UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADMICA PROFESIONAL DE INGENIERA

AGROINDUSTRIAL

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PERFORMANCE (HPLC)

Elaborado por: Contreras Waiss, Hans

Crdova Cienfuegos, Mnica

Pucallpa, marzo 2016

 I. INTRODUCCIN

En el presente trabajo se tratar sobre la cromatografa liquida de alta performance

(HPLC). La cromatografa es una antigua tcnica instrumental que ha evolucionado
enormemente en los ltimos aos, principalmente a partir de la dcada de los setenta,
con lo que, inicialmente concebida como mtodo de separacin, ha llegado a
convertirse en una fuente inagotable de mtodos de anlisis.

Pocos mtodos de anlisis qumico son tan especficos para un analito en particular,
ya que tanto las fases previas de extraccin como los procedimientos cromatogrficos
son llevados a cabo en funcin del tipo de molcula.

La tcnica de HPLC, es capaz de separar macromolculas y especies inicas,

productos naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros
grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva,
otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase
estacionaria activa.

Esta tcnica ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una
mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.

La finalidad del trabajo monogrfico es realizar una revisin bibliogrfica del tema de
cromatografa liquida de alta performance (HPLC). Iniciando desde un recuento de
generalidades, seguidamente, definicin de conceptos importantes relacionados con la
cromatografa liquida, mtodos, clasificacin, instrumentacin, y sus aplicaciones para
el estudio cuantitativo y cualitativo de muestras en bioqumica y qumica analtica.
 II. OBJETIVOS

III. MARCO TEORICO

III.1. GENERALIDADES
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra
mvil. En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una
columna que contiene a la fase fija.

La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de

vidrio, la cual est rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte
superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las

partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones, lo cual
gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil. De
esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que
requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones
requeridas.

III.2. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

Es un proceso analtico que utiliza un instrumento especialmente diseado para

separar, cuantificar y analizar los componentes de una mezcla qumica. La muestra de
inters se hace pasar mediante un flujo de disolvente hasta una columna rellena del
material especial para llevar a cabo la separacin de los componentes, posteriormente
dichos componentes pasan a un sistema de deteccin acoplado con un sistema de
grabacin de datos.

Los elementos bsicos de una cromatografa en columna son:

- Fase estacionaria: un slido poroso, el cual queda soportado en el interior de una

columna fabricada generalmente en plstico o vidrio.
- Fase mvil: es un lquido.

III.2.1. FUNDAMENTO

La cromatografa lquida (HPLC), es una tcnica utilizada para separar los

componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar, columna, y
una fase mvil. La fase estacionaria es slica. Mientras que la fase mvil acta de
portador de la muestra.
La muestra en solucin es inyectada en la fase mvil. Los componentes de la solucin
emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la
columna. Estas interacciones qumicas, determinan la separacin de los contenidos en
la muestra.

La utilizacin de los diferentes detectores depender de la naturaleza de los

compuestos a determinar.

III.2.2. MTODOS DE CROMATOGRAFA LQUIDA

A. LQUIDO-SLIDO

Se basa en la polaridad. Los compuestos que poseen grupos funcionales capaces de

producir enlaces fuertes de hidrgeno se unirn ms fuertemente a la fase
estacionaria que los compuestos menos polares. As, los compuestos menos polares
eluirn de la columna ms rpidamente que los altamente polares.

B. LQUIDO-LQUIDO

Se basa en la polaridad. Sin embargo, esta tcnica es ms apropiada para muestras

de mediana polaridad que son solubles en disolventes de dbil polaridad a polares
orgnicos. La separacin de noelectrolitos se consigue teniendo en cuenta las
polaridades de muestra y fase estacionaria y usando una fase mvil que posea una
polaridad marcadamente diferente.

C. FILTRACIN EN GEL

Se basa en el tamao molecular de los compuestos que van a ser analizados. La fase
estacionaria est formada por partculas porosas (slica, no-slica). Los componentes
de mayor tamao sern excluidos del interior de las bolas y as eluirn primero. Los
compuestos ms pequeos podrn entrar en las partculas y eluirn de acuerdo con
su capacidad para salir de los poros en los que fueron internados.

D. FASE NORMAL

Se basa en la hidrofilia y la lipofilia usando una fase estacionaria polar y una fase
mvil menos polar. As, los compuestos hidrofbicos eluyen ms rpidamente que los
hidroflicos. La fase est constituida por una matriz de slica a la que se unen grupos
silanol, amino y nitrilo que le confieren polaridad relativa respecto a la fase mvil.

