ENFOQUES CLNICOS PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCIONES

VIRALES
I. INTRODUCCION
Los mtodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden
clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, segn persigan demostrar la
presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma viral) o
bien la respuesta de anticuerpos especficos por parte del husped en el curso de
la infeccin.
Gran parte de las tcnicas utilizadas en el diagnstico clnico se basan en
pruebas serolgicas que identifican anticuerpos especficos frente a diversas
protenas antignicas.

II. RECOLECCION, TRANSPORTE Y PROCESAMIENTO DE LAS

MUESTRAS
Un elemento crucial para realizar el diagnstico de laboratorio de un virus,
cualquiera sea el mtodo empleado, es la toma y el procesamiento de una
muestra clnica adecuada.
Tambin resulta til averiguar si el paciente ha recibido vacunas virales o
teraputica antiviral en una fecha reciente. Dado que los antibiticos no tienen
efecto sobre los agentes virales se puede obtener una muestra para cultivo aun
cuando la teraputica contra las bacterias ya hubiere comenzado.

Las mejores muestras se obtienen dentro de las primeras 72hs

Despus de transcurridos 7 das habitualmente no vale la pena realizar cultivos
virales cuando se trata de huspedes inmunocompetentes.
Las muestras deben obtenerse de forma asptica.
El volumen de la muestra debe ser suficiente

A continuacin, detallaremos algunos ejemplos de recoleccin y transporte de

muestras clnicas:
Hisopados conjuntivales: Frotar la conjuntiva palpebral con un hisopo
estril humedecido con solucin salina estril. Colocar el hisopo en 3-
4ml de medio de transporte.
Hisopados de lesiones y vesculas cutneas: Recolectar la muestra
dentro de los 3 das de la erupcin de la vescula. Frotar las lesiones
cutneas o vesculas abiertas con un hisopo y colocarlo en 3-4ml de
medio de transporte.
Aspirado nasofarngeo: Es la muestra de eleccin para virus
respiratorios. Se introduce una sonda nasogstrica (SNG) por las fosas
nasales hasta la rinofaringe y se aspira el mucus en un tubo colector
especial. El contenido de la SNG se lava con medio de transporte para
virus, que se recoge en el tubo colector.
Hisopados nasales: Introducir un hisopo de algodn, seco, suavemente
en la nariz. Dejar el hisopo en la nariz durante algunos segundos para que
las secreciones sean absorbidas. Colocar el hisopo dentro de 3-4ml de
medio de transporte.
Hisopados farngeos: Frotar las amgdalas y faringe con un hisopo de
algodn seco. Colocar el hisopo en 3- 4ml de medio de transporte.
 Hisopados rectales: Introducir un hisopo de algodn humedecido 2-3cm
dentro del canal anal realizando movimientos rotatorios. Colocar el
hisopo dentro de 3- 4ml de medio de transporte.
Heces: Recolectar 2-4g de la muestra en un recipiente estril.
Orina: Recolectar un total de 10-15ml de orina recientemente emitida en
un recipiente estril y enviarla directamente al laboratorio.
Lquido cefaloraqudeo (LCR): Recolectar al menos 0,1ml de LCR (2-
3ml preferentemente). Transportarlo al laboratorio inmediatamente.
Sangre con anticoagulante (para cultivo viral o inmunofluorescencia):
Recolectar sangre entera en un tubo que contenga heparina, citrato o
EDTA. Enviar la sangre directamente al laboratorio.
Suero (para pruebas serolgicas): Recolectar la muestra de sangre en un
tubo estril que no contenga anticoagulantes. Enviar la muestra al
laboratorio (no congelar).

III. METODOS DIRECTOS

Son aquellos que detectan:
1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).
2. La presencia de antgenos virales (tcnicas inmunolgicas): Inmunofluorescencia
(IF), Enzimoinmunoanlisis (EIA), Test de Aglutinacin.
3. La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc.).
4. El virus como partcula viral (microscopa electrnica).

