CENTRO DE INVESTIGACIN Y ESTUDIOS AVANZADOS

DEL INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD DE BIOTECNOLOGA E INGENIERA GENTICA DE PLANTAS

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGA Y BIOQUMICA

CAMPUS GUANAJUATO

Caracterizacin molecular de fructanos en Agave y Dasylirion spp.,

identificacin de fructosiltransferasas y su expresin en Pichia pastoris

TESIS
QUE PRESENTA
M.C. Norma Alejandra Mancilla Margalli

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGA DE PLANTAS

Irapuato, Guanajuato, Mxico, 2006

Este trabajo titulado Caracterizacin molecular de fructanos en Agave y Dasylirion spp.,

identificacin de fructosiltransferasas y su expresin en Pichia pastoris fue realizado en el
Laboratorio de Qumica de Productos Naturales del Departamento de Biotecnologa y Bioqumica
del Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados Campus Guanajuato, bajo la asesora de la
Dra. Mercedes G. Lpez.

ii

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Mercedes G. Lpez, por su asesora, por e y especialmente por su inmensurable apoyo
(cientfico, moral y econmico). Oportuno que dirigi el

A los sinodales Dr. Luis E. Gonzlez de la Vara, Dr. John Paul Dlano F, Dra. Ana Paulina Barba
de la Rosa y Dr. Edgar Quero Gutirrez, por sus valiosas aportaciones que enriquecieron el
presente trabajo.

Al CONACyT, por apostarle a la ciencia y ayudar econmicamente a estudiantes que desean un

Mxico competitivo.

A todo el personal del Cinvestav-Guanajuato, al rea administrativa (Dora Elia Anguiano), de

intendencia (Daniel y Bertha) y de biblioteca (Mary Carmen Ruz) por su trato amable y su trabajo
siempre oportuno y eficiente.

Al Prof. Sjef Smeekens, de la Universidad de Utrecht, Holanda, por brindarme amablemente la

oportunidad de explorar en su laboratorio un campo cientfico nuevo para m.

A Tita Ritsema por sus finas atenciones y la paciencia con la que comparti y dirigi parte de este
trabajo.

Al Gobierno de los Pases Bajos por el otorgamiento de la Beca Huygens que me permiti realizar
una estancia doctoral en la Universidad de Utrecht.

Al CONACyT por el otorgamiento de una beca mixta, que sin lugar a dudas, fue de bastante
provecho para la calidad de la presente investigacin.

A la Dra. Petra Mischnick de la Universidad Tcnica de Braunschweig, Alemania, por su apoyo y

asesora en la qumica de carbohidratos.

iii

A la Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa del Instituto Potosino de Investigaciones Cientficas y
Tecnolgicas, por la oportunidad de hacer mil intentos en su laboratorio.

A mis amigos del laboratorio: Lul Macas, Blanca Aguilar, Mara Luisa Martnez, Tere Carrillo,
Isadora Jimnez, Octavio Carrillo, Claudia y Judith Urias, por su apoyo y entusiasmo contagiante.

A Tita Ritsema, Auke Verhaar, Fatima Rahmani, Anja van Dijken, Marcel Proveniers, Jolanda
Schuurmas, Anika Wiese, Henriette Schluepmann y Bas Dekkers, por su hospitalidad, por
mostrarme las maravillas de su pas y por hacerme sentir como en casa en un lugar con una
cultura diferente

A mis cubanos Lzaro Hernndez, Yanetsi Borroto, Yanet Tambara, Jos Angel y Rolando, porque
su hermandad y cario me han servido de soporte.

A mis amigos de siempre Lorena, Jimmy, Isis, Pedro y Lul, por su longeva amistad.

A mis paps, Jos Trinidad y Norma Ofelia, por su gran cario y apoyo incondicional.

A mis hermanos, Popo, Pity, Betito y Kiko, por toda la vida recorrida.

A mi esposo, Juan, por todo su amor y por los momentos compartidos.

A mis abuelitos, tos y primos.

A la pequea Ana y Caellou, por llenar de alegra nuestras vidas.

iv

NDICE
Pgina
I.
II.
III.
IV.

RESUMEN
INTRODUCCIN
OBJETIVOS
ANTECEDENTES
AGAVES Y DASYLIRION
1.1. Clasificacin taxonmica
1.1.1. Agavaceae
1.1.2. Nolinaceae
1.2. Distribucin
1.3. Descripcin de los gneros y caractersticas delimitantes de las familias
Agavaceae y Nolinaceae
1.3.1. Agave
1.3.1.1. Agave tequilana Weber var. azul
1.3.1.2. Agave angustifolia Haworth
1.3.1.3. Agave potatorum Zuccarini
1.3.1.4. Agave cantala
1.3.1.5. Agave fourcroydes
1.3.2. Dasylirion
1.4. Importancia econmica y cientfica
1.4.1. Usos tradicionales
1.4.2. Usos ornamentales
1.4.3. Obtencin de fibras naturales
1.4.4. Obtencin y caracterizacin de fitoqumicos
1.4.5. Elaboracin de bebidas alcohlicas
1.4.5.1. Bebidas fermentadas
1.4.5.2. Bebidas destiladas
1.4.6. Elaboracin de edulcorantes fructosados
1.4.7. Utilizacin del bagazo
1.4.8. Propagacin in vitro
1.5. Influencia de la zona geogrfica en los agaves
1.6. Adaptacin de los agaves
1.6.1. Adaptacin morfolgica
1.6.1. 1. Hojas
1.6.1.2. Races
1.6.1.3. Tallo
1.6.2. Adaptacin fisiolgica
1.6.2.1. Metabolismo cido de las crassulaceas (CAM)
1.6.2.2. Bioqumica del metabolismo cido de las crassulaceas (CAM)
1.6.2.3. Acumulacin de fructanos
FRUCTANOS
2.1. Estructura
2.1.1. Mtodos analticos
2.1.2. Especificidad estructural
2.2. Metabolismo

1
2
5

6
7
8
10
13
14
15
15
16
16
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20
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22
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30
30
31
33
33
33
34
39
40
43
44
45
v

2.2.1. Complejidad metablica

2.2.2. Caracterizacin bioqumica
2.2.3. Caracterizacin molecular
2.2.4. Familia GH32
2.3. Fisiologa de los fructanos
2.3.1. Carbohidratos de reserva
2.3.2. Desarrollo vegetal
2.3.3. Defoliacin
2.3.4. Descarga apoplstica
2.3.5. Ajuste osmtico
2.3.6. Tolerancia al fro
2.3.7. Tolerancia a sequa
2.3.8. Defensa contra patgenos
2.4. Potencial biotecnolgico de los fructanos
V.
JUSTIFICACIN
VI.
HIPTESIS
VII.
MATERIALES Y MTODOS

50
50
55
57
60
60
60
62
64
64
64
67
69
71
73
73
74

A) Material Biolgico
1. Regiones
74
2. Edad
74
3. Muestreo
74
B) Metodologa
1. Comparacin y caracterizacin estructural de carbohidratos de almacn en
agaves y dasylirion
1.1. Determinacin espectrofotomtrica
1.1.1. Extraccin de carbohidratos totales
77
1.1.2. Determinacin de carbohidratos totales
77
1.1.3. Determinacin de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa
77
1.1.4. Determinacin de fructanos
79
1.1.5. Determinacin de almidn
81
1.2. Extraccin de fructanos
82
1.3. Caracterizacin de fructanos
1.3.1. Cromatografa en capa fina
82
1.3.2. Cromatografa lquida de alta resolucin
83
1.3.3. Derivatizacin de fructanos a alditol acetatos parcialmente metilados
84
1.4. Caracterizacin de fructanos de Agave tequilana
88
1.4.1. Espectrometra de masas por ionizacin/desorcin por lser asistida por
una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS)
88
1.4.2. Resonancia magntica nuclear de carbono 13
88
1.4.3. Resonancia magntica nuclear de protn
89
2. Identificacin de actividades enzimticas involucradas en el metabolismo de
fructanos
2.1. Extraccin de protenas
89
2.2. Estrategias de purificacin
89
2.2.1. Cromatografa de afinidad
90
2.2.2. Cromatografa de intercambio aninico
90
vi

2.2.3. Cromatografa de hidroxiapatita

91
2.2.4. Cromatografa de exclusin en gel
91
2.3. Cuantificacin de protenas
92
2.4. Ensayos enzimticos
92
2.5. Separacin electrofortica
92
3. Identificacin y aislamiento de secuencias codificantes de enzimas del
metabolismo de fructanos de agave y su expresin en Pichia pastoris
3.1. Aislamiento e identificacin de secuencias codificantes
3.1.1. Extraccin de cido ribonucleico (ARN)
93
3.1.2. Geles de agarosa
94
3.1.3. Electroforesis en microchip
94
3.2. Obtencin de secuencias complementarias por transcripcin reversa
95
3.2.1. Diseo de oligonucletidos iniciadores
95
3.2.2. Amplificacin de secuencias complementarias
95
3.2.3. Elucin y purificacin de cido desoxiribonucleico (ADN) a partir
de bandas de agarosa
97
3.2.4. Preparacin de clulas competentes
97
3.2.5. Clonacin y transformacin
99
3.2.6. Purificacin de plsmidos
99
3.2.7. Confirmacin de la secuencia en el plsmido
101
3.2.8. Identificacin de las secuencias
101
3.3. Aislamiento de ADNc completo de la secuencia
101
3.3.1. Amplificacin rpida del extremo 5 del ADN complementario (5-RACE)
102
3.3.2. Amplificacin rpida del extremo 3 del ADN complementario (3-RACE)
104
3.3.3. Ligacin y clonacin del ADNc completo
104
3.4. Expresin en Pichia pastoris
104
3.4.1. Eliminacin del pptido seal y secuencia de terminacin
106
3.4.2. Propagacin del vector
106
3.4.3. Transformacin de Pichia pastoris y anlisis de expresin
107
VIII.
RESULTADOS
1. Comparacin y caracterizacin estructural de carbohidratos de almacn en agaves
y dasylirion
1.1. Patrn de carbohidratos no estructurales
108
1.2. Factores ontognicos
109
1.3. Influencia del ambiente en el patrn de carbohidratos no estructurales
110
1.4. Funcin de los fructanos en la sequa
113
1.5. Presencia de almidn
114
1.6. Perfil cromatogrfico de fructanos
1.6.1. Cromatografa en capa fina
116
1.6.2. Cromatografa lquida de alta resolucin
118
1.7. Anlisis de enlaces por derivatizacin
121
1.7.1. Cuantificacin de los glicosil-derivados
126
1.7.2. Significancia de la diversidad estructural de fructanos
129
1.8. Caracterizacin de fructanos de A. tequilana
130
1.8.1. Espectrometra de masas por ionizacin/desorcin por lser asistida por
una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS)
130
1.8.2. Resonancia magntica nuclear de carbono 13
130
vii

1.8.3. Resonancia magntica nuclear de protn

135
1.9. Estructuras propuestas para fructanos en Agave y Dasylirion
138
1.10. Posibles implicaciones de la presencia de fructanos en agaves y dasylirion 139
2. Identificacin de actividades metablicas involucradas en el metabolismo de
fructanos de agave y dasylirion
2.1. Estrategia Cromatogrfica I
141
2.1.1. Cromatografa de afinidad
141
2.1.2. Cromatografa de intercambio aninico
143
2.1.3. Cromatografa de hidroxiapatita
145
2.1.4. Cromatografa de exclusin en gel
148
2.1.5. Identificacin putativa de enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos 149
2.2. Estrategia Cromatogrfica II
151
2.2.1. Extracto crudo
151
2.2.2. Cromatografa de intercambio aninico
155
2.2.3. Cromatografa de afinidad
160
2.2.4. Actividades fructosiltransferasas identificadas en agaves y dasylirion
161
3. Aislamiento e identificacin de secuencias codificantes de enzimas del metabolismo
de fructanos de agave y su expresin en Pichia pastoris
3.1. Extraccin de cido ribonucleico
163
3.2. Amplificacin de fragmentos de cido desoxiribonucleico complementario (ADNc)
a travs de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
163
3.3. Identidad de los fragmentos amplificados
165
3.4. Amplificacin del ADNc completo de la fructosiltransferasa de Agave tequilana (atft)
3.4.1. Amplificacin de los extremos terminales 3 y 5
172
3.4.2. Determinacin de la orientacin de los insertos en el vector
174
3.4.3. Ligacin del ADNc completo de atft
176
3.5. Anlisis de la secuencia atft
178
3.5.1. Uso de codones del ADNc de atft
180
3.5.2. Identificacin de la protena madura
180
3.5.3. Glicosilhidrolasa 32
186
3.6. Expresin heterloga de atft
188
3.6.1. Construccin del vector pGAPZC-atft
188
3.6.2. Anlisis de expresin
189
3.6.3. Identidad de la AtFT
192
IX.
CONCLUSIONES
195
X.
PERSPECTIVAS
196
XI.
APNDICES
A.- Preparacin de soluciones
198
B.- Anlisis de fragmentacin de alditol acetatos parcialmente metilados (PMAA)
200
13
C.- Desplazamientos qumicos de C-fructanos
207
D.- Secuencias aisladas
212
XII.
REFERENCIAS
217

viii

NDICE DE FIGURAS
Pgina
Figura 1. Mayahuel
6
Figura 2. Clasificacin taxonmica de Agave y Dasylirion
8
Figura 3. Caractersticas morfolgicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae
11
Figura 4. Distribucin de las familias Agavaceae y Nolinaceae
12
Figura 5. Edulcorante fructosado Naturel
23
Figura 6. Influencia de factores abiticos en la asimilacin de CO2 en A. lechuguilla
26
Figura 7. Influencia de la temperatura en la asimilacin de CO2 en A. tequilana
27
Figura 8. reas ptimas, subptimas y marginales para el cultivo de A. tequilana en Jalisco
28
Figura 9. Cambios en la velocidad de respiracin durante sequa en races de lluvia y
establecidas en A. deserti
32
Figura 10. Diferencia de temperatura entre el rea foliar (de maz o agave) y el aire circundante 33
Figura 11. Metabolismo cido de las crassulaceas
35
Figura 12. Estrategias de flujo de carbono propuestas para especies CAM
38
Figura 13. Unidades estructurales de los fructanos
42
Figura 14. Rango de grados de polimerizacin (DP) en especies que acumulan fructanos
45
Figura 15. Diferentes vas biosintticas de fructanos en plantas superiores
48
Figura 16. Regulacin de la actividad de fructosiltransferasas
54
Figura 17. Alineamiento de protenas pertenecientes a las familias GH32 y G68
57
Figura 18. Mecanismos catalticos de las glicosilhidrolasas
59
Figura 19. Papel de las fructosiltransferasas en el desarrollo de plantas superiores
61
Figura 20. Efecto de la defoliacin en el metabolismo de fructanos
63
Figura 21. Metabolismo de fructanos en Avena sativa bajo estrs por fro
66
Figura 22. Fructanos en estrs por sequa
68
Figura 23. Modelo propuesto de la participacin de fructanos en la resistencia a patgenos
70
Figura 24. Esquema general de trabajo
76
Figura 25. Programa de elucin utilizado en la separacin cromatogrfica de fructanos
de Agave y Dasylirion
83
Figura 26. Metodologa de derivatizacin de carbohidratos a PMAA
85
Figura 27. Diseo de oligonucletidos degenerados
98
Figura 28. Vector pGEM-T Easy
100
Figura 29. Amplificacin de los extremos de ADNc mediado por ARN ligasa (RLM-RACE)
102
Figura 30. Mapa del vector pGAPZC
105
Figura 31. Contenido de carbohidratos no estructurales solubles
109
Figura 32. Presencia de almidn en especies de Agave y Dasylirion
115
Figura 33. Cromatografa en capa fina de fructanos de Agave y Dasylirion
117
Figura 34. Perfil cromatogrfico (HPAEC-PAD) de fructanos de agave comparados con
fructanos de achicoria (tipo inulina) y cebolla (neofructanos)
119
Figura 35. Perfil de elusin, utilizando cromatografa de gases, de fructanos de Agave y
Dasylirion derivatizados a alditol acetatos parcialmente metilados
122
Figura 36. Comparacin de fructanos derivatizados en tres especies vegetales
123
Figura 37. Cuantificacin de los glicosil-derivados en fructanos de las especies analizadas
127
Figura 38. Espectro de masas MALDI-TOF-MS de fructanos de A. tequilana
131
Figura 39. Espectro de 13C-RMN de fructanos de A. tequilana
131
Figura 40. Espectros de 13C-RMN de fructanos en Asparagales
135
Figura 41. Espectro de 1H-RMN de sacarosa y fructanos de Dahilia variabilis y Agave tequilana 136
Figura 42. Estructuras propuestas para fructanos presentes en Agave y Dasylirion
139
Figura 43. Cromatografa de afinidad a concanavalina A
142

ix

Figura 44. Cromatografa de intercambio aninico

Figura 45. Cromatografa de hidroxiapatita
Figura 46. Cromatografa de exclusin en gel
Figura 47. Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante
Figura 48. Perfil cromatogrfico de fructanos sintetizados por el extracto crudo de A. potatorum
Figura 49. Cromatografa de intercambio aninico
Figura 50. Actividades hidrolticas de la fraccin Q0
Figura 51. Perfil cromatogrfico de productos del ensayo enzimtico de las fracciones de
intercambio aninico de A. potatorum
Figura 52. Productos de la accin enzimtica de las fracciones afines a concanavalina A
Figura 53. Modelo propuesto para la biosntesis de fructanos en Agave y Dasylirion
Figura 54. Extraccin de ARN
Figura 55. Amplificacin de fragmentos con oligonucletidos degenerados
Figura 56. Anlisis de restriccin de productos amplificados con oligonucletidos degenerados
Figura 57. Dendograma de secuencias alineadas de fructosiltransferasas
Figura 58. Alineamiento de los fragmentos amplificados de A. tequilana con enzimas
relacionadas al metabolismo de fructanos
Figura 59. Amplificacin rpida de los extremos del DNAc de atft mediado por la ARN ligasa
Figura 60. Orientacin de los insertos At5- y At3-RACE en el vector pGEM-T Easy
Figura 61. Estrategia de clonacin para la obtencin del plsmido pGEM T-atft
Figura 62. Digestin y anlisis de restriccin
Figura 63. rbol filogentico sin raz de enzimas del metabolismo de fructanos
Figura 64. Prediccin del pptido seal en AtFT
Figura 65. Alineamiento de AtFT con Inv-V y FT
Figura 66. Perfil cromatogrfico de productos generados de AtFT excretada al medio
Extracelular
Figura 67. Perfil cromatogrfico de los productos generados de AtFT contenida en la fraccin
celular

144
146
148
150
152
156
157
158
160
162
164
165
166

168
170
173
175
177
178
179
182
184
190
192

NDICE DE TABLAS
Pgina
Tabla 1. Clasificacin de subgneros y grupos de Agave
9
Tabla 2. Composicin del aguamiel y pulque
21
Tabla 3. Productividad anual de agaves y otras plantas CAM
25
Tabla 4. Rangos de temperatura para el cultivo de A. tequilana en Jalisco
29
Tabla 5. Tolerancia de agaves y dasylirion a fro extremo
29
Tabla 6. Susceptibilidad a la cavitacin de A. tequilana y A. deserti sometidos a sequa
31
Tabla 7. Comparacin de parmetros fisiolgicos de Zea mays y Agave americana
34
Tabla 8. Clasificacin taxonmica y comportamiento CAM de algunas especies estudiadas
37
Tabla 9. Ocurrencia de fructanos en Angiospermas
41
Tabla 10. Predominancia estructural de fructanos segn la especie
46
Tabla 11. Propiedades cinticas de distintas fructosiltransferasas
51
Tabla 12. Muestreo de especies de Agave y Dasylirion
75
Tabla 13. Determinacin enzimtica de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa
78
Tabla 14. Secuencia de los oligonucletidos utilizados
96
Tabla 15. Identificacin de fructanos eludos en un sistema cromatogrfico intercambio
aninico de alta resolucin (HPAEC-PAD)
120
Tabla 16. PMAA en fructanos de Agave y Dasylirion spp., Dahlia variabilis y Allium cepa
125
Tabla 17. Contribucin relativa de compuestos derivatizados en los fructanos
128
Tabla 18. Correlacin entre diferentes compuestos derivatizados
128
Tabla 19. Desplazamientos qumicos de 13C-RMN de fructanos
133
1
Tabla 20. Desplazamientos qumicos de H-RMN de fructanos
137
Tabla 21. Calibracin de la columna de exclusin y estimacin de pesos moleculares de las
fracciones protenicas
149
Tabla 22. Productos formados en los bioensayos con fracciones Q y usando sacarosa o 1kestotriosa como sustrato
153
Tabla 23. Secuencias de enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos
167
Tabla 24. Uso de codones en el ADNc de atft
181

xi

ABREVIATURAS UTILIZADAS

DEPC
d.i.
dATP
dCTP
dGTP
DMSO
dNTP
dTTP
DTT
e.r.c.
EPI
FOS
GC-FID
GC-MS
GH
HPAEC-PAD

HPLC
Inv-CW
Inv-V
IOS
KD
Kh
1-KES
6-Kes
6G-Kes
6-KES
PAHBAH
PAR
PCR
PH
PMAA
RMN
TAE

TE
TFA
TLC

Dietil pirocarbonato
Dimetro interno
Adenosin desoxitrifosfato
Citocin desoxitrifosfato
Guanidin desoxitrifosfato
Dimetil sulfxido
Mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTP
Tiamin desoxitrifosfatos
Ditiotreitol
Respuesta efectiva de carbono (effective response of carbon)
ndice productivo ambiental (environmental productive index)
Fructo-oligosacridos
Cromatografa de gases acoplado a detector de ionizacin en flama (gas
chromatography coupled to flame ionization detector)
Cromatografa de gases acoplado a espectrometra de masas (gas
chromatography coupled to mass spectrometry)
Glicosilhidrolasa
Cromatografa de intercambio aninico de alta resolucin acoplado a detector de
pulso amperomtrico (high performance anionic exchange chromatography-pulse
amperometric detector)
Cromatografa lquida de alta resolucin (high performance liquid chromatography)
Invertasa de pared celular (invertase-cell wall)
Invertasa vacuolar
Inulo-oligosacridos
Coeficiente de distribucin de la masa molecular
Conductividad hidrulica
1-Kestotriosa (O--D-Glcp-(1-2)-O--D-Fruf-(2-1)--D-Fruf)
6-Kestotriosa (O--D-Glcp-(1-2)-O--D-Fruf-(6-2)--D-Fruf)
6-Glucosa-kestotriosa o neokestosa (O--D-Fruf-(2-6)-O--D-Glcp-(1-2)--D-Fruf)
6-Kestosa exohidrolasa
Hidracida del cido p-hidroxibenzoico
Radiacin fotosintticamente activa (photosynthetically active radiation)
Reaccin en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)
Process hardiness
Alditol acetato parcialmente metilado (partially methylated alditol acetate)
Resonancia magntica nuclear
Buffer Tris-HCl 40 mM, cido actico 20 mM, EDTA 1mM
Buffer Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0.

cido trifluoroactico (Trifluoroacetic Acid)

Cromatografa en capa fina (thin layer chromatography)

xii

I. RESUMEN

Los agaves son parte del 15% de plantas superiores que almacenan fructanos, polmeros de
fructosa sintetizados a partir de la acumulacin de sacarosa en la vacuola. Existen cinco tipos
estructurales de fructanos, segn la manera en que los residuos -D-fructofuranosa son
transferidos por las fructosiltransferasas, enzimas involucradas en su metabolismo. La
acumulacin de algn tipo de fructanos parece depender de la especie, y la presencia de stos se
sugiere importante en la tolerancia a distintos tipos de estrs abitico.
En el presente trabajo se caracteriz la estructura de fructanos y se compar el patrn de
carbohidratos no estructurales en varias especies de agave, crecidas en distintas regiones
climticas; incluyendo, adems, a Dasylirion spp., una especie poco estudiada pero morfolgica y
taxonmicamente relacionada con los agaves. El contenido de fructanos en los tallos de agave
fue superior al 60% (peso seco) y dasylirion acumul solo el 17%; mientras que, el almidn en
estas especies no represent ms del 2%. Las diferencias entre especies fueron cuantitativas ms
que cualitativas, encontrndose una correlacin de la concentracin de fructanos y aquellos
involucrados en su metabolismo (fructosa, glucosa, sacarosa) con las condiciones ambientales
donde estas plantas fueron colectadas (por ejemplo, ms fructosa en plantas colectadas en
regiones ridas). La diversidad de fructanos fue evidenciada por tcnicas cromatogrficas (TLC,
HPAEC-PAD) y espectroscpicas de alta resolucin (NMR, MALDI-TOF-MS), que permitieron
proponer estructuras complejas, hasta ahora no reportadas, que hemos denominado agavinas.
La diversidad estructural coincidi perfectamente con las diferentes actividades fructosiltransferasa
identificadas en un extracto protenico de Agave tequilana, que utilizando sacarosa como nico
sustrato, produjo un perfil de fructanos semejante a lo observado in vivo. A travs de distintos
pasos cromatogrficos se lleg a un enriquecimiento de la actividad de enzimas involucradas en
el metabolismo de fructanos en agaves.
Finalmente, se aisl un ADNc de Agave tequilana con una mayor homologa a la enzima
fructan:fructan-6-glucosa-fructosiltransferasa (6G-FFT) reportada en esprrago y cebolla; sin
embargo, su expresin en el sistema de expresin de Pichia pastoris, evidenci una principal
actividad de 1-fructan:fructan fructosiltransferasa (1-FFT). ste constituye el primer ADNc aislado
en la importante familia Agavaceae y el primer 1-FFT del orden Asparagales.

II. INTRODUCCIN

Los fructanos son carbohidratos de reserva sintetizados por solo el 15% de las plantas superiores,
y aunque han sido tpico de investigacin desde hace 200 aos aproximadamente, hay aspectos
estructurales, fisiolgicos y evolutivos que an faltan por ser elucidados. La presencia de fructanos
en agaves es reportada desde la dcada de los aos 50 y 70; sin embargo, estos estudios son
limitados a Agave vera cruz, una especie que crece en la regin de Asia y actualmente est casi
extinta. Solo recientemente, la investigacin de fructanos en agave ha resurgido, enfocndose
principalmente a Agave tequilana, especie de gran relevancia industrial en nuestro pas, debido a
que la hidrlisis de sus fructanos constituye el sustrato fermentable en la produccin de tequila.
Los fructanos son polmeros de fructosa que se sintetizan en la vacuola como respuesta a una
acumulacin de sacarosa en este organelo. Las fructosiltransferasas (FT), enzimas que participan
en su metabolismo, adicionan residuos de -D-fructofuranosa a una unidad de sacarosa utilizada
como aceptor inicial. Los cinco tipos estructurales de fructanos descritos hasta ahora, son
resultado de las distintas formas en que las diversas enzimas transfieren los residuos de fructosa.
La 1-sacarosa:sacarosa-fructosiltransferasa (1-SST), es la enzima inicial que transfiere una unidad
de fructosa de una molcula de sacarosa a otra. La 1-kestotriosa as formada (G-F-F), es el
metabolito central utilizado por las dems FT en la sntesis de fructanos superiores. La 1fructan:fructan-fructosil-transferasa (1-FFT) elonga el polmero mediante enlaces (2-1),
generando el fructano conocido como inulina; la 6-SFT sintetiza levanos, esto es, polmeros
lineales con enlaces (2-6) o introduce este tipo de enlace en una molcula de inulina existente,
produciendo los graminanos o fructanos ramificados; por su parte, la fructan:fructan-6-glucosafructosiltransferasa (6G-FFT) transfiere residuos de fructosa al carbono 6 de la glucosa, generando
los denominados neofructanos (inulina- o levano-neoserie, dependiendo del enlace),
caracterizados por tener una unidad de glucosa entre dos molculas de fructosa. Finalmente, en el
metabolismo de estas biomolculas, adems participan la fructan exohidrolasa (FEH) y la
invertasa vacuolar (Inv-V). La primera enzima degrada los polmeros hidrolizando la fructosa
localizada en un extremo; mientras que el papel de la Inv-V es controversial en el anlisis
metablico de estos carbohidratos, ya que es capaz de sintetizar o hidrolizar algunos fructanos
dependiendo de las condiciones de reaccin.

La acumulacin de un tipo especfico de fructanos parece seguir un patrn que depende de la

especie, por lo que se ha sugerido que la determinacin estructural de fructanos puede utilizarse
como criterio adicional en la clasificacin taxonmica de las especies. Por otra parte, aunque no
hay un mecanismo completamente entendido, existen evidencias experimentales que sugieren la
importancia de los fructanos en la tolerancia de algunas especies a distintos tipos de estrs
abitico, como sequa, fro o salinidad, o en una mayor resistencia contra organismos patgenos,
como los hongos Thyphula incarnata, T. ishikariensis y Microdochimm nivale.
Las implicaciones evolutivas de los fructanos y de su diversidad estructural estn lejos de ser
claras; sin embargo, algunos autores coinciden que la disponibilidad limitada de agua, fue el
principal factor climtico que dio origen a las plantas que acumulan este tipo de carbohidratos. El
orden Asparagales, donde se incluye a las familias Agavaceae y Nolinaceae, contiene especies
sintetizadoras de fructanos ampliamente distribuidas en distintos ecosistemas. Este orden no es
considerado altamente evolucionado, como los dems rdenes que almacenan fructanos.
Adicionalmente, los restos ms antiguos de plantas que sintetizan estos polmeros, corresponden
a una flora que parece ser el ancestro de los agaves actuales.
La sorprendente capacidad de los agaves para desarrollarse en ambientes hostiles, adems de las
caractersticas morfolgicas (hojas suculentas) y fisiolgicas (metabolismo CAM) especializadas
para la supervivencia en condiciones de sequa, permite la especulacin de que el metabolismo
de fructanos pudo haber sido un factor adicional importante en la adaptacin de la flora ancestral,
y que actualmente sigue jugando un papel destacado en el desarrollo de los agaves en ambientes
ridos, caracterizados por una limitacin importante de agua.
En el intento de lograr un mejor entendimiento de la fisiologa de los fructanos y su implicacin en
el mecanismo de tolerancia al estrs abitico de la sequa en agaves, en el presente trabajo se
determinaron las caractersticas estructurales de los fructanos almacenados por cinco especies de
agave crecidas en distintas regiones geogrficas de la Repblica Mexicana, con la finalidad de
encontrar una posible correlacin entre la concentracin y tipo de fructanos con las caractersticas
climticas donde se establecen las especies estudiadas. Se incluy adems, especies silvestres
de Dasylirion (de la familia Nolinaceae), para buscar una posible distincin estructural debida a la
diferencia de gneros. De acuerdo a nuestro conocimiento, es la primera vez que la presencia y
caracterizacin de fructanos en Dasylirion spp. es analizada a profundidad. As mismo, se
identificaron las principales actividades enzimticas involucradas en la sntesis de fructanos y se

aisl el ADNc de una fructosiltransferasa, en el primer intento de encaminar las futuras

investigaciones al estudio de la regulacin del metabolismo de fructanos en Agavaceae.
Un mejor conocimiento de la estructura de fructanos y la regulacin de su metabolismo en Agave y
Dasylirion, pueden generar perspectivas en el conocimiento cientfico y en sus aplicaciones
biotecnolgicas.

III. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Caracterizar los fructanos presentes en especies de Agave y Dasylirion spp,, identificar las
principales enzimas involucradas en su metabolismo y aislar sus secuencias codificantes.

OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Caracterizar y comparar la estructura de carbohidratos de almacn en cinco especies de

Agave y Dasylirion spp. y correlacionarla con las caractersticas climticas de las regiones
donde crecieron las plantas.

2. Identificar las principales actividades enzimticas involucradas en el metabolismo de

fructanos en estas especies.

3. Aislar el ADNc de las principales enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos de

Agave tequilana Weber var. azul.

IV. ANTECEDENTES

1.- AGAVES Y DASYLIRION

Los agaves y algunos miembros de la familia Nolinaceae, como Dasylirion spp., son plantas que
han acompaado al hombre a lo largo de su historia y evolucin, desde los primeros pobladores
mesoamericanos hasta la actualidad. En tiempos prehispnicos, metl (agave en nhuatl, que
tambin incluye a Dasylirion y especies relacionadas, Gentry, 1998) fue considerado como un
regalo de los dioses, la primera planta que stos haban creado y su importancia para estas
sociedades, es evidente en su legado de cdices y pinturas rupestres, donde Mayahuel, la diosa
del agave, es fcilmente identificable por sus pencas, su inflorescencia estilizada y el espumoso
pulque sobre su cabello o en una vasija entre sus manos (Figura 1) (Gentry, 1998). Agave y
Dasylirion han sido cultivos claves, componentes primarios de productividad en virtualmente
cualquier tipo de zona agrcola, desde tierras altas, productivas y de alta humedad, hasta aquellas
zonas secas e infrtiles donde en ocasiones son cultivos dominantes o exclusivos (Parsons y
Darling, 2000).

1.1. CLASIFICACIN TAXONMICA

Los miembros de las familias Agavaceae y Nolinaceae presentan un alto grado de convergencia
morfolgica, lo que dificulta el estudio de su evolucin y taxonoma (Eguiarte, 1995).

Figura 1. Mayahuel. Representacin prehispnica de la deidad del agave. Mayahuel representa la

fertilidad, una diosa que alimenta con sus 400 pechos a sus 400 hijos, todos ellos dioses de la
embriaguez.

La divergencia evolutiva de los agaves parece haber sucedido hace 60 millones de aos, durante
el Eoceno; mientras que la separacin entre Agavaceae sensu stricto y Nolinaceae habr ocurrido
hace 47 millones de aos, se calcula que su dispersin fue hace 35 millones de aos, y que sus
tallos y hojas suculentas son caractersticas ms recientemente adquiridas (Eguiarte, 1995; Nobel,
1998).

1.1.1. AGAVACEAE
Carlos Linneo estableci el gnero Agave en 1753 describiendo cuatro especies: A. americana, A.
vivipara, A. foetida (ahora en el gnero Furchraea) y A. virginica (ahora en el gnero Manfreda)
(Gentry, 1998). La familia Agavaceae fue creada en 1836 por el botnico australiano Stephen
Endlicher incluyendo el gnero Agave y Furcraea. Richard A. Salisbury en 1866 dividi la familia
en dos secciones: agaves con ovario spero donde el gnero Yucca estaba incluido y aquellos con
ovario nfero, donde se incluyeron a los gneros Agavaea, Furcraea, Littaea, Manfreda y
Polianthes. Sin embargo, como lo manifest en 1871 Joseph Hooker, la familia ha sido difcil de
clasificar, dada la amplia distribucin, presencia de hbridos, tardanza de la emergencia floral (8-50
aos) y variabilidad de estas especies dependiendo de la geografa y el clima (Pea-lvarez et al.,
2004). Una discrepancia en la clasificacin esta dada por la semejanza en la estructura floral,
propiedades de tejido y compuestos qumicos con algunos miembros de la familia Amaryllidaceae
(sbila), Alliaceae (cebolla) y Asparagaceae (esprrago) (Nobel, 1998).
Actualmente, la clasificacin reportada por Dahlgren, Clifford y Jeo (1985) es la ms aceptada. En
un anlisis de monocotiledneas basado en el nmero cromosomal, anlisis anatmico, qumico,
biogeogrfico y cladsitico, proponen al orden Asparagales con 30 familias, incluyendo Agavaceae,
Nolinaceae, Asparagaceae, Dracaenaceae, Alliaceae y Amarallidaceae (Figura 2). Describen a la
familia Agavaceae como restringida al continente americano y dividida en dos subfamilias:
Yuccoideae, con ovario spero (Yucca y Hesperale) y Agavoideae con ovario nfero (Agave,
Beschorneria, Furcraea, Manfreda, Polianthes y Prochnyanthes). Esta clasificacin es apoyada por
anlisis palinolgicos y secuencias del ADN cloroplstico del gen rbcL (subunidad grande de la
Rubisco) (Ojeda y Ludlow, 1995; Eguiarte, 1995).
En la subfamilia Agavoideae, el gnero Agave es el ms importante y fue dividido por Gentry
(1982) en dos subgneros y grupos de acuerdo a su inflorescencia (Tabla 1): Littaea, con un
rgano floral espigado y Agave, cuya inflorescencia es paniculada y con ramificaciones (Figura 3).

1.1.2. NOLINACEAE
La familia Nolinaceae fue propuesta en 1936 por el botnico japons Takenoshin Nakai, pero sta
no fue aceptada hasta 1985, cuando Dahlgren y col. reconocieron dicha separacin e incluyeron
en la familia Nolinaceae a los gneros Beaucarnea, Calibanus, Dasylirion y Nolina (Figura 2),
todos ellos con ovario spero y al parecer, sta es una familia de origen monofiltico, actualmente
con 55 especies y 60 taxa.
DIVISIN

CLASE

RDEN

FAMILIA

SUBFAMILIA

GNERO

SUBGNERO

Angisoperma

Liliopsida
(Monocotiledonae)

Magnoliopsida
(Dicotiledonae)

Asparagales

Otros rdenes

Agavaceae

Agavoideae

Nolinaceae

Otras 28 familias*

Yucca
Hesperale

Beucarnea
Calibanus
Nolina
Dasylirion

Yuccoideae

Beschorneria
Furcraea
Manfreda
Polianthes
Prochynathes
Agave

Littaea (8 secciones)

Agave (12 secciones)

Figura 2. Clasificacin taxonmica de Agave y Dasylirion. Clasificacin propuesta por

Dahlgren, Clifford y Jeo en 1995. *Alliaceae, Amaryllidaceae, Anthericaceae, Aphyllanthaceae,
Asparagaceae, Asphodelaceae, Asteliaceae, Blandfordiaceae, Calectasiaceae, Convallariaceae,
Cyanastraceae, Dasypogonaceae, Dracaenaceae, Doryanthaceae, Eriospermaceae, Funkiaceae,
Hanguanaceae, Hemerocallidaceae, Herreriaceae, Hyacinthaceae, Hypoxidaceae, Ixioliriaceae,
Luzuriagaceae, Philesaciae, Phormiaceae, Ruscaceae, Tecophilaeaceae, Xanthorrhoeaceae.
8

Tabla 1. Clasificacin de subgneros y grupos de Agave.

Subgnero
Littaea

Grupos

No.
especies
8

Amolae*

acaulescentes

Choritepalae*

especies pequeas,
tepalos separados
hojas largas filferas,
limitados a la Sierra Madre
Occidental

Marginatae

pequeas flores, largos

tepalos

21

Parviflorae

pequeas flores altamente

especializada
alto contenido de
sapogeninas
hojas y flores de suave
suculencia,
dientes pequeos
hojas aserradas, flores y
tepalos pequeos
tamao pequeo, flores
pequeas en
forma de urna
flores amarillas de pedicelo
largo

Filiferae*

Polycephalae*

Striatae*
Urcerolate

Agave

Caractersticas

Americanae

3
2

arizonica, utahensis

americana, franzosini, lurida,

oroensis, scabra,
scaposa
aurea, capensis, promontorii

Deserticolae

hojas rgidas fibrosas,

lanceoladas, y
dientes dbiles, pancula
delgada
pancula abierta, tepalos
cortos dimrficos

10

flores agrupadas en forma

esfrica en una pancula
delgada

12

Hiemiflorae

attenuata, bakeri,
pedunculifera, chrysoglossa,
ocahui, vilmoriniana,
yuccaefolia
bracteosa, ellemeetiana,
guiengola
colimana, felgeri, filifera,
geminiflora,
multifilifera, ornithobroma,
schidigera
albomarginata, ensifera,
ghiesbreghtii, horrida,
kerchovei, lechuguilla,
lophanta, pelona, pumilla
parviflora, polianthiflora,
schotti, toumeyana

celsii, chiapensis, pendula,

polyacantha,
warelliana
dasyliroides, striata, stricta

Campaniflorae* rosetas cortas, hojas

largas verdes
Crenatae
mrgenes mamilados,
pancula estrecha

Ditepalae

Ejemplos

10

bovicornuta, calodonta,
cupreata, hookeri,
inaequidens, jaiboli,
maximiliana
avellanidensis, cerulata,
deserti, gigantensis,
margaritae, mckelveyana,
moranni, sobria
applanata, chrysantha,
colorata,
flexispina, fortiflora, murpheyi,
palmeri
atrovirens, congesta,
hiemiflora, hurteri,
lagunae, pachycentra,
potatorum

Marmoratae*
Parryanae

Rigidade

Salmianae

Sisalanae
Umbelliflorae

pocas hojas escabrosas,

espina pequea
roseta globosa, compacta,
hojas cortas, anchas,
dientes conspicuos hacia
la hoja
hojas delgadas rgidas,
dispuestas en espiral,
bracteas pequeas,
abiertas poco ramificadas
largas rosetas verdes
suculentas forma piramidal
en la base de la pancula
hojas lanceoladas,
carnosas, verdes
Pancula umbelada
sostenida por un tallo
suculento

4
6

12

5
2

gypsophila, marmorata,
nayaritensis, zebra
gracilipes, guadalajarana,
havardiana,
neomexicana, parrasana,
parryi
aktites, angustifolia, cantala,
fourcroydes
karwinskii, macroacantha,
tequilana
macroculmis, mapisaga,
salmiana, tecta,
ragusae
desmettiana, kewensis,
neglecta, sisalana, weberi,
shawii, sebastiana

Clasificacin propuesta por Gentry (1982), * grupos endmicos de Mxico de acuerdo a GarcaMendoza (1992).
1.2. DISTRIBUCIN
Los agaves son de gran significancia para Mxico, pues ste se considera centro de origen,
evolucin y diversificacin del gnero. Aproximadamente el 87% (272) de las especies descritas,
se encuentran ampliamente adaptadas y distribuidas en los diversos ecosistemas de nuestro
territorio; adems de la presencia de especies menos evolucionadas y endmicas (Lpez et al.;
2003). La familia Agavaceae se distribuye desde el sur de Canad, Estados Unidos, Mxico,
Centroamrica y norte de Sudamrica, siguiendo la cadena montaosa de los Andes, hasta
Bolivia, Paraguay e islas del Caribe (Figura 4) (Garca-Mendoza y Galvn, 1995). A pesar de que
estas plantas son nativas de regiones ridas y semiridas, crecen en distintas elevaciones, desde
el nivel del mar hasta ms de 2100 m, y en habitats tan variados como bosques, colinas secas,
planicies ridas y a la orilla del mar (Irish, 2000). La distribucin de los gneros Beschcorneria,
Furcraea, Polianthes y Prochnyanthes est restringida a Mxico (Ojeda y Ludlow, 1995). La
presencia de algunos agaves en Asia y en el Mediterrneo se considera como dispersin de la
especie por la mano del hombre.
Por su parte, la distribucin de Nolinaceae es an ms restringida. Sus cuatro gneros son
endmicos del sur de Norteamrica (Carolina, Georgia, Florida, Colorado, Texas), Mxico y parte
de Centroamrica (Guatemala, Belice, Honduras). De aproximadamente 55 especies, en Mxico

10

Figura 3. Caractersticas morfolgicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae.

11

Figura 4. Distribucin de las familias Agavaceae y Nolinaceae. Modificada de Garca-Mendoza

y Galvn 1995.

12

se encuentran 49 (89%) (Figura 4) (Garca-Mendoza y Galvn, 1995), siendo la distribucin de

Beaucarnea restringida en nuestro pas (Ojeda y Ludlow, 1995).

1.3. DESCRIPCIN DE LOS GNEROS Y CARACTERSTICAS DELIMITANTES DE LAS

FAMILIAS AGAVACEA Y NOLINACEAE
Las familias Agavaceae y Nolinaceae son monocotiledneas con similitud entre ellas y con otros
miembros del orden Asparagales, en el crecimiento de sus hojas en forma de roseta, nmero de
hojas de 20 hasta ms de 200, ramilletes florales de seis flores con 6 estambres y 6 tepalos (este
ltimo trmino refiere a la combinacin de 3 ptalos y 3 spalos indistinguibles uno de otro).
Cuando las plantas alcanzan su madurez, la inflorescencia emerge de la roseta con ovarios
segmentados en tres cmaras. A pesar de dichas similitudes, estas familias difieren en algunos
puntos. Anlisis citolgicos de los agaves han determinado un nmero cromosomal x = 30 y una
haploida que oscila entre diplode y hexaplode (tequilana, 2x = 60) (Ruvalcaba-Ruiz y RodrguezGaray, 2002), con 5 cromosomas largos y 25 cortos. En contraste, la familia Nolinaceae tiene 19
cromosomas, todos del mismo tamao. Los agaves tienen flores perfectas, es decir, la parte
masculina y femenina se encuentran en la misma planta; mientras que las de Nolinaceae son
dioicas, las flores masculinas y femeninas se encuentran en distintas plantas. Las flores de las
Agavaceae son de colores y tamaos variados (al menos de 2.5 cm de largo), mientras que las
Nolinaceae son invariablemente de color crema y pequeas (menores de 2.5 mm) (Figura 3). En
las de Agavaceae, algunos gneros como Agave y Furcraea son monocrpicas, es decir, las
rosetas mueren despus de florecer; mientras que las de Nolinaceae son policrpicas y sus
rosetas producen inflorescencia en mltiples aos. Con algunas excepciones, los frutos de las
Agavaceae son dehiscentes con mltiples semillas planas y negras (con fitomelanos) contenidas
en lculos de tres cavidades que se dispersan en la madurez; mientras que los frutos de las
Nolinaceae son indehiscentes con 1 a 6 semillas redondas y cafs (sin fitomelanos) que
permanecen en el fruto (Garca-Mendoza, 1992). A pesar de esto, es importante mencionar que
dada las similitudes compartidas entre estos dos gneros, muchas veces Dasylirion y Agave son
comparadas e incluso estudiadas juntas.

13

1.3.1. AGAVE
Los agaves se consideran plantas perennes, pues su ciclo de crecimiento y floracin toma ms de
una estacin de crecimiento. Sus hojas generalmente son duras y rgidas (Figura 3), aunque
tambin hay especies de hojas laxas. Muchos agaves, en sus hojas contienen una espina terminal
y/o prominentes dientes marginales rectos o curveados, minsculos o largos y planos o
redondeados, siendo todas estas caractersticas tiles en la clasificacin taxonmica; aunque el
color de los dientes y las espinas pueden variar con la edad, medioambiente o condicin fisiolgica
de la planta (Gentry, 1998; Irish, 2000). Sus tallos generalmente son pequeos, muchas veces son
slo una base escondida entre la masa de hojas que de ste emergen, y son raras las especies
que forman troncos de tamao considerable. La inflorescencia emerge del tallo de manera
espectacular cuando la planta llega a la madurez, alcanzando 1.8 m en especies pequeas y
hasta 12 m en las ms grandes. sta tarda en emerger dependiendo de la especie: A. tequilana
toma de 8 a 10 aos, A. fourcroydes lo hace alrededor de 15 aos y en A. deserti sucede cuando
la planta alcanza la edad aproximada de 55 aos (Nobel, 1987). El largo tiempo en que la planta
comienza a florecer favorece que la propagacin de la especie sea principalmente asexual a
travs de la generacin de rizomas o hijuelos. Sin embargo, la edad y frecuencia con que los
agaves comienzan a producir hijuelos tambin es variable: a A. tequilana le toma 3 aos y A.
deserti los produce despus de los 13 aos (Nobel y Quero, 1986). Por otro lado, algunas
especies producen rizomas de manera prolfica, mientras que otros llegan a producir uno o dos
rizomas en toda su vida. Las flores establecidas comienzan a abrir desde la base hasta la punta
del tallo floral; sus 6 tpalos son duros, sostenidos en dos grupos de tres, en algunos casos con
una disposicin de ramillete o fusionados con el tejido ovrico. Las flores de las formas
paniculadas son ms resistentes y duraderas que las formas espigadas, influyendo esto en el tipo
de animales que las polinizan, siendo murcilagos y pjaros en el primer caso y pequeos
insectos en el segundo (Figura 3).
Variedades distintas de agave tienen diferentes propiedades y caractersticas; algunas por
ejemplo, son mejores productoras de savia, otras son mejores en la obtencin de fibras y otras
tantas se desarrollan mejor en suelos con ciertas caractersticas. El orgen para la diversidad
botnica de estas especies se sugiere como resultado de una seleccin prehistrica humana con
el fin de incrementar cualidades especficas, aumentando as el sistema productivo del agave
diversificado y especializado (Parsons y Darling, 2000).

14

1.3.1.1. Agave tequilana Weber var. azul

A. tequilana es una planta suculenta de tallo grueso y corto que alcanza de 30 a 50 cm en la
madurez. El rgano floral mide de 5 a 6 m y es densamente ramificado con 20 a 25 umbelas
largas con flores verdes de 68 a 75 mm de largo, sostenidas sobre pequeos pedicelos
bracteolados. Las pencas se extienden radialmente con una longitud de 90 a 120 cm de largo por
8 a 12 cm de ancho, son lanceoladas, acuminadas, fibrosas, cncavas, ms anchas en medio,
volvindose angostas y ms gruesas hacia la base; presentan un color azul verdoso que le da
nombre a su variedad, con un margen regularmente dentado y espinas aplanadas de 1 a 2 cm de
largo. A. tequilana alcanza su madurez fisiolgica entre los 8 y 12 aos. Para fines comerciales, la
inflorescencia se corta cuando comienza a emerger; de esta manera los carbohidratos destinados
a la emergencia floral son ahora acumulados en el tallo.

1.3.1.2. Agave angustifolia Haworth

El tamao y forma de A. angustifolia es altamente variable, su roseta puede ser de 1 a 1.5 m de
alto y de 2 a 2.4 m de ancho; la formas varigatas son mucho ms pequeas. Las plantas producen
numerosos hijuelos, por lo que raramente son plantas solitarias. Sus hojas lanceoladas son
numerosas y rgidas, de 2.5 a 10 cm de ancho y de 0.6 a 1.2 m de largo, planas en la superficie,
convexas hacia la punta, angostas y gruesas hacia la base. El color de sus pencas vara de verde
a verde grisceo, con pequeos dientes curveados y espaciados cada 1.3 a 3.8 cm y una espina
terminal corta, generalmente color caf o de color granate o negro. La inflorescencia paniculada de
A. angustifolia es de 3 a 5 m de largo con 10 a 20 ramificaciones con flores verdes a amarillas.
Esta es la especie ms ampliamente distribuida en Norteamrica. Generalmente se le encuentra
cerca del litoral, sabana tropical, bosques de espinas y bosques tropicales caducos; se distribuye
en elevaciones que van desde el nivel del mar (desierto sonorense con precipitacin media anual
de 250 mm) hasta los 1500 msnm o ms (zona montaosa de bosque de encino de Uruapan,
Mich. con precipitacin anual de 1680 mm) (Gentry, 1998). La especie tolera cualquier condicin y
tipo de suelo (Irish, 2000), aunque durante su establecimiento la plntula es sensible a altas
temperaturas del suelo, por lo que generalmente requiere una planta nodriza como arbustos o
rboles para crecer bajo su sombra.

15

1.3.1.3. Agave potatorum Zuccarini

A. potatorum, tobala o papalometl es una especie pequea y solitaria. Existen aproximadamente
33 variedades de acuerdo a las caractersticas de sus hojas, las cuales se encuentran entre 30 y
80, dispuestas simtricamente alrededor de un tallo pequeo para formar una roseta abierta. Las
hojas varan en forma y color, desde ovaladas, cuadriculadas o cortas lanceoladas, de 9 a 18 cm
de ancho y de 25 a 40 cm de largo y de color verde grisceo hasta blanca. El margen de las hojas
presentan protuberancias (margen mamilado), as como dientes de 0.6 a 1.3 cm de largo y
espaciados por 1.3 a 2.5 cm, con una espina terminal afilada de 2.5 a 4.4 cm de largo y de forma
sinuosa o torcida. La inflorescencia de A. potatorum puede ser un racimo o una pancula de 3 a 6
m de largo, con flores verde-amarillo y matices rojos; su reproduccin es por semillas. Esta planta
se distribuye principalmente en tierras altas y semiridas de Oaxaca y Puebla a elevaciones entre
1350 y 2250 msnm (Irish, 2000).

1.3.1.4. Agave cantala

A. cantala presenta rosetas verdes de 2 a 2.5 m de largo; hojas de 1.5 a 2 m, acuminadas,
redondeadas hacia la base, de color verde claro u oscuro, orilla lisa en la punta, rugosa en la base,
dientes cafs pequeos de 3 a 4 mm de largo con frecuencia cada 2 o 3 cm y espina terminal
pequea de 5 a 15 mm de largo. La pancula es de 6 a 8 m de largo, bulbfera con alrededor de 20
umbelas difusas en la parte superior, flores verdosas con tintes morados o rojizos de 70 a 85 mm
de largo; ovario fusiforme de 32 a 42 mm de largo (Gentry, 1998).

1.3.1.5. Agave fourcroydes

A. fourcroydes o henequn desarrolla un tronco de 1 a 1.7 m de largo. Sus hojas largas, delgadas,
angostas y lanceoladas son de color verde grisceo, de 8 a 13 cm de ancho y de 1.2 a 1.8 m de
largo; con espinas oscuras espaciadas y una espina terminal redondeada de 2 a 2.5 cm de largo.
El ciclo de esta especie toma de 20 a 25 aos y al final del mismo, se forma la inflorescencia
panculada de 5 a 6 m de largo con 10 a 18 ramificaciones. En sus flores verdes o amarillas, se
han observado malformaciones genticas en sus gametos, adjudicadas a su naturaleza
pentaploide (5x = 30), por lo que los granos de polen son estriles o de baja fertilidad y su
propagacin es principalmente por rizomas o bulbillos. Sin embargo, en el Centro de Investigacin
Cientfica de Yucatn (CICY) se determin que el potencial germinativo puede ser de hasta el

16

93%, abriendo con esto una alternativa para favorecer la variabilidad gentica de esta poblacin
(Barredo-Pool et al., 2004). La distribucin de A. fourcroydes es comn en Yucatn, Veracruz y
Tamaulipas. Es una especie susceptible al fro, una temperatura de -2 C ocasiona serios daos a
las hojas (Irish, 2000).

1.3.2. DASYLIRION
Dasylirion, de los vocablos griegos dasys, grueso y lily, lirio es la palabra propuesta por Zuccarini
(1838) para describir la forma de penacho de uno de los gneros predominantes del desierto
Chihuahuense (Figura 3). Cuando las plantas de Dasylirion son pequeas, su crecimiento en
roseta es similar a los agaves; sin embargo cuando las plantas maduran, el tallo se vuelve
prominente, tomando forma de tronco que raramente alcanza 1 m de altura, siendo D.
quadrangulatum una excepcin notable al presentar un tronco de hasta 5 m al envejecer. Las
hojas de Dasylirion son largas, lineales, flexibles y su color vara entre verde amarillento, verde
oscuro o azul-grisceo. Su margen es rayado con largos dientes pequeos, ganchudos,
apuntando hacia la base y de color amarillo a caf. Entre los espacios de estos dientes se
encuentran otros diminutos, formando as un margen serrado.
Una de las especies ms abundantes es D. wheeleri conocida tambin como sotol o cuchara del
desierto, dado que sus hojas largas, hasta 1 m de longitud, delgadas y fibrosas se ensanchan
hacia la base (de 0.9 a 3 cm) dando una forma de cuchara. A diferencia de los agaves, las hojas
de Dasylirion son suaves y deshiladas formando un follaje azul verdoso que se torna oscuro al
madurar. Las flores masculinas de Dasylirion presentan estambres amarillos protuberantes,
mientras que las femeninas son blanco-verdoso, seguidas por semillas en el interior de cpsulas
aladas. La madurez de la planta, la disponibilidad de agua y probablemente la longitud del da, son
factores que inducen la formacin del tallo floral, que llega a tener dimensiones entre 1.8 y 5.2 m.
Dasylirion es una planta bien adaptada a condiciones ridas, temperaturas extremas y tambin a
cualquier tipo de suelo. No hay evidencias cientficas que indiquen el tiempo de vida de Dasylirion
pero hay quienes sugieren que 150 aos es una edad posible.

17

1.4. IMPORTANCIA ECONMICA Y CIENTFICA

1.4.1. USOS TRADICIONALES
Algunas comunidades, en la actualidad, emplean los agaves como lo hacan las antiguas
civilizaciones: sus races, tallos, pencas y espinas se utilizan en la obtencin de hilos, fibras,
material para construccin, jabn, calzado, vestimenta, alimentos, medicinas, bebidas alcohlicas
tnicas, ornamentos y miel (Gentry, 1998).

1.4.2. USOS ORNAMENTALES

La belleza, mltiples formas y variedades de los agaves, as como su endemismo regional, las han
hecho ser consideradas como plantas exticas que llegan a cotizarse a precios elevados. Este
hecho ha favorecido la dispersin del gnero desde tiempos de la conquista. Al parecer los
espaoles y portugueses llevaron algunas especies como A. americana a Azores e Islas Canarias;
A. angustifolia, A. cantala y otras especies fueron llevadas a Asia y frica; A. americana, A. lurida
y otras especies se dispersaron en las costas del Mediterrneo, alcanzando su esplendor en el
siglo XIX, cuando los agaves se volvieron populares como especies ornamentales y exticas en
los jardines pblicos y privados de Europa (Gentry, 1998).

1.4.3. OBTENCIN DE FIBRAS NATURALES

Indicios arqueobotnicos en Oaxaca (cueva de Gil Naquitz) sugieren que el hombre utilizaba las
fibras de agave desde 10800 a.C., inicindose el trabajo textil hacia los aos 1300 a 800 a.C.
(Palma, 2000). Despus de la conquista, algunas especies como A. angustifolia, A. fourcroydes y
A. sisalana fueron introducidas en reas tropicales como Indonesia, Tanzania, Filipinas y algunos
pases africanos para la produccin comercial de fibras (Irish, 2000; Jin et al., 2004). En Mxico,
para la obtencin de fibra se utilizan A. fourcroydes y A. sisalana, especies cultivadas en el Golfo
de Mxico y Pennsula de Yucatn. En algunas regiones de Oaxaca, la elaboracin de productos
basados en fibras de agave es la segunda actividad agroindustrial ms importante (Palma, 2000).
Otras especies productoras de fibra son A. lechuguilla y A. peacockii encontradas en el Valle de
Mezquital y el Valle de Tehuacn, respectivamente. Por la composicin qumica de las fibras, con
alto contenido de celulosa y bajo porcentaje de hemicelulosa, son poco asimilables a los
microorganismos y por lo tanto ms durables; mientras que el elevado contenido de lignina,
permite que las fibras soporten la accin mecnica a las que se someten durante procesos de

18

tensin (Palma, 2000). El auge de su comercializacin y exportacin se dio a principios del siglo
XX; sin embargo, la competencia de las fibras sintticas ha cambiado la perspectiva econmica de
las zonas desrticas donde se cultivan este tipo de agaves.
Las fibras obtenidas de Dasylirion tambin han sido utilizadas en la elaboracin de canastas,
marcos, muecas y brochas. En la fiesta folklrica del norte de Mxico conocida como la flor del
sotol, se hacen creaciones artsticas a partir de la fibra para la decoracin de postes, crucifijos,
arcos de iglesias, tumbas y cementerios (Irish, 2000).