E. FASE REVERSA

Se basa en la hidrofilia y la lipofilia. La fase estacionaria consiste en una matriz de

slica empacada que lleva unida covalentemente03 una cadena alqulica de ncarbonos.

La ms hidrofbica es, en este caso, la fase estacionaria, eluyendo los compuestos

hidroflicos ms rpidamente que los hidrofbicos, que interaccionan con la fase
estacionaria. Tambin hay empaquetamientos polimricos alternativos a la slice que
ofrecen similares caractersticas con mayor resistencia dinmica y ms amplio rango
de estabilidad de pH. Existen dos variantes de la cromatografa en fase reversa:

E.1. SUPRESIN INICA

Se utiliza modificando el pH de la fase mvil para cidos y bases dbiles, de forma que
el analito pasa a ser ms lipfilo y se mejora la separacin porque se establece ms
interaccin con la columna.

E.2. FORMACIN DE PARES INICOS

Se utiliza para compuestos que tienen grupos funcionales biolgicos que sern unidos
a un contrain. El contrain se asocia al analito y lo desplaza del par inico normal
(corrientemente Na+ o Cl-) mejorando su hidrofobicidad. Para analitos catinicos se
utilizan grupos alquil o aril sulfonatos y para analitos aninicos aminas cuaternarias.

F. INTERCAMBIO INICO

Se basa en el intercambio selectivo de iones de la muestra por sus diferencias en

signo y magnitud de carga inica frente a los contraiones de la fase estacionaria. Se
trata de columnas que contienen grupo funcionales que soportan cargas unidos a una
matriz polimrica. Los iones funcionales estn permanentemente unidos a la columna
y cada uno tiene su contrain unido. La muestra es retenida porque reemplaza los
contraiones de la fase estacionaria con sus propios iones. La muestra es eluida de la
columna por cambio en las propiedades (pH, fuerza inica) de la fase mvil, haciendo
que esta desplace los iones de la muestra de la fase estacionaria.

G. AFINIDAD

Usa biomolculas inmovilizadas que tienen una afinidad especfica hacia el compuesto
de inters. La separacin ocurre cuando la fase mvil y la muestra pasan a travs de
la fase estacionaria. El compuesto o compuestos de inters de la muestra son
retenidos mientras el resto de las impurezas y la fase mvil pasa a travs. Los
compuestos son luego eluidos cambiando las condiciones de la fase mvil.

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III.2.3. CLASIFICACIN DE LA CROMATOGRAFA LIQUDA

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la
separacin, la cromatografa lquida de alta resolucin puede ser:

A. CROMATOGRAFA DE ADSORCIN

La fase estacionaria es slida. La separacin se logra por las diferencias en

solubilidad (en fase mvil) y de retencin por adsorcin (en fase estacionaria) de la
mezcla de solutos.

- Slica (90%) y almina (10%) son las fases estacionarias ms comunes.

- Tanto las molculas de solutos como de disolvente son atradas hacia los lugares
activos polares de la fase estacionaria.
- Unos solutos sern ms atrados que otros por la fase estacionaria y as se lograr
su migracin diferencial.
- Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder de elucin y la selectividad
adecuadas. Normalmente un disolvente apolar (n-hexano) unido a otro ms activo
(acetona, cloruro de metilo, etc.).

B. CROMATOGRAFA DE REPARTO

En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos
qumicamente a un soporte slido de slica. Se la subdivide en cromatografa en fase
normal y fase reversa. En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar y los
compuestos menos polares eluyen primero. En la cromatografa en fase reversa, el
compuesto unido qumicamente es un hidrocarburo aliftico y se emplean fases
mviles polares. En este caso, las sustancias ms polares eluyen primero.

C. CROMATOGRAFA INICA

Tanto fase estacionaria como fase mvil son de naturaleza inica. Los iones de la fase
estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente.

- Se emplea para el anlisis de todo tipo de iones (inorgnicos y orgnicos).

- Las molculas intercambiadoras se ligan a soportes especficos.
- El material intercambiador de la fase estacionaria es de dimetro de partcula
pequeo (1-10 m) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio
muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 10-3 meq/g).

D. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

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La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red
uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento relacionado con el tamao
molecular.

Las molculas de tamao mayor son excluidas y eluyen primero, mientras que las ms
pequeas que penetran en los poros son retenidas ms tiempo.

