Universidad de Illinois en Urbana-Champaign

Instituto Beckmande Ciencia y Tecnologa Avanzada Terica y

Computacional Grupo de Biofsica Computacional Biofsica Taller

Las protenas de
membrana
Tutoria
l

Alek Aksimentiev
Marcos Sotomayor
David Wells
editor actual:
Pataeen Mahinthichaichan
de noviembre de el ao 2016
 2

Una versin actual de este tutorial est disponible

enmaridottp:
//www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorial
s/
CONTENID 3
O

Contenid
o
1 edificioun modelo estructural de KcsA 6
1.1 Descarga y visualizacin de la protena. . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2 Examinando el archivo PDB. . . . . . . . . . La . . . . . . . . . . . . . 8
1.3 construccin de la KcsA tetrmeros. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4 La generacin de fibras discontinuas de . . . . . . . . . . . . . 12
1.5 polister y PDB para KcsA solvatacin la . . . . . . . . . . . . . 18
protena (opcional). . . . .
2 La colocacin de KcsAen una 24
membrana
2.1 La construccin de un parche de . . . . . . . . . . . . . 24
2.2 membrana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3 Alineacinde membrana y protenas. . . La . . . . . . . . . . . . . 26
2.4 combinacin de membrana y protenas. . . . . . . . . . . . . . 29
Solvatacin y de ionizacin. . . . . . . . . .
3 CorriendoUna simulacin de KcsA 34
3.1 El derretimiento de los lpidos colas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.2 .MinimizacinEquilibrado
. y con Protena constreidos . . . . 39
3.3 Equilibriocon la protena liberada. . . . . . . . . . . . Series de . . . . 41
3.4 produccin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
CONTENID 4
O

Introduccin
Este tutorial est diseado para guiar a los usuarios de VMD y NAMD a travs de todos los pasos
necesarios para configurar un sistema de protenas de membrana para simulaciones de dinmica
molecular. El tutorial asume que ya tiene un conocimiento prctico de VMD y NAMD. Para los tutoriales
que se acompaan VMD y NAMD ir a: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/

Este tutorial ha sido diseado especficamente para VMD 1.8.6 y 2.6, pero NAMD
Tambin trabajar con VMD 1.8.7 y 2.7 NAMD. Debe tener alrededor de 5 horas para completar en
su totalidad. Este tiempo puede reducirse por saltarse la seccin opcional 1.5 y utilizando los scripts
de ejemplo donde est previsto.

El tutorial se divide en tres unidades separadas. La primera unidad cubre los pasos
necesaria para configurar un modelo estructural de una protena de membrana a partir de un archivo
PDB prima. La segunda unidad se describen los pasos necesarios para colocar la protena de membrana
en un entorno similar a la nativa. Por ltimo, la tercera unidad describe los pasos necesarios para
minimizar y equilibrar el sistema resultante con NAMD.

Los ejemplos en el tutorial se centrar en el estudio de la membrana KcsA

protenas - un canal de potasio arquetpica con propiedades muy interesantes. A lo largo del texto, algo
de material se presentar en "cajas" separadas. Estas cajas contienen informacin complementaria a la
gua de aprendizaje, tales como in- formacin sobre el papel biolgico de KcsA y consejos o detalles
tcnicos que pueden explorarse posteriormente por el usuario avanzado.

Si usted tiene alguna pregunta o comentario sobre este tutorial, por favor escriba a la TCB
TutorialLista de Correo en tutorial-l@ks.uiuc.edu. La lista de correo est archivado en
maridottp: //www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/mailing lista / tutorial-l /.

KcsA. Este tutorial se centrar en la preparacin de un sistema que contiene

el canal de potasio KcsA incrustado en una membrana totalmente hidratado.
KcsA fue el primero de los canales inicos cristalizado; que est hecho de
cuatro subunidades idnticas que forman un tetrmero y cuenta con un filtro
de selectividad que permite la conduccin altamente selectivo de iones de
potasio en las velocidades de difusin casi a granel a travs de la membrana.
KcsA pertenece a una familia de canales que se encuentran en casi todos los
organismos. Estos canales tienen diversas funciones y se han implicado en la
regulacin osmtica y la sealizacin neuronal.
 CONTENID 5
O

programas necesarios
Se requieren los siguientes programas para este tutorial:
VMD:Disponible enmaridottp: //www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/(para todas las
plataformas)
NAMD:Disponible enmaridottp: //www.ks.uiuc.edu/Research/namd/(para todas las
plataformas)
Solvato (recomendado):Disponible enmaridottp:
//www.mpibpc.mpg.de/grubmueller/solvate/ (segundoe Asegrese de agregar la lnea
siguiente a solvate.c antes de la compilacin: #include <stdlib.h>)

