UNIVERSIDAD PRIVADA TELESUP

FACULTAD DE SALUD Y NUTRICIN SAN LUCAS

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

LIPASAS

Canchari Lazo, Elizabeth

Portilla Galarza, Juan

Zevallos Mallqui, William Antonio

Lima, Per
 LIPASAS

Introduccin
Las lipasas (glicerol-ster hidrolasas; EC 3.1.1.3) son enzimas que catalizan
la hidrlisis de los enlaces ster presentes en los acilgliceroles in vivo.
Adems, pueden catalizar la hidr- lisis o sntesis de un grupo amplio de
steres carboxlicos (Bornscheuer et al. 1994). Estas enzimas estn
ampliamente distribuidas en la naturaleza, y se encuentran en
microorganismos, plantas y animales (Berner y Hammond, 1970;
Mukherjee, 1996; Ruiz et al., 2007). Una caracterstica peculiar de las
lipasas es que son enzimas solubles en agua que actan sobre sustratos
insolubles y agregados, por lo que operan unidas a interfaces lpido-agua.
Bajo estas condiciones, se produce un incremento de la actividad cataltica,
respecto a las soluciones con concentraciones por debajo de la
concentracin micelar crtica, fenmeno conocido como activacin interfacial
(Sarda y Desnuelle, 1958).

Entre las aplicaciones ms exitosas de las enzimas estn aquellas que se

consiguen con sus formas inmovilizadas. Esto se debe a las ventajas que
confiere la inmovilizacin, entre las que se encuentran: la posibilidad de
recuperar la enzima del medio de reaccin, la obtencin de un producto no
contaminado con la enzima, y el incremento de la estabilidad operacional
del biocatalizador (Guisn et al., 1996a; Malcata, 1996; Kneevi et al.,
2004). Uno de los protocolos de inmovilizacin ms difundidos para las
lipasas es la adsorcin selectiva sobre soportes hidrofbicos que reproducen
las interfaces formadas por los sustratos naturales de estas enzimas
(Malcata et al., 1992; Fernndez-Lafuente et al., 1998). En este caso, la
inmovilizacin se produce a travs de un mecanismo de adsorcin interfacial
(Reis et al., 2009), basado en la activacin de estas enzimas en interfaces.

Las lipasas han suscitado un inters creciente para la industria debido a su

versatilidad, estereoselectividad, estabilidad frente a solventes orgnicos y
capacidad de sintetizar compuestos orgnicos en mezclas de reaccin con
baja actividad de agua (Segura et al., 2004; Dandavate et al., 2009). Bajo
determinadas condiciones, las lipasas pueden catalizar reacciones qumicas
distintas de la hidrlisis, como esterificacin, interesterificacin, alcoholisis,
acidolisis y aminolisis (Balco et al., 1996; Pandey et al., 1999). Estas
hidrolasas se han empleado ampliamente como aditivos para detergentes,
en las industrias alimentaria, papelera, qumica y energtica; as como para
la produccin de cosmticos, en tratamientos ambientales y en el diseo de
biosensores (MacRae y Hammond, 1995). Es notable el impacto que han
tenido las lipasas en la produccin de frmacos ms selectivos y efectivos,
con efectos secundarios menores, y en la obtencin de pesticidas de menor
toxicidad, todo ello mediante la sntesis de compuestos pticamente puros y
la resolucin de mezclas racmicas (Kirchner et al., 1985; Yoshimura et al.,
2002; Zarevcka y Wimmer, 2008). Es por ello que cobra vital importancia

BIOQUIMICA 1
 LIPASAS

profundizar en el conocimiento sobre las caractersticas funcionales de estas

enzimas, a fin de determinar las condiciones ms ventajosas de
aprovechamiento de sus propiedades, para lograr la optimizacin de los
procesos en que son empleadas.

En este trabajo se presentan los resultados de una amplia revisin en la

literatura especializada sobre las lipasas. En primer lugar, se ofrecen las
caractersticas estructurales ms importantes de estas enzimas en relacin
con las peculiares propiedades funcionales que estas determinan. A
continuacin se presenta la inmovilizacin de lipasas como tecnologa
dirigida a la obtencin de biocatalizadores ms eficientes, con nfasis en la
inmovilizacin por adsorcin interfacial: uno de los procedimientos de
inmovilizacin ms difundidos para estas protenas. Por ltimo, se resumen
las principales aplicaciones biotecnolgicas de las lipasas.

Marco Terico
Masa molecular y punto isoelctrico

La mayora de las lipasas presenta masas moleculares entre 27 y 60 kDa.

Sin embargo, se 126 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XII No. 1 Julio 2010 124-
140 conocen algunos ejemplos de lipasas con masas moleculares ubicadas
fuera de este intervalo. Los puntos isoelctricos que se han informado para
la mayor parte de las enzimas e isoenzimas de diversos orgenes se

encuentran entre 3,8 y 7,3 (tabla 1).

Plegamiento y aminocidos catalticos

Las lipasas presentan un dominio estructural cannico compuesto por ocho

cadenas que forman una hoja . Estas cadenas estn conectadas por
hlices , que quedan empaquetadas a ambos lados de la hoja . Este
ncleo central es el responsable directo de la actividad cataltica y define el

BIOQUIMICA 2
 LIPASAS

plegamiento /-hidrolasa, comn para muchas hidrolasas de orgenes

filogenticos y funciones catalticas diferentes (Ollis et al., 1992).

La actividad funcional de las lipasas se sustenta en la trada de aminocidos

clsica: nuclefilo-cido-histidina (Alam et al., 2002; Mead et al., 2002),
dilucidada inicialmente para las proteasas sernicas (Carter y Wells, 1988).
Los elementos de la trada se ubican en lazos muy bien conservados del
dominio cataltico. El nuclefilo, generalmente una serina, se localiza en un
giro que conecta una cadena con una hlice (Petersen, 1996), en el
contexto secuencial pequeo-x-nuclefilo-x-pequeo; donde x es cualquier
aminocido y pequeo se refiere a un aminocido poco voluminoso
(Ransac et al., 1996). Solo la histidina est completamente conservada en
la trada de las lipasas (Derewenda et al., 1994a), cuyo arreglo topolgico y
secuencial es la imagen especular de la trada de las proteasas sernicas
(Ollis et al., 1992) (figura 1).

Centro activo

El centro activo de las lipasas permanece protegido por una cubierta que
impide la entrada del sustrato. Este solo tiene acceso cuando la enzima se
encuentra en su conformacin activa y la cubierta se ha desplazado
(Derewenda et al., 1994b; Miled et al., 2003). Est cubierta puede ser una
hlice anfiflica (Lotti y Alberghina, 1996) o un lazo (Hui y Howles, 2002).
La estructura nativa de las lipasas es un sistema dinmico de
interconversin entre la estructura cerrada, que predomina en ambientes
homogneos, y la estructura abierta, que se estabiliza en las interfaces
lpido-agua (Grochulski et al., 1994a; Guisn et al., 1996a). Las estructuras
tridimensionales de algunas lipasas en sus conformaciones activas se han

BIOQUIMICA 3
 LIPASAS

determinado por cristalografa y difraccin de rayos X (Derewenda et al.,

1994b; Kim et al., 1997; Tyndall et al., 2002; Ericsson et al., 2008).

Adems del centro activo principal, las lipasas pancreticas humana y

porcina, y otras de origen microbiano, presentan en su regin C-terminal lo
que parece ser un sitio cataltico mnimo. Este pudiera ser responsable de la
actividad enzimtica frente a sustratos hidrosolubles como los steres del p-
nitrofenol (De Caro et al. 1986). Por otra parte, esta actividad tambin
pudiera explicarse por las transiciones conformacionales que experimentan
estas enzimas, aun en ambientes homogneos, dadas por la interconversin
estructura cerrada-estructura abierta (Kim et al., 1997).

En su conformacin activa, las lipasas presentan en su centro activo un

grupo de residuos hidrofbicos dispuestos alrededor de la serina cataltica
que constituyen una regin electroflica conocida como cavidad oxianinica
(Grochulski et al., 1994b). Adems, aparece una superficie
significativamente apolar alrededor de la entrada al centro activo que se
conoce como zona de contacto lipdico (Okkels et al., 1996). Tambin estn
presentes algunas mol- culas de agua que participan en interacciones
importantes para mantener una conformacin del sitio activo
catalticamente competente (Triantafyllou et al., 1993).