III.2.4. FUNCIONAMIENTO DEL SISTEMA HPLC

El HPLC es una tcnica analtica, que consiste en la purificacin, identificacin y

cuantificacin del analito deseado. La eleccin de la fase estacionaria y la fase mvil,
del flujo al que se va a impulsar la fase mvil a travs de la fase estacionaria e incluso
de la temperatura a la que se va a realizar la cromatografa, permitirn una correcta
separacin del analito de otros compuestos. Cada componente de una solucin tiene
unas caractersticas determinadas bajo ciertas condiciones cromatogrficas, y debe
conseguirse que la migracin del componente y de los contaminantes a travs de la
columna sea lo suficientemente distinta para que dicho compuesto sea separado de
los dems del extracto, para permitir su posterior identificacin y cuantificacin.

A este proceso se le denomina purificacin. La identificacin de compuestos es la

parte ms importante de muchos trabajos en HPLC. Para identificar compuestos se
debe seleccionar un sistema de deteccin que mida diferentes propiedades fsico-
qumicas de la molcula. Entra

En la cromatografa lquida, la fase mvil eluye de la columna durante un tiempo

determinado conteniendo cantidades muy diferentes de solutos que pasan a travs de
un sistema de deteccin. El instrumento detecta la presencia del soluto que es
convertida en una seal elctrica y sta puede ser tratada por un procesador de datos.
Se representa la seal obtenida frente al tiempo o al volumen de elucin, y al grfico
obtenido se le conoce como cromatograma.

Es preciso confeccionar previamente una curva de calibracin para establecer el factor

de respuesta como la pendiente de la medida del detector frente a las
concentraciones de los calibradores. Para ello se realiza la inyeccin de una serie de
soluciones del compuesto con concentraciones conocidas para su deteccin. Los
cromatogramas obtenidos muestran una serie de picos cuyas reas se correlacionan
con la concentracin del compuesto inyectado. Se puede tambin trabajar con
estandarizacin interna donde, tanto a los compuestos con concentraciones conocidas
como a las muestras a cuantificar, se les aade una cantidad conocida de un segundo
compuesto conocido como estndar interno. El rea del estndar interno sirve para
estandarizar puesto que las prdidas sufridas durante todo el proceso analtico
(extraccin, cromatografa, etc.) son constantes para todos los compuestos. La
representacin de la relacin del rea o la altura del analito respecto a la del estndar
interno frente a la concentracin del analito proporciona una curva de calibracin que
corrige las prdidas analticas.

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III.2.5. INSTRUMENTACIN PARA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Figura 1: Componentes de un equipo de HPLC

A. FASE MVIL Y TRATAMIENTO DE LOS DISOLVENTES

Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o de

acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los
recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos que
interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede
consistir en un sistema de bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos
para calentar y agitar los disolventes o sistemas de difusin que permiten arrastrar los
gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja
solubilidad. Con frecuencia estos sistemas tambin contienen un dispositivo para la
filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin de los disolventes. No es
necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas
de HPLC. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de
introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vaco a travs de un
filtro de poro muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases adems de la materia
en suspensin.

Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina

una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se aumenta
notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos disolventes
con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza la elucin, se vara la
relacin de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces
mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC a
menudo estn equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes
desde dos o ms recipientes en una cmara de mezcla a una velocidad que vara
continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o
exponencialmente con el tiempo.

A. SISTEMAS DE BOMBEO

Son necesarios para conseguir y regular la presin y velocidad de flujo de la fase

mvil. Cuando la fase mvil es una mezcla de solventes programa para tomar los
diferentes solventes en una proporcin determinada.
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Caractersticas:

- Generar presiones por encima de 6000 psi

- Libre de pulsaciones.
- Intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min.
- Reproducible.
- Resistente a la corrosin.

Tipos:

- Bombas reciprocas.
- Bombas de desplazamiento.
- Bombas neumticas.

Las bombas para HPLC deben cumplir ciertos requisitos fundamentales:

- Deben producir presiones estables hasta 6000 psi.

- Deben mantener el flujo libre de pulsaciones.
- Deben generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
- Deben permitir un control y reproducibilidad del flujo de solvente.
- Sus componentes deben ser resistentes a la corrosin.

B. SISTEMA DE INYECCIN

El inyector para HPLC consiste normalmente en una vlvula de inyeccin y un bucle.

Un pequeo volumen de muestra (previamente disuelta) se carga en una jeringa y es
inyectada en el bucle por la vlvula de inyeccin. Un giro del rotor de la vlvula cierra
la vlvula y pone en comunicacin el bucle que contiene la muestra con la corriente de
fase mvil que va de la bomba a la columna. El volumen del bucle determina la
cantidad inyectada y puede ir desde 5 L hasta 500 L.

