;
- Fucosterol: logk = 1,26 0,O0907~%EtOH;
- = 0,9707;
- Colesterol: logk = 1,27 0,009 1 E%EtOH;
- 9 = 0,9788;
- Estigmasterol: logk 1,33 0,00954%EtOH;
- 19 0,9846;
=
- Campesterol: logk = 1,34 0,00962%EtOH;

- 9 = 0,9779;
- log/c = 1,39- 0,010O5~%EtOH;
~-Sitosterol: 19 0,9843;
E- iso-Propanol, columna de 15 cm, 5 .zm:

19 = 0,9750;
- Desmosterol: logk = 1,10- 0,00911 ~%iPrOH;
logk J,13 0,00940%IPrOH; = 0,9706;
- Ergosterol: -
- Lanosterol: logk 1,22- 0,01018%iPrOH; =0,9881;

- Fucosterol: logk 1,25- 0,01049%iPrOH; 19 = 0,9734;
- Colesterol: logk= 1,27- 0,0l065~%iPrOH; 19 = 0,9824;
- Estigmasterol: logk l,32-0,0llI3~%iPrOH; 19=0,9870;
- Campesterol: logk 1,33-0,01 l22~%iPrOH; 19 = 0,9809;

- logk~
~-Sitosterol: 1,3$ -0,01 170%IPrOH; = 0,9854.
Las figuras 3.3.1. 1(a-e) son las representaciones grficas de las ecuaciones anteriores. Se
observ que la variacin del factor de capacidad en funcin del tipo de modificador era
)80
111 7
iouzK Cap (talo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegetales.
~storoJ
* ergosterol
fi latiosterol
* fucosterol
~ cojosterol
estgtiiaStCtOl
e caniposterol
4 B.sitosterol
1,50
0 20 40 60 80 100
MeOH (%)
Figura 3.3.1.la, Influencia de la proporcin de unetausol en la variacin de k.

Columna dc 7,5 cm de longitud.
logK
desmes toro
* OrgOslerOl
fi lanosiorol
+ fucosterol
& colesterol
estigfliatleffll
.*oanipestaoi
ql 13-shtosLerol
0,80
0 20 40 O 80 100
MoOli (%)
la proporcin de metano1 en la variacin de k.
Figura 3.3.1.lb. !nlluenCiS de
Columna dc 15 cnt de longiluid.
*orgstewi
1
fi la nos loro
+ fucosterol
&colestetol
ostigniasterol
e eaiiipOStOrOl
* il.silo,terol
80 100
MeOH (%)
la proporcin de ittttflOl cli al variacin dc k. 181
Figura 3.3.1,lc. ufluetitia de
Colunula de 26 cm dc longitud.
ta~i11< -~r ? <=i 7
Capitulo 3, Aplicacin al destilado de la desodq~l~ocin de aceitesvg?jqlgs
desniosterol
* ergoslerl
lanosterl
+ Cuoosterol
tcoles terol
estigsinsteroi
C campestorol
*B.sitosterol
0,2
0 20 40 60 80 100
EtOil (%)
Figura 3.3.1.Id. lnfl~iencIa de la proporcin de olanol en la variacin de It.
Coinnina dc 15 cm.
logK
des moslerol
*OrgOSlCrOl
Glanosterol
+ fucostero1
* coles Icrol
ostgiswskrc~l
campeste rol
B.siioslerol
0,0
0 20 40 60 80 100
i.PrOH (%)
Figura 3.3.1.Ie. Influencia de In proporcin dc Iso.psOpaSOI en la wariaclia de k.
Coluinflhl de 15 cus dc longilud.
152
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodarizacln de aceites vegetales.
o
4)
1-
o
4..
tiempo (mm>
Figura 3.3.1.lf. Anlisis de 8-sitosterol por HPLC en las siguientes

condiciones:
- 15 cm,
colufluiia
- tamao de partcula: 5 im,
fase mvil: acetonitrilo 100%
detector: UV.
183
41
Capitulo 3, Aplicacin al desfilado de la desodorizacicln de aceites vegetales
ms evidente en el iso-propanol, seguido del etanol y metanol respectivamente debido a

que la menor polaridad del modificador causa una elucin ms rpida de los solutos. En
el caso de utilizar iso-propanol, el logk descendi hasta 0,2 aproximadamente y para
todos los compuestos del estudio, para el caso de la utilizacin de etanol logk fue de
_0 4 En ambos casos la duracin de los anlisis es cofia, sin embargo, esto hacer
empeorar la resolucin entre los compuestos eluidos. El empleo de metanol condujo a
mayores tiempos de retencin que el etanol e iso-propanol para iguales procentajes en la
fase mvil; de este modo, la separacin de los diferentes compuestos fue ms
satisfactoria. La utilizacin de bajos porcentajes de modificador e, incluso, de 100% de
acetonitrilo en la fase mvil conduca a la mxima separacin de los compestos
analizados, sin embargo, la resolucin no era aceptable debido a que los picos
presentaban importantes colas. La figura 3.3.l.lf muestra un cromatograma de estas
caractersticas, donde se aprecia la aparicin de la cola en el pico de 13-sitosterol. Al
comparar la variacin del logk respecto a la longitud de columna (columnas de 20 y 7,5
cm) se observ que la columna de mayor longitud produca resultados ms satisfactorios
que los de la de menor longitud, adems de que los logk estaban ms distanciados entre
cada compuesto. El hecho de encontrar valores de logkmucho menores en la columna de
15 cm no se debe a la longitud sino al tamao de partcula, observndose que la
utilizacin de partculas de 5 xm conduce a la obtencin de menores tiempos de retencin
que el uso de partculas de 3 jxm. De este modo, y en una primera aproximacin a los
resultados finales, se poda asegurar la conveniencia de la utilizacin de la columna de 20
cm de longitud, 3 gm de tamao de partcula y metanol como modificador, para evitar al
mximo la coelucin de los compuestos de la mezcla.
Posteriormente se estudi la resolucin de los pares criticos, ya que se vi que algunos

picos presentaban colas con baja proporcin de modificador. Se calcul la variacin de la
resolucin segn el tipo y porcentaje de modificador en el caso de la utilizacin de la
columna de 15 cm y 5 gm de tamao de partcula. La longitud de columna se estudi
para los casos de 7,5 y 20 cm, ya que posean el mismo tamao de partcula (3 km) y con
184
metanol como modificador. Los resultados fueron los que aparecen en las figuras
3.3. 1. lg-p).
Las figuras 3.3.1.lg y h muestran cmo los mejores resultados en la resolucin se

consiguen al aumentar la longitud de la columna y disminuir el porcentaje de
modificador; sin embargo, la resolucin entre estigmasterol y campesterol mejora al
aumentar el porcentaje de metanol (figura 3.3.l.lj). La resolucin entre fucosterol y
colesterol solamente mejora al aumentar la longitud de la columna a partir de los 12 cm
(figura 3.3.l.ly). En cuanto a lo referido al tipo de modificador, para el par critico
desmosterol-ergosterol (figura 3.3.1.1k) la mxima resolucin se consigui utilizando
etanol en un 20%, si bien, la resolucin dependi poco del tipo de modificador y ms del
porcentaje en que se encontraba en la fase mvil. La resolucin entre el lanosterol y el
fucosterol (figura 3.3. 1.11) fue baja independientemente del tipo de modificador
empleado, incluso sin modificador. Hay que puntualizar que este estudio, el de la
resolucin en funcin del tipo de modificador, se llev a cabo utilizando la columna de 5
pxm de tamao de partcula del relleno, y es fcilmente apreciable que la resolucin
aumenta sensiblemente al cambiar a al tamao de 3 Itm: la grfica 3.3. 1. lg sobre la
resolucin entre el lanosterol y fucosterol se basa en columnas de 3 iim y muestra que
para una supuesta longitud columna de 15 cm la resolucin conseguida es siempre
superior a la de los resultados obtenidos en 3.3.1.11. Los resultados de la resolucin entre
lanosterol-colesterol, fucosterol-colesterol y estigmasterol-caflipesterol (figuras
3.3. i. 1(m-f) son semejantes a los obtenidos en el caso del par lanosterol-flicosterol,
observndose un ligero aumento de la resolucin al aumentar la polaridad del
modificador, excepto para el par lanosterol-colesterol, aunque sus resutados muestran
valores altos de resolucin. La figura 3.3.1. lo muestra cmo la resolucin entre el par
critico desmosterol-ergosterol disminuye de modo apreciable al aumentar el porcentaje
del modificador, coincidiendo con los resultados aportados anteriormente (figuras
3.3.1. 1(g-i). La resolucin entre el ergosterol y el lanosterol, utilizando metano! y la
colunma de 20 cm (figura 3.3.l.lp) muestra siempre valores altos, pero son los mayores
los encontrados para porcentajes alrededor del 50%.
185
-
9-~V.~
1 1 fi ~
12 ~<) /> ~~
1
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales

Resolucin entre desmosterol y ergosterol
1,6
R Resolucin
P=Porcca,laje dc Modificador
T=Tipo de Modificador
1,4 CLoogitud dc i~ Columna
lo R = 1,5 80 0,022W
- + O,0001281~2
C = 7,5 cm
08
06
o 20 40 60 80 100
MeOR 11%)
Figura 3.3.1.lo. Influencia de la proporcin de netanol en la variacin de la resolucin.

Columna <le 7,5 cm.
Resolucin entre ergosterol y lanosterol

65
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3~5~ 20 40 6<) 80 100

MeOH (%)
Figura 3.3.l.lp. Influencia de a proporcin de metanol en la variacin de la resolucin.

Columna de 20 cm.
191
<9-5 ~Z -< ti? >~9-9
~/
CapItulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegala/es
Los resultados muestran, en general, que, como era de esperar, se consigue una mejora de
la resolucin al disminuir el tamao de partcula del relleno, al aumentar la longitud de la
columna para aquellas de igual tamao de partcula, y al aumentar la palaridad. Estos
resultados concluyeron que para conseguir una mejor separacin de los patrones del
estudio se deba utilizar la columna de 20 cm y 3 pm de tamao de partcula con metanol
como modificador en la fase mvil. Respecto al porcentaje de metanol hay que decir que
para los pares crticos que elidan en primer lugar la resolucin mejoraba con bajos
porcentajes, sin embargo, para el par estigmasterol-campesterol (el que sufra una mayor
retencin) la resolucin aumentaba con el porcentaje de modificador, hecho que se
explica porque el aumento de la aunchura de los picos en la base era contrarrestado por el
empleo de ms cantidad de metanol. Estas ltimas conclusiones hicieron aconsejable el
empleo de gradiente de polaridad. La figura 3.3.1. lq muestra un cromatograma obtenido
utilizando la columna de 20 cm de longitud, con metanol, y las estructuras qumicas de
los patrones utilizados.
3.3.1.2- Eleccin del gradiente
El gradiente permiti acortar el tiempo de anlisis, mejorando la eficacia al estrechar los

picos sin perder resolucin.
Se obtuvieron las ecuaciones correspondientes a la variacin del factor de capacidad con

el porcentaje inicial de metanol y con la velocidad de gradiente:
- Desmosterol: logk = 1,850 0,01498-O;

-
logk 1,775 -0,00496~I;

- Ergosterol: logk= 1,859 0,01487ii1;
-
logk= 1,784 0,00485~ 1;

-
192
.
Capitulo 3. AplicacIn al destilado de la desodorizaclnde aceites vegetales.
escualeno
o3-.
o o3...
o o3- o
4.> It o
-5
desmosterol A
o E
ti,
4>
04
It E
It
o 4.> u
3-
4.. .4 o
A 4) a-
4)
4..
A
Cf) o
o, -4...
ci,
o 5 lo 15
tiempo (mm)
o
33
ergosterol lanosterol fucos terol

11
j1~
estigmasterol campesterol B-stostero]
Figura 3.3.1.lq. Cromatograma y estructuras moleculares de los

esteroles utIlizados.
193
- ,-fl
11 Y 9-~< <5 =/
<2<
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodarizacin de aceites vegetales
- Lanosterol: logk= 1,889 0,01218G;

-
logk= 1,828 - 0,00354~ 1;

- Fucosterol: logk= 1,953 0,0l800G;
-
logk = 1,863 0,00441 4;

-
- Colesterol: logk = 1,978 O,01944C;

-
logk = 1,881 - 0,00435 1;

- Campesterol: logk = 2,0 13 0,020180;
-
logk = 1,912 0,00406 I;

-
- ~-Sitosterol:logk = 2,056 0,02 182G;

-
logk = 1,946 0,00386 ~I;

-
- Escualeno: logk = 1,893 0,0O706~G;

-
logk= 1,858 0,00129 ~I;

-
0/o/min,
donde O es el gradiente en
1 es el metanol inicial en
Las figuras 3.3.1.2 a y b muestran las representaciones grficas de las ecuaciones arriba
indicadas, Se observ que el comportamiento del escualeno frente al gradiente era
copletamente distinto al del resto de componentes, producindose pocas variaciones del
tiempo de retencin, es decir, que el grasdiente de polaridad no parece afectar al tiempo
de elucin del escualeno. Estas diferencias pueden ser debidas a la distinta estructura
molecular del escualeno respecto a los otros compuestos. De esta forma, y en el rango
estudiado, la retencin relativa del escualeno mejoraba con unos compuestos a la vez que
empeoraba con otros. En el caso de haber un porcentaje inicial de metanol del 0% la
elucin del escualeno se produjo entre a del lanosterol y flicosterol. Si el % inicial era de
un 40% la elucin del escualeno, apenas variada, se produjo en el ltimo lugar, tras la
elucin del B-sitosterol. El resto de componentes sufri una disminucin del tiempo de
retencin al aumentar el gradiente, no habiendo diferencias entre ellos, con poca
afectacin de la selectividad (a) en la mayora de los casos y para ambas experiencias; la
194
5
Capitulo 3. AptCOCifl ci destilada de la desodorizacin ce aceiteS vegOtOlOS

logk
2,1
2 3 4 5
i.7~ 1
Gradiente dc metanO1 (%/tflifl)
Figura 3.3.1.2fl. Influencia del gradlefltC en la variad6 dc 1<.

% Inicial O.
40
1,5 -o
o MetallOl (% ndal)
Figtlra 3.3.1.211. InflUenCiO del porcefltflit Inichil de metano1 en la variaClOfl de It.
195
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desoaorizacin de aceites vegetales
excepcin fue el par lanosterol-fucosterol en el que la selectividad toma valores prximos

a 1 cuando las condiciones fueron de un 40% de metanol inicial. Los pares crticos
estudiados fueron desmosterol-ergosterol y campesterol-13-sitosterol para la obtencin de
los valores de resolucin, en el primero de ellos e! valor de a fue bajo en todas las
condiciones, en el segundo caso fue el ensanchamiento de los picos lo que llev a esa
determinacin. Los gradientes entre 2 y 40/dniin consiguen mayores separaciones entre el
escualeno y los esteroles lanosterol y fucosterol.
Posteriormente se procedi al estudio de la influencia de los dos factores cromatogrficos

en la resolucin de los pares crticos. Las figuras 3.3.1.2 e y d muestran las ecuaciones
obtenidas y sus representaciones grficas.
La resolucin entre el desmosterol y e! ergosterol (figura 3.3. l.2c) disminuye de modo

importante a medida que el porcentaje inicial de modificador aumenta y en menor medida
cuando dismunuye. Para la mejor separacin de estos compuestos conviene utilizar
procentajes iniciales bajos y gradientes de 3 - 8%/mm. La mejor resolucin entre el
campesterol y el B-sitosterol se consigue para porcentajes iniciales muy bajos (0 - 3 %) y
gradientes bajos; la resolucin con un gradiente del 30/dmin y acetonitrilo inicial al 100%
conduce a una resolucin cercana a 1.
Concluyendo: se observa que en el rango estudiado se obtena una mejor resolucin con
un bajo porcentaje inicial de metanol y gradientes medios. As pues, se decidi que el
gradiente fuera de 3%/mm partiendo de 0% de metanol, de esta forma, tambin se
consegua que el escualeno eluyera entre el lanosterol y el fucosterol consiguindose la
mejor separacin posible del escualeno con cualquiera de los esteroles estudiados,
Respecto a los anlisis de muestras de destilado de a desodorizacin de aceites de oliva o
girasol se consigui que escualeno eluyera en primer lugar, sin producirse solapamientos
con el estigmasterol, campesterol ni 3-sitosterol (compuestos existentes en el desfilado).
196
.
55 55~~- 1 2< 9-
O~MkM 3. A~&ws*~ al dWIk* l talles vegetales
3,%l3jIeccin d~ la temneratura de la
La figura 3.3.1.3 muestra los resultadas del clculo de la resolucin de los pares crticos
(desmosterol-Ianoserol, lanosterol-fucoserol, fucostcrol-coles-terol, colesterol-
campesterol y campesterol-B-sitosterol> dependiendo de la temperatura de la columna. Se
observ que la temperatura ms adecuada era la dc 45 0C, ya que la de 55 0C dismunia
los tiempos de retencin con apenas variacin de la anchura de Los picos, y la de 35 oc
provocaba la aparicin de colas, por lo que haba tambin prdida de resolucin. As
pues, la temperatura de la columna durante el anlisis se fij en 45 O(2~
3.3.2- AndIlsis cuantitativo
2ALLIzA1Ihli&I5SIUdI~tieo en el estudio de la resuuesta dcl detector
La figura 3.3.2. la muestra Las reas resultantes obtenidas tras la inyeccin de la solucin
de patrones en la cantidad de 20 pg, siendo las condiciones de presin del detector de 172
kPa y de temperatura entre 20 y 60 0(2~ Se observa un descenso marcado de la respuesta
del ergosterol entre 20 y 45 0(2, existiendo apenas variacin a partir de esta temperatura y
hasta los 60 0C. La respuesta del colesterol sube un comportamiento semejante, si bien,
no de modo tan acusado. La respuesta dcl estigmasterol desciende Ligeramente entre los
20 y 35 0C. aumentando a temperaturas superiores. La respuesta del escualeno vara de
modo completamente distinto al resto de componentes de la solucin al producirse un
aumento importante entre los 20 y 40 0C, con una menor disminucin a temperaturas
mayores. Las bases de estos comportainientos se encuentran, principalmente, en la
volatilidad (segn Charlesworth, 978, en la temperatura a la que la presin de vapor es
de mm Hg. o bien, el punto de fusin en su defecto) de cada uno de los compuestos,
reunidos en la tabla 33 2 1 junto con su conespondicne punto de fusin.
199
1
ANTERIOR
Ciopizulo 3. AplIcacin al destIlado de la &toflmcMn de acvltn wpahu.
Resolucin
3,0
lanosterol-fucoste rol
2.5 -
2.0
1.5 coles terol-campeste rol
r
1,0 - Incostcrol-eolestcwl
0.5
0,0
35 45 55
Temperatura (C)
Figura .iJ.I2. Influencia de le temperatura de la columna.
rea
250
20 30 40 SO 66
lemperatura l evaporador (T> A
Figura JJJ.la. Isflueoclm de la lemperulura en

el d,~eeIat eobn el Un. de i~ paStean.
200
Tabla 3.3.2.1. Puntos de fusin de los componentes de la disolucin.
Pto. fusin (0C)