Activacin interfacial

De manera general, las lipasas son enzimas que requieren de activacin

interfacial para desplegar al mximo su actividad cataltica (Malcata, 1996;
Ransac et al., 1996). Este fen- meno consiste en el incremento de la
actividad enzimtica en presencia de interfaces lpidoagua (Sarda y
Desnuelle, 1958; Chahinian et al., 2002). Se entiende por interface a la
superficie imaginaria que separa dos porciones del espacio homogneas y
distintas fsicamente. A nivel molecular, una interface consiste en un
conjunto de dos capas adyacentes de molculas ordenadas con diferente
carcter hidrofbicohidroflico (Malcata, 1996)

Cuando la enzima entra en contacto con una interface, el ambiente

dielctrico en la superficie proteica se modifica, en el sentido de potenciar
las interacciones electrostticas. Ello posibilita que la cubierta del centro
activo se Figura 1. Diagrama esquemtico del plegamiento /-hidrolasa,
presente en el dominio cataltico cannico de las lipasas. Flechas: cadenas
. Rectngulos: hlices . Conexiones: lazos. Puntos: residuos que
componen la trada cataltica (nuclefilo, cido, histidina). N y C: extremos
amino y carboxilo-terminal. 128 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XII No. 1 Julio
2010 124-140 desplace (Grochulski et al., 1994a; Petersen, 1996; Foresti y
Ferreira, 2004), y se produce una reestructuracin en la conformacin de la
molcula (Jensen et al., 2002; Aloulou et al., 2006; Lin et al., 2007). Como
resultado, los aminocidos catalticos quedan expuestos al solvente en una

BIOQUIMICA 4
 LIPASAS

orientacin adecuada, y alrededor de stos se conforma la cavidad

oxianinica, por exposicin de determinados residuos hidrofbicos e
internalizacin de otros hidroflicos (Ransac et al., 1996). Adems, se
estructura la zona de contacto lipdico en la vecindad del centro activo y de
la cubierta mvil (Grochulski et al., 1994a; Jensen et al., 2002). Todo esto
incrementa la afinidad de la enzima por sus sustratos lipdicos y contribuye
a la estabilizacin del estado de transicin durante el ciclo cataltico
(Malcata, 1996; Ransac et al., 1996; Mead et al., 2002).

Las caractersticas fsico-qumicas del sustrato tambin contribuyen de

manera significativa a la activacin interfacial (Egmond, 1996). En el estado
agregado, los triacilglicridos exhiben un grado de ordenamiento elevado,
que minimiza el nmero de estados conformacionales que pueden presentar
estas molculas en solucin acuosa, debido a la gran flexibilidad de sus
cadenas de cidos grasos. Este efecto tiene implicaciones favorables para el
reconocimiento enzima-sustrato (Petersen, 1996) (figura 2).

Agregacin molecular

Dado el carcter hidrofbico de la zona de contacto lipdico cercana al

centro activo, no es descartable su interaccin con otras sustancias de su
misma naturaleza presentes en el medio, incluyendo las zonas hidrofbicas
de otras molculas de enzima. Estas interacciones conduciran a la
formacin de agregados (Snellman et al., 2002) con baja o ninguna
actividad cataltica, debido al bloqueo de los centros activos por las propias
molculas enzimticas. El fenmeno de agregacin en soluciones acuosas
ha sido demostrado experimentalmente por varios grupos de investigadores
(Flaschel y Renken, 1991; Guisn et al., 1996b; Palomo et al., 2003), los
que obtuvieron un rpido descenso de la actividad enzimtica al aumentar
la concentracin de enzima (Pedersen et al., 2006).

Especificidad y selectividad

Si bien las lipasas han sido definidas como enzimas especficas para
catalizar la separacin hidroltica de los cidos grasos de cadena larga

BIOQUIMICA 5
 LIPASAS

presentes en los acilgliceroles (Snellman et al., 2002), los cuales son sus
sustratos naturales, muy pocas lipasas son especficas en sus reacciones.
Por este motivo, el trmino especificidad se ha ido reemplazando en la
literatura por el de selectividad, el cual describe mucho mejor el
comportamiento reactivo de estas hidrolasas. En ltima instancia, la
determinacin de la especificidad de una lipasa depende de la sensibilidad
del mtodo empleado para ello (Jensen y Hamosh, 1996).

Las lipasas pueden ser selectivas por la clase de lpido (Bornscheuer et al.,
1994; Li et al., 2009) y por la posicin (Berner y Hammond, 1970) y el tipo
de cido graso (Snellman et al., 2002; Zouari et al., 2005). Estas enzimas
pueden ser adems estereoselectivas (Cygler et al., 1995), y alcanzan a
distinguir entre enantimeros, frente a sustratos rac- micos, o entre
grupos enantiotpicos, para triacilglicridos proquirales (Bornscheuer 2002).
Por ltimo, pueden establecerse ciertas combinaciones entre los tipos de
selectividades anteriores (Jensen et al., 1994).

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica

El efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad lipasa ha sido

ensayado con diferentes sustratos para enzimas de diversas fuentes. En la
tabla 2 se presentan algunos resultados que se han informado para lipasas
en sus formas solubles.

BIOQUIMICA 6
 LIPASAS

El efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica

tambin se ha evaluado para lipasas inmovilizadas. En esos casos, se
obtienen valores aparentes de los parmetros cinticos, ya que estos se
encuentran sesgados por las condiciones de la inmovilizacin (Tutar et al.,

2009).

Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimtica

Las condiciones ptimas de pH dependen, entre otros factores, del sustrato

(Berner y Hammond, 1970) y del tampn empleados (Chvez et al., 1990).
El pH ptimo para las lipasas se encuentra generalmente en el intervalo
entre 7,0 y 9,0 (tabla 3), cuando la actividad enzimtica se ensaya frente a
sus sustratos especficos, como el aceite de oliva, la tributirina, otros
triacilglicridos peque- os y la triolena (Ra et al., 1993; Prazeres et al.,
1996). No obstante, para algunas lipasas, el pH ptimo se encuentra en la
regin acdica. Asimismo, se han encontrado lipasas con la mayor actividad
a valores de pH ms alcalinos (tabla 3).

BIOQUIMICA 7
 LIPASAS

Tambin puede suceder que se obtenga ms de un valor de pH ptimo,

manteniendo invariables las dems condiciones del ensayo (Kiyotani et al.,
1983). Esto suele ocurrir para lipasas obtenidas a partir de extractos crudos
o para mezclas heterogneas con actividad lipoltica (Berner y Hammond,
1970). La inmovilizacin puede variar el valor de pH ptimo de las lipasas
con respecto a sus formas solubles (Wei y Wu, 2008), en dependencia del
grado de exposicin resultante de sus centros activos (Balco et al., 1996).

La temperatura ptima para una enzima depende, entre otros factores, del
sustrato con el que se trabaje, ya que los ligandos ejercen un efecto
protector frente a la desnaturalizacin trmica (Chvez et al., 1990). La
temperatura ptima para las lipasas puede encontrarse en el intervalo entre
35 y 50 C, aunque existen lipasas termoestables que exhiben valores de
temperatura ptima superiores a 50 C (tabla 3).

El medio en el que se encuentre la enzima tambin influye en el valor de

temperatura ptima. De este modo, las lipasas presentes en preparados
crudos, con altas concentraciones de otras protenas contaminantes
distintas de las proteasas, sern ms estables y exhibirn valores aparentes
de temperatura ptima superiores (Chvez et al., 1990). La inmovilizacin
puede producir incrementos en los valores de temperatura ptima de las
lipasas solubles (Palomo et al., 2004; Wei y Wu, 2008), debido a su efecto
sobre la estabilidad enzimtica (Balco et al., 1996).

Inhibidores, inhibicin y efecto de aditivos sobre la actividad

enzimtica

Las lipasas son inhibidas por los organofosfatos (Kordel y Schmid, 1991;
Cavalier et al., 2000), como el dietil-p-nitrofenilfosfato y el diisopropil-

BIOQUIMICA 8
 LIPASAS

fluorofosfato (Bhardwaj et al., 2001), por las carbodiimidas en presencia de

nuclefilos, como el glicin-etil ster, y por el iodo. Tambin son inhibidores
de lipasas los cidos bornicos y el fenil-metil-sulfonilfluoruro (Dandavate et
al., 2009), as como los metales pesados, el EDTA (Snellman et al., 2002;
Dandavate et al., 2009), algunos terpenos (Morikawa et al., 2009), los iones
halgenos, los alcaloides, el cloroformo, el n-hexanol, el dietil-fenil
carbonato, el bromoformo, varias lactonas (Colowick y Kaplan, 1955; Kordel
y Schmid, 1991) y algunos 1,2-etilen-di-N-alquilcarbamatos en presencia de
detergentes (Lin et al., 2007). Algunos cationes metlicos pueden producir
inhibicin (Wu et al., 1996; Snellman et al., 2002; Park et al., 2008;
Dandavate et al., 2009).

Los inhibidores de naturaleza proteica son ms especficos por su lipasa

blanco, como es el caso del aislado a partir de la harina de trigo, que inhibi
a la lipasa pancretica, pero no fue capaz de inhibir completamente la
actividad lipasa de Candida cylindracea y no ejerci ningn efecto sobre
otras lipasas aisladas de micobacterias (Tani et al., 1994). Algunas protenas
hidrofbicas, como la albmina de suero bovino, inhiben a las lipasas
mediante su unin competitiva a las interfaces (Larsson y Erlanson-
Albertsson, 1983). Para varias lipasas se han informado los fenmenos de
inhibicin por exceso de sustrato, frente a triolena (Biesiot y Capuzzo,
1990; Prazeres et al., 1996), e inhibicin por producto, causado por los
cidos grasos (Larsson y Erlanson-Albertsson, 1983). Los detergentes (Tsai
et al., 1996; Brockman, 2000) y las emulsiones de varios solventes
orgnicos (Sugiura e Isobe, 1975) pueden actuar como inhibidores de las
lipasas. Algunos autores han informado inhibicin competitiva causada por
concentraciones elevadas de detergentes (Kimura et al., 1982).