La inyeccin a flujo parado es un mtodo especial por el cual la bomba se detiene

para realizar la inyeccin a presin atmosfrica, este sistema se utiliza cuando se
trabaja a muy alta presin.

C. COLUMNAS

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Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo de
acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Cientos de columnas empaquetadas
que difieren en tamao y relleno se comercializan por distintos fabricantes y su coste
oscila, por lo general, de 30 000 a 100 000 pesetas.

C.1. COLUMNAS CAPILARES

Los avances en HPLC han llevado a estas pequeas columnas analticas, tambin
conocidas como microcolumnas. Las columnas capilares tienen un dimetro menor a
1 mm, y hay de tres tipos: tubular abierto, parcialmente empacadas, y fuertemente
empacadas. Estas columnas permiten trabajar con volmenes de muestra de
cantidades distintas de litros, disminuyendo el flujo y el volumen de solvente usado lo
que puede llevar a una disminucin de los costes. Sin embargo, la mayora de las
condiciones y la instrumentacin deben ser miniaturizadas, la relacin de flujo puede
ser difcil de reproducir, el gradiente de elucin no es tan eficiente, y se debe tener
mucho cuidado cuando se cargan volmenes de muestra tan pequeos.

C.2. COLUMNAS DE MICROCALIBRE Y DE CALIBRE ESTRECHO

Se usan para pequeos volmenes de muestra. El dimetro tpico es de 1-2 mm.

Como en las columnas capilares, los instrumentos deben ser modificados para
acomodarse a la pequea capacidad de estas columnas. Sin embargo, excepto la
ventaja de la pequea cantidad de muestra y de volumen de la fase mvil, no se ha
notado un incremento en la sensibilidad a la cantidad de materia inyectada sin prdida
significativa en la resolucin.

C.3. COLUMNAS ESTNDAR

Son las que se usan comnmente. Su tamao ms habitual es de 2,4 mm de dimetro

y 250 mm de largo, con un tamao de partcula de 5 m de dimetro. Las partculas
pueden ser de slica o de otros polmeros especiales que les confiere resistencia a
determinadas condiciones (pH extremos) y a su vez pueden ser de forma esfrica o
irregular. Las partculas son de naturaleza porosa a fin de aumentar mucho la
superficie de interaccin con los analitos, y dado que tambin influye en la separacin,
se tiene en cuenta el dimetro de poro. Hay variaciones, pero los poros de las
partculas suelen ser de entre 100 y 300 .

C.4. COLUMNAS RPIDAS

La razn principal para usar estas columnas es aumentar el nmero de muestras que
se pueden procesar en un tiempo dado. Para muchas columnas, incrementando el
flujo o la relacin de migracin a travs de la fase estacionaria se afectar
adversamente la resolucin y la separacin. As pues, las columnas rpidas se
disean para rebajar el tiempo sin llegar a significativas desviaciones en los
resultados. Estas columnas tienen el mismo dimetro interno pero son mucho ms
cortas que la mayora de las columnas, y estn empacadas con pequeas partculas
que son tpicamente de 3 m de dimetro. Las ventajas incluyen incremento de la
sensibilidad, descenso en el tiempo de anlisis, descenso en la fase mvil usada, e
incremento en la reproducibilidad.

C.5. COLUMNAS PREPARATIVAS

Son columnas utilizadas con el objeto de permitir purificar grandes cantidades de

muestra (mg). Una columna preparativa normalmente tiene un gran dimetro porque
est diseada para facilitar grandes volmenes de inyeccin.

D. DETECTORES 09

Los detectores utilizados para HPLC siempre trabajan bajo condiciones de flujo
continuo, la muestra disuelta en la fase mvil atraviesa una celda de flujo en la que es
detectada.

Normalmente, las muestras llegan en cantidades de nanogramos al detector, pero en

anlisis de trazas e incluso de muy pocas molculas.

La respuesta del detector al paso de la sustancia est basada en un amplio rango de

caractersticas fsicas y qumicas de las sustancias. Es por esto que no existe un
detector universal, sino que cada sustancia, en principio, debe analizarse con el
detector ms adecuado dependiendo de su naturaleza fsico-qumica, del tipo de
anlisis que se lleve a cabo y del tipo de instrumentacin de la que se disponga.