Consiguiendo Empezado
You puede encontrar los archivos de este tutorial en el directorio de archivos-tutorial-MEM. A
continuacin se puede ver en la Fig. 1 los archivos y directorios de mem-tutorial-archivos.

*
Figura 1: Estructura de directorios de mem-tutorial-archivos. Este ejemplo di--salida
casa del prroco est presente slo en la versin extendida del tutorial.

To iniciar VMD VMD tipo en una ventana de terminal Unix, haga doble clic en el VMD
solicitudicono probable situada en la carpeta Aplicaciones de Mac OS X, o haga clic en la
opcin de men Inicio Programas VMD en Windows.

Expresiones de gratitud
Desarrollode este tutorial es apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (P41-
RR005969 - Recursos para Modelado de Macromolculas y bioinformtica) y la Fundacin
Nacional de Ciencia (DMR-095595 y PHY-0822613).
 1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL DE KCSA 6

1 La construccin de un modelo estructuralde KcsA

En esta unidad se va a construir el tetrmero KcsA solvatados en agua, aprender a
tener una estructura de protena cruda y construir un sistema de simulacin preparada fuera de l.

1.1 La descarga y visualizacin de la Protena

Nuestro primer paso es descargar la estructura de la protena cruda de laProtein Data
Banco, una repositorio en lnea de estructuras de protenas experimentalmente resuelto, y ver que el
uso de VMD. El archivo PDB 1K4C.pdb contiene las coordenadas atmicas de un monmero de KcsA.

1 Abra un navegador Web y vaya a www.pdb.org. los fichero que des- cargar tambin se proporciona
en mem-tutorial-files / 01-BUILD / salida / ejemplo-.
2 En el cuadro de bsqueda en la parte superior central, seleccione AP ID o palabra clave, a
continuacin, escriba
1K4C y haga clic en el sitio Search. Cada archivo PDB en la base de datos tiene un cdigo
nico de cuatro letras o nmeros que identifican la misma. Tambin se puede buscar
utilizando el nombre de uno de los autores de publicacin.
3 En la parte izquierda, haga clic en Archivos de descarga a continuacin 1K4C, a continuacin, haga
clic en el texto AP. Se le pedir que guarde el archivo 1K4C.pdb, que se debe colocar en MEM-
tutorial-files / 01-BUILD /.
From ahora en adelante, en esta unidad vamos a trabajar con archivos que se encuentran en
MEM-tutorial-files / 01-BUILD.Utilice el comando cd en una ventana de terminal
(O en Tk consola de VMD en su caso) para establecer el directorio correcto.

4 Ahora cierra el navegador web, abierta VMD, y cargar el archivo que 1K4C.pdb
you acaba de salvar.
5 Este archivo contiene no slo un monmero de la protena KcsA, sino tambin todo lo
almacenado ms resuelto de la estructura cristalina. Configurar las siguientes representaciones
de ver esto:

Seleccin Mtodo de dibujo Mtodo para

protena NewCartoon colorear
Cadena
no protenas VDW Nombre

We ver que el archivo PDB tambin contiene molculas de agua, iones, gran an-
complejos tibody (utilizados para cristalizar el KcsA), as como algunos fragmentos
de lpidos (Fig. 2). Estos elementos estructurales diferentes se dividen en "cadenas" en
el archivo PDB, que veremos en detalle en la siguiente seccin. Por ahora, el punto es
simplemente que los archivos PDB que descarga contendrn las estructuras que desea
y estructuras que no lo hace, sino que stas se separan fcilmente de uno al otro.
1 CONSTRUIR un modelo estructural de KCSA 7

Figura 2: Las molculas de archivo

1K4C.pdb

Ahora que el archivo se carga, se puede explorar probando diferentes selecciones

y el dibujo opciones, y utilice el modo de ratn de consulta (men del ratn, o el
acceso directo
0) para ver informacin acerca de los tomos individuales. Familiarizarse con la
estructura y estar seguro de que usted ha identificado como KcsA la cadena que
contiene alfa-hlices. Trate de identificar el contenido del archivo antes
mencionados y que la cadena cada pertenece.