La actividad lipasa puede ser afectada de diferentes maneras por la

presencia de iones metlicos en la preparacin, los que pueden estabilizar o
desestabilizar la estructura de estas enzimas en solucin (Tyndall et al.,
2002). Muchas lipasas requieren del ion Ca2+ para mantener una
conformacin estable y/o catalticamente competente (Amada et al., 2001;
Snellman et al., 2002). Adems del efecto inhibitorio ya mencionado, los
cationes metlicos tambin pueden actuar como activadores de las lipasas
(Kimura et al., 1982; Snellman et al., 2002; Dandavate et al., 2009). El
efecto activador del Ca2+ puede manifestarse como un incremento de la
Vmx y/o un decremento de la KM (Kimura et al., 1982). Algunos iones
provocan efectos opuestos en lipasas diferentes (Wu et al., 1996; Snellman
et al., 2002). Tambin pueden influir sobre la actividad de estas enzimas el
tampn (Alston y Freedman, 2001), el solvente (Sugiura e Isobe, 1975;
Triantafyllou et al., 1993; Sharma et al., 2002; se basa en su capacidad de
quelar el Ca2+. Los detergentes o surfactantes son aditivos de primera
importancia para la actividad lipoltica (Dandavate et al., 2009), puesto que
intervienen en la formacin de micelas a partir de la dispersin de los

BIOQUIMICA 9
 LIPASAS

grandes agregados hidrofbicos en que se organizan espontneamente los

sustratos naturales de estas enzimas en solucin acuosa. Esto trae como
consecuencia un incremento notable del rea superficial disponible para la
interaccin enzima-sustrato, con el consiguiente efecto sobre la velocidad
de la reaccin (Egmond, 1996). Estas sustancias pueden adems formar
micelas invertidas en solventes orgnicos con un contenido de agua
moderado, lo que puede traducirse en una mayor actividad y estabilizacin
de las molculas enzimticas ubicadas en su interior (Shome et al., 2007).
Los detergentes tambin pueden in- 132 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XII
No. 1 Julio 2010 124-140 fluir sobre las propiedades estereoselectivas de
las lipasas (Tsai et al., 1996). Dandavate et al., 2009) y la fuerza inica del
medio (Mead et al., 2002). El efecto inhibitorio del EDTA se basa en su
capacidad de quelar el Ca2+.

Los detergentes o surfactantes son aditivos de primera importancia para la

actividad lipoltica (Dandavate et al., 2009), puesto que intervienen en la
formacin de micelas a partir de la dispersin de los grandes agregados
hidrofbicos en que se organizan espontneamente los sustratos naturales
de estas enzimas en solucin acuosa. Esto trae como consecuencia un
incremento notable del rea superficial disponible para la interaccin
enzima-sustrato, con el consiguiente efecto sobre la velocidad de la reaccin
(Egmond, 1996). Estas sustancias pueden adems formar micelas invertidas
en solventes orgnicos con un contenido de agua moderado, lo que puede
traducirse en una mayor actividad y estabilizacin de las molculas
enzimticas ubicadas en su interior (Shome et al., 2007). Los detergentes
tambin pueden in- 132 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XII No. 1 Julio 2010
124-140 fluir sobre las propiedades estereoselectivas de las lipasas (Tsai et
al., 1996).

Sin embargo, el efecto de los detergentes no es homogneo para todas las

enzimas, ni stas son afectadas del mismo modo por todos los surfactantes
(Aloulou et al., 2007). Adems, la influencia de estos compuestos sobre la
actividad lipasa es dependiente de la dosis (Sonesson et al., 2006). Las
sales biliares son activadores fundamentales para las lipasas pancreticas
de mamferos en presencia de colipasa (Kimura et al., 1982; Larsson y
Erlanson-Albertsson, 1983), y resultan inhibitorias para otras lipasas
(Barnescu et al., 1997). El SDS, conocido por su efecto desnaturalizante
sobre las protenas, activa a determinadas lipasas e inhibe a otras (Wu et
al., 1996). Algunos detergentes no inicos previenen la formacin de
agregados enzimticos (Palomo et al., 2003) y estabilizan estructuralmente
a la molcula (Guisn et al., 1996b). El Triton-X100 es un detergente no
inico conocido por su capacidad de estimular la actividad de las lipasas
(Sharma et al., 2002).

BIOQUIMICA 10
 LIPASAS

Mtodos de determinacin de la actividad enzimtica

La actividad esterasa ms general puede determinarse empleando como

sustratos los steres de cadena aclica del p-nitrofenol o del /-naftol,
siguiendo la liberacin de la base alcohlica por mtodos
espectrofotomtricos. Deben considerarse los distintos coeficientes de
extincin del p-nitrofenol a diferentes valores de pH, la ausencia de
absorbancia a pH cido, y la ocurrencia de hidrlisis espontnea a pH bsico
(De Caro et al., 1986; Gupta et al., 2003).

Se han desarrollado numerosos ensayos para cuantificar la actividad

hidroltica de las lipasas en distintas muestras biolgicas. stos permiten
monitorear tanto el consumo de los sustratos como la liberacin de los
productos en el tiempo (Beisson et al., 2000). La desaparicin de los
sustratos puede seguirse por nefelometra o turbidimetra (von Tigerstrom y
Stelmaschuk, 1989). Sin embargo, algunas variantes de estos mtodos
experimentan interferencias debidas a la complejidad de ciertas mezclas. El
consumo de los sustratos tambin puede ser monitoreado por mtodos
espectrofotomtricos (Goujard et al., 2009), tensiometra interfacial
(Aloulou et al., 2007), microscopa de fuerza atmica (Prim et al., 2006) y
espectroscopa infrarroja. Los ltimos tres mtodos requieren un
equipamiento costoso.

El anlisis de la velocidad de liberacin de los cidos grasos puede

efectuarse indirectamente mediante el seguimiento de los protones
liberados durante la hidrlisis enzimtica. El mtodo de pH-stat, que se
fundamenta en la valoracin de la disminucin del pH en el tiempo, es una
de las tcnicas ms utilizadas bajo este principio (Bertolini et al., 1995). Los
cidos grasos liberados por la actividad de la lipasa se ionizan en solucin
acuosa mediante la prdida de protones y la mezcla de reaccin tiende a
acidificarse. La velocidad de liberacin de los cidos grasos es proporcional
a la velocidad de liberacin de los protones y, por tanto, a la velocidad de
acidificacin del medio. Si se aade NaOH a la misma velocidad a la que se
liberan los protones, el pH de la mezcla se mantiene constante en el tiempo.
Este ensayo consiste en registrar la velocidad a la que es necesario aadir el
NaOH titulante a la mezcla de reaccin, a fin de mantener el pH en un valor
fijo. Esta velocidad es proporcional a la velocidad de hidr- lisis enzimtica
de los enlaces ster del sustrato y, por tanto, su medicin permite
determinar la actividad de la enzima. La tcnica de pH-stat se ha empleado
para cuantificar la actividad lipasa en plantas, suero, plasma y secrecin
duodenal. El ensayo presenta un lmite de deteccin en el orden de 0,1
mol/min y solo puede desarrollarse en un intervalo restringido de valores
de pH, los que deben igualar o exceder el valor aparente de pKa de los
cidos grasos liberados, ya que stos deben encontrarse parcialmente
ionizados (Beisson et al., 2000).

BIOQUIMICA 11
 LIPASAS

Otra forma de medir la liberacin de protones durante el avance de la

reaccin es mediante el empleo de indicadores coloreados, Lipasas:
potencial para la adsorcin interfacial y la biocatlisis 133 cuyos espectros
de absorcin cambian con la variacin del pH. Estos mtodos son poco
especficos y pueden detectar cualquier enzima que acidifique el medio
(Lobo de Arajo y Radvanyi, 1987). Tambin es posible medir directamente
la disminucin en el pH, pero esta variante es muy poco sensible y los
cambios de pH pueden quedar enmascarados por la accin del tampn (Tan
y Tan, 1988).

La cuantificacin de los cidos grasos liberados durante el transcurso de la

reaccin se ha abordado utilizando mtodos colorim- tricos que apelan a
reactivos cromognicos cuyas absorbancias varan al interactuar con estas
molculas. Para garantizar una seal de fondo lo ms baja posible, los
triacilglicridos empleados como sustratos no deben contener cantidades
elevadas de cidos grasos libres acompaantes. Tambin se han
desarrollado ensayos fluorimtricos (Knotz et al., 2006), basados en la
interaccin entre los cidos grasos liberados y determinados fluorforos.
Estos mtodos son muy sensibles y costosos. La cromatografa en placa fina
permite cuantificar los cidos grasos liberados mediante tcnicas
densitomtricas o autorradiogrficas. Este mtodo es discontinuo y
consume mucho tiempo. La separacin entre el sustrato y los productos
radiactivos tambin puede realizarse mediante HPLC, centrifugacin o
extraccin con solventes. El ensayo radioisotpico es muy especfico y
sensible, y su lmite de deteccin es del orden de los picomoles. Su
inconveniente principal radica en el empleo de triacilglicridos sintticos
marcados radiactivamente (Beisson et al., 2000).