Ergosterol 168
Colesterol 148
Estigmasterol 164
Escualeno <-20
1 La disminucin de la respuesta que ocuire en los casos del ergosterol, colesterol y

estigmasterol en el rango de temperaturas bajas (25 45 oc para el ergosterol, 20
- - 45 oc
para el colesterol, 20 - 35 oc para el estigmasterol) se debe a la disminucin del tamao
de las partculas slidas en el evaporador ya que aumenta la volatilizacin al aumentar la
,
temperatura. A temperaturas superiores (>45 0C para el ergosterol y colesterol, > 35 0C

para el estigtnasterol) se produce un aumento del tamao de las partculas debido a la
dilatacin de stas, siendo entonces ste un factor dominante sobre la volatilizacin y
aumentando la cantidad de luz desviada. Este mismo ltimo comportamiento ocurre en el
caso del escualeno entre 20 y 40 0c, es decir, el aumento del tamao de las partculas por
la dilatacin que sufren al aumentar la temperatura, por encontrarse en estado lquido a
estas temperaturas, ya que la dilatacin que se produce en estado lquido es mucho ms
importante que la producida en los estados slidos. Sin embargo, a temperaturas por
encima de sta ltima (40 oc) comienza a apreciarse el efecto de la volatilizacin,
habiendo un leve descenso de la respuesta al acercarse a temperaturas en el evaporador
cada vez mayores. Estos resultados son concordantes con los obtenidos por otros autores
y por los obtenidos mediante razonamientos empricos (charlesworth, 1978), basndose
las explicaciones dadas en las observaciones de estos otros autores.
Una segunda experiencia, que se dedic al estudio de la presin del nebulizador y a

ampliar el rango de temperaturas hasta los 96 oc ofreci los resultados que se muestran
en las figuras 3.3.2.1 (b-e). Se observa que las nuevas temperaturas del estudio de 80 y,
especialmente, 96 0c consiguen un gran aumento de la volatilizacin de todos los solutos
Capitulo 3, Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales
rea
200
150
100
50
o
loo 150 200 250 300
Presin (kPa)
Figura 3.3,2.1W Influencia de la presin y temperatura del evaporador

en la respuesta del ergosterol
rea
300
250
200
150
100
50
o
100 150 200 250 300
Presin (kPa)
Figura 3.3,2.le. Influencia de la presin y temperatura del evaporador

en la respuesta del colesterol
202
1 - 1
Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites y

rea
250
200
150
100
~1.
so
o
100 150 200 250 300
Presin (kPa)
Figura 3.3.2.Id. Influencia de la presin y temperatura del evaporador

en la respuesta del estigmasterol.
Area
300
250
200
150
loo
50
-a--.
100 150 200 250 300
Presin (kPa)
Figura 3.3.2.le. Influencia de la presin y temperatura del evaporador

en la respuesta del escualeno.
203
- y-, - 0$
- - y
Capitulo 3. AplicacIn al destilado de la desodorizac.In de aceites vegetales.
posteriormente a la evaporacin de la fase mvil, produciendo una gran disminucin de la

respuesta. En el caso del escualeno, y debido a su mayor volatilidad, la respuesta es
extremadamente baja, hacindose casi indetectable a 96 oc (figura 3.3.2. le).
El aumento de la presin a temperatura constante conduce a la formacin de partculas de

menor tamao, con la consecuente prdida de respuesta. Charlesworth (1978) da
explicacin a este ltimo comportamiento: la diminucin del tamao de partcula supone
que la relacin superficie/volumen aumenta, adems de que se produce un mayor nmero
de partculas, por tanto, la respuesta aumentara. Sin embargo, para panculas muy
pequeas es muy importante el efecto de la prdida de luz reflejada y refractada, que son
los mecanismos ms importantes en el fenmeno de la dispersin de la luz, surgiendo
otros fenmenos (dispersin de Raleigh y dispersin de Mie) que producen luz dispersada
de menor intensidad. De este modo, el ergosterol, colesterol y estigmasterol, slidos a
temperatura ambiente, presentan dos mnimos y dos mximos en los perfiles de respuesta,
el primero de ellos se produce a las menores temperaturas cuando se produce un aumento
de la temperatura del evaporador y se debe al efecto de la disminucin del tamao de
partcula estando en estado slido, su localizacin varia en funcin del compuesto en
cuestin y de la presin utilizada. El segundo nnlino en el perfil de la respuesta se
produce a la mayor temperatura del estudio (96 0C), encontrndose la partcula en estado
lquido o semislido. El perfil de respuesta del escualeno sita los mininos en las
temperaturas extremas (25 y 96 0C) independientemente de la presin de estudio y
encontrndose siempre sus partculas del la nebulizacin en estado lquido.
La disminucin de la presin conduce a la formacin de particulas de g~~ui tamao con ,
el consiguiente aumento de la respuesta por el favorecimiento de la reflexin y refraccin

como fenmenos dominantes en el proceso de dispersin de la luz y producen luz de
mayor intensidad, por eso la respuesta mayor se alcanza, a temperatura constante, a la
presin de estudio ms baja (103 kPa) para cualquiera de los cuatro compuestos
estudiados (figuras 3.3.2. lb-e).
204
- - -~-t - -v - -
Captulo3. Aplicacin al destilado de la desodorlzack5n de aceites vegetal
La variacin de la respuesta con la presin del nebulizador y la temperatura d

evaporador del detector de masa pudo ser estudiada mediante las ecuaciones que se hallan
en las figuras 3.3.2. 1(f-i) junto a sus representaciones grficas y que fueron obtenidas
mediante regresin mltiple.
El comportamiento es similar entre ergosterol, colesterol y estigmasterol. Para estos

compuestos la mxima respuesta se alcanza a las menores presiones y temperaturas,
disminuyendo rpidamente a partir de los 80 0C, siendo poca la influencia de la presin a
partir de esta temperatura. El comportamiento diferente del escualeno qued reflejado en
el clculo de su respuesta, ya que la mxima respuesta de escualeno se consigue tambin
disminuyendo la presin, pero a temperaturas cercanas a 45 0C, en lugar de 25 0C; la
respuesta disminuye rpidamente a partir de 70 0C, con casi nula influencia de la presin.
Las condiciones ptimas del detector fueron 30 oc y presin de 137 kPa. De este modo
la respuesta de todos los compuestos pudo ser lo ms alta posible siendo a la vez
semejante entre ellas (1,9 1,7). Temperaturas de 25 0C o menores no convinieron para el
-
estudio, ya que, si bien producan altas respuestas, aumentaba mucho el nivel basal de
ruido por la dificil eliminacin de la fase mvil en el evaporador.
3.3.2.2- Linealidad de respuesta
El estudio de la linealidad de la respuesta en las condiciones del detector no optimizadas

(45 oc, 172 kPa) dio lugar a resultados semejantes a los obtenidos por Charlesworth en
1978 en el estudio de compuestos apolares. Se observ la tendencia sigmoidal de la
respuesta (figura 3.3.2.2a), existiendo un comportamiento logartmico para cantidades
superiores a 50 gg, lineal en un tramo intermedio desde 6 hasta 25 .ig (figura 3.3.2.2b), y
exponencial para las cantidades menores en el estudio (figura 3.3.2.2c). Al representar los
datos obtenidos sobre un eje doble logartmico se observ que los resultados seguan la
tendencia de una recta, concordando con los resultados anteriores de otros investigadores,
205
- y %M~-~r >Vu/T <(yJ$vA%~TI t~wwv<
<y> it <1 ~/Jgt >>,i<% 4~V?$$kty44
y --- -~ ~
rea Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales

k1~~
& ergosterol
esaialeiio
colesterol
* estigmasterol
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Canlidad inyectada g)
Figura 3.3.2.2a. Linealidad de respuesta. Coadicloues del deleetor 45 C, 172 kPa.
rea
ergosterol
escualeflo
* colesterol
* estgnnsterOl
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Cantidad inyectada o~tg)
Figura 3.3,2.2b. Lluealdad de respuesta. Condiciones del deteeton 45 oc, 172 kpa,
rea
120
100
ergosterol
esctwleno
* colesterol
Vesligmasterol
o
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12
Cantidad intectada Qg)
208
Figura s.3,2.2e. unealidad de respuesta. CoudteIt>iieS del detector 45 C, 172 Id?..
,
/> <- 1
>~J>yy< ji<4j>~i 4- >4-

/1
it rp Capitulo 3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales. -
1000,0
100,0
* ergosterol
etotialeno
10,0 ~colestetol
* estignaSterOl
1,0
0,1 5,0 50,0

0,5
Cau,tidad inyectada Qig>
Ftg~.ra 3.3.2.2<1. Represealaetn dol,te.Iogarftssttca de la ltnealtdsd de respUesta.

Coatielises del detector: 45 C, 172 kPs.
rea
1000
* ergosterol
eseufi lene
U colesIetOL
* estigmastetol
20 25
Cantidad inyectada (ns)
Figura 3.3.2.Ze. llepresentad dohIelogarItflhlC de la tiacaltdad de respuesta.
Comsdlctosses del detector: 45 C, 172 kpa,
rea
* ergosterol
oscualeno
colesterol
* estign,asterol
0,1
0,5 1,0 2,5 5,0 6,0
Cantidad inyectada (JLg)
de la liaealidatl de respuesta.
Figura 3,3.2.21. RepresCIttfiCtdfl dobte.logarItflhICfi 209
Condiciones del detector: 45 C, 172 lcPa.
,- <A
Capitulo .3. Aplicacin al destilado de la desodorizacin de aceites vegetales.
excepto para las cantidades mayores, hecho que tambin se ha descrito en la bibliogafia
sobre triglicridos y otros compuestos de baja polaridad (figuras 3.3.2.2d-D. Al realizar
las regresiones, los valores del exponente x fueron de 1,55 para el ergosterol, 1,40 para el
escualeno, 1,51 para el colesterol y 1,46 para el estigmasterol, encontrndose todos ellos
dentro del intervalo aceptado por otros investigadores.
Los resultados del clculo de la linelidad de respuesta obtenidos tras la optimizacin del
detector mejoraron los previamente conseguidos. Las ecuaciones obtenidas fueron las
siguientes:
- Ergosterol: logA = 0,803 + l,l6dogC; = 0,9834;

- Escualeno: logA = 0,705 + l,l9~]ogC; r2 0,9917;
- Colesterol: logA = 0,846 + 1,12logC; r2 = 0,9894;
- Estigmasterol: logA = 0,504 + 1,25 dogC; r2 0,9946;
donde A rea,
C = cantidad inyectada en gg.
Los valores hallados para x descendieron en los cuatro casos para hacerse ms cercanos a
la unidad, lo que significa que la respuesta se acerca ms hacia una tendencia lineal.
Estos resultados tambin posibilitaron la extensin de la respuesta exponencial hasta
cantidades de 50 ~g. Las figuras 3.3.2.2(g y h) muestran la representacin grfica de las
ecuaciones obtenidas, mostrndose, adems, la adecuacin con los datos experimentales.
El lmite de deteccin para cada compuesto se calcul a partir del error estndar de las
regresiones obtenidas (EE), siendo el lmite de deteccin la cantidad en ~.ig que
proporciona una respuesta tal que logA = 2EE.
210
..nu.m.ww ~ r~
p-~e ~ r
CapItulo 3, Aplicacin al destilado de la desodorizacln de aceites vegetales
Los lmites de deteccin obtenidos fueron los siguientes:
- ergosterol: 0,26 gg;

- escualeno: 0,31 Mg;
- colesterol: 0,22 ~g;
- estigmasterol: 0,46 gg.
3.3.2.3- Factor de respuesta
Los factores de respuesta obtenidos se representan en la figura 3,3.2.3. Si no se

consideran los resultados obtenidos para cantidades inyectadas inferiores a 2,5 pg, los
factores obtenidos respecto al ergosterol son:
Fescuajeno = 0,88
Fcoestero = 0,94
Fesiigtiiastero = 0,86
212
,
4- ~V-<
Factor de respuesta
16
1,4
*
1
+
t
1,0
0 Al-
,~ u
0,8 4 a
0,6
0,4
0,2
0,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Cantidad inyectada (tg)
Escualeno + Colesterol * Estigmasterol
Figura 3.3.2.3. Factor de respuesta de los esteroles y el escualena.
213
Y -l >Y>-
-l>J~- >11~1 1
ANLISIS DE LOS DESTILADOS DE LA DESODORIZACIN DE ACEITES

VEGETALES POR ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNTICA
NUCLEAR DE 3C DE ALTA RESOLUCIN
La preparacin de las muestras y el procedimiento utilizado es el mismo que se detalla

para los anlisis de muestras de nata y sus extractos <apartado 2.6 y 2.7). Las muestras
analizadas fueron:
- destilado de la desodorizacin de aceite de oliva,
girasol,
- extracto obtenido a 13 MPa, 40 0C y 70 mm a partir del destilado de aceite de
oliva.
La identificacin de los compuestos se llev a cabo con la ayuda de tablas de

desplazamientos qumicos existentes en la bibliografia. La tabla 3.4 contiene los
desplazamientos qumicos correspondientes al escualeno (Breitmaier y col., 1975) y 13-
sitosterol (Wright y col., 1978).
214
Tabla 3.4. Desplazamientos qumicos de escualeno y Il-sitosterol.
Escualeno 3-Sitosterol
8(ppm) ~jO S(ppm) ti6 8(ppm)
1 25,7 1 37,31 16 28,26