1.4.4. OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE FITOQUMICOS

Investigaciones realizadas en algunas especies de agave, han demostrado que estas plantas son
fuente natural de sapogeninas (hecogenina, smilagenina, tiogeninas), saponinas (clorogenina),
esteroles, terpenos, vitaminas y otros principios medicinales. En los aos 50 varias compaas
farmacuticas y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), cuantificaron el
contenido de sapogeninas en algunas especies, encontrndose niveles entre 0.5 y 4.5% en
especies como A. vilmoriana, A. cerulata, A. lechuguilla, A. lophanta, A. colimani y A. schidigera;
mientras que las especies con alto contenido de fibra como A. sisalana, A. fourcroydes y A.
angustifolia presentan menor cantidad (de 0 a 0.5%; Gentry, 1998).
En la medicina tradicional mexicana, por ejemplo, se han hecho uso de A. lechuguilla como
antirreumtico, antiinflamatorio, desinfectante en mordeduras de vboras y remocin de cogulos
sanguneos; A. intermixta, se utiliza como antiartrtico, antituberculoso y anticarcingeno (Senz,
et al., 2000); las pencas de A. americana y A. salmiana se utilizan como expectorante, cicatrizante,
diurtico, para dolores estomacales, cardiacos y escorbuto; A. vilmoriana se usa como
antiinflamatorio y antifngico, y de esta especie, recientemente, se caracterizaron dos esteroles
denominados agamensido y agavegenina (Jin et al., 2004). D. wheeleri tambin presenta algunas
propiedades medicinales como antitusivo y en tratamientos de cefaleas (Gioanetto y Franco,
2004).

1.4.5. ELABORACIN DE BEBIDAS ALCOHLICAS

Las diversas variedades de agave encontradas en territorio mexicano, se han usado desde
tiempos inmemoriales en la elaboracin de bebidas alcohlicas. Los factores que afectan las
caractersticas de los agaves, como temperatura, humedad, ciclo natural y precipitacin pluvial,

19

hacen que los productos obtenidos en cada regin sean de propiedades nicas (IiguezCovarrubias et al., 2001a). De acuerdo al proceso, las bebidas alcohlicas pueden ser
fermentadas o destiladas.

1.4.5.1. BEBIDAS FERMENTADAS

El pulque es la bebida fermentada ms conocida. Algunos cdices mexicanos manifiestan que los
Aztecas elaboraban el pulque (octli) durante su migracin al Valle de Mxico entre 1172 y 1291
d.C. y era un componente importante en ritos religiosos y ceremoniales (Gentry, 1998). Esta
bebida se prepara de la savia que emana del agave, que al llegar a la madurez y antes de que
emerja la inflorescencia, se le hace una incisin. El drenado conocido como aguamiel es dulce y
cuando se fermenta, produce el pulque. Esta bebida se hace a partir de un nmero limitado de
especies como A. salmiana, A. mapisaga, A. atrovirens, A. hookeri y A. americana (Irish, 2000),
cuyos jugos muchas veces son mezclados y fermentados por un complejo de levaduras y
bacterias (Bacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Pseudomonas, Streptococcus, Diplobacter,
Bacillus, Saccharomyces y Pichia, entre otros) que producen etanol y otros compuestos qumicos
que dan sabor y consistencia viscosa a la bebida (Gentry, 1998). El pulque es fuente importante
de hierro (hasta 1.1 mg/mL) y cido ascrbico (60 mg/L). Adicionalmente, en esta bebida se han
identificado riboflavina y otras vitaminas B (Tabla 2), as como saponinas biolgicamente activas
(Backstrand, et al., 2002).

1.4.5.2. BEBIDAS DESTILADAS

Dentro de las bebidas destiladas, destaca el tequila, smbolo de fusin cultural, pues fueron los
espaoles quienes a su arribo, introdujeron la prctica de destilacin al proceso de fermentacin
que ya practicaban las culturas prehispnicas (Mancilla-Margalli, 2000). Esta bebida ha pasado
por un proceso histrico, cultural, econmico, social y tecnolgico, hasta llegar a la actualidad en
la que se le considera como bebida representativa de Mxico, con reconocimiento mundial y
protegido por una denominacin de origen.
El tequila se produce exclusivamente con A. tequilana Weber var. azul, cuyos tallos cortados en
mitad son cocidos y su jugo es extrado por desgarramiento de la pulpa. Si el tequila es mixto, se
le adiciona hasta un 49% de azcares de otras fuentes (caa o melaza) o solo los azcares
propios del agave si la bebida es 100%. Para la fermentacin, se inocula la levadura

20

Saccharomyces cerevisiae (20 a 50 106 clulas/ mL) y posteriormente el mosto obtenido, es

destilado una primera vez (destrozamiento) en alambiques de cobre para separar las vinazas
(levaduras, azcares no fermentables, minerales, slidos) de otros compuestos, y una segunda
vez (rectificacin), para concentrar los alcoholes en el cuerpo del destilado (45 a 50 GL) y separar
las cabezas y colas. Este producto es envasado como tequila blanco o puede ser reposado en
barriles de roble blanco o encino por un ao o ms para producir respectivamente, el tequila
reposado o aejo (Cedeo, 1995; Bautista-Justo et al., 2001; Lpez y Dufour, 2001).
Otras bebidas alcohlicas provenientes del destilado de jugos de agaves fermentados, incluyen
mezcal, bacanora, sotol y, recientemente, henequn. El bacanora se produce en un lugar de
Sonora del cual deriva su nombre. A. angustifolia y A. palmeri son las especies que ms se
utilizan. Para la elaboracin del mezcal, las especies ms usadas son A. angustifolia, A.
potatorum, A. cantala y A. karwinskii. Por su parte, el sotol se produce principalmente en
Chihuahua a partir de plantas silvestres del gnero Dasylirion; mientras que, la produccin del
henequn se realiza a partir de A. fourcroydes.
Tabla 2. Composicin de aguamiel y pulque.
Compuesto
Aguamiel Pulque
Agua (g/100 g)
94.0
98.3
Cenizas (g/100 g)
0.4
0.2
Protenas (g/100 g)
0.30
0.37
Extracto no-nitrogenoso (g/100 g)
5.30
1.13
Ca (mg/100 g)
20
11
P (mg/ 100 g)
9
6
Fe (mg/100 g)
nr
0.70
Tiamina (mg/100 g)
0.02
0.02
Riboflavina (mg/100 g)
0.03
0.03
Niacina (mg/100 g)
0.40
0.35
cido ascrbico (mg/100 g)
6.7
5.1
N (g/100 mL)
nr
0.14
Lisina (g/100 mL)
nr
16.2
Triptofano (g/100 mL)
nr
2.7
Histidina (g/100 mL)
nr
4.7
Fenilalanina (g/100 mL)
nr
11.2
Leucina (g/100 mL)
nr
10.5
Tirosina (g/100 mL)
nr
6.4
Metionina (g/100 mL)
nr
0.7
Valina (g/100 mL)
nr
6.6
Arginina (g/100 mL)
nr
10.9

nr, no reportado. Los valores indicados corresponden a aquellos encontrados en una muestra.
Datos tomados de Gentry, 1998.

21

El proceso de elaboracin de estas bebidas es similar al tequila (cosecha, cocimiento, molienda,

fermentacin, destilacin y envasado), pero el proceso de elaboracin es ms rudimentario. Las
pias se cocen en hornos rsticos consistentes en hoyos en el suelo cubiertos de carbn, piedras
refractarias y bagazo de pias. La molienda se realiza con una tahona, molino rstico que consiste
en una piedra plana redonda jalada por un caballo o por maceracin con un mazo de madera. A la
botella de mezcal generalmente se le adiciona un gusano (Hypopta agavis), que naturalmente
ataca a la planta, dndole un sabor distintivo a la bebida. Esta bebida est en un proceso de
crecimiento y consolidacin en el mercado nacional e internacional (Gentry, 1998). Actualmente se
reconoce con una denominacin de origen que autoriza a seis estados de la repblica para su
explotacin, incluyendo Oaxaca, Guerrero, Zacatecas, Durango, San Luis Potos y Tamaulipas.
Por otra parte, la gran aceptacin del sotol en la regin norte del pas, ha encaminado los
esfuerzos de industriales y productores para lograr la denominacin de origen de esa bebida en
dicha regin.

1.4.6. ELABORACIN DE EDULCORANTES FRUCTOSADOS

Un hecho importante de destacar, es el otorgamiento de una patente a investigadores de la
Universidad de Guadalajara, quienes desarrollaron un procedimiento para la produccin de
jarabes fructosados a partir de plantas de agave. Dicho proceso consiste en la aplicacin de una
inulinasa comercial (1 a 1.5 g/L) a un extracto de agave, rico en fructanos y libre de material slido.
La hidrlisis enzimtica de los fructanos se lleva a cabo de 4 a 5 h en un rango de temperatura de
40 a 50 C, produciendo un jarabe rico en fructosa. Este producto ha empezado a comercializarse
en tiendas naturistas de Mxico bajo el nombre de Naturel o Sweetrel (Figura 5) por la
Industrializadora Integral de Agave, S.A. de C.V. (productora de Tequila Orendain). Naturel es un
producto que presenta un 68% (w/v) de fructosa y 5% de glucosa (Lpez-Mungua, 2004), y
constituye una alternativa edulcorante saludable con algunas ventajas sobre la sacarosa.

1.4.7. UTILIZACIN DE BAGAZO

Durante la molienda de pias para la obtencin del jugo que ser fermentado, se genera el
bagazo, producto de desecho que representa hasta el 40% del peso de las pias. Este material
altamente fibroso, se deja en los campos o de manera emprica, se mezcla con arcilla en la
elaboracin de ladrillos o se seca al sol para la obtencin de material de empaque. Ante el

22

reconocimiento internacional del tequila, la Universidad de Guadalajara, visionando un problema

ecolgico creciente, realiz una investigacin encaminada al uso de este material (IiguezCovarrubias et al., 2001a y b). Se mostr que la alimentacin de borregos Pelibuey con una dieta
basada en bagazo de agave, tiene la misma eficiencia en ganancia de peso que el rastrojo de
maz comnmente utilizado, con la ventaja que el bagazo esta disponible cualquier poca del ao
(Iiguez-Covarrubias et al., 2001a). Por otra parte, tablas fabricadas con bagazo de agave, son
ms resistentes a la humedad que aquellas fabricadas de lamo, adems de presentar una
resistencia mecnica superior a lo establecido por las normas de calidad (Iiguez-Covarrubias et
al., 2001a). Tambin se ha ensayado el uso del bagazo en la elaboracin de aglomerados, billetes
bancarios, filtros, absorbentes, geotextiles y junto con la copra de coco para la elaboracin de
sustratos sin suelo en la siembra de cultivos como maz.

Figura 5. Edulcorante fructosado Naturel. Elaborado a partir de la hidrlisis de fructanos en

agave, ofrece ventajas saludables sobre el consumo de sacarosa. Tomada de Lpez-Mungua,
2004.

23

1.4.8. PROPAGACIN in vitro

A pesar de la generacin de una gran cantidad de semillas durante la reproduccin sexual de los
agaves (de 7,000 a 30,000 semillas/inflorescencia), el gran porcentaje de depredacin y en
ocasiones las inadecuadas condiciones de germinacin, hacen que la manera ms comn de
propagacin de estas plantas sea asexual, a travs de hijuelos que son cortados por el hombre y
sembrados en nuevos campos. Esta manera de reproduccin pone en riesgo la variabilidad
gentica de estos cultivos (Gil-Vega et al., 2001) y los expone a una gran devastacin en el caso
de plagas o enfermedades.
Otro tipo de propagacin vegetativa es a travs de bulbillos, hijuelos pequeos que emergen del
quiote; sin embargo adems de su menor incidencia, tambin presentan bajos ndices de
supervivencia (Nikam et al., 2003). Una alternativa viable ha sido la propagacin in vitro, y
actualmente existen numerosos reportes en donde utilizando segmentos de tallos, rizomas,
bulbillos, fragmentos de semillas, callos y explantes de hojas, han logrado la propagacin y
regeneracin de agaves de importancia comercial como A. sisalana o agaves amenazados como
A. victoria-reginae (Nikam et al., 2003). Aunque esta tcnica pone en riesgo la variabilidad
gentica de las plantas, entre sus ventajas destaca la obtencin de un gran nmero de plntulas
homogneas de caractersticas genotpicas deseables, aceleramiento de la propagacin
vegetativa, aseguramiento de la calidad y certificacin de que las plntulas que se llevan al campo
estn sanas. Esto ha sido de gran significancia en el caso de A. tequilana, que con la gran
demanda mundial del tequila a finales de los aos 90 propici escasez de plantas, aunado a que
las enfermedades propias del cultivo empezaban a devastar grandes extensiones de cultivo. El
reto de propagacin in vitro a nivel industrial fue superado con creces, produciendo 2 y 4.5
millones de plntulas en el 2002 y 2003, respectivamente. Actualmente, en el campo hay ms de
500 mil plantas de A. tequilana propagadas, con un desempeo agronmico sobresaliente,
superando incluso, al mejor material de siembra tradicional (Bosch-Guha, 2004).
La propagacin in vitro de A. fourcroydes tambin logr rendimientos superiores a la propagacin
por rizomas; los agaves crecen ms rpido y producen mayor cantidad de hojas grandes (Herrera
et al., 2004). Para A. potatorum, A. cupreata y A. parrasana, la propagacin in vitro es
especialmente valiosa, ya que estas plantas no forman rizomas y su reproduccin sexual o por
bulbillos es ineficiente (Santacruz-Ruvalcaba et al., 1999; Salazar et al., 2004).

24

1.5. INFLUENCIA DE LA ZONA GEOGRFICA EN LOS AGAVES

El rendimiento de los agaves, el tiempo en que llegan a su madurez, contenido de carbohidratos y
sus caractersticas morfolgicas, son altamente influenciadas por factores abiticos como tipo de
suelo, temperatura, humedad y elevacin. En algunos agaves como A. deserti, A. salmiana (Nobel
y Meyer, 1985), A.lechuguilla (Nobel y Quero, 1986) y A. tequilana (Ruiz-Corral et al., 2002), se ha
determinado un valor denominado ndice productivo medioambiental (EPI), que correlaciona tres
factores ambientales: estatus hdrico, temperatura y radiacin fotosintticamente activa (PAR) con
la fijacin de CO2 por parte de la planta, medida como ganancia en peso seco (donde un valor de
1 indica condiciones no limitantes (Figura 6).
En A. lechuguilla se observ que el EPI tiene una mayor relacin con el estatus hdrico del suelo
(r2 =0.97), seguido del ndice PAR (r2 = 0.25) y que la temperatura no tiene efecto (r2 =0.00) sobre
la productividad. Un valor EPI de 0.38 kg m2 ao-1 para esta especie sembrada en campo, es
bajo comparado con cultivos agrcolas de alto rendimiento como trigo y maz (1-2 kg m2 ao-1);
sin embargo, este valor es cuatro veces mayor cuando se compara con otras plantas que viven en
ecosistemas desrticos ( 0.1 kg m2 ao-1) (Nobel y Meyer, 1985). La medicin mensual del EPI
se correlaciona con el nmero mensual de hojas nuevas y estima la productividad de la planta
(Figura 6D y Tabla 3) (Quero y Nobel, 1987), pudiendo dar una idea confiable sobre los meses
mas favorables para la cosecha y factores ambientales que influyen sobre dicha productividad
(Nobel, 1984).
Tabla 3. Productividad anual de agaves y otras plantas CAM.
Especie
A. deserti
A. fourcroydes
A. salmiana
A. lechuguilla
Opuntia ficus-indica
Ananas comosus

Productividad
(kg/m-2 ao-1)
1.06
1.60*
1.05
0.38
1.36*
1.2*

*, productividad reportada en cultivos comerciales bajo condiciones donde el agua no es factor

limitante. Para efectos de comparacin, se reporta un rango de productividad de 3 a 7 kg/m2/ao
en cultivos como alfalfa, caa y de 1 a 2 kg/m2/ao para trigo y maz en condiciones no limitantes.
Datos tomados de Nobel y Meyer, 1985.

25

Figura 6. Influencia de factores abiticos en la asimilacin de CO2 en A. lechuguilla.

Recuadros sombreados indican tiempo de oscuridad (noche). , potencial hdrico. A) Estatus
hdrico: las plantas fueron regadas semanalmente (--, suelo -0.5 MPa) o sometidas a sequa
(suelo < -0.5 MPa) durante 7 (--) y 13 das (- -); B) Temperatura, los nmeros indican
temperaturas da/noche; las plantas fueron irrigadas semanalmente; C) PAR, distintos grupos de
plantas fueron sometidas por 10 das a un valor PAR (mol m-2) como se indica; D) Productividad,
valores mensuales de EPI calculado a partir de la fijacin de CO2 bajo las condiciones biticas A),
B) y C) como indicador predictivo de la ganancia en peso seco mensual (nmero promedio de
hojas desplegadas por planta). Modificada de Nobel y Quero, 1986 y Quero y Nobel, 1987.
En A. tequilana por ser una especie de gran importancia econmica, ha sido posible llevar un
registro de sus plantos y con esto su ecofisiologa ha sido ms estudiada. En esta especie se
observ que la temperatura nocturna influye ms que la diurna para la fijacin de CO2 (Figura 7) y

26

que la actividad fotosinttica se favorece con un bajo ndice PAR, bajo contenido de humedad en
el suelo y temperaturas nocturnas frescas (12 a 16 C). En base a lo anterior se estableci para el
estado de Jalisco, regiones ptimas, subptimas y marginales para este cultivo (Figura 8 y Tabla
4), considerndose como ptimas, regiones con una elevacin entre 1100 y 2800 msnm y climas
subtropical templado y subtropical semiclido (Ruiz-Corral et al., 2002). A. tequilana cultivado en
zonas ptimas y manejo agrcola adecuado, presenta tasas de fotosntesis comparable a plantas
C3 y C4 (921 mmol CO2 m-2 da-1 en clima subtropical templado y 763 mmol CO2 m-2 da-1 en clima
subtropical semiclido), pero con una menor velocidad de transpiracin. Esto no slo significa
mayor cantidad de CO2 fijado, sino que un aumento en la superficie cultivada con esta planta
puede representar efectos ecolgicos benficos, dada su capacidad de secuestrar carbono, en
tiempos de larga sequa cuando pocas plantas con metabolismo C3 o C4 lo pueden hacer
(Pimienta-Barrios et al., 2001 y 2004).

Figura 7. Influencia de la temperatura en la asimilacin de CO2 en A. tequilana. La fijacin de

CO2 fue negativa en la mayor parte del da, incrementndose al final del da. La fijacin mxima
nocturna fue de 17 mol m-2 s-1 (267 mmol m-2 d-1) para plantas en un rgimen de temperatura de
25C/15C, 14 mol m-2 s-1 (298 mmo m-2 d-1) en temperaturas de 15C/5C y slo 6 mol m-2 s-1
(84 mmol m-2 d-1) cuando las plantas tienen ciclos de 35C/25C. Modificada de Nobel et al., 1998.

27

Figura 8. reas ptimas, subptimas y marginales para el cultivo de A. tequilana en el

estado de Jalisco. Se indica el rea potencial para el cultivo de esta planta, que corresponde a
casi 10 veces el rea cultivada actualmente. Los municipios valorados son indicados en los
nmeros superiores. Tomada de Ruz-Corral et al., 2002.

28

1.6. ADAPTACIN DE LOS AGAVES

El adjetivo noble o admirable con que Linneo describi a las plantas de agave, refiere a su
capacidad para crecer en ambientes hostiles y soportar temperaturas extremas, que van desde 20C hasta ms de 38C (Tabla 5). Esta capacidad puede ser resultado de las adaptaciones
morfolgicas y fisiolgicas que presentan estas plantas.
Tabla 4. Rangos de temperatura para el cultivo de A. tequilana en Jalisco.
Variable

ptima

Subptima

Marginal

Temperatura nocturna (C)

10 a 16

5 a 10 16 a 25

<5 >25

Temperatura diurna (C)

15 a 25

10 a 15 25 a 35 <10 >35

Probabilidad de heladas

< 0.10

>0.10

Tomada de Ruz-Corral et al., 2002.

Tabla 5. Tolerancia de agaves y dasylirion a fro extremo.

Especie
Temperatura
Especie
Temperatura
A. americana
- 9 C
A. parryi
- 29 C
A. angustifolia
- 4 C
A. parviflora
- 12 C
A. attenuata
- 2 C
A. pelona
- 7 C
A. bovicornuta
- 7 C
A. salmiana
- 15 C
A. cerulata
- 12 C
A. scabra
- 12 C
A. chrysantha
- 8 C
A. schidigera
- 9 C
A. datylio
- 4 C
A. schotti
- 12 C
A. deserti
- 9 C
A. shawii
- 4 C
A. desmettiana
- 4 C
A. sisalana
- 4 C
A. filifera
- 8 C
A. striata
- 9 C
A. fourcroydes
- 4 C
A. tequilana
- 4 C
A. geminiflora
- 4 C
A. toumeyana
- 12 C
A. havardiana
- 23 C
A. utahensis
- 23 C
A. lechuguilla
- 18 C
A. victoriae-reginae
- 12 C
A. lophantha
- 12 C
A. vilmoriana
- 6 C
A. macrocantha
- 4 C
A. weberi
- 11 C
A. marmorata
- 4 C
A. zebra
- 7 C
A. murpheyi
- 12 C
D. acrotriche
- 9 C
A. neomexicana
- 29 C
D. leiophyllum
- 18 C
A. ocahui
- 9 C
D. quadrangulatum
- 9 C
A. palmeri
- 12 C
D. texanum
- 15 C
A. parrasana
- 9 C
D. wheeleri
- 18 C

Tomada de Irish, 2000.

29

1.6.1. ADAPTACIN MORFOLGICA

1.6.1.1. HOJAS
La suculencia de sus pencas es una de las caractersticas ms peculiares de los agaves; stas
contienen un parnquima esponjoso especializado de paredes delgadas, gran cantidad de
cloroplastos y vacuolas prominentes. Estas clulas almacenan agua y ayudan a amortiguar los
cambios de disponibilidad de agua en el suelo. Por su gran capacidad de almacenamiento, la
longevidad de las pencas (hasta 15 aos o muchas veces durante toda la vida de la planta) le
confiere al agave la ventaja de contener suficientes provisiones para el florecimiento (Irish, 2000).
La proporcin volumen:rea foliar es un ndice til que indica la capacidad de almacenar agua en
las hojas; pencas con gran volumen y pequea rea foliar tienen ms agua disponible para la
transpiracin. As, el distintivo tamao de los agaves influye en el uso eficiente de agua (ganancia
de peso seco por unidad de transpiracin) que finalmente afecta su distribucin: los agaves de
mayor tamao se encuentran en la regin sur-centro de Mxico, zona con mayor humedad que la
regin norte (Woodhouse et al., 1983; Linton y Nobel, 2001).
Por otra parte, la disposicin en roseta de las hojas, le permiten a los agaves colectar el agua de
lluvia hacia el tallo; adems que la sombra formada por las mismas, reduce la evaporacin y
protege el rgano floral (Gentry, 1998). El nmero de estomas en la epidermis es 10 veces inferior
a las dicotiledneas e incluso a otras monocotiledneas. Aunque esto disminuye la frecuencia de
intercambio gaseoso, tambin decrece la prdida de agua por transpiracin (Nobel, 1988). La
cutcula cerosa que cubre las pencas, es otra adaptacin para prevenir la prdida excesiva de
agua. Otro tipo de adaptacin morfolgica de los agaves es el pequeo dimetro de sus vasos
conductores y su baja densidad en las hojas, confirindole la caracterstica de baja conductancia
hidrulica (Kh) (6 mmol m-2 da-1 en A. deserti vs 33-94 mmol m-2 da-1 en rboles leosos) y mayor
susceptibilidad a la cavitacin, es decir, al bloqueo de los vasos del xilema con aire o vapor de
agua. Este fenmeno disminuye la Kh y el potencial hdrico de la planta, que finalmente provoca el
cierre estomatal y disminucin en la prdida de agua (Linton y Nobel, 2001). En un experimento de
estrs hdrico por 100 das en A. tequilana y A. deserti, se evidenci que la primera es ms
susceptible a la cavitacin (Tabla 6), observada como un mayor decremento en la Kh. Esto fue
explicado por una menor proporcin volumen:rea foliar (2.3 vs 3.3), traducido como hojas ms
delgadas, mayor velocidad de transpiracin y un subsecuente decremento mayor de su potencial
hdrico foliar (foliar). Como en otras especies, en este caso tambin existe una correlacin entre la

30

Tabla 6. Susceptibilidad a la cavitacin de A. tequilana y A. deserti sometidos a 100 das de

sequa.
Sequa
(das)

1suelo

(MPa)

foliar
(MPa)
A.
tequilana

Decremento
en 2Kh (%)
A. tequilana

Transpiracin
(mol m-2da-1)
A. tequilana

foliar
(MPa)
A. deserti

Decremento
en Kh (%)
A. deserti

Transpiracin
(mol m-2da-1)
A. deserti

0
20
40
60
80
100

-0.02
3nr
Nr
Nr
Nr
-4.00

-0.58
-0.76
-1.62
-2.28
-2.90
-3.42

0
10
43
60
84
85

11.6
2.4
0.8
nd
0.4
0.3

-0.64
-0.76
-0.83
-1.09
-1.58
-1.96

0
2
nr
21
32
41

6.2
1.6
0.5
4nd
0.4
0.3

1,

potencial hdrico; 2Kh, conductancia hidrulica foliar; 3nr, no reportado; 4nd, no determinado..
Datos tomados de Linton y Nobel, 2001.
vulnerabilidad a la cavitacin, tolerancia a sequa y caractersticas ambientales: A. deserti es
predominante en el noreste del desierto de Sonora con un promedio pluvial anual de 240 mm,
mientras que A. tequilana en la regin de Jalisco, recibe un promedio anual de 1000 mm (Linton y
Nobel, 2001).

1.6.1.2. RACES
Las caractersticas de las races en los agaves tambin resultan de importancia para la
supervivencia de estas especies en lugares secos. Sus clulas epidermales contienen un
parnquima lignificado que reduce la prdida de agua (Palta y Nobel, 1989). Aunque menos
estudiada, la morfologa de la raz de Dasylirion, tambin se ha observado en estas especies, un
sistema radicular fibroso con una endodermis esclerificada rodeada por una corteza gruesa de
clulas parenquimatosas. Las plantas jvenes presentan de 2 a 3 races fusiformes contrctiles,
mientras que las mayores presentan un sistema radicular densamente disperso (Bogler, 1995).
Al igual que otras plantas desrticas perennes, y en una estrategia para eficientar la presencia de
agua, cuando hay indicios de humedad en el suelo, A..deserti produce races finas (races de
lluvia) en forma de ramificaciones sobre un sistema radicular establecido. Estas races de lluvia
incrementan el rea de absorcin y la captura de agua y nutrientes, haciendo un contacto efectivo
de suelo-raz. Sin embargo, durante sequas, el potencial hdrico del suelo decrece por debajo del
de las races y las races de agua son eliminadas, probablemente por un costo respiratorio y
conductividad hidrulica mayor a las races establecidas (Figura 9).

31

Figura 9. Cambios en la velocidad de respiracin durante sequa en races de lluvia y

establecidas en A. deserti. Smbolos blancos indican la velocidad medida durante el da y los
smbolos oscuros denotan los datos obtenidos durante la noche. En condiciones iniciales, la
velocidad de respiracin para las races establecidas fue de 2.15 mol CO2 kg-1 s-1 y 4.55 mol
CO2 kg-1 s-1 durante la noche y el da, respectivamente; mientras que para las races de lluvia fue
de 6.20 mol CO2 kg-1 s-1 y 14.5 mol CO2 kg-1 s-1 para la noche y el da respectivamente. Se
observ un decremento mayor y ms rpido en las races de lluvia alcanzando un valor 0 a los 6
das (suelo = -0.9 MPa), condicin que solo caus una reduccin en la respiracin para las races
establecidas. Modificada de Palta y Nobel, 1989.
El encogimiento de las pequeas races en sequa provoca en el suelo huecos que disminuyen la
conductividad hidrulica y aumenta la resistencia de la raz a movimientos de agua (hasta 100
veces, segn clculos) (Schulte y Nobel, 1989). Las races de lluvia, adems, no se recuperan
despus de una rehidratacin, probablemente por diferencias en la presin osmtica y una menor
conductividad hidrulica de las races establecidas que son capaces de mantener una respiracin
basal a suelo = -1.3 MPa. Esto minimiza la prdida de agua y ayuda a prevenir la muerte de las
races establecidas, cuya recuperacin es completa despus de que cesa la sequa (Palta y Nobel,
1989).

32

1.6.1.3. TALLO
Durante tiempos de sequas severas, los tallos llegan a encogerse, provocando delgadas fisuras
en el suelo alrededor de la base de la planta. Esto incrementa la utilidad de la forma de roseta al
canalizar el agua cuando llueve (Irish, 2000).

1.6.2. ADAPTACIN FISIOLGICA

1.6.2.1. METABOLISMO CIDO DE LAS CRASSULACEAS (CAM)
Indudablemente uno de los factores fisiolgicos de mayor importancia para el desarrollo de los
agaves en ambientes ridos, es el uso del metabolismo fotosinttico del cido de las crassulaceas,
conocido como metabolismo CAM. Tan notable caracterstica fue descrita para A. americana a
finales de los 60 (Iiguez-Covarrubias et al., 2001). Parte de los resultados reportados por Ehrler
(1969) se muestran en la Figura 10 y Tabla 7, donde se compara el comportamiento fisiolgico del
maz y A. americana, y se evidencia que esta especie sigue un patrn tpico de plantas con
metabolismo CAM.
10

Agave americana
Zea mays

Diferencia de Temperatura (C)

0
0.00

2.00

4.00

6.00

8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

-2

-4

Hora

Figura 10. Diferencia de temperatura entre el rea foliar (de maz o agave) y el aire
circundante. Los recuadros indican tiempo de oscuridad en la medicin realizada en invernadero.
La diferencia de temperatura durante el da marca una respuesta distinta de ambas plantas a una
misma condicin ambiental. Durante la noche, la menor diferencia de temperatura entre las hojas
de agave y el aire, indica una apertura estomatal nocturna. Modificado de Ehrler, 1969.

33

Tabla 7. Comparacin de parmetros fisiolgicos de Zea mays y Agave americana.

Zea mays
Transpiracin (g m-2 h-1)
Resistencia foliar a difusin
cm-1)
Frecuencia estomatal
(estomas cm-2)

(s

Agave americana

5.96
93.0

90.0
7.1

30.0
17.1

14.6
239.0

Epidermis
inferior
9247

Epidermis
superior
5077
9407
69.4
0.007

Epidermis
inferior
3717

Epidermis
superior
4850
2228
34.4
0.015

Prdida de agua (g)*

Ganancia de peso seco (g)*
Eficiencia de uso de agua
(ganancia
en
peso/transpiracin)*

El patrn de transpiracin y resistencia foliar es inverso en ambas especies, indicando un tiempo

de apertura estomatal diferente. Los valores indican el promedio de la medicin de tres plantas
independientes. El smbolo * representa la medicin en un perodo de 10 semanas. El cuadro
rayado indica tiempo de oscuridad. Modificado de Ehrler, 1969.
En contraste al metabolismo C3 y C4, las plantas CAM reducen la prdida de agua por
transpiracin, al abrir los estomas para la asimilacin de CO2 durante la noche, cuando la
diferencia de concentracin de vapor de agua entre el tejido foliar y el ambiente circundante es
menor (Lpez et al., 2003). La prdida de agua por parte de la planta sucede a una velocidad dos
veces mayor que la toma de agua; sin embargo, se alcanza un balance positivo porque la prdida
de agua por transpiracin sucede por la noche, mientras que la toma de agua a travs de las
races ocurre durante las 24 h del da (Nobel, 1997).
1.6.2.2. BIOQUMICA DEL METABOLISMO CIDO DE LAS CRASSULACEAS (CAM)
En general, el metabolismo CAM se caracteriza por una movilizacin masiva de carbohidratos
durante el perodo de oscuridad (Figura 11), que a travs de la gliclisis produce fosfoenolpiruvato
(PEP). Este compuesto se carboxila por la fosfoenolpiruvato-carboxilasa (PEPC, E.C. 4.1.1.31)
usando bicarbonato (HCO3-) como sustrato (Trpodi y Podest, 1997). El oxaloacetato formado de
esta reaccin, se reduce rpidamente a malato por una NAD(P)-malato deshidrogenasa de origen
citoslico y/o mitocondrial (Hopkins, 1995). El malato-2 formado se mueve pasivamente hacia la
vacuola a travs de un canal especfico, acoplado a un transporte activo de protones (una bomba
H+-ATPasa vacuolar) (Dood et al., 2002). En A. deserti la acumulacin nocturna de cidos en la
vacuola del clornquima, aumenta el potencial osmtico y genera un gradiente que favorece la
adquisicin de agua por el tejido parenquimatoso.

34

Cloroplasto

Figura 11. Metabolismo cido de las crasulceas. Durante el perodo de oscuridad, los estomas
abiertos permiten la asimilacin de CO2 mediante la produccin de malato que es almacenado en
la vacuola. Durante el da, el cierre de los estomas reduce la prdida de agua, mientras que el
malato es descarboxilado y fosforilado en el citoplasma para la sntesis de carbohidratos en el
ciclo de Calvin. T-P, triosa-fosfato; OAA, cido oxalactico; MAL, malato; PEP, fosfoenolpiruvato;
PYR, piruvato; a, PEP-carboxilasa; b, malato deshidrogenasa; c, enzima descarboxilasa.
Modificado de Hopkins, 1995.
Existe la controversia, si estos cambios osmticos son suficientes para la adquisicin de agua del
suelo; sin embargo, son significativos para mantener el turgor de las clulas del clornquima y la
apertura de los estomas durante tiempos de sequa (Schulte y Nobel, 1989). La actividad de la
PEPC es regulada por una fosforilacin reversible a un residuo de serina mediada por la PEP
carboxilasa cinasa (PPCK), cuya expresin responde a un ritmo circadiano o al estatus de carbono
indicado por la concentracin de malato (Kingston-Smith, 2001; Dood et al., 2002).
Durante el perodo de luz, cuando los estomas se encuentran cerrados, las enzimas
descarboxilasas liberan el CO2 a partir de la descarboxilacin del malato (Figura 11). El CO2
liberado se difunde hacia el cloroplasto donde se fija por la ribulosa 1,5-difosfato carboxilasaoxigenasa (RUBISCO, E.C. 4.1.1.39) e incorporado al ciclo de reduccin del carbono fotosinttico

35

(ciclo de Calvin) para formar carbohidratos de almacn mediante la gluconeognesis (Cushman y

Bohnert, 1999).
La fuente de carbono que produce PEP durante el perodo de oscuridad, vara dependiendo de la
especie. Algunas plantas CAM degradan glucanos o almidn cloroplstico, mientras que otras lo
hacen a partir de fuentes extracloroplsticas (Trpode y Podest, 1999). Por otra parte, tambin se
ha mostrado plasticidad en plantas CAM en cuanto al uso de la principal enzima descarboxiladora:
unas especies presentan principalmente actividad de PEP carboxicinasa (PEPCK, E.C.4.1.1.49),
mientras que en otras esta actividad no es suficiente para explicar la decarboxilacin del cido
mlico y presentan actividad importante de las enzimas descarboxilasas mlico-NAD de origen
mitocondrial (NAD-ME, E.C. 1.1.1.39) y mlico-NADP dependiente de origen citoslico (NADP-ME,
E.C.1.1.1.40). Se ha sugerido una correlacin taxonmica en base a la principal enzima
descarboxilasa y al carbohidrato de reserva degradado en la formacin de PEP; sin embargo,
Christopher y Holtum (1996) demostraron que esto no siempre es as (Tabla 8), y en un anlisis de
distintas especies, postularon distintas vas CAM en base a la estrategia que presentan en la
conservacin de carbohidratos de reserva, la compartamentalizacin de las principales
descarboxilasas y de los transportadores de membrana involucrados en su metabolismo:
i).- Especies que usan descarboxilasas ME y que producen almidn cloroplstico. En estas
especies, el cloroplasto importa piruvato (PYR) del citoplasma y exporta PEP a travs de un
transportador cloroplstico del tipo Pi/triosa-P que intercambia PEP por triosa-P. Esta accin
puede promover la acumulacin de triosa-P en el cloroplasto y favorecer la sntesis y almacn de
almidn y glucanos en dicho organelo (Figura 12A).
ii).- Especies que usan descarboxilasa PEPCK y que producen almidn cloroplstico. El
metabolismo de estas especies puede ser explicado por un intercambio de triosa-P (a la vacuola)
por Pi (al citoplasma) a travs de un transportador de Pi. Este ltimo metabolito puede provenir del
pirofosfato (PPi) producido durante la polimerizacin del almidn (Figura 12B).
iii).- Especies que usan descarboxilasa PEPCK y que producen carbohidratos extracloroplsticos.
En estas especies el PEP producido en el citosol va malato deshidrogenasa y PEPCK, puede
estar disponible para las enzimas gluconeognicas citoslicas que promueven la acumulacin de
hexosas o polisacridos en el citosol y/o vacuola (Figura 12C).
iv).- Especies que usan decarboxilasas ME y que producen carbohidratos extracloroplsticos. En
este caso, la exportacin de PEP del cloroplasto al citoplasma puede no involucrar un intercambio

36

por triosa-P, como en el caso de las especies ME que almacenan almidn, sino un intercambio por
Pi, proveniente quiz de un proceso extracloroplstico de polimerizacin de hexosas (Figura 12D).
A. guadalajarana presenta este tipo de metabolismo (Tabla 8).
En A. sisalana, la relacin inversa entre el contenido de fructanos y cido mlico, sugiere que
estos carbohidratos suministran el sustrato para la sntesis de cido mlico durante la noche;
mientras que durante el da, los fructanos sen sintetizan a partir de la acumulacin de sacarosa en
la vacuola (Izaguirre-Mayoral et al., 1995). Bajo condiciones ambientales favorables muchas
plantas CAM fijan CO2 durante el da a travs de la RUBISCO y por la noche usando la PEPC por
la va CAM (Graham y Nobel, 1996). Hartsock y Nobel (1976) mostraron que un constante riego en
A. deserti fuerza a estas plantas a asimilar CO2 durante el da, sin una diferencia significativa
Tabla 8. Clasificacin taxonmica y comportamiento CAM de algunas especies estudiadas.
Clasificacin

Principal
Decarboxilasa

No.
especies
analizadas

Principal
Carbohidrato
de almacn

Magnoliopsida
(Dicotilednea)
Aizoaceae

ME

Almidn

Cactaceae
Portulacaceae
Clusiaceae
Crassulaceae

ME
PEPCK
PEPCK
ME

5
1
1
9

Almidn

Cucurbitaceae
Euphorbiaceae
Asteraceae
Asclepiadaceae

nd
PEPCK
PEPCK
PEPCK
PEPCK

Liliopsida
(Monocotilednea)
Agavaceae
Dracaenaceae
Asphodelaceae
Orchidaceae
Bromeliaceae

ME
nd
ME
PEPCK
PEPCK
ME
PEPCK
PEPCK

4
5
3

3
2
5
2
16

Fru/Glc
Almidn

Especies analizadas

Mesembryantheum
crystallinum
Opuntia aurantiaca

Almidn

Clusia rosea
Kalanchoe tubiflora,
pinnata, daigremontiana
Xerosicyos danguyi

Almidn
Almidn

Hoya carnosa
Stapelia gigantea

No almidn
Fructanos
Suc
Almidn/Glc
Galactomanano
Almidn
Almidn
Fru/Glc/Suc

Agave guadalajarana
Fourcroya humboldtiana
Sansevieria hahnii
Aloe vera
Aloe arborescens
Vanilla planifolia
Portea petropolitana
Ananas comosus

nd, no determinado. Modificado de Christopher y Holtum, 1996.

37

Figura 12. Estrategias de flujo de carbono propuestas para especies CAM. A) Especies ME
que almacenan almidn cloroplstico, B) Especies PEPCK que almacenan almidn cloroplstico,
C) Especies PEPCK que almacenan carbohidratos extracloro-plsticos. a, NADP-ME citoplsmica
o mitocondrial; b, piruvato-Pi-dicinasa; c, enolasa y fosfogliceromutasa; d, transportador Pi-triosaP; e, PEPCK; MAL, malato; OAA, cido oxalactico; PYR, piruvato; PEP, fosfoenol piruvato; T-P,
triosa-fosfato. En D) Especies ME que almacenan carbohidratos extracloroplsticos; se ejemplifica
para los que almacenan fructanos en la vacuola: GFFm, fructanos; GF, sacarosa; G, glucosa; F,
fructosa; FBP, fructosa 1,6-difosfato; a, fructan exohidrolasa; b, invertasa; c, aldolasa; d, piruvato
cinasa; e, gliclisis; f, PEPC; g, malato deshidrogenasa; h, canal especfico para el transporte de
MAL a la vacuola; i, transportador tipo Pi/TP; j, enzima mlica. Modificado de Christopher y
Holtum, 1996.

38

cuando utilizan el metabolismo CAM (0.63 vs 0.57 nmol cm-2 s-1); sin embargo, A. tequilana parece
ser una planta con metabolismo CAM obligado, desde que plantas micropropagadas no cambian
su funcionalidad estomatal (Santamara et al., 1995).
Las ventajas del metabolismo CAM son evidentes cuando se mide la proporcin de transpiracin
(moles de agua transpirados/moles de CO2 fijados). Este parmetro toma un valor de 50 a 100
para plantas CAM, 200 a 350 para plantas C4 y de 500 a 1000 para plantas C3. Esto significa que
el proceso fotosinttico puede continuar en plantas CAM despus de extensos perodos de sequa
que pueden causar un cese completo de fotosntesis en plantas C3 y restringir severamente la
fijacin de CO2 en plantas C4 (Hopkins, 1995).
1.6.2.3. ACUMULACIN DE FRUCTANOS
El principal producto fotosinttico de los agaves son fructanos, compuestos oligomricos o
polimricos constituidos por unidades -fructofuranosil que se acumulan principalmente en su tallo
(Lpez et al., 2003). El primer reporte de la presencia de este carbohidrato en agaves fue en 1888
(Suzuki, 1993), y aunque no existen evidencias cientficas que comprueben la contribucin de este
compuesto en la adaptacin de los agaves en condiciones hostiles, investigaciones en otras
plantas modelo lo sugieren.

39

2. FRUCTANOS
En el reino vegetal, la mayora de los carbohidratos se encuentran como polisacridos de elevado
peso molecular; algunos son constituyentes estructurales y otros almacn de energa y carbono
(Mancilla-Margalli, 2000). El almidn es el carbohidrato de reserva ms ampliamente distribuido,
seguido de sacarosa, glucomananos y fructanos, siendo este ltimo de gran inters en el
desarrollo del presente trabajo.
Los fructanos se aislaron por primera vez en 1804 por el cientfico alemn Rose a partir de un
extracto de Inula helenium como una sustancia soluble que precipita con alcohol. Thomson (1818)
denomin inulina a esta sustancia que fue descrita en otras especies como Dahlia variabilis,
Helianthus tuberosus (1864), Hordeum vulgare (1878), Phleum pratense (1887), Agave (1888) y
microorganismos como Bacillus levaniformans (1901). Tanret (1891-1893) descubri que la
hidrlisis de esta molcula produce principalmente unidades de fructosa (Fru) y slo una pequea
cantidad de glucosa (Glc) (Susuki, 1993).
En la actualidad se reconoce que los fructanos se encuentran en el 15% de plantas superiores
(45,000 especies), representados principalmente por familias altamente evolucionadas (Tabla 9).
Adems, los fructanos tambin se encuentran en algunos hongos (Aspergillus, Penicillium y
Fusarium), algas (Acetabularia) y en varios taxa bacterianos (Bacillus, Erwinia, Pseudomonas,
Aceobacter, Streptococcus y Actynomices) (Vijn y Smeekens, 1999).

2.1. ESTRUCTURA
Con el establecimiento de la qumica moderna de carbohidratos, el grupo britnico de Norman
Haworth (Premio Nobel de Qumica 1937) realiz estudios para determinar la estructura de la
inulina y sus derivados, concluyendo que est constituida por molculas de Fru unidas por los
carbonos 1 y 2. En 1950 Hirst demostr que la Glc es parte de la molcula y no un contaminante
como se crea anteriormente. En la actualidad se sabe que los fructanos presentan estructuras
variadas y de acuerdo al comit de nomenclatura del Primer Simposio Internacional de Fructanos
(Alemania, 1988) se defini a los fructanos como molculas con uniones -furanosilfructosa
principalmente, y donde la Glc no necesariamente es parte de la definicin.
Las unidades estructurales bsicas de los fructanos se forman por la transferencia de una Fru a
uno de los tres hidroxilos primarios presentes en la sacarosa (Suc, Figura 13). Los trisacridos
formados (DP3) se denominan kestotriosas en honor al lugar donde su potencial industrial fue

40

reconocido (Kingston, Inglaterra) (Suzuki, 1993). La transferencia de una Fru al oxgeno del C1 o
C6 de la Fru en una molcula de Suc genera la 1-kestotriosa (1-Kes) y 6-kestotriosa (6-Kes),
respectivamente, de acuerdo a la nomenclatura propuesta por Waterhouse y Chatterton (1993);
mientras que la adicin de una Fru al oxgeno del C6 de la Glc, genera la neokestosa (6G-Kes).
La 1 y 6-kestotetraosa (o bifurcosa) por su parte, es un tetrasacrido (DP4) ramificado, es formado
por la transferencia de una Fru al grupo hidroxilo disponible del carbono 6 o 1 en la Fru interna de
la 1-Kes o 6-Kes, respectivamente (Figura 13). La subsecuente transferencia de Fru a cualquiera
de estos ismeros forman polmeros que de acuerdo al tipo de enlace se clasifican como sigue:
Tabla 9. Ocurrencia de fructanos en Angiospermas.
Familias
Monocotiledneas
Poales
Gramineae
Asparagales
Amaryllidadeae
Agavaceae
Haemodoraceae
Iridaceae
Alliaceae
Xanthorrhoeaceae
Dicotiledneas
Asterales
Compositae
Campanulales
Stylidiaceae
Goodeniaceae
Dipsacales
Calyceraceae
Polemoniales
Boraginaceae
Menyanthaceae
Polemoniaceae
Ericales
Pyrolaceae
Clethraceae
Total

Especies Regin de mayor distribucin

estimadas

8,000

Fro-templado clido

1,100
700
100
1,800
3,500
60

Templado clido-tropical
Semirido-tropical
Tropical-subtropical
Cosmopolita
Cosmopolita
rido subtropical

25,000
1,800
150
300

Cosmopolita
Templado
Semirido
Semirido

60
2,000
40
300
40
120
45,000

Semirido
Templado-subtropical
Cosmopolita-acutica
Clido-templado fro
Templado fro-subtropical
Subtropical-tropical

Se indica la distribucin de estas especies. Modificada de Hendry y Wallace, 1993.

41

Figura 13. Unidades estructurales de los fructanos. Las kestotriosas se forman por la
transferencia de una -fructosil-transferencia a cualquiera de los hidroxilos primarios de la
sacarosa. El tetrasacrido ramificado, bifurcosa, se genera por transferir una fructosa a una
kestotriosa.
i).- Inulina, polmero lineal de unidades D-Fruf con enlaces (2-1) y una Glc en el extremo (G12F1-2). Esta molcula se encuentra principalmente en dicotiledneas y ha sido ms estudiada en
Asteraceae como achicoria (Cichorium intybus), alcachofa Jerusalem (Helianthus tuberosus),
alcachofa (Cynara scolymus), diente de len (Taraxacum officinale), dalia (Dahlia variabilis) y
yacon (Polymnia sonchifolia) (Van Laere y Van den Ende, 2002).
ii).- Levano (o especficamente flena cuando se refiere a plantas), es un polmero lineal con
enlaces (2-6). Su unidad estructural es la 6-Kes (G1-2F6-2Fn). Se encuentra en pastos como
Phleum pratense y Dactylis glomerata. En general, las bacterias productoras de fructanos
presentan este tipo de estructura, con pocas excepciones como Streptococcus mutans que
produce inulinas.

42

iii).- Graminano, fructano que contiene ambos tipos de enlace. Generalmente son estructuras
ramificadas con bifurcosa como unidad bsica. Se encuentra en algunas Poaceae como trigo
(Triticum aestivum) y cebada (Hordeum vulgare) (Pavis et al., 2001).
iv).- Inulina neoserie, estructuralmente basada en la 6G-Kes (mF2-1F2-6G1-2F1-2Fn). Es un
polmero formado por adiciones de Fru a uno o ambos extremos de la 6G-Kes mediante enlaces
(2-1). Las Asparagaceae como esprrago (Asparagus officinalis) y cebolla (Allium cepa) son
algunos ejemplos (Ritsema et al., 2004).
v).- Levano neoserie, polmero similar a la inulina neoserie pero sus enlaces son de tipo (2-6).
Este es el fructano menos comn, se presenta en pocas especies de Poales como avena (Avena
sativa) y Lolium spp. (Pavis et al., 2001a).
vi).- La serie inulo-n-osa (donde n indica el nmero de unidades de Fru, inulobiosa, inulotriosa, etc,
hasta n=18), se ha encontrado en algunas especies de Asteraceae. Pensando que podran ser
productos de hidrlisis, se busc sin xito la presencia de alguna -glucosidasa y slo
recientemente se ha evidenciado que forman parte del metabolismo de los fructanos (Van den
Ende et al., 1996b).

2.1.1. MTODOS ANALTICOS

Las estructuras de fructanos se han elucidado con tcnicas analticas que separan y/o identifican
los diferentes ismeros. La cromatografa en papel y en capa fina (TLC), fueron las primeras
tcnicas usadas en la identificacin de fructanos. Dependiendo de la fase estacionaria
(generalmente silica gel) y el sistema de eluyentes, pueden resolverse fructo-oligosacridos (FOS)
hasta de 14 unidades o grado de polimerizacin (DP) e incluso es posible identificar los tres
ismeros de kestotriosa (Sims et al., 1992; Cairns et al., 1999). La cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC) tambin ha sido utilizada con columnas de silica aminada y de fase reversa C8
y C18 usando agua para eluir los carbohidratos (Bancal et al., 1993).
El pKa de los OH en los carbohidratos, oscilante entre 12 y 13, se aprovecha en la separacin de
fructanos en soluciones alcalinas, a travs de la cromatografa de intercambio aninico de alta
resolucin acoplado generalmente, a un detector de pulso amperomtrico (HPAEC-PAD).
Utilizando las columnas PA1 (preparativa) o PA100 (analtica), los fructanos se eluyen con un
gradiente creciente de acetato de sodio, manteniendo constante el NaOH cuya concentracin
determina la resolucin de los compuestos. En esta cromatografa, el in acetato se intercambia

43

por el anin carbohidrato, desplazando as a los diferentes fructanos. Por su parte, la deteccin del
PAD se basa en la medicin de la corriente producida por la oxidacin de los carbohidratos en un
electrodo de oro (Bancal et al., 1993).
En la caracterizacin de fructanos, una herramienta concurrida es la resonancia magntica nuclear
(NMR), principalmente de 13C y con menor frecuencia de H, donde los desplazamientos qumicos
de Suc, inulina, levanos y graminanos han sido determinados (Carpita et al., 1991; Praznik et al.,
1992; Shiomi, 1993; Pavis et al., 2001a; Sims, 2003). Esta tcnica no destructiva generalmente se
complementa con la cromatografa de gases (GC) de fructanos derivados a alditol acetato
parcialmente metilados (PMAA). En esta tcnica los OH libres de la molcula son completamente
metilados por la adicin de CH3I y posteriormente hidrolizados, generando monosacridos con
nuevos grupos OH que son reducidos y acetilados (Carpita y Shea, 1989). Los PMAA son
separados en un GC acoplado a un espectrmetro de masas (MS) para su identificacin o a un
detector de ionizacin en flama (FID) para fines cuantitativos (Addison y Ackman, 1968; Jorgensen
et al., 1990).

2.1.2. ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL

Los fructanos se encuentran en las plantas como una mezcla polidispersa de variados DP,
pudiendo presentar distintas estructuras an en el mismo tejido. A pesar de esta diversidad, se ha
determinado que cada especie acumula fructanos con una estructura e intervalo de DP
caracterstico (Figura 14A). Por ejemplo, las dicotiledneas generalmente almacenan inulina
(Vergauwen et al., 2003) y dentro de stas, achicoria y cardo (Echinops ritro), pertenecientes al
orden Asteracea, presentan fructanos de distinta longitud, hasta 20 y 45 DP, respectivamente
(Figura 14B). Esta diferencia se atribuye a diferentes propiedades cinticas de las
fructosiltransferasas (FT), enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos. Las FT de
achicoria tienen mayor afinidad a los inulo-oligosacridos (IOS), mientras que las de cardo lo son a
inulinas de mayor DP (Hellwege et al., 1998; Vergauwen et al., 2003).
De igual manera, la diversidad de estructuras presente en monocotiledneas parece seguir un
patrn taxonmico (Cairns y Ashton, 1993). Bonnet et al. (1997) propusieron que la determinacin
estructural es un criterio confiable en la clasificacin de las tribus que conforman a la familia
Poaceae (Tabla 10); por ejemplo, la tribu Triticeae con los gneros Triticum, Secale, Hordeum,
Elytrigia presentan graminanos, en tanto que la tribu Aveneae, con los gneros Avena y Lagurus,

44

contienen predominantemente levanos y neofructanos en menor cantidad. Este criterio es apoyado

por la identificacin de estructuras de fructanos en miembros del orden Asparagales (Sims et al.,
2001; Sims, 2003). En estas especies se encuentra una diversidad de estructuras, siendo ms
parecidas aquellas en especies taxonmicamente ms relacionadas; por ejemplo, especies de
Phormium tenax y P. cookianum (familia Phormiaceae), Cordyline australis (Asteliaceae) y Agave
vera cruz (Agavaceae) contienen fructanos basados en 1-Kes, 6G-Kes y bifurcosa; mientras que
gneros ms alejados como Allium cepa (Alliaceae) y Asparagus officinalis (Asparagaceae)
presentan estructuras lineales predominantemente con Glc interna (Sims et al., 2001).

2.2. METABOLISMO
Los fructanos se sintetizan en la vacuola como respuesta a la acumulacin de sacarosa (Suc) en
este organelo, por la accin de una serie de enzimas conjuntamente denominadas
fructosiltransferasas (FT). De acuerdo al modelo clsico de Edelman y Jefford (1968), la sntesis
de inulina en H. tuberosus, inicia con la enzima sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST,

Figura 14. Rango de grados de polimerizacin (DP) en especies que acumulan fructanos. A)
Porcentaje acumulativo de DP (modificado de Van Loo et al., 1995); B) Patrn cromatogrfico
HPAEC-PAD caracterstico de achicoria y cardo. G, Glc; F, Fru; S, Suc; K, 1-Kes; N, Nys; F2,
inulobiosa; F3, inulotriosa; F4, inulotetraosa; los nmeros indican los DP de la serie inulina.
Modificado de Vergauwen et al., 2003.

45

Tabla 10. Predominancia estructural de los fructanos segn la especie.

Especie
Estructura
Rango promedio DP
ASTERALES
2-19 20-40 >40
Cichorium intybus
Helianthus tuberosus
Taraxacum officinale
Cynara scolymus
Dahlia variabilis
POALES
Tribu Triticeae
Triticum aestivum
Hordeum vulgare
Tribu Bromeae
Bromus tectorum
Tribu Aveneae
Avena sativa
Lagurus ovatus
Tribu Poeae
Lolium rigidum
Lolium perenne
Dactylis glomerata
ASPARAGALES
Alliaceae
Allium sativa
Allium cepa
Allium amploprasum
Asparagaceae
Asparagus officinalis
Agavaceae
Agave vera cruz
Agave deserti
Phormiaceae
Phormium tenax
Phormium cookianum
Bulbinella hookeri

Inulina, inulo-n-osa
Inulina, inulo-n-osa
Inulina, inulo-n-osa
Inulina
Inulina

55
74
41
31

18
20
31
13
21

17
6
28
87
40

Referencia
157, 201
157, 58
157, 58
157, 76
157

graminanos/ramificados
graminanos/ramificados

20
20

graminanos/ramificados

20

Levanoneoserie
Levanoneoserie

20, 224
20

Inulina, inulineoserie, graminanos,

levanos
Inulina, neofructanos, levanos,
ramificado
levanos

20, 148
148
20, 148

Inulineoserie
Inulineoserie
Inulineoserie

30
100
80

40
16

30
4

215
215
215

Inulineoserie

180

Ramificado
Inulina, neofructano

51
228

Inulina, neofructano, ramificado

Inulina, neofructano, ramificado

182
182

Inulina*

183

*, primer reporte de una especie miembro del orden Asparagales que contiene inulina como
fructano predominante.
E.C.2.4.1.99) que transfiere irreversiblemente unidades de Fru de una molcula de Suc donadora
a otra Suc receptora a travs de un enlace (2-1) (Gupta y Kaur, 2000; Figura 15):
G-F
donadora

G-F

G-F-F

receptora

46

Una segunda enzima, la fructan:fructan 1-fructosiltransferasa (1-FFT, E.C.2.4.1.100), elonga la

cadena transfiriendo reversiblemente unidades de Fru de un fructano a otro o incluso a Suc, que
tambin acta como aceptor de Fru:
G-(F)m +

G-(F)n

G-(F)m-1 +

G-(F)n+1

donde m > 1 y n > 0

De la diversidad estructural en monocotiledneas, es evidente la participacin de otras FT en la

sntesis de enlaces (2-6) y ramificaciones. Satyanarayana (1976a) report actividad 1-SST en
una fraccin cromatogrfica de Agave vera cruz, y la presencia de 1-FFT fue tambin sugerida
para explicar la sntesis in vitro de 1,1-kestotetraosa (DP4 inulina o Nys) e IOS superiores
formados despus de tiempos mayores de incubacin (Satyanarayana, 1976b); sin embargo,
durante el ensayo enzimtico no hubo formacin de fructanos basados en 6G-Kes ni estructuras
con enlaces (2-6) ni molculas ramificadas como se observa in vivo (Satyanarayana, 1976c).
Dorland et al. (1977) discutieron la posible actividad para una fructosil-transferencia al C6 de la Glc
de 1-Kes o fructanos superiores (formacin de neofructanos). Este tipo de actividad denominada
fructan:fructan 6-glucosa-fructosiltransferasa (6G-FFT) fue primeramente descrita en cebolla
(Henry y Darbyshire, 1980) y ajo (Darbyshire y Henry, 1981), y posteriormente purificada de races
de esprrago (Shiomi 1981; 1982). La actividad caracterstica de esta enzima es la formacin de
FOS con residuos de Glc interna por la transferencia de Fru de la 1-Kes o IOS a Suc o IOS
formando un enlace (2-6) sobre el C6 de la Glc (Ritsema y Smeekens, 2003; Ueno et al., 2005).
Esta reaccin es reversible: la 6G-FFT transfiere Fru de la 6G-Kes a la Suc formando 1-Kes,
aunque a una velocidad mucho menor (Shiomi, 1982):
G-F-Fm +

G-Fn

G-Fm-1 +

F-G-Fn+1

m, n 1

Los enlaces (2-6) de graminanos y levanos presentes en Poaceae, se forman por accin de la
sacarosa:fructan 6-fructosiltransferasa (6-SFT, E.C. 2.4.1.10). Esta enzima utiliza Suc como
donador de Fru a una amplia variedad de fructanos de diferente estructura y DP, formando
exclusivamente enlaces (2-6). La 6-SFT a diferencia de la 1-FFT, usa fructanos como fructosil-

47

Figura 15. Diferentes vas biosintticas de fructanos en plantas superiores. En plantas que sintetizan fructanos, la acumulacin vacuolar de
sacarosa induce la sntesis de novo de la 1-SST y acumulacin de 1-kestotriosa. La accin de diferentes fructosiltransferasas sobre este
metabolismo genera la diversidad estructural encontrada de manera especfica en cada especie.