Esta variedad de ensayos enzimticos proporciona amplias posibilidades al

investigador en este campo, pero al mismo tiempo dificulta la comparacin
entre los resultados obtenidos en distintos laboratorios mediante el empleo
de mtodos diferentes. Esto se debe a que las condiciones del ensayo
influyen sobre la velocidad de la reaccin catalizada enzimticamente
(Chvez et al., 1990).

Inmovilizacin

Las ventajas derivadas de la inmovilizacin de enzimas tambin son

aplicables a las lipasas. Debido a la hidrofobicidad marcada que presentan
los sustratos naturales de estas enzimas, las mezclas de reaccin en las que
ellas operan deben contener un solvente org- nico o un agente
emulsificante apropiados, que traen consigo la ruptura de la homogeneidad
del medio. Bajo estas condiciones, es deseable que la lipasa constituya una
fase independiente dentro del sistema de reaccin, a fin de prevenir la
contaminacin de los productos con cierto nivel de actividad enzimtica
residual. Esta aspiracin tecnolgica puede alcanzarse con la inmovilizacin,

BIOQUIMICA 12
 LIPASAS

la que adems extiende el tiempo de vida til del reactor (Balco et al.,
1996; Kneevi et al., 2004). Se ha desarrollado una variedad amplia de
protocolos de inmovilizacin para las lipasas (tabla 4).

Inmovilizacin por adsorcin interfacial

Uno de los protocolos de inmovilizacin ms difundidos para las lipasas es la

adsorcin selectiva sobre soportes con cierto grado de hidrofobicidad
(Fernndez-Lafuente et al., 1998). Segn la propuesta de Bastida et al.
(1998), los soportes hidrofbicos mimetizan las interfaces formadas por los

sustratos naturales de las lipasas, por lo que estas enzimas se adsorben

fuertemente sobre ellos en una forma abierta e hiperactivada, involucrando
la zona de contacto lipdico (Okkels et al., 1996). Esta interaccin no es un
efecto de asociaciones hidrofbicas, ya que se produce a fuerzas inicas
bajas (Bastida et al., 1998; Fernndez-Lafuente et al., 1998; Sabuquillo et
al., 1998; Snellman et al., 2002) y las lipasas son protenas muy hidroflicas
(FernndezLafuente et al., 1998). Por tanto, este es un mecanismo de
adsorcin interfacial, basado en la activacin interfacial y propia solo de
protenas con actividad superficial como las lipasas.

Entre las bondades que presenta el mtodo de inmovilizacin por adsorcin

interfacial pueden citarse la sencillez de la tcnica, la ausencia de reactivos
caros y txicos, la capacidad para retener o incrementar la actividad
especfica (Malcata et al., 1992; Palomo et al., 2004; Cunha et al., 2009), la
potenciacin de la estereoselectividad de la lipasa (Bastida et al., 1998;

BIOQUIMICA 13
 LIPASAS

Fernndez-Lafuente et al., 1998), y la posibilidad de recuperar el soporte,

debido a la reversibilidad parcial de las interacciones (Balco et al., 1996).

Entre los soportes ms utilizados para estos fines se encuentran aquellos

basados en la activacin de la agarosa con grupos hidrofbicos como butilo,
fenilo y octilo (Bastida et al., 1998; Sabuquillo et al., 1998;
FernndezLafuente et al., 1998; Cunha et al., 2009). La fortaleza de la
adsorcin de las lipasas sobre octyl-agarosa es de tal magnitud, que se
requieren altas concentraciones de detergente, urea o guanidina para
romper las interacciones (Fernndez-Lafuente et al., 1998)

Aplicaciones biotecnolgicas

Las enzimas son catalizadores biolgicos extraordinariamente especficos y

de gran poder cataltico. La aplicacin industrial de la tecnologa enzimtica
es particularmente interesante en procesos que requieren condiciones de
reaccin suaves, en trminos de pH, temperatura y presin, debido a la
labilidad de la mezcla. Estas molculas se requieren en cantidades
pequeas, pueden distinguir entre grupos funcionales de reactividad similar
y son capaces de modificar un sustrato dado dentro de una mezcla
compleja, llegando a discriminar incluso entre dos ismeros pticos en el
caso de compuestos quirales. En la literatura especializada puede
encontrarse abundante documentacin sobre el empleo de enzimas en la
obtencin de principios activos (Klibanov, 1990).

Las lipasas son enzimas con una aplicacin amplia en diferentes procesos
industriales, particularmente en sus formas inmovilizadas. Ellas se emplean
en la produccin de detergentes y de saborizantes naturales (Pandey et al.,
1999), en la hidrlisis de aceites y grasas (Taylor, 1996), en la produccin
de papel (Jaeger y Reetz, 1998) y en la elaboracin de cosmticos
(Benjamin y Pandey, 1998). Debido a su capacidad de catalizar la sntesis
de determinados compuestos en medios orgnicos con actividad de agua
controlada (Dandavate et al., 2009; Tabla 4. Algunos mtodos de
inmovilizacin empleados para las lipasas Fuente Soporte Mtodo Referencia
Candida cylindracea Alginato de sodio Atrapamiento Hertzberg et al. 1992
Pncreas porcino Celite, esferas de vidrioaminopropil, silanizado y con
lavado cido. Adsorcin fsica Martins et al., 1994 C. antrctica Resina
acrlica Enlazamiento inico Claon y Akoh, 1994 C. rugosa Polipropileno
Adsorcin fisica Lpez et al., 2001 C. antrctica A y B, C. rugosa,
Rhizomucor miehei, Rhyzopus oryzae Sulfato-dextrana-MANAEagarosa CL
4B Enlazamiento inico Fuentes et al., 2004 Pncreas porcino Esferas de
criogel polivinil-alcohol Enlazamiento covalente Markvicheva et al., 2005
Arthrobacter sp. Materiales hidrofbicos sol-gel Encapsulacin Yang et al.,
2009 Thermomyces lanuginosa Glutaraldehdo Entrecruzamiento Gupta y
Khare, 2009 Lipasas: potencial para la adsorcin interfacial y la biocatlisis
135 Gupta y Khare, 2009), las lipasas se han empleado en la produccin de

BIOQUIMICA 14
 LIPASAS

intermediarios para la sntesis orgnica (Vaidya, 1996), as como de

penicilinas (Savidge, 1984).

Las lipasas han sido utilizadas extensivamente en la obtencin de

compuestos pticamente puros (Yoshimura et al., 2002) y en la resolucin
de mezclas racmicas (Kirchner et al., 1985; Felluga et al., 2009),
aprovechando sus propiedades estereoespecficas (Bornscheuer, 2002;
Segura et al., 2004). Esta aplicacin tiene un impacto considerable en la
produccin de frmacos ms selectivos y efectivos, con efectos secundarios
menores, y en la obtencin de pesticidas con menor incidencia en el medio
ambiente (Zarevcka y Wimmer, 2008). Esto se debe a que la actividad
funcional de los compuestos quirales es debida generalmente a uno de los
enantimeros, mientras que el otro es inocuo o perjudicial, y puede reducir
la actividad del primero, provocar reacciones colaterales indeseadas, o
simplemente aportar una contribucin innecesaria a la dosis teraputica con
su presencia en la mezcla (Ariens, 1984).

Caso clnico

En un paciente diagnosticado con pancreatitis, cules seran los resultados

esperados en un examen de laboratorio completo?

DESARROLLO:

Leucocitos: Elevados, es de esperarse una leucocitosis a base de

una neutrofilia. La neutrofilia ocasionada por necrosis de los acinos
pancreticos como resultado de la autodigestin enzimtica.
Bilirrubina: La obstruccin del conducto coldoco es la complicacin
ms frecuente de la pancreatitis crnica despus de la formacin del
pseudoquiste. Los reportes que se basan en los niveles elevados de
fosfatasa alcalina o bilirrubina. La bilirrubina esperada es del tipo
directo o conjugada.
Amilasa: En Pancreatitis aguda la actividad puede aumentar en unas
pocas horas y se mantiene elevada por tres a cuatro das, en caso
que se de una complicacin estos niveles pueden mantenerse por un
periodo ms prolongado.
Lipasa: Puede considerarse un marcador especfico de enfermedad
heptica. La enzima puede aumentar mucho en casos de pancreatitis
aguda, incluso 10 veces su nivel normal.
Glucosa: Tambin en casos avanzados de pancreatitis crnica puede
haber aumento de los niveles de glucosa ("azcar") en sangre al
disminuir los niveles de insulina producida por el pncreas. A su vez
podemos esperar valores elevados de hemoglobina glicosilada cuando
la descompensacin de la glucosa es prolongada.

BIOQUIMICA 15
 LIPASAS

Es necesario tambin solicitar pruebas enzimticas de insulina y

glucagn para evaluar la produccin de estas.
Calcio: disminuye debido a una produccin reducida de hormona
paratiroidea durante la pancreatitis.