2 131,2 2 31,57 17 56,11
3 124,4 3 71,69 18 11,87
4 26,7 4 42,25 19 19,40
5 39,8 5 140,76 20 36,17
6 134,8 6 121,59 21 18,82
7 124,4 7 31,92 22 33,95
8 26,8 8 31,92 23 26,13
9 39,8 9 50,17 24 45,85
10 135,0 10 36,51 25 29,18
11 124,4 11 21,11 26 19,84
12 28,3 12 39,81 27 19,07
13 17,7 13 42,33 28 23,09
14 16,0 14 56,79 29 12,32
15 16,0 15 24,32
(~4 2
2 6
~ 2
numeracin de los carbonos del escualeno
215
numeracin de los carbonos del 13-sitosterol
Se calcul el porcentaje molar en que se encontraban los compuestos anlizados de modo

anlogo al realizado con la grasa lctea.
Los espectros de DDO obtenidos mediante 13C-RMIN son los mostrados en las figuras
3.5(a-c), las figuras 3.5(d-f) muestran los espectros de DDG. A continuacin, en la tabla
3.5a se detallan los desplazamientos qumicos asignados a sus correspondientes carbonos,
as como sus integrales para cada seal y en las muestras analizadas.
Tabla 3.5a. Desplazamientos qumicos, grupos funcionales asignados e integrales

correspondientes tras el anlisis por 3C-RMN de los DD de aceites de oliva y
girasol.
rea
DDO DDG
5 (ppni) Carbono Control Extracto
180,27 -COOH1 11,62 15,7 15,7
135,07 CO (Es)2 2,6 3,2 -
134,86 C6 (Es) 2,6 3,2 -
216
* Y (N
<enfrIo
3 A$ca*M al &stthz& eh a <hna&rtMCMfl eh caltes wpfttles
tabla 3.Sa (continuacin)

rea
DDO DDG
Carbono Control Extracto
131,19 C2(Es>
2,9 3
130,19 CIJ(L)
1,5 1,9 10,6
130,01 C9(O,L)
15,0 16,8 15,9
129,71 CO(O)
3.5 4,9 8,1
128,07 CIO(L)
1,5 .9 9,0
127,91 (712(L)
1.5 1,9 11,2
24,43 (73 (Es>
3,3 5,0
24,32 + (77, CII
24,29 (Es) 6,5 10,1 0.8
3
60,16 n.a.
0,3 .6
39,73 C5,C9(Es)
5,7 10,7
34,10 (72
5,5 21,9 26,2
31,90
15,4 20,6 19,5
3 .52 w3 (L)
2,7 4.0 19,0
29,76-
28,83 19,9 166,8 57,5
28.26 (712 (Es)
3,3 5,6
27,21 CH
2-.CH~ 23,8 32,4 33,3
27,15 CIA
26,77 (78 (Es> 2.5 4.8

26,66 (74 (Es) 2,5 4,8
25,65 CI(Es)+ 5.18 7.6 3,9
Cli. (1)
24,96 03(L) 2,6 3.0 1
121,0 16,9 >26,6
24,68 03
22,67 5,8 21,7 36.8

7,64 (713 (Es) 2,4 4.3
6,01 (714 (Es) 2,7 4 04
217
(#nk. 3. A$icat al Sn eh th aceites vegetales
tabla 3.5a (continuacin)

rea
DDO DDG
Control Extracto
5,97 (715 (Es) 2,7 4,! 0,4
4.07 col 15,2 21,5 27,2
Los carbonos no wgn.ados a wng~sn compuesto defitudo se refieren al total dc cidos grasos
libres de La muestra.
1
jis escualeno,
aa no asignado
Los componentes principales, tanto del DIJO. DDG, como del extracto analizado fueron
los cidos grasos libres, de este modo se comprob que estos compuestos son tambin
A
extrados por el dxdo de carbono supereritico. Los cidos grasos mayoritarios fueron
os insaturados. oleico en el D[)O, y linoleico y oleico respectivamente en el DDG. Los
cidos grasos saturados se encontraron en menor proporcin. No se detect la presencia
de cidos grasos de cadena corta, que s aparecen como consecuencia de tratamientos de
calentamientos severos, como las frituras (CalI Hellin y ClauseIl. 1985). Estos resultados 3
indcaron que la composicin en cidas grasos de los destilados es muy semejante a la del
aceite virgen, aunque en los primeros se encuentran libres. No se detect la existencia de
trglcridos, tampoco de otros lpidos saponificables como son los steres metilicos y
etlicos de os cidos grasos, tan abundantes en otros estudias realizados por otros
investigadores (24,1%; Bondioli y col.. 1993).
La fraccin insaponificable del DIJO y su extracto estuvo compuesta en su gran mayora

por escualeno. y no se detect la presencia dc ningn otro compuesto. La proporcin de
escunieno encontrada en el DIJO fue muy superior a la del DLX), donde nicamente pudo
cauntificarse la cantidad de escualeno partiendo de aquellos carbonos con tiempo de
relajacin ms corto (carbonos metiuicos); sin embargo. ste pudo detectarse gracias a la
apreciacin dc seales menores no cuantificables. Asimismo, pudo ser detectada la
218
(tvla 1 tp&eflM it eh te eh OC#tU vegetales
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CV
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04
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VN
en
F .1 l4.~
1
222
Captado 3. Ap&tacin al uilab eh a eh aceites vegetales
presencia de compuestos esterlicos en el DIJO, lo que no ocurri en cl DDO. La baja

intensidad de las seales de stos compuestos junto con [a similitud dc sus 8 (Wright y
col. 978) no permiti distinguir entre la existencia de 13-sitosterol, estigmasteral,
cainpesterol u otro esterol. La composicin dcl DIJO y su extracto fue bastante similar.
Seguidamente. la tabla 35b recoge los resultados obtenidos para a cuantificacin de los
componentes de los destilados:
Tabla 3.Sb. Composicin de los liD de aceites de diva y girasol
DDO DDG
Control Extra cta
Escualeno (CI5xl0~ 15,08 16,02 1,45
I~C5+w)
lnsaturado/saturado2 (di cn;i 3,61 3,06 1,58
OIeicolllnoIeco (@o<o} ~ 9,00 7,84 0,71

k (710(L))
(%mol>
ados grasos libres (maL/meO
El hecho de utilizar los carbonos metilicos y metilnicos para cuantificar los compuestos
de las muestras se debe a que poseen tiempos de relajacin menores, con lo cual, los
resultados obtenidos en las integraciones son los ms prximos a Los valores reales. Esto
se observa claramente si sc comparan las integrales obtenidas para Los carbonos col y los
carboxilicos. los segundos poseen integrales menores debido a unas relajaciones
incompletas. El uso de los carbonos oleihicos es el ms conveniente para el clculo de la
relacin moLar entre cidos oleico y lanoleico, por existir por sopando seales
caracterlsttcas de cada uno de ellos Los tiempos de rtlajacLn no influyen en cl clculo al
tratarse de seflales muy prximas
223
CapItulo 3. A$tanin it nhlmM eh te &wehrscMa eh aceites vegetales
Los resultados obtenidos tras los anlisis del DDO y su extracto son muy similares, con
lo que se podia concluir que en esas condiciones la selectividad en la extraccin era baja
y los compuestos se encuentran en las mismas proporciones antes y despus de la
extraccin supcrcdtica.
No se pudieron establecer comparaciones entre la composicin de los destilados y los

aceites virgenes de os que procedieron al no diponer de ellos En cuanto a los datos
encontrados en a biblliografla acerca de la composicin de los aceites virgenes de oliva y
girasol (Gunstone y col., 1986) se vio que existia una gran variabilidad; sin embargo, se
pudo concluir que la composicin de los destilados estaba dentro de los rangos de
composicin de los aceites vrgenes en lo referido nicamente a la composicin en cidos
grasos y con la diferencia de que en los destilados se encuentran en forma carboxillica 4
libre y en los aceites se encuentran esterificados al glicerol constituyendo los

tnglicrmdos.
Si consideramos que los cidos grasos libres del DIJO son oleico y palmtico (los
mayoritarios) obtenemos que el escualeno se encuentra en una concentracin de 208 1~11
1111
g/Kg. Esta concentracin es sensiblemente mayor a la encontrada en el aceite virgen

(alrededorde 1,5 mg/Kg. Fedeli, 1977).
13
>1
14
14
4
224
VV ~ :.W$JMI1% jlUl5JIJIflhlI
Capwh 3. Apiktctbi it ehufle> eh a &sodw*twt&w ch aceites vegetales
APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON CO2 SUPERCRITICO AL

DESTILADO DE LA DESODORIZACIN DE ACErrES VEGETALES
3.6- MATERIALES Y MTODoS
3.6. 1- PeserIpddn del equipo extractor
Las extracciones con fluidos supererticos se llevaron a cabo con un extractor Hewlett-
y
Packard modelo 7680A equipado con un restrietor variable que permite el control
independiente del flujo y la presin, y adems produce una despresarizacin instantnea
del fluido supererhhco a su salida La muestra se deposita en una celda cilndrica de acero
inoxidable de 7 mL de volumen, para la recogida del extracto el equipo est provisto de y-
una trampa slida intercambiable, donde se produce la calda de presin mencionada, que
se aya posteriormente con un disolvente orgnico para la recuperacin del extracto
retenido El control del sistema se realiza automticamente a travs de un programa y
informtico especifico suministrado con el equipo, con un ordenador Hewlett-Packard

modelo Vectra QSI]65. El fluido superertico usado fue dixido de carbono de calidad
analtica. Existe tambin un sistema criognico mediante dijudo de carbono para enfriar ti
la bomba, celda de extraccin, restrictor y trampa, y que no necesariamente ha de ser de
calidad tan alta como el superertico. La figura 3>6.1 muestra un esquema del
1-1 -
funcionamiento del equipo.
y-:
3. & 2- Opilmlzadn en la preparacin de la muestra

-4<
44
<11
La celda se prepar para la extraccin introduciendo el destilado, habiendo taponado

previamente la entrada y salida de la celda con lana de vidrio. Con este mtodo se
producan contaminaciones en la lineas del extractor, ya que la muestra es lquida y sale
por la parte infenor de la celda, contaminando las extracciones posteriores. Por ello, se
decidi utilizar arena de mar lavada (Panreac) en una cantidad dc 5 g para servir de
225
0 f~.v;r;.Tr.::nr?<~ t~1~i!Iq~, ~ 4 Tfl~ WUMS
Cwltuto 3. Ap&oclon it dnttIsM de o n de nifes wgetain
soporte del destilado. Tan-lo la arena como la lana de vidrio no se extraan ni retenan los
compuestos de la muestra. La cantidad de muestra indrodtjcida dependi de dos factores:
a) que el extracto se obtuviera en la mayor cantidad posible y b} que la arena no quedara
saturada de muestra y sta pasan hacia los conductos del extractor.
Las muestras fueron destilados de la desodorizac&n de aceites de ojiva y girasol.
3.4.3- Efecto de la presin y la tempEratura en la escrracdn del desfilado de la

desodorizacln de aceites vegetales
Se estudi la cantidad de destilado extrado en funcin de la temperatura y la presin

aplicadas en la celda, En los diferentes mtodos utilizados se consideraron los valores de
las siguientes variables:
- flujo del fluido supercritico: 1 y 3 mL/mm,

- tiempo de extraccin: 20 y 30 mm,
- fraccionamientos: hasta los 70 ruin con frecuencias de 2, 5 y 10 mm,
- temperatura dc la celda de extraccin: 40, 50 y 60 0C,
- presin: lO; 13; 5, 17,5; 20; 22,5; 25 y 30 MPa.
- disolvente de lavado: cloroformo:metanol (2:1),
- trampa para recoger los extractos: de botas de acero inoxidable (Hewlett-
Packard).
1
En los pnmeros ensayos realizados, el extracto fue depositado sobre la superficie de las
bolas de acero de la trampa, que se lav con la mezcla de disolventes mencionada tras
completar la extaccin.. recogindose las disoluciones en viales de 1 mL. El nmero de
viales utilizado fue de 6 para asegurar la completa disolucin del extracto y averiguar a la
vez el nmero mnimo de viales necesarios, que se encontr ser de 2. La cantidad de
extracto se obtuvo por pesada tras la evaporacin del disolvente en una corriente de N~.
2.27
Capitulo 3. Apflczrtn si thullab de la ch di aaJW w~moIe.t
En todos los casos se mantuvo la trampa a 20 *~C y el restnctor a 45 0C durante la

extraccin, elevndose la temperatura de la trampa a 45 ~Cdurante el lavado de la misma
con disolvente.
Los fraccionamientos se realizaron manteniendo presin y temperatura de la celda

constantes. Finalizado el tiempo de extraccin de cada fraccin se acomodaban las
condiciones de lavado, recogindose los vinies con la disolucin, y posteriormente se
continuaba con un nuevo paso extractivo dcl fraccionamiento
Asimismo, se colocaron frascos con la mezcla cloroformo:metanol (2:1) a la salida

haciendo burbujear el CO
2 gaseoso que saJe del extractor con el fin de retener los restos
de extracto arrastrado por el gas.
Los extractos obtenidas se analizaron por cromatografla Lquida de alta eficacia (segn los
apartados 32 y 33).
3.4.4- Modificacin del equipo de atraccin
Las modificaciones realizadas en el extractor se encaminaron a obtener todo el extracto

producido, para que no existieran prdidas, y. a la vez, a mejorar la repetibilidad de las 4?
extracciones
228
>7,4
Capnilo 3. Ap&a*h. al suM de la Ib> de tnfln wqjuloln
3.5. 1- Optimlzacin en la preparacin de la nwestra
Se comprob que una cantidad superior a 400 mg de muestra produca una saturacin de
la arena, pasando el destilado al interior de las lneas del equipo, contaminndolo. Dado
que la cantidad de arena utilizada era a mxima admisible debido a la capacidad de la
celda de extraccin, se tomo la cantidad dc 400 mg como la mayor posible para la
obtencin de extractos sin producirse contaminacin ni prdidas hacia el interior del
equipo.
Sin embargo, tal como se comprob posteriormente, la trampa de bolas de acero no

permita la retencin de altas cantidades de extracto, por lo que hubo que reducir ]a 1
cantidad de muestra a la mxima permitida por La trampa, que fue dc 80 mg. Esta
reduccin dificuit La obtencin de mayores extractos.
La modificacin llevada a cabo en el equipo extractor (apanado 3.7.2) permiti

nuevamente el uso de cantidades de muestra de 400 mg
II
3. 7.2- Modificacin del equipo atractor
La figura 3 72a representa el esquema del extractor una .ez modificado. La modificacin
consisti en burbujear el CO2 gaseoso en un frasco que contena la mezcla
cloroormo:mctanol (2.1> empleada (200 mL) pan impedir que se perdiera extracto por /
arrastramiento de molculas de salmo por el gas tras la despresurizacin El realizar la

modificacin fue necesario tras descubrir que se producan prdidas de la muestra
extrada
2.29
(~MwIa J. Ap&sdu al deslate de a de anita ~qetnM.r
(>1ra modificacin necesaria fue la de obviar a salida del extracto disuelto procedente de
la trampa hacia los viales. En su lugar, se procedi a conducirlo al frasca de burbujeo. La
cantidad de extracto se obtuvo por pesada tras la evaporacin del disolvente a presin
reducida.
Los primeros resultados obtenidos se ilustran en la figuras 372b. Estos resultados se

obtuvieron previamente a la modificacin del equipo y con una cantidad de muestra de
4
4(X) mg Se observ que fraccionamientos realizados con frecuencias de 5 ruin a 40 0C Y
y-Y
.4
con diferentes presiones conducan a resultados en la extraccin total dificilmente
explicables, ya que a Las presiones ms bajas (13 MPa) se obten a mayor cantidad de
y-,
extracto que a las mayores presiones y as sucesivamente. Del mismo modo, se observ y--
que el mximo en la extraccin se alcanzaba antes en el tiempo para presiones mayores