48

aceptores pero no como donadores (Duchateau et al., 1995); esta caracterstica no es trivial, ya
que la fructosil-transferencia de Suc a fructanos es exergnica e irreversible (Figura 15).
Al parecer, la 1-Kes es el metabolito central a partir del cual se forman las diversas estructuras por
accin de distintas FT, lo que implica que la 1-SST es ubicua en las plantas que almacenan
fructanos. Sin embargo, la presencia de 6-Kes principalmente en gramneas, ha sugerido la
existencia de una 6-SST, actividad an no confirmada. Chatterton y Harrison (1997) apoyaron esta
idea al observar que Poa ampla crecida en un rgimen de 10/5C da/noche present
exclusivamente levanos pero nunca 1-Kes. Por otra parte, la expresin heterloga de la 6-SFT en
tabaco (Sprenger et al., 1995 y 1997) evidenci que en presencia nicamente de Suc, la 6-SFT
acta como invertasa (78%) pero tambin usa la Suc como aceptor formando la 6-Kes (20%) e
incluso tambin acta como 1-SST al sintetizar 1-Kes (15%). La caracterstica de transferasa de
esta enzima cambia significativamente de acuerdo al sustrato (Duchateau et al., 1995;
Hochstrasser et al., 1998):
G-F

donador

G-F

1-Kes

donador

G-F

G-F-F
G-F

G-F(F)-F

1y 6-kestotetraosa (bifurcosa)

aceptor

donador

H2O

Actividad 6-SFT

G-F-F
6-Kes

Actividad 6-SST

F
Actividad -fructosidasa

aceptor

En el proceso de degradacin de fructanos participan la 1-FFT y las fructan exohidrolasas (FEH,

E.C.3.2.1.80). La 1-FFT transfiere Fru de fructanos a la Suc o fructanos con DP menor; mientras
que las FEH con actividad exoltica hidrolizan la Fru del extremo reductor del sustrato,
disminuyendo en uno su DP (De Roover et al., 1999; Van den Ende et al., 2004):
G-F-(F)m

H2O

G-(F)m-1 +

m 1

Basado en la diferencia de energa libre de los enlaces glicosdicos, las FEH exhiben especificidad
de sustrato, por lo que se clasifican como 1-FEH o 6-FEH si hidrolizan preferentemente enlaces
(2-1) o (2-6), respectivamente (Henson y Livingston, 1996). Recientemente, se caracteriz en
trigo la 6-kestosa exohidrolasa (6-KEH), una FEH altamente especfica a la 6-Kes, y a diferencia
de todas las dems, no es inhibida por Suc (Van den Ende et al., 2005). As mismo, en achicoria
existen isoformas (1-FEH I, 1-FEH IIa, 1-FEH IIb) con diferentes puntos isoelctricos (pI) (Tabla

49

11), propiedades cinticas y patrn de expresin. La clasificacin de las FEH como E.C.3.2.1.80
es inexacta, pues esto refiere a las -fructofuranosidasas, enzimas capaces de hidrolizar fructanos
y Suc; mientras que las FEH son inactivas ante Suc e inactivadas por este mismo metabolito (De
Coninck et al., 2005). Algunas FEH son solubles en la vacuola mientras que otras insolubles
interactan con la pared celular. Hasta hace poco se crea que la FEH asociada a la pared celular
no tena contacto con su sustrato; sin embargo, Livingston y Henson (1998) demostraron la
presencia de fructanos en el apoplasto de avena.

2.2.1. COMPLEJIDAD METABLICA

El modelo 1-SST/1-FFT propuesto por Edelman y Jefford (1968), fue severamente criticado por la
posible presencia de artefactos en ensayos enzimticos (la invertasa puede sintetizar los DP3),
con frecuencia los fructanos sintetizados in vitro no corresponde con aquellos presentes en los
tejidos e incompatibles caractersticas cinticas de las enzimas con condiciones de sustrato in vivo
(Cairns y Ashton, 1991; Cairns, 1993). La purificacin a homogeneidad de algunas enzimas
(Koops y Jonker, 1996; Van den Ende and Van Laere, 1996b; Van den Ende et al., 1996a,b,c;
Lscher et al., 1996; 2000) y la expresin heterloga de sus ADNc (Tabla 11) han permitido la
validacin del modelo y una caracterizacin refinada; encontrndose que el metabolismo es
complejo, las enzimas tienen actividades traslapadas que dependen de la concentracin y tipo de
sustrato, sus propiedades cinticas pueden ser solo estimadas, un mismo factor induce una
actividad e inhibe otra. Las enzimas anablicas, catablicas y sus sustratos se encuentran en el
mismo compartimento vacuolar, lo que implica un control enzimtico altamente regulado.

2.2.2. CARACTERIZACIN BIOQUMICA

La acumulacin de Suc en la vacuola es un punto de control en el metabolismo de fructanos; sta
induce la sntesis de novo de la 1-SST e inhibe al mismo tiempo a la FEH, indicando una
regulacin transcripcional de ambos genes de manera opuesta (Asega y Machado, 2004). La
concentracin umbral de Suc que induce la sntesis de fructanos depende de la especie e incluso
del tejido (Pavis et al., 2001b); por lo general el valor de la Km de 1-SST es alto y el de la FEH es
bajo (Tabla 11), hecho crtico para que ambas reacciones se lleven a cabo en el mismo organelo.
Aunque el metabolismo puede ser distinto en cada especie, se ha mostrado en trigo, achicoria,
yacon y Lolium temulentum la actividad simultnea de estas dos enzimas, sugiriendo que la FEH

50

Tabla 11. Propiedades cinticas de distintas fructosiltransferasas.

Enzima
1-SST
1-SST5
1-SST5

Origen

1P.M.

Helianthus
tuberosus
Hordeum
vulgare
Helianthus
tuberosus

(kDa)
55 y
27
50 y
22
59 y
26

2pI

4.93 &
4.99
4.89, 4.94, 4.98,
5.02, 5.09

1-FFT

Cichorium
intybus

52 y
17

4.3

6-SFT5,6

Hordeum
vulgare

49 y
23

4.9 & 5.1

6G-FFT

Allium
cepa

52 y
25

6GFFT6
1-FEH
1-FEH II

Asparagus
officinalis
Triticum
aestivum
Cichorium
intybus

3pH

4T

op
3.5-5

op
2025
nd

nd

5.56.5

5.68

68

5.4

70

4.9

64

5.2

nd

5.3

Donador

Aceptor

Producto

Comentario

Referencia

Suc

Suc

DP3>DP4

102

Suc
1-Kes
Suc

Suc
Agua
Suc

113

1-Kes

Agua
1-Kes

1-Kes Km 13 mM >
1-Kes Km 119 mM
>
DP4 Km 152 mM >
DP5 <
fructanos DP <
DP+1
Suc

Suc >
1-Kes >
Nys >
FOS >
Fructanos
DP+1

1-Kes
Suc + F
1-Kes>Nys
>DP5
Suc
Nys>DP5
1-Kes
DP4-7
DP + 1
DP + 1
DP + 1

6-Kes+Fru
Fru + Glc
Bifurcosa
6G-Kes, DP4-6 neo &
inulina
6G-Kes
1-Kes
6G-Kes,
Neo >>IOS

53

1-Kes, Km 83 mM

Suc >
Agua
1-Kes
1-Kes

6G-Kes
1-Kes

Suc
Suc
Suc, IOS

112

206

59

201
213

5.5

35

(2-1)>(2-6)

Agua

DP-1 + Fru

Inhibicin por Suc, Ki

5.9 mM

48

51

1-FEH IIa
6-FEH
6-FEH

Cichorium
intybus
Dactylis
glomerata
Lolium
perenne

5.2
57
69

Inhibicin por Suc, Ki 6 mM

5.5

4.7

5.1-5.6

nd

agua

Inhibicin por Suc

119

agua

DP-1 + Fru
DP-1 + Fru
Glc + Fru
DP-1 + Fru

Inhibicin por Suc, Ki, 134 mM

213

agua

Suc + Fru

No inhibida por Suc

215

36, 20, 19

6-KEH6,7

Triticum
aestivum
Triticum
aestivum
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana

72

4.9

70

4.9

~ 72

5.4

Levanos

agua

levano-1 + Fru

45

~ 72

4.9

levanos > inulina

agua

DP-1 + Fru

45

1,

nd

DP-1 + Fru

Beta
vulgaris

6-FEH
AtcwINV3
1,6-FEH
AtcwINV6

30

agua

6-FEH7

1-FEH

5.0

levano Km 91 mM > graminano >

inulina
levano
bifurcosa > inulina >
Suc
levanos
neolevanos
levanbiose
6-kes, Km77mM
6-Kes Km, 29
alta/especfico

212

Peso molecular; 2, punto isoelctrico; 3, pH ptimo de reaccin; 4, temperatura ptima de reaccin;5, isoformas; 6, funcionalidad ensayada en

sistemas heterlogos; 7, localizacin apoplstica.

52

tambin influye en el patrn de fructanos acumulados (Itaya et al., 2002; Van den Ende et al.,
2003a).
En trigo, la Suc induce la 1-SST y 6-SFT comportamiento totalmente abolido en presencia de
cordicepina o cicloheximida, inhibidores de la transcripcin y traduccin, respectivamente,
indicando una regulacin a estos niveles (Figura 16A) (Martinez-Nel et al., 2001). En presencia
de un inhibidor de invertasa vacuolar (2,5-dideoxi-2,5-imino-D-manitol. Dim) la Suc an induce la
expresin, indicando que esta accin se debe a sta y no a sus productos de degradacin (Mller
et al., 2000), al parecer esto es independiente de hexocinasas y quizs a travs de una cascada
de transduccin de seales que involucra receptores de membrana, segundos mensajeros,
proten-cinasas y factores de transcripcin (Figura 16B) (Mller et al., 2000; Martinez-Nel et al.,
2001) ). Probablemente, al ser la Suc citoslica la pequea fraccin de Suc total (la mayor parte
se almacen en la vacuola como fructanos) responde a pequeos cambios citoslicos regulando la
expresin de estos genes (Nagaraj et al., 2004). Sin embargo, la regulacin de los transcritos 1SST y 6-SFT parece ser distinta: la acumulacin de Suc induce la expresin inmediata de 1-SST y
acumulacin de 1-Kes, y solo despus de una fase lag se observa la expresin de 6-SFT y la
sntesis de sus productos (Figuras 16C y 16D); adems tambin se ha observado que el ARN de
la 6-SFT decrece con el tiempo a pesar de que la Suc se mantiene constante (Lu et al., 2002). Por
su parte, la actividad constitutiva de 1-FFT participa en la flexibilidad metablica de los fructanos a
travs de su naturaleza reversible, elongando o acortando las molculas de acuerdo a la
concentracin de los sustratos, de la misma enzima y de la relacin (1-SST+1-FFT)/Suc (Van den
Ende y Van Laere, 1996c). Las propiedades cinticas de la 1-FFT que la hacen ms afn a un
sustrato o a otro son especficas para cada especie (Hellwege et al., 1998; 2000), aunque el
patrn de los fructanos tambin depende de la concentracin de las FT: a mayor concentracin de
enzima se sintetizan fructanos de mayor DP (Van den Ende y Van Laere, 1996a). La Suc no es
donador para la 1-FFT pero puede ser un buen aceptor (Km 0.2-6 mM), formndose rpidamente
la 1-Kes seguido de una fase lag para la sntesis de fructanos superiores, por lo que una
concentracin umbral de 1-Kes/Suc debe alcanzarse para que la 1-Kes compita eficientemente
como aceptor (Van den Ende et al., 1996b). Cuando esta relacin alcanza un valor de 1.5
(determinada in vitro en achicoria) la 1-SST acta como 1-FFT y sintetiza IOS hasta DP5 (Van den
Ende et al., 1996c).

53

Figura 16. Regulacin de la actividad de fructosiltransferasas. En A) y B) las hojas de trigo

fueron cortadas y puestas en oscuridad en una solucin de Suc 0.5 M o de Suc ms el inhibidor
indicado: A) C, control (agua); S, Suc 0.5 M; CHX, cicloheximida 5 g/mL (inhibidor de la
traduccin); COR, cordicepina 200 g/mL (inhibidor de la transcripcin). B) S, Suc 0.5 M; G,
genistena 100 M (inhibidor de tirosin-proten cinasa); TFP, trifluoroperazina 200 M (inhibidor de
la estimulacin dependiente de calcio de la 3:5-nucletido cclico fosfodiesterasa); W7, N-(6aminohexil)-5-cloro-1-naftaleno sulfonamida 200 M (antagonista de calmodulina); ST,
staurosporina 2 M (inhibidor de proten-cinasas dependdiente de calcio; OA, cido okadaico 1 m
(inhibidor de proten fosfatasas). En C) y D) hojas de cebada cortadas fueron expuestas a luz para
inducir la acumulacin de fotosintatos; C) Actividades de 1-SST y 6-SFT; D) Expresin de los
transcritos de 1-SST y 6-SFT; el transcrito de ubiquitina es utilizado como referencia. Modificada
de Martinez-Noel et al., 2001 y Nagaraj et al., 2004.

54

La Inv-V (E.C.3.2.2.26 G-F G + F) est involucrada tambin en el metabolismo de fructanos.

Esta enzima no solo se localiza en la vacuola y regula el nivel de Suc, sino que adems compite
por este sustrato con alta afinidad (Km 2-34 mM para actividad Inv vs 100-500 mM para actividad
FT), hidroliza los DP3 y en alta concentracin de Suc los sintetiza (Km 100-300 mM) (Cairns y
Ashton, 1991; Kingston-Smith et al., 1999); mientras que en baja concentracin de sustrato y
temperaturas altas, las FT actan como Inv-V (Van den Ende et al., 1996c). La activacin de la
Inv-V disminuye la concentracin de Suc e induce la actividad de la FEH. La Fru acumulada por el
ataque exoltico de fructanos inhibe a su vez a la Inv-V (Ki 2.5 mM en L. temulentum y 118 mM en
H. vulgare) (Kingston-Smith et al., 1999; Wang et al., 2000) y en Asteraceae, sta es aceptor de 1FFT (Km 199 mM), formndose la serie inulo-n-osa observada en estas especies durante el
invierno o en el florecimiento (Van den Ende et al., 1996b). La acumulacin de Suc o Fru
desplazan el equilibrio de la 1-FFT hacia el catabolismo, acortando el DP de los polmeros al usar
la Fru o Suc como fructosil-aceptores (Van den Ende et al., 1996b).
Una actividad intrnseca de 1-FFT ha sido confirmada recientemente en la 6G-FFT de cebolla
(Fujishima et al., 2005) y de Lolium perenne (Lasseur et al., 2006). La expresin de sus
respectivos ADNc en sistemas heterlogos mostr que estas enzimas sintetizan IOS a partir de 1Kes (Vijn et al., 1997; Ritsema et al., 2003; Lasseur et al., 2006). En clulas de tabaco, la 6G-FFT
produjo un patrn de fructanos similar a lo encontrado en el tejido usando 1-Kes como nico
sustrato, por lo que Ritsema et al. (2003) proponen que en cebolla, un sistema de dos enzimas (1SST/6G-FFT) es suficiente para la sntesis de fructanos. Fujishima et al. (2005) refuerzan esta
idea al caracterizar la enzima purificada. Este sistema parece diferente en esprrago, cuya enzima
presenta alta especificidad de 6G-FFT sin otra actividad aparente; su alta actividad relativa 1FFT/6G-FFT, sugiere que esta especie presenta un sistema de tres enzimas (1-SST/1-FFT/6GFFT). La 6G-FFT purificada de Lolium spp., no es capaz de sintetizar DP>6 ni explicar la
presencia nativa de neolevanos de alto peso molecular (St John et al., 1997); sin embargo la
caracterizacin molecular de la 6G-FFT en Lolium perenne, demostr una actividad 1-FFT para
esta enzima (Lasseur et al., 2006).

2.2.3. CARACTERIZACIN MOLECULAR

El primer ADNc aislado de una FT vegetal fue la 6-SFT de cebada (Sprenger et al., 1995), seguido
de muchas otras. La caracterizacin molecular de estos ADNc han deducido algunas

55

generalidades para las FT: los heterodmeros que conforman a estas enzimas se codifican en un
solo marco de lectura (ORF) traducido en un producto de 85 kDa que es procesado
postraduccionalmente en un subunidad larga N-terminal de 60 kDa y una subunidad pequea Cterminal de 25 kDa (Altenbach et al., 2004). En sistemas heterlogos, los ADNc expresados no
se procesan en dos subunidades como ocurre in planta, pero su anlisis funcional sugiere que
este hecho no es necesario para la actividad (Lscher et al., 2000). Aunque se sabe poco del
mecanismo de regulacin de las FT, durante el mapeo del gen de la 6-SFT en distintas variedades
de cebada, se observ que a pesar de una alta homologa, existe polimorfismo en regiones
codificadoras y principalmente intrnicas, que pueden contribuir a regular la expresin del gen y
determinar la variacin estructural y cuantitativa de los fructanos presentes en gramneas (Wei et
al., 2000).
La similitud de actividades en Inv-V y FT es confirmado por la alta identidad de aminocidos entre
estas enzimas (del 42 a 56% de identidad) (ver ms adelante), despertando el inters de posibles
relaciones moleculares y evolucin funcional (Kawakami y Yoshida, 2002). Se sugiere que las FT
derivaron de las Inv-V por pequeos cambios mutacionales en su secuencia codificadora, hecho
sugerido porque la levansucrasa de Bacillus subtilis cambia sus actividades de polimerasa a
hidrolasa con una nica sustitucin de arginina-331 en su secuencia (Chambert y Petit-Glatron,
1991).
A diferencia de las FT, se han aislado pocos ADNc de FEH: 1-FEH I, IIa y IIb de achicoria,
Campanula rapunculoides, 6-FEH y 6-KEH de trigo y tambin sorprendentemente de especies que
no sintetizan fructanos como la 6-FEH de betabel y dos de Arabidopsis thaliana (AtcwINV3 es una
6-FEH y AtcwINV6 hidroliza ambos enlaces) (De Coninck et al., 2005). El anlisis de aminocidos
muestra que dichas enzimas, tienen mayor similitud a las invertasas de pared celular (Inv-cw) (43
a 59%) que a Inv-V (40 a 41%). Van den Ende et al. (2004) especulan que las FEH evolucionaron
a partir de -fructosidasas extracelulares de bajo pI que degradaban Suc y fructanos, como
algunas enzimas microbianas actuales, y cuya especializacin se dio para evitar interferencias en
acciones hidrolticas de la FEH con procesos de carga y descarga de la Suc al floema. Las FT
pudieron dar lugar a las FEH vacuolares por la fusin de una seal de direccin vacuolar a una
FEH extracelular preexistente.

56

2.2.4. FAMILIA GH32

Las enzimas glicosilhidrolasas (GH), se clasifican en 90 familias en base a la similitud de su
secuencia de aminocidos que implica una relacin mecanstica y en estructura tridimensional
(3D). Las Inv, Suc-6-fosfato-hidrolasas, inulinasas, levanasas, FT de hongos y vegetales estn
clasificadas en la familia GH32 (Figura 17); mientras que las FT bacterianas e invertasas de la
bacteria Zymomonas mobilis y Bacillus sp. pertenecen a la familia GH38. Estas dos familias se
agrupan en el clan GH-J y junto con el clan GH-F (familias GH43 y 62) forman la superfamilia furanosidasa (Pons et al., 2004).
I

.
Gd-LsdA
Bs-Lev
Tm-Inv
Dc-Inv
Ao-Inv
Ac-6GFFT

II

APHAAD---TPQWRPVLHFSPAAYWMNDPNGPILLDGVYHLFYQYAPGSMTWGHPSWGHA
ADAADSSYYDEDYRPQYHFTPEANWMNDPNGMVYYAGEYHLFYQYHPYGLQWGPMHWGHA
-----------MFKPNYHFFPITGWMNDPNGLIFWKGKYHMFYQYNPRKPEWGNICWGHA
PSYPWTNDMLSWQRTSFHFQPQENWMNDPNGPLFHMGWYHLFYQYNPDSAIWGNITWGHA
GQYPWTNKMLSWQRTGFHFQPEKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPNAAVWGDIAWGHA
-EFPWTNDMLAWQRCGFHFRTVRNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNKDFAYWGNITWGHA
.
:
** .
:****.* :
* **:***:
**
****

89
81
49
177
164
117

III
Gd-LsdA
Bs-Lev
Tm-Inv
Dc-Inv
Ao-Inv
Ac-6GFFT

TSTDLLHWTEHGVAIAATP--GEEIFSGSLVPDPLNRSGLGSTDAPPLLAFHTSVFHDNP
VSKDLVTWEHLPVALYPDE--KGTIFSGSAVVDKNNTSGFQTGKEKPLVAIYT------VSDDLVHWRHLPVALYPDDETHG------------VFSGSAVEKDGKMFLVYTY--YRDP
ISRDLINWLHLPFAMQPDQ--WYDING-------VWTGSATILPDGKIVMLYTG--DTDD
VSKDLLSWRHLPLAMVPDR--WYDING-------VWTGSATILPDGRIIMLYTG--ATNE
VSRDLINWQHLPVAVGPDH--WYDISG-------VWTGSIIVVSEDRVVMLFTG--GTKS
* **: * . .*: .
..:
.
..
:. ..*
.

147
132
95
226
213
166

IV
Gd-LsdA
Bs-Lev
Tm-Inv
Dc-Inv
Ao-Inv
Ac-6GFFT

AHPDGTQAQSVSVSHDGGFTWRPYAH-NPVLTLHPDSR--QFRDPSVFWYQD-GGC....
QDREGHQVQSIAYSNDKGRTWTKYAG-NPVIP-NPGKK--DFRDPKVFWYEK-EKK....
THNKGEKETQCVAMSENGLDFVKYDG-NPVISKPPEEGTHAFRDPK---VNRSNGE....
LVQVQNLAYPANLSDPLLLDWIKYPD-NPVMFPPPGIGSTDFRDPTTAWIGP-DGK....
SVQVQNLAVPADLSDPLLLEWTKVDDANPILVPPPGVGATDFRDPTTAWFEPSDST....
FDQSINLAEAADPSDPLLLKWIKYDN-NPILWPPPGIVRDDFRDPNPIWYNASEST....
:
**::
*
****.

V
Gd-LsdA
Bs-Lev
Tm-Inv
Dc-Inv
Ao-Inv
Ac-6GFFT

VI

WLDHGADQYATTLFA...
WTDYGRDFYAAVSWS...
LLDHGTDFYAAQTFF...
RLDYG-KYYASKTFY...
RYDLG-KFYASKTFY...
RYDWG-KFYASRTFF...
* . **:

199
183
147
280
269
221

320
295
246
402
396
354

.....
.....
.....
.....
.....
....

EVALHLVVDRASVELFANDGVLRMTDLIFPP
KVKLRIFVDRSSVEVFGNDGKQVITDIILPD
--RIRAFLDSCSVEFFFNDS-IAFSFRIHPE
SLSMRLLVDHSIVESFAQGGRTVITSRVYPT
TLSLRILVDHSIVESFAQGGRASATSRVYPT
TFAVRILVDHSVIESFAMGGRTSATSRAYPT
:: .:* . :* * ..
:
*

507
484
407
619
615
572

: .

Figura 17. Alineamiento de protenas pertenecientes a las familias GH32 y GH68. En las
cajas negras se muestran las secuencias conservadas en estas protenas. Gd-LsdA, levansucrasa
de Glucanoacetobacter diazotrophicus (GH68); Bs-Lev, levansucrasa de Bacillus subtilis (GH68);
Tm-Inv, invertasa de Thermotoga maritima; Dc-Inv, invertasa de Daucus carota (GH32); Ao-Inv,
invertasa de Asparagus officinalis (GH32); Ac-6GFFT, fructosiltransferasa de Allium cepa (GH32);
(http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/ghf-32.html)

57

La catlisis de las GH sucede a travs de uno de dos mecanismos, segn si la ruptura del enlace
glicosdico resulta en la retencin o inversin de la configuracin del sustrato. Las GH que retienen
la configuracin anomrica del sustrato (enzimas de retencin), en las que se incluyen las GH32 y
68, siguen un mecanismo de doble desplazamiento que involucra un intermediario covalente
glicosil-enzima (Figura 18). Por su parte, las enzimas de inversin actan en un solo paso: una
molcula de agua es desprotonada y activada (nuclefilo) por un residuo bsico. Un residuo cido
protona al oxgeno del grupo glicosil-saliente al mismo tiempo que sucede la ruptura (Withers y
Aebersold, 1995).
El anlisis 3D de cristales ayuda al entendimiento del mecanismo cataltico. Sin embargo, en el
caso de las GH32 la elucidacin cataltica se ha realizado primordialmente por comparacin de las
propiedades cinticas de las enzimas despus de bloquear residuos presuntamente importantes o
a travs de mutaciones puntuales, y solo recientemente se ha cristalizado la Inv bacteriana de
Termotoga maritima (Alberto et al., 2004) y la FEH de C. intybus (Verhaest et al., 2004 y 2005), as
como la levansucrasa de Bacillus subtilis y Gluconoacetobacter diazotrophicus SRT4 de la familia
GH68 (Martnez-Fleites et al., 2004). Se asume que la donacin de protones y el ataque
nuclefilico son realizados por grupos carboxilos de aminocidos conservados. En el clan J existen
dominios que presentan los residuos cidos asprtico y glutmico (Figura 16): el dominio RDP
(caja IV) y el motivo EC (caja VI). El bloque I es el llamado caja de unin a Suc con un consenso
determinado como H-X-X-[PTV]-X-X-X-X-[LIVMA]-[NSCAYG]-[DE]-P-[NDSC]-[GA].En Inv, este
dominio fue inicialmente reconocido como esencial para la unin a Suc y presenta un motivo fructosidasa ms variable de acuerdo a la actividad enzimtica (Ritsema et al., 2004, 2005).
Anlisis de mutacin en algunas enzimas GH32, muestran que es el cido glutmico (EC caja VI)
quien dona un protn al oxgeno del glicsido saliente, mientras que el cido asprtico (bloque I)
es el nuclefilo que ataca al C2 de la Fru, formando un intermediario covalente fructosil-enzima
con la liberacin del grupo saliente. En un segundo paso, el cido glutmico sustrae un protn de
una molcula de agua, permitiendo que el OH- as formado, desplace a la Fru y se restauren los
residuos del centro activo (Reddy y Maley, 1996; Batista et al., 1999; Pons et al., 2004) (Figura
17). Por su parte, en la familia GH68 podra ser un poco diferente, pues la caja I es mucho menos
conservada. Song y Jacques (1999) despus de observar prdida completa de actividad en una
FT de Streptococcus salivarius, en la mutacin D309S de la caja IV y solo una reduccin cuando la
mutacin se realiz en el cido asprtico del bloque I, sugieren que este residuo en el motivo RDP

58

es el nuclefilo, en tanto que el cido asprtico en el motivo -fructosidasa no interacta

directamente con el sustrato sino que estabiliza un giro -plegada en esta regin.

Figura 18. Mecanismos catalticos de las glicosilhidrolasas. A) Mecanismo de retencin (doble

desplazamiento), un aminocido del sitio activo acta como cido protonando al oxgeno
glicosdico, mientras que otro residuo acta como nuclefilo atacando el C2 de la fructosa, para
formar un intermediario covalente fructosil-enzima y liberar el grupo saliente. En un segundo paso,
el primer aminocido u otro diferente acta como base, desprotonando el agua y el OH- formado,
desplaza la fructosa para regenerar el sitio activo; B) Mecanismo de inversin (desplazamiento
directo), un aminocido del sitio activo acta como base, desprotonando la molcula de agua
nucleoflica, mientras que otro aminocido que acta como cido, protona el oxgeno glicosdico al
mismo tiempo que sucede la ruptura; esta reaccin sucede a travs de un estado de transicin
oxo-carbanin. Modificada de Withers y Aebersold, 1995.

59

Finalmente, se ha reconocido la importancia de algunos aminocidos altamente conservados en

las secuencias de estas familias, ya sea en el mantenimiento de la orientacin o el valor de pKa de
residuos claves, generando as el ambiente esencial para la catlisis; entre ellos, el cido asprtico
(bloque RDP) y la cistena (bloque EC) y el residuo aromtico (triptfano, fenilalanina o tirosina)
presente en la caja de unin a Suc.

2.3. FISIOLOGA DE LOS FRUCTANOS

Los fructanos constituyen una extensin del metabolismo de Suc, regulando su concentracin
citoplasmtica por debajo de niveles que conllevan a la inhibicin fotosinttica (Pollock et al., 2003)
y contribuyendo en procesos donde la implicacin de Suc ha sido demostrada, como expresin de
genes y distribucin de fotosintatos. El papel de los fructanos como carbohidrato de reserva fue
sugerido desde 1922 por Collin y Belval; sin embargo, las investigaciones de las ltimas dcadas
han dado cabida a especular que estas molculas, estn implicadas, adems, en la fisiologa del
desarrollo de las plantas as como en procesos de adaptacin a distintos tipos de estrs.

2.3.1. CARBOHIDRATO DE RESERVA

Los fructanos como carbohidratos de reserva a largo plazo, son localizados en rganos de
almacn como tubrculos (alcachofa Jerusalem y dalia), races (achicoria y diente de len), bulbos
(cebolla, ajo, tulipn), discos florales (alcachofa) y tallos (agave); en gramneas se almacenan en
los internodos de tejidos vegetativos, en semillas y principalmente en las vainas de las hojas
maduras (Morvand-Bertrand et al., 2001). Como reserva a corto plazo, stos se almacenan en el
mesfilo de rganos autotrficos como hojas y tejidos florales. La sntesis y movilizacin diaria de
este tipo de almacn contrasta con el de largo plazo, donde estos procesos pueden estar
separados por meses, indicando que la cintica y mecanismo de regulacin deben ser diferentes.

2.3.2. DESARROLLO VEGETAL

Como carbohidrato de reserva, los fructanos suministran carbono y energa en el proceso de
crecimiento y desarrollo de la planta (Orthen y Whermeyer, 2004). Los cambios en el patrn de
fructanos a lo largo de un ciclo fenolgico se deben entre otros factores, a las caractersticas
ambientales estacionales: la alta irradiancia y largos fotoperodos caractersticos del verano,
promueven la fijacin de carbono, la consiguiente sntesis y acumulacin de fructanos. En el

60

otoo, la senescencia de los rganos areos reduce la sntesis de fructanos e induce en algunas
plantas el inicio de la dormancia que se consuma en el invierno, caracterizado por lluvias escasas
y reduccin de temperatura y fotoperodo, con la movilizacin de carbohidratos de las partes
areas hacia los rganos de almacn. Finalmente en primavera, la movilizacin masiva de
fructanos de los rganos de almacn cubre las necesidades energticas para los nuevos brotes y
tejidos (Machado y Dietrich, 1993). En Asteraceae como achicoria, alcachofa y Vernonia
herbaceae se ha estudiado el cambio metablico de fructanos. En un principio se presenta un
proceso de optimizacin del aparato fotosinttico con la activacin de 1-SST y acumulacin de
fructanos; mismos que decrecen durante la emergencia de brotes o durante la generacin de
rganos florales con la activacin de la FEH (Figura 19). En esta etapa los rganos de almacn, se
convierten de tejidos consumidores a proveedores. Un incremento de fructanos vuelve a
observarse durante un intenso crecimiento vegetativo o durante la dormancia (Gupta y Kaur,
2000).
La remocin de fructanos de rganos de almacn tambin se observa durante el florecimiento de
Hemerocallis spp. (Bieleski, 1993), Phippsia algida (Solhaug y Aares, 1994) y Campanula
rapunculoides (Vergauwen et al., 2000). La alta produccin de hexosas, provenientes de este
proceso, disminuye el potencial osmtico y mantiene la presin de turgor necesaria para el
crecimiento celular.

Figura 19. Papel de las fructosiltransferasas en el desarrollo de plantas superiores.

A) Actividad enzimtica y acumulacin de fructanos en tubrculos de Polymnia
sonchifolia (Asteraceae); B) Expresin de fructosiltransferasa en distintos tejidos de
Triticum aestivum (Poaceae). Modificada de Itaya et al., 2002 y Van den Ende et al.,
2005.

61

En achicoria a pesar de la alta actividad de FEH durante el florecimiento no hay acumulacin de

Fru; sta puede ser dirigida al citoplasma para su conversin a Suc (Gupta y Kaur, 2000) o
participar en la sntesis de inulo-n-osas observadas durante el florecimiento de C. rapunculoides
(Vergauwen et al., 2000). En cereales, los fructanos se acumulan durante el crecimiento del tallo,
pero su concentracin declina durante la produccin de granos, con la acumulacin de mono- y disacridos (De Gara et al., 2003).
2.3.3. DEFOLIACIN
El efecto de defoliacin en el metabolismo de fructanos ha sido ms estudiado en pastos, dada la
frecuencia de prcticas de poda y pastoreo en estas especies. La reduccin en el rea foliar y
produccin de fotosintatos, provoca la activacin de la 1-FEH y remocin de los fructanos
almacenados en la regin basal (regin de elongacin celular) y las vainas de hojas maduras que
la cubre (Figura 20A y B). Hay un flujo de carbono de las vainas (que almacenan hasta el 70% de
los fructanos) hacia la zona de elongacin, favoreciendo el flujo de carbono hacia el meristemo
foliar con un decremento transitorio en los tejidos de la raz.
La sntesis de fructanos marcados por la administracin de 13C-Fru despus de la defoliacin,
indica un metabolismo activo de sntesis y degradacin de fructanos, pues al mismo tiempo hay
una demanda consumidora del tejido de elongacin para regular el carbono necesario para la
refoliacin (Amiard et al., 2003a).
En achicoria y Vernonia herbaceae, la prdida del tejido fotosinttico por defoliacin, promueve en
la raz un cambio abrupto de tejido consumidor a proveedor. La 1-SST decrece y despus de un
perodo lag, la FEH se activa hidrolizando los fructanos almacenados para proveer la energa
requerida en el mantenimiento y respiracin celular (Figura 19C y D). Al reestablecerse la
capacidad fotosinttica de las hojas hay un incremento de hexosas y Suc en la raz y sntesis de
fructanos con la activacin de 1-SST y decremento de la FEH. A partir de este momento la raz es
otra vez rgano consumidor (Gupta y Kaur, 2000; Asega y Machado, 2004). La mxima actividad
de invertasa en V. herbacea se ha registrado durante la fase lag, antes de la activacin de la FEH,
sugiriendo que al igual que los fructanos, la hidrlisis de Suc provee energa en la restauracin de
tejido fotosinttico y/o la hidrlisis de este metabolito es necesaria para proveer las condiciones
vacuolares ideales para la actividad de FEH (Suc inhibe a la FEH) (Asega y Machado, 2004).

62

Figura 20. Efecto de la defoliacin en el metabolismo de fructanos. A) Actividades

enzimticas en la vaina (v) y clulas en elongacin (e) de Lolium perenne despus de la
defoliacin; B) Concentracin de carbohidratos en clulas de elongacin; C) Actividades
enzimticas del metabolismo de fructanos en plantas de Cichorium intybus control (c) y despus
de la defoliacin (d); D), Comparacin de la concentracin de carbohidratos en plantas control (c) y
despus de la defoliacin (d). Modificada de Morvan-Bertrand et al., 2001 y de Roover et al., 1999.
Despus de la defoliacin, la produccin de clulas con paredes celulares ms delgadas, es
consecuencia del preferente flujo de carbono proveniente de fructanos, al meristemo del vstago.
El estatus de carbono (cantidad de fructanos almacenados en la base de las hojas) en pastos
antes de la defoliacin, influye en la primera fase de la restauracin del tejido fotosinttico
(rendimiento en el vstago), pero no en la segunda fase, cuando los fotosintatos son de nuevo la
principal fuente de carbono (Morvan-Bertrand et al., 1999).

63

2.3.4. DESCARGA APOPLSTICA

La compartamentalizacin del metabolismo primario de carbono se ha mostrado en gramneas,
donde diferentes concentraciones de carbohidratos solubles se observan en clulas epidermales,
mesoflicas y haces vasculares. Los fructanos son metabolizados en estos dos ltimos tipos
celulares. Al parecer, sin embargo, son regulados de manera distinta, pues en cebada por
ejemplo, aunque el nivel de transcrito de 6-SFT en el mesfilo es mayor, hay ms acumulacin de
fructanos en los haces vasculares, probablemente debido a una menor concentracin umbral de
Suc para su sntesis. Esta caracterstica responde a la funcin y posicin anatmica de estas
clulas, encargadas de la carga de Suc del apoplasto o simplasto a los haces vasculares. Los
fructanos contribuyen as, a mantener un gradiente de Suc entre el floema y los tejidos
consumidores (Koroleva et al., 1998; Lu et al., 2002; Asega y Machado, 2004). La posible
presencia de fructanos y sus enzimas metablicas en apoplasto y tejidos vasculares (Wang y
Nobel, 1998; Livingston y Henson, 1998) refuerza la idea de la participacin activa de los fructanos
en este proceso.

2.3.5. AJUSTE OSMTICO

A diferencia del almidn que es insoluble, los fructanos son solubles y pueden contribuir al
potencial osmtico de la vacuola. La participacin de fructanos como osmolitos se demostr en la
geofita Lachenalia minima, donde la acumulacin de FOS en la capa interna del bulbo disminuy
el potencial osmtico de la planta y estableci un gradiente hdrico entre las capas interna, media y
externa, facilitando la toma de agua del suelo, preferentemente en la capa interna donde se lleva a
cabo la expansin celular (Orthen, 2001).
En gramneas, se observa claramente en las hojas un gradiente de concentracin de fructanos,
siendo mayor en la regin basal donde se lleva a cabo la divisin y elongacin celular. Se sugiere
que la sntesis de fructanos en estas clulas es un punto de control en la concentracin de Suc
para mantener el potencial osmtico adecuado en el proceso de elongacin (Morvan-Bertrand et
al., 2001; Pavis et al., 2001b).

2.3.6. TOLERANCIA AL FRO

Las bajas temperaturas limitan el crecimiento ms que el proceso fotosinttico; sin embargo, la
acumulacin de fotosintatos y sus intermediarios fosforilados llegan a inhibir la fotosntesis a corto

64

plazo a travs de la inhibicin de los genes fotosintticos o por el secuestro de fosfato,

respectivamente (Hjelm y gren, 2003), por lo que la sntesis vacuolar de fructanos puede ser una
ventaja que evita dicha inhibicin en las clulas autotrficas.
En plantas resistentes al fro, la reduccin de temperatura induce un proceso de aclimatacin
esencial para la supervivencia. En 1935, Tumenov defini este evento como process hardiness
(PH) (Livingston y Henson, 1998). ste ha sido ms estudiado en cereales como trigo y avena, y
muestra que la capacidad de soportar el fro esta dado por caractersticas multignicas de cada
variedad. La primera etapa (1PH) sucede a temperaturas superiores a 0C, con la induccin de 1SST y 6-SFT y acumulacin de fructanos y Suc en la corona (Van den Ende et al., 2005); mientras
que en la 2PH, cuando se observa una resistencia a temperaturas inferiores, los fructanos son
hidrolizados por FEH e Inv, con la acumulacin de carbohidratos solubles y expresin de genes
relacionados con el estrs (Figura 21) (Tabaei-Aghdaei et al., 2003).
La actividad FEH apoplstica, evidenciada por primera vez por Livingston y Henson (1998),
cuestion el exclusivo metabolismo vacuolar de los fructanos, y aunque esta actividad puede ser
resultado de dao celular o de exocitosis, se sugiere que la presencia apoplstica de FEH, FOS y
monosacridos es determinante para la resistencia a fro (Livingston y Henson, 1998; TabaeiAghdaei et al., 2003).
La acumulacin de FOS en el apoplasto no es significativa para disminuir el punto de congelacin;
sin embargo, su mecanismo protector parece no estar restringido a las propiedades coligativas.
Estos compuestos se acumulan en regiones discretas donde pueden, entre otras cosas,
interactuar con las membranas plasmticas con protenas claves en la supervivencia al fro,
prevenir la adhesin de hielo y/o actuar como osmoprotectantes evitando la deshidratacin de los
tejidos (Livingston y Henson, 1998; Orthen y Whermeyer, 2004).
Los fructanos, adems, confieren ventajas durante inviernos prolongados con nieve, donde las
condiciones de hipoxia ( 3% O2, 44% CO2, medido en plntulas de trigo sometidas a -5 C
durante 5 d) conllevan a reemplazar la fosforilacin oxidativa por la fermentacin, un proceso
ineficiente (2 ATP/mol Glc vs 32 en la respiracin) que provoca la rpida reduccin de las reservas
de carbono. Phleum pratense es tolerante a la hipoxia, con una menor velocidad metablica y una
actividad fotosinttica basal (Bertrand et al., 2003). Se especula que esto se debe a los costos
energticos, pues aunque se calcula que por cada Fru incorporada a la cadena de fructanos se
necesita 1.5 ATP para reciclar la Glc generada como subproducto, puede haber un ahorro

65

Figura 21. Metabolismo de fructanos en Avena sativa bajo estrs por fro. A) Concentracin
de carbohidratos en la corona; B) Concentracin de carbohidratos en el fluido apoplstico de la
corona; C) Actividad de FEH; D) Actividad de invertasa. Control, 5 semanas a 13 C; 1PH, 3
semanas a 2 C; 2PH, 3 das a -3 C. Modificada de Livingston y Henson, 1998.
energtico si se considera que la sntesis vacuolar de fructanos mantiene un gradiente de Suc con
el citoplasma, evitando la necesidad del uso de un transporte activo de Suc o gradientes de pH
(Van Laere y Van den Ende, 2002). Otra hiptesis sugiere que la disminucin del potencial
osmtico, por hidrlisis de fructanos, facilita algunos procesos metablicos. Por otra parte, el fro
tambin genera especies reactivas de oxgeno que daan la funcin de algunas enzimas y la
integridad de la membrana celular. Estos sntomas se reducen en plantas de tabaco transgnicas
que expresan fructanos, confirmando la observacin de que plantas aclimatadas al fro adquieren,

66

adems, tolerancia a la generacin de radicales libres (Parvanova et al., 2004). Finalmente, la

presencia del metabolismo de fructanos confiere ventajas sobre aquellas que no lo hacen, al
facultarlas de un rpido crecimiento cuando se reestablecen las condiciones ambientales (Vijn y
Smeekens, 1999).

2.3.7. TOLERANCIA A SEQUA

Hendry (1987) propuso que la aparicin de taxa que acumulan fructanos, correspondi a un
cambio climatolgico de sequas estacionales y que la distribucin actual de plantas que sintetizan
estos carbohidratos, corresponde a esta misma caracterstica. Por otra parte, Pilon-Smit et al.,
(1995) evidenciaron que la acumulacin de fructanos en tabaco transgnico confiere resistencia al
estrs hdrico impuesto por la adicin de polietilenglicol. Por tal motivo, los fructanos son
molculas candidatas en el mecanismo de tolerancia a sequa. Sin embargo, se reportan
diferentes respuestas de estos carbohidratos. Dependiendo de la especie, los fructanos se
acumulan, decrecen o modifican su DP durante el estrs (Amiard et al., 2003b).
En gramneas como trigo, Festuca arundinacea, Phleum pratense y Lolium perenne, se ha
reconocido la contribucin de la hidrlisis de fructanos al ajuste osmtico de estas especies
durante un dficit hdrico (Figura 22A-D). En condiciones de hidratacin, Festuca arundinacea
presenta en su zona de elongacin foliar un potencial de soluto (s) de ~ -1.5 MPa, donde los
fructanos (DP<5) explican el 13%. Esta contribucin disminuye durante el estrs hdrico, en donde
el s de -3.2 MPa es principalmente atribuido a la acumulacin de hexosas. A pesar del arresto en
el crecimiento foliar y decremento de materia seca proporcional a la prdida de fructanos, este
valor es suficiente para mantener el turgor, indicando que el estrs hdrico limita ms el uso de
carbono que la toma de agua. La acumulacin de hexosas, adems, constituye un sustrato
disponible en el citoplasma para la fosforilacin enzimtica o para la gliclisis, siendo una ventaja
sobre especies que almacenan almidn, donde las hexosas disminuyen durante el estrs por dao
a la actividad sucroltica (Spollen y Nelson, 1994). Adems de la acumulacin de monosacridos,
en una respuesta ms retardada, se observa la acumulacin de fructanos, siendo stos
marcadores moleculares interesantes para determinar la tolerancia a estrs salino, pues la mayor
acumulacin de fructanos se observa en especies de trigo ms tolerantes (Kerepesi y Galiba,
2000).

67

Figura 22. Fructanos en estrs por sequa. A-D) Cambios en la concentracin de carbohidratos en el
tejido foliar de Lolium perenne sujeto a 14 das de sequa seguido de rehidratacin (lnea discontinua) o
plantas control (lnea continua); E) Efecto protector en liposomas de fosfatidilcolina (FC) de inulina de
achicoria (), dalia () o hidroxietil almidn (HEA) (), medido como porcentaje de retencin de
carboxifluorescena; F) Barrido FTIR de los grupos CH2- de lipososmas de FC para medir la temperatura
de transicin de la fase cristalina a la fase de gel (tm) en presencia de inulina de achicoria 1:1 (FC:inulina,
tm 8 C), 1:2 (tm 7 C), HEA(1:2) o FC control (tm 29 C). La tm se mide como el punto medio de cada curva
como se indica con las flechas. Modificada de Hincha et al., 2000 y Amiard et al., 2003b.

68

Aunque se discute si la acumulacin de fructanos en plantas estresadas es un mecanismo de

proteccin o solo resultado de un uso disminuido de fotosintatos de una planta con crecimiento
limitado, hay evidencias de la interaccin de fructanos con la membrana durante procesos de
desecacin; por lo que el papel de la posible presencia apoplstica de fructanos sea una
proteccin celular a travs de la estabilizacin de la membrana (Van Laere y Van den Ende, 2002).
En un estado deshidratado, la membrana se encuentra en fase de gel (L) y al rehidratarse sta
vuelve a la fase lquida-cristalina (L); sin embargo, durante la transicin hay daos en la
integridad celular que provocan la fuga de molculas internas. Experimentalmente, la presencia de
fructanos disminuye la temperatura de transicin L-L (tm) (Figura 22 E-F) y aumenta la
temperatura del proceso inverso L-L (tg) (Hincha et al., 2000; Vereyken et al., 2003a). De
acuerdo a mtodos espectrofotomtricos, los fructanos interactan con las cabezas lipdicas de las
membranas, desplazando molculas de agua y provocando una rigidez en las cabezas y mayor
movilidad en las colas (acilos) (Vereyken et al., 2003b). Dicha interaccin se favorece cuando los
lpidos son pequeos y los fructanos de mayor DP (Hincha et al., 2002; Vereyken et al., 2003a). Lo
anterior indica una interaccin hidrofbica, pues adems, los fructanos son capaces de interactuar
con las membranas an en condiciones de hidratacin aunque de manera menos pronunciada
(Vereyken et al., 2003b). El efecto de un levano de ~125 DP es equivalente a una inulina de ~15
DP; esta diferencia es atribuida a una menor flexibilidad conformacional del levano, donde los
anillos furanosa son parte del esqueleto molecular (Vereyken et al., 2003a).

2.3.8. DEFENSA CONTRA PATGENOS

En trigo se ha observado que variedades resistentes a fro son ms susceptibles a infecciones por
hongos y viceversa, y aunque no hay una hiptesis satisfactoria para explicar este hecho, es clara
la participacin de los fructanos. Kawakami y Yoshida (2002) mostraron una expresin diferencial
de los genes de la 1-SST y la 6-SFT en trigo. Las variedades tolerantes a fro muestran una
regulacin negativa en la expresin de estos genes durante 2PH relacionada con la disminucin
de fructanos, en tanto que, en los cultivares resistentes al hongo hay un incremento persistente en
el transcrito de ambos genes y una sntesis activa de fructanos, por lo que se cree que estos
carbohidratos son una fuente de carbono menos disponible para los hongos, comparado a FOS
(DP9-11), mono- y di-sacridos predominantes en variedades resistentes a fro.

69

Figura 23. Modelo propuesto de la participacin de fructanos en la resistencia a patgenos.

La reduccin del crecimiento y demanda de carbohidratos por bajas temperaturas (1) inducen la
acumulacin de monosacridos fosfato (2), los cuales generan Suc (3a) y monosacridos (3b).
Los niveles citoslicos de monosacridos son percibidos por hexocinasas (4) que activan la
expresin de genes de respuesta de defensa (5). La acumulacin intracelular de Suc induce la
formacin y acumulacin de fructanos en la vacuola (6). Parte de la Suc es transportada a la
corona (tejido consumidor) y tambin almacenada como fructanos. Durante el transcurso del
invierno, los fructanos son metabolizados en fructosa (7) que en equilibrio con los monosacridos
fosfato y Glc mantienen el umbral citoslico para la expresin continua de los genes de defensa.
La acumulacin de carbohidratos solubles concomitante con la prdida de agua (8) causa un
decremento en el potencial osmtico limitando el crecimiento del patgeno. Modificada de Gaudet
et al., 1999.
Por otra parte, tambin se maneja la hiptesis de que un decremento en el potencial hdrico de la
planta causado por la acumulacin de carbohidratos solubles limita el crecimiento de patgenos; y
finalmente, se considera la posible participacin de fructanos en la expresin de genes de
resistencia como protenas relacionadas a patognesis (quitinasas, -glucanasas) a travs de su
catabolismo a azcares simples (Figura 23) (Gaudet et al., 1999).
La presencia de FEH en plantas que no almacenan fructanos como betabel y Arabidopsis, sugiere
la participacin de esta enzima como mecanismo de defensa contra patgenos o microbios

70

endofticos que sintetizan este tipo de carbohidrato. Mientras que en trigo, especie que produce
fructanos, la altamente especfica 6-KEH puede prevenir la sntesis de levanos de origen
microbiano en el apoplasto (Van den Ende et al., 2005).

2.4. POTENCIAL BIOTECNOLGICO DE FRUCTANOS

Desde 1935, la inulina se ha utilizado clnicamente para la medicin de la velocidad de filtracin
glomerular en ensayos de funcin renal; mientras que en la dcada de los 80 creci el inters del
uso de los fructanos para aplicaciones industriales.
La inulina puede ser qumicamente modificada con fines especficos; por ejemplo, los steres de
inulina tienen propiedades adecuadas de viscosidad para ser utilizados como surfactantes,
revestimentos y cosmticos; mientras que la dicarboxil-inulina es buen acomplejante de calcio
para dispersar las actividades del CaCO3 en la produccin de detergentes.
En el campo mdico se ha propuesto el uso de hidrogeles de inulina como agente acarreador de
frmacos con accin especfica en el colon, o la utilizacin de estas molculas como protectores
de frmulas farmacuticas en procesos de liofilizacin (Vereyken et al., 2003b).
A principios de los 90, Blgica y Holanda comenzaron la extraccin industrial de inulina utilizando
achicoria como materia prima y, recientemente, esto se ha extendido a Alemania y Estados
Unidos. En la ltima dcada, la produccin industrial de inulina creci exponencialmente (de 1,000
a 100,000 ton/ao) casi exclusivamente para fines alimentarios (Van Laere y Van den Ende,
2002). Los fructanos con alto DP confieren a los alimentos una consistencia cremosa; mientras
que los fructanos de bajo DP presentan mayor poder edulcorante que la Suc, por lo que el uso de
fructanos empieza a extenderse en la elaboracin de mayonesas, cremas, postres y chocolates no
cariognicos y de bajo valor calrico (Archer et al., 2004).
Las investigaciones de las ltimas dcadas destacan a los fructanos como ingredientes
funcionales, es decir, ingredientes que adems de aportar un valor nutricional a los alimentos,
mejoran la salud del consumidor. Dada su estructura qumica, los fructanos resisten la hidrlisis de
enzimas digestivas pasando intactos al colon donde son sustrato especfico para bacterias
benficas, principalmente del gnero Lactobacillus, Bifidobacteria y Enterococcus (Roberfroid,
2002). El crecimiento de estas bacterias desplaza aquellas de efectos txicos como Escherichia y
Clostridium. Adems, como parte del metabolismo de fructanos, estas bacterias generan cidos

71

grasos de cadena corta (SCFA, cidos actico, propinico, butrico y lctico) que tienen efectos
sistmicos (Delzenne, 2003).
Aunque los mecanismos an estn por determinarse, dentro de los efectos benficos del consumo
de prebiticos (fructanos o FOS), probiticos (Lactobacillus o Bifidobacteria) o ambos (simbiticos)
puede enlistarse un mejoramiento en la respuesta inmunolgica, disminucin srica de colesterol y
triglicridos, absorcin de minerales como Ca y Mg, tolerancia a la lactosa, mejor respuesta de la
insulina a la glucosa y prevencin de cncer (Kaur y Gupta, 2002).

72

V. JUSTIFICACIN

La presencia de fructanos en plantas evolucionadas indica una ventaja sobre otras formas de
almacenamiento de carbono. El agave es un ejemplo de plantas que almacenan fructanos; sin
embargo, a pesar de ser uno de los pocos cultivos cuyos fructanos son utilizados industrialmente,
su relevancia bioqumica y fisiolgica ha sido escasamente estudiada. La proteccin de fructanos
a plantas bajo estrs abitico, fuertemente apoyada por la resistencia observada en plantas
transgnicas, sugiere una importante implicacin de este carbohidrato en la notable capacidad de
los agaves para crecer en ambientes hostiles.
Para un mejor entendimiento del metabolismo de fructanos y su papel en agaves es importante
establecer primeramente las caractersticas estructurales de estos carbohidratos, las enzimas
implicadas en su sntesis y la regulacin de estas ltimas.

VI. HIPTESIS

La estructura de fructanos en Agave y Dasylirion es especie especfica y est determinada

fuertemente por el desarrollo de la planta y las condiciones geoclimticas. La estructura de los
fructanos, puede relacionarse estrechamente con las actividades fructosiltransferasas presentes
en extractos protenicos y la expresin de los genes que codifican a estas enzimas.

73

VII. MATERIALES Y MTODOS

A. MATERIAL BIOLGICO
1. Regiones
En la Tabla 12 se muestra las cinco especies de agave y dasylirion analizadas en el presente
trabajo. Adems, se indican las regiones donde se realiz el muestreo y las caractersticas
climticas de cada lugar, de acuerdo a lo reportado por el INEGI (http//www.inegi.gob.mx). Los
agaves fueron cosechados de campos cultivados por productores de bebidas alcohlicas
elaboradas a partir de estas plantas, mientras que las especies de Dasylirion, se colectaron de
forma silvestre en la regin de la sierra de Chihuahua, siguiendo el mtodo que se realiza por
parte de los productores de la bebida sotol, teniendo como nico criterio de seleccin el tamao de
la planta y presencia del rgano floral.

2. Edad
La edad calculada de los agaves colectados fue de 6 aos, tiempo al cual la mayora de las
especies aqu consideradas, alcanzan su madurez, y el rgano floral emergente haba sido
cortado; por lo que se asume que la mayor parte de los carbohidratos destinados al desarrollo de
este rgano se encontraban acumulados en el tallo (o la pia). Aunque se desconoce con certeza
la edad de las especies de Dasylirion, por la presencia de la inflorescencia, se asume que las
plantas eran maduras. La colecta de estas especies fue lo ms homognea posible basada en el
tamao de la planta y la presencia de su rgano floral.

3. Muestreo
El muestreo de todas las plantas se realiz en la primavera del 2002, excepto para A. tequilana de
la regin de Guanajuato (At-G), que fue colectada durante el otoo. Se jimaron tres plantas de
cada especie, siempre durante las primeras horas de la maana (entre 10 y 12 h) y fueron
almacenadas a - 20 C al llegar al laboratorio. At-G fue congelado en nitrgeno lquido
inmediatamente despus de colectado y fue almacenado en el laboratorio a 80 C. Todas las
pias fueron trituradas en un procesador, pulverizadas con nitrgeno lquido en un mortero con
pistilo y liofilizadas o procesadas en fresco segn se indica.

74

Tabla 12. Muestreo de especies de Agave y Dasylirion. Se indica las caractersticas geoclimticas de las regiones donde estas plantas fueron
colectadas. La abreviacin que se indica, es la que se utilizar en adelante en el texto.
Regin
Especie
Abreviatura
Latitud norte
Longitud oeste
m sobre el nivel
del mar
Rango promedio
de temperatura
anual (C)
Precipitacin
pluvial (mm)
Tipo de clima

LosAltos,
Jalisco
tequilana
At-J
20 32'
103 40'
2000

Pnjamo,
Guanajuato
tequilana
At-G
20 26'
101 43'
1780

Ures,
Sonora
angustifolia
Aa-S
29 26'
110 23'
380

Matatln,
Oaxaca
angustifolia
Aa-O
16 52'
96 23'
1740

SolaVega,
Oaxaca
potatorum
Ap-O
16 30'
97 59'
1440

SolaVega,
Oaxaca
cantala
Ac-O
16 30'
97 59'
1440

Mrida,
Yucatn
fourcroydes
Af-Y
2058'
89 37'
10

Pegis,
Chihuahua
Dasylirion
Dsp-C
29 30'
104 30'
800

8-22

18 24

22-26

26-28

12-18

12-18

24-28

mximo 43,
mnimo -23

705-870

700-800

<400

800-2000

600-1500

600-1500

700-1110

100-300

templado
subtropical,
verano
lluvioso

semiclido
subhmedo,
verano
lluvioso

clido, muy
seco

clido
subhmedo,
verano
lluvioso

clido
subhmedo,
verano
lluvioso

semiclido, muy
seco

templado
templado
subhmedo, subhmedo,
verano
verano
lluvioso
lluvioso

75

Determinacin Estructural de Fructanos, Identificacin de sus Actividades Enzimticas y Expresin de sus ADNc en Pichia pastoris

Material Biolgico
Agave tequilana (Jalisco, Guanajuato) A. angustifolia (Sonora, Oaxaca)
A. canatala (Oaxaca)
A. potatorum (Oaxaca)
A. fourcroydes (Yucatn) Dasylirion spp. (Chihuahua)

Caracterizacin de
carbohidratos

Identificacin
enzimtica

Aislamiento de ADNc y su expresin

heterloga

Determinacin de carbohidratos no
estructurales

Extraccin y purificacin parcial de protenas

por pasos cromatogrficos

Extraccin y amplificacin de secuencias

genmicas

Extraccin y caracterizacin de fructanos

(TLC, HPAEC-PAD, PMAA)

Ensayos de actividad enzimtica

Aislamiento del ADNc completo por RLMRACE

Caracterizacin de fructanos en A.
tequilana
MALDI-TOF, H-, 13C-NMR

Identificacin electrofortica

Expresin heterloga de ADNc de

fructosiltransferasa en Pichia pastoris

Figura 24. Esquema general de trabajo.

76

B. METODOLOGA
La Figura 24 muestra el esquema general de trabajo desarrollado durante la presente
investigacin. Dicho esquema se describe detalladamente en las siguientes secciones.

1. COMPARACIN Y CARACTERIZACIN ESTRUCTURAL DE CARBOHIDRATOS DE

ALMACN EN AGAVES Y DASYLIRION

1.1. DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA

1.1.1. EXTRACCIN DE CARBOHIDRATOS TOTALES
Los carbohidratos totales se extrajeron a partir de 100 mg de material liofilizado y 50 mL de
solucin etanlica al 80%. La suspensin se agit durante 30 min a 80 C, se filtr con papel
Wathman No.1 y el remanente slido se someti a extraccin dos veces ms, en un medio acuoso
por 15 min. Los tres sobrenadantes se juntaron y se afor hasta un volumen final de 250 mL.

1.1.2. DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS TOTALES

Veinticinco L de esta solucin se llev hasta 1 mL con agua desionizada y se utiliz para la
determinacin de carbohidratos totales con el mtodo de Dubois et al. (1956). La curva de
calibracin se hizo con una solucin estndar de Fru (Sigma) 1 mM, diluida en un rango de
concentracin de 0 a 50 g/mL.
A 1 mL de cada muestra contenidas en tubos de ensaye se le adicion 1 mL de fenol al 5%,
seguido de 5 mL de H2SO4, que para una buena reproducibilidad del mtodo, se adicion rpida y
directamente sobre la superficie del lquido. Los tubos reposaron 10 min a temperatura ambiente,
se agitaron y se colocaron 20 min a bao Mara de 20 C. La absorbancia se ley en un
espectrofotmetro visible (Spectronic 20) dentro de los prximos 30 min a 490 nm.