PANCREATITIS

CLINICA

Dolor abdominal: Es el sntoma principal de la pancreatitis aguda. El

dolor puede variar desde una leve molestia tolerable hasta un sufrimiento
intenso, constante e incapacitante. En ocasiones su comienzo es brusco
pero en otras oportunidades est precedido por crisis dolorosas
reiterativas de intensidad moderada.De forma caracterstica el dolor, que
es constante y sordo, se localiza en el epigstrio y la regin periumbilical,
y a menudo se irradia hacia la espalda, el trax, los flancos y la regin
inferior de abdomen.

Nauseas, vmitos: Son frecuentes y se deben a la hipomotilidad gstrica

y a la peritonitis qumica. Si bien por lo general son biliosos, el vmito
abundante de tipo gstrico denota obstruccin litisica completa de la
papila.

Distensin abdominal.
Taquicardia.
Hipotensin.
Fiebre: En la fase inicial de la enfermedad suele ser de origen txico-
inflamatorio, no infeccioso, salvo en los casos de colangitis asociada.
Hipersensibilidad y rigidez muscular en el abdomen, ruidos
hidroareos disminuidos o ausentes.
Signos pulmonares: estertores basales, atelectasia y derrame
pleural; este ltimo es ms frecuente en el lado izquierdo.
Shock: Puede obedecer a las siguientes causas:
- Hipovolemia secundaria a la exudacin de protenas plasmticas
hacia el espacio retroperitoneal (quemadura retroperitoneal).
- Mayor formacin y liberacin de pptidos de cininas que producen
vasodilatacin y aumento de la permeabilidad vascular.
- Efectos sistmicos de las enzimas proteolticas y lipolticas
liberadas en la circulacin.
Signo de Cullen y Turner: Es la aparicin de una coloracin azulada
periumbilical o en los flancos respectivamente, es muy infrecuente

BIOQUIMICA 16
 LIPASAS

(menor al 3%) pero es un indicador de gravedad; su origen es la

infiltracin hemorrgica del epipln menor, ligamento redondo o
retroperitoneo en las pancreatitis agudas necrotizantes.
Ictericia: se da en el 20 al 30% de los casos. En los casos leves, su
causa ms frecuente es la obstruccin litisica de la papila. En los
ataques graves lo ms habitual es que la ictericia sea el resultado de
una falla heptica temprana, sobre todo cuando la etiologa del
ataque es el alcohol.
Falla multiorgnica: luego de las 72 horas de evolucin, el dolor y
los vmitos disminuyen, pero en los ataques graves los signos de
falla multiorgnica dominan el cuadro.
Flemn pancretico: signo tardo del examen fsico, aparece en el
30 al 40% de los ataques graves y por lo general corresponde al
pncreas y tejido peripancretico inflamado. Se lo reconoce como una
masa supraumbilical dura, extendida transversalmente y de tamao
variable. En ocasiones, una coleccin lquida de gran tamao puede
exteriorizarse tempranamente por una masa palpable

LABORATORIO

ENZIMAS PANCREATICAS:

La sensibilidad de las enzimas pancreticas sricas en el diagnstico de

pancreatitis aguda es diferente y depende bsicamente de la velocidad con que
cada una de ellas se aclara de la circulacin. Sobre la base de este aclaracin de
enzimas circulantes, el punto de corte de sus niveles sricos para el diagnstico
de la pancreatitis aguda no puede ser fijo (habitualmente 2-3 veces por encima
del lmite superior de la normalidad), sino variable, dependiendo del tiempo
transcurrido desde el inicio de la enfermedad.

Amilasa total

La concentracin srica de amilasa se usa de forma generalizada como prueba de

deteccin sistemtica para la pancreatitis aguda en el paciente con dolor
abdominal agudo o el dolor de espalda.

Aproximadamente, el 85% de los pacientes con pancreatitis aguda presentan

un aumento de la amilasa srica. La amilasa srica suele aumentar en la
primeras 24hs del proceso y permanece elevada durante 1 a 3 das. Las cifras
retornan a la normalidad en 3 a 5 das, salvo en el caso que exista necrosis
pancretica extensa, obstruccin incompleta de los conductos o formacin de

BIOQUIMICA 17
 LIPASAS

pseudoquistes Por este motivo su sensibilidad cae a valores del 30% a partir
de las 48hs de inicio del dolor abdominal

Un valor mayor a 65UI/L har cuestionable una pancreatitis aguda; una

concentracin mayor a 130UI/L hace ms probable el diagnstico y valores
3 veces mayores de lo normal lo establecen, siempre que se haya excluido
otros procesos que elevan la amilasa. Adems del pncreas son varios los
rganos capaces de producir amilasa: las glndulas salivales, las trompas de
Falopio, los ovarios, el intestino delgado, el pulmn, la prstata y el hgado. Sin
embargo en la prctica, y en condiciones normales, solo el pncreas y las
glndulas salivales contribuyen en forma significativa al mantenimiento de los
niveles sricos de esta enzima. Los valores de la amilasa en suero son de
utilidad solo para el diagnstico, no guardan correlacin con la severidad del
cuadro, por lo tanto no tienen valor pronstico.

Su sensibilidad es del 83%, su especificidad del 88% y su valor predictivo

positivo del 65%.

La siguiente tabla muestra los trastornos que pueden generar falsos

positivos en esta prueba.

ENFERMEDADES TRANSTORNOS NO OTROS TRANSTORNOS

PANCREATICAS PANCREATICOS ABDOMINALES
Pancreatitis - Insuficiencia renal - Colecistitis
crnica. - Lesin de las - Litiasis del coldoco
glndulas salivales - lcera perforada
Traumatismo - Cncer de pulmn, - Infarto intestinal
pancretico esfago, mama, - Peritonitis
ovario. - Aneurisma artico
- Macroamilasmia - Hepatopata crnica
Cncer de
- Quemaduras - Apendicitis aguda
pncreas
- Embarazo - Obstruccin intestinal
- Traumatismo cerebral

Las siguientes son situaciones que pueden generar falsos negativos:

a) Si se retrasa (de 2 a 5 das) la obtencin de la muestra de sangre.

b) Si el trastorno subyacente es una pancreatitis crnica en vez de una

pancreatitis aguda.

BIOQUIMICA 18
 LIPASAS

c) Presencia de hipertrigliceridemia.

Lipasa

Es la segunda determinacin ms frecuentemente utilizada en el diagnstico

de la pancreatitis aguda. La lipasemia tiene la ventaja de que no se eleva en
algunas situaciones que son causa de falsos positivos de la amilasa, sin
embargo acompaa a la amilasa en los falsos positivos secundarios a
patologa biliar aguda, lcera perforada, obstruccin intestinal, trombosis
mesentrica y apendicitis aguda. La actividad de la lipasa srica aumenta de
forma paralela a la de la amilasa, y la determinacin de ambas enzimas
aumenta el rendimiento diagnstico.

Los niveles de lipasa pueden permanecer elevados de 7 a 14 das. La lipasa

puede ser ahora la enzima ms indicada para establecer un diagnstico de
pancreatitis aguda. Los avances en los sustratos y la tecnologa ofrecen al
mdico mejores opciones, especialmente cuando se recurre a un anlisis
turbidomtrico. Los nuevos anlisis de lipasa utilizan colipasa como cofactor
y estn totalmente automatizados

Su sensibilidad es de 94%, su especificidad del 96% y su valor predictivo

positivo del 86%.Los valores elevados de lipasa y de tripsina srica suelen
ser diagnsticos de pancreatitis aguda; estas pruebas son especialmente
tiles en los pacientes con hiperamilasemia de origen no pancretico

Isoamilasas

Otra posibilidad es fraccionar la amilasa en sus isoenzimas salivar(s) y

pancretica (p). La inhibicin de la izoenzima tipo S, por un doble
anticuerpo monoclonal, es un mtodo sencillo y rpido que permite juzgar la
elevacin aislada de la enzima de origen pancretico, evitando as la
confusin con hiperamilasemias extrapancreticas.

Hay que tener en cuenta que la determinacin de la isoamilasa no permite

diferenciar las causas intestinales de hiperamilasemia. Esto se debe a la
ausencia de la isoamilasa S por debajo del Angulo de treitz, de manera que
cualquier hiperamilasemia de origen intestinal se debe forzosamente a una
elevacin aislada de la isoamilasa P.

BIOQUIMICA 19
 LIPASAS

En el suero normal el 35 al 45% de la amilasa es de origen pancretico. En

los casos de pancreatitis aguda, la amilasa srica total vuelve a la
normalidad ms rpidamente que la isoamilasa pancretica, esta ltima
puede permanecer elevada de 7 a 14 das. Con respecto a esta prueba
algunos autores advierten que no suelen ser fiables cuando hay un aumento
mnimo o moderado de la amilasa total; en estos casos resulta til recurrir a
un anlisis del tripsingeno srico.

Fraccionamientos ms finos de las isoenzimas pancreticas, como puede ser

la determinacin de la subfraccin P3, caracterstica de la pancreatitis
aguda, son de escasa utilidad en la rutina por su complejidad.