(25 MPa), pero el rendimiento era siempre menor a que bajas presiones. Tras alcanzarse
el mxmo de extraccin se produca una extraccin nula de destilado en las siguientes
fracciones.
La figura 372c muestra la variacin en la cantidad extrada en los fraccionamientos

dependiendo de la duracin de cada paso en Las condiciones de 13 MPa y 40 0C. Los
fraccionamientos realizados con frecuencias de 5 ruin condujeron a la abtencin de
mayores cantidades de extracto, mientras que la cantidad de extracto disminuy conforme si
aumentaba la duracin de cada paso, siendo menor con fracciones de 10 ruin. Las es
extra4cones llevadas a cabo en un solo paso con una duracin de 70 mm produjeron y
extractos mmnLmos La imposibilidad de la explicacin <le los resultados obtenidos se

resolvi cuando se comprob que la cantidad de extracto restante se eliminaba por y-
arrastramiento del CO~ gas tras la despresurizacin. La colocacin de frascos con 1~

disolvente en la salida del gas para la extraccin de 70 mm en un solo paso permiti
confirmar esta hiptesis ya que las cantidades perdidas se recuperaron y llegaron a igualar
a las cantidades extradas en los fraccionamientos dc 5 mm (tambin indicado en la figura
3 7 2cy Este hecho sc debe a que la trampa dc bolas de acero es incapaz de retener todo
el extracto, llegada una cantidad. sta queda saturada y el resto de extracto se pierde junto
231
Capit> 3 4&otiw al suk de a de de asilar t<qsloles
al CO2 gaseoso El fraccionanuento en tiempos cortos permite que la trampa no se sature
y que se recupere para el siguiente paso tras el lavado con el disolvente. Esta es la razn
por la que los resultados ms satisfactorios se alcanzaron para tiempos de fracciones de 5
mm, seguidos de lO mm y por ltimo dc 70 miii (figura 3.7k). Al elevar la presin del
tratamiento se produce una ms rpida extraccin por lo que los efectos comentados
anenonnente sc hacen ms patentes y provocan que el tiempo necesario de cada paso en
un fraccionamiento se reduzca hasta 2 mm.
Las figuras 3 72d para los tratamientos a 40 ~Cy 352e para los tratamientos a 60 ~C
muestran que, independientemente de la presin del tratamiento, los resultados en el
rendimiento de la extraccin son buenos y totalmente explicables si los pasos del
fraccionamiento tienen una duracin de 2 mitin. Las condiciones de mayor extraccin se
alcanzan a 30 MPa y 40 ~C,siendo ya total la extraccin a los 20 fin de tratamiento. A
medida que disminuye la presin de estudio a temperatura y tiempo constante disminuye
el rendimiento obtenido, existiendo una gran diferencia entre los resudados obtenidos a
25 y 22.5 Mpa. hecho explicable por el descenso de densidad que se produce. A la
0C los rendimientos obtenidos son menores que a 40 0C girando en
temperatura de <>
tomo al 4O9~., y las diferencias debidas a la presin utilizada son menos patentes. Las
diferencias entre obtenidas entre Las extracciones a 40 0C y a 60 ~C se deben a que el
proceso determinante en la extraccin es el debido a La densidad y el aumento de la
solubilidad de los compuestos a extraer, tanto a altas, medias o bajas presiones, y en lo
que se refiere nicamente a la cantidad de extracto. Al comparar el rendimiento de la
extraccin lubindose reahzado el fraccionamiento o no, y antes de la modificacin del
equipo de extraccin (figura 3 7 20. se observa claramente que las mayores diferencias se
producen entre las extracciones a 40 ~C y a presiones sucesivamente mayores ya que
stas se producen m
4s rpidamente, con lo que la trampa se satura antes y la cantidad de
extracto no retemdo en la trampa es mayor
La baja tapacidad de la trampa para retener el extracto y a consecuente necesidad de

realizar fracconamtenuvs cm pasos muy cortos condujo a que los mtodos utilizados no
233
j/
C~,UUU 3. 4&ctri e/ de te ido de aceites vege
fueran factibles y Fue necesana La modmficacian del equipo de atraccin. Las figuras
37 2g y h muestran los resultados obtenidos para los tratamientos de extraccin del
destilado de la desodorizacin del aceite de oliva y girasol respectivamente, utilizando el
acoplamiento del frasco de burbujeo. Estos datos quedan tambin reflejados en las tablas
37.2a y b
Tabla 3.7,2a. Extractos obtenidos a partir del destilado de la

desodorizacin de aceite de ojiva (mg) en las condiciones indicadas.
lo 25,3 5,9 3,8

15 155,0 116,1 5,7
20 237,9 221,7 230.4 >1
25 326.8 345.4 355,4

30 377,2 362<?86
Tabla 3.7.2b. Extractos obtenidos a partir del destilado de la

desodorizacin de aceite de girasol (mg) en las condiciones indicadas.
Presl6n (Mf.) 40 W 50 oc 60W

lO 25,7 10,1 10,9
15 113.2 93,4 61,8
20 226,5 165,5 152.4
25 261.2 264.6 284,1
30 273 334l~0 345,9
A presiones dc 10, 15 y 20 MPa el mximo mudmuento de la extraccin se produce a 40

T, seguido de 50 y 60 C debido a que la deirndad dcl fluido es el (etor dominante en
la extraccin. A la presin de 25 MP. sc produce un equshbno entre La densidad del
fluido y el efecto de la volatilidad del utstrato, existiendo un rendimiento semejante a las
236
CepJfidoJ A al &smbb & le de melles vegetales
tres temperaturas de estudio, esto mismo se produce entre 50 y 60 ~C & 20 MPa. El

cambio de densidad provocado por I~ compresibilidad del fluido es poco notable entre 25
y 30 MPa. sin embargo, es marcado el efecto del aumento dc la presin de vapor por
aumento de la temperatura; esto conduce que el mayor rendimiento se alcance a 60 0C,
seguido de 50 y 40 C respeccivarnese, y de modo ms evidente en el caso de las

expenencias realizadas con destilado de la desodonzacion de aceite de girasol. -J
>1
y-
3.7.3. Sfeco de la presin y la temperatura en la extraccin de os compuestos

de la fraccin nsaponlflcabfr del destilado de la desodorizacin de aceites
vegetales
los compLiestos insaponificables hallados en el destiLado dcl aceite de oliva fi.eron os-y-
escualeno, f3sitostero.l, campesterol y esngmasterol, se detectaron otros compuestos

minoritarios, pero sin llegar a identificarlos (posiblemente A-avenasterol o A?-
estigmasienoIY Estos mismos compuestos fbercn los existentes en los destilados de aceite 1
de girasol y sus extractos, habiendo ms cantidad de esteroles y menos escualeno

respecto a las muestras de clin (tabla 3 7.3a). No se detect la presencia de &-caroteno m
de cx-tocoferol en ninguna de las muestras analizadas tras 1-a inyeccin de patrones. Las
figuras 3.73a y b muestran los cromatogramas de ODO y DDG respectivamente.
Tabla 3.73., Composicin & la fraccin insaponficable del destilado de

la desodozac,n de aceites de clin y girasol
DDO<%) DDG<%1
-Ir
E,seu-aeno 40,96 26,5 1
Campesterol
FMlgrnasterol
29,19
mi d.
22.56
23,81
It os,
y
IL<Sltonerol 29J5 27,05
-tos
~tet- dcMnct~de -
s
Ir
237
C&pMt 3. A-p&a#n al desUde fr-U de aceites vegetales
1
1>
5 10 5 20
tiempo <an)
flgesn Y7J8. Cninwgrama por HPLC de los compuestos
osepoalflca bies del desitied. de la dnodorlzacl6n de aceite de
olive,
4.>
si)
o 5 lo 5 20 25
tiempo (mii)
nra u 3k CNmatograma por HPLC de la fraccl4o
lmuapnUkahle tal dwttlede de la desedorliacln de aceite de
girasol-.
238
4)
Ir
csirt~ J Apfinra al - t ~j4)j * aceito vegetales os

Ir
1
El escualeno es el componente mayontao en la fraccin inupouiftcablc de ambos
sustrastos, si bien , el DDO posee la mayor cantidad. El segundo componente en 41
procentaje es el 8-sitosterol> FI campesacrol es el esterol que se encontr en menores -k
proporciones en el DOC, sin embargo, no se detectaron cantidades cuantificables de A
estigmasterol en el 000
os)
Las tablas 37.3<Lg) muestran las eantuiades extradas, expresadas en mg en cada

extracto, de los compuestos ansapowflcosabks identificados para cada una de las
condiciones estudiadas y con 000 y DOC corno sustrato. Los anlw-s realizados a los
e -
extractos obtenidos a partir dc DOC no detectaron estigmasterol en cantidades

os -
cuantficables. excepto en las condiciones de 30 MPs y 50 C. Independientemente de la
os.
temperatura, a la presin de lo MPs slo se detect la presencia de escualeno, a 15 MPa
se extrajeron 1,14 mg de B~siiostero a 40 C y el campesterol comenz a ser
II
cuantficable a partir de las extracciones a 20 MPs y SC) C. Las cantidades extradas de
tj
escualeno, campesterol y B-si-tostcrol amnentaron al aumentar La presin de la extraccin,
<A
siendo siempre mayoritaria la cantidad extrada de escualeno, seguida de B-sitosterol y -
campesterol Los extractos obtenidos a partir del DLX) tambion contuvieron escualeno
los
como componente mayontano, seguido dc &siostcrol. estiginasterol y escuaieno. Sin -
embargo. la cantidad de esteroles extrada lite superior a la del 000. El campesterol se

fr
extrajo cuantitativamente a partir de 2.5 MPs a las tres temperaturas. El estigmasterol y el os
tt-stosterol no se detectaron en los extractos obtenidos a 10 MPs y SO y 6<0 <~C.
4
Las figuras 3.7.3c <DLX)) y d (DOC) representan la extraccin de escualeno y de
esteroles totales en ftn~n de la densidad dcl C0~ y la temperatura dc los tratamientos. [4os~
Se observa que ni te mm mayor extraccin dc escualeno respecto -a los esteroles a os
densidades inferiores a 0,70 g/snL, sobre todo en el caso del ODO, presentando la
extraccin de esualeno pocas variaciones en todo el rango dc densidades (entre 1 y 3
< 2-
mg. tanto para los extractos de DLX) como dc DlXs) tos esteroles son pobremente
eximidos a den afcrnns a 0,70 MiL un embargo. a densidades superiores ~
239 1
CapItulo 3 Ap&nCtAn al &MUa&> eh La de eh aceites vegetales
Tabla 3.7.3b. Composicin (mg> de la fraccin iusaponiflcable de los extractos de DDO
obtenidos a 40 ~C.
Presin (MP.) escualeno campesterol estigmaiterol 0-altosterol

0 1,91 - - -
15 2,33 - - 1,14
20 2,38 - - 1,21
25 2,41 1,43 - 1,47
30 2,48 1,79 180
Tabla 3.7,Jc. Composicin (mg> de la fraccin insapomfcable de los extractos de ODO

obtenidos a 50 0C.
Presin (NiPa) escualeno cmnipesterol eutlpmasterol 0sltosterol
lO .12 - - -
15 2,38 - - -
20 2.67 1,59 - 1,45

25 2.56 1,65 - 1,66
30 2,61 1,73 1,42 1,80
Tabla 3.7.3d. Composicin (mt> de La fraccin insaponficable de los extractos de DDO

obtenidos a 60 C.
Ji4xtI,sscualent~E0Q!tOr9J estlgmasterol 13-altosterol

lO 1.32 - - -
15 2,48 -
20 2,41 - 1,20
25 2,51 1,7? 1,71
30 2,49 1,6-4 fi, 1,67
.
Capttrlo .1 A#kac$n al kutibuM eh u eksu&rfrncSv de aceiles vegetales
Tabla 3.7.3e. Composicin (mg) de La fraccin nsaponiflcable de los extractos de DDG

obtenidos a 40 C.
Presin MPs escualeno tun feral uit . asterol f3sit**terol

lO 1,54 1,14 1,04
15 2,09 - 1,43 1.39
20 2,86 - 1.36 1,86
25 2,38 1,87 1,24 1,90
30 2.58 153 2,05
Tabla 3.7.Jf. Composicin <mg) de la fraccin insaponificable de los extractos de DDG

obtenidos a 50 W.
Pres~4~!IMYa) escusleno eaj~pesterolest1~gnusterol 0-sitosterol

lO 1.12 - - -
15 1.98 - 1,35 1,29

20 2,19 - 1,45 1.58
25 2,21 1,34 1,60 1,91
30 2,61 1,76 l,7E 2,59
Tabla 3.7.Jg. Composicin (nsj) de la fraccin Insaponirscable de los extractas de DDG

obtenidos a 60 %.
Presin(MPBI_eseusleno eam,pesterol estIgmas 13-sltosterol

0 1,10 - - -
15 1,57 - 1,37 1,18

20 2,66 - 1,35 1,59
25 2,79 1,20 1,611 2,30
__ 30 2,44 1,37 2,07 2,45
,
Cap&do 3. A$arMn al tu~bt eh a k 1 aceItes vegetales
experimentan un rpido aumento en sm cantidades extradas, elevndose la cantidad de

esteroles totales obtenida por encima de la de escualeno.
La temperatura acta de modo decisivo en la extraccin de los componentes de la

fraccin insaponificabie (figuras 3>7>3< y d}. Se observa que el aumento de la temperatura
a densidad constante aumenta las cantidades extradas de escualeno y, ms claramente, de
esteroles. El aumento de la temperatura se observa principaltuente sobre la extraccin de
los esteroles, ya que estos compuestos son menos solubles que el escualeno en el CO2
supercritico y el aumento de la volatilidad se constituye como factor primero en la

extaccin Este claro aumento de La extaccin de esteroles se produce a densidades de
9C, 0.79 WmL a $0 0C y 0,89 ViriL a 40 ~C. La extraccin de esteroles en
0,74 g/mL a 60
las condiciones de ms bajas densidades tambin viene dada por las cantidades relativas
de stos en lo destilados originales, de ene nodo, hay una mayor extraccin de esteroles
en las muestras de DIX1 debido a que se presentan en mayores cantidades y de escualeno
en cl [390. Tambin se observa el efecto de la temp~eranra del tratamiento en la
extraccin del escualeno, producindose mximos dc extraccin, para cada temperatura,
en densidades semejantes a las de los esteroles, pero de modo menos marcado.
La selectividad de La extaccin del escualeno respecto al total de esteroles puede

definrse. de modo anlogo al dcl colesterol respecto a los tnglicridos (apanado 2.5.7),
COrno
re*-rwn ~awk,w 1 esaen>in en el exrcpelo

rOa cm erm*no ehiero& s en origen
Los resuludos de La scfrenvuhsd quedan reflejadas en las figuras 3.7.3< para el ODO y
3 7 31 para cl Dlxi La mayor scltctwtdtid St ikatua para las extracciones donde no ha
habido extraccin dc esteroles, > los valores hueme w&uio, sm embargo, las
cannilade de escualeno eaaido son muy (los rendimientos en la extraccin estn
redsenlastaMas37.iayb)
5ScproduccotromzimoenIasckctiMada2OMPay
244
CtpftWo 2. Ap&rUn al desnUde de ka de ches vegetales
las temperaturas dc 40 y 60 C para La extraccin dc escualeno a partir de DDG,

alcanzndose el valor de 2.5, que. sin embargo, es inferior al alcanzado en estas mismas
condiciones partiendo de 300 (alrededor dc 3>. A presiones mayores de 20 MPa, la
selectividad dismtnuye, llegando a valores dc 3 1.5 en cualquiera dc las tres
temperaturas y sustrastos, excepto a 25 y 30 MPa y 40 C con DIX), que se mantiene
superior <cercana a 2), debido a La menor extraccin dc esteroles en estas condiciones. Se
puede concluir que las condiciones de mayor selectividad se alcanzan a las menores
presiones y mayores temperaturas de estudio, pero se desaconseja el tratamiento por
obtenerse un bajo rendimiento de extracto. Las condiciones ms fav&ables son Las que se
producen al tratar DDO a una presin de 20 MPa y 40 C. S se parte de DOC con las
mismas condiciones de tratamiento, la selectividad conseguida disminuye en 0,5
unidades.
Una gran parte de los componentes de los destilados de la desodorizacin de los aceites
de oliva y girasol son cidos grasos libres, y stos tambin se extraen cuando se someten
a un tratamiento con CO2 supereritico, tal como se vio en los anlisis realizados por RMN
(apartado 35). Se calcularon las cantidades relativas de compuestos insaponificables

(escualeno ~ esteroles) que se encontraban en los extractos por diferencia a partir de las
masas de extracto obtenidas gravun~tricamente. Los resultados quedan expresados en las
figuras 3 73gparaelDDOy3 73h parad DDG.
Se aprecta que a lo MPa y. en mucha menor medida, a 15 MPa los extractos se hayan
enriquecidos en material msaponifick, aunque la cantidad extrada es demasiado baja.
A presiones mayores, no parece haber vanacin en las bajas cantidades extradas
0C y 1<) NiPa fueron las ms
respecto a la de aculas grasas hbret Las condiciones dc 60
favorables en Las reduccin de la extxtccin dc los cidas del DDO, seguido de la
extraccin a 50 y 40 N- por cte arden La explicacin puede ser la baja volatilidad de los
cidos grasos Ubres frese a las esteroles y, sobre todo, al escuaLeno. que es el compuesto
niapniftcabk que sc encuentra en ms cantidad en los destilados. La menor cantidad en
que se encuentra el escuakno en el DLX) frente al DDO puede ser la causa de que la
245
(op#nk 3 A~tat*u nf kaiah it a de netites vegetales
fraccin insaponificable se encuentre en menor proporcin en los extractos, aunque

tambin se ha de tener en cuenta que el DOC tiene ms cantidad de cidos grasos
insaturados que el DDO y que stos son ms fcilmente extrafbles por el CO2
supercritico> Las extracciones a que se somete el DDG proporcionan extractos menos

ricos en compuestos insaponiflcabies que el DDO y Las diferencias conseguidas a las
mayores temperaturas son menos evidentes. A partir de 20 MPa y para todas las
temperaturas y sustratos del estudio se mantiene la relacin entre compuestos
sapomficables/nsaponificablet, habiendo una composicin semejante a la de las muestras
en su origen>
-s
246
Capitulo 4.
Aplicacin del dixido de carbono supercritlco a la inactivacin
depectinenerasa en zumo de naranja.
y
Caplinio 4 ApUawMtnpmekbwrIMn&u hUpa 4 aso de naranja
SI
~ 1
4.1- INTRODUCCIN. LOS CTRICOS
Los frutos citncos representan una de las producciones ms relcnntes de la agricultura

7:
espaola y la ms importante de la provincias de Mwtia y Valencia. Predominan las
variedades para el consumo en fresco, pero tambin tienen nnpoctancta las que pueden -5
4
destnarse a las industrias para su trat4bnnactn en zwnos.