1.1.3. DETERMINACIN DE D-GLUCOSA, D-FRUCTOSA Y SACAROSA

La determinacin de Suc, Glc y Fru se realiz simultneamente a travs de ensayos enzimticos,
utilizando un kit comercial (Boehringer Mannheim), segn se muestra en la Tabla 13.
El contenido de Glc se determin mediante la actividad enzimtica de la hexocinasa, que cataliza
la fosforilacin de este carbohidrato por parte del ATP con la formacin simultnea de ADP,
D-Glc +

ATP

Glc-6-P +

ADP

77

Tabla 13. Determinacin enzimtica de D-Glucosa, D-Fructosa y Sacarosa.

- Solucin I
- Muestra

Blanco para DGlc y D-Fru

-

Determinacin de
D-Glc y D-Fru
-

Blanco para
Suc
66 L

Determinacin
de Suc
66 L

33 L

33 L

Las soluciones se mezclaron suavemente y se incubaron 5 min a 37 C

- Solucin II

330 L

330 L

330 L

330 L

- Agua

600 L

600 L

600 L

600 L

Las soluciones se mezclaron suavemente y la absorbancia se ley a 340 nm en los prximos tres minutos
(A1)
- Suspensin III

6 L

6 L

6 L

6 L

Las soluciones se mezclaron suavemente y despus de 15 min se ley la absorbancia a 340 nm (A2)
- Suspensin IV

6 L

6 L

Las soluciones se mezclaron suavemente y despus de 15 min se ley la absorbancia a 340 nm (A3)
Solucin I, buffer de citratos pH 4.6 y -fructosidasa (720 U); Solucin II, buffer de trietanolamina

pH 7.6, 110 mg de NADP, 260 mg de ATP y MgSO4; Suspensin III, hexocinasa (320 U), glucosa6-fosfato deshidrogenasa (160 U); Suspensin IV, fosfoglucosa isomerasa (420 U).
La Glc-6-fosfato se oxida en presencia de Glc-6-P-deshidrogenasa a gluconato-6-P por el NADP,
el cual a su vez se reduce a NADPH.
Glc-6-P +

NADP

D-Gluconato-6-P

+ NADPH

H+

El NADPH se relaciona estequiomtricamente a la cantidad de Glc, por lo que a travs de su

medicin espectrofotomtrica a 340 nm se cuantific la Glc presente en las muestras. Las
diferencias de absorbancias A2 y A1 entre la muestras y el blanco, (A2 A1)D-Glc (A2 A1)blanco D-Glc
(Tabla 13) dio un valor correspondiente al NADPH generado por la presencia de Glc libre (AGlc).
Para determinar la concentracin de Glc se aplic la ecuacin I:

i).- DETERMINACIN DE D-GLUCOSA

c=

V MW
. A
d v 1000

(I)

donde c, concentracin (g/L),

v, volumen final de reaccin (mL)
MW, peso molecular (g/mol)
V, volumen de la muestra (mL)
, coeficiente de extincin del NADPH a 340 nm (6.3)
78

d, longitud de la celda espectroscpica

A, el cambio de absorbancia
El valor resultante se multiplic por el factor de dilucin (0.1).
ii).- DETERMINACIN DE D-FRUCTOSA
Al igual que para la cuantificacin de Glc, la determinacin de Fru se hizo mediante su fosforilacin
por parte de la hexocinasa,
D-Fru +

ATP

Fru-6-P +

ADP

En presencia de fosfoglucosa isomerasa, la Fru-6-P es convertida a Glc-6-P y se oxida a

gluconato-6-P como se indic anteriormente,
Fru-6-P

Glc-6-P

El A2 de D-Glc/D-Fru (Tabla 13) (A2blanco - A2muestra) corresponde nicamente al NADPH

formado despus de la oxidacin de Glc-6-P proveniente de la Glc libre, y slo en la reaccin
subsecuente, la fosfoglucoisomerasa isomeriz la Fru-6-P a Glc-6-P, por lo que la absorbancia
medida posteriormente (A3) correspondi al NADPH generado por ambos carbohidratos. La
concentracin de Fru en las muestras se determin por la diferencia de ambos valores delta (A3 A2) aplicando la ecuacin I.
iii).- DETERMINACIN DE SACAROSA
La Suc presente en las muestras fue hidrolizada por una invertasa a Glc y Fru,
Suc

H2O

D-Glc +

D-Fru

Despus de esta reaccin, la Glc fue determinada como se indica anteriormente, y la

concentracin de Suc en las muestras fue calculada a partir de la diferencia de concentraciones de
la Glc antes y despus de la hidrlisis.
El A2 de Suc (A2blanco A2muestra) incluye el NADPH debido a la Glc libre y aquella proveniente de
la hidrlisis de Suc. Esta absorbancia se rest a aquella debido nicamente a la Glc libre (A2 DGlc/D-Fru)

generando un valor ASuc, que fue utilizado para calcular la concentracin de Suc por la

aplicacin de la ecuacin I.

1.1.4. DETERMINACIN DE FRUCTANOS

La determinacin de fructanos se realiz con el kit comercial Fructan Assay Procedure
(Megazyme), siguiendo el mtodo referido en la AOAC con el nmero 999.03 (McCleary et al.,
2000). Se pesaron 100 mg de muestra liofilizada que fueron suspendidos en 40 mL de agua

79

destilada caliente. Para la extraccin de fructanos, las muestras se agitaron 15 min a 80 C, se

enfriaron a temperatura ambiente, se aforaron a 100 mL y se filtraron con papel Whatman No. 1.
Para la remocin de Suc, almidn y azcares reductores, alcuotas de 200 L se incubaron a 40
C por 30 min con 200 L de una mezcla de sacarasa (100 U), -amilasa (500 U, de Bacillus
subtilis), pullulanasa (100 U, de Klebsiella pneumoniae) y maltasa (1000 U, de levadura). Los
monosacridos as formados, fueron reducidos a alcohol azcares con la adicin de 200 L de
NaHB4 e incubando 30 min a 40 C. La reaccin se par y el exceso de borohidruro formado se
elimin adicionando 500 L de cido actico 100 mM. Este cido adems, ajust el pH a un valor
~ 4.5. Alcuotas de 200 L de la solucin anterior se colocaron en nuevos tubos de ensaye y se
adicion 100 L de fructanasa (exo-inulinasa), mezclando el contenido en un vrtex, e incubando
la reaccin 20 min a 40 C para asegurar la completa hidrlisis de los fructanos a Fru y Glc.
Finalmente, para cuantificar los azcares reductores recin formados, las muestras fueron tratadas
con 5 mL de PAHBAH e incubados en un bao de agua hirviendo por exactamente 6 min,
enfriados en agua fra (18-20 C) durante 5 min y su absorbancia fue leda en los 10 min
siguientes a 410 nm.
Doscientos L de una solucin estndar de Fru (1.5 mg/mL) se diluy con 900 L de buffer de
acetato de sodio 100 mM (pH 4.5). Cuatro rplicas de 200 L de esta solucin (que contiene 54.5
g de Fru) se trataron con la hidracida del cido p-hidroxibenzoico (PAHBAH) como se indica
anteriormente y su valor de absorbancia fue utilizado como factor de conversin a g (54.5 g de
Fru/absorbancia de 54.5 g de Fru). Fructanos de dalia y Suc liofilizada, contenidos en el kit, se
utilizaron para la validacin del mtodo.
El contenido de fructanos se determin segn la ecuacin II:
Fructano (% w/w) = E F 5 V 1.1 100 1 162 (II)
0.2
W
1000 180
Donde, E, absorbancia de la reaccin leda contra el blanco
F, factor de conversin de 54.5 g de Fru a su absorbancia
5, factor para convertir los 200 L ensayados a 1 mL
V, volumen utilizado en la extraccin de fructanos (100 mL)
1.1 , para considerar que se tomaron 200 L de 1.1 mL de la digestin
0.2 enzimtica
W, peso de la muestra en mg (100 mg)
100 , factor para expresar el contenido de fructanos en % de peso
80

W
1 , factor para convertir de g a mg
1000
162 , factor para convertir Fru libre, como es determinada, a fructosa
180 anhdra, como se encuentra en los fructanos
1.1.5. DETERMINACIN DE ALMIDN
La presencia de almidn en especies de Agave y Dasylirion se determin con el kit comercial
Total Starch Assay Procedure (Megazyme), adoptado por la AOAC en el mtodo 996.11
(McCleary y Monaghan, 2002). Cien mg de muestra liofilizada se humedecieron en un tubo de
ensaye con 200 L de etanol al 80% agitando en vrtex. El almidn presente en las muestras fue
parcialmente hidrolizado con 3 mL de -amilasa termoestable (300 U), disuelta en buffer MOPS
50 mM (pH 7.0) e incubando en bao de agua hirviendo por 6 min y con agitacin vigorosa cada 2
min. Para la hidrlisis de las dextrinas remanentes y liberacin de Glc, los tubos se colocaron en
un bao Mara a 50 C, se adicion 4 mL de buffer de acetato de sodio 200 mM (pH 4.5) y 100 L
de amiloglucosidasa (20 U) y se incub 30 min agitando vigorosamente con frecuencia. El
contenido de los tubos se afor a 10 mL y se tomaron triplicados de 100 L en tubos de ensaye
limpios. A cada triplicado, se aadi 3 mL de reactivo de determinacin de Glc (GODOP) y se
incub a 50 C durante 20 min. La absorbancia se ley a 510 nm.
Durante la optimizacin de la tcnica, para cuantificar la posible presencia de almidn resistente a
la hidrlisis, despus de humedecer las muestras con etanol al 80% se aadi 2 mL de DMSO, los
tubos se agitaron y se colocaron en bao de agua hirviendo por 5 min. Sin embargo, la
absorbancia de las muestras as tratadas no fue diferente a aquellas tratadas como se indica
anteriormente. Por lo tanto, se asumi que los tallos de agave y dasylirion no almacenan almidn
resistente y los triplicados se determinaron como se describi en un principio. Una solucin
estndar de Glc (100 g/100 L) se utiliz como factor de conversin de absorbancia a g (100
g de Glc/absorbancia de 100 g de Glc). Almidn de maz de alta pureza (98%), contenido en el
kit, se utiliz para validar el mtodo.
El contenido de almidn se determin segn la ecuacin III:
Almidn (% w/w) = E F 1000 100 1 162 (III)
W
1000 180
Donde, E, absorbancia de la reaccin leda contra el blanco
F, factor de conversin de 100 g de Glc a su absorbancia
81

1000, volumen de correccin (alcuotas de 100 L se tomaron de 10 mL)

W, peso de la muestra en mg (100 mg)
100 , factor para expresar el contenido de almidn en % de peso
W
1 , factor para convertir de g a mg
1000
162 , factor para convertir Glc libre, como es determinada, a Glc
180 anhdra, como se encuentra en el almidn
1.2. EXTRACCIN DE FRUCTANOS
Los fructanos fueron extrados de acuerdo a la metodologa optimizada en nuestro laboratorio para
agaves y dasylirion (Lpez et al., 2003). Se pesaron 30 g de muestra liofilizada y los fructanos se
extrajeron con 100 mL de etanol al 80%, en un bao con agitacin a 75 C, durante 1 h y
manteniendo el pH a 7.5-8.0 para evitar la hidrlisis cida. Las muestras se filtraron y fueron reextradas dos veces ms con 50 mL de agua por 30 min. Los filtrados se juntaron y se lavaron con
cloroformo para eliminar los residuos orgnicos, reposando la muestra toda la noche a 4 C para
lograr una mejor separacin de fases. La fase acuosa se recuper y su volumen se redujo a un
10% en un rotavapor al vaco y un bao a 65 C. Los fructanos de alto peso molecular (HMF, <
DP10) fueron precipitados con la adicin de 100 mL de etanol absoluto; mientras que los fructanos
de bajo peso molecular (LMF, > DP10) permanecieron en el sobrenadante. Las muestras
reposaron toda la noche a 4 C. El etanol fue eliminado de cada fraccin y los fructanos fueron
concentrados en un rotavapor, se disolvieron en agua desionizada, se liofilizaron y se
almacenaron en desecadores hasta su anlisis.

1.3. CARACTERIZACIN DE FRUCTANOS

1.3.1. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)
Se prepararon soluciones de fructanos al 10% y 1 L de cada solucin fue analizado en placas
analticas de silica gel con soporte de aluminio (10 10 cm, Alldrich). Las placas se desarrollaron
de 3 a 5 veces, segn se indica, en un sistema de solventes de butanol:propanol:agua (3:12:4,
v/v/v). Las placas se asperjaron con un reactivo de anilina-difenilamina-cido fosfrico en base de
acetona (Anderson et al., 2000) y reveladas hornendolas a 80 C por 15 min. Este reactivo
produce un color grisceo en presencia de aldosas, mientras que las cetosas producen un color
rosado. Una mezcla de 1-Kes, Nys y DP5 (Megazyme) y Fru, Glc y Suc (Sigma) fue utilizada como
estndar.
82

1.3.2. CROMATOGRAFA DE ALTA RESOLUCIN DE INTERCAMBIO ANINICO ACOPLADO

A DETECTOR DE PULSO AMPEROMTRICO (HPAEC-PAD)
Las muestras de fructanos se disolvieron al 1% en agua millipore; 50 L de esta solucin fue
filtrada en una membrana PVDF (hidrofbica, 0.22 m), centrifugando a 3500 rpm por 2 min. La
solucin filtrada se transfiri a un vial de HPLC. Se inyect 1 L de esta solucin en un sistema
Dionex HPAEC-PAD y las muestras se separaron en una columna analtica PA 100. El sistema de
elucin consisti en las siguientes soluciones: i) solucin A, agua millipore; ii) solucin B, NaOH
0.5 M, en estado lquido y grado HPLC; iii) solucin C, acetato de sodio 1 M. En la Figura 25 se
muestra el programa de elucin: T0min = 80% A, 20% B; T5min = 50% A, 50% B; T15 min, 40% A, 50%
B, 10% C; T20min = 33% A, 50% B, 17%C; T35min, 50% B, 50% C.
La identidad de los compuestos se determin con estndares o por comparacin del patrn de
elucin de fructanos de otros cultivos que se corrieron bajo condiciones similares (Shiomi et al.,
1991; Ritsema et al., 2003).

Figura 25. Programa de elucin utilizado en la separacin cromatogrfica de fructanos de

Agave y Dasylirion.

83

1.3.3. DERIVATIZACIN DE FRUCTANOS A ALDITOL ACETATOS PARCIALMENTE

METILADOS (PMAA)
Se pesaron 10 mg de fructanos liofilizados y se colocaron en reactiviales de 4 mL. Se aadieron
500 L de DMSO (Sigma), agitando y sonicando toda la noche o hasta la disolucin completa de
la muestra. La derivatizacin de carbohidratos a PMAA se hizo de acuerdo al mtodo de Ciucanu y
Kerek (1984) con algunas modificaciones. Los pasos de este proceso se muestran
esquemticamente en la Figura 26 (tomando como ejemplo a la 6-Kes).

i).- METILACIN
La metilacin se realiz por adiciones subsecuentes de NaOH pulverizado finamente y en fresco,
seguido de CH3I. La cantidad de NaOH aadida se calcul en base a lo siguiente:
- Nmero de moles del monosacrido anhidro base (MW 162 mg/mmol)
Cantidad de muestra 162 mg/mmol.
- El nmero de moles se multiplic por el nmero de grupos OH disponibles para la metilacin en
el polmero (en el caso de los fructanos, 3 para cada residuo de fructosa). Con el nmero de moles
se calcul la masa de NaOH correspondiente y se multiplic por tres para tener un exceso de
reactivo y asegurar una metilacin completa. Por su parte, el CH3I se adicion en una cantidad
molar equivalente al NaOH considerando la densidad de este agente metilante (2.275 mg/L).
Este proceso se realiz durante 3 das, adicionando los reactivos en intervalos de 4 a 5 h y
manteniendo la agitacin constante y las condiciones anhidras. El in CH3SOCH2-Na+, generado
como producto secundario, form una suspensin lechosa que dificult la agitacin de la
suspensin e indic el final de la metilacin.

ii).- EXTRACCIN DE PRODUCTOS METILADOS

El contenido de los reactiviales se vaci en un tubo con rosca de 30 mL, enjuagando los
reactiviales dos veces con agua destilada y una ms con CH2Cl2. Se adicionaron 5 gotas de
Na2S2O3 al 5% para reducir los iones yoduro que se generan con frecuencia. La fase orgnica se
recuper, mientras que la acuosa se extrajo dos veces ms con CH2Cl2, recuperando y juntando la
fase orgnica. La fase orgnica se lav con suficiente agua para eliminar reminiscencias de
DMSO. Cuando la formacin de las dos fases no fue muy clara, se adicion una pequea cantidad
de NaCl para facilitar la separacin de las fases.

84

i) Metilacin

ii) Hidrlisis

iii) Reduccin

iv) Acetilacin

Figura 26. Metodologa de derivatizacin de carbohidratos a alditol acetatos parcialmente

metilados (PMAA).

85

A la fase orgnica se le agreg perlas de CaCl2 para retirar la humedad y despus de un tiempo
suficiente, las muestras se pasaron por columnas de Na2SO4 anhidro y se llevaron a completa
sequedad con N2 (g). La eficiencia de la metilacin se verific por anlisis de infrarojo, donde la
desaparicin de la banda correspondiente al grupo alcohol, en el rango de 3700 a 3100 cm-1,
indic una completa metilacin.

iii).- HIDRLISIS
A los fructanos permetilados, contenidos en reactiviales de 4 mL, se les adicion 900 L de cido
trifluoroactico (TFA) 0.5 M. La hidrlisis se realiz a 90 C por 1 h. El reactivial se dej enfriar.
Las muestras se llevaron a completa sequedad con N2 (g) con adicin de tolueno para formar una
mezcla azeotrpica. Una vez que las muestras se secaron, se aadi 1 mL de tolueno y se
llevaron de nuevo a completa sequedad.

iv).- REDUCCIN
La reduccin se llev a cabo con 5 mg de borohidruro de sodio deuterado (NaBD4) disueltos en
500 L de NH4OH 1N, a 60 C por 1 h. Una vez que se enfriaron los reactiviales, se adicion
cuidadosamente 5 gotas de cido actico para destruir el exceso de NaBD4. Las muestras se
evaporaron hasta 1/3 de su volumen original, aadiendo una solucin metanlica de cido actico
al 15% (manteniendo siempre una temperatura inferior a 40 C). Este paso se repiti dos veces
para asegurar la eliminacin de boratos que pueden interferir en la acetilacin o favorecer la
produccin de difructosa anhidra. Las muestras se llevaron a completa sequedad en presencia de
metanol.

v).- ACETILACIN
A las muestras hidrolizadas y reducidas, se adicion 500 L de anhdrido actico y 250 L de
piridina como catalizador. La acetilacin se llev a cabo por 2 h a 90 C. Despus de que las
muestras se enfriaron, la reaccin se neutraliz aadiendo, con cuidado y lentamente, unas gotas
de solucin saturada de NaHCO3, esperando que poco a poco la solucin dejara de producir CO2.

86

vi) EXTRACCIN DE ALDITOL ACETATOS PARCIALMENTE METILADOS

El reactivial conteniendo los PMAA se lav dos veces con solucin saturada de NaHCO3 y dos
veces ms con CH2Cl2, pasando la muestra a un recipiente de 30 mL. La fase orgnica se
recuper, mientras que la fase acuosa se lav dos veces ms con CH2Cl2, recuperando y juntando
la fase orgnica. La fase orgnica se lav dos veces ms con agua y otra tercera con HCl 0.1 M
fro para destruir la piridina remanente. La fase orgnica se sec con CaCl2 anhidro y despus de
un tiempo, los PMAA se filtraron en una columna de Na2SO4 anhidro y se llevaron a completa
sequedad con N2 (g).
vii) IDENTIFICACIN DE DERIVADOS POR CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADA A
ESPECTROMETRA DE MASAS (GC-MS)
Las muestras fueron disueltas en 4 mL de CH2Cl2. Para la separacin cromatogrfica se inyect 1
L, en un modo splitless, en un cromatgrafo de gases (Hewlett Packard 5890 Series II)
acoplado a un espectrmetro de masas (Hewlett Packard 5972 Series) como detector. Se utiliz
una columna capilar de fenil metil silicon al 5% (HP-5, 25 m 0.31 mm d.i. 0.52 m de grosor) y
helio (He) como gas acarreador a una velocidad de flujo de 2 mL/min, sosteniendo una presin de
5 psi. La temperatura inicial del horno fue de 60 C sostenida por 3 min, seguida de una rampa de
temperatura de 4 C/min hasta 160 C por un min, 0.5 C/min hasta 180 C por 1 min y
finalmente, 20 C/min hasta 300 C por 10 min. La temperatura del inyector y del detector fue de
300 C. En el detector de masas, las muestras vaporizadas se ionizaron en alto vaco por
bombardeo electrnico con una energa de ionizacin de 70 eV. Suc (Sigma), 1-Kes, Nys, DP5
(Megazyme) y fructanos extrados de tubrculos de cebolla y dalia fueron derivatizados como se
indica anteriormente. La identificacin de los derivados se hizo de acuerdo a su patrn de masas,
comparaciones con los estndares y segn lo reportado en la literatura (Carpita y Shea, 1990;
Bancal et al., 1993).

viii) CUANTIFICACIN DE DERIVADOS POR CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADA A

UN DETECTOR DE IONIZACIN EN FLAMA (GC-FID)
Para la cuantificacin de los derivados, 1 L de las muestras se inyect en un cromatgrafo de
gases Hewlett Packard (5890) operado bajo las mismas condiciones que se describieron
anteriormente. Se utiliz un detector FID, que por su gran sensibilidad y su respuesta uniforme y

87

proporcional al nmero de compuestos formados en la combustin, sigue siendo el detector de

eleccin para anlisis cuantitativos. Una mezcla de H2 (combustible) y aire (oxidante) fue utilizada
para la combustin. El rea de los compuestos, registrada en un graficador Hewlett Packard
(HP3396 Series II), fue corregida en base a una respuesta efectiva de carbono (e.r.c.), segn los
parmetros determinados por Sweet y col (1975) para este tipo de compuestos. Una vez corregida
el rea de los derivados, stos fueron cuantificados en base a porcentaje de rea.

1.4. CARACTERIZACIN DE FRUCTANOS DE A. tequilana Weber var. azul (JALISCO)

Los fructanos de plantas de A. tequilana Weber var. azul proveniente de la regin de Los Altos,
Jalisco fueron caracterizados con mtodos espectroscpicos de mayor resolucin, mismos que a
continuacin se describen.

1.4.1. ESPECTROMETRA DE MASAS POR IONIZACIN/DESORCIN POR LSER ASISTIDA

POR UNA MATRIZ-TIEMPO DE VUELO (MALDI-TOF-MS)
En el anlisis de masas por ionizacin/desorcin por lser asistida por una matriz (MALDI-TOFMS) se utiliz un sistema Hewlett-Packard LDI AOOXP MS en un modo in positivo. El voltaje de
aceleracin fue de 30 kV y el voltaje de extraccin fue de 9 kV. Se us una presin de vaco de
2.110-6 Torr. Las muestras se ionizaron con lser de nitrgeno (337 nm) con un pulso de 4 a 7.5
J y un ancho de pulso de 3 ns. Las muestras se disolvieron en agua y co-cristalizadas con cido
2,5-dihidroxibenzoico, utilizado como matriz asistente. Las muestras se introdujeron a la sonda y
rpidamente se secaron al vaco. La solucin de la muestra se seco serialmente con la matriz para
obtener una sensibilidad ptima. Una mezcla de maltooligosacridos se us como estndar de
calibracin.

1.4.2. RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR DE CARBONO 13

Este anlisis fue realizado en colaboracin con el Dr. Guillermo Mendoza-Daz de la Facultad de
Ciencias Qumicas de la Universidad de Guanajuato. Cinco mg de fructanos de A. tequilana
liofilizados, fueron disueltos en 500 L de agua deuterada (D2O). El espectro de 13C-RMN fue
registrado con un equipo Varian de 300 MHz, utilizando 32 barridos. La muestra se analiz a 30
C, con un tiempo de adquisicin de 3.5 s y un pulso de 90. Las seales se asignaron por
comparacin con los ajustes qumicos presentados por Suc (Sigma), 1-Kes, Nys, DP5

88

(Megazyme), utilizados como estndares, y por valores reportados en la literatura (Liu et al., 1991;
Sims et al., 2001 y otros). El tetrametil silano fue utilizado como referencia externa.

1.4.3. RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR DE PROTN

Cinco mg de fructanos de A. tequilana liofilizados se disolvieron en 500 L de D2O. El espectro de
1H-RMN

fue generado con un equipo Varian de 300 MHz en un modo de transformada de Fourier,

usando 32 barridos. Las muestras fueron analizadas a 30 C con un tiempo de adquisicin de 3.5
s con un pulso de 90.

2.

IDENTIFICACIN

DE

ACTIVIDADES

ENZIMTICAS

INVOLUCRADAS

EN

EL

METABOLISMO DE FRUCTANOS

2.1. EXTRACCIN DE PROTENAS

Todo el proceso de extraccin de protenas se llev a cabo a 4 C utilizando en cada lote de
extraccin 250 g de muestra molida. Este material se pulveriz con N2 lquido y las protenas se
extrajeron con buffer McIlvaine (2 mL/g) adicionado con -mercaptoetanol 1 mM (Apndice A). La
suspensin se agit constantemente durante 2 h, se filtr con un cedazo y despus se centrifug a
18000 rpm por 30 min. El sobrenadante se satur con sulfato de amonio al 20% y se dej reposar
por 2h. El precipitado obtenido despus de centrifugar, se descarto y el sobrenadante, de nuevo
se saturado con sulfato de amonio al 80%, dejndolo precipitar toda la noche. Las protenas
recuperadas por centrifugacin se disolvieron con buffer de afinidad (buffer McIlvaine adicionado
con CaCl2 1 mM, MnSO4 1 mM y NaCl 0.5 M) y centrifugadas. El material precipitado fue
eliminado. Al sobrenadante se le denomin extracto crudo.

2.2. ESTRATEGIAS DE PURIFICACIN

En la identificacin de las enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos en agave y
dasylirion, se intentaron dos estrategias de purificacin, cuyos resultados se muestran en el
presente trabajo. En la primera estrategia se utiliz cromatografa de afinidad, de intercambio
aninico, de exclusin y resina de hidroxiapatita y los productos generados fueron identificados por
TLC. Mientras que, en la segunda estrategia de purificacin, se utiliz la cromatografa de
intercambio aninico, seguido de cromatografa de afinidad; los productos se identificaron con TLC

89

y/o HPAEC-PAD. A continuacin se describen las condiciones cromatogrficas que se utilizaron

en ambas estrategias.

2.2.1. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

Se utiliz una columna de vidrio con resina de afinidad concanavalina A (Amersham Pharmacia
Biotech; (16.5 1.2 cm)) equilibrada con 130 mL de buffer de afinidad (Apndice A). El extracto
crudo se carg a la columna a una velocidad de flujo de 0.5 mL/min y se recuper la fraccin que
no interactu con la resina. La columna se lav con buffer de afinidad hasta una lectura
espectrofotomtrica (280 nm) menor de 0.01 ( 3 vol. de columna). La muestra se eluy con 1.5
vol. de -metil-manopiransido 150 mM disuelto en buffer de afinidad, colectando fracciones de 3
mL. Las fracciones con absorbancia se juntaron y al igual que la fraccin sin interaccin con la
resina, se dializaron contra agua por 16 h con cambios continuos y agitacin suave. Se realiz una
dilisis posteriormente contra buffer McIlvaine, utilizando membranas de dilisis (Sigma) de 12
kDa de corte. A esta fraccin que se denomin ConA, se le determin concentracin protenica por
el mtodo de Bradford (1976) y se hicieron ensayos enzimticos. La muestra se liofiliz.

2.2.2. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO ANINICO

La muestra diluida en 3 mL de buffer de intercambio aninico (Apndice A) fue cargada en una
columna de vidrio (12 1.2 cm) con resina de intercambio aninico Mono Q Sepharose Fast Flow
(Amersham Pharmacia Biotech), previamente equilibrada con 3 vol. de buffer. Se recuper la
fraccin que no interaccion con la resina, denominndosele fraccin Q0. La columna se lav con
este mismo buffer hasta 280 nm < 0.01 (3 vol.) utilizando un flujo de 0.5 mL/min. Las protenas
se eluyeron con un gradiente continuo de 100 mL de NaCl (0 a 600 mM) disuelto en buffer de
intercambio aninico, colectando fracciones de 3 mL. Las fracciones con absorbancia se juntaron
en grupos y, junto con la fraccin que no present interaccin con la resina, se dializaron contra
agua por 16 h con cambios continuos y agitacin suave y posteriormente con buffer McIlvaine. A la
muestra Q0 y las denominadas Q1, Q2, etc. se les determin concentracin protenica y se ensay
su actividad enzimtica. Las muestras se liofilizaron.

90

2.2.3. CROMATOGRAFA DE HIDROXIAPATITA

Las fracciones Q provenientes de la cromatografa de intercambio aninico fueron cargadas en
una columna de vidrio (1.5 1.7 cm) con resina de hidroxiapatita (Bio Rad). La resina se equilibr
con 3 vol. de columna (9 mL) de buffer Bis-Tris-HCl 20 mM (pH 6.0). La muestra disuelta en este
buffer (de 200 a 500 L) se carg a la columna. La columna se lav con 3 mL de buffer,
recuperando esta fraccin denominada HA-L (hidroxiapatita-lavada). La muestra que interaccion
con la resina, se eluy con 3 vol. de buffer NaH2PO4 300 mM (pH 5.6) y colectada en dos
fracciones. Estas muestras se denominaron HA-E1 y HA-E2, respectivamente (hidroxiapatitaeluida). Cada una de las fracciones se dializ contra agua durante 5 h y se liofiliz. Las muestras
se disolvieron en buffer McIlvaine y se realiz el ensayo enzimtico.

2.2.4. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN (FILTRACIN EN GEL)

Para la cromatografa de exclusin, se utiliz una columna de vidrio (60 2.6 cm) empacada con
resina Sephacryl S-200 (Amersham Pharmacia). La columna se equilibr con buffer de exclusin
(Apndice A). Para determinar el volumen vaco se carg azul dextran (2000 kDa) a la columna, a
una concentracin de 1 mg/mL; mientras que para calibrar la columna se corrieron los siguientes
estndares: catalasa (232 kDa), -globulina (158 kDa), seroalbmina (66 kDa) y lisozima (14.3
kDa). La determinacin del volumen vaco y la calibracin de la columna se hicieron por triplicado.
La muestra liofilizada se diluy en 3 mL de buffer de exclusin, se carg en la columna y se eluy
con este mismo buffer a una velocidad de 0.8 mL/min, colectando fracciones de 2 mL. El
coeficiente de distribucin (KD) de la masa molecular de las protenas eludas se calcul de
acuerdo a la ecuacin IV:

KD = Volumen de elucin muestra - Volumen vaco

(IV)

Volumen de columna - Volumen vaco

Las fracciones con absorbancia se juntaron por grupos, se dializaron contra agua con cambios
continuos y agitacin suave, y posteriormente dializadas contra buffer McIlvaine. Se realizaron
ensayos enzimticos.

91

2.3. CUANTIFICACIN DE PROTENAS

La concentracin de protenas en cada fraccin fue determinada por el mtodo de Bradford (1976),
basado en el cambio de color del Coomassie de rojo a azul, despus de que este colorante
interacciona con las protenas. Aunque las protenas usadas para este ensayo son
desnaturalizadas irreversiblemente, este mtodo es preferido por rpido y sensible (25 a 200
g/mL). Los extractos de protenas disueltos en buffer McIlvaine se llevaron a un volumen final de
100 L, se aadi 1 mL de buffer Bradford (Apndice A) y se agit en vrtex. Para la
cuantificacin de protenas en cada determinacin se hizo en paralelo, una curva de calibracin
usando albmina de suero bovino (BSA) como protena estndar.

2.4. ENSAYOS ENZIMTICOS

La actividad enzimtica de cada una de las fracciones eludas de las distintas columnas
cromatogrficas, fueron ensayadas en buffer McIlvaine, en presencia de Suc 200 mM, 1-Kes 50
mM o fructanos de agave al 1%, incubando a 0 30 C, segn se indica. Se tomaron alcuotas
peridicamente para ser analizadas por TLC o HPAEC-PAD. Las enzimas se inactivaron a 90 C
durante 5 min.

2.5. SEPARACIN ELECTROFORTICA

La separacin electrofortica de protenas se llev a cabo en geles de poliacrilamida (PAGE) al
10% (resolucin para protenas de 18 a 75 kDa), en condiciones desnaturalizantes en presencia
del detergente SDS. El reservorio interno y externo de la cmara electrofortica se llen con buffer
de electroforesis (Tris 25 mM, glicina 192 mM). Las muestras se mezclaron con buffer de muestra
5, se calentaron 10 min a 100 C, se concentraron con un breve pulso en una microfuga y se
cargaron en cada carril del gel concentrador. Las protenas se separaron con una corriente de 200
V. Las protenas separadas por geles de electroforesis se visualizaron con azul de Coomassie.
Los geles se transfirieron en pequeos contenedores con 20 mL de solucin de tincin (Apndice
A) y agitacin suave. Los geles fueron desteidos con solucin de desteido hasta la visualizacin
clara de las bandas de protenas.

92

3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS CODIFICANTES DE ENZIMAS DEL

METABOLISMO DE FRUCTANOS DE AGAVE Y SU EXPRESIN EN Pichia pastoris

3.1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS CODIFICADORAS

3.1.1. EXTRACCIN DE CIDO RIBONUCLEICO

Aproximadamente 50 mg de material de agave o dasylirion almacenado a -80 C fueron colocados
en un tubo eppendorf de 2 mL de capacidad, inmersos en un tanque con N2 lquido y pulverizados
en un desmembrador (B. Biotech International, Alemania) por 2 min a 2800 rpm, usando dos
perlas de vidrio de 2 mm y dos de 4 mm de dimetro. Se probaron distintos mtodos de extraccin
de ARN buscando las condiciones ptimas de rendimiento y calidad de acuerdo a las
caractersticas del material en estudio:

i) MTODO DE PRECIPITACIN CON CLORURO DE LITIO

Al tejido pulverizado se agregaron 500 L de buffer de extraccin (Apndice A) y se agit en el
desmembrador. Se adicionaron 500 L de mezcla fenol:cloroformo: alcohol isoamlico (v/v/v,
50:49:1), se agit en el desmembrador, se le adicion 40 L de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) y se
agit de nuevo en el desmembrador. Las muestras reposaron en hielo por 15 min y se
centrifugaron a 4 C a 13000 rpm por 15 min. La suspensin se transfiri a un tubo eppendorf
nuevo y se desecharon los restos de tejidos. La muestra se centrifug a 13000 rpm por 20 min y
se transfiri la fase acuosa (superior) a un eppendorf. Se aadi 500 L de isopropanol fro y se
dej reposar 20 min a 80 C. La muestra se centrifug y la pastilla se lav con 1 mL de etanol
absoluto centrifugando a 10000 rpm durante 5 min. El precipitado se sec poniendo primero el
tubo invertido sobre un papel filtro por 1 min en la campana y luego se dej secar en hielo.
La pastilla se resuspendi en 200 L de agua estril tratada con DEPC, eliminando el material
insoluble por centrifugacin. El ARN se precipit con 100 L de LiCl 8M durante toda la noche a 20 C, recuperndose al da siguiente por centrifugacin a 13000 rpm durante 20 min. La pastilla
se lav con etanol al 75%, resuspendindola posteriormente con cuidado. Se centrifug de nuevo
a 7500 rpm por 20 min. El ARN se resuspendi en agua desionizada y se almacen a - 20 C
hasta su anlisis.

93

ii).- MTODO DE TRIZOL (Gibco, BRL)

Al tejido pulverizado se agreg 1 mL de reactivo Trizol (solucin monofsica de fenol pH 8 e
isotiocianato de guanidina). El rompimiento del tejido se hizo en el desmembrador agitando a 2800
rpm durante 2 min. Las muestras se dejaron reposar por 5 min a temperatura ambiente para
disociar completamente el complejo nucleoprotico y despus se centrifugaron a 13000 rpm por
20 min, transfiriendo la suspensin a un eppendorf limpio y eliminando los restos de tejido. La
muestra se centrifug de nuevo a 13000 rpm por 20 min. Se recuper la fase acuosa (superior),
transfirindola a un tubo nuevo. Se adicion alcohol isoproplico fro y se dej reposar 15 min a
temperatura ambiente. El ARN se recuper por centrifugacin. La pastilla se lav con etanol fro al
75%, resuspendindola y centrifugndola de nuevo a 7500 rpm por 15 min. El ARN se
resuspendi en 20 L de agua desionizada y se almacen a -20C hasta su anlisis.

3.1.2. GELES DE AGAROSA

Para el anlisis de la integridad del material genmico y la verificacin de algunos productos, se
corrieron geles de agarosa. La agarosa se disolvi en buffer TAE con bromuro de etidio (Apndice
A). Se mezcl 2 L de muestra con 2 L de buffer de carga y se aplicaron individualmente en
cada pozo del gel de agarosa. Las corridas se efectuaron en buffer TAE a 2 mV/min. La
visualizacin de las bandas de cidos nucleicos se hizo mediante luz ultravioleta.

3.1.3 ELECTROFORESIS EN MICROCHIP

La calidad y concentracin del ARN se midi en un aparato de electroforesis Agilent 2100
bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) que funciona en base a microchips (RNA 6000
Nano LabChip kit). Se adicion una serie de colorantes a 1 L de cada una de las muestras de
ARN, las cuales se depositaron dentro de unas microceldas contenidas en una placa de chips. La
placa se agit por 1 min y se coloc dentro del lector. Adicional a las muestras, se corri 1 L de
marcador de ARN como control positivo. La seal emitida consisti en un electroferograma que
puede traducirse en una imagen de gel de agarosa.

94

3.2. OBTENCIN DE SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS (ADNc) POR TRANSCRIPCIN

REVERSA
Una vez obtenido ARN de calidad aceptable, se dispuso a la sntesis de las cadenas
complementarias (ADNc) a travs de reacciones de transcripcin reversa, utilizando el kit RT-PCR
Superscript II (Gibco BRL). En un tubo eppendorf libre de nucleasas, se coloc 1 L de oligo-dT1218

(500 g/mL), 2 L de ARN total, 1 L de mezcla de dNTP (10 mM de cada uno dATP, dGTP,

dCTP y dTTP) y agua estril hasta un volumen final de 12 L. La mezcla de reaccin se calent a
65 C por 5 min para destruir cualquier estructura secundaria del ARN que pudiese causar error
en la transcripcin reversa. Inmediatamente se coloc la mezcla en hielo y se aadi 4 L de
buffer de transcripcin (Apndice A), 2 L de DTT 0.1 M y 1 L de inhibidor recombinante de
ribonucleasas RNaseOUT (40 U/L). El contenido del eppendorf se mezcl suavemente, se
incub 2 min a 42 C y posteriormente se aadi 1 L (200 U) de transcriptasa reversa
Superscript II (purificada de cepas de E. coli que expresan el gen pol del virus de la leucemia,
Moloney murine). La reaccin se incub 50 min a 42 C y se inactiv a 72 C durante 15 min. Para
eliminar restos de ARN complementario al ADNc se adicion 1 L (2 U) de RNasa H de E. coli y la
reaccin se incub 20 min a 37 C.

3.2.1. DISEO DE OLIGONUCLETIDOS INICIADORES

En las reacciones de amplificacin mediada por la enzima ARN polimerasa (PCR), se utilizaron
oligonucletidos degenerados como iniciadores (o primers) (Tabla 14). Estos fueron diseados
en base a regiones altamente conservadas de secuencias de ADNc, reportadas en el banco de
datos

(www.ncbi.nhl.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val)

como

involucradas

en

el

metabolismo de fructanos. Se incluyeron secuencias de Inv-V y diversas FT de origen vegetal

(Figura 27). Como control positivo de la reaccin de PCR se utilizaron oligonucletidos
pertenecientes a secuencias conocidas de ARN ribosomal de algunos agaves como A. americana
y A. striata (Tabla 14).

3.2.2. AMPLIFICACIN DE SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS

La mezcla de ADNc sintetizados por transcripcin reversa fue utilizada como templado en la
reaccin de amplificacin por PCR, usando distintas combinaciones de los oligonucletidos
degenerados (AtFT1-AtFT2; AtFT3-AtFT4 y AtFT1-AtFT4). Para un volumen final de reaccin de
95

50 L, en un tubo de PCR se adicion 5 L de buffer de PCR 10 adicionado con MgCl2 25 mM,

0.5 L de mezcla de dNTP 20 mM, 0.5 L de cada oligonucletido iniciador 100 M, 0.5 L de
enzima Taq polimerasa (Thermophilus aquaticus, 5 U/L), 41.5 L de agua y 2 L de ADNc. Las
condiciones de amplificacin fueron como se indican: temperatura inicial de desnaturalizacin 95
C por 2 min, seguido de 30 ciclos con una temperatura de desnaturalizacin de 95 C por 1 min,
temperatura de alineamiento de 50 C por 30 s y temperatura de extensin de 72 C por 1.5 min;
posteriormente se utiliz una temperatura final de extensin de 72 C por 10 min. Los productos
de PCR se analizaron por geles de agarosa al 0.8%.

Tabla 14. Secuencia de oligonucletidos utilizados.

Oligonucletido
At-Ctr1
At-Ctr2
At-FT1
At-FT2
At-FT3
At-FT4
5AtRACEOuter

Secuencia
5-TTGAGGCCCGAACGG-3
5-TATTGCAGGATCGCA-3
5-TWYCATTTYCARCC-3
5-GGGTCNCKGAARTC-3
5-TGGGGCCAYGCNGTVTCC-3
5-TCVAYRCAYTCCCACAT-3
5-TGGATTGGGGTCCCTGAAGTCCT-3

5AtRACEInner

5-AGCCACCGCAAGATTGACGAC-3

3 AtRACE
5RACE Adapter

5-CGGGCTCAGTTGCGGTATTA-3
5-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACAC
UGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3
5-GCTGATGGCGATGAATGAACAC
TG-3
5-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTG
CTGGCTTTGATG-3
5-GCGAGCACAGAATTAATACGAC
T-3
5-TTACCGCAATCGGAATCGATTTT
GGGTGAG-3
5 GGAGTTTTGAGTGTCTAGATGAG
CTTTCAG-3

5RACE Outer
5RACE Inner
3RACE Outer
PpAt-FT1
PpAt-FT2

Direccin
Directa (control)
Reversa (control)
Directa (degenerado)
Reversa (degenerado)
Directa (degenerado)
Reversa (degenerado)
Reverso (gen especfico; externo)
Reverso (gen especfico; interno)
Directo (gen espec-fico)
5Adaptador
(Ambion)
Directo (Ambion)
Directo (Ambion)
Reverso (Ambion)
Directo (se indica el
sitio Cla I)
Reverso (se indica el sitio Xba I)

De acuerdo al cdigo IUB: W= A + T; Y= C + T; R, A + G; N= A + C + T + G;

K= T + G; V= A + C + G

96

3.2.3. ELUCIN Y PURIFICACIN DE ADN A PARTIR BANDAS DE AGAROSA

La separacin de los productos de PCR por electroforesis fue visualizada por UV y aquellas
consideradas promisorias de acuerdo a su tamao (kb), fueron eluidas y purificadas del gel, con
un kit comercial (GFX PCR DNA and gel band purification kit, Amersham). La banda cortada del
gel se coloc en un tubo eppendorf, se adicion 300 L de buffer de captura (buffer de acetato
con agentes caotrpicos), se agit y se incub a 60 C por 15 min o hasta que la agarosa se
disolvi completamente. La suspensin se carg en una columna empacada con matriz de fibra de
vidrio. Despus de centrifugar 30 s a 13000 rpm, el ADN qued retenido en la matriz de vidrio,
mientras que protenas y sales contaminantes fueron eliminadas en el sobrenadante. El ADN se
lav con buffer de lavado (TE con etanol absoluto a una concentracin final del 80%),
centrifugando 30 s a 13000 rpm. A la columna se le adicion 50 L de agua desionizada,
reposando por 2 min. Posteriormente el ADN fue eluido por centrifugacin a 13000 rpm durante 2
min. El ADN purificado se concentr hasta sequedad total por sublimacin al vaco (en un maxidry) a temperatura ambiente.

3.2.4. PREPARACIN DE CLULAS COMPETENTES

Las clulas de E. coli DH5 se utilizaron para propagar las secuencias amplificadas. Se tom una
sola colonia de esta cepa, se inocul en 5 mL de medio Luria Bertani lquido (LB) y se incub toda
la noche a 37 C con agitacin moderada. Al da siguiente, se tomaron 2.5 mL de esta suspensin
celular y se inocul a 500 mL de medio LB contenido en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Las clulas
crecieron en agitacin constante a 37 C hasta una densidad ptica a 600 nm de 0.5 a 0.6. Las
clulas se dejaron reposar 15 min en bao de hielo y se transfirieron a un recipiente de centrfuga
previamente enfriado. Los procesos subsecuentes se llevaron a cabo a 4 C. Las clulas se
centrifugaron a 4200 rpm durante 20 min, desechando el sobrenadante y resuspendiendo la
pastilla en 5 mL de agua fra. Se aadieron 500 mL de agua destilada fra, agitando hasta una
suspensin homognea. Las clulas se centrifugaron de nuevo, descartando el sobrenadante
inmediatamente. Las clulas se resuspendieron con el lquido remanente. El paso anterior se
repiti, eliminando inmediatamente el sobrenadante y resuspendiendo la pastilla bacteriana en
glicerol estril al 10%. Las clulas se centrifugaron, el sobrenadante se elimin y el precipitado se
resuspendi en 4 mL de glicerol al 10%. Se hicieron alcuotas de 100 a 200 L de clulas en tubos
eppendorf, se congelaron inmediatamente en N2 lquido y se almacenaron a 80 C.

97

Figura 27. Diseo de oligonucletidos degenerados. Diversas secuencias de fructosiltransferasas e invertasas reportadas en el banco de datos,
fueron alineadas. Sitios conservados fueron utilizados para el diseo de oligonucletidos degenerados. De acuerdo al cdigo IUB: W= A + T; Y= C
+ T; R, A + G; N= A + C + T + G; K= T + G; V= A + C + G. Para abreviaturas Ac-1SST y otras, ver Tabla 22.

98

3.2.5. CLONACIN Y TRANSFORMACIN

La clonacin se realiz en un sistema pGEM-T Easy Vector (Promega) (Figura 28), usando la
enzima T4 DNA ligasa (del bacterifago T4, Promega). En un tubo eppendorf se coloc 1 L de
buffer de ligacin 10x, 1 L de enzima T4 DNA ligasa (3 U Weiss*/L, *cantidad de enzima que
cataliza el intercambio de 1 nmol de 32P de pirofosfato en [, -32P]-ATP en 20 min a 37 C), 3 L
de agua desionizada y 5 L de ADN. La mezcla se incub a 4 C por un tiempo variable de 24 a
48 h o a 16 C toda la noche. El sistema pGEM-T Easy consiste en un vector abierto con un par
de timinas en sus extremos, que facilita la clonacin de un producto de PCR despus de que la
enzima Taq en el proceso de amplificacin, adiciona en los extremos del producto un par de
adeninas.
La transformacin se realiz por electroporacin usando clulas competentes E. coli DH5F.
Estas clulas se colocaron en una celda de electroporacin, se adicion de 2 a 5 L de la mezcla
de clonacin y se dej reposar en hielo por 15 min. La transformacin se realiz con un pulso
breve de 2.5 V, una resistencia de 200 ohms y una capacitancia de 25 F.
Inmediatamente se adicion a la celda 1 mL de medio LB. Esto se transfiri a un tubo de ensaye
estril y se incub en agitacin a 37 C por 1 h para la recuperacin de las clulas. Las clulas
transformadas se sembraron en distintos volmenes dispersndolas con una varilla de vidrio en
placas de LB agar (15 g/L) que contena IPTG como inductor de la expresin del plsmido,
carbenicilina (50 g/mL) como factor de seleccin y X-Gal (40 mg/mL disuelto en dimetilformamida) como sustrato de la enzima -galactosidasa (Figura 28). Las placas se incubaron toda
la noche a 37 C. Las colonias que desarrollaron un color blanco despus de crecer, se
recuperaron con la ayuda de una punta estril, se estriaron en placas LB con carbenicilina y las
puntas se transfirieron a tubos de ensaye con 1 mL de LB con antibitico. Los tubos se incubaron
toda la noche en agitacin a 37 C.

3.2.6. PURIFICACIN DE PLSMIDOS (MINIPREPARACIONES)

Las clulas crecidas en medio LB con antibitico fueron recuperadas por centrifugacin a 13000
rpm por 20 min. La purificacin del ADN plasmdico (mini-preps) se realiz con un kit (Quiagen). La
pastilla celular se resuspendi en 200 L de buffer P1 (con RNAasa), se adicion 350 L de
A)
99

B)

Figura 28. Vector pGEM-T Easy. A) Mapa del vector. Se muestra el origen de replicacin para E.
coli (ori), el gen para la -lactamasa que confiere resistencia a la familia de la ampicilina (Ampr) y
el sitio de clonacin mltiple que interrumpe el gen lac Z. T7 y SP6 son regiones promotoras. B)
Secuencia promotora y de la regin de clonacin mltiple. En el sitio de clonacin se encuentra un
segmento corto de ADN de E. coli que codifica los primeros 146 aminocidos de la enzima galactosidasa (del operon lac). Su expresin depende de la capacidad de la clula husped de
codificar la porcin C-terminal de dicha enzima. En presencia del inductor IPTG, la clula traduce
ambos fragmentos que se asocian por -complementacin, generando una protena activa. Las
bacterias Lac+ resultantes de esta complementacin generan colonias azules en presencia del
sustrato cromognico X-Gal; mientras que la insercin de una secuencia de ADN en el sitio de
clonacin, resulta en la formacin de un fragmento N-terminal incapaz de complementacin por lo
que forman colonias de color blanco.

100

buffer de lisis y se incub a temperatura ambiente por 5 min.

Se aadi 350 L de solucin de

neutralizacin. La suspensin se centrifug a 13000 rpm por 10 min. El sobrenadante se carg en

una columna que se centrifug a 13000 rpm por 2 min. La resina se lav con una solucin de
lavado por centrifugacin. A la resina se adicion 50 L de agua desionizada y se incub 5 min a
temperatura ambiente. El ADN plasmdico se eluy por centrifugacin a 13000 rpm por 2 min.

3.2.7. CONFIRMACIN DE LA SECUENCIA EN EL PLSMIDO

Para confirmar la presencia de la secuencia en el plsmido se hicieron reacciones de amplificacin
(PCR), utilizando la combinacin de oligonucletidos degenerados utilizados anteriormente (Tabla
14) y utilizando el plsmido como templado.
Por otra parte, se realiz un anlisis de restriccin, usando las enzimas Eco RI (5-GAATTC-3) o
Not I (5-GCGGCCGC-3) que reconocen las secuencias palindrmicas que flanquean la regin
de clonacin multiple del vector (Figura 27). En un tubo eppendorf se adicion 1 L de buffer O+
(MBI Fermentas) 3.5 L de agua desionizada, 0.5 L de enzima de restriccin (Eco RI o Not I) y 5
L de ADN plasmdico. La reaccin se incub a 37 C por 2 h. Como control negativo se utiliz
una reaccin sin enzima. El producto de la reaccin se corri en geles de agarosa para confirmar
la presencia del inserto. Despus de una cuantificacin espectrofotomtrica a 260 nm, se
tomaron de 200 a 500 ng de ADN plasmdico que contena el inserto y se secuenci.

3.2.8. IDENTIFICACIN DE LAS SECUENCIAS (Blast)

Los fragmentos de nucletidos correspondientes a los resultados de secuenciacin, se
compararon contra una base de datos (www.ncbi.nih.gov/blast) para determinar las mayores
homologas y proponer una posible funcin a la secuencia codificadora.

3.3. AISLAMIENTO DEL ADNc COMPLETO DE LA SECUENCIA CODIFICANTE

Una vez conocidos pequeos segmentos de las secuencias codificadoras, se disearon
oligonucletidos especficos para aislar el ADNc completo (Tabla 14), a travs de la rpida
amplificacin de los extremos del ADNc mediados por la RNA ligasa (RLM-RACE, Ambion). En
reacciones independientes, se amplific los extremos 5(5-RACE) y 3(3-RACE), de acuerdo al
esquema que se presenta en la Figura 29.

101

3.3.1. AMPLIFICACIN RPIDA DEL EXTREMO 5 DEL ADN COMPLEMENTARIO (5-RACE)

i).- ELIMINACIN DE ARNm TRUNCADOS O INCOMPLETOS
En un tubo eppendorf se coloc 2 L de buffer CIP 10, 2 g de ARN total, 1 L de fosfatasa
intestinal de ternera (CIP) y agua hasta un volumen de 10 L. La reaccin se incub a 37 C por 1
h. La enzima CIP hidroliza los fosfatos expuestos del ARNm incompletos o truncados. Despus de
terminada la reaccin, se purific el ARN adicionando 500 L de fenol:cloroformo:alcohol
isoamlico (50:49:1, v/v/v). Se centrifug y se recuper la fase acuosa (superior). El ARN se
precipit con 500 L de alcohol isoproplico, incubando a 20 C por 20 min. El ARN se recuper
por centrifugacin a 13000 rpm por 20 min y se lav con etanol fro al 75%, resuspendiendo la
pastilla y finalmente centrifugando a 7500 rpm por 10 min. La pastilla final se resuspendi en 10
L y se cuantific espectrofotomtricamente a una absorbancia de 260 nm.

Figura 29. Amplificacin de los extremos de ADNc mediado por ARN ligasa (RLM-RACE).
Mtodo segn Ambion. CIP, fosfatasa intestinal de carnero; TAP, fosfatasa cida de tabaco; OGE
5y 3, oligonucletido gen especfico para el extremo 5y 3, respectivamente (5- y 3-AtRACE);
rectngulo negro, los adaptadores y en rectngulo a cuadros oligonucletidos suministrados en el
kit.

102

ii).- HIDRLISIS DE LA ESTRUCTURA CAP DE LOS ARNm

En un tubo eppendorf se coloc 2 L de buffer TAP 10, 2 L de ARN purificado de la reaccin
anterior, 1 L de fosfatasa cida de tabaco (TAP) y agua hasta un volumen final de 10 L. La
reaccin se incub a 37 C por 1 h. La enzima TAP hidroliza la estructura CAP (CH3-GpppNpNp-)
de los ARNm, dejando expuestos los grupos fosfato.

iii).- LIGACIN CON EL ADAPTADOR 5-RACE

Una vez expuesto los grupos fosfato de los ARNm se les adapt al extremo 5 una secuencia
conocida o adaptador 5-RACE (Tabla 14) En un tubo eppendorf se coloc 2 L de buffer de ligasa
10, 2 L de la reaccin anterior, 1 L de enzima ligasa y agua hasta un volumen final de 10 L.
La reaccin se incub a 37 C por 1 h.

iv).- TRANSCRIPCIN REVERSA

La transcripcin reversa para la sntesis de ADNc se realiz con el kit comercial RT-PCR
Superscript II (Invitrogen), de acuerdo a las instrucciones de la seccin 3.2. Como templados se
utilizaron hexmeros al azar.

v).- AMPLIFICACIN POR PCR

La reaccin de PCR se realiz con las siguientes condiciones: temperatura inicial de
desnaturalizacin de 95 C por 2 min; 30 ciclos de amplificacin consistente en una temperatura
de desnaturalizacin de 95 C por 1 min, temperatura de alineamiento de 50 C por 30 s y
temperatura de extensin de 72 C por 2 min. La temperatura final de extensin fue de 72 C por
10 min. Para la amplificacin, se utiliz el oligonucletido suministrado en el kit (5RACE Outer,
Tabla 14) para amplificar el extremo 5 y el oligonucletido gen especfico (5AtRACEOuter) para
amplificar la secuencia en el sentido inverso. Se realiz una segunda reaccin de PCR (de
anidamiento) bajo las mismas condiciones, utilizando el oligonucletido gen especfico (5AtRACE
Inner) y el oligo 5-RACE Interno suministrado en el kit (5RACE Inner). Los productos de PCR se
analizaron por geles de agarosa al 1% para verificar el tamao de los fragmentos. Las bandas se
eluyeron y se purificaron.

103

3.3.2. AMPLIFICACIN RPIDA DEL EXTREMO 3 DEL ADN COMPLEMENTARIO (3-RACE)

En la amplificacin del ADNc en su extremo 3, la fraccin del ARNm se enriqueci a partir del
ARN total, mediante su purificacin en una resina de secuencia poli-A. Para la sntesis del ADNc,
la transcripcin reversa se realiz con el kit RT-PCR Termo Script (Invitrogen), utilizando oligos dT
adaptados a una secuencia conocida (3RACE Adapter, Ambion). La temperatura de la
transcripcin se llev a cabo a 55 C. La amplificacin del extremo 3 del ADNc recin sintetizado,
se llev a cabo mediante un PCR, utilizando un oligonucletido con una secuencia poli A para
amplificar el extremo 3 (3RACE Outer, Ambion) y un oligonucletido especfico diseado a partir
de la secuencia conocida (3AtRACEOuter, Tabla 14). Las condiciones de la reaccin de PCR
fueron como se describe para la amplificacin del extremo 5. Los productos se corrieron en un gel
de agarosa al 1% para verificar el tamao de los fragmentos.

3.3.3. LIGACIN Y CLONACIN DEL ADNc COMPLETO

Cada uno de los extremos del ADNc se clonaron de manera independiente en el vector pGEM-T
Easy y se utilizaron para la transformacin de clulas competentes de E. coli DH5. Se hizo un
escrutinio de colonias blancas, purificacin de plsmidos y verificacin del ADNc por
secuenciacin. Cada uno de los fragmentos fue caracterizado por un anlisis de restriccin para
determinar la orientacin de los insertos. Se dise una estrategia de clonacin para lograr la
ligacin de ambos extremos en la direccin correcta, utilizando un sitio de restriccin nico (Bsh TI
o Age I, 5-ACCGGT-3) en la regin donde ambos fragmentos se traslapan. El ADNc completo y
contenido en el vector, se utilizaron para transformar clulas competentes de E. coli DH5. Las
colonias blancas obtenidas se recuperaron, se purificaron los plsmidos y el inserto se caracteriz
a travs de anlisis de restriccin y finalmente por secuenciacin.

3.4. EXPRESIN EN Pichia pastoris

La levadura Pichia pastoris cepa silvestre X-33 fue el hospedero de eleccin para la expresin
heterloga del ADNc con el objetivo de investigar la especificidad de sustrato y el modo de accin
de la enzima codificada. Como vector de expresin se emple el plsmido pGAPZC (Figura 30)
que confiere resistencia a zeocina (expresin del gen sh ble) y permite la expresin constitutiva del
transgen bajo el promotor GAP (gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa). Dado que el plsmido

104

pGAPZC no contiene un origen de replicacin de levadura, las clulas transformantes se

generan a partir de una recombinacin homloga entre el plsmido y el genoma de la levadura.