Amilasuria y tasa de aclaracin de Amilasa/Creatinina

Es posible determinar enzimas en orina, sobre todo amilasa, tanto en

muestras de 24hs como en las recogidas de forma aislada, incluyendo
sencillas pruebas rpidas cualitativas. Estas determinaciones no suelen ser
de eleccin, ya que el perfil sintomtico del paciente con pancreatitis
justifica la obtencin de muestras sricas. Por otro lado tanto la amilasa
urinaria como la tasa de aclaracin de amilasa/creatinina, no superan en
sensibilidad ni en especificidad la determinacin de los niveles sanguneos
de amilasa. Sin embargo, en ocasiones es posible detectar niveles urinarios
de amilasa elevadas durante algo ms de un tiempo que en sangre, ya que
en algunos casos la elevacin de amilasa srica puede ser fugaz.

Otros

Tanto la fosfolipasa A2, como la tripsina inmunorreactiva y la elastasa-1-

pancretica requieren complejas determinaciones, y por ende su utilidad
prctica en la patologa de urgencias es limitada.

LABORATORIO GENERAL:

- Leucocitosis: Con desviacin a la izquierda secundaria al proceso

toxico inflamatorio pancretico que por lo tanto no indica infeccin.
- Hematocrito: En los casos ms graves puede haber
hemoconcentracin con valores de hematocrito que excedan el 50%,

BIOQUIMICA 20
 LIPASAS

debido a la prdida de plasma hacia el espacio retro pancretico y la

cavidad peritoneal.
- Hiperglucemia: Secundaria a mltiples factores, entre ellos la
menor produccin de insulina, el aumento en la liberacin de
glucagn y la mayor produccin de glucocorticoides y de
catecolaminas suprarrenales.
- Parmetros de Colestasis (BILIRRIBINA, FAL,
GAMAGLUTAMILTRANSPEPTIDASA Y TRANSAMINASAS): La
elevacin de estos parmetros es indicativa del compromiso del
drenaje biliar y apoya el origen biliar de esta enfermedad. La
hiperbilirrubinemia (mayor a 4mg/dl) aparece aproximadamente en el
10% de los pacientes y los niveles retornan a la normalidad en 4 a 7
das.
- Hipocalcemia: Se presenta en un 25% de los casos. Es indicativo de
necrosis grasa peripancretica, ya que se ha observado que existe
saponificacin intraperitoneal del calcio por los cidos grasos en zonas
de necrosis grasa, con grandes cantidades (hasta 6 gr.) disueltas o
suspendidas en el lquido asctico.

DIAGNOSTICO POR IMAGENES

Estudios Radiolgicos.

Aunque hay una o ms anomalas radiolgicas en ms del 50% de los

pacientes, los hallazgos son inconstantes e inespecficos. Entre ellos se
destacan en la Rx directa de abdomen:

- leo localizado que suele afectar el yeyuno (asa centinela).

- leo generalizado con niveles hidroaereos.
- Signo del colon interrumpido, que se debe a la dilatacin aislada del
colon transverso.
- Distensin duodenal con niveles hidroaereos
- La presencia de calcificaciones en el rea pancretica en ocasiones
puede sugerir una pancreatitis crnica de base.
- Masa que con frecuencia es un pseudoquiste.
- El principal valor de las radiografas convencionales en la pancreatitis
aguda consiste en ayudar a excluir otros diagnsticos, sobre todo una
vscera perforada.

Ecografa.

Suele ser el procedimiento inicial en la mayora de los pacientes en los que

se sospecha enfermedad pancretica. Su principal utilidad en la pancreatitis
aguda, es en el diagnostico etiolgico mediante la evaluacin de la vescula
y la va biliar. En cuanto al diagnstico ecogrfico de pancreatitis aguda, se
basa en la presencia de signos pancreticos y peripancreticos. El
agrandamiento de la glndula y los cambios en su forma y ecogenicidad son

BIOQUIMICA 21
 LIPASAS

signos frecuentes pero de valor relativo por su gran variabilidad en sujetos

normales. Sin embargo en la situacin clnica apropiada un pncreas
aumentado de tamao y deformado es suficiente para confirmar el
diagnstico. Un signo muy especfico es la separacin neta del pncreas con
respecto a los tejidos circundantes. En los ataques graves es comn la
presencia de colecciones liquidas bien definidas que asientan en los espacios
retrogstricos y pararrenal anterior izquierdo que tienen gran valor
diagnstico. Hay que tener en cuenta que su ya de por si baja sensibilidad
para el diagnstico de pancreatitis aguda se ve en la prctica reducida por
el hecho de la frecuente interposicin de gas, que impide la visualizacin de
la glndula en ms de la mitad de los casos en la fase inicial de la
enfermedad, sin embargo, el operador entrenado puede apreciar un
agrandamiento caracterstico de la glndula.

Tomografa Computada.

El papel fundamental de la TC es la clasificacin local de gravedad ms que

el diagnstico primario de pancreatitis aguda. No obstante, en casos de
diagnstico dudoso, por ligera o nula elevacin enzimtica en suero, o en
los casos de gravedad clnica en ausencia de dolor abdominal, el papel de la
TC el fundamental en el diagnstico de la enfermedad. En estos casos se
observa una glndula aumentada de tamao, de bordes mal definidos,
heterogeneidad del parnquima, presencia de colecciones lquidas.

Es ms sensible que la ecografa, a pesar de esto por razones de costo,

empleo de radiaciones ionizantes y reducida capacidad para evaluar el
sistema biliar, la tomografa con propsito diagnstico, solo est indicada
ante el fracaso de la ecografa para reconocer el pncreas.

La realizacin de una TC antes de las 48 hs. de evolucin desde el inicio

de la enfermedad, tiende a infravalorar la gravedad del cuadro local de
pancreatitis y por tanto, el momento idneo de su realizacin es entre las
48 y 72 hs.

CASO CLNICO 1.

Hombre de 45 aos de edad llega a la emergencia quejndose de dolor

severo en el epigastrio, nuseas y vmitos, los cuales han empeorado en los
ltimos das. Su abdomen es sensible al tacto a nivel epigstrico, sin seas
de rebote. Laboratorio manda los resultados.

BIOQUIMICA 22
 LIPASAS

En suero:

Fosfatasa alcalina: 100 u/l

Amilasa: 445 u/l

Lipasa: 1000 u/l

Bilirrubina total: 10 mg/dl

Sodio: 145 mEq/dl

Nitrgeno rico: 10 mg/dl

Potasio: 4 mEq/l

Cloruro: 110 mEq/l

Bicarbonato: 25mEq/dl

Glucosa: 130mEq/dl

Creatinina: 1mg/dl

Calcio: 9.5mEq/dl

DESARROLLO:

- Amilasa: 445 u/l, elevada por lo que sugiere enfermedad pancretica.

- Lipasa: 1000u/l, elevada marcador de enfermedad pancretica,
aumenta mucho en pancreatitis aguda.
- Glucosa: 130 mg/dl. Levemente elevada por lo que sugiere
produccin deficiente de insulina.
- Bilirrubina total: 10mg/dl, aumenta en enfermedad heptica el tipo
bilirrubina directa.
- Cloruro: leve aumento de los niveles de cloruro.

DIAGNOSTICO:

El examen laboratorial sugiere que ocurre dao pancretico, que junto con
las manifestaciones clnicas podramos llegar a la conclusin de pancreatitis
aguda.

PANCREATITIS AGUDA

BIOQUIMICA 23
 LIPASAS

Patognesis

El pncreas exocrino produce proenzimas y enzimas digestivas:

tripsingeno, fosfolipasa A2, quemotripsina que se sintetizan en el retculo
endoplsmico y son trasladadas al aparato de Golgi y desde all se secretan
(en forma separada sin permitir el contacto entre ellas): 1) las hidrolasas
lisosomales dentro de los lisosomas (entre ellas la catepsina B) , y 2)
vacuolas de condensacin conteniendo las enzimas digestivas en forma
grnulos de zimgeno que luego son liberados a la luz acinar y se fusionan
con la membrana celular. Estos zimgenos normalmente se activan en la luz
duodenal, donde una enteropeptidasa produce el clivaje del tripsingeno
convirtindolo en tripsina que a su vez activa a las dems proenzimas.
Dentro del pncreas existen varios mecanismos de defensa que impiden la
activacin enzimtica in situ: 1) in- 20% de su actividad, 2) mesotripsina:
que inactiva a la tripsina 3) antiproteasas (1- antitripsina y 2-
macrogobulina) que impiden la activacin de las proenzimas. Cuando se
presenta el agente desencadenante, se produce una cadena de eventos,
que conduce a la autodigestin del pncreas. Inhibidores de la tripsina que
bloquean un La pancreatitis se inicia con la fusin gulacin), 2) lipasa
(necrosis grasa), 3) intrapancreatica entre los lisosomas (catepsina B) y las
vacuolas conteniendo zimgenos (crinofagia), y por accin de la catepsina
B, en presencia de calcio, se produce el clivaje del tripsingeno
transformndose en tripsina, que una vez activada no puede ser inhibida
(todo nada). Los niveles de tripsina aumentan progresivamente dentro de
la vacuola, hasta producir su ruptura, liberndose al intersticio pancretico.
La tripsina liberada, activa ms tripsina y otras enzimas: 1) fosfolipasa A2
(necrosis por coaquemotripsina (edema vascular), 4) elastasa que destruye
la elastina de los vasos sanguneos, (lesin vascular hemorrgica); y
mediadores envueltos en la cascada inflamatoria como: complemento,
sistema kinina-kalicreina y de coagulacin. Estos mediadores producen
vasoconstriccin a nivel arteriolar y de la microcirculacin pancretica, lo
cul enlentece el flujo sanguneo, aumenta la permeabilidad vascular,
produciendo xtasis capilar, extravasacin de lquido y edema, hipoxia
tisular e isquemia del rgano.