}
4.1.!- Composidn de law cftran
Los frutos ctricos. por su alto contenido en vitaminas y componentes minerales, constituyen,

dentro de la alimentacin humana, un producto de apreciado valor nutritivo. Entre dichas
frutas, las naranjas son las ms aceptadas. esto se debe flrndarneatalmcnte al sabor agradable
debido a La relacin azcar/cido, caractertstica de ellas y a sta notable valor alimenticio
(KdTord, 1973)
4
Las partes fundamentales de Los fi-tatas cnicos son epicarpio o flaveda, mesocarpio o albedo y
endocarpio o pulpa (figura 4 1 1.
El flavedo es la capa ms externa del fruta En eRa se encuentran los piastidios y numerosos ~il1-
vesculas de aceite esencial. Los > contienen clorofila en los frutos no maduros, y
caroteno,ximtofila y. en menor candad. > > cuando el fruta ha madurada
El albedo es una capa blanca y ~enq compuesta por clulas de forma ytamafio
rmgular, con grandes esp~ws iutercelulurn Denos de aire.
ir
La wmposicn del albedo es la r

I~I ~
4
7~5 80%
Materia seca 20-25%
248

.
44
Cq~tYM 4 Apfieatn pan a eflimcMn it Ja - Mamo de naranja. [st.
~ [54
11-5
[4-
44% SI---.
Azcares -.5

[554>
Glucosa 63.3%
Fructosa 20,5%
Sacaron 16% 4
Celulosa 33% e
Sustancias pcticas 20%. 1
5 .2
4>
Los ctncos son, a continuacin de tas manzanas, b segunda fuente ms importante de

pectinas pitia La mdustna. Otros componentes dcl albedo son Los glucsidos hesperidina y 4,
lmonina~ este ltimo importante por el problema & su intenso sabor amargo en la aceptacin PS
de los productos derivados de los citricos.
(-45<
[54
Debajo de las capas que consatuyen el fiando y albedo est el endocarpio o pulpo, formado
por una serie de segmentos. Cada segmento contiene una masa compacto de vesculas con Si-

4>
junio La pulpa es la principal pete comestible dcl fruto y gencrahuente alcanza el 50- 80%
- 4-4--
del peso del fruto entero <Keftord. 1973> 4,
~ 4.25> -
Los slidos disueltos en los zumos ctricos estn compuestos principalmente por azcares y
acdos fin Las naranjas son los azcares Las es dentro de los slidos
41
disueltos Los acdos presentes en e] nana de naranja son el ctax que predomina, y el ~4
nialico laminen hay pectinas solubles que al expmir la fruta quedan, en pone, incorporadas
al zumo Entre Las enrunas cxtuentes cabe destacar la pectiuesterasa. cuya actividad es mayor
en el endocarpio que en el albedo.
44
Por itmo, dentro del fruto estn kas ni las que cabe un alto porcentaje de
protenas y dc aceite -
~jF~ -;
~ > 2-
249
C#nU 4 A$wtrtM pta a tnrtnwtttn eh a pn 4 tuteo de naranja
epicarpio

me 4kiflrpt
anzkn~arpic
~cai lite
segnento
mest-r&ftfi entre eegfltitoa
vn.cula conteniendo zumo
pared celular
cal ul a
WZICULA
pared celular orgnu o
vattnia conteniendo aun>
CMMLA
Figura 4.1.1. M~rAflog*a do la carattJm.
250
.
~.1
C~swU 4. Aptftatn pro U awflnwMu it a pee Manto de naranja.
fil
4.1.2- Sustwwlaspdcilcas
1 tu sustane mas pcticas son un grupo compkjo de polisacridos cidos que se encuentran en
cantidades variables en el espacio intercelular de los tejidos do plantas superiores,
paruculannente en la lmina medis Estas sustancias se pueden clasificar del siguiente modo
~ 1-,
(Fogarty y Kelly. 1983>: 4, <4
-5-->
Ir;
4$
4-4,
designan a aquellos glcidos coloidales complejos de origen

vegetal y que contienen una gran proporcin de unidades de cido anhidrogalacturnico. Los
grupos carboxlicos del cido poligalacturnico pueden estar esterificados parcialmente por
grupos metilo o parcai o totalmente neutralrutdos por una o ms bases, >5/
la - es el nombre dado a la instancia que origina las sustancias pcticas,

tambn de origen vegetal y que adems es insoluble en agua,
~ - cosquenocontienenmsque
una pequea parte dc steres metilicos. B~o las condiciones adecuadas forman geles con
azcares y cidos; si el contenido en metcnilos es bajo pueden ibrmarse geles con algunos
iones Las sales de los cidos pectnicos pueden ser neutras o cidas
la psM~fl~ o Las - se refieren a los cidos pectinicos solubles en agua, pueden ~-i,i
4+>
contener diferentes proporciones dc steres meulicos y grado de neutralizacin, Tambin

pueden tbrrnar geles It
-5

el es el cido XAipIaCUEICO coloidal esenchnente libre de steres
~
rnetihcos Los pectatos ni sw sales derivada. 4
5.44
-S
45
251 IV.
-4
Captniloi Aptteertdu pu tu - U tsJiarodonoranJa
Los polisacridos pcticos son cidos poligalacturnicos. fonnack>s por cido galacturnico
con enlaces cx- 1,4 (que potencian la fonnacin dc coloides> y ramifIcaciones de otras
unidades no urnica.s, como rhamnosa, arabinos, galactosa. niosa y cosa~ La figura 4 1 2 1
representa la estructura general de las sustancias pcticas (Macmillan y Sbeiman, 1974).
55
O
O ~I:~
3
444
SI+~
OH 44>
O 4-
Si
OH >1
14 ~
OH
o >1-
[
7
4>14
Jo si 44 55
OH
444
OH O
CH3
OH ~..
O I~
Figura4l2.l Estructuradelas
El nmero de estenfkacicnes dc kw ca4nllscos a rnnol es miahle y depende

tambin de la especie vertal cm cuutta. Palo apater acetilos en C2 y C3, 4-.
4
~4I
44
252
.
Si
Cq#etu 4 Aplka Sn pu La teaeaewt eh Li l amo ch naranja.
~1
ji
55.
afectando a tas propiedades de gelifleacin. El peso molecular, en el caso de la naranja, est
alrededor de 400(X) y 50000. SI->..
u5
La prdida de solubilidad puede producirse por las siguientes razones:
- unin a iones polivalentes como los de cako~ io y bierro, que causan la

precipitacin de las sustancias pcticas poco esterificadas y reducen la solubilidad de
las altamente esenfleadas,
2. unin de los grupos carboxflicos a los hidroxilos de otros constituyentes celulares,

como la celulosa o hernicelukxsas. 45
(5-
3. enlaces inicos entre los carboxilos y Los grupos bsicos de las protenas.
4555
st
4 uniones ms dbiles con otros constituyentes celulares. 44

-VS
1~~
5 entretazamienro mecnico entre s o con polimeros de la pared celular.
4ilZ L 4-11
Lassustancaspcucaasclocahtaflcflla - niediaflacapadewnintercelularyla
pared primaria de los vegetales ( y I%IWk 1960} Su sintcsis comienza en las
pnmcras etapas de crecimiento y La textura de los frutos depende,
en parte, de La cantidad de sacas pcbCa& El fruto ~trde presenta protopectinas,
rnsolubles, que se nnsft>nmw cm solubles la ir > suavizando la textura. La 44-
facilidad de disoluctn en agua al La longitud & la cadena polisacrida,
pero en caso de pwductrsc una u Anima dxsolucwnu altamente viscosas,
41
>
dependiendo del peso de > - fricas iujca, pH., temperatura y

24
4<
concentracin. 44
253 Vr
;1
Cqinle 4 Ap*c4wMn pum la twdhrbhs it U eW amo de naranja k

14-1
La siguiente tabla muestra el contenido de sustancias pcticas en algunos frutar
Siui,j<
4-55
Fruto Sustmndas$~!!~t~L. 4->
4-
55
Uva 0,2-1,0
Manzana 0,5-1.6 ;p+4jj.
Pomelo 1.6-4,5 4-
~-i4->45
Limn 3,0-4,0 .44-
Limn (semillas) 6,0
$
$5 555
Limn (corten) 32,0 SI
Limn (pulpa> 25,0

Naranja (corteza) 20,0
Naranja (membrana) 29.0
Naa~culas~
h
En zumos de ctricos, a diferencia dc otros unos. su naturaleza turbia se considera una
caracterstica deseable. La uwbdetz propia del zumo no se presenta en el zumo existente en las 9
vacuolas celidares, sino que proviene dc la ruptura de las clidos durante el proceso de
41
extraccin En este proceso, compuestos de alto peso molecular de los organelos y citoplasma
quedan suspendidos en ci zumo junto con
pctico. Toda esta suspensin coloidal
- dc membrana y material de origen
la turbidez al auno y se compone de un
1>
3O~/o de protenas, 20% dc besperidina, 15% dc celukna y laemicehilosa y 5dc pectina 1
(Bennet. 1987), siendo el 3O~/o restante an > . Sin embargo. el efecto de la pectina
sobre la rurbidez es el ms importante (KimbsiI, 1991). ya que su insolubilizacin tambin
4>1
puede arrastrar otros compuestos dc conaderar su gran peso molecular (hasta 100.000 [4
o200 (XX))
I-
11-5 ~
254
Caphlo 4. A$kwMn para U 6 de be *1 auto de naranja.
4.1.3- Endmav pddlcar
La abundanca de sustancias pcticas en Los vegetales ha creado difrrentes sistemas

enzimticos capaces de degradar estas estucbsn. stos se diferencian tanto por su
mecanismo de accin como por su distribucin. Los enzrmas pcbcos se producen por plantas
y microorganismos. pero no por clulas animales 1 os enzimas pcticos se clasifican en dos
pnncipales grupos (Rombouts y Pilnilc, 1980):
ISi
1 enzimas que desesterifican mediante hidrlisis, son las pectinesterasas (tambin

llamadas pectasas y pectin-mneal ~ La desesterificacin de 1. pectina produce
metanol y cido pctico (figura 4.1.34 k
.5-
O
~OCH~ O
O
HO H
OH o + CH3OH
H
O
HO 14~ 4
Jl
OH 3-5-555V
O
-5>4.
Figura 4 1 3a> Reaccin de la - > (PE)fr 4-5

.24
2 enzimas que rompen la cadena a. son las despohmerasas. Estos 14

Si,
enzimas producen la toan de los enlaces idicos por hidrlisis (hidrolasos, figura
[4<
4.l.3b>o por3.ehrnmacion< 4513c)>

~1
4
k
1 4 - L- -
255 54- 55
2
(#ts 4 tp&utMn para tu de la iJSM> de naranja.
O O
-OH ~ OH
H H
PO
OH O -fr
-OH
O 51
HO 4- 1
>1 5-a
Si~
41
Si
Figura 4 1 3b> Reaccin de las bidrolasals (po PO
-5-5
Las poligalacturonasas tienen a los como mejor susarato para sta accin, mientras que 4-1~
la actividad disminuye al amnentar el grado de eteifeacin.
Sil
4
O O 4.
~ OCH3 ~ OH
H H
O
OH
O
4-,
H 0CM3
O
OH
OH
O
Fgura4 It Reaccindels <sZC*IC4iB& PL>.
4>
i~
iii Si Si
[4
256 4145
- ~4->1 j
53
CapUn/o 4. AplicacIn para la Inactivactn cte fa pectinesterasa del zumo de naranja>

341
45-
44-5-
4-4
4.1.4- Pectinesterasas en ctricos
453
4~
Las pectinesterasas son biosintetizadas por plantas superiores, hongos y algunas bacterias. Las 4-14
de frutos son las mejor estudiadas, encontrndose mltiples formas moleculares e isoenzhnas.
-5- 4
La accin pectinestersica fre ya estudiada por Frmy en 1840, que observ que al adicionar Si>
44>
zumo de zanahoria a una solucin de pectina se formaba un gel. El gel se deba a la hidrlisis <VV
> Sil
de los steres de la pectina seguida de la precipitacin como pectato clcico.
Los ctricos, junto con el tomate, son los frutos que presentan mayores cantidades de
pectinesterasa (Versteeg y col., 1978). El ablandamiento de los tejidos del fruto durante la
Sil
maduracin y el almacenamiento se ha asociado con la accin de la pectinesterasa, ms que a 54--y
.-1~
la accin de los otros enzimas pcticos. 34-

La calidad de los zumos de ctricos depende de las reacciones enzunticas que ocurren no
ik- 7~5~ -
Si 34-1
:4
slo durante el desarrollo y maduracin del fruto, sino tambin durante el procesado y
4--
almacenamiento del zumo. Cuando un zumo se obtiene por expresin del ctrico, los enzimas
son liberados de los lugares donde normalmente se encuentran. Varios de estos enzimas 4-4
Si
34
catalizan reacciones adversas que afectan al sabor y apariencia del zumo, en general a su
calidad. La pectinesterasa es el enzima que ms afecta al empeoramiento de la calidad del
-4
zumo.
Si,
Al comienzo del desarrollo de la industria de procesado de zumos de ctricos se reconoci la

clarificacin en zumos embotellados y enlatados como resultado de la accin de
pectinesterasa que no haba sido inactivada por medio de la pasterizacin, normalmente
realizada a 70 <C 1 mm (Ting y Rouseff, 1986). -44-4
I
531
~14
Si
44-
La pectinesterasa se encuentra asociada con elementos estructurales del fruto. Segn
Bruemmer (1980) no exista actividad en el zumo filtrado, pero encontr 58, 44 y 28 unidades
de actividad pectinestersica por kg de tejido seco en flavedo, albedo y pulpa
respectivamente. Si nos atenemos al zumo, la mxima actividad se encontr en los restos de
257
-44
Cop/uto 4. Ap/Jaretn para fa inactivacln de a pectineslerasa del zumo de naranja 4 42
~Si
1
vesculas (pulpa) y la menor en el sobrenadante del zumo centrifUgado, siendo la actividad del
Si
zumo proporcional a su contenido en pulpa (Ronse, 1951; Rouse y col., 1954). Jansen y col.
(1960) mostraron que la pectinesterasa est unida a las paredes celulares formando un
22
complejo enziina-sustrato con la pectina. Conforme la pectinesterasa acta sobre la pectina, 45-Si
<5
$545
desesterificndola, el enzima va pasando al medio desde la pared hasta llegar a un equilibrio. <5
Sin embargo el enzima soluble es un 20% ms activo que el unido a la pared. 53/
-1-5
-4-5
4.1.4.1- Isoenzimas
jI-
Actualmente se conocen varias formas de pectinesterasa de ctricos que difieren en sus

-4
propiedades cinticas y termoestabilidad (Versteeg, 1979). Algunas de las inegularidades

445
para la inactivacin trmica de la pectinesterasa y la estabilidad de la turbidez pueden
$4
atribuirse a la accin de diferentes formas de pectinesterasa.