Figura 30. Mapa del vector pGAPZ

C. La expresin del vector se encuentra bajo la regin
promotora del gen constitutivo de la gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa (pGAP, 1-483 pb);
factor (493-759 pb), secuencia seal derivada de Saccharomyces cerevisiae que transporta la
protena traducida al espacio extracelular; sitio de clonacin mltiple con sitios de restriccin que
permiten la insercin del ADN heterlogo (760-828 pb); eptope myc (827-856 pb), EQKLISEEDL,
facilita la deteccin de la protena heterloga con el anticuerpo Anti-myc; regin His (872-889 pb),
codifica 6 histidinas para la purificacin de la protena heterloga por afinidad; AOX1 TT (893-1233
pb), regin de terminacin del gen aox1 que procesa eficientemente el ARNm, incluyendo la
poliadenilacin y la estabilidad de la molcula; pTEF1 (1234-1644 pb), promotor del factor de
transcripcin de S. cerevisiae que dirige la expresin del gen Sh ble en P. pastoris que confiere
resistencia a zeocina; pEM7 (1645-1712 pb), promotor eucaritico sinttico que dirige la expresin
constitutiva de Sh ble en E. coli; Sh ble (1713-2405 pb), regin codificadora para el gen Sh ble de
Streptoalloteichus hindustanus que codifica para la resistencia a zeocina; CYC1 (2088-2405 pb),
regin de terminacin de la transcipcin del gen CYC1 de S. cerevisiae que permite la eficiente
terminacin del gen Sh ble; pUC ori (2416-3089 pb), permite la replicacin y mantenimiento del
plsmido en E. coli.

105

3.4.1. ELIMINACIN DEL PPTIDO SEAL Y SECUENCIA DE TERMINACIN

Las FT vegetales son sintetizadas como protenas precursoras con 2 pptidos seales
consecutivos en el extremo N-terminal que se escinden durante la entrada de la enzima al retculo
endoplasmtico y su posterior transporte a la vacuola, respectivamente. El empleo del programa
SignalP (versin 3.0; www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) indica la presencia del pptido seal en la
protena deducida del ADNc aislado. Para deducir el posible inicio de la protena madura se realiz
un alineamiento mltiple de secuencias de la protena deducida del ADNc con diferentes Inv y FT,
cuyos sitios de procesamiento proteoltico se han determinado experimentalmente. Se disearon
los oligonucletidos PpAt-FT1 y PpAt-FT2 (Tabla 14) con la finalidad de eliminar la secuencia
seal y la secuencia de terminacin del ADNc aislado. As mismo, con el uso de estos
oligonucletidos se introdujo en la secuencia, los sitios de restriccin Cla I (Bsu 1 5I, 5ATCGAT-3) en el extremo 5 y Xba I (5-TCTAGA-3) en el extremo 3, para permitir la
clonacin del inserto en fase con el vector. Para la reaccin de amplificacin se utiliz 10ng de
templado, 25M de cada oligonucleotido, 10mM dNTP, 1u Pfu y el ADN fue amplificado bajo las
siguientes condiciones: temperatura inicial de 94 C por 4 min, seguido de 30 ciclos de
temperatura de desnaturalizacin de 94 C por 45 s; 60 C por 45 s; 72 C por 1.30 min y un paso
final de 72 C por 5 min Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa, se purificaron y
se clonaron en el vector pGAPZC previamente digerido con Cla I y Xba I. A esta construccin se
le denomin pGAPZC-At-FT.

3.4.2. PROPAGACIN DEL VECTOR

Se utilizaron clulas de E. coli para la propagacin del vector pGAPZC-At-FT. Las clulas se
transformaron por electroporacin y se incubaron toda la noche en placas LB con bajo contenido
de sal (NaCl 0.5%) suplementadas con zeocina (50 g/mL). Se usn anlisis de PCR y anlisis
de restriccin para el escrutinio de eventos positivos. Confirmada la correcta ligacin de la
secuencia en el marco de lectura del vector, se seleccion un clon de E. coli para producir
suficiente cantidad de plsmido y transformar clulas competentes de P. pastoris.
Aproximadamente 5 g de ADN se lineariz con la enzima de restriccin Avr II (Xma JI, 5CCTAGG-3) que digiere en la regin interna del vector. La digestin se inactiv por
calentamiento, el ADN se extrajo con fenol:cloroformo y se precipit con 1/10 vol. de acetato de

106

sodio 3 M y 2.5 vol. de etanol al 100%. Se recuper el ADN por centrifugacin y la pastilla se lav
con etanol al 80%, se sec y se resuspendi en agua destilada.

3.4.3. TRANSFORMACIN DE Pichia pastoris Y ANLISIS DE EXPRESIN

Se inocularon 5 mL de medio YPD con una colonia de la cepa silvestre X-33 de P. pastoris y se
incubad toda la noche a 30 C. Quinientos L de este preinculo fue inoculado a 500 mL de
medio YPD y se incub toda la noche hasta una densidad ptica a 600 nm de 1.3-1.5. Las
clulas se recuperaron por centrifugacin a 1500 rpm por 5 min a 4 C. La pastilla se resuspendi
en 500 mL de agua fra (0 C) y las clulas se centrifugaron de nuevo y se resuspendieon en 250
mL de agua fra. Las clulas se centrifugaron y se resuspendieronen 20 mL de sorbitol 1M,
repitiendo este paso y manteniendo las clulas en hielo para ser usadas en fresco.
Las cepas de P. pastoris X-33 crecieron a 30 C en un medio YPG [extracto de levadura al 1%
(w/v), peptona al 2% (w/v) y glicerol 2% (v/v)], medio YPDS [ extracto de levadura al 1% (w/v),
peptona al 2% (w/v), Glc 2% (w/v) y sorbitol 1 M] o en un medio de fermentacin [glicerol 4% (v/v),
(NH4)2SO4 2.2% (w/v), K2HPO4 1.82% (w/v), MgSO4.7H2O 0.75% (w/v) y CaCl2.2H2O 0.05% (w/v),
suplementado con vitaminas y elementos trazas recomendados por Cregg et al., 1987]. Las cepas
de P. pastoris X-33 se transformaron por electroporacin con 5 g del vector pGAPZC-AtFt
linearizado con Avr II. Las transformantes se seleccionaron en placas YPDS suplementadas con
Zeo (100 g/mL) y se incubaron 4 das a 30 C.
Se realizaron fermentaciones con P. pastoris expresando el gen atft o cepas transformadas con el
vector pGAPZC vaco (control negativo) usando tanques de fermentacin de 2.5 L (B.E.
Marubishi, Tokio, Japn) acoplado a una computadora para la adquisicin de datos y supervisin
de las condiciones de fermentacin, a travs de un programa denominado FERMACS. Las
condiciones de operacin durante la fermentacin fue una temperatura de 30 C y pH 6.0, una
velocidad constante de aereacin a un flujo de 4 L/min y agitacin de 500 rpm. El final de la fase
de fermentacin despus de la deplecin del glicerol fue juzgado en base a un incremento en el
pH y pO2. Posteriormente, el cultivo fue adicionado con glicerol al 50% (v/v) y elementos traza, con
un incremento gradual del flujo entre 29.5 y 811.2 mL/min respecto al volumen inicial. Despus de
una fermentacin por 72 h, las celulas se colectaron por centrifugacin y se ensay la actividad
enzimtica en la biomasa y en el sobrenadante del cultivo.

107

VIII. RESULTADOS Y DISCUSIN

1. COMPARACIN Y CARACTERIZACIN ESTRUCTURAL DE CARBOHIDRATOS DE

ALMACN EN AGAVES Y DASYLIRION

1.1. PATRN DE CARBOHIDRATOS NO ESTRUCTURALES

La cantidad de carbohidratos que es almacenada en los tallos de agave es la caracterstica ms
importante considerada por los productores de estos cultivos; pues al ser la pia la parte industrial
utilizada en la elaboracin de bebidas alcohlicas, una mayor acumulacin de azcares en este
rgano significa mayores ganacias econmicas. En la Figura 31 se muestra el contenido de
carbohidratos no estructurales solubles en las especies de agave y dasylirion estudiadas. La
mayora de estas especies present un intervalo de concentracin de carbohidratos totales entre
360 y 640 mg/g. Dichos valores indican que estas especies acumulan mayor cantidad de
carbohidratos en su rgano de almacn comparada con otros cultivos como dalia (350 mg/g en
tubrculos) determinado en este mismo estudio, o con lo reportado para achicoria (240 mg/g, Van
Waes et al., 1998) o pastos como Lolium perenne (hasta 370 mg/g, Turner et al., 2006). De las
especies analizadas, destaca la alta concentracin de carbohidratos en A. tequilana proveniente
de la regin de Jalisco (At-J, 891.27 mg/g). Este resultado coincide con lo reportado por Nobel et
al. (1998), quienes establecen que esta especie acumula en su tallo hasta el 80% de los
carbohidratos no estructurales, una cantidad 2 a 3 veces mayor en comparacin con otras
especies como A. deserti. Probablemente dicha caracterstica influy desde el siglo XIX, para la
dominancia de esta especie en la elaboracin del vino de mezcal (tequila) sobre otras especies, e
incluso sobre otras variedades como criollo, pata de mula, moraleo, chato, mano larga y bermejo.
La Figura 31 muestra una gran diferencia en la distribucin de carbohidratos solubles entre las
especies de Agave y Dasylirion. En dasylirion (Dsp-C), la Fru fue el carbohidrato ms abundante
(38.43%), seguido de Glc (27.36%); mientras que los fructanos y la Suc representan el 17.98 y
16.21%, respectivamente. En contraste, los fructanos constituyen el principal carbohidrato no
estructural en agaves, con valores superiores al 60%. El mayor porcentaje de fructanos fue
observado en A. angustifolia proveniente de Oaxaca (Aa-O) con un 85.81% (516.94 mg/g),
correspondindole a A. fourcroydes de Yucatn (Af-Y) el porcentaje ms bajo de 64.22% (482.47
mg/g). Esta caracterstica en Af-Y refleja el uso dado para esta especie, la cual es cultivada

108

Carbohidratos totales

Fructanos

Sacarosa

Fructosa

Glucosa

1000
900
800
700

mg/g DM

600
500
400
300
200
100
0

At-J

At-G Aa-S

Aa-O Ac-O Ap-O

Af-Y Dsp-C

Dv

Especies de Agave y Dasylirion

Figura 31. Contenido de carbohidratos no estructurales solubles. El valor presentado es el
promedio de tres determinaciones independientes. La concentracin esta dada en base seca
(DM). Abreviaturas segn se indica en la Tabla 12.
principalmente para la obtencin de fibras y solo ms recientemente, en la elaboracin de bebidas
alcohlicas (henequn), que es el principal uso del resto de las especies analizadas. De igual
manera, una baja concentracin de fructanos concomitante con una mayor cantidad de fibra fue
observada en dasylirion, una planta que es utilizada tanto para la obtencin de fibra como para la
elaboracin de la bebida alcohlica (sotol). Aun as, estos valores representan altas
concentraciones de fructanos comparados por ejemplo, con trigo con una concentracin promedio
de 60 mg/g (Kerepesi y Galiba, 2000).

1.2. FACTORES ONTOGNICOS

La menor cantidad de fructanos encontrados en dasylirion (96.02 mg/g) puede ser explicada como
una diferencia de gneros; sin embargo, tambin se debe considerar la presencia del rgano floral
en esta planta, ya que la concentracin de estos carbohidratos es afectada por aspectos
ontognicos (Marx et al., 1997; Itaya et al., 2002). La depolimerizacin y movilizacin de fructanos,

109

as como la exportacin de Suc, han sido reportadas durante actividades fisiolgicas que
demandan energa a la planta, para los procesos de regeneracin foliar en pastos (Amiard et al.,
2003), durante el llenado de granos en cereales (Yang et al., 2004), procesos de brote en
Asteraceae (Machado de Carvalho y Dietrich, 1993) y durante el desarrollo floral del lirio de la
maana (Alliaceae, Hemerocallis, Bieleski, 1993), Phippsia algida (Gramineae) (Solhaug y Aares,
1994) y Campanula rapunculoides (Campanulaceae, Vergauwen et al., 2000). La emergencia de la
inflorescencia en dasylirion pudo haber causado un decremento en la concentracin de fructanos
debido a la depolimerizacin de la molcula, para suministrar la energa requerida en la floracin.
La alta concentracin de Suc y monosacridos presentes en esta especie, puede contribuir a
mantener el potencial osmtico y la presin de turgencia al nivel requerido para los eventos de
crecimiento y expansin celular.

1.3. INFLUENCIA DEL AMBIENTE EN EL PATRN DE CARBOHIDRATOS NO

ESTRUCTURALES
Una alta acumulacin de fructanos y la presencia de carbohidratos relacionados con su
metabolismo (Suc, Fru, Glc) en los tallos de agave, confirma que es en este rgano donde se
presenta el metabolismo activo para este tipo de carbohidratos. Sin embargo, la principal
diferencia entre los agaves fue la distribucin de los carbohidratos restantes.
Las plantas provenientes de la regin de Oaxaca presentaron el mismo comportamiento: una baja
concentracin de Suc y una an menor, de Glc; curiosamente, estas especies tambin
presentaron una alta concentracin de Fru. Una relacin de alta Fru y una casi imperceptible
cantidad de Glc, refleja un estado fisiolgico de hidrlisis activa de fructanos en el tallo por parte
de la FEH. La probable actividad de FEH se correlaciona con una baja concentracin de Suc, que
de otra manera estuviese inhibiendo su actividad enzimtica. Para una probable actividad de FEH
debe esperarse un bajo DP de los fructanos y un decremento en el potencial osmtico,
condiciones probablemente requeridas para el buen desarrollo de los agaves bajo las
caractersticas climticas que prevalecen en esta regin.
Af-Y y At-J, por su parte, tambin presentaron una concentracin considerable de Fru (Af-Y,
present la ms alta concentracin de Fru, 130.45 mg/g); sin embargo, a diferencia de las
especies de Oaxaca, tambin se observ una cantidad significativa de Glc, casi en una relacin de
3 a 1. Esto indica una respuesta fisiolgica diferente por parte de estas especies; sugiriendo la

110

presencia de una FEH activa en accin concertada con una Inv, que adems de generar
cantidades equimolares de Glc y Fru a partir de la hidrlisis de Suc, puede inducir una mayor
actividad de la FEH al evitar la inhibicin de esta enzima por la Suc. Alternativamente, una mayor
cantidad de Glc, tambin puede ser indicativa de un proceso de inhibicin de la reincorporacin de
este carbohidrato al metabolismo primario de la clula. Por otra parte, el indicio de una actividad
FEH no necesariamente sugiere un proceso de degradacin, ya que en algunas
monocotiledneas, como el trigo, se ha observado la co-ocurrencia de actividades 1-SST y FEH,
sugiriendo que esta ltima enzima puede participar en la determinacin estructural de los fructanos
(Van den Ende et al., 2003b).
Respecto a A. angustifolia, aunque taxonmicamente clasificadas como tal, las plantas
provenientes de Oaxaca y Sonora presentaron un patrn de carbohidratos muy distinto (Figura
31), influenciado seguramente por las condiciones ambientales, pues incluso, estas plantas
presentaron caractersticas morfolgicas dismiles. Equiza et al. (2001), en un estudio realizado en
variedades de trigo con diferente tolerancia al fro, mostraron diferencias morfolgicas atribuidas
principalmente a un proceso de economa de agua, ms que a la intensidad de luz o al mismo
estrs trmico.
Por otra parte, de acuerdo a lo establecido por la Secretara de Patrimonio y Fomento Industrial
(1997), por sus caractersticas geogrficas adecuadas para el cultivo de A. tequilana var. azul,
Jalisco y Guanajuato se encuentran dentro de la zona de denominacin de origen para la
elaboracin de tequila. Sin embargo, aunque A. tequilana proveniente de Jalisco y Guanajuato
pertenecen a esta variedad y por su forma de propagacin (rizomas), son considerados
genotpicamente iguales (Gil-Vega et al., 2001), el contenido de carbohidratos difiri
significativamente (900 vs 550 mg/g), sugiriendo que las condiciones geoclimticas propias de
cada lugar, pueden influir en el patrn de carbohidratos, as como se ha reportado una variacin
en el contenido de azcares en otras especies que acumulan fructanos en funcin de las
condiciones abiticas (Sims, 2003; Gebbing, 2003).
En este sentido, para A. tequilana crecida en distintas zonas de Jalisco, se han establecido
regiones ptimas y marginales para su cultivo (Ruz-Corral et al., 2002). Dependiendo de las
condiciones de la regin, esta planta presenta un comportamiento diferencial en su desarrollo y
contenido de carbohidratos: su ciclo en la regin centro (Tequila-Amatitn) es de hasta 6 aos, en
tanto que en los Altos, el ciclo toma de 8 a 10 aos pero con mejores parmetros de calidad como

111

alto contenido de azcares, bajo porcentaje de fibra y mayor dimensin de la planta con un peso
promedio de 60 kg para las pias vs 40 kg en aquellas de la regin centro (Valenzuela, 1997). Un
estudio en la determinacin del EPI (seccin 1.5, pag. 24) mostr que las frescas temperaturas
nocturnas (7 a 18 C) que se presenta en los Altos, es la condicin ms determinante para una
mayor fijacin de CO2 en esta especie (Ruz-Corral et al., 2002). Desde el punto de vista
bioqumico, se ha mostrado que temperaturas nocturnas frescas favorecen la actividad de la
PEPC en plantas CAM, y aunado a una disminucin de la transpiracin, hay una mayor
asimilacin de carbono (Pimienta-Barrios et al., 2001). En la Tabla 12 se muestra que la zona de
Los Altos, Jal. presenta un tipo de clima subtropical templado (temperatura media anual entre 5 y
18 C), en tanto que Pnjamo, Gto. es considerado como semiclido subhmedo (temperatura
media anual entre 18 y 22 C). Siendo la temperatura entre estas dos zonas la caracterstica ms
contrastante, puede ser este factor el ms influyente en el diferente contenido de carbohidratos
observado entre ambas plantas.
Finalmente, debe considerarse que esta discrepancia tan notoria puede deberse tambin, a las
distintas pocas en que estas plantas fueron colectadas: At-J en marzo y At-G en diciembre del
2002. En A. tequilana se ha observado una tasa mxima de fijacin de CO2 durante la primavera
(23 mol m-2 s-1), cuando existe un mayor flujo fotosinttico de fotones (1337 mol m-2 s-1) y
una menor humedad en el suelo (12%); mientras que a finales de otoo y principios de invierno,
cuando la humedad del suelo aumenta (24%) y el flujo fotosinttico de fotones disminuye (583
mol m-2 s-1), la fijacin de CO2 reportada decrece a la mitad (12 mol m-2 s-1). Considerando
que la cantidad de luz interceptada es un factor condicionante en la eficiencia de conversin de
energa luminosa a materia seca y su distribucin a los rganos y sus constituyentes, en achicoria
y alcachofa Jerusalem se ha mostrado que este parmetro es determinante en el rendimiento de
inulina (Meijer et al., 1993). La temperatura ambiental tambin presenta un efecto dominante en la
acumulacin de estos carbohidratos, pues las bajas temperaturas en Asteraceae favorecen las
actividades enzimticas de FEH y 1-FFT (Monti et al., 2005). Por lo tanto, la poca en que se
cosechan los cultivos que acumulan fructanos, definitivamente debe ser factor determinante en el
DP y contenido de carbohidratos.

112

1.4. FUNCIN DE LOS FRUCTANOS EN LA SEQUA

A pesar de que no hay un mecanismo completamente entendido, las evidencias indican un papel
protector de los fructanos a plantas sometidas a estrs hdrico (Pilon-Smit et al., 1995; De Roover
et al., 2000; Vereyken et al., 2003a); y aunque se han reportado diferentes respuestas, todas ellas
implican un ajuste en la concentracin o DP de los fructanos (Amiard et al., 2003b). En el caso de
las especies analizadas en este trabajo, Aa-S y Dsp-C, que fueron las plantas colectadas en
regiones donde la limitacin del agua es una caracterstica ambiental, presentaron un patrn de
carbohidratos cuyo comportamiento puede explicarse como un mecanismo de adaptacin a
condiciones de sequa.
Aa-S y Dsp-C presentaron cantidades significativas de Suc (87.48 y 86.60 mg/g, respectivamente;
Figura 31). Aunque slo fue menor que en Af-Y (95.07 mg/g), en Aa-S, despus de los fructanos,
la Suc representa el carbohidrato ms abundante. La acumulacin de Suc en variedades de trigo
se ha correlacionado con una mayor tolerancia a la sequa (Kerepesi y Galiba, 2000). De acuerdo
a la Tabla 12, Aa-S y Dsp-C son las especies que crecen en mayores condiciones de sequa, con
un promedio de precipitacin pluvial inferior a 400 mm. Aunque no elucidado claramente el efecto
fisiolgico, es evidente que la sequa, es una condicin ambiental que induce cambios en la
particin del carbono fotosinttico, y favorece la acumulacin de Suc, probablemente a travs de la
activacin de la sacarosa-fosfato-sintasa (E.C. 2.4.1.14, Amiard et al., 2003b).
Dentro de los distintos efectos que provoca la sequa, puede mencionarse la respuesta observada
en achicoria y otras dicotiledneas, donde hay una activacin de FT y acumulacin de fructanos
(De Roover et al., 2000). Mientras, la acumulacin de cantidades significativas de Glc y Fru
observada en dasylirion, indica que esta especie ms bien sigue el comportamiento reportado en
otras monocotiledneas como Festuca arundinacea, Lolium perenne y Triticum aestivum, donde
se evidencia una acumulacin de hexosas provenientes de la hidrlisis de fructanos (Spollen y
Nelson, 1994; Karsten y MacAdam, 2001). Esta acumulacin, como respuesta a sequa, provoca
un decremento en el potencial osmtico de la planta y sostiene el estatus hdrico a un valor que
permite mantener el metabolismo en un nivel basal (Karsten y MacAdam, 2001).
Adicionalmente, en Aa-S y Dsp-C se present una relacin cercana a 1 de Fru:Glc. Esto sugiere la
presencia de una invertasa. Sin embargo, debe ser improbable su naturaleza vacuolar, pues como
se ha sealado, una disminucin en la concentracin vacuolar de Suc conlleva a una regulacin
positiva de la FEH, cuya actividad en estas especies no es evidente a partir de los resultados

113

mostrados en la Figura 31. Por lo tanto, se sugiere la intervencin de una invertasa probablemente
apoplstica, cuya participacin en la hidrlisis de fructo-oligosacridos (FOS) y Suc como medio
de proteccin celular localizada (disminucin del punto de congelacin local o interaccin con la
membrana plasmtica), ha sido propuesta en avena (Livingston y Henson, 1998) y en Agave
deserti (Wang y Nobel, 1998). En el primer caso, la posible participacin de la invertasa
apoplstica fue evidente cuando la planta de avena fue sometida a temperaturas congelantes,
condiciones que implican una disposicin limitada de agua; mientras que A. deserti es una planta
ampliamente dispersa en el desierto sonorense, con una precipitacin pluvial promedio de 200
mm. Con lo anterior podemos concluir, que una alta concentracin de Suc y cantidades
equimolares de Fru y Glc en Aa-S y Dsp-C, son condiciones de adaptacin de estas especies a la
sequa extrema presente en las regiones donde fueron colectadas.

1.5. PRESENCIA DE ALMIDN

Los fructanos son una alternativa diferente al almidn donde no se involucra la formacin de
steres de fosfato durante su sntesis; sin embargo, esta alternativa no es absoluta, pues las
plantas que almacenan fructanos tambin sintetizan almidn (Orthen, 2001). La Figura 32 muestra
que los tallos de agave y dasylirion almacenan almidn en un intervalo de 0.75% para Ap-O hasta
el 2.71% para Af-Y. La carencia de este carbohidrato en agaves ha sido reportado en A. vera cruz
(Srinivasan y Bathia, 1953) y A. deserti (Wang y Nobel, 1998), situacin similar para otros
miembros Asparagales como Asparagus officinalis, donde se report la ausencia de almidn
(Pollock, 1986) o su presencia en concentraciones inferiores al 2% como en Allium vineale
(0.021%), A.ursinum (0.032%) (Hendry, 1987) y Phormium spp. (2%) (Sims et al., 2001). Este
intervalo es inferior al 11% encontrado en tubrculos de dalia en este trabajo y a lo reportado en
otras monocotiledneas, con un rango de 4.0% en Hordeum vulgare y hasta un 25.3% en Poa
jemtlandica (Cairns et al., 2002a).
La presencia de almidn en especies que sintetizan fructanos, indica que la capacidad gentica de
acumular este carbohidrato no es expresada en alto grado como en otras especies. Y aunque no
hay anlisis de los mecanismos que limitan su acumulacin principalmente en tejidos vegetales,
Cairns et al. (2002b) descartan alguna causa por fotoasimilacin, inhibicin por acumulacin de
Suc o fosfato o la implicacin de un ritmo circadiano.

114

Figura 32. Presencia de almidn en especies de Agave y Dasylirion. Para fines de

comparacin tambin se determin almidn en tubrculos de Dahlia variabilis (Dv).
En el presente trabajo no se determin la presencia de almidn en las pencas; sin embargo, la coocurrencia de almidn y fructanos en rganos foliares ha sido reportada en especies sintetizadoras
de fructanos (Orthen, 2001; Cairns et al., 2002). Contrario a esto, en A. deserti, prcticamente no
se detect almidn en los tejidos vasculares de sus hojas maduras, sino que, adems de Suc,
fueron detectados 1-Kes, 6G-Kes, Nys y un DP5 (Wang y Nobel, 1998). La presencia de estos
FOS en el floema, sugiere que solo una pequea fraccin de Suc generada en la fotosntesis es
acumulada transitoriamente en forma de almidn, mientras que otra parte importante debe ser
transportada en los tejidos vasculares, donde es sustrato para la sntesis de FOS, a partir de
actividades FT detectadas en el floema de A. deserti (Wang y Nobel, 1998).
Al momento, no hay estudios fisiolgicos enfocados a la interaccin metablica de almidn y
fructanos en rganos de almacn. En papas transgnicas que sintetizan levanos a partir de la
introduccin del gen sacB que codifica para la levansucrasa de Bacillus subtilis, se observ la
acumulacin de fructanos en el amiloplasto. Sin embargo la presencia de este enzima heterloga
provoc cambios en la particin de carbono, los grnulos de almidn mostraron alteraciones

115

morfolgicas y fsicas y el rendimiento de los tubrculos fue inferior a las silvestres (Gerrits, 2000).
Por otra parte, anlisis histolgicos en alcachofa Jerusalem y cebolla, han mostrado la presencia
de almidn durante la fase de desarrollo del tubrculo y del bulbo, respectivamente, pero este
carbohidrato desaparece durante la dormancia; por lo que Orthen (2001 y 2004) sugiere que cada
uno de estos carbohidratos cumple funciones fisiolgicas distints de acuerdo al estado fenolgico
de la planta.
La acumulacin de fructanos sugiere una ventaja evolutiva sobre el almidn, considerando: i) su
naturaleza qumica (Fru-f vs Glc-p), con una conformacin piranosa de mayor flexibilidad; ii) su
localizacin vacuolar (vs plastdica), donde la gran capacidad de almacn de este organelo evita la
inhibicin de la fotosntesis por acumulacin de Suc citoplsmica; iii) su solubilidad (soluble vs
cristalino precipitado), que afecta significativamente las relaciones hdricas y propiedades
coloidales de las clulas y iv) sus enzimas metablicas, que son menos sensibles a bajas
temperaturas e inducibles a estrs abitico (Vijn y Smeekens, 1999; Van Laere y Van den Ende,
2002). En agaves, la mayor concentracin de fructanos sobre almidn puede presentar ventajas
fisiolgicas en ambientes ridos o donde se requieran cambios rpidos en la distribucin de
carbono, como cuando hay una repentina disposicin de agua en las regiones desrticas.

1.6. PERFIL CROMATOGRFICO DE FRUCTANOS

1.6.1. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)
La tcnica de TLC fue de las primeras usadas en la caracterizacin de fructanos y est an en
uso, pues aunque con menor resolucin, da informacin cualitativa semejante a sistemas
cromatogrficos de alta resolucin, adems de ofrecer la ventaja de ser un mtodo sencillo, barato
y rpido. En una primera aproximacin, los fructanos de agave y dasylirion fueron separados en
fructanos de alto y bajo DP por precipitacin con etanol absoluto. Los FOS (DP < 8) fueron
visualizados en un sistema de TLC de base de slice (Figura 33). En general, la fraccin de bajo
DP est pobremente representada en las especies analizadas; por lo que, la principal fraccin de
fructanos debe corresponder a molculas con un mayor DP. La identidad de los compuestos
adems, fue corroborada con estndares, a excepcin de una seal que se observ entre la Suc
y 1-Kes. De acuerdo a sistemas de TLC similares, se tiene bien establecido que la serie de los
neofructanos (con Glc interna) presentan valores de Rf mayor a la serie de inulina con el mismo

116

Figura 33. Cromatografa en capa fina de fructanos de Agave y Dasylirion. La cromatografa

fue desarrollada tres veces en un sistema de solventes de butanol:propanol:agua (3:12:4, v/v/v).
St, estndares: M, fraccin de monosacridos (fructosa y glucosa); O, punto de origen.
DP (Cairns et al., 1999), por lo que esta seal en nuestro sistema, debe corresponder a la 6G-Kes,
molcula que caracteriza a los miembros de las Asparagales. Y al igual que lo reportado para
algunos miembros de este orden, como esprrago y cebolla, no fue evidente la presencia de 6Kes, molcula que en este sistema migra con un Rf inferior a la 1-Kes.
Las seales correspondientes a DP4 y DP5 fueron tambin visualizadas, aunque con una menor
intensidad y, mediante la fase mvil aqu utilizada, fue difcil establecer si stos pertenecen a la
serie inulina, a la neoserie o representan una mezcla de ambos. At-J present el patrn ms
dismil; esta especie contiene casi exclusivamente monosacridos (Glc y Fru) y solo se observ
una seal muy tenue correspondiente a la 6G-Kes. Los FOS estuvieron prcticamente ausentes,
indicando que la mayor parte de sus fructanos corresponden a molculas de mayor DP. En las
especies de agave de la regin de Oaxaca (Aa-O, Ac-O y Ap-O), adems de Af-Y, se observ una
baja cantidad 1-Kes. Esta molcula fue ms evidente en Aa-S y ms abundante en At-G y Dsp-C.
A partir de la Figura 33 es posible concluir que los agaves y dasylirion acumulan en sus tallos al
menos dos tipos de fructanos: la serie inulina, caracterstica de algunas Asteraceae, como
117

achicoria, alcachofa Jerusalem y dalia, y una segunda serie de neofructanos reportada en

Asparagales como cebolla, ajo y esprrago.

1.6.2. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (INTERCAMBIO ANINICO

ACOPLADO A DETECTOR DE PULSO AMPEROMTRICO (HPAEC-PAD)
La cromatografa de alta resolucin HPAEC es actualmente el mtodo preferido para la
visualizacin de la distribucin de fructanos presentes en una planta, ya que esta herramienta no
solo permite la separacin de las diferentes series de fructanos (inulinas, levanos y neofructanos),
sino que adems, es posible distinguir FOS ismeros, como las kestotriosas (1-Kes, 6-Kes y 6GKes) (Shiomi et al., 1991; Bancal et al., 1993; Pavis et al., 2001a). En la Figura 34 se muestra el
perfil cromatogrfico de los fructanos extrados de A. tequilana, A. potatorum y A. angustifolia y se
compara con los fructanos bien determinados en achicoria y cebolla. La Tabla 15 enlista los
compuestos identificados en estas especies.
La achicoria, de la familia Compositae, acumula en sus races fructanos de la serie inulina (Ix,
donde x indica el DP), y aunque hay evidencias de la presencia de residuos ramificados en esta
especie (Carpita et al., 1991; Wack y Blaschek, 2006), su contribucin no es significativa y en la
Figura 34 solo se observa una serie de fructanos lineales con unidades fructo-furanosil (2-1) con
un incremento progresivo en su DP. Por otra parte, el perfil cromatogrfico de los fructanos
presentes en cebolla ha sido ampliamente identificado (Ernst et al., 1998; Ritsema et al., 2003).
ste es caracterizado por la presencia de la serie inulina, adems de la presencia dominante de
neofructanos, identificados por la presencia de una unidad interna de Glc (i--D-Glcp). La 6G-Kes
es el fructano ms abundante de esta serie (DP3); mientras que para los neofructanos superiores
(DP4) hay diferentes ismeros, dependiendo de la Fru terminal que acepta una unidad fructofuranosil para la elongacin de la cadena. En la diferenciacin de estos ismeros, Ernst et al.
(1998) propusieron nombrar como Nx cuando la molcula es elongada por ambos extremos o
como Nx cuando la elongacin sucede solo del lado de la Glc.
De acuerdo al tiempo de retencin mostrado en los picos eluidos de las distintas especies de
agave (Figura 34), se evidencia en estas plantas la presencia de la serie inulina tal como en
achicoria; adems como sucede en cebolla, tambin se encuentra presente neofructanos
elongados en ambos extremos de la cadena (tipo Nx y Nx). Adicionalmente, en los agaves se
identificaron la elucin de picos con una menor abundancia a los dems y que no concuerdan con

118

Figura 34. Perfil cromatogrfico (HPAEC-PAD) de fructanos de agave comparados con

fructanos de achicoria (tipo inulina) y cebolla (neofructanos). La identificacin de los
compuestos eludos se hizo segn se indica en la Tabla 15.

119

algn tiempo de retencin de los fructanos correspondientes a las especies utilizadas como
referencia. En agaves, las seales pertenecientes a fructanos con mayor DP se vuelven anchas y
poco resueltas, sugiriendo la presencia de una mezcla de ismeros. Probablemente, estos picos
son debidos a molculas con enlaces (2-6) o a unidades ramificadas, tal como se ha reportado
en algunos miembros Asparagales que sintetizan este tipo de carbohidratos (Brasch et al., 1988;
Spies et al., 1992; Sims et al., 2001; Sims, 2003). El perfil de fructanos en las especies de agave
analizadas en la Figura 34, son muy similares entre s; sin embargo, se observan algunas
diferencias en la abundancia de los picos.
Tabla 15. Identificacin de fructanos eludos en un sistema cromatogrfico intercambio
aninico de alta resolucin (HPAEC-PAD).
Pico Tipo de fructano
S
I3

inulina

N3

neofructano

I4

inulina

N4
N4
I5
N5

neofructano
neofructano
inulina
neofructano

N5
I6
N6
7
8
9
10
*

neofructano
inulina
neofructanos
fructanos
fructanos
fructanos
fructanos
fructanos

Nombre
sacarosa
1-kestotriosa
(1-Kes)
6G-kestotriosa
(6G-Kes/ Neo)
1,1-kestotetraosa
(nistosa, Nys)
1y6G-kestotetraosa
1,6G-kestotetraosa
1,1,1-kestopentaosa
1,1y6G-kestopentaosa/
1y1,6G-kestopentaosa
1,1,6G-kestopentaosa
1,1,1,1-kestohexaosa
mezcla de neofructanos
ismeros de DP 7
ismeros de DP 8
ismeros de DP 9
ismeros de DP 10
no identificados

Achicoria Cebolla Agave spp.

Los compuestos fueron identificados su comportamiento de elucin comparado con estndares o

especies ampliamente caracterizadas como achicocria y cebolla. La nomenclatura de los
compuestos identificados es de acuerdo a Waterhouse y Chatterton, 1993. La asignacin de los
picos sigue la propuesta de Ernst et al., 1998, donde Ix, refiere a la serie inulina con x grado de
polimerizacin; Nx y Nx indican respectivamente, si el fructano es elongado sobre ambos extremos
de la molcula o slo del lado de la glucosa, respectivamente. Los asteriscos indican fructanos no
identificados en agaves, en base a los tiempos de elucin de los compuestos usados como
referencia. El smbolo , indica la presencia del compuesto en las especies analizadas.
120

1.7. ANLISIS DE ENLACES POR DERIVATIZACIN DE FRUCTANOS A ALDITOL

ACETATOS PARCIALMENTE METILADOS (PMAA)
Para ensayar la hiptesis de que los fructanos son especie-especficos, la fraccin de alto peso
molecular (DP>8) de cada una de las especies, fue derivatizada a compuestos PMAA. Al igual que
lo observado en el perfil cromatogrfico de los agaves, de la Figura 35 se puede concluir que las
diferencias de estos productos son ms cuantitativas que cualitativas.
El cromatograma de Aa-S se tom como representativo de estas especies y se compar con los
PMAA resultantes de la derivatizacin de fructanos de dalia y cebolla (Figura 36). La identidad de
cada derivado fue determinado de acuerdo a los criterios discutidos en la literatura (Carpita y
Shea, 1990; Bancal et al., 1993), por comparacin con estndares y por anlisis del patrn de
fragmentacin generado por el bombardeo de electrones a estos compuestos. En el Apndice B
se

muestra con detalle un anlisis de la fragmentacin de cada uno de los compuestos

derivatizados que fueron identificados; mientras que en la Tabla 16 se resume esta informacin.

i) Dahlia variabilis
Al igual que en otras Asteraceae, la inulina almacenada en races de achicoria, se caracteriza por
tener una unidad de Glc en un extremo no reductor, y especficamente en el caso de dalia, esta
molcula adems contiene un bajo porcentaje de ramificaciones (Carpita et al., 1991; Wack y
Blaschek, 2006). La Fru en su forma reducida, al igual que otras cetosas, genera los epmeros
glucitol y manitol. Los epmeros derivados de la Fru terminal (-D-Fruf-t) presente en fructanos,
fueron resueltos en la columna HP5 utilizada, y corresponde a los compuestos 1 y 2 mostrados en
la Figura 36. Estas molculas fueron muy simtricas y caracterizadas por la presencia de los
dobletes m/z 161 y 162 como fragmentos primarios, y m/z 205 y 206, 145 y 146 y 101 y 102, como
fragmentos minoritarios. Estos patrones de fragmentacin idnticos son en ocasiones reconocidos
solo por sutiles diferencias en su intensidad. El compuesto 3 fue asignado a la unidad terminal de
-D-Glucopiranosa (-D-Glcp-t); el fragmento base de esta molcula es m/z 102, diferente al
fragmento base m/z 129 caracterstico de los residuos de Fru. Los fragmentos primarios m/z 161 y
162 de intensidades similares, generaron los iones m/z 129 y 102 a partir de la eliminacin de
metanol y cido actico, respectivamente. Una ruptura menos favorecida sucedida entre los
carbonos contiguos metoxilados C2 y C3, gener un fragmento prominente de m/z 118 y un
fragmento diagnstico para esta molcula de m/z 205.

121

Figura 35. Perfil de elusin, utilizando cromatografa de gases, de fructanos de Agave y

Dasylirion derivatizados a alditol acetatos parcialmente metilados. Las abreviaturas son
como se indican en la Tabla 12.

122

Figura 36. Comparacin de fructanos derivatizados en tres especies vegetales. Agave

angustifolia de Oaxaca fue elegida como representativa de las especies aqu estudiadas y sus
productos de derivatizacin fueron comparados con Allium cepa (cebolla) y Dahlia variabilis (dalia).
El nmero de pico corresponde al compuesto identificado segn se indica en la Tabla 16.

123

La principal contribucin de fructanos en dalia y otras Asteraceae corresponde a las unidades de

Fru unidas mediante enlaces (2-1) (2-1-D-Fruf), representada en los compuestos 4 y 5 de la
Figura 36. stos corresponden a los epmeros glucitol y manitol, y sus espectros son
caracterizados por m/z 190 y 161 como fragmentos primarios, resultado de la ruptura entre los
carbonos metoxilados contiguos C3 y C4. Una cantidad de 1,6-di--D-fructofuranosa (1,6-di--DFruf) fue evidenciada con este mtodo e identificada en el compuesto 8. Este derivado es debido a
la presencia de Fru ramificadas, reportado en bajo porcentaje en dalia (Carpita et al., 1991; Wack
y Blaschek, 2006). La presencia de los epmeros glucitol y manitol derivados de este tipo de Fru,
no fueron aqu cromatogrficamente resueltos, por lo que el patrn de fragmentacin de esta
molcula (Tabla 16) corresponde a una mezcla de ambas configuraciones. Estas unidades fueron
identificadas por la presencia de un doblete caracterstico de m/z 189 y 190.

ii) Allium cepa

El perfil cromatogrfico de los PMAA derivados de cebolla (Figura 36) muestra una diferencia
cuantitativa con dalia. La principal contribucin de -D-Fruf-t (compuestos 1 y 2) indica en esta
especie la presencia de fructanos con un DP menor (DP3-10 reportado en cebolla vs DP hasta 48
en dalia, Praznik y Beck, 1985; Fujishima et al., 2005). El patrn de fragmentacin de un
compuesto adicional observado (compuesto 7), indica la presencia de -D-glucopiranosa interna
(-D-Glcp-i). El fragmento base de esta molcula es m/z 102 con un fragmento prominente de m/z
118. A diferencia de la -D-Glcp-t, este derivado presenta un fragmento de m/z 233 debido a un
grupo acetil adicional en el C6. Adems, las unidades -D-Glcp-i y -t pueden ser diferenciadas
una de otra, debido a que la ruptura entre los C3 y C4 producen los fragmentos m/z 162 y 189 y
m/z 161 y 162, respectivamente.

iii) Agave y Dasylirion

Del cromatograma de Aa-S (Figura 36) y de todas las dems especies de Agave y Dasylirion
(Figura 35), es evidente que los fructanos en estas plantas presentan una diversidad estructural. El
compuesto 7 en estos cromatogramas confirma la presencia de neofructanos, adems de
unidades de -D-Glcp-t (compuesto 3), ramificaciones (compuesto 8) y la presencia de -2-1-DFruf indica una cantidad importante de enlaces (2-1) (compuestos 5 y 6).

124

Tabla 16. Alditol acetatos parcialmente metilados identificados en fructanos de Agave y Dasylirion spp., Dahlia variabilis y Allium cepa.
Pico
1

Tr a
50.21

2
50.81
3
55.07
4
63.71
5
64.36
6d
64.74
7
68.67
8
82.14

Compuesto derivatizado
2,5-Di-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4,6tetra-O-metil-D-manitol
2,5-Di-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4,6tetra-O-metil-D-glucitol
1,5-Di-O-acetil-(1-deuterio)-2,3,4,6tetra-O-metil-glucitol
2,5,6-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4-triO-metil-manitol
1,2,5-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-3,4,6-triO-metil-manitol
2,5,6-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4-triO-metil-glucitol + 1,2,5-Tri-O-acetil-(2deuterio)-3,4,6-tri-O-metil-glucitol
1,5,6-Tri-O-acetil-(1-deuterio)-2,3,4-triO-metil-glucitol
1,2,5,6-Tetra-O-acetil-(2-deuterio)-3,4di-O-metil-hexitol

Tipo de enlace b
-D-Fruf-t
-D-Fruf-t
-D-Glcp-t
(26)--D-Fruf
(21)--D-Fruf
(21)/ (26)--DFruf
-D-Glcp-i
1,6-di--D-Fruf

Patrn de fragmentacin c
129 (100), 162 (46.6), 161 (30.0), 87 (25.0), 101 (15.8), 102 (15.0), 75 (11.7), 145
(8.3), 72 (8.3), 146 (6.8), 113 (3.3), 120 (2.1)
129 (100), 162 (38.9), 161 (34.7), 87 (24.5), 101 (15.2), 102 (14.4), 75 (10.1), 72
(10.1), 146 (5.8), 145 (5.08), 113 (3.3), 120 (2.8)
102 (100), 129 (62.0), 118 (55.7), 101 (52.4), 145 (40.0), 71, 72 (36.6), 87 (36.0),
76 (31.1), 162 (27.8), 161 (26.2), 59 (26.2), 60 (18), 113 (14.0), 205 (11.4)
129 (100), 162 (45.2), 87 (35.8), 99 (16.9), 189 (15.0), 71, 72, 102 (13.2), 75
(12.2), 60 (10.3)
129 (100), 87 (33.8), 161 (25.4), 190 (23.7), 101 (14.4), 100 (13.5), 71, 72 (10.1),
75 (8.47), 145 (6.7), 59. 60, 99, 102, 113 (3.3)
129 (100), 87 (30.3), 161 (29.4), 190 (14.1), 162 (11.6), 101 (10.7), 100 (8.9), 71,
72, 75, 118 (7.1), 189 (6.2), 99 (5.3)
102 (100), 118 (75.8), 99 (56.8), 129 (55.1), 87 (51.7), 101 (27.5), 59 (25.8), 72,
162 (22.4), 71 (22), 60 (14.6), 100, 189 (13.7), 72 (12.0), 145 (6.8), 233 (4.3)
129 (100), 87 (42.5), 190 (20.3), 189 (17.5), 100 (16.2), 99 (14.8), 60 (11.1), 71,
72 (7.4)

El nmero de pico corresponde al orden de elucin mostrado en la Figura 34; a Tiempo de retencin (min) en la columna HP5; b t, i, unidades
terminal e interna, respectivamente; c valores en parntesis indican la intensidad relativa de los fragmentos; d, en el caso de D. variabilis y A. cepa, este
pico corresponde nicamente al 1,2,5-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-3,4,6-tri-O-metil-glucitol.

125

Adicionalmente, en el compuesto 4 se identific un derivado correspondiente a la configuracin

manitol del derivado (2-6)-D-fructofuranosa (,2-6-D-Fruf), caracterizada por un fragmento m/z
189, indicativo de que el oxgeno 6 debe estar sustituido por un grupo acetilo. Esto evidencia la
presencia de enlaces (2-6) en las especies de Agave y Dasylirion. La reduccin de los
compuestos metilados con borohidruro deuterado, introdujo asimetra en los derivados de (2-1)- y
(2-6)-D-Fruf que de otra manera hubiesen producido fragmentos idnticos. De esta forma, los
enlaces (2-1)-Fruf fueron diferenciados por la presencia de m/z 190 y 161 como fragmentos
mayoritarios, mientras que los enlaces (2-6)-Fruf generaron fragmentos m/z 189 y 162.
Los epmeros manitol de estos derivados fueron cromatogrficamente bien resueltos en los picos 4
y 5 (Figura 36), mientras que esto no fue posible para los epmeros glucitol. Por lo tanto, el pico 6
presente en los cromatogramas de agaves y dasylirion contiene las configuraciones glucitol para
ambos tipos de enlace (Figuras 34 y 35; Tabla 16): 2,5,6-tri-O-acetil-2-deuterio-1,3,4-tri-O-metilglucitol para los residuos (2-1)-D-Fruf y 1,2,5-tri-O-acetil-2-deuterio-3,4,6-tri-O-metil-glucitol para
las unidades (2-6)-D-Fruf. El patrn de fragmentacin para este pico es el resultado de todos los
iones presentes en ambos derivados. Para aspectos de cuantificacin, el porcentaje de
contribucin de cada derivado en el pico 6, fue calculado como la proporcin de m/z 189/190
(resultante de la reduccin con NaBD4), tomando en consideracin la abundancia natural de 13C
(1.11%) (Carpita y Shea, 1990).

1.7.1. CUANTIFICACIN DE LOS GLICOSIL-DERIVADOS

Aunque los fructanos de agave y dasylirion parecen estructuralmente similares, la Figura 37
muestra diferencias significativas en la contribucin de cada derivado. Un anlisis cuantitativo de
estas discrepancias puede ser til en la elucidacin de posibles estructuras para cada especie. La
contribucin de los PMAA se cuantific como porcentaje de mol (% mol) del total de compuestos
en cada una de las especies, se compararon entre ellos y con las proporciones encontradas para
dalia y cebolla.
Tericamente, los fructanos contienen, si es el caso, una unidad de Glc por cada molcula; por lo
que de los datos colectados, se confirma lo observado por TLC: las especies de Agave y
Dasylirion almacenan en sus tallos al menos dos tipos de fructanos: aquellos con una unidad -DGlcp-t y una serie que corresponde a los neofructanos.

126

Fru-terminal

Glc-terminal

Fru (2-6)

Fru (2-1)

Glc-interna

Ramificacin

100

80

mol %

60

40

20

At-J

At-G

Aa-S

Aa-O

Ac-O

Ap-O

Af-Y

Dsp-C

Figura 37. Cuantificacin de los glicosil-derivados en fructanos de las especies analizadas.

Ac, Allium cepa. Las barras representan la desviacin estndar de tres repeticiones determinadas
independientemente.
Retomando la idea de una unidad de Glc por molcula de fructano, los % mol correspondientes a
-D-Glcp-i y -t se sumaron y fueron considerados como la unidad. Los valores de % mol de los
dems compuestos fueron comparados con esta unidad (Tabla 17). A partir de estos datos fue
posible deducir comportamientos interesantes (Tablas 17 y 18), que permitieron asociar las
especies en tres grupos: el Grupo I, integrado por At-J, Aa-S, Aa-O y Ap-O; en el Grupo II, se
incluy a Ac-O, Af-Y y Dsp-C; mientras que un comportamiento totalmente diferente fue observado
en At-G, que conform el Grupo III.
La serie de neofructanos fue ms abundante en los agaves del Grupo I, presentando cuatro
estructuras de neofructanos por cada molcula con -D- Glcp-t; en el Grupo II esta relacin fue de
2:1, mientras que At-G present cantidades equimolares de estos fructanos. Una mayor
contribucin de enlaces (2-1) en relacin a los (2-6) fue una constante observada en todas las
especies; siendo la relacin de 2, 4 y 3 para los Grupos I, II y III, respectivamente. De manera
interesante, en el Grupo I se present una relacin cercana a 1 entre los derivados de (2-6)-Fruf
y las unidades ramificadas; este valor no fue significativamente diferente al 0.8 encontrado para el
resto de las especies, sugiriendo esto la presencia de un enlace (2-6) en cada punto de
127

Tabla 17. Contribucin relativa de compuestos derivatizados en los fructanos.

DP
Estimado

t-
-DGlcp

i-
-DGlcp

t-
-DFruf

(2-6)-
-DFruf

(2-1)-
-DFruf

1,6-di-
-DFruf

At-J

18.12

0.2

0.79

4.7

3.46

5.53

3.42

Aa-S

13.07

0.18

0.82

4.51

1.9

3.92

1.74

Aa-O

31.75

0.21

0.79

10.51

6.01

9.64

4.59

Ap-O

15.34

0.17

0.83

5.19

2.12

4.84

2.19

Ac-O

11.17

0.33

0.67

4.27

0.95

3.71

1.24

Af-Y

6.66

0.31

0.69

2.81

0.49

1.82

0.55

Dsp-C

9.09

0.38

0.62

3.21

0.84

3.08

0.96

7.13

0.52

0.48

2.99

0.65

1.75

0.74

Dv

37.43

n.d.

2.44

nd

33.17

0.82

Ac

4.79

0.66

0.34

2.38

nd

1.32

0.09

Grupo
I

II

III
At-G
Standard

La sumatoria del % mol correspondiente a -D-Glcp-i y -t fue considerada como la unidad y como
referencia para los dems compuestos derivatizados. nd, no detectado.
Tabla 18. Correlacin entre diferentes compuestos derivatizados.
Grupo DGlc-i/DGlc-t (2-1)/ (2-6) (2-6)/1,6-di-Fru Fru-t/1,6-di-Fru
I
At-J

3.95

1.60

1.01

1.37

Aa-S

4.56

2.06

1.09

2.59

Aa-O

3.76

1.60

1.31

2.29

Ap-O

4.88

2.28

0.97

2.37

Ac-O

2.03

3.91

0.77

3.44

Af-Y

2.23

3.71

0.89

5.11

Dsp-C

1.63

3.67

0.88

3.34

0.92

2.69

0.88

4.04

II

III
At-G

Los valores fueron calculados relativos a la abundancia de -D-Glcp-i y -t, que fue considerada
como la unidad. nd, no detectado.

128

ramificacin. Otro dato importante, fue la relacin encontrada entre la Fruf-t y las ramificaciones.
Este valor puede correlacionarse con la longitud de la molcula, as como con la frecuencia de
ramificacin; ya que en molculas con un alto DP o altamente ramificadas, esta proporcin toma
un valor cercano a 1. En este contexto, el Grupo I present el valor ms bajo, con un relacin
cercana a 2 para todas las especies incluidas, a excepcin de At-J que tuvo un valor de 1,
indicando la presencia de fructanos altamente ramificados. Ac-O y Dsp-C presentaron un relacin
de 3, mientras que una estructura menos ramificada puede deducirse para At-G y Af-Y con valores
de 4 y 5, respectivamente. La estimacin del DP promedio se realiz a travs de la sumatoria de
cada uno de los compuestos derivatizados (Tabla 17).
Los valores obtenidos para dalia y cebolla validaron este mtodo, ya que el DP calculado de esta
manera cay en el intervalo reportado para estas especies (Praznik y Beck, 1985; Fujishima et al.,
2005). De esta forma, los agaves del Grupo I contienen fructanos de alto DP (de 13 a 32),
mientras que las especies restantes almacenan fructanos con un DP inferior que va desde DP711. En la literatura cientfica no hay muchos reportes sobre el intervalo de DP en especies de
agaves. En A. deserti se determin un rango de DP entre 3 y 32 (Satyanarayana, 1976c), y ms
recientemente, nuestro grupo de trabajo report valores de DP entre 3 y 29 para A. tequilana
(Lpez et al., 2003, ver ms adelante). El DP estimado para todas las especies de agave y
dasylirion aqu consideradas, cayeron dentro de estos valores; sin embargo, este intervalo es muy
amplio, y sugiere la presencia de una mezcla heterognea de fructanos con un comportamiento
polidisperso.

1.7.2. SIGNIFICANCIA DE LA DIVERSIDAD ESTRUCTURAL DE FRUCTANOS

En un anlisis realizado por Chatterton y Harrison (2003), se sugiere que la diversidad estructural
encontrada en Agropyron cristatum es importante para la tolerancia de este pasto a las
condiciones de sequa. La diversidad de fructanos encontrada en agaves puede ser determinante
en el desarrollo de estas plantas en ambientes hostiles. Sin embargo, cabe resaltar que a partir de
los datos obtenidos, no se encontr una relacin aparente de la estructura de los fructanos con el
medio ambiente donde se desarrollaron las plantas. Por ejemplo, las plantas de A. angustifolia
colectadas en dos zonas diferentes, Sonora y Oaxaca, estuvieron asociadas al mismo grupo
(Grupo I); en tanto que, diferentes especies, A. potatorum y A. cantala, colectadas en la misma
regin (Sola de Vega, Oaxaca) fueron clasificadas en distintos Grupos (I y II, respectivamente).

129

Esto puede sugerir, que la concentracin y DP de los fructanos puede estar relacionado con
factores ambientales (ver secciones 1.3 y 1.4.), y que la estructura de estas molculas puede estar
ms relacionada a la especie. Sin embargo, esta ltima aseveracin debe hacerse con cuidado, ya
que Dasylirion spp., que pertenece a la familia Nolinaceae que es la taxonmicamente ms
alejada, se agrupa junto a A. fourcroydes (Yucatn) y A. cantala (Oaxaca). En tanto, A. tequilana
proveniente de la regin de Guanajuato, form un grupo totalmente separado, a pesar de
pertenecer a la misma especie de A. tequilana proveniente de la zona de los Altos, Jal.

1.8. CARACTERIZACIN DE FRUCTANOS EN A. tequilana Weber var. azul (JALISCO)

Para una caracterizacin estructural ms detallada, los fructanos de A. tequilana Weber var. azul
colectada en la regin de los Altos, Jal. fueron analizados con mtodos espectroscpicos de alta
resolucin como la ionizacin/desorcin por lser asistida por una matriz-tiempo de vuelo (MALDITOF-MS) y resonancia magntica nuclear (RMN).

1.8.1. ESPECTROMETRA DE MASAS POR IONIZACIN/DESORCIN POR LSER ASISTIDA

POR UNA MATRIZ-TIEMPO DE VUELO (MALDI-TOF-MS)
En la Figura 38 se muestra el espectro de masas para At-J obtenido mediante la tcnica de
MALDI-TOF-MS. Este espectro permite confirmar con una mayor resolucin y precisin, la
presencia de una mezcla polidispersa de fructanos en agaves. El rango de masas observado es
de m/z 527 a 4739 Da; valores que indican para esta especie, fructanos con un DP de 3 a 29
formando aductos con el Na (G-Fn+ + Na+).
1.8.2. RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR DE 13C
La Figura 39 muestra el espectro de 13C-RMN de los fructanos de At-J. El desplazamiento qumico
de la seal de sus carbonos, fue determinado por comparacin con espectros de estndares como
Suc, 1-Kes, Nys, 1-fructosil-nistosa (DP5) (Megazyme), dalia (Sigma) y con aquellos valores
reportados en la literatura para fructanos en otros cultivos (Brasch et al., 1998; Liu et al., 1991;
Bonnet et al., 1997; y otros).
La Tabla 19 muestra los desplazamientos de las seales correspondientes, cuando las muestras
fueron sometidas a un campo magntico. En el Apndice C, adems se muestra los valores
reportados en la literatura y que fueron de gran utilidad para la interpretacin de los espectros.

130

Figura 38. Espectro de masas MALDI-TOF-MS de fructanos de A. tequilana. El espectro fue

registrado en la forma de in positivo (H+); el cido 2,5-dihidroxibenzoico fue la matriz utilizada. La
especie analizada provino de la regin de los Altos, Jal.

Figura 39. Espectro de 13C-RMN de fructanos de A. tequilana. Los desplazamientos qumicos

en el espectro de At-J fueron asignados por comparacin con compuestos estndares Los
nmeros sobre la seal indican el nmero de carbono correspondiente a la fructosa y aquellos con
una G como subndice, indica los correspondientes a la glucosa.
131

La regin 104.0 a 106.0 ppm corresponde a la seal del carbono anomrico de los residuos -DFruf. Esta regin muestra una, dos y tres seales para Suc, 1-Kes y Nys con una, dos y tres
unidades de Fru, respectivamente. El DP5 (fructosil-nistosa) tambin muestra tres seales en esta
regin, pero con un ligero ensanchamiento en una de ellas, indicando que el residuo adicional de
Fru tiene un desplazamiento equivalente a otra unidad fructo-furanosil. El espectro de dalia, con
una sola seal en esta regin, indica un solo tipo de Fru predominante (-D-Fruf 2-1), que vuelve
simtrica la seal. En el espectro de At-J, las cuatro seales observadas en la regin anomrica (
104.87, 104.68, 104.54 y 104.06 ppm), indican la presencia de al menos cuatro diferentes
unidades -D-Fruf. La seal 104.54 ppm fue asignada a la -D-Fruf-t, pues este valor es
semejante al 104.53 ppm presente en la Suc y cae en el rango de 104.3 a 104.9 ppm reportado
para este tipo de unidad. El valor 104.06 ppm fue asignado a la D-Fruf-i (2-1), ya que se sabe
que el enlace del C1 de hexafuranosas desplaza la seal campo abajo de su carbono adyacente
(Tabla 19 y Apndice C); pues a diferencia de la conformacin de silla de la forma piranosa, el
anillo furanosa es ms susceptible a cambios conformacionales. Esta seal es la ms intensa en
la regin anomrica de At-J e indica la predominancia del enlace (2-1) en fructanos de esta
especie. Una resonancia a una mayor frecuencia (campo abajo) es reportada en el C2 de D-Frufi (2-6) y de 1,6-di--D-Fruf (Brasch et al., 1988; Spies et al., 1992; Sims et al., 2001), por lo que
los valores de 104.87 y 104.68 ppm en At-J, pueden deberse a la presencia de enlaces (2-6) y
fructosas ramificadas, respectivamente. En el espectro de At-J no se observa resonancia en la
regin de 103.20-104.4 ppm caracterstico de -D-Glcp-i (Liu et al., 1991; Shiomi, 1993); sin
embargo, para esta unidad tambin se ha reportado una resonancia de 104.5 ppm (De Bruyn y
Van Loo, 1991), por lo que es posible que la seal 104.54 ppm sea debida a ambas unidades de
-D-Fruf-t y -D-Glcp-i. Una resonancia a 98.9 ppm es caracterstica de una -D-Fruf
reductora (De Bruyn y Van Loo, 1991), por lo que la ausencia de seal en esta zona confirma la
naturaleza no reductora de los fructanos. Una seal 93.1 ppm presente en los estndares, es
debido al C1 anomrico de la Glc y cae dentro del rango reportado ( 91.5 -94.0 ppm). En la Suc
esta seal tiene una intensidad semejante a la del C2 de la Fru, y sta va disminuyendo conforme
aumentan las unidades de Fru (Suc > 1-Kes > Nys > DP5), hasta no ser detectado en el espectro
de dalia. En At-J, esta seal no fue evidente; sin embargo, las seales debidas a los C2 y C5 de la
Glc si fueron detectadas ( 71.96 y 73.25 ppm, respectivamente).