Actualmente se discute el rol de la lesin secundaria por isquemia-

reperfusin en la Cuando los mediadores de inflamacin El calcio en la
patognesis de la necrosis pancretica, consistente en la liberacin de
radicales libres (perxido) que destruyen los lpidos mitocondriales y de la
membrana celular, lesionan el endotelio y aumentan la permeabilidad
capilar. La activacin de la respuesta inflamatoria desencadena la migracin
y activacin de clulas inflamatorias (Polimorfonucleares, macrfagos),
adhesin leucocitaria al endotelio microvascular, liberacin de citokinas

BIOQUIMICA 24
 LIPASAS

(factor de necrosis tumoral alfa, interleuquinas 1, 6 y 8), aumento de la

produccin de derivados del cido araquidnico (prostaglandinas, factor
activador plaquetario y leucotrienos) enzimas lipolticas y proteolticas y
radicales libres del oxgeno, conducentes a la trombosis, hemorragia y
necrosis del pncreas. La caspasa-1 (tambin llamada enzima convertidora
de IL-1) juega un papel importante en la respuesta inflamatoria, ya que
produce el clivaje proteoltico del precursor de la IL-1, y de la IL-18 (factor
inductor de interferon- ), que tiene un papel primordial en la respuesta
inflamatoria Th1, debido a su capacidad de inducir la produccin de
interferon- en los linfocitos T y en las "natural killer", e induce la expresin
de genes y la sntesis de FNT-, IL-1 y otras citoquinas .(kinina-kalicreina)
alcanzan el torrente sanguneo, desencadenan la respuesta inflamatoria
sistmica: vasodilatacin sistmica, aumento de la permeabilidad vascular,
adhesin leucocitaria, inestabilidad hemodinmica, insuficiencia renal, CID,
shock y falla multiorgnica . Cuando se infecta la necrosis, se produce
hiperactivacin de los macr-fagos que se encuentran en la zona y liberan
grandes cantidades de citoquinas (hipercitoquinemia), que activan ms
neutrfilos en rganos distantes, llevando a disfuncin multi-orgnica.

Pancreatitis aguda:

El calcio es liberado desde el retculo endoplsmico rugoso, el aumento de

su concentracin activa el tripsingeno, y modula la actividad de otras
enzimas y hormonas. En un tercio de los casos, la pancreatitis aguda se
acompaa de hipocalcemia por diversos mecanismos: 1) reduccin del
grado de fijacin a las protenas por hipoalbuminemia que conduce a
disminucin de los niveles de calcio srico total 2) secuestro del calcio en
las zonas de necrosis grasa (saponificacin), que produce reduccin del
calcio inico.

CASO CLNICO 2.

Pancreatitis aguda en una adolescente.

Un caso atpico

Como es sabido, la pancreatitis aguda es una enfermedad inflamatoria poco

frecuente causada por la liberacin intersticial de las enzimas pancreticas.
Lo que da lugar a que ocurran procesos de auto digestin de las cinos

BIOQUIMICA 25
 LIPASAS

glandulares. La clsica descripcin clnica la caracteriza por dolor en el

epigastrio como sntoma principal.

En cuanto al diagnstico clnico se considera a la tomografa abdominal para

su diagnstico por su alta sensibilidad y especificidad estadstica en casos
de pancreatitis aguda.

CASO CLNICO

Se trata de una adolescente de 14 aos con un padecimiento de dos das de

evolucin que ingresa con el antecedente de vomitar contenido alimenticio.
Haba recurrido a un mdico particular que le indic: amoxicilina, cido
clavulnico y peroxicam, sin mostrar mejora clnica. A sus manifestaciones
clnicas se agrega dolor abdominal (de leve intensidad) el que es referido a
nivel del hipogastrio. Como continuaba con vmitos postprandiales se le
indic butilhioscina, ranitidina, metoclopramida y paracetamol, sin mostrar
mejora clnica: persistiendo con vmitos, dolor abdominal y se agrega
cierta prdida del estado de alerta, por lo que es llevada al Hospital
General de Cuautitln. En su historia clnica menciona el antecedente de
tener estenosis mitral, tratada con propranolol y cido acetilsaliclico.

A su ingreso se le encontr hipoactiva, hiporreactiva, con palidez de

tegumentos, mucosa oral seca y el cuello con ingurgitacin yugular. En
los campos pulmonares se encontr rudeza respiratoria y en el corazn,
ruidos cardiacos arrtmicos. Su abdomen estaba blando con peristalsis
disminuida, y cierta resistencia muscular. No mostr dolor al palpar su
apndice, sus extremidades estaban fras, con un llenado capilar de cuatro
segundos; sus pulsos perifricos eran dbiles, con hipotensin, taquicardia y
temperatura normal; su respiracin era polipnica, por lo que se le
diagnostic y manej como paciente con choque cardiognico, con cargas
de soluciones cristaloides, la gasometra arterial compatible con acidosis
metablica, y su qumica sangunea mostr: hiperglucemia, hiperkalemia,
hipocalcemia, amilasa normal (30u/L), lipasa normal (157); su biometra
hemtica (BH) con leucocitosis, neutrofilia y trombocitopenia; PFHs
normales. El ultrasonido abdominal mostr una vescula con abundante
detritus, lquido espeso. Su pared de 7 mm, 60 mm x 30 mm, con lquido
libre en la cavidad (aproximadamente 600 mL), por lo que se le hizo una
puncin obteniendo 5 mL de lquido; al que se le hicieron estudios de
citologa y citoqumica que reportaron leucocitos 200: PMN 40%, MN 60%;
la glucosa fue de 114 mg, el colesterol 43 mg, aspartato aminotransferasa
(AST) 27 U/L, tromboplastina (TP) 3.8, alanina aminotransferasa (ALT) 52
U/L, amilasa 14 U/L, K 5.8 , Na 147, Cl 116 [mmol/L]. La adolescente es
valorada por el cirujano pediatra, quien descart que tuviese apendicitis

BIOQUIMICA 26
 LIPASAS

aguda, y sugiere continuar su manejo con soluciones cristaloides, colocacin

de sonda nasogstrica y con una tomografa computadorizada (TAC)
abdominal, la cual inform un discreto aumento del volumen del pncreas,
con una densidad disminuida a nivel de la cabeza, donde se observ
escaso volumen de lquido perifrico, pancreatitis edematosa y en la
vescula una imagen hiperdensa compatible con lito. Por lo que se concluye
que el diagnstico de la enferma era una pancreatitis aguda edematosa. En
las primeras horas de su estancia hospitalaria se le tom un
electrocardiograma que mostr tener fibrilacin auricular, por lo que se trat
con verapamilo y digoxina. De acuerdo con estos hallazgos clnicos se
confirm su diagnstico de pancreatitis, mantenindola en ayuno por cinco
das con soluciones cristaloides, antibiticos, reposo gstrico y con una
sonda nasogstrica. La evolucin fue satisfactoria. A su egreso del hospital,
por mejora, fue examinada por cardiologa en el INP, donde se le hicieron
estudios de ecocardiograma, que informaron coartacin de la aorta,
insuficiencia mitral e hipertensin pulmonar secundaria; por lo que se le
inici tratamiento con medicamentos antiarrtmicos y diurticos.

Se le hospitaliza para su seguimiento clnico y para su tratamiento

definitivo.

DISCUSIN

Si bien la pancreatitis es una entidad poco frecuente en nios, en los

ltimos aos ha aumentando la frecuencia de casos publicados, tenemos la
percepcin que se ha visto un incremento de casos de esta enfermedad, y
al buscar informacin sobre este tema no encontramos nada acerca de la
frecuencia de pancreatitis aguda en los nios de este pas. De acuerdo con
la literatura, la mayora de los casos tienen un curso benigno y un buen
pronstico, ya que el problema suele ser autolimitado, y con una tasa de
letalidad de 2%. En los casos severos su curso es rpido y progresivo, por
lo que su letalidad llega a ser de 50%. A este respecto, las principales
causas de la mortalidad precoz suelen ser por shock y por falla respiratoria.
En este caso la evolucin de la adolescente fue favorable ya que su
sintomatologa remiti entre los das cuatro a siete de su evolucin. En esta
joven se present un cuadro de pancreatitis aguda leve; aunque
inicialmente con repercusin sistmica debido, probablemente, a su
problema cardiolgico. Por esta misma razn cabe mencionar que de
acuerdo con la clasificacin de APACHE II su pronstico inicial fue malo, con
una puntuacin de 25 la que corresponde a una letalidad de 55%.5
Afortunadamente este caso evolucion favorablemente hasta su remisin
sintomatolgica.