6 Una vez que haya terminado de explorar la estructura, cerca

de VMD.
Webpdb.VMD puede descargar un archivo pdb desde el Protein Data
Bank si una conexin de red disponible. Slo tienes que escribir el
cdigo de cuatro letras de la protena en la entrada de texto Nombre de
archivo de la ventana del explorador de archivos de la molcula y pulse
el botn Cargar. VMD lo descargar automticamente.
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 8
DE KCSA

coordenadasarchivo. El archivo 1K4C.pdb se corresponde con el de

rayos X la estructura de KcsA refinado en el 2,0 resolucin
proporcionada por Yu Feng Zhou, Jo~ao H. Morais-Cabral, Amelia
Kaufman, y Roderick MacKinnon no, Naturaleza 414, 43- 48 (2001).
Dr. MacKinnon recibi el 2003
Premio Nobel de Qumica por sus descubrimientos relativos a canales
en las membranas celulares.

1.2 Examinando el archivo

PDB
AP archivos son simplemente archivos de texto, y contienen ms informacin que
simplemente atmica
coordenadas.Aqu vamos a ver en el archivo que ha descargado en un editor de texto
y examinar su contenido.

1 Abra el archivo de 1K4C.pdb en su editor de texto favorito, por ejemplo,

escribiendo
emacs 1K4C.pdb en una ventana de terminal.

2 En primer lugar, slo tiene que mirar a travs del archivo. Ntese la gran
cantidad de informacin: autores, resolucin, mtodo experimental, la
estructura secundaria, etc. Las coordenadas atmicas no se inician hasta que la
3 Ahora vamos a ver algunas partes especficas que son particularmente
importantes.
Primero,mirar los artculos COMPND que comienzan en la lnea 4.
COMP MOL_ID: 1;
ND 2 MOLCULA: ANTICUERPO fragmento Fab de cadena
COMP 3 pesada; CADENA: A;
ND 4 MOL_ID: 2;
COMP 5 MOLCULA: cadena de anticuerpo fragmento Fab
ND 6 LUZ; CADENA: B;
COMP 7 MOL_ID: 3;
ND 8 MOLCULA: CANAL DE POTASIO
COMP 9 KCSA; CADENA: C;
ND 10 FRAGMENTO: CANAL DE POTASIO
COMP 11 KCSA;
ND 12 DIRIGIDO: S;
COMP MUTACIN: S
Estos artculos Lista de las cadenas de protenas que se consultaron ms arriba (Fig.
2). Nosotros
ver que la cadena C es el canal KcsA nos interesa. Adems de los mencionados aqu,
hay una cadena X que contiene el agua de molculas, iones y fragmentos de lpidos.

4 Queremos construir un sistema con un canal entero KcsA, un tetrmero, sin

embargo, la
AP archivo que hemos descargado contiene un nico monmero. Para generar
las subunidades que faltan, debemos aplicar matrices de transformacin. Estas
matrices se dan en la observacin 350 del archivo PDB. Encuentra esta seccin.
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 9
DE KCSA