132

Tabla 19. Desplazamientos qumicos de 13C-RMN.

Carbono
F1

F2

F3

F4

F5

F6

A. tequilana
61.67-i, (2-1)

Sacarosa 1-Kestotriosa

Nistosa

DP5 inulina D.variabilis

62.16

60.99-t

61.46-t

60.27

61.71

61.24-glc

61.48-i

61.64-i

59.97

n.d.

60.77-i, (2-6) o-r

61.46-i

59.67

n.d.

62.27-i, (2-6)

59.67

n.d.

104.87-i, 2-6

104.53

104.36

104.30-t

103.00

104.10

104.68-r

103.86

103.84-i

102.51

n.d.

104.54-t o -glc

103.66-i

102.34

n.d.

104.06-i, 2-1

102.34

n.d.

77.54-t,-i, 2-1

77.19

77.24

78.10

76.8

77.80

77.32-i, 2-6

77.24

77.38

76.00

n.d.

77.32

77.38

76.62

n.d.

75.98i, 2-6

74.82

75.05

75.05

73.72

75.11

75.46

74.43

74.92

73.57

n.d.

75.17

74.47

73.12

n.d.

74.60-glc

73.12

n.d.

81.95-glc

82.23

81.82

81.84

80.54

81.92

81.12-glc

81.74

81.70

80.38

n.d.

n.d.

81.70

80.38

n.d.

64.11

63.23

62.95

62.86

61.56

62.98

63.37

62.8

62.86

61.56

n.d.

63.10

62.86

61.56

n.d.

G1

n.d.

93.03

93.11

93.13

91.80

n.d.

G2

71.96

71.92

71.76

71.80

70.48

n.d.

G3

n.d.

73.42

73.19

73.20

71.87

n.d.

G4

n.d

70.05

69.81

69.82

68.50

n.d.

G5

73.25

73.25

73.04

73.06

71.74

n.d.

G6

n.d.

60.94

60.69

60.71

59.38

n.d.

El valor de los desplazamientos es en ppm; Fx indica el nmero de carbono en la fructosa; Gx el

correspondiente a la glucosa; donde hay mayor certidumbre se indica los posibles asignamientos
qumicos de la seal basados en los estndares o en referencias: -t, residuo terminal; -i, (2-1),
residuo interno con enlace (2-1); -i, (2-6), residuo interno con enlace (2-1); -r, residuo
ramificado; -glc, glucosa interna. n.d., no detectado.

133

Todas las seales correspondientes a la Glc se observan en el espectro de la asparagosina

(DP14), fructano caracterizado en Asparagus officinalis (Shiomi, 1993), y en los FOS de
Cordyline australis (DP 16) (Brasch et al., 1988) y Pucinella peisonis (DP 10) (Spies et al.,
1992). La dbil visualizacin de solo algunas seales de la Glc en At-J, indica un DP superior al de
las especies mencionadas, pero inferior al de dalia.
Las zonas restantes del espectro de At-J se muestran complejas, indicando que los cinco tipos de
seales pueden estar presentes. El desplazamiento qumico en regiones cercanas, vuelve ancha
las seales considerablemente, haciendo difcil una exacta interpretacin; sin embargo, es posible
destacar algunas caractersticas del espectro. Una seal identificada a 60.77 ppm puede ser
atribuida a -D-Fruf (2-6) (60.8 ppm en levanos, Shiomi, 1993) o a 1,6-di--D-Fruf ( 60.8 ppm
para U. maritima, P. peisonis y Agropyron repens, Spies et al. 1992); mientras los enlaces (2-1)
se evidencian con la seal C1 a 61.6 ppm, confirmada en los estndares de 1-Kes y dalia. Un
desplazamiento a una menor frecuencia, 61.24 ppm, sugiere la presencia de -D-Glcp-i (De
Bruyn y Van Loo, 1991; Shiomi, 1993). Los ajustes a 74.6 ppm debido al C4 y 81.95 y 81.12
ppm debidas a los carbonos 5 (C5) confirman lo anterior, ya que sus valores semejan a lo
reportado para neofructanos (De Bruyn y Van Loo, 1991; Shiomi, 1993). La presencia de 1,6-di-D-Fruf tambin puede sugerirse por la semejanza de los valores reportados para estructuras
ramificadas como los fructanos presentes en C. australis, U. maritima y Phormium spp. (Brasch et
al., 1988; Spies et al., 1992; Sims et al., 2001); sin embargo, estos valores caen en las regiones
pobremente resueltas. Finalmente, cabe destacar que el espectro de At-J present mayor
semejanza con aquellos publicados para Cordyline australis, Phormium spp. y especialmente para
Urginea maritima (Figura 40). Esto confirma lo reportado por Sims et al. (2001 y 2003), que
aseveran que la estructura de los fructanos puede ser un criterio adicional para la clasificacin de
las especies; pues al estar stas taxonmicamente ms relacionadas, presentan fructanos con
caractersticas estructurales semejantes.

134

Figura 40. Espectros de 13C-RMN de fructanos en Asparagales. Comparacin de frucanos de

Agave tequilana (Jalisco) con lo reportado en la literatura para Phormium spp. (Sims et al., 2001);
Urginea maritima (Spies et al., 1992) y Cordyline australis (Brasch et al., 1988).
1.8.3. RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR DE PROTN
A diferencia de

13C-RMN,

los reportes de 1H-RMN de fructanos son mucho ms escasos (De

Bruyn y Van Loo, 1991; Liu et al., 1991). En la Figura 41 se muestra los espectros de 1H-RMN
obtenidos para Suc y fructanos de dalia y At-J; mientras que la Tabla 20 muestra las asignaciones
dadas a las seales emitidas por estos compuestos, de acuerdo a los valores reportados en la
literatura y a sus caractersticas espectrales (presencia de singletes, dobletes, etc). A partir de la
estructura de la Suc, se deducen once seales para los distintos protones presentes en la
molcula (seis para Glc y 5 para Fru). La seal emitida por el H1 de la Glc es fcilmente
identificada, pues al ser el nico protn unido a un tomo de carbono con dos oxgenos vecinos,
resuena como un doblete a altas frecuencias ( 5.1-5.4 ppm).

135

Figura 41. Espectro de 1H-RMN de sacarosa y fructanos de Dahlia variabilis y Agave

tequilana.
Los H3 y H4 de la Fru fueron identificados como un doblete y un triplete con desplazamientos de
4.00 y 3.83 ppm, respectivamente. Los dobletes a 3.36 y 3.32 ppm fueron asignados al H6 unido
al carbono primario de la Glc y Fru, respectivamente; mientras que el singlete observado a 3.45
ppm es debido al H1 de la Fru, cuyo carbono tiene como vecino al C2 que carece de protones. El
H3 de la Glc se identific como un triplete a 3.52 ppm. Finalmente en la regin 3.58-3.72 ppm
se observa una seal sin resolucin debida a los cercanos desplazamientos qumicos de H2 y H5
de la Glc y al H5 de la Fru, por lo que no fue posible una asignacin especfica de sus
desplazamientos qumicos. En el espectro de inulina de dalia, solo fue posible identificar las
resonancias correspondientes al H3 ( 4.04 ppm) y H4 ( 3.88 ppm) de la Fru.

136

Tabla 20. Desplazamientos qumicos de 1H-RMN.

1H

Suc

De Bruyn y Van
Loo, 1991
G1
5.42

1-Kes

6G-Kes

6-Kes

6G-Kes

Suc

Dalia

De Bruyn y Van
Loo, 1991
5.44

De Bruyn y Van
Loo, 1991
5.4

Liu et al.,
1991
5.15

Liu et al.,
1991
5.22

Este
trabajo
5.20 (d)

Este
trabajo
n.d.

G2

3.57

3.57

3.57

3.33

3.37

n.r.

n.d.

G3

3.48

3.47

3.53

3.53

3.56

3.52 (t)

n.d.

G4

n.r.

n.r.

n.r.

3.25

3.34

3.22 (t)

n.d.

G5

n.r.

n.r.

n.r.

3.6

3.77

n.r.

n.d.

G6

n.r.

n.r.

n.r.

3.61

3.5

3.32 (d)

n.d.

3.45 (s)

n.r.

4.00 (d)

4.04 (d)

3.83 (t)

3.88 (t)

n.r.

n.r.

3.36 (d)

n.r.

3.66
F1

n.r.

n.r.

n.r.

3.46-i

3.46-O1

3.46-t

3.52-O6
3.64-O6

F3

F4

F5

F6

4.25 (d)

4.06 (t)

n.r.

n.r.

4.28 (d)

4.19 (d)

3.97-i

4.04-O1

4.22 (d)

4.19 (d)

3.94-t

4.00-O6

4.08 (t)

4.15 (t)

3.82-i

3.89-O1

4.05 (t)

4.08 (t)

3.87-t

3.97-O6

n.r.

n.r.

3.72-i

3.69-O1

n.r.

n.r.

3.65-t

3.71-O6

n.r.

n.r.

3.55-i

3.53-O1

3.73-i

3.63-O1

3.40-t

3.54-O6

Valores de desplazamientos qumicos (en ppm) de 1H reportado para sacarosa, 6-kestotriosa y

6G-kestrotriosa (neokestosa); Gx indica el nmero de protn en la glucosa; Fx el correspondiente
a la fructosa; -t, residuo terminal; -i, residuo interno; -O1 y O6, residuos unidos al O1 y O6 de la
glucosa interna, respectivamente. En este trabajo las resonancias de 1H para sacarosa y fructanos
de dalia fueron asignadas de acuerdo a los valores de la literatura y por las caractersticas del
espectro; la letra entre parntesis indica la seal de resonancia: s, singlete; d, doblete y t, triplete.
n.r., no reportado o no resuelto; n.d., no detectado.
Respecto a los fructanos de At-J, la resonancia del H1 de la Glc ( 5.23 ppm) fue bien resuelta,
mientras que las dems seales se presentaron sin resolucin en un intervalo de 3.40 a 4.18
ppm. La complejidad de los fructanos en esta especie evidenciada en

13C-RMN

y el estrecha

regin donde los protones resuenan, hizo imposible la resolucin de sus seales y con ello un
detallado anlisis estructural. Sin embargo, a travs de la integracin del rea bajo los picos

137

(Figura 41) fue posible estimar el DP de los fructanos presentes en At-J. Considerando que la
seal de 5.23 ppm corresponde al nico H1 de la Glc, su rea fue considerada como la unidad
(0.76) y relacionada con la regin del resto de las seales (94.25), estimndose un aproximado de
124 H presentes en esta rea y que corresponde a un DP promedio de 21 unidades.

1.9. ESTRUCTURAS PROPUESTAS PARA FRUCTANOS EN Agave Y Dasylirion

Las caractersticas estructurales determinadas en los fructanos de agaves y dasylirion, coinciden
con otros miembros de las Asparagales. En general, stos se caracterizan por una baja
representacin de inulinas comparados con los miembros Asterales. Adems, la presencia del
ismero 6-Kes no es vidente, consecuentemente, si existen levanos en estas especies, deben
estar solo en pequeas cantidades. Por otra parte, en el orden Asparagales es posible distinguir
claramente al gnero Allium, con su predominante neoserie y fructanos lineales tipo inulina, de
otros gneros taxonmicamente menos relacionados como Phormium, Cordyline, Urginea y Agave
caracterizados por la presencia de graminanos y unidades ramificadas. Considerando que los
fructanos en agaves y dasylirion constituyen una mezcla polidispersa y con estructuras
heterogneas, es difcil elucidar una estructura molecular para estas especies. Sin embargo, los
datos colectados ofrecen una valiosa informacin acerca de las caractersticas predominantes de
estos carbohidratos. A partir de dichos datos en la Figura 42 se muestra dos tipos generales de
estructuras propuestas para los fructanos en estas especies, con valores de n1 a n4 0 y variables
acorde a cada especie y condiciones medioambientales.
Una posible estructura clasifica a estos fructanos como graminanos ramificados (Figura 42A), ya
que en estas plantas se evidenci los dos tipos de enlace -fructo-furanosil, adems de la
presencia de 1,6-di--D-Fruf (Fru ramificada). La estructura ms pequea de un fructano
ramificado, corresponde a la bifurcosa (1 y 6-kestotetraosa, DP4), por lo que probablemente a
partir de esta estructura las FT presentes en agaves y dasylirion catalizan la elongacin de la
molcula. Esta estructura semeja a aquella reportada para A. vera cruz. Para esta especie,
Aspinall y Das Gupta (1959) proponen un graminano de DP31 altamente ramificado.
Una segunda estructura propuesta para los fructanos de agaves y dasylirion es caracterizada por
una unidad de i--D-Glcp con puntos de ramificacin, neofructano ramificado (Figura 42B). A
este tipo estructural lo hemos denominado agavinas (Mancilla-Margalli y Lpez, 2006) y aunque

138

Figura 42. Estructuras propuestas para fructanos presentes en Agave y Dasylirion. A)

graminano ramificado con glucosa terminal y B) con una unidad de -D-glucopiranosa interna y
puntos de ramificacin (agavinas). La diferencia entre las especies debe estar dado por los valores
de n1 a n4 0, que a su vez deben depender no solo de la especie sino de las condiciones
ambientales.
no hay reportes de una caracterizacin molecular de un fructano con tales caractersticas, ste es
muy semejante a la estructura propuesta para Urginea maritima (Spies et al., 1992). La propuesta
para los fructanos en estas especies coincide en un esqueleto 1)-D-Fruf--(2 con una unidad
-D-Glcp interna, con una cierta frecuencia de ramificacin (cada tres residuos para At-J y U.
maritima) y una unidad D-Fruf (2-6) en cada punto de ramificacin seguida de un -D-Fruf
terminal. La diferente contribucin de cada tipo de estructura y la longitud de la cadena
encontradas en miembros de este gnero, pueden reflejar diferencias no solo atribuibles a
lasespecies, sino adems debe reflejar el estado fisiolgico de la planta y su capacidad de
adaptacin a diferentes condiciones geoclimticas.

1.10. POSIBLES IMPLICACIONES DE LA PRESENCIA DE FRUCTANOS EN AGAVES Y

DASYLIRION
Las implicaciones evolutivas de la diversidad estructural de los fructanos no son claras; sin
embargo, de acuerdo a Hendry (1987 y 1993), los fructanos son el principal carbohidrato de
almacn en ms de la mitad de las especies del orden Liliales (actualmente orden Asparagales de
acuerdo a la clasificacin de Dahlgren, Clifford y Jeo, 1985), y propone que la presencia de este
carbohidrato es clave para la distribucin cosmopolita de estas especies, incluyendo regiones
tropicales y ridas. Este orden no es considerado altamente evolucionado como el resto de los que
almacenan fructanos. Adems, las evidencias ms antiguas de plantas que almacenan estos

139

carbohidratos, corresponden a especies primitivas representadas actualmente por miembros de la

familia Agavaceae. En las regiones ridas donde estas especies crecen exitosamente, la
disponibilidad limitada de agua es la caracterstica predominante. Estas condiciones fueron, de
acuerdo a Hendry, factores climticos que contribuyeron al origen de las plantas sintetizadoras de
fructanos. Por lo tanto, de una manera especulativa, podemos concluir que la diversidad
estructural de los fructanos, pudo haber sido determinante en la supervivencia y adaptacin de la
flora ancestral de las Asparagales, y que actualmente su presencia sigue siendo factor relevante
para el desarrollo de estas especies en condiciones ridas.

140

2.

IDENTIFICACIN

DE

ACTIVIDADES

ENZIMTICAS

INVOLUCRADAS

EN

EL

METABOLISMO DE FRUCTANOS DE AGAVE Y DASYLIRION

La diversidad de estructuras encontrada en tallos de agave y dasylirion a partir del anlisis de sus
carbohidratos, sugiere la participacin de diferentes FT en su sntesis. En la literatura cientfica,
concerniente a

la purificacin de FT de origen vegetal, sobresalen dos estrategias

cromatogrficas utilizadas. La primera, la cual es empleada por la mayora de los autores (Van den
Ende et al., 1996; Marx et al., 1997; St. John et al., 1997a), utiliza primeramente una cromatografa
de afinidad, seguida de intercambio inico; mientras que en una segunda estrategia, estos pasos
cromatogrficos son invertidos (Duchateau et al., 1995; Koops y Jonker, 1996; Henson y
Livingston, 1996). En la identificacin de actividades de las FT en agaves y dasylirion en este
trabajo, se intentaron ambas estrategias y los resultados de stas se muestran a continuacin.

2.1. ESTRATEGIA CROMATOGRFICA I

2.1.1. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Las protenas precipitadas con una saturacin al 80% de sulfato de amonio, fueron recuperadas
por centrifugacin y cargadas en una columna de afinidad de concanavalina A. La fraccin
protenica que no interaccion con la resina tuvo una absorbancia 280nm de 2 a 3, pero no
present actividad de FT utilizando Suc o 1-Kes como sustrato, por lo que esta fraccin fue
eliminada. Por otra parte, las protenas con afinidad a la resina, fueron eluidas con 1.5 vol. de metil-manopiransido. En la Figura 43A se observa que las protenas eluyeron en un solo pico, por
lo que las fracciones correspondientes se juntaron en lo que se denomin fraccin ConA. La
interaccin de estas protenas con la resina y su desplazamiento por la adicin de -metilmanopiransido, confirma la naturaleza glicosilada de esta familia de enzimas, reportada
anteriormente por algunos autores (Van de Ende et al., 1996b, Koops y Jonker, 1996).
La determinacin de Bradford indic una concentracin de 1 mg/mL. Una concentracin protenica
de 0.6 g/L fue utilizada en el bioensayo enzimtico, que evidenci la presencia de FT, FEH y
seguramente de Inv (Figura 43B). Utilizando 200 mM de Suc como sustrato, se detect la
formacin de FOS hasta DP5, desde el primer tiempo de muestreo (18 h), no habiendo formacin
de fructanos superiores an despus de 65 h (Figura 43B). Generalmente, los reportes sobre la

141

Figura 43. Cromatografa de afinidad a concanavalina A. A) Se muestra el patrn de elucin de

protenas de Agave tequilana (Jalisco) y Agave angustifolia (Oaxaca) de la resina concanavalina A
despus de la aplicacin de -metil-manopiransido 150 mM. B) Productos del ensayo enzimtico
de A. tequilana a distintos tiempos de reaccin (0, 18, 40 y 65 h), con distintos sustratos (sacarosa
200 mM o fructanos al 1%) y dos temperaturas de incubacin (30 C y 0 C); St, compuestos
estndar; M, monosacridos (fructosa + glucosa); Suc, sacarosa; 1-Kes, 1-kestotriosa; Nis,
nistosa; DP5, fructosil-nistosa; O, origen de la cromatografa.
sntesis de fructanos in vitro indican diferentes resultados comparado a lo encontrado in planta,
regularmente el DP es notablemente inferior. Estas diferencias son atribuidas a las diferentes
caractersticas de los medios de reaccin (Van den Ende et al., 2003). Adems, se ha establecido

142

en Asteracea, que el patrn de fructanos sintetizados in vitro depende de la relacin (1-SST + 1FFT)/Suc (Van den Ende et al., 1996; Hellwege et al., 2000) y que la formacin de fructanos
superiores, sucede despus de que la 1-Kes es acumulada en una concentracin capaz de
competir con la Suc como fructosil-aceptor (Van den Ende et al., 1996b). La sntesis nica de FOS
en la fraccin ConA puede ser explicada por una reduccin de Suc, sin suficiente acumulacin de
1-Kes para inducir la sntesis de fructanos superiores.
De acuerdo a Van den Ende y Van Laere (1996b), las FT de achicoria presentan mayor actividad a
0 C, mientras que la actividad Inv genuina o intrnseca en las FT se ve decrecida a esta
temperatura. Con la finalidad de reducir el tiempo de sntesis in vitro y de contrarrestar la posible
interferencia de Inv en la sntesis de fructanos, la fraccin ConA se incub a 0 C; sin embargo,
contrariamente a lo esperado, hubo una severa reduccin en la actividad (Figura 43B) y slo se
observ la formacin de 1-Kes. Las FT parecen tener diferentes propiedades cinticas de acuerdo
a la especie (Vergauwen et al., 2003) y no solo eso, sino que tambin pudiesen ser reguladas por
distintos factores. Por ejemplo, durante condiciones de sequa, la 1-SST de achicoria es inducida
(De Roover et al., 2000), mientras que en algunas monocotiledneas esta enzima es inhibida
(Kawakami y Yoshida, 2002). Como parte de su ciclo fenolgico, las plantas de achicoria son
sometidas a temperaturas fras que inducen la acumulacin de fructanos en sus races (Bais y
Ravishankar, 2001); mientras que las necesidades fisiolgicas de los agaves son distintas, y las
bajas temperaturas incluso, pueden causar detrimentos en estas plantas (Irish, 2000). Por lo tanto,
es posible que la regulacin de las FT en agaves sea distinta a la achicoria y que podra estar
sujeta a otros factores de induccin, ms relacionados con el estatus hdrico que con la
temperatura.
Por otra parte, la fraccin ConA fue ensayada en presencia de fructanos al 1% extrados de At-J.
La formacin de monosacridos (Glc y Fru) es indicativa de la presencia de Inv y/o FEH en esta
fraccin (Figura 43B).

2.1.2. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO ANINICO

Despus de dializada y concentrada la fraccin ConA, sta fue aplicada a una columna de
intercambio aninico (Mono Q Sepharose, Amersham Pharmacia). Al igual que lo reportado por
Van den Ende et al., (1996b), al valor de pH utilizado (7.0), las actividades -fructofuranosidasas
(Inv y FEH), no interactuaron con la resina, por lo que esta fraccin fue colectada (Q0) y ensayada

143

para estas actividades. La fraccin protenica que se peg a la resina Mono Q, fue eluida con un
gradiente lineal de NaCl (0 a 600 mM). La Figura 44A muestra que las protenas provenientes de
At-J y Aa-O presentaron un comportamiento similar; sus protenas eluyeron en cuatro picos
principales (Q1, Q2, Q3 y Q4) a concentraciones similares de NaCl (75, 155, 310 y 525 mM,
respectivamente).

Figura 44. Cromatografa de intercambio aninico. A) La fracciones ConA de A. tequilana

(Jalisco) y A. angustifolia (Oaxaca) fueron cargadas en una resina MonoQ y eluidas con un
gradiente continuo de NaCl (0-600 mM, pH 7.0); B) Productos del ensayo enzimtico de A.
tequilana a distintos tiempos de reaccin (0, 18, 40 y 65 h); St, compuestos estndar; M,
monosacridos (fructosa + glucosa); Suc, sacarosa; 1-Kes, 1-kestotriosa; Nis, nistosa; DP5,
fructosil-nistosa; O, origen.

144

Cada una de estas fracciones fue ensayada para actividad de FT (Figura 44B). Las fracciones Q1
y Q2 no mostraron actividad FT cuando fueron incubadas con Suc 200 mM; mientras que las
fracciones Q3 y Q4 presentaron actividad FT diferencial, indicando que la cromatografa de
intercambio aninico enriqueci las distintas actividades en diferentes fracciones. En presencia de
Suc, las protenas en Q3 sintetizaron FOS hasta DP5, mientras que en Q4 solo se observ la
generacin de 1-Kes. Para alcachofa Jerusalem, Koops y Jonker (1996), reportaron la elucin de
1-SST de una resina MonoQ (pH 6.5) a una concentracin de 250 mM de NaCl, que podra
equivaler a los 310 mM de la fraccin Q3, donde esta enzima podra estar enriquecida. Por otra
parte, la dbil presencia de 1-Kes en Q4 puede ser explicada como una actividad residual de 1SST en esta fraccin; donde probablemente pueda encontrarse enriquecida la 1-FFT. Esta ltima
enzima utiliza Suc como fructosil-aceptor en la generacin de 1-Kes, pero es incapaz de utilizarla
como donador. La generacin de FOS (DP>3) a partir de 1-Kes puede evidenciar si esta fraccin
est enriquecida con la 1-FFT; desafortunadamente, este bioensayo no se llev a cabo.

2.1.3. CROMATOGRAFA DE HIDROXIAPATITA

Las FT presentan pesos moleculares y propiedades bioqumicas semejantes (Tabla 11) que
complica su purificacin y caracterizacin. Una estrategia cromatogrfica para separar estas
actividades es el uso de la resina de hidroxiapatita (HA) (Koops y Jonker, 1996; Lscher et al.,
2000). Esta resina es un mineral que presenta grupos de calcio, hidroxilos y fosfatos; por lo que su
superficie constituye un mosaico complejo de cargas y la interaccin de las protenas con la resina
es multifactorial, dependiendo entre otras cosas, de la naturaleza de la protena (cida o bsica),
la interaccin especfica de los grupos carboxilo y de las caractersticas del eluyente (Gorbunoff y
Timasheff, 1984). Las protenas contenidas en la fraccin Q3 y Q4 disueltas en buffer Bis-Tris-HCl
(pH 6.0) fueron cargadas a la resina HA. La fraccin lavada con este mismo buffer fue colectada
en la fraccin denominada HA-L (Q3 o Q4). Posteriormente, la columna fue lavada con buffer
NaH2PO4 300 mM (pH 5.6). Los grupos fosfato del buffer neutralizan los sitios de caIcio de la
resina y le confirieren carga negativa (Gorbunoff y Timasheff, 1984). La fraccin protenica eluda
de esta forma se denomin HA-E (Q3 o Q4). En la Figura 45 se muestra los productos obtenidos
en el ensayo enzimtico de estas fracciones. El uso de la resina HA discrimin notoriamente las
diferentes actividades FT, reteniendo aparentemente la actividad 1-SST pero no la 1-FFT, en
acuerdo a lo reportado por Koops y Jonker (1996).

145

Figura 45. Cromatografa de hidroxiapatita. Las fracciones Q3 y Q4 fueron cargadas en una

columna de hidroxiapatita. La columna se lav con Bis-Tris-HCl 20 mM (pH 6.0) recuperando las
fracciones sin interaccin: HA-L; mientras que la fraccin protenica que interaccion con la
columna se eluy con NaH2PO4 300 mM (pH 5.6): HA-E. El ensayo enzimtico se realiz con Suc
200 mM o 1-Kes 45 mM, segn se indica, tomando alcuotas a tiempos 0, 18, 45 y 60 h. St,
compuestos estndar; M, monosacridos; Suc, sacarosa; 1-Kes, 1-kestotriosa; Nis, nistosa; DP5,
fructosil-nistosa; O, origen.
i) HA-LQ3
En la fraccin Q3, las protenas sin interaccin no presentaron actividad en presencia de Suc 200
mM, pero usando 1-Kes 45 mM se logr la sntesis de productos superiores a DP5, sin generacin
de monosacridos, por lo que se sugiere que esta fraccin est enriquecida con 1-FFT.
ii) HA-EQ3
La fraccin protenica que fue eluda de la resina, sintetiz FOS en presencia de Suc. Sin
embargo, de manera interesante, se observ un patrn caracterstico de -fructofuranosidasa en

146

presencia de 1-Kes, con la generacin predominante de monosacridos (Glc y Fru). Esto sugiere
la presencia de 1-SST en esta fraccin, enzima que es capaz de utilizar Suc como sustrato para
formar 1-Kes principalmente, y FOS superiores (actividad 1-FFT) solo cuando cierta relacin de
Suc/1-Kes es alcanzada (Van den Ende et al., 1996a); mientras que su actividad fructofuranosidasa, puede ser semejante a lo reportado en trigo, donde la 1-SST en presencia de
1-Kes 50 mM, present actividad predominante de 1-FEH con la generacin de Fru y Suc (Nagaraj
et al., 2004).
iii) HA-LQ4
La fraccin HA-LQ4 en presencia de Suc, sintetiz un producto cuyo Rf es inferior al de la 1-Kes
(Figura 45) con dominante produccin de monosacridos. Cuando esta misma fraccin fue
ensayada con 1-Kes, hubo formacin de FOS superiores a DP5. Este hecho sugiere la posible
presencia de una actividad 6-SFT, enzima que usa Suc como fructosil-aceptor y donador (20%
de la actividad) en la formacin de 6-Kes, producto con un Rf inferior a la 1-Kes. Esta enzima tiene
predominante actividad de Inv (78%) en presencia de Suc, que justifica la produccin importante
de monosacridos observada. Por otra parte, esta enzima, presenta actividad polimerizante
cuando usa 1-Kes como sustrato (Sprenger et al., 1997) y que puede explicar la presencia de FOS
en el bioensayo usando 1-Kes como sustrato.
iv) HA-EQ4
La fraccin protenica que eluy de la resina en esta fraccin, al igual que HA-EQ3, present
caractersticas de 1-SST, pero con notables diferencias. En presencia de Suc, el producto
predominante fue la 1-Kes, y a diferencia de HA-EQ3, se observ una ligera accin polimerizante
slo en el ltimo tiempo de muestreo (60 h). En presencia de 1-Kes no hay actividad fructofuranosidasa, sino una actividad de polimerizacin, y al igual que la fraccin HA-LQ3 no hay
presencia de monosacridos, sugiriendo una actividad de polimerizacin de una enzima que
adems es capaz de utilizar Suc. A diferencia de lo reportado en cebolla y esprrago,
recientemente se mostr que la 6G-FFT de Lolium perenne puede utilizar Suc como donador en la
sntesis poco favorecida de 1-Kes (Lasseur et al., 2006); por lo que en la fraccin HA-EQ4 no
podemos eliminar la posible presencia de la 6G-FFT en los agaves.
Aunque la resina HA claramente discrimin diferentes actividades FT, no podemos descartar la
presencia de una mezcla de ms de una de ellas en las distintas fracciones. La actividad 1-SST en
las fracciones HA-EQ3 y -EQ4 con comportamientos distintos, abre la posibilidad de la existencia

147

de isoformas para esta enzima, igual que lo reportado en otras especies (Duchateau et al., 1995;
Lscher et al., 1996 y 2000a). Por ejemplo, Lscher et al. (2000a) reporta en cebada dos
isoenzimas 1-SST. Ambas formas generan 1-Kes y Glc a partir de Suc, pero una de ellas en
presencia de 1-Kes presenta actividad FEH, generando Fru y Suc. Se sugiere que la Suc
generada de esta forma, es utilizada posteriormente para la sntesis de 1-Kes y produccin de Glc.

2.1.4. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN (FILTRACIN EN GEL)

La resina de exclusin Sephacryl S-200 fue calibrada con protenas estndares (Figura 46A). La
fraccin Q0, que no interaccion con la resina de intercambio aninico y que present actividad de
-fructofuranosidasa, se carg en la columna y fue eluda con buffer de exclusin.

Figura 46. Cromatografa de exclusin en gel. A) Determinacin del volumen vaco con azul
dextran (2000 kDa) y calibracin de la columna Sephacryl S-200 (Amersham Pharmacia) con
catalasa (232 kDa), -globulina (158 kDa), seroalbmina (66 kDa) y lisozima (14.3 kDa); B) La
fraccin Q0 proveniente de intercambio aninico fue cargada en la columna y eluda con buffer de
citrato-fosfato 50 mM (pH 5.5), colectando tres fracciones: Q0-A, Q0-B y Q0-C; C) Productos del
ensayo enzimtico de las tres fracciones ensayadas con fructanos al 1% extrados de Agave
tequilana (Jalisco), a distintos tiempos de reaccin (0, 18, 45 y 60 h). St, compuestos estndar; M,
monosacridos (fructosa y glucosa); Suc, sacarosa; 1-Kes, 1-kestotriosa; DP4, nistosa; DP5,
fructosil-nistosa; O, origen.

148

El patrn de elucin muestra tres fracciones claramente definidas, denominadas Q0-A, Q0-B y Q0C (Figura 46B). De acuerdo a la ecuacin de regresin y=0.5882 + 2.8613, (r2 0.9461), obtenida
graficando el log PM de las protenas estndares vs su coeficiente de distribucin (Ecuacin IV),
para las fracciones eluidas se detemin un intervalo de peso molecular de 126 a 180 kDa para
Q0-A, 70 a 121 kDa para Q0-B y de 23 a 38 kDa para Q0-C (Tabla 21).
Cada una de las fracciones fue ensayada con fructanos al 1% extrados de A. tequilana (Jal.). La
Figura 46C muestra claramente que la actividad FEH est contenida en la fraccin Q0-B. Los
productos generados de esta reaccin fueron exclusivamente monosacridos, aunque la seal
para estos carbohidratos fue de menor intensidad a la esperada. A diferencia de las FT, las FEH
son enzimas monomricas con PM de 65 a 75 kDa (Tabla 11) (Marx et al., 1997; De Roover et al.,
1999; Van den Ende et al., 2003), por lo que el rango de peso molecular de la fraccin Q0-B
coincide con los valores reportados para estas enzimas.

2.1.5. IDENTIFICACIN PUTATIVA DE ENZIMAS INVOLUCRADAS EN EL METABOLISMO DE

FRUCTANOS EN Agave tequilana (JALISCO)
La Figura 47 muestra un gel SDS-PAGE de las fracciones protenicas obtenidas a lo largo de los
distintos pasos cromatogrficos. Como se puede observar, a pesar de pasar el extracto crudo por
varias resinas, an se observa la presencia de una mezcla de protenas. Aunque lejos de la
posibilidad de atribuir con alta certeza una actividad especfica a alguna protena observada,
podemos sin embargo, marcar algunas bandas como fuertes candidatos con actividad FT, con
base en su enriquecimiento cromatogrfico correlacionado con las actividades observadas en este
trabajo y los pesos moleculares reportados en la literatura.
Tabla 21. Calibracin de la columna de exclusin y estimacin de pesos moleculares de las
protenas en la fraccin QO.
Protena

PM (kDa)

Azul dextran
Catalasa
-Globulina
Seroalbmina
Lisozima
Q0-A
Q0-B
Q0-C

2000
232
158
66
14.3
126-180
70-121
23-38

log PM

Ve

Ve/Vo

Kav

Conc.
(mg/mL)
3.3010
130
1
1
-3
2.3654
132
1.0153
2
8.65
2.1986
156
1.2000
0.1125
2
1.8195
190
1.4615
0.2597
2
1.1553
386
2.9692
1.1080
2
2.10-2.25 134-168 1.0307-1.2930 0.0173-0.1298
1.84-2.08 172-224 1.3230-1.7230 0.1817-0.4068
1.36-1.57 284-332 2.1846-2.5538 0.6665-0.8743
-

Ve, volumen de elucin; Vo, volumen muerto (determinado con azul dextran), Kav, Ve-Vo/Vc-Vo;
V, volumen de columna (361.0318 mL).
149

Figura 47. Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE). Fracciones

protenicas obtenidas de Agave tequilana (Jalisco) a travs de distintos pasos de purificacin. PM,
marcadores de peso molecular; ConA, fracciones eludas de concanavalina A; fracciones Q
obtenidas de intercambio aninico, Q0, sin interaccin; Q3 y Q4, eludas con 310 y 525 mM de
NaCl, respectivamente; fracciones HA obtenidas de hidroxiapatita por lavados (HA-L, sin
interaccin) con Bis-Tris HCl 20 mM o eludas (HA-E) con NaH2PO4 300 mM. En asteriscos se
marcan las probables enzimas participantes en el metabolismo de fructanos.
En el carril Q0, hay bandas de protenas que no se observan en los siguientes carriles. En esta
fraccin se observ una actividad FEH, que de acuerdo a los resultados de la cromatografa de
exclusin, esta protena debe presentar un peso molecular de 70 a 121 kDa. Una banda marcada
con un asterisco arriba de los 68 kDa podra corresponder a esta enzima. En las fracciones
provenientes de HA, donde hubo mayor discriminacin de actividad, se observa un par de bandas
enriquecidas de 40 y 22 kDa; en estas fracciones se observ actividad polimerizante, sin
generacin de monosacridos (Figura 44), por lo que estas bandas pueden corresponder al
heterodmero de la 1-FFT; sin embargo, estos valores difieren con lo reportado para estas enzimas
( 50 y 20 kDa).

150

2.2. ESTRATEGIA CROMATOGRFICA II

En la segunda estrategia ensayada, el extracto crudo fue separado en una resina de intercambio
aninico (Mono Q Sepharose; Amersham Pharmacia), seguida de una cromatografa de afinidad
(concanavalina A). Para esta estrategia, se ensayaron los extractos protenicos de At-J, Aa-S, ApO y Dsp-C. Estas especies mostraron un comportamiento casi similar con diferencias
principalmente cuantitativas o en la presencia o ausencia de un compuesto minoritario (Tabla 22);
siendo Dsp-C, la especie con un comportamiento ms dismil. En las siguientes secciones se
muestran nicamente los resultados obtenidos para A. potatorum. Los productos de los
bioensayos fueron detectados en esta ocasin por HPAEC-PAD. Esta tcnica presenta el
inconveniente de que el detector tiene diferentes factores de respuesta para cada compuesto, por
lo que para fines cuantitativos, el equipo debe calibrarse para cada compuesto detectado (Pavis et
al., 2001a); sin embargo, su lmite de deteccin y capacidad de resolucin la hacen una de las
tcnicas de mayor utilidad en el anlisis de fructanos.

2.2.1. EXTRACTO CRUDO

Para identificar las principales actividades enzimticas, 40 L de extracto crudo de A. potatorum
(15.82 mg/mL) fueron ensayados a un volumen final de 50 L, usando Suc o 1-Kes a una
concentracin de 200 mM o con fructanos al 1% (Figura 48). Despus de 24 h de reaccin, los
productos formados con Suc y 1-Kes fueron comparables al patrn de fructanos encontrados in
planta (Figura 34). Sutiles diferencias observadas in vivo e in vitro son atribuibles a un entorno
distinto (Van den Ende et al., 2003), adems de un probable requerimiento de la induccin de los
genes que codifican para estas FT en la sntesis de estos carbohidratos (Vijn et al., 1997;
Kawakami and Yoshida, 2002; Nagaraj et al., 2004). La formacin de FOS de diversas estructuras
hasta un DP12, habla de la presencia de diferentes enzimas involucradas en su sntesis. La
capacidad de usar Suc como nico sustrato inicial en la formacin de estos productos, indica que
la 1-SST es una enzima activa en la sntesis y acumulacin de 1-Kes, metabolito central usado por
las dems FT que polimerizan este trisacrido en diferentes maneras. Los DP3 ms abundantes
fueron la 1-Kes y 6G-Kes. Una considerable acumulacin de la serie inulina, representada
mayoritariamente por Nys (I4), sugiere la participacin de 1-FFT en la elongacin de estos IOS. Al
igual que lo observado in planta, los fructanos sintetizados in vitro corresponden mayoritariamente
a los neofructanos, representados por 6G-Kes (N3), 1 y 6G-kestotetraosa (N4, FGFF) y 1,6G-

151

kestotetraosa (N4, FFGF). Estos compuestos DP4, son ismeros producidos por una fructosiltransferencia a cualquiera de las dos Fru terminales presentes en la 6G-Kes. Esto puede suceder

Figura 48. Perfil cromatogrfico (HPAEC-PAD) de fructanos sintetizados por enzimas

presentes en el extracto crudo de A. potatorum. Los picos son identificados segn se indica en
la Tabla 15.

Tabla 22. Productos formados en los bioensayos con fracciones Q y usando sacarosa o 1kestotriosa como sustrato. Se utiliza la nomenclatura propuesta por Ernst et al. (1998), en donde
Ix, refiere a la serie inulina con x grado de polimerizacin; Nx y Nx indican respectivamente, si el
fructano es elongado sobre ambos extremos de la molcula o slo del lado de la glucosa,
respectivamente. Se indica la enzima identificada y el nmero de asteriscos indica la actividad
relativa de acuerdo a la abundancia de los productos formados (s.p., sin producto).

152

Fraccin + Sustrato
Q1 + Suc 200 Mm

Q1 + 1-Kes 50 mM

A.angustifolia
I3
1-SST
N3, N4, N4 6G-FFT
6-K
6-SFT
I4.DP7 1-FFT*
N3, N4
6G-FFT*
I4
1-FFT*

Q2 + Suc 200 mM

GFF

Q2 + 1-Kes 50 mM

N3, N4, N4 6G-FFT***

I4.DP8
1-FFT**

Q3 + Suc 200 mM

I3
N3

Q3 + 1-Kes 50 mM

N3, N4, N4 6G-FFT**

I4..DP8 1-FFT***

Q4 + Suc 200 mM

I3

Q4 + 1-Kes 50 mM

N3, N4, N4 6G-FFT***

I5..DP5 1-FFT*

Q5 + Suc 200 mM

Q5 + 1-Kes 50 mM

1-SST*

1-SST**
6G-FFT*

1-SST*

s.p.

N3, N4, N4 6G-FFT**

I4
1-FFT*

A. tequilana
I3
1-SST**
N3, N4, N4
6G-FFT**
6-K, BF
6-SFT
I4. DP9
1-FFT**
N3, N4, N4
6G-FFT**
6-K, BF
6-SFT
I4. DP9
1-FFT**
I3
1-SST**
N3, N4, N4
6G-FFT**
6-K, BF
6-SFT
I4..DP10
1- FFT**
N3, N4, N4
6G-FFT**
6K, BF
6-SFT
I4DP10
1-FFT***
I3
1-SST**
N3, N4, N4
6G-FFT**
6-K, BF
6-SFT
I4..DP13
1- FFT**
-

A. potatorum
I3
1-SST***
N3, N4, N4
6G-FFT***
6-K, BF
6-SFT
I4. DP6
1-FFT**
N3, N4, N4
6G-FFT***
BF
6-SFT
I4. DP8
1-FFT**
I3
1-SST***
N3, N4, N4
6G-FFT**
6-K, BF
6-SFT
I4..DP5
1- FFT*
N3, N4, N4
6G-FFT**
BF
6-SFT
I4DP7
1-FFT**
I3
1-SST***
I4
1-SST o FFT*

N3, N4, N4
I4DP6

I3
N3, N4, N4
6-K, BF
I4. DP13
N3, N4, N4
6K, BF
I4DP8
I3
N3, N4, N4
6-K, BF
I4. DP7
N3, N4, N4
BF
I4. DP7

1-SST**
6G-FFT**
6-SFT
1-FFT***
6G-FFT*
6-SFT
1-FFT**
1-SST***
6G-FFT**
6-SFT
1-FFT*
6G-FFT*
6-SFT
1-FFT**

Dasylirion spp.
s.p.

I4

1-FFT

I3
N3, N4, N4
6-K, BF
I4..DP6

1-SST***
6G-FFT***
6-SFT*
1- FFT**
-

I3
I4

1-SST**
1-SST o FFT*

6G-FFT**
1-FFT***

N3, N4, N4
I4

6G-FFT***
1-SST o FFT*

I3

1-SST**

I3
I4

1-SST**
1-SST o FFT*

N3, N4, N4
I4DP7

6G-FFT**
1-FFT***

N3, N4, N4
I4

6G-FFT***
1-SST o FFT*

N3, N4, N4

6G-FFT**

I3
I4

1-SST**
1-SST o FFT*

N3, N4, N4
I4DP6

6G-FFT**
1-FFT***

N3, N4, N4
I4

6G-FFT***
1-SST o FFT*

153

a travs de la actividad de la 1-FFT o la 6G-FFT (Ritsema et al., 2005); sin embargo, la relativa
abundancia de la 6G-Kes in vitro y la acumulacin de neofructanos in vivo, sugiere fuertemente
que la 6G-FFT es una actividad importante en plantas de agave y dasylirion.
La sntesis de FOS del extracto crudo de A. potatorum con 1-Kes 200 mM, no difiere mucho del
patrn de fructanos formados con Suc (Figura 48). De nuevo, se observan productos de DP12,
pero con una mayor acumulacin de FOS superiores a 5. Una diferencia notable, fue la presencia
de fructosil-nistosa (I5) y picos adicionales con DP7 y 8, los cuales son claramente ausentes en los
productos formados a partir de Suc. Aunque estos ltimos productos no pueden ser identificados
con certeza, pudiesen tratarse tambin de IOS; hecho que sugiere una competencia de la 6G-FFT
y la 1-FFT por la 1-Kes como sustrato.
Cuando el extracto crudo fue ensayado con fructanos de agave al 1%, se identific la presencia de
actividad FEH (Figura 48), evidente por la gran acumulacin de Fru y una disminucin
principalmente de Suc y 1-Kes. La cantidad significativa de Glc puede ser indicio tambin de una
importante actividad de Inv.
Varios de los pequeos picos observados en el perfil cromatogrfico de los fructanos in planta
(Figura 34), fueron tambin sintetizados a partir del extracto enzimtico con Suc o 1-Kes, aunque
con una abundancia menor. De acuerdo al anlisis de metilacin, estos compuestos deben
pertenecer a graminanos o pequeos fructanos ramificados; por lo que en agaves y dasylirion
deben estar presentes adems, aquellas enzimas encargadas de la sntesis de enlaces (2-6) y/o
puntos de ramificacin. La sntesis de estos compuestos implica una fructosil-transferencia al C6
de una fructosa en la generacin de un enlace (2-6), reaccin catalizada por la 6-SFT. Los
productos caractersticos de esta enzima en gramneas, 6-Kes y bifurcosa (1 y 6-kestotetraosa),
no son caractersticos de las Asparagales. De acuerdo a su comportamiento cromatogrfico, el
pequeo pico que eluye entre 1-Kes y 6G-Kes (marcado con un asterisco en la Figura 48), podra
atribuirse a la 6-Kes y la bifurcosa podra estar coeluyendo con la 1 y 6G-kestotetraosa (N4)
(Shiomi, 1992; Bancal et al., 1993; Pavis et al., 2001a); sin embargo, estos compuestos son solo
tentativamente identificados como tal en agaves y dasylirion. Por otra parte, la baja actividad de 6SFT contrasta con el porcentaje de enlaces (2-6) encontrada en agaves y dasylirion mediante
anlisis de PMAA (Tablas 16 y 17); el cual aunque siempre inferior al porcentaje de enlaces (21), se encuentra en cantidades importantes. Sin embargo, dada la relativa abundancia de puntos
de ramificacin en estas plantas, puede sugerirse que la 6-SFT es ms activa en la sntesis de

154

graminanos y fructanos ramificados que en la formacin de 6-Kes y sus productos de

polimerizacin. En especies de Lolium, para explicar la sntesis preferente de levanoneoseries
sobre la escasa generacin de fructanos ramificados, se propone que la 6-SFT tiene menor
afinidad al uso de 1-Kes (para la sntesis de bifurcosa) que la afinidad de 6G-FFT a este mismo
sustrato (en la sntesis de 6G-Kes) (Pavis et al., 2001b). En plantas de agave y dasylirion, la
afinidad de la 6-SFT pudiese tambin ser diferencial, presentando mayor afinidad por los IOS
como sustratos en la formacin de fructanos ramificados que por el uso de Suc y 6-Kes en la
sntesis respectiva de 6-Kes y levanos superiores.

2.2.2. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO ANINICO

Las protenas del extracto crudo se aplicaron a una columna de intercambio aninico (Mono Q).
Las protenas sin interaccin con la resina, fueron recuperadas en la fraccin Q0 (Figura 49). Las
protenas con interaccin fueron eluidas con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M. A pesar de que este
gradiente fue ms amplio que el usado en la estrategia I (0 a 600 mM), las fracciones no pudieron
resolverse en picos bien definidos, tal vez el volumen del gradiente no fue suficiente. Siete
fracciones (Q1 a Q7) fueron colectadas como se muestra en la Figura 49 y utilizadas en
bioensayos enzimticos con Suc o 1-Kes. La Tabla 21 indica los productos formados en las
distintas fracciones y los compara con las cuatro especies estudiadas (At-J, Aa-S, Ap-O y Dsp-C).
i) Fraccin Q0
La Figura 50 muestra las actividades hidrolticas encontradas en la fraccin Q0. Cuando estas
protenas fueron ensayadas con Suc 200 mM, se observ la produccin de Glc y Fru y una
pequea cantidad de 1-Kes. La FEH no hidroliza Suc (De Connick et al., 2005), por lo que estos
resultados indican la presencia de Inv, que adems de hidrolizar Suc (G-F G + F), en un
exceso de este sustrato es capaz de transferir unidades de Fru de una Suc donadora a otra
aceptora, formando las kestotriosas (G-F + G-F GFF + G). La presencia de FEH en la fraccin
Q0 fue evidente al utilizar 1-Kes como sustrato, donde hubo produccin importante de Suc y Fru
principalmente (GFF GF + F). Cuando esta misma fraccin fue ensayada con fructanos de
agave al 1%, se observ una generacin importante de Fru, probablemente a partir de la hidrlisis
de los fructanos superiores, cuya abundancia se vio disminuida. Cantidades casi equimolares de
Fru y Glc, indican que la Inv tambin fue importante en la actividad hidroltica presente en esta
fraccin.

155

ii) PROBABLES ISOFORMAS DE 1-SST

La Figura 51 muestra el patrn cromatogrfico de los ensayos enzimticos de cada fraccin Q.
Cabe destacar la alta produccin de Glc y poca generacin de Fru en todas las fracciones, cuando
se utiliza Suc como sustrato. Esto indica la presencia de la 1-SST con una activa utilizacin de
esta molcula como fructosil-donador (G-F + G-F GFF + G). La constante presencia de esta
actividad en las tres fracciones aqu descritas, sugiere la existencia de isoenzimas para la 1-SST,
como se discuti anteriormente en la seccin 2.1.3. Aunque se desconoce la significancia
fisiolgica de isoformas de las enzimas 1-SST, se han evidenciado dos formas en cebada y cinco
isoenzimas en alcachofa Jerusalem (Lscher et al., 1996 y 2000a), con diferentes propiedades
electroforticas y patrones de glicosilacin.
iii) Fraccin Q1
En la fraccin Q1 es posible detectar varias actividades enzimticas: enzimas capaces de utilizar
Suc y enzimas con actividades polimerizantes. La formacin importante de 1-Kes a partir de Suc,
indica la presencia de la 1-SST; sin embargo tambin se identific tentativamente a la 6-Kes y

Figura 49. Cromatografa de intercambio aninico. El extracto crudo (12 mL) fue cargado a la
resina Mono Q (45 mL), lavado con 2.5 vol. columna con Bis-Tris HCl 15 mM (pH 7.0) y eluido 100
mL de un gradiente lineal de NaCl (0-1M).

156

Figura 50. Actividades hidrolticas de la fraccin Q0. La nomenclatura de los picos es de

acuerdo a Ernst et al. (1998). En el cromatograma inferior se hace una comparacin de los
fructanos control (lnea negra) sin extracto y fructanos en presencia de la fraccin Q0 (lnea azul).
La nomenclatura de los picos es como se indica en la Figura 48.
bifurcosa (BF), aunque en cantidades muy inferiores; por lo que la 6-SFT, enzima que tambin
utiliza Suc como donador, debe estar presente y quiz es responsable de alguna reaccin de
polimerizacin. En esta fraccin se encontr enriquecida la actividad 6G-FFT, pues la formacin
de neofructanos (6G-Kes, 1&6G- y 1,6G-kestotetraosa) fue superior incluso a la serie inulina.
Usando 1-Kes 50 mM como sustrato, se observ la sntesis de fructosil-nistosa (I5) y
probablemente otros IOS superiores; sin embargo, el producto principal en esta reaccin fue la
6G-Kes. Esto de nuevo, sugiere la presencia de la 1-FFT y 6G-FFT en la misma fraccin y la
competencia de ambas enzimas por el sustrato, donde al parecer la 6G-FFT tiene mayor afinidad.
En la caracterizacin de la 6G-FFT de cebolla y Lolium perenne, se sugiere que esta enzima
sintetiza neofructanos e inulina, a partir de la 1-Kes (Ritsema et al., 2003; Lasseur et al., 2006).

157

Figura 51. Perfil cromatogrfico (HPAEC-PAD) de productos del ensayo enzimtico de las
fracciones de intercambio aninico de A. potatorum. La nomenclatura de los picos es como se
indica en la Figura 48; BF, bifurcosa. Tiempo de reaccin, 24 h.
Hecho contrario se ha demostrado en esprrago, donde las evidencias indican que estas
actividades se encuentran en enzimas independientes y altamente especficas (Ueno et al., 2005).
Al igual que el gnero Allium y Asparagus, el gnero Agave pertenece al orden Asparagales, por lo
que ambas posibilidades son factibles en la familia Agavaceae. Esto es, los productos de
polimerizacin observados en la fraccin Q1 (Figura 50) pueden ser debidos a la existencia de una
6G-FFT con ambas actividades, o a la presencia de dos actividades independientes y especficas.
iv) Fraccin Q2
El producto principal de la fraccin Q2 fue la 1-Kes cuando se us Suc como sustrato, habindose
formado tambin una cantidad significativa de 6G-Kes como nico producto identificable de la 6G-

158

FFT (Figura 51). La deteccin de 6-Kes y bifurcosa, sugiere adems la presencia de la 6-SFT.
Igualmente, se detect un pequeo pico correspondiente a la Nys; seguramente dada por la
presencia de la 1-SST, que utiliza Suc para formar 1-Kes y posteriormente Nys. A pesar de haber
detectado actividad de Inv en la fraccin Q0 (Figura 51), no se puede descartar su presencia en
esta fraccin; pues en concentraciones considerables de Suc, esta enzima sintetiza los tres DP3
observados, esto es, 1-Kes, 6-Kes y 6G-Kes (Km de actividad transferasa de 220 a 300 mM). Sin
embargo, en Inv de Saccharomyces cerevisiae y de achicoria, bajo tales condiciones, el producto
favorecido de la Inv es la 6-Kes (Cairns y Ashton, 1991; Van den Ende y Van Laere, 1993),
compuesto que es sintetizado solo en menor cantidad en la fraccin Q2 (Figura 51).
Cuando esta fraccin fue ensayada con 1-Kes, hubo sntesis de los neofructanos, aunque en esta
ocasin la Nys fue el FOS predominante. Estos resultados dan una idea de que las actividades
6G-FFT y 1-FFT pudiesen estar en enzimas distintas. Esto es, en las fracciones Q1 y Q2 se
evidencia la presencia de ambas actividades; sin embargo, stas presentan comportamientos
distintos bajo las mismas condiciones de reaccin. Seguramente, estas fracciones contienen ms
de una actividad, pero las actividades especficas estn enriquecidas en cada una de dichas
fracciones protenicas. La eficiencia en la competencia por el sustrato tambin debe ser
influenciado por la concentracin enzimtica, de acuerdo a Van den Ende et al. (1996) que
establecen que el patrn de productos formados depende de la concentracin de las enzimas
presentes. Aunque es difcil saber las proporciones de ambas actividades en cada una de las
fracciones, si en la Q2 hay un enriquecimiento de la 1-FFT, an es evidente la mayor afinidad de la
6G-FFT por la 1-Kes, que aunque en concentraciones inferiores, sintetiza cantidades
considerables de neofructanos.
v) Fraccin Q3
Las fracciones Q3 a Q7 presentaron el mismo comportamiento, por lo que nicamente se muestra
el patrn de fructanos obtenidos con Q3 (Figura 51). En presencia de Suc se observ poca
actividad, hubo sntesis de 1-Kes aunque en menor cantidad comparada a las fracciones
anteriores. La Nys tambin se gener en poca abundancia. El uso de Suc como sustrato indica
actividad de 1-SST; sin embargo, la enzima debe estar en una concentracin mucho menor. Cabe
resaltar que en estas fracciones no se detect 6-Kes y bifurcosa, por lo que la 6-SFT no debe
estar aqu presente. El bioensayo con 1-Kes evidenci una importante actividad de 1-FFT, pues el
producto principal fue Nys, adems de la formacin de otros IOS. Solo pequeas cantidades de

159

neofructanos fueron sintetizados en esta reaccin, indicando remanentes de actividad 6G-FFT.

Esto adems, refuerza la idea de actividades independientes de 6G-FFT y 1-FFT.

2.2.3. CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

Cada una de las fracciones Q, fueron cargadas a una columna de concanavalina A. Las fracciones
eluidas con -metil-manopiransido provenientes de Q1 y Q2 fueron denominadas ConA-1 y
ConA-2, respectivamente. Las fracciones Q3 a Q7, que presentaron actividades enzimticas
similares, se juntaron en una sola fraccin, se cargaron en la resina de concanavalina A y la
fraccin eluida se denomin ConA-3. La Figura 52 muestra los productos enzimticos obtenidos
cuando dichas fracciones fueron ensayadas con Suc o 1-Kes.

Figura 52. Productos de la accin enzimtica de las fracciones afines a concanavalina A.

Las fracciones obtenidas de intercambio aninico fueron cargadas en una columna de afinidad y
fueron eluidas con -metil-manopiransido. La nomenclatura de los picos es como se indica en la
Figura 48.
160

En la fraccin ConA-1, fue fcil la identificacin de la actividad 1-SST, pues en presencia de Suc,
hubo sntesis nicamente de 1-Kes y con 1-Kes como sustrato, el producto formado fue Nys. En la
fraccin ConA-2, es evidente la participacin de la 1-SST en la sntesis de 1-Kes; sin embargo, en
esta ocasin hubo una sntesis significativa de Nys, probablemente por la presencia de 1-FFT.
Cuando esta fraccin fue ensayada con 1-Kes, hubo actividad polimerizante y sntesis de FOS
hasta DP6. Hubo formacin de una cantidad significativa de Nys, siendo predominantes los
neofructanos, indicando la participacin de la 6G-FFT. Finalmente, en la fraccin ConA-3 se
descarta la presencia de la 1-SST o 6-SFT, pues las actividades enzimticas contenidas en dicha
fraccin no utilizaron Suc como fructosil-donador y no hubo sntesis de productos. Por otra parte,
esta fraccin en presencia de 1-Kes hubo una marcada actividad polimerizante con la sntesis de
fructanos hasta DP10; el patrn de fructanos obtenidos semeja a los encontrados in planta (Figura
34). Aunque los neofructanos fueron sintetizados en este extracto, la abundancia de IOS
(identificados nistosa Nys y fructosil-nistosa I5) fue notablemente mayor que en las fracciones
anteriores, evidenciando la participacin de una actividad 1-FFT. Al igual que lo observado en la
cromatografa de intercambio aninico, un anlisis de los productos de ConA-2 y -3, abre la
posibilidad de que las actividades 6G-FFT y 1-FFT co-eluyan o la presencia de ambas actividades
en una sola enzima. Como se explica en la seccin anterior, la primera opcin puede ser la mas
viable; sin embargo, tampoco se descarta la presencia de algn cofactor o condicin presente en
la fraccin ConA-3 que modifique el comportamiento de la enzima hacia una mayor afinidad por la
1-Kes y preferente sntesis de IOS.