BIOQUIMICA 27
 LIPASAS

Es conveniente mencionar que para los nios con esta enfermedad no existe
una escala de gravedad de la pancreatitis; sin embargo, los factores de mal
pronstico clnico son la leucocitosis inicial > 16,000/ mm3, la
hiperglucemia > 200 mg/100 mL, el DHL > 700 UI/L, TGO > 250 UI/L,
hipocalcemia < 8mg/dL, el decremento sbito del hematocrito > 10%, la
creatinina srica > 5 mg/dL, el PO2 arterial < 60mmHg y la acidosis
metablica, considerando que la asociacin de ms de cuatro de estos
indicadores ensombrece el pronstico de la pancreatitis aguda en los nios.

En esta adolescente con hiperglucemia, leucocitosis e hipocalcemia su

evolucin fue buena. Es conveniente mencionar que las causas de
pancreatitis pueden ser mecnicas o estructurales (30%), por
enfermedades sistmicas (20%), idiopticas (25%), por frmacos (15%),
infecciones (10%) o hereditarias (5%).7 En los nios pueden ser causada
por traumatismos, enfermedades multisistmicas, medicamentos,
infecciones y anomalas idiopticas y congnitas del sistema
pancreaticobiliar. Las anomalas estructurales y las idiopticas son las que
suelen tener una mayor recurrencia.

En esta joven la causa se gener por litiasis vesicular, por lo que se

mantiene en vigilancia continua ya que su pancreatitis puede reincidir;
motivo por el cual se le da seguimiento por consulta externa de este
hospital, y en cuanto sea posible se le har una colecistectoma. Se
requieren dos de tres criterios para su diagnstico: clnico, de laboratorio e
imagenolgico.

Es conveniente resaltar que el dolor abdominal intenso en estos enfermos

es la manifestacin que indica la posibilidad de que los pacientes tengan
pancreatitis, ya que el dolor se manifiesta de manera continua y es
localizado en la parte ms alta del abdomen; de tipo transfictivo y se irradia
hacia la espalda. En los nios slo 40% manifiestan este dolor de intensidad
variable y persistente, pero puede acompaarse de nuseas y vmitos, lo
que no modifica la intensidad del dolor.

El dolor se hace resistente a los analgsicos; tambin es conveniente

mencionar que algunos nios refieren alivio al adoptar la posicin en gatillo.
En cuanto a la ingesta de alimentos, esta enfermedad puede provocar
aumento de dolor y vmitos, y los pacientes graves tienen taquicardia,
fiebre e hipotensin. En cuanto a la exploracin clnica del nio, ste puede
o no estar irritable y con signo de rebote positivo e hipoperistalsis; en ellos
es excepcional encontrar signos de Grey, Turner y Cullen, que son
signos de pancreatitis hemorrgica, as como tambin de ascitis y derrame
pleural con dificultad respiratoria, oliguria o anuria.

En estos enfermos la amilasa se eleva ms de tres veces de su

concentracin normal, generalmente seis a doce horas despus de sus

BIOQUIMICA 28
 LIPASAS

manifestaciones, y ordinariamente tiene una vida media de diez horas,

persistiendo elevada por tres a cinco das. En cuanto a la lipasa se eleva
tempranamente y permanece elevada por ms tiempo que la amilasa; su
sensibilidad es de 85 a 100%, aunque su incremento no se asocia con las
manifestaciones de gravedad; sin embargo, una relacin lipasa-amilasa
mayor de dos sugiere la pancreatitis aguda. Si bien se pueden medir otras
enzimas (Fosfatasa A, tripsina, tripsingeno, colipasa, etc.), su uso no est
an validado para el diagnstico de pancreatitis. En lo que atae a la
imagenologa en el diagnstico de la pancreatitis, el ultrasonido es
especialmente til para descartar la litiasis vesicular.

El pncreas hipoecoico, con aumento de tamao y diagnstico de

pancreatitis no est presente en 35% de los enfermos, debido a la
presencia de gas en los intestinos y en slo 25 a 50% de los enfermos con
pancreatitis muestran sensibilidad. En cuanto a la tomografa, sta se debe
hacer con doble contraste a las 48 horas despus, a todo paciente que no
mejore con el manejo conservador inicial o si se sospecha de alguna
complicacin. La TAC tiene una sensibilidad del 87 a 90% y una
especificidad de 90 a 92%.

Finalmente en cuanto al tratamiento es oportuno mencionar que los casos

de pancreatitis aguda leve, suelen ser manejados clnicamente en la sala de
pediatra: en tanto que los casos graves son manejados en la unidad de
cuidados intensivos.

Cabe agregar que los objetivos de tratamiento en la pancreatitis aguda son

reducir la secrecin pancretica exgena, eliminar el dolor y tratar el shock
y las manifestaciones hidroelectrolticas. No hay un tratamiento bien
definido para todos los casos de pancreatitis aguda, ya que el manejo de
estos pacientes consiste en soporte de fluidos intravenosos, reposo gstrico
y aspiracin por la sonda nasogstrica; aunque en aquello nios con
problema de motilidad intestinal o vmitos severos es importante darles
soporte nutricio y analgesia. En cuanto al empleo de antibiticos, stos se
reservan para pacientes con infeccin documentada como pancreatitis
aguda grave y necrotizante; sin embargo, en general un tercio de estos
nios con pancreatitis son resueltos nicamente con medidas generales.
Hay tambin informes en la literatura que sugieren emplear somatostatina,
bloqueadores H2 y otros medicamentos.

El octetrido es un octapptido sinttico de accin prolongada, anlogo de

la somatostatina, ya que disminuye las secreciones gastrointestinales,
biliares y pancreticas, facilitando el tratamiento de estos enfermos. Cuando
la pancreatitis es leve la ingestin por la va oral se restablece, en tanto se

BIOQUIMICA 29
 LIPASAS

controle el dolor y aparezcan signos positivos de trnsito intestinal; lo que

usualmente ocurre a los 4 o 5 das.

Cuando la pancreatitis es grave se indica el aporte de los nutrimentos por

va parenteral en todos los casos. Respecto al empleo de la analgesia, en
estos casos el dolor es el sntoma ms notorio, y se debe procurar un
manejo cuidadoso de estos enfermos; el empleo de la sonda nasogstrica
ante la presencia de que haya retencin gstrica permite reducir el dolor.
Los antiinflamatorios no esteroideos son efectivos en el control del dolor
pancretico, pero considerando las eventuales complicaciones de su uso
prolongado se emplea slo en algunos casos.

En cuanto a los opiceos, son altamente eficaces en el control del dolor

pancretico, recordando siempre que la petidina y la metadona no producen
espasmo en el esfnter de Oddi, a diferencia de la morfina, por lo que estn
contraindicadas. El tratamiento quirrgico como solucin slo est indicado
en los casos de pancreatitis necrtica infectada o en las pancreatitis con
patologa biliar. En cuanto a la pancreatitis aguda leve asociada a
colecistitis, el empleo para corregirla es la colecistectoma laparoscpica, y
sta se indica cuando la inflamacin pancretica ha cedido, aunque se
prefiere hacer para prevenir recurrencias. Es oportuno sealar que las
complicaciones de pancreatitis, adems de la formacin de abscesos,
pseudoquistes y trombosis de la vena esplnica existen otras como la
hemorragia gastrointestinal, la ruptura de un pseudoaneurisma pancretico
y la encefalopata pancretica.

Finalmente, hablando del pronstico es conveniente mencionar que el curso

clnico es variable en estos enfermos, va desde una forma leve, transitoria,
autolimitada y con molestia abdominal leve, hasta un cuadro fulminante con
rpido deterioro, complicando as la disfuncin orgnica mltiple, con
desenlac en horas o das. Por esto es importante clasificar y conocer los
criterios de la gravedad desde el ingreso del paciente, para enterar a los
familiares de la gravedad de estos casos

Referencias Bibliogrficas
Alam, M., Vance, D. E., Lehner, R. 2002. Structure-function analysis of
human triacylglycerol hydrolase by site-directed mutagenesis: identification
of the catalytic triad and a glycosylation site. Biochem 41 (21): 6679-87.
Aloulou, A., Puccinelli, D., De Caro, A. M., Leblond, Y., Carrire, F. 2007.

A comparative study on two fungal lipases from Thermomyces lanuginosus

and Yarrowia lipolytica shows the combined effects of detergents and pH on
lipase adsorption and activity. Biochim Biophys Acta 1771 (12): 1446-56.

BIOQUIMICA 30
 LIPASAS

Aloulou, A., Rodrguez, J. A., Fernndez, S., van Oosterhout, D., Puccinelli,
D., Carrire, F. 2006. Exploring the specific features of interfacial
enzymology based on lipase studies.

Biochim Biophys Acta 1761 (9): 995-1013. Alston, M. J., Freedman, R. B.

2001.

A comparison of lipase-catalyzed ester and lactone synthesis in low-water

systems: Analysis of optimum water activity. J Basic Microbiol 41 (6): 363-6.
Amada, K., Kwon, H. J., Haruki, M., Morikawa, M., Kanaya, S. 2001.

BIOQUIMICA 31