OBSER 350 Biomolcula: 1

VACI 350 APLICA EL SIGUIENDO A CADENAS: ANTES
N 350 BIOMT 1 1.000000 A, DE 0.00000
OBSER 350 1 1 0.000000 0.000000 CRISTO 0.00000
VACI 350 BIOMT 1 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000
N 350 2 2 -1.000000 0.000000 0.000000 310.66000
OBSER 350 BIOMT 2 0.000000 0.000000 1.000000 310.66000
VACI 350 3 2 0.000000 -1.000000 0.000000 0.00000
N 350 BIOMT 3 0.000000 0.000000 0.000000 310.66000
OBSER 350 1 3 1.000000 -1.000000 1.000000 0.00000
350 BIOMT 3 0.000000 0.000000 0.000000 0.00000
VACI
350 2 4 0.000000 0.000000 0.000000 0.00000
N 350 BIOMT 4 -1.000000 1.000000 1.000000 310.66000
OBSER 350 3 4 0.000000 0.000000 0.000000 0.00000
VACI BIOMT 0.000000 0.000000
N 1 1.000000
5 Mira las lneas marcadas BIOMTn donde n es un nmero. Cada conjunto de
tres
lneas BIOMTn describe las rotaciones y traslaciones necesarias para
generar cada subunidad (observe que la primera matriz es simplemente
una matriz unidad, que corresponde a ninguna transformacin.) En la
siguiente seccin, se ver cmo utilizar estas matrices para generar el
6 Ahora desplazarse un poco ms, y mirar a la observacin 465 y 470
OBSERVACIN
lneas. Estas lneas describen los residuos y los tomos que faltan en la
estructura, respectivamente. Todas las estructuras faltan algunos tomos y
residuos y es importante para comprobar si faltan piezas son relevantes para la
cuestin que se estudie con las simulaciones. A continuacin se ver cmo
psfgen es capaz de adivinar las coordenadas de algunos de los tomos que
7 Cierre el editor de
texto.
1.3 La construccin de la KcsA
tetrmeros
A medida que descubre a s mismo, el archivo PDB 1K4C.pdb contiene slo una
subunidad de
el tetrmero KcsA. Sin embargo, para la mayora de las protenas, hay slo una
subunidad, o todas las subunidades estn presentes en el archivo PDB originales.
Aqu se va a construir todo el tetrmero KcsA, sealando que para muchas otras
protenas de membrana, este paso no ser necesario.

1 Iniciar una nueva sesin de VMD y seleccione el men Extensiones Tk

consola
elemento de la ventana VMD principal. Los siguientes cuatro pasos tambin se
replican en el buildtetra.tcl guin.
2 Crear y guardar el segmento A de la protena escribiendo la siguiente
composicin
comandos en la ventana Tk consola.
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 10
DE KCSA

cd "<su directorio principal> / MEM-tutorial-files / 01-BUILD /"

mol nueva 1K4C.pdb
establecer todos [atomselect encima de todo]
$ Un conjunto segname
todo writepdb KCSA-A.pdb
$ eliminar
todo en cuenta que siempre debe eliminar selecciones una vez que haya
Tenga
terminado con
ellos.
rotacionesy de las traducciones en VMD. Las matrices de
transformacin previstos en la observacin 350 de un archivo PDB
(lneas de marcado BIOMT) contienen
4 columnas y 3 filas cada uno. La matriz formada por las primeras tres
columnas y tres filas describe una rotacin, mientras que la ltima
ycolumna
traducciones, por una
describe lo que hay que aadir
traduccin. VMDuna cuarta
utiliza 4 fila
4({0 0 0 1})para
matrices a la
realizar rotaciones

Ahora va a transformar las coordenadas del segmento A en las del segmento B,

C, y D mediante el uso de las transformaciones de matriz adecuados como se describe
a continuacin. Tenga en cuenta que no vamos a repetir los iones de potasio ya que
estn ubicados en el eje de simetra de la protena.

3 Crear y guardar el segmento B de la protena escribiendo la siguiente

composicin
comandos en la ventana Tk consola.
set sel [atomselect superior "todo y no nombra K"]
$ Set sel segname B
$ Sel movimiento{{-1,0 0,0 0,0 310,66{}0.0 -1.0 0.0 310,66}
{0,0 0,0 1,0 0,0{}0,0 0,0 0,0 1,0}}
$ Sel writepdb KCSA-B.pdb
$ Borrar sel
Observamos que en el paso anterior se utiliz la segunda matriz (BIOMT2) de la
observacin
350 en 1K4C.pdb con una fila adicional. Asegrese de aadir espacios entre los
vectores delimitadas por{}.
4 Eliminar la molcula actual, cargar la estructura cristalina de nuevo y KcsA
crear segmento C de la protena escribiendo los siguientes comandos en el
tk ventana de la consola.
mol eliminar la parte superior
con nueva 1K4C.pdb
jun sel [atomselect superior "todo y no nombra K"]
$ Set sel segname C
to
$ Sel movimiento{{0.0 -1.0 0.0 310,66{}1,0 0,0 0,0 0,0}
{0,0 0,0 1,0 0,0{}0,0 0,0 0,0 1,0}}
$ Sel writepdb KCSA-C.pdb
$ Borrar sel
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 11
DE KCSA