1. Aislamiento Viral - Cultivos Celulares

La base del diagnstico viral es la deteccin del virus o de sus componentes.
 Un cultivo celular es obtenido, de explantes de rganos o de embriones de
animales.
La suspencin de celulas libres as obtenidas se coloca en la superficie plana de
un recipiente de vidrio o plstico en donde las clulas se adhieren y multiplican
formando una fina capa de clulas que se llama MONOCAPA CELULAR.
Esta monocapa de clulas crece en un medio de cultivo complejo que contiene
albmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer.

Los cultivos celulares se dividen en:

Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de clulas, tejidos u rganos tomados
directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces.
Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta
aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el
cariotipo correspondiente a la especie de que provienen.
Lneas Celulares Continuas: Permite un nmero finito de subcultivos y son
heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una lnea continua,
esta debe de haber sido subcultivada por lo menos 70 veces.

2. Deteccin de Antgenos - Tcnicas Inmunolgicas

Las tcnicas inmunolgicas que desarrollaremos a continuacin, pueden
utilizarse tanto para la deteccin de antgenos (mtodos directos), como de
anticuerpos (mtodos indirectos).
Para el procedimiento directo (deteccin de antgenos), se utiliza un anticuerpo
especfico antiviral (por lo general IgG) a cuya fraccin Fc se ha conjugado una
molcula marcada.
Para el procedimiento indirecto (deteccin de anticuerpos), se emplea un anti-
anticuerpo marcado y la reaccin se realiza sobre un cultivo celular infectado
por el virus en estudio.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID)

Es una de las tcnicas ms antiguas y de uso ms difundido en el laboratorio
clnico.
Muestras clnicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos
donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados
con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y
se combinan con los antgenos vricos en el interior de las clulas. La reaccin
antgeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la
aparicin de fluorescencia de color verde manzana.
 TEST DE AGLUTINACION
Los ensayos de aglutinacin, dependen de la fijacin inicial de anticuerpos
antivirales especficos sobre eritrocitos o partculas de ltex. Luego este reactivo
se incuba con la muestra clnica en la cual se investiga el antgeno y las
partculas se aglutinan si el antgeno adecuado se encuentra presente.
El test de aglutinacin ha sido usado para detectar antgeno de Rotavirus en
heces (el ms importante)

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Fue originalmente aplicado para identificar el antgeno de superficie de la
Hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo anti-HBsAg. Estos ensayos tienen una
buena sensibilidad y especificidad, pero la aparicin de un mtodo como el
ensayo inmunoenzimtico (EIA) con su mayor tiempo de conservacin de los
reactivos, su costo relativamente ms bajo y la ausencia de residuos radioactivos,
ha reemplazado las tcnicas de RIA en la mayor parte de los casos de deteccin
de antgeno viral.

ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA)
Los EIA para la deteccin de antgeno se basan habitualmente en la captura del
antgeno por anticuerpos especficos unidos a una fase slida, en general el
pocillo de una microplaca o una pequea esfera de plstico. El antgeno viral
presente en la muestra clnica se combina con el anticuerpo fijado a la fase
slida y el antgeno viral se detecta mediante la adicin de otro anticuerpo
especfico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o
fosfatasa alcalina.

3. Tcnicas de Biologa Molecular - Investigacin de cidos nucleicos virales

SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS
Actualmente es posible extraer secuencias especficas de un fragmento de ADN
por medio de las endonucleasas de restriccin. Luego estas secuencias extradas,
se pueden desnaturalizar y marcar ya sea con una enzima o con un istopo
radioactivo. A estas cadenas marcadas y que tienen una secuencia conocida se
llaman sondas de cidos nucleicos.

DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES POR SONDA

SINTETICA
 Es un ensayo de hibridacin molecular con una sonda marcada. Las
hibridaciones pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.
Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los
cidos nucleicos. Posteriormente se aade un DNA marcado, complementario
del DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la
hibridacin. La muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel
que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada.
Citomegalovirus, Papilomavirus y Epstein-Barr virus han sido identificados
usando sondas de cidos nucleicos.

AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES MEDIANTE

PCR
La PCR es una amplificacin de secuencias especficas del DNA. Se basa en la
utilizacin de secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados primers o
cebadores, que se hibridan de forma especfica con cada una de las cadenas de
DNA , previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados.
La combinacin de la PCR y las sondas de cidos nucleicos marcadas promete
ser el mtodo ms sensible para la deteccin e identificacin de los virus.

4. Microscopa Electrnica
Mediante el microscopio electrnico es posible observar la morfologa de los
viriones presentes en muestras clnicas. La limitacin del mtodo adems del
costo del microscopio, es que necesita de una alta concentracin de viriones
(aproximadamente 109 partculas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en
la muestra, por ello es poco sensible. Esto hace que sea una tcnica poco
utilizada, ms an con el desarrollo de tcnicas alternativas de utilidad similar.

VI. METODOS INDIRECTOS

Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte
del husped:
. Deteccin de anticuerpos especficos antivirales por tcnicas inmunolgicas
(EIA, IFI,WB, etc.).
. Produccin de anticuerpos in vitro.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

Se basa en la unin de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente
a los antgenos virales expresados en la superficie y citoplasma de clulas
infectadas.

Se incuba el suero del paciente con las clulas infectadas y no infectadas. Luego
se realiza un lavado con PBS y se agrega posteriormente anticuerpo anti IgG
humana conjugada con isotiocianato de fluorescena. El isotiocianato de
fluorescena es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposicin de la luz
ultravioleta y emite una luz verde caracterstica.
El conjugado se unir a los anticuerpos del paciente si la reaccin es positiva,
leyndose la prueba en un microscopio de fluorescencia.
ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO (EIA)
Tiene las ventajas de ser un mtodo verstil, relativamente econmico, sensible
y de lectura objetiva (instrumental).
La metodologa es la siguiente: Los antgenos virales se inmovilizan sobre una
fase slida (esferita, policubetas para microtitulacin u otros elementos de
plstico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la
reaccin Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada
con una enzima, seguida por el substrato apropiado para esta. Los resultados se
pueden leer con un espectrofotmetro y en algunos casos de forma visual.

TEST DE AGLUTINACION
El fundamento y el procedimiento de esta tcnica ya fueron descripto para el
estudio de Ag viral (mtodo directo).
Ahora lo que buscamos es detectar anticuerpos antivirales, por eso se usan
partculas de ltex recubiertas con Ag viral.

WESTERN BLOT (WB)

Son particularmente tiles para el diagnstico del HIV.
La tcnica de WB se basa en la separacin electrofortica de protenas virales
que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto de
determinar la presencia de anticuerpos especficos contra cada una de esas
protenas.
Esta tcnica se realiza esquemticamente en 3 pasos:
1. Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que luego
son tratados qumicamente para su disgregacin e inactivacin. Los
antgenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel
de Poliacrilamida.
2. Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag
separados a membranas de nitrocelulosa.
3. Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa.
Posteriormente se aaden anticuerpos anti-inmunoglobulina humana
unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por ltimo, se
agrega el substrato enzimtico para la visualizacin de las bandas
reactivas con un producto final coloreado.

La tcnica es muy similar a un EIA, menos sensible pero ms especfica que

esta.
PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN VITRO
Se trata de una tcnica nueva que ha sido aplicada para el diagnstico de la
infeccin perinatal. Este procedimiento revela la presencia de anticuerpos
antivirales producidos in vitro a partir de los linfocitos B extrados de sangre
total, lo que indicara que el sistema inmune del paciente ha sido estimulado por
el virus.
La produccin de Ac antivirales in vitro promete ser de gran valor en el
diagnstico temprano de nios infectados por VIH.