Caractersticas:

- Sensibilidad adecuada.
- Estabilidad y reproducibilidad buenas.
- Respuesta lineal extendida a varios rdenes de magnitud.
- Tiempo de respuesta corto.
- Respuesta rpida e independiente del caudal.
- Manejo sencillo.
- Respuesta selectiva a algunos analitos.

Tipos de detectores:

D.1. DETECTORES DE ABSORBANCIA

La Figura 4.5 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la medida
de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A fin de minimizar
el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo
menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de 1 a 10 L y las
longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de este tipo est
restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.

DETECTORES DE ABSORBANCIA ULTRAVIOLETA CON FILTROS

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Los detectores de absorcin UV ms simples son los fotmetros de filtros con una
lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos casos es aislar la lnea
intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos tambin se pueden utilizar
las lneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este tipo
de detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a alguna
de estas longitudes de onda. Algunos grupos funcionales orgnicos y diversas
especies inorgnicas exhiben una banda ancha de absorcin a una o ms de esas
longitudes de onda.

DETECTORES DE ABSORBANCIA ULTRAVIOLETA CON MONOCRORNADORES

La mayora de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que

consisten en un espectrofotmetro de barrido con ptica de red. Algunos se limitan a la
radiacin ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la visible.
Se pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se puede obtener el
cromatograma completo a una sola longitud de onda o alternativamente, cuando los
picos que eluyen estn suficientemente separados, se puede elegir distinta longitud de
onda para cada pico. En este caso, debe emplearse el control por ordenador para
elegir la mejor longitud de onda en cada caso. Cuando se desean los espectros
completos con fines de identificacin, se puede parar el flujo del eluyente durante un
tiempo suficiente que permita el barrido de la regin de longitud de onda que interesa.

DETECTORES DE ABSORBANCIA EN EL INFRARROJO

Comercialmente se ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. El primero con barrido

de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro semicirculares. El
segundo, mucho ms sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los
instrumentos de transformada de Fourier. Las cubetas de los detectores de infrarrojo
son semejantes a las de radiacin ultravioleta excepto en que las ventanas se
construyen de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta
oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volmenes de 1.5 a 10 L. Los instrumentos de infrarrojo
ms sencillos pueden trabajar a una o ms longitudes de onda; alternativamente, se
pueden obtener los espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elucin. Los
instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera anloga a los
instrumentos de series de diodos para las medidas de absorbancia ultravioleta que se
han descrito en la seccin anterior. Una de las mayores limitaciones al uso de los
detectores de infrarrojo se debe a la baja transparencia de muchos de los disolventes
que se utilizan.

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D.2. DETECTORES DE FLUORESCENCIA

Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseo a los

fluormetros y espectrofluormetros. En la mayora de ellos, la fluorescencia se detecta
por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de
excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio,
y uno o ms filtros para aislar la radiacin fluorescente. Los futuros desarrollos en los
detectores de fluorescencia probablemente se basarn en el uso de fuentes de lser
sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad y selectividad. Una ventaja
inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta ser ms
de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. En
cromatografa de lquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separacin y
determinacin de los componentes fluorescentes de las muestras.

D.3. DETECTORES DE NDICE DE REFRACCIN

Estos detectores miden la diferencia de ndice de refraccin, entre el disolvente que en

su camino hacia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y el efluente de la
columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos estn separados por una
placa de vidrio montada a un ngulo de modo que si las dos disoluciones difieren en el
ndice de refraccin se produce una desviacin de un haz de luz incidente. El
desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca
una variacin de la seal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada,
proporciona el cromatograma. Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja
de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales
anlogos a los detectores de llama en cromatografia de gases. Adems, son fiables y
no dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de
temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas
milsimas de grado centgrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayora
de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elucin con
gradiente.

D.4. DETECTOR DE DISPERSIN DE LUZ

Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la HPLC,

el detector de dispersin de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la columna se
pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de
nitrgeno o aire. Las finas gotitas se llevan a travs de un tubo de conduccin a
temperatura controlada donde tiene lugar la evaporacin de la fase mvil, lo que
origina unas finas partculas de analito. La nube de partculas de analito pasa a travs
de un haz lser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiacin dispersada
perpendicularmente al flujo. Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es
que su respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los solutos no
voltiles. Adems es notablemente ms sensible que el detector de ndice de
refraccin.

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D.5. DETECTORES ELECTROQUMICOS

Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de

detectores electroqumicos. Estos dispositivos se basan en cuatro mtodos
electroanalticos que incluyen la amperometra, la voltamperometra, la coulombimetra
y la conductimetra.