5 Por ltimo, repita el mismo procedimiento para crear el segmento D escribiendo

el
los siguientes
mol eliminarcomandos:
la parte superior
con nueva 1K4C.pdb
jun sel [atomselect superior "todo y no nombra K"]
$ Set sel segname D
to
$ Sel movimiento{{0,0 1,0 0,0 0,0{}-1,0 0,0 0,0 310,66}
{0,0 0,0 1,0 0,0{}0,0 0,0 0,0 1,0}}
$ Sel writepdb KCSA-D.pdb
$ Borrar sel

6 Salir VMD y localizar los cuatro archivos con el nombre KCSA-A.pdb, KCSA-
B.pdb,
KCSA-C.pdb, y KCSA-D.pdb, cada uno que contiene un segmento de la
tetrmero. Si algo parece mal, utilice la secuencia de comandos
buildtetra.tcl para regenerar los archivos correctos.
Ahora que ha creado todos los monmeros va a fusionar en una sola
archivo.

7 Utilice el comando cat en Unix para concatenar todos los archivos escribiendo
en una Ter
minal ventana: gato KCSA KCSA-A.pdb-B.pdb KCSA KCSA-C.pdb-D.pdb
> KCSA.pdb. Si est utilizando Windows, utilice un editor de texto para
copiar y pegar el contenido de todos los archivos en un archivo llamado
8 El uso de un editor de texto, abra el archivo KCSA.pdb, la bsqueda de END y
eliminar la
lneas:
FIN
CRYST1 155,330 155,330 76,270 90,00 90,00 90,00 P 1 1
eseestn entre los segmentos A y B, B y C, as como las que se encuentran
entre los segmentos C y D.
editando directamente los archivos PDB (como se hizo anteriormente) no es
deseable, es posible que desee creacin
comi un script Tcl que realiza las mismas operaciones, preservando la indexacin y
el formato que en su lugar.

9 Guarde el archivo modificado como KCSA-ALL.pdb. Abrir VMD, cargue

KCSA-ALL.pdb,
y establecer las siguientes representaciones:
Seleccin Mtodo de dibujo Mtodo para
protena NewCartoon colorear
segname
no protenas VDW Nombre
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 12
DE KCSA

Figura 3: vistas superior y lateral del tetrmero KcsA con un complejo anticuerpo
(1K4C.pdb).

En VMD, usted debera ser capaz de ver el pleno, tetramrica, KcsA canal a lo largo
de
con agua, iones, fragmentos de lpidos, y los complejos de anticuerpo grandes usadas
para cristalizar (fig 3).

de transformacin descritos en la observacin 350 de un archivo PDB

en bruto y la salida de la forma multimrica de la protena en un
archivo PDB GLE pecado. Solucin: compruebe la secuencia de
comandos disponibles en
mono2polyhttp://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/script biblioteca
/ scripts /

configuracin es muy conveniente para la incorporacin de la protena en

una membrana y tambin facilita el uso de varias herramientas de
anlisis. Sin embargo, las protenas de membrana obtenidos a partir de la
Protein Data Bank a menudo no estn alineados a lo largo del eje z. Para
esos casos, VMD proporciona el plugin oriente, que permite la alineacin
de los ejes principales de una molcula para x, y, z, las direcciones. El
plug-in se puede encontrar
en:http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/script biblioteca /
scripts / Oriente / You tambin puede que desee comprobar las
"Orientaciones de las protenas en las membranas" en la base de
datoshttp://opm.phar.umich.edu/

1.4 La generacin de fibras discontinuas de

polister y PDB para KcsA
Ahora que usted ha construido toda la estructura de KcsA y su composicin de
anticuerpos
compleja, que va a generar archivos PSF y AP por slo la protena del canal, las
molculas de agua tallographic cristalitos, y los iones. Va a generar estos archivos
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 13
DE KCSA

intensificar el uso de VMD y psfgen. Los primeros cinco pasos se incluyen en la

secuencia de comandos
prepfiles.tcl.