555
1<4
Se han encontrado formas mltiples de pectinesterasa de ctricos. Evans y McHale (1978)

-45>,
caracterizaron dos isoenzimas en naranjas y limones, el primero de ellos lo encontraron en la

ji
piel y el segundo en las vesculas y carpelos. Versteeg y col, (1978) tambin partieron de <44
44-
pulpa y piel de naranjas, llegando a caracterizar dos isoenzimas (PEI y PEH). Los trabajos de
Rombouts y col. (1982) llegaron a aislar PEil nicamente de la piel, pero FBI se encontr
tambin en carpelos y vesculas. Ambos tenan un peso molecular de 36200, pero PEI era dos
veces ms activo. PEI tena una actividad ptima a pH 7,6 y PEII a 8,0. Posteriormente,
-4
Versteeg (1979) aisl un tercer isoenzima (HM-PE) y comprob que era ms termoestable
que PEI y PEII, de 54000 de peso molecular y con un 5% de la actividad total. Tambin pudo
separar HM-PE en tres fracciones, siendo el isoenzima HM-PEII el que contena el 85% de la
4$
actividad. En total se llegaron a aislar 12 isoenzimas de pectinesterasa en zumo de naranja, si
bien, PEI y PEil mostraron ms del 80% de la actividad (60% y 30% respectivamente).
-Si.
44,
258
Capitulo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectineslerasa del zumo de naranja.
4- U
4-!
<4
Y-
4.1.4.2- Estabilidad de los isoenzimas

-5-Si
<5
La actividad pectiinestersica de naranja se pierde solamente en un 15% tras dos aflos si se

conserva a 4 oc en NaC O, 1M y tampn fosfato a pH 7,5 (Versteeg, 1979). A 30 oc PH era 4-445-5
5-4
SI <>sv
estable 24 h a pH 4 y 7, pero PEil slo lo era durante 6 h a pH 4. Sin embargo, HIM-PE era
activo tras 15 das de almacenamiento.
4<-
53
Experiencias sobre la estabilidad trmica llegaron a la conclusin de que a pH 4, PEil era la
menos estable al inactivarse a 55 0C. PEI se inactivaba a 65 0C y HM-PB a 85 0C. Segn 34:
Kiinball (1991), la temperatura de pasterizacin nonnalmente empleada para el zumo de
$34
naranja (alrededor de 66 0C) ha de elevarse hasta 88 0C durante un tiempo no inferior a 10-15
-Y
s para evitar la accin de los enzimas; en el zumo de limn la temperatura puede bajarse hasta
--5-5
74 0C por su alto contenido en cidos, Segn Versteeg (1979), PEI y PEII poseen el 90% del -54;
45:
total de la actividad clarificante del zumo a 30 oc, sin embargo, a 5 0C PEI solamente
45<5
consevaba un 1% de su actividad a 30 oc y no se obsevaba una clarificacin significativa 2
<5
hasta la cuarta semana, excepto por la causada por la HM-PB, que si permaneca activa,
Segn Ting y Rouseff (1986) la temperatura de pasterizacin ha de elevarse hasta 90 oc lii s <4
341
o temperaturas mayores con menores tiempos. Seymour y col. (1991a y b) purificaron y
5-54-
caracterizaron dos fonnas de pectinesterasa, la termoestable (TS-PE) y la terinolbil (IL-PE)
distinguindose por su inactivacin a 70 0c durante 5 mm. Segn Snir y col. (1996) la
inactivacin de la TL-PE se consigue a partir de 2 mm, no variando la actividad tota! en
calentamientos de tiempos menores o iguales a 10 miii. 44-4
4-4-fi
Wicker y Temelli (1988) estudiaron la cintica de unactivacin de la pectinesterasa del zumo
de naranja cuando era sometida a un tratamiento trmico, observando un comportamiento no
4-
lineal debido a la existencia de fracciones de enzima con diferente termoestabilidad, si bien la -5<4
.4
velocidad de inactivacin poda acomodarse a una cintica de orden 1. Sin embargo,

anterionnente, Marshall y col. (1985) observaron que la cintica de inactivacin del enzima 45-54-5
dependa de la cantidad de slidos solubles en el zumo, cuantificada como 0Brix, entre 10 -
41
4154>
35 0Brix la cintica era de primer orden, pero por encima de 40 0Brix la cintica se tomaba 454-554-
259
Capitulo 4. AplIcacin para la inactivacin de fa pedneserasa del zumo de naranja
sigmoidal. Los estudios sobre la inactivacin de la pectinesterasa se han realizado en su

mayora sobre tratamientos trmicos a presin atmosfrica, incluso se han realizado estudios
sobre la inactivacin con CO2 supercritico; sin embargo, no se han encontrado referencias que
traten de acomodar los resultados de inactivacin a una cintica cuando los tratamientos se
realizan mediante la tcnica del CO2 supercrtico.
4.1.4.3- Estabilidad de la tarbidez y actividad pectinestersica 1>

Versteeg (1979) concluy que HM-PE era el isoenzima responsable de la desestabilizacin y
/
del zumo de naranja durante el almacenamiento y que la estabilizacin de la turbidez se

consigue por calentamiento a 90 oc i niin para inactivar este isoenzima. Sin embargo, la alta
451~
temperatura del procesado produce sabores desagradables en el zumo (Kew y Veldhuis,
1961). Adems, aunque representen las menores fracciones de la actitividad pectinestersica
453
del total del fruto (Rombouts y col., 1982; Versteeg, 1979; Seymour, 1991a; Wail<er, 1992),
0C, siendo necesaria su 5 45
estas formas son las ms activas en zumos mantenidos a 4
inactivacin (Versteeg, 1980; Seymour, 1991b). Tambin, Versteeg y col, (1980) advierten de
la posible desestabilizacin de la turbidez a pesar del almacenamiento a temperaturas bajo k
It.
Si
cero pero superiores a -20 0C, incluso en concentrados. U1
~Si
4.2.1- Preparacin de la muestra 42.

5
Previamente a cadatratamiento, las naranjas procedentes del comercio (4 Kg) se expriman en

34>5>
un exprimidor domstico Braun Citromatic de 50 Hz. El zumo se hizo pasar por un tamiz de 1 ~4
4-~
.42
4<5
5442-4- 45
mmi de luz de malta para eliminar fragmentos groseros de pulpa y evitar la aparicin de 4>
obstrucciones en la conducciones del equipo de tratamiento supercrtico. It4-
~Si
344; Si
-5511 -4
-5-
260 I
.
ii
53-5
CapItulo 4 Aplicacin para la Inactivacln de la pectinesterasa del zusno dc naranja
~-44
-5
Parte del zumo obtenido se utilizaba para realizar los diferentes tratamientos. El resto del
7v
zumo se conservaba a 4 oc y se utilizaba como control para los posteriores anlisis a realizar 5334 ~55
~3fi
en el mismo da. Las muestras se congelaron a -20 oc para prolongar su conservacin en el >4- >5<j
-[-4
Si~
caso de que fuera necesano.
~4-f
$3.
-5
-4jI Si~
-54-
4.2. 2- Efecto sobre el zumo de naranja del tratamiento con dixido de carbono en [.4 ~
II
55
condiciones supercrticas 45
,4Si
Los tratamientos se llevaron a cabo utilizando el extractor de fluidos supercrticos 1 Si~

semipreparativo LDC Analytical modificado (apartado 2.4.2). Se realizaron en modo
esttico y sin obtencin de extracto. La figura 4.2.2 representa el equipo tal como fue
li
modificado para los tratamientos del zumo de naranja. La celda fue la comnmente
utilizada para la extraccin a partir de slidos con las vlvulas cerradas para la realizacin 4<
5<
de tratamientos estticos.
El zumo se someti a las siguientes condiciones de temperatura, presin y tiempo: .4?

-54
4
- 40 y 60 oc,
- 6,9; 20,7y34,5 MPa,
- 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 minutos, 4-Si>
- 120 y 180 mm a 34,5 MPa y 60 0C con el fin de someter la pectienesterasa a las 1

-fi
condiciones de inactivacin ms severas.
Posteriormente se realizaron los anlisis junto con el control, que fue el zumo recin
exprimido sin someter al tTatazrnento supercrtico. <54-4
44
261 4<
-5-5
______________________ fi
.
CapItulo 4. Aplicacin para la inacthacin de lapeclinesterasa del zumo de naranja.
CRIOSTATO CELDA DE
EXTRACCrN
o
oc
9 CONTROLADORES
o DE TEMPERATURA
lz~
E-.
Figura 4.2.2. Esquema del extractor superertico sernipreparativo

para el tratamiento de zumo de naranja
262
-<Si>
-5-51
Capitulo 4 AplicacIn para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja

4-41-53-5
414
4.23- Determinacin de la actividadpectinestersica Si

-- 41->
4-
La actividad pectinestersica (APE) de los zumos controles y los sometidos a condiciones
supercrticas se detennin por valoracin (Ronse y Atkins, 1955). Para evitar errores por
exceso en la valoracin, el dixido de carbono de la muestra se ehminaba bajo coniente de
N2. SI
--5
Se utiliz como sustrato 30 mt de una solucin de pectina de ctricos altamente metoxilada

(Sigma Chemical Co.) al 1% en solucin acuosa con NaC 0,1M y NaN3 lniiN1, agitada Si~
0C. El pH de esta solucin se ajusta a 7,50 (ptimo de actuacin del
constantemente a 30
enzima) con disoluciones de NaOH y Hcl. La adicin de la muestra (2-5 mL) provoca la
liberacin de inetanol y grupos carboxilicos procedentes del sustrato en exceso. La APE se
calcula a partir del volumen de NaOH 0,0 lN consumido para neutralizar los grupos
carboxlicos producidos en un tiempo de 5 mm. Se define 1 UPE (unidad de actividad ~ ~Si-~
4
-5
pectinestersica) como la cantidad de enzima que libera 1 iimol de grupos carboxilicos por <~,
mmuto en las condiciones estndar de ensayo. La APE se suele dar como UPE por unidad de
volumen de muestra en mL y se calcula mediante la siguiente frmula:
4-4 1
UPE _ (mL NaOH) (N NaQEZ) (1O~) (4.1)

mL (mm) (mL zumo)
4 ~4-f
4$
$
4.24- Medida de la turbidez
El zumo se someti a las siguientes condiciones:

Si~4-
- temperaturas de 40, 50 y 60 0C,

presiones de 6,9; 138
,, 20T
,, 276
, y 345 MPa, 4-5
~-
4-
5
263
4
-5
I
____________________________________________________ 4~5 -5
.
-5
4--Si
tSi<
5$
Capitulo 4. Aplicacin para la inacilvacin de fapectinesterasa del zumo de naranjo.

j>4-5 55/
44;
El tiempo de tratamiento fue de 1 h. Tras el tratamiento el zumo era extrado con la presin
propia de la celda. Tambin se realizaron tratamientos en los que se despresuriz la celda 4(54
4; Si
~Si<
previamente a la extraccin del zumo.
555 5-1 Si
En el mismo equipo se realizaron tratamientos a 40, 50 y 60 0C durante 1 h a presin 43~
-Si
atmosfrica para la realizacin de controles tnnicos. Tambin se someti el zumo a presin -5-5
Si -4
45$
subetitica (5,5 MPa) y temperatura ambiente durante un tiempo mnimo como control en la -5-5
variacin de turbidez sin inactivacin de pectinesterasa.

-54-
Si-
La medicin de la turbidez se realiz segn el mtodo de Versteeg y col. (1980). El zumo se 4;

Sis-
~Si
centrifug a 320xg durante 10 miii. El sobrenadante se virtio en cubetas de 1 mm de espesor y
se midi la absorbancia a 660 nm frente a un blanco de agua destilada en un
4<
espectrofotmetro Beckman modelo DUt7O.
-~<5
i~-5J
El clculo de la precisin del mtodo de medida se realiz a travs del clculo de la 4-Si)jI
~1~5
desviacin estndar relativa de triplicados de muestras. Se realizaron quintuplicados durante -4;
dos das de una misma muestra ya centrifugada para comprobar la estabilidad de la turbidez
,44
de los preparados.
st --5
4.2.5- Medida del color
Si4
El color es uno de los atributos de calidad ms a considerar en Ja apariencia o aspecto de los

alimentos, En concreto, se ha observado anteriormente que el color de los zumos de naranja
sufre variaciones al ser sometido a tratamientos supercriticos, si bien, estos resultados son
difcilmente interpretables (Balaban y Arreola, 1991). -Si
42-4>
El color se midi segn el mtodo de Gonzles y col. (1990). Previamente se centrifug el

zumo a 320xg durante 10 mm. Se realizaron los espectros de absorcin UVVJS de los
264
$ 1
~45 >j
. : ~
Capl u/a 4. Aplicacin para fa inactivacin de la peclinesterasa del zumo de naranja
sobrenadantes en el espectrofotmetro, acopiado a un ordenador con velocidad de registro de

2400 mulmun, equivalente a registrar un dato de absorbancia cada 2 mm. Las medidas se
realizaron por quintuplicado para el estudio de su precisin. El mtodo de Gonzles y col, se
fiuindamenta en el la CJE, mejorando el tiempo de anlisis de las muestras. Se realiza un
registro y procesamiento de datos con ordenador, se consigue el control de un alto nmero de
muestras en un tiempo coito y, adems, el anlisis de los atributos cromticos de los muestras
estudiadas es ms eficiente, cmodo, preciso, exacto que otros utilizados anteriormente y
permite un mejor entendimiento de los resultados. Este mtodo ha sido utilizado con xito por
Gonzles (1990), Gonzles y col. (1990>, y Gmez-Cordovs y Gonzlez-Sanios (1995).
Posteriormente se calcularon los parmetros cromticos, que son la intensidad, tonalidad,

brillantez, longitud de onda dominante y pureza de cada muestra. Estas variables se definen
de la siguiente manera (Gonzles, 1990):
intensidad, es el rea entre la curva de absorbancias y el eje de longitud de onda desde

400 hasta 600 nm,
tonalidad, es la pendiente de la curva de absorbancias en el rango de 450 a 500 nm,

por regresin lineal simple,
brillantez, es la cantidad de gris que condene un color, dentro de una escala

comprendida entre el negro y el blanco,
longitud de onda dominante, es el matiz de color tal como rojo, verde, azul, etc.,
pureza, corresponde a la variacin que tiene un color cuando al permanecer invariable

el tono se va aclarando paulatinamente.
265
CapItulo 4. Aplicacin para la inaclivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja.
4.2 6- Efecto del almacenamiento sobre la turhdezy color
Se llev a cabo un estudio de la variacin de la turbidez y del color durante el

almacenamiento de zumos sometidos a los siguientes tratamientos:
1. almacenamiento a 4 0C,
- control (zumo no tratado),
- 27,6 MPa y 40 0C durante 1 h, extrayendo el zumo a presin, u
- 27,6 MTPa y 50 0C durante 1 h, extrayendo el zumo a presin,
2, almacenamiento a temperatura ambiente,
- control (zumo no tratado),

-34,5 MIPay 60 oc durante ib, extrayendo el zumo a presin,
-~ p,jy~ a temperatura ambiente dwwitc el ~ ndmo necesario para su 5>
posterior extraccin a presin. Ifl.J>AtjJt~ , Si
1-II
54-455!
4,3.1- Efecto del tratamiento con dixido de carbono supercr(fico sobre la

nactivacin depectinesterasa de zumo de naranja 4>
El estudio de la precisin del mtodo de valoracin de la APE, tras realizar valoraciones por Si
quintuplicado, ofreci valores de desviacin estndar relativa <9%,
I>
Las tabla 4.3.1 presenta los resultados de APE de los zumos antes y tras el tratamiento
supercritico para las condiciones estudiadas.
266
.5-fi
Capitulo 4. Aplicacin para la Inactivacin de Mi pectinesterasa del zumo de naranja.

4-34 1
<~1
Tabla 4.3.1. Actividad pectinestersica (UPEImL) de
los zumos antes y tras los tratamientos
con dixido de carbono supercritico (SC-CO
2). al
45
40 0C 60W ,5353
tiempo >554-
(mm) 6,9 NIPa 20,7 MPs 34,5 MPs atniosf. 6,9 NIPa 34,5 MiPs
________________________________________ <~
Si?
~ Si
0 1,21 1,20 1,19 1,15 1,20 1,20 -4:
34
1 1,05 1,20 1,15 0,80 0,30 0,25
10 1,10 1,25 0,90 0,30 0,30 0,25
15 1,10 1,15 0,95 0,30
fi1
- 0,25
20 1,05 1,00 0,90 0,30 0,30 0,25

30 1,00 0,80 0,75 0,30 0,25 0,20 -55
45 1,00 0,70 0,60 0,30 0,25 -
60 0,75 0,50 0,35 0,30 0,25 0,15

90 0,65 0,45 - - 0,20 0,15
(-5-
120 0,55 - - - - 0,20 -555>
180 - - - - - 0,20
<Si
345
Si
Se observ que los tratamientos a 60 oc fueron los ms enrgicos; sin embargo, tambin se 5545
<-5
observ que la presin era un factor a tener en cuenta, ya que los tratamientos a presin st
atmosfrica a 60 0C sufrieron una menor inactivacin de la pectienesterasa. A presin

atmosfrica y 60 0C la unactivacin es ms lenta que a cualquiera de 1-as presiones de estudio,
ya que al cabo de 1 miii la actividad se ha reducido solamente a 0,80 UPE/mL, mientras que
555
en los tratamientos supercrticos llega a ser de 0,20 UPE/mL, pudindose considerar valores 44,-
fi-Si
de +0,05 como elTor del propio mtodo de medida. Los tratamientos realizados a 60 0C
dejaron una actividad residual de 0,20 0,05UPE/mt causada por la pectienesterasa
tennonesistente (la inactivacin se consigui totalmente en ensayos realizados a 90 oc y
presin atmosfrica).
4
En los estudios realizados a 40 0C se pudo adecuar al orden cero la cintica de unactivacin
34 1-5
fi
mediante anlisis por regresin lineal simple, siguiendo la ecuacin:
267
Capitulo 4 Aplicacin para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja.
344
APErnL=APE6 /rnLKt (4.2) 4