E. SISTEMA PARA EL TRATAMIENTO DE DATOS

Es indispensable para registrar los cambios en alguna propiedad en funcin del

tiempo. La representacin grfica de estos registros se llama crometograma. En estos
registros aparece una serie de picos simtricos sobre el eje de los tiempos para la
identificacin cuantitativa (rea bajo los picos) y cualitativa (posicin en el eje) de los
componentes de una muestra.

III.2.6. APLICACIONES

La cromatografa lquida de alta performance a pesar de ser una tcnica

relativamente nueva, se cuenta que describe numerosas aplicaciones en la qumica.
En la mayora de los casos, stas consisten en determinaciones de sustancias cuyo
anlisis por otra tcnica cromatogrfica resulta muy difcil. Estos resultados
comprenden:

ANLISIS QUMICO HPLC

COMPUESTOS INICOS COMPUESTOS DE ALTO COMPUESTOS
PESO MOLECULAR TERMOLBILES Y NO
VOLTILES
- Aminocidos - Polmeros - Vitaminas
- Sales inorgnicas - Hidrocarburos - Pesticidas
- cidos orgnicos, etc. polinucleares - Esteroides
- Productos naturales, - Plastificantes
etc. - Drogas
- Productos
farmacuticos

El campo de aplicacin de esta tcnica es muy extenso. Algunas de las aplicaciones

se enumeran a continuacin:

- Productos farmacuticos: antibiticos, sedantes, esteroides, analgsicos

- Bioqumica: aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos
- Alimentacin: edulcorantes artificiales, antioxidantes, aditivos
- Contaminantes: plaguicidas, herbicidas, fenoles, PCBs
- Qumica forense: drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
- Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrgenos.

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 IV. CONCLUSIONES

1. La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de

los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o
estacionaria y otra mvil.

2. El HPLC, consiste en proceso analtico que utiliza un instrumento especialmente

diseado para separar, cuantificar y analizar los componentes de una mezcla
qumica.

3. La cromatografa liquida de alta performance es un tipo de cromatografa en

columna utilizada frecuentemente en bioqumica y qumica analtica.

4. El equipo para HPLC est constituido por: una fase mvil y tratamiento de los
disolventes, sistema de bombeo, columna, detector y sistema para el tratamiento
de datos.

5. El HPLC es una tcnica que posee numerosas aplicaciones en el campo de la

qumica, bioqumica, medicina, alimentos y medio ambiente.
 V. RECOMENDACIONES

1. Sugiero que se indague ms a fondo sobre cromatografa liquida de alta

performance, mtodos, instrumentacin y aplicaciones, en especial en la
industria alimentaria y agroindustria, para adquirir eficaces conocimientos
en el campo cientfico y tecnolgico. Consultando revistas, artculos,
blocks cientficos que nos sirvan de recursos acadmicos y alimenten
nuestros conocimientos, para obtener buenos resultados en el campo
laboral como ingenieros agroindustriales.

2. Ante la era tecnolgica y los descubrimientos cientficos la industria debe

de seguir innovando y mejorando con mtodos, tcnicas y equipos
sofisticados, para el anlisis qumico (cualitativo, cuantitativo) que
contribuyan al estudio para las soluciones de los problemas medio
ambientales, alimenticios, salud y entre otros.

VI. BIBLIOGRAFA
Sitios webs:

Hernndez P. Jos M. Cromatografia lquida de alta eficacia. 2005.

Consulta: 18/12/2014.file:///C:/Users/user/Downloads/2004-2005-Edu-08-Tema.pdf

Cromatografa Lquida (HPLC). Consulta: 17/12/2014

http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-gases%20l%C3%ADquidos.pdf

Qu es la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC)?. 30 de agosto del 2006.

QuimiNet. Consulta: 17/12/2014. http://www.quiminet.com/articulos/que-es-la-
cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia-hplc-14764.htm

Daniel. HPLC Partes del equipo. 2010. Scribd. Consulta: 20/12/2014.

http://es.scribd.com/doc/29466592/HPLC-Partes-Del-Equipo#scribd

Cromatografa de lquidos de alta resolucin. Consulta: 20/12/2014.

http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8248/4/T4cromatliquid.pdf
VII. ANEXO
 Foto 1: Equipo de HPLC

Fuente: Universidad Nacional Agraria de la Selva

Foto 2: Diagrama HPLC

Fuente: http://www.shodex.net/index.php?seitenid=1&applic=1472
Foto 3: Espectrofotmetro

18
 Fuente: UNAS

Foto 4: Docente a cargo del laboratorio

Fuente: UNAS