2.2.4. ACTIVIDADES FRUCTOSILTRANSFERASAS IDENTIFICADAS EN AGAVES Y

DASYLIRION
A partir del anlisis estructural de los fructanos almacenados en los tallos de agave y dasylirion, y
de las actividades identificadas en estas mismas especies, es posible deducir las FT involucradas
en el metabolismo de fructanos en estas plantas. En la Figura 53 se muestra un modelo de una va
metablica probablemente disponible en estas especies.
Al igual que lo reportado en otras plantas, la acumulacin de Suc en la vacuola debe ser el factor
que induce la sntesis de las kestotriosas 1-Kes y 6-Kes por parte de la 1-SST y 6-SFT,
respectivamente. Sin embargo, las propiedades cinticas de estas enzimas deben ser diferentes,
pues la preferente sntesis de 1-Kes sobre la 6-Kes indica que la 1-SST es ms activa usando Suc

161

como sustrato. La 6-SFT probablemente presenta mayor actividad en la generacin de molculas

ramificadas, usando inulinas o neofructanos como sustratos.
La 1-Kes debe ser el metabolito a partir del cual se sintetizan los neofructanos por accin de la
6G-FFT, molculas de inulina a travs de la 1-FFT o fructanos ramificados cuando acta la 6-SFT.
El que se siga preferentemente una va metablica en la sntesis de un tipo estructural especfico,
puede depender de factores como concentracin umbral de sustratos, concentracin y
propiedades cinticas de cada una de las enzimas involucradas y, muy probablemente, de
condiciones climticas y ontognicas, como determinantes en la induccin de los genes de estas
enzimas.

Figura 53. Modelo propuesto para la biosntesis de fructanos en Agave y Dasylirion.

162

3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS CODIFICANTES DE ENZIMAS DEL

METABOLISMO DE FRUCTANOS DE AGAVE Y SU EXPRESIN EN Pichia pastoris

3.1. EXTRACCIN DE CIDO RIBONUCLEICO (ARN)

La calidad del material genmico extrado, influye determinantemente en el xito del aislamiento
de secuencias codificadoras; por lo tanto, se ensayaron distintos mtodos de extraccin de ARN
ptimo para agaves, con un tallo especialmente fibroso y alto contenido de carbohidratos. En la
Figura 54 se compara el ARN de At-G extrado con distintas metodologas. En la determinacin de
la integridad y cuantificacin del ARN, los electroferogramas son ms sensibles y precisos que los
geles de agarosa. Los dos picos que se muestran en los electroferogramas corresponden a los
ARN ribosomales 28S y 18S, en una relacin 1:1 para el caso del mtodo de precipitacin con LiCl
y de 1:2 para el mtodo de trizol. El ARN extrado con este ltimo mtodo, muestra un poco de
degradacin, visible como un pequeo pico al inicio del espectro. Esto mismo tambin fue evidente
en el gel de agarosa. La conversin de los picos en el electroferograma a bandas de un gel de
agarosa, se muestra en el panel C de la Figura 54. En la Figura 54D se muestra un gel de agarosa
correspondiente al ARN extrado con los mtodos de precipitacin de LiCl y Trizol
El mtodo de eleccin fue el de Trizol, pues la degradacin del ARN es mnima y es, adems, una
metodologa rpida, sencilla y principalmente de mejores rendimientos (1.15 g/L de Trizol vs
0.15 g/L de precipitacin con LiCl).

3.2.

AMPLIFICACIN

DE

FRAGMENTOS

DE

CIDO

DESOXIRIBONUCLEICO

COMPLEMENTARIO (ADNc) A TRAVS DE LA REACCIN EN CADENA DE LA

POLIMERASA (PCR)
Una concentracin de ARN de 0.25 g/L de At-G fue utilizada para la sntesis de la primera
cadena de ADN complementario (ADNc), y sta ltima se utiliz en la amplificacin de fragmentos,
a travs de una reaccin de PCR usando tres diferentes combinaciones de oligonucletidos
iniciadores. En la Figura 55A se muestran las bandas de los fragmentos amplificados con los
oligonucletidos AtFT1 y AtFT2 (Tabla 14, Materiales y Mtodos). Se observ una banda
prominente de 450 pb, de acuerdo al tamao aproximado de 430 pb esperado segn el
alineamiento mostrado en la Figura 27 (3.1.5. Materiales y Mtodos). Se observa sin embargo, una
banda importante de 1300 pb, indicando una baja especificidad de esta combinacin de

163

oligonucletidos. La combinacin de oligonucletidos AtFT3 y AtFT4 produjo bandas de

aproximadamente 480 pb (Figura 55B); mientras que la combinacin de oligonucletidos AtFT1 y
AtFT4 gener los fragmentos de 610 pb (Figura 55C). Cepas de E. coli

DH5 fueron

transformadas con el vector pGEM-T Easy conteniendo cada uno de los fragmentos amplificados.
Los plsmidos fueron purificados y despus de la confirmacin de la presencia del inserto en el
vector por anlisis de restriccin (Figura 56), varias bandas fueron secuenciadas.

Figura 54. Extraccin de ARN. A) y B) electroferogramas de ARN extrado con el mtodo de

precipitacin con LiCl y de Trizol, respectivamente; C) conversin de los electroferogramas a un
gel virtual; D) visualizacin de bandas de ARN en un gel de agarosa. M, marcadores de peso
molecular; A1 a A4, diferentes muestras de ARN extradas con el mtodo de precipitacin con
LiCl; B1 a B5, muestras extradas con trizol; C1 y C2, ARN extrados con el kit RNAeasy Plant
Mini en presencia de hidrocloruro de guanidina e isotiocianato de guanidina como agentes
caotrpicos, respectivamente.

164

Figura 55. Amplificacin de fragmentos con oligonucletidos degenerados. Se utilizaron tres

combinaciones de oligonucletidos segn se indica. Para la secuencia de los oligos, ver Tabla 14
(Materiales y Mtodos).
Las colonias blancas obtenidas con la combinacin de AtFT1 y AtFT2 no presentaron crecimiento
cuando se incubaron en medio lquido LB con antibitico, o si crecieron, el anlisis de restriccin
mostr la presencia de vectores vacos.

3.3. IDENTIDAD DE LOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS

La secuencia de los fragmentos amplificados fue analizada y comparada en el banco de datos
disponibles en la red (www.ncbi.nhl.gov). Tres de estas secuencias presentaron alta identidad con
enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos. La secuencia de sus ADNc y los
aminocidos resultantes de su traduccin se muestran en el Apndice D. En la Tabla 23 se
enlistan las secuencias reportadas de enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos y que
fueron utilizadas a lo largo de este trabajo para la comparacin y caracterizacin de nuestras
secuencias. Los fragmentos aislados fueron alineados con las secuencias protenicas de la Tabla

165

Figura 56. Anlisis de restriccin de productos amplificados con oligonucletidos

degenerados. Los plsmidos pGEM-T Easy que contienen los fragmentos amplificados fueron
incubados 1.5 h a 37 C con la enzima Eco RI. Los nmeros en los carriles indican la colonia a
partir de la cual los plsmidos fueron purificados. Las colonias 1, 2, 7, 8 son transformantes con el
inserto amplificado a partir de la combinacin de oligonucletidos AtFT1 y AtFT4; las colonias 5 y 6
fueron transformadas con el producto de amplificacin de AtFT3 y AtFT4. M, marcador en pb; el
carril C es el control negativo (plsmido 6 sin enzima). El vector pGEM-T Easy tiene un tamao de
3015 pb.
23. El dendograma resultante se muestra en la Figura 57, donde se observa que las FT de
monocotiledneas se agrupan aparte de las dicotiledneas, teniendo ms homologa las enzimas
con la misma funcin; es decir, las 6-SFT agrupan entre ellas, mientras que las 1-FFT caen en el
mismo grupo. Esto no es el caso para las FT e Inv-V del orden Asparagales, donde las Inv-V, 1SST y 6G-FFT se agrupan entre ellas. Una de las secuencias amplificadas de A. tequilana se
agrup con la Inv-V de maz (42.4%), de esprrago (73.6%) y de cebolla (99.1%), con la que
present la mayor homologa, por lo que a esta secuencia se le denomin At-InvV. Otra secuencia,
agrup con las 6G-FFT de esprrago (64.3%) y cebolla (62.4%) y fue denominada At-FT.
Finalmente, la tercera secuencia present una homologa de ~70% con CWI de cultivos como
arroz, maz, papa, zanahoria y jitomate; su homologa con las FEH presentan un rango de 58 al
65% y una homologa todava inferior se observ con algunas FT como 6-SFT de Poa secunda
(43%) y 6G-FFT de cebolla (42%). Esta secuencia fue denominada At-FEH.
Van den Ende et al., (2002) discuten el origen polifiltico de las Inv-V y FT a partir de una Inv
ancestral. De acuerdo a estos autores, una repetida duplicacin de esta Inv debi dar origen, de
manera independiente, a tres tipos de enzimas vacuolares: i) Inv-V de dicotiledneas, ii) FT de
dicotiledneas e iii) Inv-V y FT de monocotiledneas. Una Inv poco evolucionada pudo haber dado
origen a las FT antes de la divergencia de mono- y di-cotiledneas, que posteriormente evolucion
a las FT de dicotiledneas; esto justifica el agrupamiento de FT de dicotiledneas con Inv-V de
166

Tabla 23. Secuencias de enzimas relacionadas con el metabolismo de fructanos.

Enzima

Especie

pI

No. aminocidos

1-SST
1-SST
1-SST
1-SST
1-SST
1-SST
1-SST
1-SST
1-SST
6-SFT
6-SFT
6-SFT
6-SFT
6-SFT
6-SFT
1-FFT
1-FFT
1-FFT
1-FFT
1-FFT
1-FFT
1-FFT
1-FFT
1-FFT
6G-FFT
6G-FFT
6G-FFT
Inv
Inv
Inv
Inv
Inv
1-FEH I
1-FEH IIa
1-FEH IIb
1-FEH
1-FEH
1-FEH
6-FEH
1-FEH
6-KEH
6-FEH
CWI
CWI
CWI

Cichorium intybus
Taraxacum officinale
Helianthus tuberosus
Cynara scolymus
Allium cepa
Allium sativum
Festuca arundinacea
Lolium perenne
Triticum aestivum
Agropyron cristatum
Poa secunda
Lolium temulentum
Lolium perenne
Hordeum vulgare
Triticum aestivum
Cichorium intybus
Helianthus tuberosus
Cynara scolymus
Echinops ritro
Viguiera discolor
Lolium perenne
Lolium perenne
Triticum aestivum
Triticum aestivum
Allium cepa
Asparagus officinalis
Lolium perenne
Daucus carota
Allium cepa
Asparagus officinalis
Tulipa gesneriana
Zea mays
Cichorium intybus
Cichorium intybus
Cichorium intybus
Campanula rapunculoides
Triticum aestivum
Triticum aestivum
Triticum aestivum
Hordeum vulgare
Triticum aestivum
Beta vulgaris
Arabidopsis thaliana
Nicotiana tabacum
Triticum aestivum

D
D
D
D
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
D
D
D
D
D
M
M
M
M
M
M
M
D
M
M
M
M
D
D
D
D
D
D
D
M
M
D
D
D
M

5.12
4.97
5.03
5.36
5.03
5.43
4.74
5.20
4.91
5.64
5.45
4.95
5.11
5.18
5.24
4.97
4.95
4.95
4.92
4.77
5.57
4.85
4.91
4.99
5.46
5.56
4.84
5.06
4.94
4.88
5.05
4.96
7.06
5.32
5.32
5.13
4.9
4.9
7.06
5.06
4.92
4.98
9.10
9.12
9.00

640
632
630
637
623
623
654
653
662
623
618
625
623
625
616
617
615
615
608
609
670
648
648
644
612
610
645
661
690
662
628
670
568
581
581
578
597
596
598
599
587
606
589
580
584

No. Accesin
banco de datos
U81520
AJ250634
AJ009757
Y09662
CAA06838
AY098442
AJ297369
AY245431
AB159786
AF211253
AF192394
AJ532550
AF494041
X83233
AB029887
U84398
AJ009756
AJ009756
AJ811624
AJ811625
AY082350
AF481763
AB088409
AB088410
Y07838
AB084283
AF492836
X75352
AJ006067
AF002656
X95651
U16123
AJ242538
AJ295033
AJ295034
AJ509808
AJ516025
AJ508387
AM075205
AJ605333
AB089270
AJ508534
NM_112232
X81834
AF03042

Abreviatura
Ci-1SST
To-1SST
Ht-1SST
Cs-1SST
Ac-1SST
As-1-SST
Fa-1SST
Lp-1SST
Ta-1SST
Acr-6SFT
Ps-6SFT
Lt-6SFT
Lp-6SFT
Hv-6SFT
Ta-6SFT
Ci-1FFT
Ht-1FFT
Cs-1FFT
Er-1FFT
Vd-1FFT
Lp-1FFT2
Lp-1FFT1
Ta-1FFa
Ta-1FFTb
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Lp-6GFFT
Dc-Inv
Ac-Inv
Ao-Inv
Tg-Inv
Zm-Inv
Ci-1FEH I
Ci-1FEH IIa
Ci-1FEH IIb
Cr-1FEH
Ta-1FEHa
Ta-1FEHb
Ta-6FEH
Hv-1FEH
Ta-6KEH
Bv-6FEH
Ath-CWI
Nt-CWI
Ta-CWI

*D, dicotilednea; M, monocotilednea

167

Figura 57. Dendograma de secuencias alineadas de fructosiltransferasas. En negrillas y

subrayadas se resalta las secuencias amplificadas con los oligonucletidos degenerados usando
ADNc de A. tequilana como templado. Las abreviaciones son como se indica en la Tabla 23. El
nmero refiere a la distancia de similitud.
monocotiledneas que no sintetizan fructanos, como el arroz (Oriza sativa). Por otra parte, las InvV y FT de monocotiledneas pudieron haberse originado una vez que la Inv ancestral divergi en
mono- y dicotiledneas; esto explica por qu, por ejemplo, la 1-SST de cebolla tiene mayor
homologa con la Inv que le dio origen (Inv de cebolla) que a otras 1-SST de dicotiledneas. La
explicacin de esta evolucin puede ser clave para entender la diversidad enzimtica en
monocotiledneas comparada con un metabolismo ms simple en las especies dicotiledneas.
La secuencia At-FEH se agrup con las FEH y otras Inv-CW. Su identidad como FEH puede
verificarse por la presencia de dominios caractersticos para este tipo de enzimas. Casi al inicio de
la secuencia amplificada se identific el triplete WIN (Figura 58), caracterstico de las Inv cidas de
origen vegetal (Inv-V y Inv-CW) (Gallagher et al., 2004).

168

At-FEH

----YHFQPPRNWINDPNGPMYYNGIYHLFYQYNPYGAVWG----NIVWAHSVSTDMINWKALEPAIYPSKPFDVNGCWSGSATILPGN-KPAILYTGIDPQNRQVQNIAFPKNLSDPYLREW

117

At-Inv

------------------------------------------------WGHAVSRDLVHWTHLPLAMVPDQWYDINGVWTGSATILPDG-QIVMLYTGATNESVQVQNLAVPADQSDTLLLRW

77

At-FT

----YHFQPPRYFMSDPSGPVYYKGWYHFFYQHNAKAAFWG----NIAWGHAASRDLLNWVHLPLAVEPDHWYDIEGDWTGSVAVLPDG-RVIMLFTGGTGANELAQVVNLAVAADPSGPLLMEW 117

Ci-1SST

QRSAYHFQPDKNFISDPDGPMYHMGWYHLFYQYNPESAIWG----NITWGHSVSRDMINWFHLPFAMVPDHWYDIEGVMTGSATVLPNG-QIIMLYTGNAYDLSQLQCLAYAVNSSDPLLLEW

225

Ht-1SST

QRSTYHFQPDKNFISDPDGPMYHMGWYHLFYQYNPQSAIWG----NITWGHSVSKDMINWFHLPFAMVPDHWYDIEGVMTGSATVLPNG-QIIMLYSGNAYDLSQVQCLAYAVNSSDPLLIEW

213

Ac-1SST

QRTGYHFQPPNHFMADPNAAMYYKGWYHFFYQYNPNGSAWDY---SISWGHAVSKDMIHWLHLPVAMVPDHWYDSKGVWSGYATTLPDG-RIIVLYTGGTDQLVQVQNLAEPADPSDPLLIEW

203

Ta-1SST

QWQRTGYHFQPDKYYQNDPNGPVYYGGWYHFFYQYNPSGSVWEP-QIVWGHAVSKDLIHWRHLPPALVPDQWYDIKGVLTGSITVLPDG-KVILLYTGNTETFAQVTCLAEPADPSDPLLREW

242

Acr-6SFT

QRSSYHFQPAKNYMSDPDGLLYYGGWYHMFYQYNPVGTDWAD---GMAWGHAVSRNLVQWRTLPIAMKPDQWYDILGVLSGSVTVLPNG-TVIMLYTGATN-DWYVEATCLALPADPNDPLLRRW 207

Hv-6SFT

QRSGYHFQTAKNYMSDPNGLMYYRGWYHMFYQYNPVGTDWDD---GMEWGHAVSRNLVQWRTLPIAMVADQWYDILGVLSGSMTVLPNG-TVIMIYTGATN-ASAVEVQCIATPADPNDPLLRRW 206

Cs-1FFT

ERTAFHFQPAKNFIYDPNGPLFHMGWYHLFYQYNPYAPFWG----NMTWGHAVSKDMINWFELPIALAPTEWYDIEGVLSGSTTILPDG-RIFALYTGNTNDLEQLQCKAVPVNASDPLLVEW

208

Ci-1FFT

ERTAYHFQPAKNFIYDPNGPLFHMGWYHLFYQYNPYAPIWG----NMSWGHAVSKDMINWFELPVALTPTEWYDIEGVLSGSTTALPNG-QIFALYTGNANDFSQLQCKAVPLNTSDPLLLEW

209

Lp-1FFT

QRTGFHFQPEKNWMNDPNGPVYYKGWYHLFYQYNPEGAIWGN---KIAWGHAVSRDMLRWRHLPIAMFPDQWYDINGAWSGSATVLPDG-RIVMLYTGSTNASVQVQCLAFPSDPSDPLLTNW

245

Ac-6GFT

QRCGFHFRTVRNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNKDFAYWG----NITWGHAVSRDLINWQHLPVAVGPDHWYDISGVWTGSIIVVSED-RVVMLFTGGTKSFDQSINLAEAADPSDPLLLKW

190

Ao-6GFFT

QRAGFHFRTVKNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNPNYAYWG----DISWGHAVSRDLLNWFHLPVAVKPDRWYDIYGVWTGSITVMPDDGRVVMLYTGGTKEKYQIMSVAMAADPSDPLLVEW

187

Ac-Inv

QRTGFHFQPVKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPEGAVWG----NIAWGHAVSRDLVHWTHLPLAMVPDQWYDINGVWTGSATILPDG-QIVMLYTGATNESVQVQNLAVPADQSDTLLLRW

269

Ao-Inv

QRTGFHFQPEKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPNAAVWG----DIAWGHAVSKDLLSWRHLPLAMVPDRWYDINGVWTGSATILPDG-RIIMLYTGATNESVQVQNLAVPADLSDPLLLEW

237

Dc-Inv

QRTSFHFQPQENWMNDPNGPLFHMGWYHLFYQYNPDSAIWG----NITWGHAISRDLINWLHLPFAMQPDQWYDINGVWTGSATILPDG-KIVMLYTGDTDDLVQVQNLAYPANLSDPLLLDW

250

Zm-Inv

LRTGYHFQPPKNWINDPNAPMYYKGWYHFFYQYNPKGAVWG----NIVWAHSVSRDLINWVALEPALRPSIPGDRYGCWSGSATVLPDGGGPVIMYTGVDHPDINYQVQNVAYPKNVSDPLLREW 173

Ci-1FEH

YRTGFHFQPPKNWINDPNGPMYFNGVYHLFYQYNPYGPLWG----NISWGHSISYDLVNWFLLEPALSPKEPYDINGCLSGSATILPGP-RPIILYTGQDVNNSQVQNLAFPKNLSDPLLKEW

161

Cr-1FEH

YRTGYHFQPPQNWMNDPNGPMYYKGVYHFFYQYNPNGPLFGD---IMIWGHSVSYDLVNWIHIDPAIYPTDPADINSCFSGSATFLPGY-KPVMLYTGLDTEKRQVQNLAVPKNLSDPFLREW

166

Lp-FEH

YRTAYHFQPPKNWINDPNGPMYYNGIYHEFYQYNPNGSLWG----NIIWGHSVSTDLINWIPVEPAIERDIPSDISGCWTGSATIISGD-QPIIIYTG-ADKENR-QLQNIVLPKNKSDPYLREW 163

Hv-1&6FEH

YKTAFHFQPAKNWMNDPSGPMYFNGIYHEFYQYNLNGPIFG----DIVWGHSVSTDLVNWIGLEPALVRDTPSDIDGCWTGSVTILPGG-KPVIIYTG-GNIDQH-QTQNIAFPKNRSDPYLREW 183

Ta-6KEH

YRTAYHLQPPKNWINDPCGPMYYNGIYHEFYQYNPDGSFNPNTSYNIVWGHSVSTDLVNWITLEPAIEPDTPNDIKGCWSGSATIVSGD-QPVIIYTGVIDIEKH-QVQNIALPKNRSDPYLREW 177

Bv-6FEH

YRTAYHFQSPKNWMNDPNGPMIYKGIYHLFYQYYPYDPVWHT---EIVWGHSTSTDLINWTQQPIALSPSEPYDINGCWSGSITILPQN-KPVILYTGINNKNYQVQNLALPKNLSDPYLKEW

176

Ta-CWI

LRTGYHFQPPKHWINDPNGPMYYKGLYHLFYQYNPKGAVWG----NIIWAHSVSTDLVDWVALEPGIYPSKPFDINGCWSGSATILPNG-VPVIMYTGIEPKETPSAERRVPGQPLRPFLRKW

162

Zm-CWI

LRTGYHFQPPMNWINDPNAPLYYKGWYHLFYQYNPKGAVWG----NIVWAHSVSRDLINWVALEPAIYPSIPSDKYGCWSGSATILEDG-TPAILYTGIDRADINYQVQVLALPKDASDPLLREW 173
.. .

*.*: * ::: *

.:

:*

:::*

. :

. *

169

At-FEH

VKP-DYNPIIA---PV-NGINASAFRDPTTAWHGPD-GHWRLVIGSKRK----HRGMAIMYRSRDFINWIRAKHPLHSANG-TGMWECI----------

192

At-Inv

KKSE-ANPILV----PPPGIGDKDFRDPTTAWYEPSDDTWRIVIGSKDS---SHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILH-AVERVGMWECV----------

154

At-FT

IKYDA-NPVLH----PPRGIGLKDFRDPNPVWYNSLESTWYVVAGSKNDSL-SHTGIALVYTTKDFLSYTLLPGVLH-AVDIVGMWECV----------

198

Ci-1SST

KKYEG-NPILF----PPPGVGYKDFRDPSTLWMGP-DGEWRMVMGSKHNETI---GCALVYRTTNFTHFELNEEVLH-AVPHTGMWECVDLYPVSTTHT

326

Ht-1SST

KKYEG-NPVLL----PPPGVGYKDFRDPSTLWSGP-DGEYRMVMGSKHNETI---GCALIYHTTNFTHFELKEEVLH-AVPHTGMWECVDLYPVSTVHT

314

Ac-1SST

KKSNG-NPILM----PPPGVGPHDFRDPFPVWYNESDSTWHMLIGSKDD---NHYGTVLIYTTKDFETYTLLPDILHKTKDSVGMLECVDLYPVATTGN

310

Ta-1SST

VKHPA-NPVVF----PPPGIGMKDFRDPTTAWFDESDGTWRTIIGSKNDSD--HSGIVFSYKTKDFLSYELMPGYMYRGPKGTGEYECIDLYAVGGGRK

346

Acr-6SFT

TKHPA-NPIIW----SPPGIGTKDFRDPMTPWYDDSDHTWRTLFGSKDDHHGHHDGIAIMYKTKDFLNYELIPGILHRVEN-TGEWECIDFYPVGGGG-

307

Hv-6SFT

TKHPA-NPVIW----SPPGVGTKDFRDPMTAWYDESDETWRTLLGSKDDHDGHHDGIAMMYKTKDFLNYELIPGILHRVVR-TGEWECIDFYPVGRRS-- 302

Cs-1FFT

VRYDA-NPILY----APSGIGLTDYRDPSTVWTGP-DGKHRMIIGTKRNTT----GLVLVYHTTDFTNYVMLDEPLH-SVPNTDMWECVDLYPVSTTNDS 308

Ci-1FFT

VKYEN-NPILF----TPPGIGLKDYRDPSTVWTGP-DGKHRMIMGTKINRT----GLVLVYHTTDFTNYVMLEEPLH-SVPDTDMWECVDLYPVSTINDS- 309

Lp-1FFT

TKYEG-NPVLY----PPPHVGEKDFRDPTTAWYDGSDGMWRIVIGSKDNRR---AGMALTYKTKNFHDFELVPGVLHRVPA-TGMWECIDLYPVGGARGID 353

Ac-6GFT

IKYDN-NPILW----PPPGIVRDDFRDPNPIWYNASESTYHIVVGSKNDSL-QHTGIALVYLTKDFKKFDLLPTVLH-SVDKVGMWECVEVYPVATTGPL- 302

Ao-6GFFT

VKYDEVNPVLR----PPPGIGLTDFRDPNPIWYNTTDSTWQLVIGSKNDSL-QHTGIAMVYTTKDFINLTLLPGVLH-SVDHVGMWECVDLFPVASSGPL- 297

Ac-Inv

KKSE-ANPILV----PPPGIGDKDFRDPTTAWYEPSDDTWRIVIGSKDS---SHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILH-AVERVGMWECVDFYPVATADSSH 376

Ao-Inv

TKVDDANPILV----PPPGVGATDFRDPTTAWFEPSDSTWRIAIGTKDA---DHSGVALVYSTKDFLNYTLLPGTLH-TVKHVGMWECIDFYPIATSGAG- 344

Dc-Inv

IKYPD-NPVMF----PPPGIGSTDFRDPTTAWIGP-DGKWRITIGSKVNKT----GISLMYKTTDFITYELLDNLLH-AVPGTGMWECVDFYPVSVTVSN- 350

Zm-Inv

VKP-SHNPVIV---PE-GGINATQFRDPTTAWRGPGPEQWRLLVGSAAGSS-PPRGVAYVYRSRDFRRWRRVRRPLHSAP--TGMWECPDFYPVSKGGAPR 282

Ci-1FEH

IKW-SGNPLLT--PVDD--IKAGQFRDPSTAWMGPD-GKWRIVIGSEID----GHGTALLYRSTNGTKWIRSKKPLHFSSK-TGMWECPDFYPVTNGDKKG 261

Cr-1FEH

VKH-KANPIMT-TPEG---VKADDFRDPSTAWLGYD-GKWRVLVGSKKN----DLGVAYLYQSKDFVKWERFDYPLMSMME-TSTWECPDFFPVSVSSTNG 267

Lp-FEH

TKA-GNNPVIQ---PVGPGLNASQFRDPTTGWIGPD-GLWRIAVGAELN----GYGAALLYKSQDFLNWTRVDHPLYSSNA-SSMWECPDFFAVLPGNSGG 265

Hv-1_6FEH

IKA-ANNPVLR---PDEPGMNVIEFRDPTTGWIGPD-GHWRMAVGGELN----GYSAALLYKSEDFLNWTKVDHPPYSHNG-SNMWECPDFFAALPGNNGG 285

Ta-6KEH

TKA-GNNPVIQ---SGVPGLNSGQFRDPTTGWIGPD-GLWRIAVGAQLN----GYGAALLYKSEDFLNWTRVDHPLYSSNA-SIMLECLDFFAVLPGSNNG 280

Bv-6FEH

IKL-PQNPLMAGTPTNNNNINASSFRDPSTAWQLSD-GKWRVIVGTQQG----KRGLAVLFTSDDFVKWNNTGNPLHSTEG-NGIWECPDFFPVYVGKSLG 280

Ta-CWI

VKP-DYNPIIN---PD-HGINASAFRDPTTAWYGPD-GHWRLVVGSKEN----MRGIAVLYRSRDFRRWIKAHHSLHAG-L-TGMWECPDFYPVAVAGGRR 271

Zm-CWI

EKPEEYNPVAT---PAAGGINATQFRDPTTAWRHAG--HWRMLVGSVRG----ARGMALVYRSRDFRKWTKAKHPLHSAAL-TGMWECPDFFPVS-GPGLQ 275
:

**:

:*** . *

: : :

**

Figura 58. Alineamiento de los fragmentos amplificados de A. tequilana con enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos. Se
muestra nicamente el alineamiento en la regin donde el ADNc fue amplificado. *, indica que los residuos son idnticos; :, indica que hay
una sustitucin conservada y ., indica la existencia de un sustitucin semi-conservada. Las abreviaturas son como se indica en la Tabla 23.

170

En este triplete, muchas veces la isoleucina es intercambiada por metionina (WMN) y aunque no
hay evidencias de su importancia en la funcionalidad de este tipo de enzimas, tambin se
encuentra conservada en las FEH reportadas hasta ahora (Figura 58). Este dominio no se
encuentra en las FT vegetales, a excepcin de la 1-FFT de L. perenne (WMN). Se mantiene
conservada la presencia de un residuo aromtico (el triptfano puede ser sustituido por tirosina o
fenilalanina), cuya importancia en la estabilidad de la estructura enzimtica ha sido sugerida. La
presencia de este dominio es por lo tanto, importante para diferenciar las FT de actividades fructofuranosidasas. At-FT present en esta regin un triplete FMS, descartando su accin fructofuranosidasa; desafortunadamente, el fragmento At-Inv no fue amplificado en esta regin.
Un par de aminocidos ro arriba de este tripptido, se encuentra el denominado motivo fructosidasa, indicado en la Figura 58 en itlica y subrayado. Este dominio tambin es altamente
conservado en Inv como una secuencia NDPNG, pudiendo ser diferente o no en las FT y FEH. El
fragmento At-FEH presenta una secuencia NDPNG en esta regin, en tanto que el pentapptido
SDPSG, identificado en At-FT, nos permite afirmar que esta secuencia no corresponde a una Inv o
FEH, sino ms bien a una FT. Esta regin no fue amplificada en At-Inv, la cual present una mayor
homologa con las Inv.
Otro dominio que se considera importante, es el pentapptido WEC[P/V]D. Esta secuencia es til
para diferenciar InvV de CWI, pues en el primer caso, este motivo conserva la valina, que es
intercambiada por prolina en el caso de las CWI. Las secuencias At-FT y At-Inv conservan el
motivo WECV, presente adems en las FT, reforzando la idea de que este tipo de enzimas ha
evolucionado a partir de Inv-V ancestrales y no de CWI. Curiosamente, At-FEH present en este
sitio una secuencia WECI. Este cambio de isoleucina por valina tambin se observa en la 1-SST
de trigo, la 6-SFT de cebada y Agropyron crystatum e Inv-V de esprrago. El motivo WECI en AtFEH difiere al conservado WECPD de CWI y las dems FEH, comprometiendo quiz su identidad
como FEH. Sin embargo, la 6-KEH tambin presenta un motivo bastante dismil al resto de las fructofuranosidasas (LECLD). Goetz y Roitsch (1999), mostraron por mutagnesis sitio dirigida,
que un cambio de prolina por valina en la secuencia de CWI de Chenopodium rubrum
(Amaranthaceae), es suficiente para ajustar el pH ptimo de la actividad Inv a valores ms bsicos
(de 3.75 a 4.4), semejantes al pH ptimo de las Inv-V, as como la especificidad de su sustrato
(reduccin importante de hidrlisis de la rafinosa). Estos autores discuten que este efecto puede
ser explicado, por la influencia que estos residuos (prolina o valina) pueden tener en la orientacin

171

del grupo tiol en el residuo de cistena conservado en el dominio EC contiguo (marcado con una
flecha en la Figura 58), as como su valor de pKa, esencial para su funcin de catalizador cidobase en el ataque nucleoflico a la Suc. Esto abre la posibilidad de determinar el pH ptimo de
catlisis de la 6-KEH y comprobar si este dominio est involucrado en la alta especificidad de su
actividad.

3.4. AMPLIFICACIN DEL ADNc COMPLETO DE LA FRUCTOSILTRANSFERASA (atft)

3.4.1. AMPLIFICACIN DE LOS EXTREMOS TERMINAL 5 Y 3
En la Figura 59 se muestra la estrategia que se sigui para obtener el ADNc completo de atft. A
partir de la secuencia obtenida con los oligonucletidos degenerados, se disearon
oligonucletidos altamente especficos para amplificar cada uno de los extremos (5- y 3-AtRACE,
Tabla 14). Estas secuencias se marcan en negrillas en la Figura 59. Los ADNc reportados para
otras FT y FEH, tienen una longitud promedio ligeramente mayor a 2 kb, por lo que en atft se
espera un fragmento aproximado de 1300 a 1500 pb para el extremo 3 y de 600 a 800 pb para el
extremo 5.Para evitar la interferencia de ARNm truncados, el ARN total se digiri con fosfatasa
intestinal de carnero (CIP) para hidrolizar estos ARN incompletos. Despus de una purificacin, la
mezcla fue tratada con fosfatasa cida de tabaco (TAP), la cual hidroliza la estructura CAP en el
extremo 5 de los ARNm, dejando expuestos sus grupos fosfatos que se aprovecharon para el
acoplamiento de una secuencia adaptadora a travs de una ARN ligasa (Figura 59A, Tabla 14).
Por su parte, para el xito del aislamiento del extremo 3', se enriqueci la fraccin de los ARNm
con una resina de poli-A.
Figura 59. Amplificacin rpida de los extremos del ADNc de atft mediado por la RNA ligasa
(RACE). A) Estrategia seguida para la obtencin del ADNc completo: i) La secuencia peptdica
obtenida con los oligonucletidos degenerados; a partir de sta se disearon los oligonucletidos
gene especfico para amplificar los extremos 5' y 3' (OGE 5' y 3'); ii) Representacin del ADNc
completo; la caja rayada indica la posicin de la secuencia conocida y las cajas negras
representan las secuencias por amplificar; iii) Integracin de adaptadores a los extremos 5' y 3' del
ADNc. A partir de sus secuencias se usaron oligonucletidos para amplificar, junto con los OGE 5'
y 3', el ADNc completo. Las flechas continuas indican las secuencias de los oligonucletidos
externos y las discontinuas la de los oligonucletidos internos (PCR anidado). La regin comn
entre los extremos 5 y 3 contiene un sitio Bsh TI (5-ACCGGT-3) indicado con una punta de
flecha en i). B) Productos de amplificacin de los extremos 5' y 3' del ADNc atft. C) Anlisis de
restriccin de las construcciones p-GEM-T At3- y At5RACE que contienen los extremos
amplificados; los plsmidos fueron digeridos con Not I (5-GCGGCCGC-3). Los nmeros indican
el nmero de clon; C, digestin control (sin enzima); M, marcador.

172

173

En la transcripcin reversa de estos ARNm, se utiliz un templado de oligo-dT acoplado a una

secuencia adaptadora, de tal manera que el extremo 3 de los ADNc recin sintetizados,
contuviera una secuencia conocida. Los oligonucletidos 5'- y 3'-RACE, suministrados por la casa
comercial Ambion y diseados a partir de las secuencias de los adaptadores (Tabla 14), fueron
utilizados junto con los oligonucletidos gen-especficos 5- y 3-AtRACE, respectivamente, para
amplificar los extremos correspondientes. En la Figura 59B se muestran los productos de
amplificacin obtenidos por PCR. Para el extremo 3 se obtuvo una sola banda de
aproximadamente 1800 pb; mientras que para el extremo 5 se observ una banda prominente de
750 pb y dos bandas adicionales de menor tamao e intensidad, posiblemente debidas a una
amplificacin inespecfica.
Las bandas de tamao esperado fueron purificadas y ligadas, de manera independiente, en el
vector pGEM-T Easy. Las construcciones pGEM-T At3RACE y pGEM-T At5RACE as obtenidas,
se utilizaron para la transformacin de clulas competentes de E. coli DH5. Se hizo un escrutinio
de colonias blancas, purificacin de plsmidos y anlisis de restriccin para verificar la presencia
del inserto en el vector (Figura 59C). Los plsmidos que liberaron el inserto del tamao esperado
al ser digeridos con Not I (5-GCGGCCGC-3) fueron secuenciados. Estas nuevas secuencias
alinearon perfectamente con las provenientes de los oligonucletidos degenerados. En el extremo
3 se identific la regin poli-T (Apndice D). En la regin comn a ambas secuencias se encontr
un sitio de restriccin Bsh TI (5-ACCGGT-3), nico en la secuencia completa y no presente en
el vector. Este sitio fue aprovechado posteriormente para la ligacin de ambos fragmentos.

3.4.2. DETERMINACIN DE LA ORIENTACIN DE LOS INSERTOS EN EL VECTOR

La zona donde se empalman las secuencias At5- y At3-RACE comprende una regin de 168 pb,
donde se identific el sitio Bsh TI 15 pb ro arriba de esta zona de traslapamiento. Esta enzima
junto con Sal I (5-GTCGAC-3), que presenta un sitio de corte nico dentro de la zona de
clonacin mltiple del vector pGEM-T Easy, se utiliz para determinar la orientacin de los insertos
en el vector. En la Figura 60A y 60B se muestran las dos probables orientaciones para los insertos
At5- y At3-RACE, respectivamente. Si el inserto At5-RACE tuviera una orientacin 5 3, una
doble digestin con Sal I y Bsh TI producira un fragmento pequeo de 170 pb y uno mayor de
3595 pb; mientras que si la orientacin fuese inversa 5 3, la doble digestin dara un

174

Figura 60. Orientacin de los insertos At5- y At3-RACE en el vector pGEM-T Easy. A) y B)
Las dos posibles orientaciones de los insertos At5- y At3-RACE, respectivamente, se indican los
tamaos tericos (pb) de las bandas esperadas despus de una doble digestin con Sal I y Bsh TI;
C) Anlisis de restriccin de las clonas 20 y 12 con las construcciones pGEM-T At5-RACE y At3RACE, respectivamente. DD, doble digestin (Sal I/Bsh TI); SP6 y T7, son regiones promotoras en
el vector pGEM-T Easy.

175

fragmento de 600 pb y otro de 3165 pb. Respecto al fragmento At3-RACE, una orientacin 5
3 se evidenciara por la presencia de una banda de 1800 pb y otra de 3015 pb. En el caso
de que el inserto tuviese una orientacin inversa, 5 3, la digestin debera producir una banda
de 4785 pb y otra, no visible, de apenas 30 pb.
Distintas clonas fueron analizadas por restriccin. En la Figura 60C se muestran los productos de
digestin de las construcciones pGEM-T At5-RACE y -At3-RACE cuando stos fueron incubados
de manera independiente con la enzima Sal I, Bsh TI o ambas en una doble digestin. Cuando se
utiliz una sola de las enzimas, se observa al vector linealizado. La doble digestin en el vector
pGEM-T At5-RACE produjo una banda cercana a las 700 pb y otra superior a las 3000. En la
doble digestin de pGEM-T At3-RACE, se observ la presencia de una banda de 1700 pb y otra
superior a las 3000 pb. Con la anterior se concluye que el inserto At5-RACE tiene una orientacin
5 3, mientras que la orientacin del inserto At3-RACE es 5 3.

3.4.3. LIGACIN DEL ADNc COMPLETO DE atft

La estrategia que se sigui para la ligacin de los extremos At5- y At3-RACE se muestra en la
Figura 61. El plsmido pGEM-T At5-RACE fue digerido con las enzimas Not I y Bsh TI. Not I corta
en ambos extremos del vector y Bsh TI dentro del inserto; por lo que se obtuvieron tres bandas:
una banda 1) de 3015 pb correspondiente al vector, una banda 2) de 600 pb y una banda 3) ms
pequea de 150 pb. Estas dos ltimas, corresponden al inserto digerido y contienen en sus
extremos, terminaciones cohesivas con sitios Not I y Bsh TI en sentido 5 3 para la banda 2) y
en direccin opuesta para la secuencia 3).
Por otra parte, el plsmido pGEM-T At3-RACE fue digerido con las enzimas Bsh TI y Sal I. Esta
ltima enzima, corta solo en un extremo del vector, por lo que los productos obtenidos de esta
digestin fueron un fragmento 4) de 3030 pb, que corresponde al vector (3015 pb) ms un
pedazo del inserto y un fragmento 5) de 1800 pb. Ambos fragmentos tienen en sus extremos,
terminaciones cohesivas Bsh TI y Sal I (Figura 61).
Las bandas 2, 4 y 5 se eluyeron y purificaron del gel (Figura 62A). Posteriormente, la banda 4 se
digiri con la enzima Not I, para eliminar de esta manera, los 15 pb correspondientes al extremo
5de la zona de sobrelapamiento (banda 4*). Adems con esta digestin, el vector (banda 4*)
contiene ahora en sus extremos 5 y 3, las terminaciones Not I y Sal I, respectivamente. Este
vector se cort, eluy y purific. Finalmente, usando la enzima T4 ADN ligasa, el vector (banda
176

4*), con extremos Not I y Sal I, se lig con el fragmento 2 (terminacin Not I y Bsh TI) y con la
banda 5 (terminacin Sal I y Bsh TI). Esto hace posible una sola direccin en la ligacin y asegura
la correcta orientacin de los fragmentos At5- y At3-RACE junto con el vector pGEM-T Easy. El
plsmido pGEM- T atft, obtenido de esta manera, fue utilizado para la transformacin de clulas de
E. coli DH5.

Figura 61. Estrategia de clonacin para la obtencin del plsmido pGEM-T atft. Las bandas
2, 4 y 5, productos de digestin de los plsmidos pGEM-T At5-RACE y At3-RACE, fueron ligadas
para la obtencin de pGEM-T atft, que contiene el ADNc completo de la fructosiltransferasa
aislada de A. tequilana.

177

Figura 62. Digestin y anlisis de restriccin. A) Distintas clonas del plsmido pGEMT At5RACE digeridas con Not I y Bsh TI; clonas del plsmido pGEM-T At3RACE
digeridas con Sal I y Bsh TI; el vector pGEM-T que contiene 15 pb de la regin
empalmada (proveniente de la digestin de At3-RACE) digerido con Not I; B) Anlisis
de restriccin de distintas clonas del plsmido pGEM-T atft digeridas con Not I.
La Figura 62B muestra un anlisis de restriccin donde se evidencia la presencia de un inserto
mayor a 2 kb cuando el plsmido es digerido con la enzima Not I. Tres clonas fueron utilizadas
para la purificacin de plsmidos y confirmar su identidad por secuenciacin.

3.5. ANLISIS DE LA SECUENCIA atft

El ADNc atft presenta una longitud de 2226 pb, incluyendo las 96 y 222 bases en las regiones 5- y
3-UTR (untranslated region), respectivamente. En el Apndice D se muestra la secuencia y su
traduccin terica. Se observa la regin poli-A en el extremo 3 y los codones subrayados y en
negrilla, indican el inicio (ATG) y terminacin (TGA) de la traduccin. En la regin 5-UTR, en
negrillas, se indica un pequeo marco de lectura (ORF) que precede al ORF de atft. Esta
secuencia codifica un pptido de 22 aminocidos, cuya funcin es difcil de precisar.
La secuencia atft consta de un marco de lectura abierta de 1905 pb, que codifica para una
protena de 635 aminocidos, con una masa molecular terica de 69.9 kDa y un pI de 5.38. Los
aminocidos de naturaleza hidrofbica (alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptfano y
valina) predominan en un 37.63%, seguido de aminocidos polares (asparagina, cistena,
glutamina, tirosina, serina y treonina) con un 24.72%, aminocidos cidos (cidos asprtico y
glutmico) con el 11.33% y finalmente, aminocidos bsicos (lisina y arginina) con el 7.87%.
La relacin filogentica de AtFT con otras enzimas del metabolismo de fructanos se observa en el
rbol filogentico sin raz de la Figura 63; su anlisis evidencia tres principales ramificaciones. En

178

el grupo I y II se agrupan las FT de mono- y di-cotiledneas, respectivamente; mientras que en un

tercer grupo ms distante se observan las enzimas FEH. AtFT comparte an una mayor
homologa con las 6G-FFT de esprrago (69%) y cebolla (68%), quienes junto con las 1-SST de
cebolla y ajo (identidad del 65 y 68%, respectivamente) forman el subgrupo Ia, correspondiente a
las FT de miembros Asparagales. Varias Inv-V de monocotiledneas tambin presentan alta
identidad con AtFT: cebolla y esprrago (65%), tulipn (60%), adems de Inv-V de especies que
no sintetizan fructanos, tales como arroz y caa de azcar (60%).

Figura 63. rbol filogentico sin raz de enzimas del metabolismo de fructanos. Las
secuencias analizadas corresponden a protenas inmaduras traducidas a partir de su
ADNc. Las secuencias fueron alineadas con el programa clustal W
(http//www.ebi.ac.uk/clustalW) y el programa TREEVIEW fue utlizado para crear el
rbol filogentico.

179

AtFT es menos similar a la 6G-FFT de L. perenne (54%), quien junto con otras FT de Poaceae
conforman el subgrupo IIb. Las actividades 6-SFT se agruparon como Ic; la identidad de AtFt con
estas enzimas vara de 52 al 56%. Por otra parte, una menor homologa de AtFT fue observada
con 1-SST y 1-FFT de Asterales (49 to 54%) agrupados en las ramificaciones IIa y IIb,
respectivamente. Una relacin mucho ms distante es observada con las enzimas FEH; sus
homologas varan de 35 a 38% en monocotiledneas y de 38 a 40% para especies
dicotiledneas.

3.5.1. USO DE CODONES DEL ADNc DE atft

El contenido total de residuos de citosina (C) y guanina (G) en la regin codificadora de atft es de
52.23%. Aunque no est disponible an el genoma completo de Agave tequilana, y no hay muchas
secuencias aisladas de sta u otras especies de agave para fines de comparacin, en la Tabla 24
se muestra el uso de codones encontradas para el atft. Hay una tendencia al uso preferencial de
C, principalmente, y de G en la tercera posicin de los codones sobre adenina (A) o timina (T). La
excepcin es isoleucina con frecuencias equivalentes de T y C, adems de treonina, alanina, cido
asprtico y glicina que usan preferentemente T en la tercera posicin del triplete.

3.5.2. IDENTIFICACIN DE LA PROTENA MADURA

De acuerdo a algunos criterios propuestos (Von Heijne, 1986; Von Heijne y Abrahmsn, 1989; Jain
et al., 1994), el pptido seal de la mayora de las protenas recin sintetizadas, se caracteriza por
una regin-n de 5 a 8 aminocidos rica en residuos bsicos (lisina, arginina, histidina), seguido de
la regin-h de 8 a 12 aminocidos hidrofbicos (alanina, cistena, fenilalanina, isoleucina, leucina,
metionina, valina) y aminocidos propensos a la formacin de -hlices (cido asprtico, glicina,
asparagina, serina) y finalmente, la regin-c de una carcter ms polar, tpicamente de 6
aminocidos e involucrada en el sitio de reconocimiento y ruptura por parte de la peptidasa del
pptido seal (Jain et al., 1994). En la Figura 64 se sealan estas tres regiones identificadas en la
secuencia deducida para atft. La frontera de la regin-n se localiz en el residuo arginina-29, el
residuo positivo ms situado hacia el C-terminal (Von Heijne y Abrahmsn, 1989); mientras que la
regin-h cumple con las caractersticas para organismos eucariotes: presencia de aminocidos
hidrofbicos (alanina, fenilalanina, leucina y valina) y aminocidos formadores de -hlices
(serina), adems de presentar un carcter ms hidrofbico que en el caso de las bacterias por

180

Tabla 24. Uso de codones en el ADNc de atft. El nmero al lado del aminocido, indica el
nmero de veces que dicho aminocido es codificado por el codn correspondiente; en parntesis,
se indica su frecuencia en por ciento y en negrillas, se indica el total de veces que aparece este
residuo en la protena.
1era posicin
(extremo 5)

2a

Posicin

T
Phe 10 (50.0)
Phe 10 (50.0)
Phe 20
Leu 8 (12.5)
Leu 10 (15.6)

C
Ser 4 (9.1)
Ser 10 (22.7)
Ser 9 (20.5)
Ser 7 (15.9)

Leu 11 (17.2)
Leu 19 (29.7)

Pro 7 (20.0)
Pro 10 (28.6)

Leu 3 ( 4.7)
Leu 13 (20.3)
Leu 64
Ile 11 (40.7)
Ile 11 (40.7)

Pro 8 (22.8)
Pro 10 (28.6)
Pro 35
Thr 16 (39.0)
Thr 14 (34.1)

Ile 5 (18.5)
Ile 27
Met 9 (100)

Thr 5 (12.2)

Val 14 (25.0)
Val 18 (32.1)

Thr 6 (14.6)
Thr 41
Ala 15 (27.8)
Ala 12 (22.2)

Val 5 (8.9)
Val 19 (33.9)
Val 56

Ala 15 (27.8)
Ala 12 (22.2)
Ala 54

A
Tyr 12 (44.4)
Tyr 15 (55.6)
Tyr 27
Alto 0 (0)
Alto 0 (0)
His 8 (40.0)
His 12 (60.0)
His 20
Gln 6 (37.5)
Gln 10 (62.5)
Glc 16
Asn 11 (44.0)
Asn 14 (56.0)
Asn 25
Lys 12 (52.2)
Lys 11 (47.8)
Lys 23
Asp 23 (60.5)
Asp 15 (39.5)
Asp 38
Glu 15
Glu 19
Glu 34

3era posicin
(extremo 3)
Cys
Cys
Cys
Alto
Trp

G
2 (50.0)
2 (50.0)
4
1 (100)
18 (100)

T
C
A
G

Arg 2 (7.4)
Arg 2 (7.4)

T
C

Arg 4 (14.8)
Arg 4 (14.8)

A
G

Ser
Ser
Ser
Arg

4 (9.1)
10 (22.7)
44
4 (14.8)

T
C

Arg 11 (40.7)
Arg 27
Gly 24 (45.2)
Gly 14 (26.4)

Gly 7 (13.2)
Gly 8 (15.1)
Gly 53

A
G

T
C

ejemplo, con una proporcin de leucina de 40% (38.46%) y 10% de alanina (15.38%) (Von
Heijne y Abrahmsn, 1989).
Utilizando

el

programa

SignalP

(versin

3.0)

disponible

en

la

direccin

www.cbs.dtu.dk/services/SignalP (Bendtsen et al., 2004), para AtFT se predijo un pptido seal de

43 aminocidos; es decir, la peptidasa podra actuar entre los codones 43 y 44, en la secuencia
LLA-AAL (Figuras 64 y 65). La hidrofobicidad, longitud y presencia de aminocidos con carga
negativa (cidos glutmico y asprtico), sugieren que este pptido-seal dirige a la preproprotena
al retculo endoplsmico, donde debe ser eliminado por la peptidasa y la proprotena as generada,
debe sufrir modificaciones postraduccionales antes de dirigirse a la vacuola, siendo seguramente
la glicosilacin, una de las ms importantes.
Adicionalmente, se identific la secuencia W-XXX-[M/I/V]-LXWQ, reportada en In-V y FT de
monocotiledneas alrededor del inicio de la protena madura (secuencia subrayada en la Figura
181

Figura 64.- Prediccin del pptido seal en AtFT. Se utiliz el programa SignalP 3.0
(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) con dos mtodos algortmicos de prediccin: A) Redes
neurales, con el score S que indica la probabilidad de que el aminocido pertenezca a un pptido
seal o a una protena madura; score C, indica la probabilidad de que el aminocido sea el sitio
de corte por parte de la peptidasa; score Y, es un derivado de S y C, para dar mayor confiabilidad
a la prediccin. B) Modelo de Markov, calcula la probabilidad de la presencia o ausencia del
pptido seal en la secuencia, as como el sitio de corte, en base a las regiones n, h y c.

182

65; Van den Ende et al., 2002), aunque en esta regin, la AtFT muestra una sustitucin
conservada de triptfano por fenilalanina (aminocido 82) con una secuencia FTTKMLQWQ. La
larga secuencia despus del pptido seal y antes del inicio de la protena madura, es
caracterstica de Inv-V y FT (de 59 a 115 aminocidos) y sugiere la presencia de un pptido lder
que debe dirigir la protena hacia la vacuola (Van den Ende et al., 2002). Esto contrasta con el
pptido seal ms corto (20 a 30 aminocidos), reportado en CWI e incluso FEH cuya localizacin
vacuolar ha sido confirmada (Chalmers et al., 2005). En el alineamiento de AtFT con otras Inv-V y
FT, se observa una zona poco conservada despus de la regin correspondiente al pptido seal.
El pptido lder de las Inv-V y FT tambin es eliminado de la proprotena para dar lugar a la
protena madura con la funcionalidad requerida. De acuerdo al alineamiento con otras protenas
cuyo sitio de ruptura en la formacin de la protena madura ha sido reportado (Sprenger et al.,
1995; Van den Ende et al., 1996, 2000; Vijn et al., 1997; Kawakami y Yoshida, 2002; Lidgett et al.,
2002; Ueno et al., 2005), se estableci el inicio de la protena madura de AtFT a partir del
aminocido glicina-76 (Figura 65, Apndice D), es decir, la proprotena debe ser procesada en la
secuencia AGL-GEE para dar finalmente, una protena madura con una masa terica de 62 kDa y
un pI de 5.17; valores que coinciden con el peso molecular deducido a partir de las secuencias de
otras FT (60 a 69 kDa) (Wei y Chatterton, 2001; Gallagher et al., 2004; Nagaraj et al., 2004), y
diferente de los valores reportadas para los heterodmeros de las FT purificadadas con
subunidades alrededor de 50 y 20 kDa (Tabla 11). Estas diferencias sugieren que dichas enzimas
son traducidas a partir de un nico ARNm que debe ser posteriormente, procesado en dos
subunidades y glicosilado (Sprenger et al., 1995; Lscher et al., 1996).

Figura 65. Alineamiento de AtFT con Inv-V y FT. Las cajas negras indican las secuencias
consenso en la familia GH32; resaltado y subrayado, se muestran los sitios potenciales de
glicosilacin de AtFT; marcado con gris se indica el inicio de la subunidad larga de la protena
madura, y en el caso de Hv-6SFT, tambin el inicio de la subunidad pequea; los residuos
resaltados y en itlicas, sealan los posibles residuos importantes en la especificidad de las
distintas enzima, de acuerdo a Wei y Chatterton (2001). La flecha indica el sitio de procesamiento
del pptido seal de AtFT. Lnea de consenso, * aminocidos idnticos; :, sustituciones
conservadas; ., sustituciones semi-conservadas. Abreviaturas, como se indica en la Tabla 23.

183


AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT
Ac-Inv
Ao-Inv

-MGSQ---DVESARSLHAPIVG----------SPPPRRTLTLRSLSLALSVVAFLLAAALLLSKSGSVPNPNQGL
-MDAQ---DIESR----HPLIG----------ARPRRR--ALRSLSILLAAALLLGLVLFYANGTGSGTAVD------M---ATSLQ----APILG----------SRPPRR--TLRFLSFALFSALVLVVASFSSRKSESGSGLR---MGSH---GKPPLPYAYKPLPS---DAADGK----RTGCMRWSACATVLTASAMAVVVVGATLLAGLRMEQAVD-MGSHTMPGKPPLPYAYKPLLSGTTDEANGQ----RTGCTRRRVCAAMLTASAMVVVVVAAAFLARARVDKVVN-MASS------TTATTPLILRDETQICPQLAGSPVGRRLSMANVLSGILVFVLVICVLVAVIHDQSQQIMATN--MASS------TTAATPLILHND---------STPRRRLSLAKLLSGIPVAVLVIFALVTVILNQSQHTSATGNI
-MESR----SIPGAYAYEPLPHSS-DDAHGHDDRRSAGGVRWRACAAVLAASALVVFVVAST-LAGSRVDRVAVD
-MSSD---DLESPPSSYLPIPPSD---EFHDQPPPLRS--WLRLLSIPLALMFLLFLATFLSNLESPPSDSGLVS
MASSR---DVESPPTSYAPLPSDD---EQRPGSAPPRS--RLRLIAIAMPPILLLALAAALF-LSGSGAVTDLVA
:
:
:
.

61
52
49
64
69
66
59
68
66
66

AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT
Ac-Inv
Ao-Inv

--------------------------------------------------DAILAPLPQSGAGLGEE----DYPF
-------------------------------------------------------------PVRVDN----EFPW
-------------------------------------------------------------SGSVEP----EYAW
-----------------------------------------------------------------EEAAAGGFPW
-----------------------------------------------------------------EEAAGG-FPW
--------------------------------------------NHQGGDKPTSAATFTAPLLQVDLKRVPGKLE
--------------------------------------------DFHGGDKPSSDTTFTE-MVPEELKQVLIKLE
VAAMPALSETARSRGK----------------------------DAGVSEKTSGAADEMGFLGAGSGADADGFPW
DPVTFDVNPAVVRRGKDAGVSDKTSGVDSGFVLDPVAVDANSVVVHRGKDAGVSDKTSGVDSGLLKDSPLGPYPW
GPSP-DTMPEIVR-------------------------------TDRGVEEGVSSKSSGAGPGLLTSVSHGQYPW

82
62
59
73
78
97
90
115
141
109

AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT
Ac-Inv
Ao-Inv

TTKMLQWQHTGFHFQPPRYFMSDPSGPVYYKGWHHFFYQHNAKAAFWGN-IAWGHAASRDLLNWVHLPLAVEPDH
TNDMLAWQRCGFHFRTVRNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNKDFAYWGN-ITWGHAVSRDLINWQHLPVAVGPDH
TNQMLTWQRAGFHFRTVKNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNPNYAYWGD-ISWGHAVSRDLLNWFHLPVAVKPDR
SNEMLQWQRSGYHFQTAKNYMSDPNGLMYYRGWYHMFYQYNPVGTDWDDGMEWGHAVSRNLVQWRTLPIAMVADQ
SNEMLQWQRSSYHFQPAKNYMSDPDGLLYYGGWYHMFYQYNPVGTDWADGMAWGHAVSRNLVQWRTLPIAMKPDQ
SNADVEWQRSAYHFQPDKNFISDPDGPMYHMGWYHLFYQYNPESAIWGN-ITWGHSVSRDMINWFHLPFAMVPDH
SNAGVEWERSAYHFQPDKNFISDPDGPMYHMGWYHLFYQYNPESAIWGN-ITWGHSISRDMINWFHLPFAMVPDH
SNAMLQWQRTGFHFQPEMNWMNDPNGPVYYRGWYHLFYQYNPEGAVWGN-IAWGHAVSRDLVHWRHLPLAMVPDQ
TNQMLSWQRTGFHFQPVKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPEGAVWGN-IAWGHAVSRDLVHWTHLPLAMVPDQ
TNKMLSWQRTGFHFQPEKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPNAAVWGD-IAWGHAVSKDLLSWRHLPLAMVPDR
:. : *:: .:**:.
::.**.* :*: ****:***:*
: * : : ***: *:::: * **.*: .*:

156
136
136
148
153
171
163
189
215
183

AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT
Ac-Inv
Ao-Inv

WYDIEGDWTGSVAVLPDG-RVIMLFTGGTGANELAQVVNLAVAADPSDPLLMEWIKYDA-NPVLHPPRGIGLKDF
WYDISGVWTGSIIVVSED-RVVMLFTGGT--KSFDQSINLAEAADPSDPLLLKWIKYDN-NPILWPPPGIVRDDF
WYDIYGVWTGSITVMPDDGRVVMLYTGGT--KEKYQIMSVAMAADPSDPLLVEWVKYDEVNPVLRPPPGIGLTDF
WYDILGVLSGSMTVLPNG-TVIMIYTGAT-NASAVEVQCIATPADPNDPLLRRWTKHPA-NPVIWSPPGVGTKDF
WYDILGVLSGSVTVLPNG-TVIMLYTGAT-NDWYVEATCLALPADPNDPLLRRWTKHPA-NPIIWSPPGIGTKDF
WYDIEGVMTGSATVLPNG-QIIMLYTGNA--YDLSQLQCLAYAVNSSDPLLLEWKKYEG-NPILFPPPGVGYKDF
WYDIEGVMTGSATMLPNG-QIIMLYTGNA--YDLSQLQCLAYAVNSSDPLLLEWKKYEG-NPILFPPPGVGYKDF
WYDINGVWTGSATVFPDG-QIIMLYTGNA--YDLAQLQCLAYAVNSSDPLLLEWKKYEG-NPILFPPPGVGYKDF
WYDINGVWTGSATILPDG-QIVMLYTGAT--NESVQVQNLAVPADQSDTLLLRWKKSE-ANPILVPPPGIGDKDF
WYDINGVWTGSATILPDG-RIIMLYTGAT--NESVQVQNLAVPADLSDPLLLEWTKVDDANPILVPPPGVGATDF
**** * :** :..:. : *::** :.
:
:* . : .*.** .* *
**:: .* *:
**

229
207
206
220
225
242
234
260
286
255

AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT1
Lp-FFT2
Ac-Inv
Ao-Inv

RDPNPVWYNSSESTWYVVVGSKNDSL-SHTGIALVYTTKDFLSYTLLPGVLHAVDIVGMWECVDLYPVATAG-PL
RDPNPIWYNASESTYHIVVGSKNDSL-QHTGIALVYLTKDFKKFDLLPTVLHSVDKVGMWECVEVYPVATTG-PL
RDPNPIWYNTTDSTWQLVIGSKNDSL-QHTGIAMVYTTKDFINLTLLPGVLHSVDHVGMWECVDLFPVASSG-PL
RDPMTAWYDESDETWRTLLGSKDDHDGHHDGIAMMYKTKDFLNYELIPGILHRVVRTGEWECIDFYPVGRRS--RDPMTPWYDDSDHTWRTLFGSKDDHHGHHDGIAIMYKTKDFLNYELIPGILHRVENTGEWECIDFYPVGGGG--RDPSTLWMGP-DGEWRMVMGSKHN---ETIGCALVYRTTNFTHFELNEEVLHAVPHTGMWECVDLYPVSTTHTNG
RDPSTLWRGP-DGDWIMIMGSKHN---QTIGCALVYRTSNFTHFELSEEPLHAVPHTGMWECVDLYPVSTTHTNG
RDPTTAWFDESDQTWRTVIGSKDNNG--HAGIAMVYKTKDFLNYELIPGYLHRVDGTGMWECIDFYPVGGK---RDPTTAWFDESDQTWRTVIGSKDNNG--HAGIAMVYKTKDFLNYELIPGYLHRVDGTGMWECIDFYPVGGK---RDPTTAWYEPSDDTWRIVIGSKDS---SHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILHAVERVGMWECVDFYPVATADSSH
RDPTTAWFEPSDSTWRIAIGTKDA---DHSGVALVYSTKDFLNYTLLPGTLHTVKHVGMWECIDFYPIATSG-AG
*** . *
:: :
.*:*.
* *::* *.:*
*
** * .* ***::.:*:.