3Si,4
donde: APE0 APE inicial expresada como UPE, Si
53455
K = constante de velocidad expresada en UPE/(niL~niun),
t = tiempo en minutos.
1>54-
41
fi- -5434
Los resultados obtenidos para la cintica de unactivacin fueron los indicados a continuacin: --5-55
44-5l
0C y 6,9 MPa: APE/mL = -0,00509t + 1, 1288, r2 = 0,9210;
-40
-40 0C y 20,7 MPa: APE/mL = -0,01033t + 1,2401, = 0,9023; b Si
-40 0Cy 34,5 MiPa: APE/mL=-0,14204t+ 1,20501,?0,9715.
Se puede observar, tambin, el efecto dependiente de la presin sobre la inactivacin

pectinestersica, ya que la constante de velocidad de inactivacin aumenta progresivamente
(en valor absoluto) al aumentar la presin del tratamiento, siendo la alcanzada a 20,7 MPa el
doble que a 6,9 MPa, y a 34,5 MIPa llega a iriplicarse. ste un hecho que satisface las
44-
-5-5155
<4-
espectativas para conseguir efectos de inactivacin con empleo de menores temperaturas de -Sir
calentamiento. Sin embargo, los tratamientos no son tan drsticos como los que se realizaron
a 60 0C, independientemente de la presin utilizada.
4-5 34
4.52- Efecto del tratamiento con dixido de carbono supereritico sobre la

nodflcacin de la turbidez del zumo de naranja
Los resultados tras la medicin de la turbidez de una misma muestra durante dos das se -54-
4-34
presentan en la figura 4.3.3a (del apartado 4.3.3). Se observa que la turbidez de los zumos tras
la centrifugacin es muy estable tras dos das de mediciones, ya que la desviacin estndar u134
~i55
relativa conseguida es <1,5%, del mismo modo que esta turbidez no impide una muy buena -Sil
repetibilidad de los resultados. La razn de la estabilidad se explica ya que tras la
268 4
5-Yfis
g-
CapItulo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectinesierasa del zumo de naranja. <4
4 - -
4-534-
fil
centrifugacin disminuye la concentracin de pectinesterasa en el sobrenadante,
<4
disminuyendo su actividad. fl~
Ii
<~~34
>4<5
La precisin del mtodo al realizar triplicados de un zumo ofreci un valor de desviacin .4-fi?
4;
estndar relativa <1,5%, siendo un mtodo muy preciso (figura 4.3.3b, del apartado 4.3.3). fiSi/<
1~5fi
Se observ un aumento generalizado de la turbidez del zumo de naranja tras los trataniletitos
4;
supercriticos. El aumento no se produca en los tratamientos trmicos a presin atmosfrica. Si Si~
>45>5 53
La tabla 4.3.2 presenta los resultados de absorbancias a 660 nm de los zumos antes y tras los
,4-Y
tratamientos en las condiciones indicadas. En todos estos casos el zumo se extrajo a presin ~55>
tras finalizar el tratamiento. La figura 4.3.2 representa la variacin de turbidez calculada del
siguiente modo:
T T
AT ~ (4.3)
2? 531)
siendo:
~55
434
AT la variacin de la turbidez,
T, la turbidez antes del tratamiento,
T
1la twbidez tras el tratamiento,
antes y tras los tratamientos con dixido de

Tabla 4.3.2. Turbidez (ka) de los zumos
-44-
>55
carbono supercritico (SC-CO2). ~1>
0C)
Temperatura (
Presin (MiPa) ____________ 50
____________ 60
40
control SC-CO
control SC-CO2 2 control SC-co2
atmosfrica 0,0359 00381 0,0359 0,0417 0,0359 0~O320
6,9 0,0271 0,1069 0,0340 0,0763 0,0406 0,0847
13,8 0,0476 0,2231 0,0464 0,2063 0,0200 0,1479

20,7 0,0393 0,0864 0,0393 0,1197 0,0393 0,1337
27,6 0,0504 0,1967 0,0504 0,1204 0,0869 0, 707
34,5 0,0274 0,0963 0,0274 0,1496 0,0869 0,1199
269
-rvz-c>- ~- 5
-fi
6
Capitulo 4. Aplicacin para la inactivacin de la peclinesterasa del zumo de naranja.
4l~~
4-4>
Sin embargo, aument tambin la turbidez en los zumos que no eran sometidos a presiones
leves (5,5 Mpa) y a temperatura ambiente. El aumento en la turbidez de los zumos no se
47<
produjo cuando stos eran extraidos del equipo tras la despresurizacin de la celda (a presin --Si
atmosfrica) a pesar de haber sido sometidos al tratamiento supercrltico (ver tambin el

apartado 4.3.4).
~<
Por lo tanto, el aumento de la turbidez no se debe al tratamiento superciitico sino a las fuerzas 3434
de cizallan-iiento que se producen mediante la despresurizacin. Estas fuerzas provocan una 3-44
disgregacin de las partculas del zumo en partculas ms pequeas y numerosas que se
4-34
4
mantienen ms tiempo en suspensin, aumentando la turbidez del zumo y disminuyendo la
formacin de precipitados. En conclusin, el aumento de turhidez del zumo no es dependiente
de la presin y la temperatura del tratamiento superertico a que se ha sometido sino que
depende de las fuerzas producidas al realizar la despresurizacin simultneamente a la
obtencin del zumo una vez tratado. -54
~Si
4.3.3- Efecto del tratamiento con dixido de carbono superertico sobre la
mod~flcacin del color delzjitno de naranja 4
Se realizaron los clculos de precisin del equipo y delmtodo al igual que en la medida de la
A
turbidez (apartado 4.3.2). Los resultados, representados en las figuras 4.3.3a y 4.3.3b
respectivamente, fueron igualmente satisfactor os.
La figura 4,3.3c muestra los espectros de absorcin UVIVIS de un control, dos zumos
sometidos a condiciones supercriticas (obtenidos simultneamente, SC+FC, o tras la
despresurizacin de la celda, SC) y de un ziuno presurizado a 5,5 Mpa, FC. l53
444
4, Si
Los zumos tratados con dixido de carbono superoritico y extrados a presin (SC+FC) >65>
34Sis
ofrecieron valores de absorbancias mayores que los controles en todo el espectro de
longitudes de onda estudiado. Estos resultados indican que n-o existe un cambio en el color <54
270 <5
4<4
CapItulo 4. AplicacIn para la inactivacin de lapectinesleraso del zumo de naranja.
Absorbancia CV(%)
4,0 2,0
35
3,0 1,5
25
2,0 1,0
1,5
1,0 0,5
0,5
0,0
0,0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
Longitud de Onda (nm)
Figura 4.3.3a. Precisin en la medida del espectro 13V/VIS
Absorbancia CV (a/o)
4,0 20
3,5
3 0 1,5
2,5
2,0 1,0
1,5
11,0 0,5
0,5
0,0 0,0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
Longitud de Onda (nm)
Figura 4.3.3b. Precisin del mtodo de medida del color

271
7 fi
Si
-5 53~Yfi.5
captulo 4. Aplicacin para la inactivacin de lapectinesterasa del zumo de naranja, 3454 >Si
-5
55
4 -5
smo una prdida de transmitancia debido a la mayor presencia de particulas suspendidas en el -fi
zumo. Sin embargo, entre 400 y 600 nm se aprecia que se produce un aumento de la t Si
absorbancia que no se corresponde nicamente con un simple aumento de las particulas en

suspensin, sino que es debida a la modificacin del color. Las mayores aborbancias en estas
longitudes de onda producen un viraje de color desde el naranja (control) hasta el amarillo 47
~
fi
(zumo tratado) fcilmente apreciable bajo un examen visual. La figura 4.3.3d muestra una
fotogralla de un zumo antes del tratamiento y de otro zumo tratado del modo SC+FC.
I~$Si
4;SiSi
El tratamiento a 5,5 MIPa y temperatura ambiente (FC) produjo resultados similares a los
anteriores. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre los zumos tratados y 4-Si>
extraidos a presin atmosfrica (SC) y los controles. Las causas de estos resultados son las 44
mismas que las expuestas para la modificacin de la turbidez (apartado 4.3.3), es decir quela 44-
fil
ausencia de frerzas de cizallamiento evita la formacin de ms partculas suspendidas, no
aprecindose modificacin de la transmitancia.
4
1?
La tabla 4.3.3 ofrece los resultados obtenidos para los controles y los tratamientos realizados.
564
Se observa que, tras los tratamientos, se produce un aumento en los valores de pureza e
-5
mtensidad, no se produce diferencias significativas en los valores de longitud de onda
dominante, y disminuyen los valores de brillantez y tonalidad. Estos resultados se achacan al 1
aumento de la turbidez y no a un cambio de color, excepto los resultados de la tonalidad, que
reflejan el cambio del naranja (controles) al amarillo (tratados).
53
55
Los resultados obtenidos difieren a los obtenidos por Balaban y Arreola (1991) ya que no se
observaron diferencias dependientes de las condiciones de temperatura y presin de
tratamiento sino de la forma de obtencin del zumo una vez tratado para la inactivacin de la
pectmesterasa.
1>4
273 ib
-54
Tabla 4.3.3a. Influencia en la brillantez del tratamiento supercrtico y posterior obtencin
del zumo a presin.
Temperatura (0C)
40 50
Presin (MIPa) 60
control SC-CO, control SC-CO
2 control SC-CO
atmosfrica 31,82 3L83 31,82 28,41 31,82 37,73
6,9 39,14 2,95 53,41 7,76 25,41 5,67
13,8 47,86 2,34 21,50 0,16 48,58 0,80

20,7 30,89 5,25 30,89 1,90 30,89 1,36
27,6 23,32 0,28 23,32 2,05 35,22 0,60
34,5 37,75 3,97 37,75 0,77 35,22 3,19
Tabla 4.3.3b. Influencia en la pureza del tratamiento supercrtico y posterior obtencin

del zumo a presin.
0C)
Temperatura (
Presin (MiPa) 40 50 60
control SC-CO, control SC-CO, control SC-CO,
atmosfrica 32,28 31,17 32,28 35,98 32,28 32,61
6,9 49,28 91,89 26,30 87,28 47,84 88,91
13,8 30,09 93,19 51,23 98,76 33,37 97,95

20,7 47,48 88,05 47,48 94,27 47,48 95,74
27,6 53,22 95,28 53,22 90,73 43,07 8401
34,5 38,39 89,29 38,39 96,89 43,07 42,18
265
Captulo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja.
Tabla 4.3.3c. Influencia en la longitud de onda dominante del tratamiento superoritico y

posterior obtencin del zumo a presin.
Temperatura (0C)
Presin (MPa) 40 50 60
control SC-CO
2 control SC-CO2 control SC-CO2
atmosfrica 580,2 579,3 580,2 579,8 580,2 578,8
6,9 579,1 585,8 579,5 583,6 581,1 584,6
13,8 579,6 586,8 581,3 592,6 579,2 589,8
20,7 575,4 584,9 575,4 587,4 575,4 585,3
27,6 574,9 587,1 574,9 586,5 577,6 588,3
34,5 580,5 585,6 580,5 589,6 577,6 587,0
Tabla 4.3.3d. Influencia en la intensidad del tratamiento superoritico y posterior

obtencin del zumo a presin.
0C)
Temperatura (
40 50 60
Presin (MPa)
control SC-CO
2 control SC-CO2 control SC-CO2
atmosfrica 131,28 131,19 131,28 141,11 131,28 118,33
6,9 128,72 460,35 79,76 347,96 166,96 386,38

13,8 92,92 494,43 189,24 852,96 97,71 676,87
20,7 150,05 388,91 150,05 522,98 150,05 579,09
27,6 181,05 705,14 181,05 485,60 126,48 569,27
34,5 121,78 418,35 121,78 638,57 126,48 348,12
266
CaplitIo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja
Tabla 4.3.3e. Influencia en la tonalidad del tratamiento supercrtico y posterior obtencin

del zumo a presin.
Temperatura (0C)
50 60
Presin (MPa) 40
control SC-CO
control SC-CO control SC-CO
.2,75 iO~~ -3, ra~
atmosfrica -2,754W -2, 7710>~ -2,751W -s,sa~
3,97 io~~ ,i367.1G~2
6,9 -6,08 iO~ -1, 48310>
-2,77 j~.3 -2,5221&
13,8 -2,42 iO3 .1,59010> -4,42 iW -270410>
..7,75.I0>1 .1,17210> .~,75 io-3 -1,56910 ,7,75. i& -2,41&ltT
20,7
-9,15 iW -131510> -5,16 o3 -3,4&lcT
27,6
-3,451W -1,26610> -3,451W -1,89210>
34,5
267
,,
~-5~-5----5 55> fi-<,~ ~>4
--5 <5-
Capitulo 4. Aplicacin para (a inactivacin de lapeclinesterasa del zumo de naranja
4.3.4- Modticacin de la turbidez y color del zumo de naranja durante el fi

almacenamiento
-Si
Las figuras 4.3.4a y b muestran fotograflas de los zumos conservados a 4 0C tras un da y una .
semana, respectivamente, del tratamiento con CO

2 supercrtico. Se observa que tras un da fi--4=4- fi
todas las muestras han clarificado parcialmente. La turbidez del clarificado es mayor en los
dos zumos tratados que en el zumo control debido al aumento del nmero de menores
partculas en suspensin. Adems, se observa que el volumen de precipitado es menor en los
zumos tratados, ya que parte de ste an se conserva en suspensin, y su aspecto es ms
gelatinoso. Las observaciones realizadas tras una semana de almacenamiento desde el
tratamiento sirvieron para marcar ms las diferencias entre el zumo control y los tratados.
Si~
4-
Si>fi{53
Respecto a los zumos almacenados a temperatura ambiente se realizaron medidas de turbidez

durante 15 dias, tras los que los zumos presentaban ya un deterioro que imposibilit la
realizacin de posteriores medidas. Los resultados se representan en la figura 4,3.4c, En los ,-~Si
<>6<
tres casos estudiados se observ un aumento de turbidez al cabo de un da, debido - -5
probablemente a la actuacin de otros procesos enzimticos que producen un aumento del

nmero de partculas estables en suspensin (poligalacturonasas y pectfn-liasas), con el Si
consiguiente aumento de la turbidez.

Si-
A partir del cuarto da de almacenamiento, el zumo que no fue sometido a ningn iratamiento 4-
>1
recuper el valor inicial de la turbidez y sta sigui perdindose lentamente hasta el da 15.
Hay que tener en cuenta que la turbidez inicial en los controles es baja, con lo que la 4-)
disminucin que se produce durante el alimacenainiento es poco pronunciada.
-5-4;
Los zumos que suflieron las fuerzas de cizallamiento (SC+FC y FC, figura 43.4c), <fi
producidas por la salida del dixido de carbono a presin, alcanzaron valores iniciales de 4- 4- 41
56
turbidez sensiblemente mayores a los controles, tal como ya se ha indicado en el apartado <-4
4.3.2, pero no se puede considerar significativa la diferencia de turbidez entre estos dos tipos
de tratamientos.
ii
278
--5
Y-fi
Cap/nilo 4. Aplicacin para la inactivacin de la pectinesterasa del zumo de naranja
El zaino piesutizado (FC, figura 4.3.4c) sufri una rpida prdida de turbidez desde el da 1
hasta el da W, ya que el aumento de la turbidez te compensado posteriormente por la accin
de la pectinesterasa, que conservaba plenamente su actividad. Posterionnente, la clarificacin
se desalToll ms lentamente,
El zumo sometido a condiciones supercr!ticas (SC + FC, figura 4.3.4c) mantuvo estables los
valores de tubidez hasta el da 10 debido a la baja actividad pectinestersica. Una posible
reacitvacin del enzima (Balaban y Areola, 1991) fue la causante de la prdida de turbidez
entre los das 10 y 15. De este modo se comprueba que semejora la turbidez de un zumo con
el tratamiento de presin, si bien es la inactivacin de la pectinesterasa llevada a cabo con el
dixdo de carbono supercritico la que pennite una estabilizacin de estos valores elevados de
turbidez durante tiempos de almacenamiento ms prolongados.
280
;
,-~ i~
Conclutlfles.
CONCLUSIONES
la. El anlisis de la grasa lctea por cromatografiEl lquida de alta eficacia junto con el
anlisis por GC de los cidos grasos de las fracciones procedentes de la separacin
por HPLC premiti la estimacin de 181 especies moleculares, 30 de ellas
identificadas por primera vez, debindose destacar la presencia de 10 triglicridos
con un nmero impar de carbonos y 3 con un cido graso de cadena ramificada.
2a~ La comparacin en la composicin triglicrica de la grasa de leche de oveja, cabra y

vaca, pone de manifiesto que la de oveja es la ms enriquecida en triglicridos
saturados de media, la de vaca en triglicridos de cadena larga saturados y la de cabra
en triglicridos saturados de cadena media.
3a La adicin de un soporte slido e inerte que aumente la superficie de contacto y evite
la formacin de canales preferenciales es necesario para mejorar el rendimiento de las

extracciones y, sobre todo, la extraccin selectiva de colesterol.
4a Las condiciones de 14,5 MPa y superiores en presencia de bolas de vidrio son las que
proporcionan una mayor reduccin de colesterol en la nata (75%)