IV

II

III

v
302
280
279
292
297
313
305
329
329
358
326

184

AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT
Ac-Inv
Ao-Inv

VII
VIII
VGRALEN----SVPAGENVKHVLKAGLNDEWHDYYAIGTYDREANKWTPDDEIIDVGIGLRYDWGKFYASRTFYD
LHKAIDNFDVDRVLDRSTVKHVLKASMNDEWHDYYAIGTFDPIGNKWTPDDETVDVGIGLRYDWGKFYASRTFFD
IGRGLD----RSMMLADNVKHVLKASMNDEWHDYYAIGSYDVATHRWVPDDESVDVGIGMRIDWGKFYASRTFYD
------------SDNSSEMLHVLKASMDDERHDYYSLGTYDSAANTWTPIDPELDLGIGLRYDWGKFYASTSFYD
------------SENSSEVLHVLKASMDDERHDYYSLGTYDSAANIWTPIDPELDLGIGLRYDWGKFYASTSFYD
LDMK---------DNGPNVKYILKQSGDEDRHDWYAVGTFDPEKDKWYPDDPENDVGIGLRYDYGKFYASKTFYD
LDMM---------DNGPNVKYILKQSGDEDRHDWYAIGSFDPINDKWYPDDPENDVGIGLRYDYGKFYASKTFYD
--------------NGSEELYVIKESSDDDRHDWYTLGKYDAAANTFTAADPENDLGIGLRYDWGKFYATKTFYD
ANHGLDP----SARPSPAVKHVLKASMDDDRHDYYAIGTYDPAQNTWVPDDASVDVGIGLRYDWGKFYASKTFYD
ANRGLDP----SVRPSKLVKHVLKESSDDDRQDWYAIGTYDPDTNKWTPDDESLDVGIGLRYDLGKFYASKTFYD
.
:::* . ::: :*:*::*.:*
. : . *
*:***:* * *****: :*:*

373
355
350
355
360
379
371
390
429
397

AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT
Ac-Inv
Ao-Inv

PVKQRRVLWGYVGETDSREVDIRKGWASVEGLARTVLFDEKTGTNLLTWPVEEVESLRMT-SKNFSNVIISPGTT
PLKQRRIIWGYIGEVDSQKADIAKGWASLQGIPRSVLYDVKTGTNVLTWPIEEMEGLRMA-RKDFSGIKIKKGST
PVKERRVMWGYVGETDSGDADVAKGWASFQGIPRTVLFDVKTGTNVLTWPIEEVESLRMT-RKDFSDIVVNKGST
PAKNRRVLMGYVGEVDSKRADVVKGWASIQSVPRTVALDEKTRTNLLLWPVEEIETLRLN-ATELTDVTINTGSV
PAKKRRVLMGYVGEVDSKRADVVKGWASIQSVPRTIALDEKTRTNLLLWPVEEIETLRLN-ATELSDVTLNTGSL
QHQKRRVLWGYVGETDPPKSDLLKGWANILNIPRSVVLDTQTGTNLIQWPIEEVEKLRSTKYDEFKDVELRPGSL
QHKSRRVLWGYVGETDPPKDDLLKGWANMLNIPRTIVLDTVTGTNLIQWPIDEVENLRSKKYDEFKDVELRPGSI
PAKNRRVLWGWIGETDSERADVAKGWASLMSIPRTVELDEKTRTNLIQWPVEELETLRIK-STDLGGVTIDHGSV
HAKKRRILWSWIGETDSETADIAKGWASLQGVPRTVLLDVKTGSNLITWPVVEIESLRTR-PRDFSGITVDAGST
QEKKRRVLWGWIGESDSESADILKGWASLQGIPRTVLYDLRTGSNLITWPIEEVESLRSN-LHDFSGITIDKGST

447
429
424
429
434
454
401
464
503
471

:.**:: .::** *.

AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT
Ac-Inv
Ao-Inv

*: ****.. .:.*::

* :*:: **: *:* **

:: .: :

*:

VQL-DIGDANQLDIVAEFEIKKEELEAVIEA--DVTYNCSTSGGAATRGLLGPFGLLVLANED-LTEQTATYFYV
VELSDFGDAFQIDIEAEFTISKEALEATIEA--DVGYNCSSSGGAAIRGTLGPFGLLVLANQD-LTENTATYFYV
VEL-HVGDANQLDIEAEFEMDKDALETAIEA--DIGYNCSSSGGAVSRGVLGPFGLFVLANQD-LTELTATYFYV
IHI-PLRQGTQLDIEASFHLDASAVAALNEA--DVGYNCSSSGGAVNRGALGPFGLLVLAAGDRRGEQTAVYFYV
VHV-PLRQGTQPDIEATFHLDAAAVAALNEA--DVGYNCSSSGGAVNRGALGPFGLLVLAAGDRRGEKTAVYFYV
VPL-EIGTATQLDISATFEIDQKKLQSTLEA--DVLFNCTTSEGSVGRGVLGPFGIVVLADAN-RSEQLPVYFYI
IPL-EIGSATQLDIMATFEIDEKMLESTLEA--DVLFNCTTSEGSVGRGVLGPFGIVVLADAK-RSEQLPVYFYI
YPL-PLHRATQLDIEASFRIDTATVAALNEA--DVGYNCSTSGGSANRGALGPFGLLVLADG--KAEQTAVYFYV
FKL-DVGGAAQLDIEAEFKISSEELEAVKEA--DVSYNCSSSGGAAERGVLGPFGLLVLANQD-LTEQTATYFYV
FHL-DVHGAAQLDIEAEFKINEESLSAEAENGTGVMYNCSGGGGAAERGLLGPFGLLVLANSD-LTEQTAAYFYV
:

. * ** * * :.

: :

.: :**: . *:. ** *****:.***

518
501
495
501
506
525
517
534
574
485

..***:

AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT
Ac-Inv
Ao-Inv

GRGTDGSLQTHLCQDELRSSKAYNIVKRVVGHTVPVLAGEMLSLRILVDHSIVESYAQGGRASTTSRVYPTEAIY
SKGIDGSLITHFCQDETRSSKANDIVKRVVGGTVPVLDGETFAVRILVDHSVIESFAMGGRTSATSRAYPTEAIN
SRATDGSLHTHLCHDEMRSSKANDIVKRVVGGTFTVLDGELLSLRILVDHSIVESFAQGGRTSATSRVYPTEAIY
SRGLDGGLHTSFCQDELRSSRAKDVTKRVIGSTVPVLDGEALSMRVLVDHSIVQGFDMGGRTTMTSRVYPMES-Y
SRGLDGGLQTSFCQDELRSSRAKDVTKRVIGSTVPVLGGEAFSMRVLVDHSIVQGFAMGGRITMTSRVYPMEA-Y
AKDTDGTSKTYFCADESRSSTDKDVGKWVYGSSVPVLGGENYNMRLLVDHSIVEGFAQGGRTVVTSRVYPTKAIY
AKNTDGSSKTYFCADESRSSMDKSVGKWVYGDSVPVLEGEKHNMRLLVDHSIVEGFAQGGRTVVTSRVYPTKAIY
AKGLDGTLQTHFCHDESRSTLARDVVKRVVGYTVPVLDGEAFSVRVLVDHSIVESFAMGGRSTATSRVYPTEAIY
SRGMDGGLNTHFCQDEKRSSKASDIVKRIVGHSVPVLDGESFALRILVDHSIVESFAQGGRASATSRVYPTEAIY
SRGVDGELQTHFCQDEMRSSKANDIVKSVVGGTVPVLKGETLSLRILVDHSIVESFAQGGRASATSRVYPTEAIY
.: **
* :* ** **:
.: * : * :..** **
:*:*****:::.: ***
***.** ::

AtFT
Ac-6GFFT
Ao-6GFFT
Hv-6SFT
Acr-6SFT
Ci-1SST
To-1SST
Lp-1FFT
Ac-Inv
Ao-Inv

EGARVFLFNNATAATVIGKSVKIWHMNSTHDTICHYPSLKAQ-------SAARVFLFNNATGVDVIAESVKIWQMNSTYNDFYHF-------------ERARVFLFNNATGATITAKAVKVWQMNSTSNQYYPFTSSN---------QEARVYLFNNATGASVTAERLVVHEMDSAHNQLSNEDDGMYLHQVLESRH
QEAGVYLFNNATGASVTAERLVVHEMDSAHNQLSNEDAYMYVR------GAAKIFLFNNATGISVKVS-LKIWKMAEAQLDPFPLSGWSS--------GAAKLFLFNNATGISVKAS-LKIWKMAEAQLDPFPLSGWSS--------GAAGAYLFNNATGGSVTVEKLVVHEMDSSYNQIFMADDL----------NNARVFVFNNATGAKVTAQSLKVWHMSTAINEIYDPATSVM--------SSAKVFLFNNATGASITAQSLKIWHMNSTLSRPFDFNDGAQAQ------* ::*****. : . : : .* :

593
576
570
575
580
600
592
609
649
604

635
612
610
625
623
640
632
648
690
662

185

En la secuencia terica de AtFT, se identificaron seis sitios potenciales de glicosilacin (N-X-S/T,

donde X no es prolina) (Figura 65), valor que cae dentro del intervalo reportado de sitios de
glicosilacin presente en FT (de 5 a 9; Chalmers et al., 2005). La presencia de sitios de
glicosilacin coincide con la capacidad de estas protenas de ser retenidas en resinas de ConA.
Esta propiedad sugiere que estas enzimas deben ser procesadas en el retculo endoplsmico y es
una caracterstica de las enzimas vacuolares, por lo que adicionalmente al valor terico de su pI
(5.17), se sugiere que AtFT tiene una localizacin vacuolar, al igual que las dems FT y concuerda
con el pH para la actividad ptima de este tipo de enzimas.

3.5.3. GLICOSILHIDROLASA 32
La comparacin con la base de datos, tambin indic que AtFT pertenece a la familia 32 de las
glicosilhidrolasas (GH32), donde tambin se incluye algunas -fructofuranosidasas como
invertasas,

levanasas,

inulinasas

FT

de

vegetales

hongos

(http://afmb.cnrs-

mrs.fr/CAZY/families.html). Esto fue confirmado en el anlisis de alineamiento mostrado en la

Figura 65, donde se identificaron algunas secuencias consenso reportadas para la familia GH32
(Batista et al., 1999; Menndez et al., 2002; Ritsema et al., 2004).
La regin I corresponde a la secuencia conocida como caja de unin a Suc. Ritsema et al. (2004),
recientemente demostraron que esta regin influye en la determinacin del producto y no en la
especificidad de sustrato. Esta regin presenta el consenso HXX-[P/T/V]-XXXX-[A/I/L/M/V][A/C/G/N/S/Y]-[D/E]-P-[C/D/N/S]-[A/G] (Chalmers et al., 2005) con el motivo -fructosidasa
NDPNG, altamente conservado en Inv-V y 1-SST de Festuca arundinacea y ms variable en el
resto de las FT (Wei y Chatterton, 2001). En una FT dada, este pentapptido es ms homlogo a
una enzima de otra especie que codifica para la misma actividad enzimtica que a otra FT de la
misma especie pero con diferente actividad, mantenindose siempre invariable el presunto
nuclefilo cido asprtico en posicin adjunta a la prolina (Ritsema et al., 2005). La secuencia
SDPSG en AtFT, indica que el ADNc aislado codifica para una FT ms que para una Inv-V, y que
esta regin es ms homloga a los pentapptidos SDPDG de 1-SST de las Asterales, SDPNG
reportado en 6-SFT de las Poales o a la secuencia NDPSG observada en las 6G-FFT de las
Asparagales cebolla y esprrago (Figura 65). La naturaleza FT de AtFT, adems, se confirma con
la presencia de fenilalanina-102 en la regin I. En esta posicin, hay un residuo aromtico muy
conservado; en las Inv-V, ste siempre corresponde a triptfano, en tanto que en las FT es

186

fenilalanina o tirosina pero nunca triptfano (Ritsema et al., 2005). En esta misma regin es
posible localizar una serina que diferencia a las FT vegetales con las de otras fuentes (por
ejemplo, est ausente en las FT de bacterias y hongos; Rehm et al., 1990).
A travs del anlisis de la secuencia, adems es posible identificar el origen de las FT. Por
ejemplo, en la regin I se identifica una serina que diferencia a las FT vegetales con las de otras
fuentes (por ejemplo, est ausente en las FT de bacterias y hongos). Adems, el consenso
DXG_KFYA (regin VIII) es una regin altamente conservada, donde el guin indica un
aminocido faltante en FT vegetales y presente en algunas de otro origen (Rehm, 1998).
De manera interesante, en la posicin 116 (regin II) AtFT muestra un cambio conservado de
tirosina presente en la mayora de las FT por una histidina. Se identificaron, adems, los residuos
RDP y EC en las regiones IV y V, respectivamente. Estos residuos han sido sugeridos como clave
en la funcionalidad de las enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos. El tripptido RDP
est estrictamente conservado en todas las -fructofuranosidasas, incluyendo las FT bacterianas
pertenecientes a la familia GH68. El cido asprtico en este dominio, parece involucrado en el
enlace o ruptura de la Suc por parte de las levansucrasas bacterianas de Glucanacetobacter
diazotrophicus y Streptococcus salivarius (Menndez et al., 2002). En la misma regin referida, las
Inv-V vegetales muestran el consenso altamente conservado DFRDPTTAW y, de nuevo, este
consenso puede ser diferente en las FT (Batista et al., 1999). En AtFT esta caja consiste en la
secuencia DFRDPNP, consenso estrictamente conservado para las otras dos secuencias 6G-FFT
de Asparagales (Vijn et al., 1997; Ueno et al., 2005), pero diferente a la secuencia 6G-FFT de
Lolium perenne (Lasseur et al., 2006).
Wei y Chatterton (2001) mostraron un alineamiento mltiple de FT, Inv-V y CWI, indicando
aminocidos que pudiesen ser especficos para cada tipo de actividad enzimtica. Para cebolla, la
nica secuencia 6G-FFT reportada en ese momento, estos autores sugirieron los aminocidos
arginina-77, valina-79, lisina-104 y arginina-351 como especficos para dicha actividad (Figura 65).
La secuencia de esprrago posteriormente reportada (Ueno et al., 2005) mostr coincidencia con
la mayora de estos aminocidos (arginina-74, valina-76 y arginina-346), habiendo un cambio de
lisina por prolina-101. Con lo que respecta a la AtFT, estos aminocidos difieren casi por completo
(glutamina-97, prolina-99, alanina-124), coincidiendo nicamente en la arginina-369; mientras que
ninguna coincidencia con estos residuos es observada con la secuencia 6G-FFT de L. perenne
(Lasseur et al., 2006).

187

3.6. EXPRESIN HETERLOGA DE atft

La comparacin de las secuencias deducidas de ADNc involucrados en el metabolismo de
fructanos, junto con anlisis filogenticos, han permitido asignar con cierta confiabilidad una
funcin putativa a una secuencia. Sin embargo, dada la gran similitud que comparte esta familia de
protenas, puede resultar arriesgado inferir una funcin putativa solo en base a la homologa de la
secuencia de aminocidos, por lo que se vuelve necesario el anlisis de expresin del ADNc
aislado. Un sistema de expresin heterlogo, adems, ofrece la posibilidad de estudiar las
propiedades enzimticas de la protena, en un medio aislado de probables interferencias
endgenas, hecho invaluable en el caso de las FT donde esta demostrado el interferencia de sus
actividades.
Uno de los problemas en la expresin de los ADNc de las FT, es la presencia de Inv endgenas
en sistemas heterlogos como tabaco, papa y betabel, que compiten por la Suc como sustrato. La
mutante Inv- de Saccharomyces cerevisiae tambin ha sido utilizada; sin embargo, la actividad de
las FT expresadas en esta levadura resulta baja probablemente por una hiperglicosilacin,
caracterstica de este sistema (Ritsema y Smeekens, 2003). Afortunadamente, otra levadura,
Pichia pastoris, se caracteriza por la ausencia de enzimas sucrolticas, por lo que la convierten en
el sistema ideal en el estudio de enzimas relacionadas con el metabolismo de Suc, adems de
presentar un patrn de glicosilacin y modificaciones postraduccionales semejantes a un sistema
vegetal (Trujillo et al., 2002; Ritsema y Smeekens, 2003). Por estas ventajas, P. pastoris ha sido el
sistema ms recurrido en los ltimos tiempos en la expresin de FT, Inv y FEH (Sprenger et al.,
1995; Hochstrasser et al., 1998; Lscher et al., 2000; Trujillo et al., 2002; De Coninck et al., 2005),
utilizando generalmente el vector pPICZ, cuya expresin se encuentra regulada bajo el promotor
del gen alcohol oxidasa (aox I), inducible en presencia de metanol.
3.6.1. CONSTRUCCIN DEL VECTOR pGAPZ
C-atft
Los oligonucletidos PpAt-FT1 y PpAt-FT2 (Tabla 14) se usaron para amplificar el ADNc atft
completo contenido en el vector pGEM-T Easy, eliminando adems el pptido seal y el codn de
terminacin (TGA) de esta secuencia, e introduciendo en el nuevo fragmento los sitios de
restriccin Cla I y Xba I, para facilitar su ligacin en pGAPZC. Este vector contiene el promotor
de la enzima gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (GAP), cuya expresin es constitutiva; y de

188

probarse su inocuidad en las clulas hospederas, puede resultar una alternativa econmica y
segura para el anlisis o produccin de este sistema con alguna perspectiva biotecnolgica.
El vector pGAPZC-AtFT as generado, fue amplificado en clulas de E. coli crecidas con el
antibitico zeocina como agente de seleccin. La presencia de la construccin en las
transformantes fue confirmado, y el vector fue analizado por secuenciacin, para verificar que la
secuencia estuviese en el marco de lectura correcto. El vector linearizado con Avr II fue utilizado
para transformar, por electroporacin, la cepa silvestre de P. pastoris X33. La secuencia AtFT fue
incorporada al genoma de la levadura por un proceso de recombinacin homloga.

3.6.2. ANLISIS DE EXPRESIN

En el extremo 5 de su secuencia, AtFT es fusionado al factor (factor de secrecin derivada de
S. cerevisiae), por lo que se esperara que al producirse la protena, sta fuese secretada al medio
extracelular; sin embargo, en ocasiones esto no sucede y la protena permanece en el interior.
Una vez crecidas, las levaduras fueron centrifugadas, recuperndose el sobrenadante y la fraccin
celular. La velocidad de crecimiento y la produccin de biomasa fueron comparables entre la cepa
silvestre X33 y las clulas transformadas, indicando que la expresin constitutiva de AtFT no fue
txica para la clula hospedera. Durante el crecimiento de las clulas, el pH del medio disminuy
de 6 hasta 4.5 o an a valores inferiores y la actividad FT se detect principalmente en las clulas.
La disminucin del pH pudo haber interferido en el correcto proceso de excrecin de la protena o
haber causado su inactivacin por un valor de pH inferior al de su actividad ptima. Para resolver
lo anterior, cepas transformadas de P. pastoris fueron inoculadas en un tanque de fermentacin de
2.5 L, en condiciones de alta aireacin y un control de pH a un valor de 6. Aun as, la comparacin
de las Figuras 66 y 67 muestra que la actividad enzimtica en el sobrenadante fue menor que la
detectada en las clulas. Esta menor actividad indica que el pptido seal del factor dirigi a la
protena AtFT recin sintetizada, hacia el espacio periplsmico, donde la mayor parte de la
actividad debi ser retenida, al igual que se ha reportado en otras fructosidasas. La deteccin de
actividad tambin sugiere que durante su trnsito al periplasma, AtFT debi ser glicosilada,
condicin que parece esencial para su funcin cataltica (Ritsema y Smeekens, 2003). Los
sustratos y productos del ensayo enzimtico fueron capaces de fluir hacia o desde el espacio
periplsmico va un proceso de difusin.

189

Figura 66. Perfil cromatogrfico de los productos generados de AtFT excretada al medio
extracelular. A) Fructanos de cebolla; Productos del ensayo enzimtico del extracto protenico
secretado al medio extracelular utilizando B) sacarosa, C) 1-Kestotriosa o D) nistosa como
sustrato.

190

Figura 67. Perfil cromatogrfico de los productos generados de AtFT contenida en la

fraccin celular. A) Fructanos de cebolla; Productos del ensayo enzimtico del extracto
protenico contenido en la fraccin celular utilizando B) sacarosa, C) 1-Kestotriosa o D) nistosa
como sustrato.

191

En presencia de Suc como nico sustrato, no hubo deteccin de actividad FT en la fraccin del
sobrenadante (Figura 66B). Sin embargo, en la fraccin celular se observ una produccin
considerable de 1-Kes a partir de este sustrato. Las FT con capacidad de utilizar Suc como
donador es la 1-SST y la 6-SFT, y solo recientemente se report en la 6G-FFT de L. perenne, la
sntesis de pequeas cantidades de 1-Kes a partir de Suc (Lasseur et al., 2006). Minimizando este
hecho, los autores sugieren que en presencia nica de Suc, esta enzima sintetiza primero 1-Kes
que utiliza posteriormente para la formacin de 6G-Kes, que se forma despus de 4 h de reaccin.
Sin embargo, la cantidad de 1-Kes sintetizada por AtFT es considerable y no se observa la sntesis
de otro producto adicional. Se puede descartar la interferencia de una Inv que sintetice este
producto a partir de las condiciones del ensayo (alta concentracin de Suc), pues P. pastoris
carece de cualquier actividad sucroltica.
Cuando AtFT de la fraccin celular o el sobrenadante fue ensayado en presencia de 1-Kes o Nys
como sustratos, hay una clara actividad 1-FFT (Figuras 65 y 66). Hay generacin de IOS hasta
DP6 e incluso hasta DP7 en el caso de la fraccin celular; y es en esta ltima fraccin donde los
productos se sintetizaron en mayor abundancia. Una combinacin de sustratos (Suc + 1-Kes, Suc
+ Nys o 1-Kes + Nys) no modific el patrn de fructanos sintetizados. En el caso del
sobrenadante, la incubacin con Nys disminuye notablemente la formacin de Suc y Fru,
sugiriendo que la reaccin de polimerizacin es limitada en presencia de 1-Kes, ya que sta debe
competir con la Suc y agua como fructosil-aceptor. Adems de la serie Ix como productos
generados predominantemente por AtFT, tambin se observ la generacin de pequeos picos,
que de acuerdo a la comparacin con el perfil cromatogrfico de fructanos de cebolla,
corresponden a los neofructanos. Estos resultados indican que atft codifica una 1-FFT con
actividad colateral de 6G-FFT. La actividad relativa 1-FFT/6G-FFT de esta enzima debe tener una
proporcin mucho mayor al reportado para cebolla (0.45, Fujishima et al., 2005) y L. perenne
(0.48, Lasseur et al., 2006), y ms parecido al sistema de esprrago donde se reporta para la 6GFFT una relacin de actividad 1-FFT/6G-FFT de 16 (Ueno et al., 2005) y donde adems se
demuestra la existencia de enzimas independientes para la sntesis de inulinas y neofructanos.

3.6.3. IDENTIDAD DE LA AtFT

La inesperada incapacidad de AtFT de sintetizar 6G-Kes, a pesar de la mayor homologa con las
enzimas de actividad 6G-FFT, confirma la importancia de ensayar la expresin de secuencias

192

genmicas en un sistema heterlogo antes de asignarles una funcin putativa. Esto coincide con
otros autores (Van den Ende et al., 2003; Gallagher et al., 2004; De Coninck et al., 2005) cuyas
evidencias demuestran que enzimas con funcionalidad (Inv vs FT) y localizacin (vacuolar vs
apoplstica) diferentes pueden asociarse en un mismo grupo filogentico. atft es la primera
secuencia clonada para una actividad 1-FFT de Asparagales. Su mayor homologa con la 6G-FFT
de cebolla y esprrago y no con otras 1-FFT de monocotiledneas, refuerza la hiptesis de que las
FT evolucionaron independientemente en familias no relacionadas, a travs de pequeos cambios
mutacionales que causaron diferencias en la especificidad de sustrato y por lo tanto, en el perfil de
sus fructanos.
La comparacin de AtFT con las secuencias de 6G-FFT de cebolla y esprrago, muestra que
mientras estas dos ltimas presentan el consenso NDPSG en el motivo -fructosidasa, AtFT
difiere en la serina-104 (SDSPG) (Figura 65). Ritsema et al. (2005) discuten que este motivo es
bien conservado en las enzimas que comparten la misma actividad cintica. En un trabajo
reciente, estos autores demostraron que mutaciones en el residuo cido asprtico-84 de la 6GFFT de cebolla (posicin equivalente a la serina-104 de AtFT) afecta la especificidad del producto.
La mutacin N84S que genera el consenso SDPSG, semejante al presente en AtFT, cambi la
actividad de esta enzima. Esta protena al igual que la silvestre, es incapaz de utilizar Suc como
sustrato donador; sin embargo, con esta nica mutacin dicha enzima no tuvo mas actividad de
6G-FFT, sino que sintetiz fructanos tipo inulina en presencia de 1-Kes. El comportamiento de
esta enzima es similar a lo que fue observado en el anlisis de expresin de AtFT. Esto ayuda a
explicar, en parte, la actividad 1-FFT encontrada en esta enzima, porque la secuencia fructosidasa de AtFt es menos similar al consenso conservado YDPNG de las 1-FFT de
dicotiledneas o NDPNG de las monocotiledneas.
atft tambin es el primer ADNc aislado para una FT de la importante familia Agavaceae y
contribuye a enriquecer el limitado conocimiento del metabolismo de fructanos en estas plantas.
Aunque AtFT sintetiza neofructanos, esto no explica la predominancia de estos carbohidratos en la
planta y en los ensayos de actividad enzimtica. Su pequea actividad 6G-FFT fuertemente
sugiere la presencia de enzimas independientes: AtFT activa en la sntesis de inulinas y una 6GFFT, an no purificada ni clonada, encargada de la formacin de neofructanos. Por otra parte,
tampoco se puede descartar que AtFT tenga una funcin dual de 1-FFT/6G-FFT. Los neofructanos
observados en agaves podran ser sintetizados por reacciones de polimerizacin a partir de la 6G-

193

Kes generada. Esto es, inicialmente AtFT podra sintetizar 6G-Kes y despus de haber alcanzado
cierto umbral, AtFT podra actuar sobre este mismo metabolito elongando la cadena a travs de
cualquiera de los dos residuos de Fru terminal.
Una desventaja de P. pastoris como sistema de expresin puede ser las diferencias en el
comportamiento enzimtico de las enzimas heterlogas comparadas con las nativas. Esto ha sido
explicado como diferencias durante el plegamiento o el proceso de glicosilacin (Hochstrasser et
al., 1998; Ueno et al., 2005). La presencia de actividad AtFT en el sobrenadante y en la fraccin
celular, indican que la protena fue procesada diferencialmente, hecho que se ve reflejado por
distintos comportamientos enzimticos en ambas fracciones: la fraccin celular es ms activa y
utiliza Suc en la sntesis de 1-Kes. Si un cambio de un solo aminocido puede modificar la
especificidad del producto formado por una FT, un distinto plegamiento o grado de glicosilacin,
podra estar modificando la actividad enzimtica de AtFT de manera importante; por lo que la
expresin de atft en otro sistema heterlogo o la purificacin a homogeneidad de la enzima
podran ser datos valiosos en el anlisis del metabolismo de fructanos en agaves.

194

IX. CONCLUSIONES

Los tallos de agave almacenan fructanos como principal carbohidrato de reserva (hasta
el 80% de su peso seco). La presencia de enlaces -D-Fruf-(2-1), -(2-6) y disustituda,
as como unidades -D-Glcp-interna y terminal, indican una complejidad similar a lo
reportado en otros miembros Asparagales, reforzando la posibilidad de utilizar la
determinacin estructural de fructanos como un criterio adicional en la clasificacin
taxonmica.

Las diferencias estructurales en los fructanos de agave y dasylirion son ms cuantitativas

que cualitativas. La concentracin de este carbohidrato y aquellos relacionados con su
metabolismo (Sac, Fru, Glc) presentaron una correlacin con las condiciones climticas
donde crecieron las plantas. Este hecho sugiere que la presencia, diversidad y/o
metabolismo de los fructanos en estas especies, puede contribuir a una mejor tolerancia a
estrs abitico, especialmente a condiciones de sequa, donde por lo general se
desarrollan.

En el extracto crudo de agaves y dasylirion se logr la identificacin de diferentes

actividades enzimticas, con capacidad de sintetizar un espectro de fructanos semejante a
lo encontrado in vitro a partir de sacarosa como nico sustrato.

Los distintos pasos cromatogrficos utilizados, permitieron la identificacin de actividades

diferenciales de las FT encontradas en agaves.

El ADNc aislado de A. tequilana (atft), codifica una glicosilhidrolasa de la familia 32

(GH32). Su consenso DPSG distinto al DPNG altamente conservado en Inv, la identifica
como una FT. Ls expresin heterloga de atft en Pichia pastoris, mostr que sta es una
1-FFT a pesar de que su secuencia es ms homloga a la 6G-FFT de las Asparagales
Asparagus officinalis (esprrago) y Allium cepa (cebolla).

Este es el primer ADNc aislado de una 1-FFT de Asparagales y el primer FT de la familia

Agavaceae.

195

X. PERSPECTIVAS

i).- La identificacin de la diversidad estructural de fructanos en plantas de agave y dasylirion, las

propiedades de las diferentes actividades enzimticas que participan en su sntesis y el
entendimiento de la regulacin de la expresin de sus respectivos genes, pueden conducir al
entendimiento de las bases fisiolgicas que le permite a estas plantas regular sus niveles de
carbohidratos como un mecanismo de tolerancia al estrs hdrico.

ii).- El conocimiento de la secuencia del ADNc que codifica para la AtFT, facilita la obtencin de su
secuencia genmica. El anlisis de su sistema de intrones y exones puede ayudar a entender los
mecanismos, factores ambientales y genticos que regulan su expresin. Dado los antecedentes
de una variabilidad en el motivo -fructosidasa en las FT y de la implicacin de un mecanismo de
splicing alternativo en papa bajo estrs por fro, se hace interesante el estudio de la disposicin
genmica de dicho gen buscando algn comportamiento similar.

iii).- El anlisis de expresin de AtFT indica que sta es 1-FFT, a pesar de su mayor homologa
con la 6G-FFT de esprrago y cebolla. Este hecho abre la perspectiva de futuros anlisis
mutacionales, encaminados al entendimiento de la relacin estructura-funcin con la especificidad
de la actividad enzimtica. Por ejemplo, un anlisis en la mutacin S104D en el motivo fructosidasa de AtFT (SDPSGP), diferente al motivo presente en esprrago y cebolla (NDPSGP), o
una mutacin en el dominio DFRFPNP presente nicamente en estas tres secuencias, pueden dar
una idea de los dominios y residuos clave en la especificidad enzimtica de estas FT.

iv).- La identificacin de la diversidad estructural en agaves, obliga a estudiar las propiedades de

estas nuevas molculas, para una potencial aplicacin biotecnolgica (agrcola, industrial,
farmacutica, alimentaria) similar o diferente a las aplicaciones dadas a los fructanos tipo inulina.
Un especial nfasis podra ser puesto en el rea de prebiticos, desde que recientemente se ha
demostrado que la 6G-Kes, presenta un mejor efecto bifidognico que los IOS, ya industrialmente
utilizados con fines nutracuticos.

196

v).- La inocuidad de la expresin constitutiva de A-FT, ofrece la perspectiva de escalar su

expresin heterloga a un nivel industrial o semi-industrial para aplicaciones biotecnolgicas.

vi).- Finalmente, un entendimiento bsico de la fisiologa de los fructanos con el metabolismo de

carbohidratos en agaves, a lo largo de todo su ciclo de desarrollo, podra permitir la sobreexpresin endgena de AtFT, para volver realidad el sueo de todo industrial tequilero: mayor
acumulacin de fructanos a una menor edad de la planta.

197

XI. APNDICES
APNDICE A. PREPARACIN DE SOLUCIONES
Reactivo revelador de carbohidratos: Solucin A, 100 mL de difenilamina al 4% en acetona; solucin B,
100 mL de anilina al 4% en acetona; Solucin C, 20 mL de cido fosfrico al 85%. Mezclar las soluciones
antes de usarse.
Solucin Bradford (stock): 100 mL de etanol al 95%, 200 mL de cido fosfrico 88%, Serva azul G 350
mg. Estable indefinidamente a temperatura ambiente.
Reactivo de Bradford (reactivo de trabajo): 425 mL de agua destilada, 15 mL de etanol al 95%; 30 mL de
cido fosfrico al 88%. Mezclar y filtrar a travs de un papel Whatman No.1. Almacenar a temperatura
ambiente en una botella mbar. Estable por varias semanas, pero necesita ser filtrada de nuevo.
Buffer McIlvaine: Citrato-fosfato 50 mM, pH 5.5, EDTA 5 mM, NaN3 0.02%, PMSF 0.1 M
Buffer de afinidad: Citrato-fosfato 50 mM, pH 5.5, EDTA 5 mM, NaN3 0.02%, PMSF 0.1 M, con CaCl2 1
mM, MnSO4 1 mM y NaCl 0.5 M
Buffer de intercambio aninico: Bis-Tris-HCl 15 mM, pH 7.0, EDTA 5 mM, NaN3 0.02%, PMSF 0.1 M
Buffer de exclusin: citrato-fosfato 50 mM, pH 5.5, NaCl 200 mM, NaN3 0.02%.
Gel separador: El gel separador al 10% se prepar con 3.3 mL de solucin stock de acrilamida (acrilamida
3%, bis-acrilamida 0.08%), mezclado con 2.5 mL de buffer de separacin (Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8) y 4.1 mL
de agua. Para geles desnaturalizantes se aadi SDS a una concentracin final de 0.4%. Se aadi 50 L
de persulfato de amonio al 10% y 5 L de N,N,N,N-tetrametilene-etilendiamina (TEMED) para permitir la
polimerizacin de la solucin.
Gel concentrador: El gel concentrador al 5% se prepar mezclando 670 L de solucin stock de acrilamida
con 1 mL de buffer concentrador (Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 para geles nativos y Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 y SDS
0.4% para geles desnaturalizantes) y 2.3 mL de agua. Se aadi 30 L de persulfato de amonio y 5 L de
TEMED. Esta solucin se pipete sobre el gel de separacin polimerizado, insertando un peine
electrofortico y se permiti su polimerizacin.
Buffer de muestra: Tris-HCl 312.5 mM pH 6.8, glicerol 50% y azul de bromofenol 0.05% para geles nativos
y Tris 1 M, glicerol 50%, azul de bromofenol 0.05% y SDS 10% para geles desnaturalizantes.
Solucin de tincin: Azul Coomassie R-250 0.2%, metanol 90%, cido actico glacial 10%.
Solucin de desteido: Metanol 10%, cido actico glacial 10%.
Buffer de extraccin de ADN: Tris-HCl 100 mM, EDTA 25 mM, NaCl 250 mM, SDS 0.5%, pH 8.0.
Buffer TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0.
Buffer TAE: Tris-HCl 40 mM, cido actico 20 mM, EDTA 1mM.
Buffer de extraccin de ARN: Tris-HCl 100 mM, EDTA 15 mM, NaCl 200 mM, sarcosyl 0.5%.

198

Bromuro de etidio: 4 L de bromuro de etidio de una solucin stock de 10 mg/mL por cada 100 mL de
TAE.
Buffer de carga: Tis-HCl 10 mM pH 7.6, azul de bromofenol 0.03%, cianol xileno 0.03%, glicerol 60%,
EDTA 60 mM.
Buffer de transcripcin: Tris-HCl 250 mM, pH 8.3, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM.
Buffer de PCR: Tris-HCl 200 mM, pH 8.4, KCl 500 mM.
Medio Luria Bertani: Bactotriptona 1%, extracto de levadura 0.5%, NaCl 1%, pH 7.0.
Buffer de ligacin 10
: Tris-HCl 300 mM pH 7.8, MgCl2 20 mM, DTT 20 mM, ATP 2 mM, polietilenglicol
10%.
Buffer O+: Tris-HCl 50 mM pH 7.5, MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM, BSA 0.1 mg/mL.
Medio YPD: Extracto de levadura 1%, peptona 2%, dextrosa 2%, pH 7.0.

199

APNDICE B. ANLISIS DE FRAGMENTACIN DE PMAA

1.- 2,5-Di-O-acetil-2-deuterio-1,3,4,6-tetra-O-metil-hexitol (-glucitol y -manitol) (-D-Fruf-t)

200

2.- 1,5-Di-O-acetil-(1-deuterio)-2,3,4,6-tetra-O-metil-glucitol (-D-Glcp-t)

201

3.- 2,5,6-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4-tri-O-metil-manitol (D-Fruf-2-6)

202

4.- 1,2,5-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-3,4,6-tri-O-metil-manitol (D-Fruf-2-1)

203

5.- 2,5,6-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4-tri-O-metil-glucitol + 1,2,5-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-3,4,6-tri-O-metil-glucitol [D-Fruf- - (21)/ (26)]

204

6.- 1,5,6-Tri-O-acetil-(1-deuterio)-2,3,4-tri-O-metil-glucitol (-D-Glcp-i)

205

7.- 1,2,5,6-Tetra-O-acetil-(2-deuterio)-3,4-di-O-metil-hexitol (-glucitol y -manitol) (1,6-di--D-Fruf)

206

APNDICE C. DESPLAZAMIENTOS QUMICOS DE 13C-FRUCTANOS

El valor de los desplazamientos es en ppm; Fx indica el nmero de carbono en la fructosa; Gx el correspondiente a la glucosa; donde se muestra se
indica los asignamientos reportados en la literatura: -t, residuo terminal; -i, (2-1), residuo interno con enlace (2-1); -i, (2-6), residuo interno con
enlace (2-6); -r, residuo ramificado; -glc, glucosa interna. n.d., no detectado; n.r., no reportado.
Carbono

Suc
Carpita et al.,
1991

F1

Suc
De Bruyn y
Van Loo,
1991
62.5

F2

104.5

106.38

F3

77.8

79.11

F4

75.4

76.71

F5

82.2

84.07

F6

63.2

65.11

G1
G2
G3
G4
G5
G6

92.9
71.9
73.4
70
73.2
61

n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.

64.07

1-Kes
De Bruyn y
Van Loo,
1991
61.7
61.2
104.1
104.5
77.5
77.5
75.2
74.7
81.9
82
62.9
63.1
93.3
71.9
73.4
70
73.2
60.9

1-Kes
Shiomi, 1993

6-Kes
Liu et al.,
1991

6-Kes
Praznik et al
1992

6G-Kes
Shiomi, 1993

6G-Kes
Liu et al.,
1991

61.04-t
61.50-i
104.34-t
103.86-i
77.25

59.48-t
60.88-i
103.35-t
103.35-i
76.20-t
75.81-i
74.35-t
74.01-i
80.77-t
79.86-i
62.20-t
62.58-i
91.72
70.65
72.19
68.88
71.99
59.94

61.4-t
62.4-i
104.9-t
104.9-i
77.8-t
77.4-i
75.9-t
75.5-i
82.3-t
81.4-i
63.7-t
64.1-i
93.2
72.1
73.7
70.4
73.5
61

62.19-t
60.94-t
104.45-t
104.43-t
77.52
76.97
75.08
74.67
82.08
81.88
63.16
63.09
92.85
71.8
71.13
69.79
72.23
61.13

61.13-O1
59.89-O6
103.29-O1
103.24-O6
75.94-O1
76.47-O6
73.57-O1
74.01-O6
80.70-O1
80.90-O6
61.96-O1
61.93-O6
91.56
70.58
72.03
68.81
71.11
59.95

75.09
74.47
81.82
81.73
62.98
62.81
93.1
71.75
73.21
69.83
73.03
60.74

6G-Kes
De Bruyn y
Van Loo,
1991
61
61.1
104.5
104.5
77.1
77.6
75.2
74.7
81.9
82.1
63.2
63.2
92.8
71.8
73.2
70
72.4
60.9

207

Carbono

F1

F2

F3

F4

F5
F6

G1
G2
G3
G4
G5
G6

Nis

FFGF

FGFF

Inulina

Inulina

Inulina

Shiomi, 1993

Shiomi, 1993

Shiomi, 1993

Shiomi, 1993

61.08-t
61.74-i
61.55-i
104.38-t
103.93-i
103.74-i

62.19-t
61.38-i

61.50-t
61.58-i

Goto et al.,
1995
61.8

104.44-t
104.37-t
103.73-i

61.11-t
60.93-t
61.73-i
104.46-t
104.38-t
103.99-i

Spies et al.,
1992
61.7

104.1

103.93

78.37
77.48
76.96
75.08
75.04
74.67
82.08
81.88
63.16
63.09

77.52
77.3
77.15
75.17
75.06
74.49
81.93
81.84
63.04
62.92

104.4-t
103.95-i
103.89-i
103.85-i
103.79-i
77.73
77.67
77.45
75.06
75.03
74.96
81.78

77.8

78.04

75.1

75.35

81.9

81.91

83.75

63

62.99

64.82

92.74
71.76
73.15
69.89
72.19
61.09

92.99
71.77
73.16
69.88
72.28
61

62.98
62.94
62.82
93.18
71.9
73.3
69.92
73.13
60.8

n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.

93.2
72.03
73.59
70.23
73.24
61.17

78.2
77.49
77.43
75.15
75.03
74.57
81.93
81.78
62.97
62.94
62.9
93.2
71.88
73.3
69.92
73.14
60.81

C. intybus
(2-1)
Sims et al.,
2001

C. intybus
(2-1)
Carpita et al.,
1991
63.55
63.17

H.tuberosus
(2-1)
Sims et al.,
2001
n.r.

105.3-t
104.9-i

105.88
106.34

105.3-t
104.7104.9-i

79.67
79.99
79.46
76.97
76.65

94.1

n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.

94.1-t

208

Carbono

P. sochifolia
(2-1)
Goto et al.,
1995
61.61-t
61.84-i
62.08-glc

Levano
(2-6)
Goto et al.,
1995
61.27

Levano
(2-6)
Shiomi,
1993
60.8

F. arundinacea
(2-6)
Carpita et al., 1991

F2

104.53-t
104-i
104.14-glc

104.95

105.04

F3

77.82-t
78.20-i
77.89-glc
75.46-t
75.38-i
74.93-glc
81.99-t
82.00-i
82.18-glc
63.02-t
63.10-i
63.15-glc
93.35
72.08
73.57
70.24
73.34
61.17

77.56

77.2

76.26

76.07

81.06

81.13

64.21

64.2

F1

F4

F5

F6

G1
G2
G3
G4
G5
G6

n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.

P. peisonis
(2-6)
Spies et al.,
1992
60.8-t
60.8-i, (2-6)

P. pratense
(2-6)
Sims et al.,
2001
n.r.

A. cepa
Neo
Sims et al.,
2001
n.r.

T. aestivum
Graminano
Carpita et al.,
1991
63.23
62.82

106.91
106.5
106.33

104.8-t
105.1-i

105.3-t
105.6, 2-6-i

105.3-t
104.7-104.9-i

78.99
79.4
79.71
77.91
77.3

77.5-t
77.2-i

106.36
106.19
106.91
105.95
79.54
79.32

62.61
63.11
63.75

75.4-t

79.13
77.11

82.99
83.84

76.1-i

78.04
77.47

66.1
65.17
64.89
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.

82.0-t
81.2-t

83.03
83.79

63.3-t
64.3-i

66.12
65.06
64.94, 65.35
n.r.
n.r.
n.r.

93
71.9
73.5

94.1-t

94.1-t
93.6-i

209

Carbono

F1

A. repens
Mezcla compleja
Spies et al., 1992
60.80-t
60.80-i, (2-6)
61.20-r

F2

104.50-t
105.00-i,( 2-6)
104.30-r

F3

77.50-t
77.10-i, (2-6)
77.50-r

A. officinalis
Asparagosina
Shiomi, 1993
61.27-t
61.13-t
61.08-t
61.77-i
61.55-i
61.49-i
61.46-i
61.40-i
61.35-i
104.26t
103.90-i
103.87-i
183.81-i
103.76-i
103.69-i
103.64-i
78.08
78.04
77.94
77.93
77.86
77.84
77.78
77.75
77.71
77.70
77.66
77.63
77.42

Phormium
tenax/cookianum
Sims et al, 2001
n.r.

C. australis
Mezcla compleja
Brasch et al., 1988
61.40
61.50
61.80
62.10

U. maritima
Mezcla compleja
Spies et al., 1992
60.80-t
61.20-i, (2-1)
60.70-i, (2-6)
60.80-r

105.30-t
104.70-i, (2-1)
104.90-i, (2-1)
105.60-i, (2-6)
105.50-r

104.40
104.50
104.90-t
105.00-r
105.30-i

104.50-t
104.00-i, (2-1)
104.90-i, (2-6)
104.60-r

n.r.

77.90
78.10
78.40
78.60

77.50-t
77.50-i, (2-1)
77.30-i, (2-6)
77.50-r

210

F4

75.10-t
75.70-i, (2-6)
75.70-r

F5

81.90-t
81.10-i, (2-6)
81.10-r

F6

63.10-t
64.20-i, (2-6)
64.00-r

G1
G2
G3
G4
G5
G6

n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.

75.09
75.03
75.00
74.96
74.93
74.85
74.82
74.43
81.74

n.r.

75.70
76.00
76.50
76.70

75.40-t
75.20-i, (2-1)
76.00-i, (2-6)
75.90-r

n.r.

81.90-t
81.90-i, (2-1)
81.00-i, (2-6) y -r

63.00
62.95
62.91
62.87
62.83
62.71
92.85
71.80
73.13
69.79
72.23
61.13

n.r.

81.10
81.30
81.50
82.40
82.50
63.50
63.50
64.00
64.40

93.40, 93.70
72.40
73.90
70.50, 71.00
73.70
68.90

n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.

94.10-t
93.60-i
n.r.
n.r.
n.r.
n.r.

63.40-t
63.10-i, (2-1)
64.00-i, (2-6) y -t

211

APNDICE D. SECUENCIAS AISLADAS

TAC CAT TTC CAG CCA CCG CGA AAT TGG ATC AAC GAT CCA
Y

AAT GGA CCA ATG TAT TAT AAT GGC ATC TAC CAC CTC TTC
N

TAT CAG TAC AAC CCC TAC GGT GCA GTG TGG GGC AAC ATT
Y

GTG TGG GCC CAC TCA GTT TCA ACG GAC ATG ATC AAT TGG
V

AAG GCA CTC GAA CCC GCG ATC TAC CCG TCC AAA CCC TTT
K

GAC GTT AAC GGG TGC TGG TCC GGG TCG GCT ACC ATC CTC
D

CCG GGT AAC AAA CCC GCC ATC CTC TAC ACG GGT ATC GAC
P

CCG CAA AAC AGG CAG GTC CAA AAC ATT GCG TTC CCA AAA
P

AAC CTG TCC GAC CCG TAT CTT CGC GAA TGG GTC AAA CCC
N

GAT TAC AAC CCG ATA ATT GCC CCC GTC AAC GGG ATC AAC
D

GCT AGT GCG TTC CGC GAC CCG ACA ACG GCC TGG CAC GGT
A

CCG GAC GGG CAC TGG AGG CTG GTG ATT GGG AGC AAG AGG
P

AAG CAC AGG GGG ATG GCC ATC ATG TAC CGG AGC CGG GAC
K

TTT ATT AAC TGG ATC CGG GCG AAG CAC CCG TTA CAC TCT
F

GCT AAC GGT ACG GGT ATG TGG GAA TGC ATT
A

Secuencia At-FEH. En la parte superior se muestra la secuencia del ADNc y en la parte inferior y
en negrilla, el producto de su traduccin.

212

TGG GGC CAT GCT GTA TCC AGA GAC CTA GTC CAC TGG ACT
W

CAC CTA CCC CTA GCC ATG GTC CCA GAC CAA TGG TAC GAC
H

ATC AAC GGC GTC TGG ACC GGG TCG GCC ACC ATC CTA CCG
I

GAC GGC CAA ATC GTC ATG TTG TAC ACC

D

GGG GCC
G

ACC AAC

GAA TCG GTC CAA GTC CAG AAC TTA GCG GTC CCA GCA GAT
E

CAG TCC GAC ACG TTA CTC CTG AGA TGG AAG AAG TCC GAG
Q

GCC AAC CCC ATC CTG GTC CCT CCC CCA GGC ATA GGG GAC
A

AAG GAC TTC AGG GAC CCC ACC ACA GCA TGG TAC GAA CCT
K

TCC GAC GAC ACA TGG CGC ATC GTG ATC GGC TCC AAG GAC
S

TCC TCC CAT AGC GGC ATC GCC ATC GTC TAC AGC ACC AAG
S

GAC TTC ATC AAC TAC AAA CTC ATC CCT GGG ATC CTC CAT
D

GCG GTG GAG CGG GTT GGT ATG TGG GAA TGC GTT
A

Secuencia At-Inv. En la parte superior se muestra la secuencia del ADNc y en la parte inferior y
en negrilla, el producto de su traduccin.

213

TAC CAT TTC CAG CCC CCA AGA TAT TTT ATG AGC GAT CCC
Y

AGC GGT CCC GTG TAC TAC AAG GGT TGG TAC CAT TTC TTC
S

TAC
Y

CAA CAC AAT GCA AAA GCT GCA TTC TGG GGC AAC ATT
Q

GCA TGG GGT CAT GCT GCG TCT CGT GAC CTC CTC AAC TGG
A

GTC CAC CTA CCC TTG GCT GTG

V

CCT GAT GGT CGG GTC ATA ATG CTA

P

GAA CCG GAC CAT TGG TAT

GAT ATT GAA GGT GAC TGG ACG GGC

D

TCA GTT GCG GTA TTA

S

TTC
F

ACT GGT GGT ACC

T

GGT GCG AAT GAG CTG GCA CAG GTC GTC AAT CTT GCG GTG
G

GCT GCC GAT CCC TCG

A

ATC GGC
I

Q
P

K
Y

CCC GGT GTC CTC CAC

P

CTC AAG GAC TTC AGG GAC CCC AAT CCA GTC TGG
F

GTT TAC ACC ACC AAA GAC TTT

V

TCC AAG AAT GAT TCA TTA TCC

S

CCA GTG CTG CAT CCT CCG CGT GGC

TAT AAC TCA TTA GAA TCC ACA

Y

GGT CCA CTC CTG ATG GAA TGG ATC

G

AAG TAT GAT GCA AAC

K

TGG TAC GTA GTG GCT GGC

W

CAC

ACT GGT ATT GCT CTT

CTC

TCC

TAC ACT CTC CTC

Y

GCT GTT GAT ATT GTC GGC ATG TGG

A

GAG TGC GTT GA

E

Secuencia At-FT. En la parte superior se muestra la secuencia del ADNc y en la parte inferior y
en negrilla, el producto de su traduccin.

214

TGCGTTTGCTGGCTTTGATGAAAGTGTCTCAACCCTTCACCCATTTTCTTCACTTGGTCG
M K V S Q P F T H F L H L V
GGTGTTATTACGCTCACCGGCGGTGACCTCACCACC ATG GGC TCG CAG GAC
G

R Alto

GTC GAG TCT GCT CGC TCG CTG CAC GCC CCC ATC GTC GGT TCC CCT
V

CCT CCG CGG AGG ACG TTA ACG TTA AGA TCA CTC TCC CTC GCC CTG
P

TCC GTC GTC GCC TTC CTC CTT GCT GCG GCC CTT TTA CTC AGT AAG
S

TCG GGT TCG GTT CCG AAC CCG AAT CAA GGA CTG GAT GCA ATA TTG
S

GCT CCA TTA CCG CAA TCG GGT GCG GGT TTG GGT GAG GAG GAC TAC
A

CCG TTT ACC ACT AAG ATG CTG CAG TGG CAG CAC ACC GGG TTC CAT
P

TTC CAA CCC CCA AGA TAT TTT ATG AGC GAT CCC AGC GGT CCC GTG
F

TAC TAC AAG GGT TGG CAC CAT TTC TTC TAC CAA CAC AAT GCA AAA
Y

GCT GCA TTC TGG GGC AAC ATT GCA TGG GGT CAT GCT GCG TCT CGT
A

GAC CTC CTC AAC TGG GTC CAC CTA CCC TTG GCT GTG GAA CCG GAC
D

CAT TGG TAT GAT ATT GAA GGT GAC TGG ACG GGC TCA GTT GCG GTA
H

TTA CCT GAT GGT CGG GTC ATA ATG CTA TTC ACT GGT GGT ACC GGT
L

GCG AAT GAG CTG GCA CAG GTC GTC AAT CTT GCG GTG GCT GCC GAT
A

CCC TCG GAT CCA CTC CTG ATG GAA TGG ATC AAG TAT GAT GCA AAC
P

CCA GTG CTG CAT CCT CCG CGT GGC ATC GGC CTC AAG GAC TTC AGG
P

GAC CCC AAT CCA GTC TGG TAT AAC TCA TCA GAA TCC ACA TGG TAC
D

GTA GTG GTT GGC TCC AAG AAT GAT TCA TTA TCC CAC ACT GGT ATT
V

GCT CTT GTT TAC ACC ACC AAA GAC TTT CTC TCC TAC ACT CTC CTC
A

CCC GGT GTC CTC CAC GCC GTT GAT ATT GTC GGC ATG TGG GAG TGT
P

GTC GAT CTC TAT CCC GTA GCA ACT GCA GGT CCT TTA GTT GGC CGG
V

GCT CTT GAA AAT TCG GTG CCA GCC GGA GAA AAC GTT AAA CAT GTG
A

TTG AAA GCA GGC TTG AAT GAC GAG TGG CAT GAT TAC TAT GCG ATC
L

215

GGG ACG TAT GAT CGA GAA GCA AAC AAA TGG ACC CCG GAT GAT GAG
G

ATT ATT GAC GTC GGA ATT GGG TTG AGA TAT GAT TGG GGC AAA TTT
I

TAC GCG TCA AGG ACG TTT TAC GAT CCT GTA AAA CAG AGG AGG GTG
Y

CTA TGG GGG TAT GTT GGG GAA ACT GAT AGT AGG GAA GTT GAC ATT
L

CGG AAG GGT TGG GCT TCA GTC GAG GGC CTT GCG CGA ACA GTG TTG
R

TTT GAC GAA AAA ACA GGG ACC AAC CTC CTC ACT TGG CCA GTT GAG
F

GAG GTG GAA AGC CTC AGG ATG ACC AGC AAA AAT TTC AGC AAC GTG
E

ATC ATC AGC CCG GGA ACC ACT GTC CAG CTC GAC ATT GGT GAT GCG
I

AAT CAG CTG GAC ATA GTT GCC GAG TTT GAG ATT AAA AAA GAG GAA
N

CTT GAG GCT GTC ATC GAG GCC GAT GTC ACC TAC AAC TGC AGC ACC
L

AGC GGT GGT GCT GCC ACC CGA GGC CTG CTT GGA CCT TTT GGT CTG
S

CTT GTG CTT GCA AAT GAG GAT CTC ACT GAG CAG ACT GCG ACC TAC
L

TTT TAT GTT GGT AGG GGA ACT GAT GGC AGT CTG CAG ACT CAC TTG
F

TGC CAG GAT GAA TTG AGG TCA TCC AAG GCC TAC AAC ATC GTT AAG
C

AGG GTG GTA GGG CAC ACG GTT CCG GTG CTT GCT GGT GAA ATG TTG
R

TCT TTA AGA ATA CTG GTG GAT CAC TCA ATT GTG GAG AGC TAT GCT
S

CAA GGA GGT AGG GCA TCC ACC ACA TCT CGC GTG TAC CCA ACT GAA
Q

GCA ATC TAT GAG GGG GCA CGA GTC TTT CTC TTC AAC AAC GCG ACT
A

GCA GCC ACT GTG ATC GGC AAG AGT GTG AAG ATA TGG CAT ATG AAC
A

TCC ACA CAC GAC ACT ATC TGT CAC TAC CCC AGC CTG AAA GCT CAA
S

TGAGACACTCAAAACTCCATATTCTATGTGTTATTGTTGTCATTATCATTGATTGGCAT
Alto

GTTTCATTTAAGAGGACAATGTATCCGAGTTATATCGGTCCGTTGATGTTTCTCGAGTTC
GAGCAGCTATAGCTCATATTCCTTCACTTTGAAGGTTGGTGTTTGCAGTACGATATGCAC
CATTTCTAGTAGAAAATATCCTGGTTGATAATGCCTAAAAAAAAAA
Secuencia AtFT. Secuencia completa del ADNc amplificado; en cuadros negros se muestra el
codn de inicio (ATG) y de terminacin (TGA); as como los sitios probables de ruptura del pptido
seal () y el pptido lder () para generar la protena madura. Se muestra las regiones 5- y 3UTR (regin poli-A). En la zona 5-UTR se marca con negrillas un marco de lectura previo al inicio
de la protena madura.
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