independientemente de la temperatura. La mayor selectividad se consigue a la
0C.
densidad de 0,7 gImL y temperatura de 60
5a, La espectroscopia de 3C-RMTN ha demostrado ser una tcnica de utilidad por ser
complementaria a las tcnicas cromatograficas usadas en la presente memofltt
6~. El detector de masa a 30 oc y 121 kPa es adecuado para el anlisis cuantitativo por
HPLC de esteroles y escualeno en mezclas en las que exista una gan variedad de
estos compuestos.
281
Conclusiones.
Y. La mayor selectividad en la extraccin de escualeno respecto a los esteroles en los

destilados analizados se consigue a bajas presiones (10 - 20 MPa) y altas
temperaturas (60 y 50 0C), si bien, densidades muy bajas (0,29 0,39 g/mL)
-
conducen a bajos rendimientos de la extraccin.
ga, La inactivacin de la pectinesterasa responde a una cintica de orden cero, siendo la
constante de velocidad directamente proporcional a la temperatura y presin del

tratamiento con CO
2 supercrtico.
Y. El aumento de la turbidez y la variacin de color de los zumos tratados se debe a la

aparicin de fuerzas de cizallamiento en el caso de que la obtencin del zumo sea
simultnea a la despresurizacin. La variacin de la turbidez y el color, en las
condiciones estudiadas, es independiente de la presin y la temperatura del
tratamiento,
loa. La inactivacin de la pectinesterasa junto con la obtencin del zumo

simultneamente a la despresurizacin contribuye a preservar el aspecto del zumo
durante el almacenamiento, ya que, a temperatura ambiente, se consigue un aumento
de la turbidez y su mantenimiento hasta un tiempo de 15 das,
282
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299
Anexos.
ANEXO 1
10 CLS REM************randonigradienteeisocraticoprimeros*****************
20 OPTIoN BASE 1
30 N 30: TNPUT NUMERO YNOMBREDELAFRACCION; 5<, X$
40 DIM As(N), D(N, 2), AGT(N), CONC(N, 2), 17(N), PAG(N)
50 PR>INT - INDICA EL AREA DE LOS SIGUIENTES ACDOS GRASOS
60 PRJiNT EN NUMERO DE CUENTAS
70 FOR 1 1 TO N: READ A$(I), D(I, 1), D(I, 2)
80 PRTNT A$(I), D(I, 1), D(1, 2): INPUT AREA; AGT(I)
85 NBXT 1
92 CLS : Y x * 40/60 + 13 + 1/3
93 INPUT AREA DEL PATRON INTERIO EN NUMERO DE CUENTAS; API
94 INPIJT CONCENTRACION DE PATRON INTERNO; CPI
95 ECNmjn = (LOG((Y - 2.8297) /2.8297)! LOG(10) + .81143 .0289) .06025
-
96 ECNrnax (LOG((Y - 28297 + 2/3) /2.8297)/LOG(10) + .81143 + .0289)/.06025

109 FORI= 1 TON
110 IP 1 1 THENF(I)= 238: 0010 118
111 ff1 2 TREN F(I) >476: 0010 118
112 IP 1 = 3 TREN F(I) .623: GOTO 118
113 fF1 =23 THIENF(I) .914: GOTO 117
114 IP 1 = 25 TI-liEN 17(1) .868: 0010 117
115 1117 1 27 TREN F(1) .87 ELSE F(I) = 1
1117ff 1 = 23 OR 1 = 25 OR 1 = 27 TREN CONC(1, 1) AGT(I) * CONC(15, 1) (AGIOS) *
17(I)): COTO 119
118 CONC(I, 1) AGT(1) * CPI 1 (API * 17(1))
119 NEXTI
140 CLS
150 FORI= 1 TON
155 POR J=I TON
160 POR 10 = STO N
163 TRGO(J) = D(I, 1) + D(J, 1) + D(I0, 1): TRGO(2) D(I, 2) + D(J, 2) + D(I0, 2)
165 ECN = TRGO(1) - 2>12448 * TRGO(2)
170 IP ECN > ECNmin ANIS ECN <ECNmax TREN CONC(1, 2) CONC(1, 1): CONC(J, 2) =
CONC(J, 1): CONC(I0, 2) CONC(I0, 1)

175 NEXT 10
180 NEXTJ
181 NE.XTI
182 Z$ B:\FV + X$: OPEN O, #], Z$
183 FOR 1 = 1 TO N: WRITE #1, A$(I), D(I, 1), D(I, 2), AGT(I), CONC(I, 1), CONC(I, 2),
F(I): NEXT 1
184 WRITE #1, API, CH
185 GLOSE 1
210 TCONC = O
220 FOR 1= 1 ION: TCONC TCONC + CONC(I, 2): NEXT 1
=
230 FOR 1 1 TO N: PAG(I) (CONCQ, 2)! TCONC) * 00

= =
240 NEXT Y
241 LPRINT FRACCION; X; ELUCION A LOS; Y; MINUTOS
300
.5-5
____ - . . .-. .-. -- . .- rr
242 LPRINT ECNmn=; ECNmin; ECNm &, ECNmax

243 LPRIINT AREA DE PATRON INTERNO ,API, CONCENTRCION DE PATRCY44
INTERNO: CPI ;
250 LPRINT: LPRJNT TRIOLICERIDO; TAB(33); NC; TAB(39>; WDEII. TAB(46k

ECN; TAB(57); %; : LPRINT
260 FOR 1 1 TO N=
270 FOR J 1 TO N=
280 FOR 10 .1 TO N
290 TRG$ A$(J) + A$(J) + A$(10)
=
320 117 J ITHEN 360

330 IF 10 J THEN RES (PAG(I) PAG(J) PAG(10)) /(1000<)) tSE RES (PAQ<T)
= * * *
PAG(J) PAG(I0) 3)/(10000): (lOTO 370

* *
360 lE 10 J THEN RES (PAG(l) PAG(J) PAG(I0) 3)/(10000) ELSE RES (PAC)(I)
= = * * *
* PAG(J) * PAG(l0) * 6)/(10000)

37OIFRES<l THEN4IO
375 ECN (D(l, 1) + D(J, 1) + D(l0, 1)) -2>12448 (DQ, 2) + D<J, 2) + DQO, 2>)
= *
380 IF ECN < ECNmIn OR ECN> ECNmax TREN 410

400 LPRJNT TAB(4); TRG$; TAB(32); TRGO(l); TAB(39). TRGO<2t TAB(43); EGN;
TAB(55); RES
410 NEXT 0
420 NEXT J
430 NEXT 1
440 DATA C4:0 ,4,0,C6:0 ,6,0,C8 O ,S,0,CIO:0 ,10.0$CIO:I e,I0,17C120 tIZO
450 DATA C13:0 130040 ,14,0,C14 1 ~,I4,l,Ri.Cl5:0~,t5,O,~4Ai~CI50 tl$.O,tlS:O
,15,0
460 DATA CIS:l 45,1,C16:O ,i,0,CI:0 #160MC16:l ~.l6,I,Cl6 I(fl.),16,i,i.
C17:0 .17,0
470 DATA ai-C17:0 ,17,0,C17:0 ,17,0,C17 1 ,I7,1,~Cl8 O tlS,0$CIS:l(O) Ufl)
480 DATA CE: 1(V) ,8,I,C18:2(L) ,18,27C19 O ,l9,O7CIS:3(I&n> ,1L3
490 DATA ctcC 18:2 1 8,2,C20:0 ,20,0,C20: ,20, 1
,
700 EMO
I
e
IOCLS
20 OPTION BASE 1
fi~
30W = 30: INPUT NUMERO Y NOMBRE DE LA FRACCION. X, X$
40 DIM AsN), D(N, 2), AGT(N), CONC(N, 2), P(N), PAG(N)
50 PRINT INDICA EL AREA DE LOS SIGUIENTES ACIDOS CRASOS
-
60 PRINT EN NUMERO DE CUENTAS

70 POR 1 1 TO N: READ A$(l), D(l, 1), 0(1,2)
80 PRINT A$(I), 0(1, 1), D(I, 2): INPUT AREN; AGTQ)
85 NEXT l
92 CLS : Y = x * 40/6013 + 1/3
93 INPUT AREA DEL PATRON iNTERNO EN NUMERO DE CUENTAS. API
94 INPUT CONCENTRACION DE PATRON INTERNO; CM
95 ECNmin (LOG((Y - 28297>/ 2>8297)1 LOG{IO>- 720%- 0151)101919
96 ECNmax =(LOG((Y -28297 +2/3)/28297)ILOG<l0)-. 72093 * 0151>/ 01919
[09 PORI= ITON
[10 IF 1 = l THEN F(1) = 238 (lOTO lIS
III IF 1 = 2 THEN F(1) =476 (lOTO lIS
112 IF 1 = 3 TREN F(1) = 623 (lOTO lIB
113 IP 1 = 23 TREN F(I) .914: (lOTO 117
114 IP 1 = 25 THEN F(I) 868: (lOTO 117
115 IP 1 = 27 TI-LEN P(I) 87 ELSE F(I)
117 IP 1 = 23 OR 1 = 25 OR 1 27 TREN CONC(I. 1) AGT(I> * CONC(IS. 1>/(A01415)t
F(1)): COTO 19
liS CONC(I. I) = AGT(I) * CPI 1 (API * P(T))
119 NEXT 1
140 CLS
150F0R1 ITON
155 PORJ= ITON
160 POR 10 = J TO N
165 ECN = (0(1, 1) + D(J, 1) + DOC, 1)) -2 [4747* <XI, 2) + EX>. 2) + NI .2
170 IP ECN > ECNrnin ANO ECN < ECNmaX TREN CONCO. 2) ~ONCQ 1> CONC(J, 2>
CONC(J, 1) CONCO0, 2) = CONC(I0, 1)
75 NEXT 10
180 NEXT J
181 NEXT 1
82 Z$ [3 \PV + X$- OPEN O. al. 21$
183 POR 1 1 TO N WRITE $11. A$(IX 0<1. It XI. 2>. AGTUt CONCO. [>,CONC(L2~
F(l) NEXT
184 WRITE fI, API. CPI
185 CLOSE 1
210 TCONC =0
220 POR 1 1 TO N TCONC TCONC + cONttL 21 ?4EXT
230 POR 1 L TO N PAG(t) (CONC(I. 2)1 TtONc) 1W
-
240 NEXT 1 ELUCION A L&St Y, MINUTOS

241 LPRINT FRCCION, X;
ECNmiW~ ECNmift, o ECNm x . ECNat
242 LPRINT
iv
Anexos.
243 LPRINT AREA DE PATRON INTERNO: ; API; CONCENTRACION DE PATRON

INTERNO: ; CH
250 LPRINT : LPRINT TRIGLICERIDO<; TAB(33); NO; TAB(39); <DE; TAB(46);
ECN; TAB(57); %; : LPRINT
260 FOR 1 1 TO N
270170RJ=ITON
280 FORJO = 5TO N
290 TROS = A$(I) + AS(S) +
320 IP J <o> ITHEN 360
330 IP 10 = 5 TREN RES (PAG(I) * PAG(J) * PAG(I0)) (1 0000) ELSE BES (TPACI(I) * -
PAG(J) *PAG(I0) * 3)/(10000>: GOTO 370
360 IP 10 = 1 TREN RES = (PAG(I) * PAG(J) * PAG(I0) * 3) 1(100 00) ELSIE RES =(PAG(I)
* PA(l(J) * PAG(I0) * 6)1 (10000)
370 IFRES<i TH?EN4IO
375 ECN= (D(I, ])-1-D(J, 1) -i-D(I0, 1)) -2.14747 * (13(1, 2)+D(J,2)+D(I0, 2))
380117 BON < BONmin OR ECN> iECNmax TI-lEN 410
390 TRGO(]) = D(I, 1) + D(IJ, 1) + D(10, 1): TRGO(2) D(I, 2) + D(J, 2) + D(I0, 2)
400 LPRIINT TAB(4); TRG$; TAB(32); TRGOQ); TAB(39); TRC3O(2); TAB(45); ECN;
TAB(55); RES
410 NEXT lO
420 NEXT J
430 NEXT 1
440 DATA 04:0 ,4,O, 06:0 ,6,0,C8:0 ,8,0,CIO:0 ,l0,0,CIO:l ,10,1,C12:0 ,12,0
450 DATA C13:0 13,0,<C14:0 ,14,0,<C14:1 ,14,1,iCIS:0 15,0,aiC15:0 <%15,0,C15:0
<,
45,0
460 DATA 015:1 ,15,1, 1 CI:0 %16,0,CI:0 ,16,0,C16: 1 tlb,I,<C16: l(Pa) <,16,t,<i
017:0,17,0
470 DATA al-CI 7:0 ,17,0,C17:0 ,17,0,CI 7:1 ,17,1,CIS:0 , 18,0,<CIS: 1(0)1,18,1
480 DATA 018:1(V), 18,1,018:2(L) ,18,2,C19:0 ,19,0,C] 8:3~Ln) ,18,3
490 DATA ctcC]8:2 ,18,2,C20:0 ,20,0,C20:1 ,20,l
700 END
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1k APLICACION DEL DIOXIDO DE CARBONO

REFINADO DE ACEITES VEGETALES Y ZUMO

Pon cnne ?r flr. iL

APLICACION DEL DIOXIDO DE CARBONO

ALIMENTOS: NATA, SUBPRODUCTOS DEL

REFINADO DE ACEITES VEGETALES Y ZUMO

PEDRO RUIZ SALA

GUILLERMO SANTA-MARA BLANCO, Dr. EN CIENCIAS QUMICAS,

CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado Aplicacin el dixido de carbono

Y para que as conste firmo el presente certificado en Madrid a diecisiete de octubre de

Guillermo Santa-Maria Blanco

Tambin me gustara expresar mi agradecimiento:

A la Dra. Afaria Teresa Orzez Villanueva. del Departamento de Nutricin y Bromatologa JI de la

CAPTULO 1. INTRODUCCIN. EXTRACCIN CON FLUIDOS

1,1. FLUIDOS SUPERCRITICOS 2

1.2. APLICACIN A LOS ALIMENTOS DEL DIXIDO DE CARBONO

CAPTULO 2. APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE

2.2. MATERIALES Y MTODOS 67

2.3. RESULTADOS Y DISCUSIN 80

APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE CARBONO SIJPERCRTIcO A LA

2.4. MATERIALES Y MTODOS 122

2.5. RESULTADOS Y DISCUSIN 128

2.6. MATERIALES Y MTODOS 149

2.7. RESULTADOS Y DISCUSIN 150

CAPITULO 3. APLICACIN DE LA EXTRACCIN CON DIXIDO DE

3.1. INTRODUCCIN 164

ANLISIS DE LOS COMPUESTOS DE LA FRACCIN INSAPONIFICABLE DEL DESTILADO

3.2. MATERIALES Y MTODOS 168

3.2.3,2. Eleccin de la fase mvil 171

3.2,3.3. Eleccin del gradiente 171

3.2.3.4. Eleccin de la temperatura de la columna 172

3.2.3.5. Anlisis estadstico 172

3.2,4. Anlisis cuantitativo 173

3.2.4.1. Estudio del detector. Anlisis estadstico 173

3.2.4.2. Linealidad de la respuesta 177

3.2.4.3. Clculo del factor de respuesta 177

3.2.4.4. Precisin del mtodo 178

3.3. RESULTADOS Y DISCUSIN 178

ANLISIS POR ESPECTROMETRA DE 3C-RMN 214

3.4. MATERIALES Y MTODOS 214

3.5. RESULTADOS Y DISCUSIN 216

3.6. MATERIALES Y MTODOS 225

3.6.1. Descripcin del equipo extractor 225

desodorizacin de aceites vegetales 227

3.7, RESULTADOS Y DISCUSIN 229

CAPTULO 4. APLICACIN DEL DIXIDO DE CARBONO SUPERCRTICO A

4.1. INTRODUCCIN. LOS CTRICOS 248

4.3. RESULTADOS Y DISCUSIN 266

3C-RMN = Resonancia magntica nuclear del 3C

1.1- FLUIDOS SUPERCRTICOS

1.1.1- Definicin de fluido supercrtico

una liquefaccin al elevar la presin o vaporizacin al aumentar la temperatura. La figura

El punto critico es caracterstico de cada sustancia. La tabla 1. 1.1 recoge la temperatura y

Tabla 1.1.1. Condiciones crticas de varios solventes

Compuesto CCIF3 CO2 SE6 C51112 1120

Pc (gImL) 0,58 0,47 - 0,23 0,32

Las propiedades de los fluidos supercrticos son expresadas frecuentemente en trminos

Figura 1.1,1. Diagrama de fases slido-lquido-gas-tluido superertico. PT =

Capitulo 1. introduccin. Extraccin confluidos supercritlco&

1.1.2- Propiedades de losfluidos supereriticos

Tabla 1.1.2. Propiedades fisico-quimicas de los gases y los lquidos en

Densidad Viscosidad Coeficiente de Difusin