1 Asegrese de que KCSA-ALL.pdb se carga en VMD como la molcula de la parte

superior. Entonces,
seleccione la opcin de men Tk consola Extensiones en la ventana VMD
principal.

2 Psfgen requiere no ligada de forma covalente segmentos de estar en los archivos

PDB separadas.
Guarde cada segmento KcsA escribiendo en la ventana de la consola Tk:
cd "<su directorio principal> / MEM-tutorial-files / 01-BUILD /" S
foreach{A B C D{}
establecer seg [top atomselect "segname $ S y la cadena C y protena"]
$ Seg writepdb seg $ S.pdb
$ Seg eliminar
}
Cada uno de los archivos que guard contiene un nico segmento (monmero) de la
KcsA
protena de membrana.

3 Ahora se ahorrar un segmento que contiene iones de potasio escribiendo en el

tk ventana de la consola:
sistema del pote [atomselect superior "nombre de K y resid 3001 3003 3005
3006"]
$ Establecer nombre
olla POT
$ POT conjunto
olla resname
Note que hemos seleccionado cuatro de los siete posibles iones de potasio. Nosotros
elegimos
una configuracin de iones que es realmente factible, con dos iones en el filtro de
selectividad y dos en los vestbulos intracelulares y extracelulares de la protena.
Vamos a utilizar el resto de los iones de colocar las molculas de agua en el filtro de

Los iones en el filtro de selectividad de KcsA. El filtro de selectividad

de canales potsicas est ocupado por dos o tres iones bajo condiciones
fisiolgicas. Hay cinco sitios de unin para K + iones, y un estado
tpico corresponden a los sitios 1 y 3 ocupados por de potasio, mientras
que una molcula de agua en el sitio de 2 separa ambos iones (este
estado se denota como [1,3]). estados transitorios de tipo 3 iones en el
filtro de selectividad, por ejemplo, [0,2,4], se producen entre los
estados [1,3] y [2,4].
4 Seleccione los restantes iones de potasio y transformarlas en molculas de agua
segundoy escribir en la ventana de la consola Tk:
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 14
DE KCSA

establecer npot [atomselect superior "nombre de K y resid 3002 3004

3007"]
$ npot Nombre del conjunto de
$ npot OH2
$ npot establecer resname
TIP3 writepdb
Siempre es deseable mantener la mayor cantidad de informacin de la estructura
cristalina
como sea posible. En este ejercicio no incluiremos en nuestros anticuerpos o
fragmentos de lpidos modelo resueltos en el cristal, pero vamos a mantener las
molculas de agua cristalogrficas situadas en las cercanas del canal y en las

5 Seleccionar y guardar las molculas de agua alrededor del canal KcsA tecleando
la ventana Tk consola:
foreach S{A B C D{}
conjunto wat [atomselect superior "segname $ S y
resname HOH y dentro de 10 (cadena C y protena) "]
$ Wat writepdb crystwat $ S.pdb
$ Wat borrar
}

En caso de que algo ha fallado durante los pasos anteriores, utilice la secuencia de
comandos prepfiles.tcl
para crear de nuevo los archivos correspondientes.

Water molculas.Water molculas situadas en las cavidades internas

de las protenas a menudo desempean un papel funcionalmente
relevante. Mientras que estas molculas de agua ya podran estar
presentes en la estructura cristalina que se utilice, es posible que desee
utilizar un software especfico para determinar si las molculas de agua
adi- cionales pueden ser colocados alrededor o en el interior de su
protena. El programaradiestesista haHa sido diseado especficamente
para colocar Wa- ter molculas en las cavidades internas, y mantiene o
los descarta basado en la energtica. Adems de aadir molculas de
agua, tambin se puede evaluar aguas cristalogrficos, tales como los
observados en 1K4C.pdb anteriormente.
Ahora usted debera tener AP archivos separados para cada segmento de protena,
para los iones,
y para las molculas de agua cristalogrficos seleccionados. Sin embargo, antes de
generar PSF y archivos PDB para el tetrmero KcsA, tambin tenemos que
comprobar si existen enlaces disul- fide entre los residuos de cistena y lo que los
estados de protonacin de residuos y histidinas son cargadas.

6 En VMD, que debe mostrar la molcula KCSA-ALL.pdb, crear

las siguientes representaciones grficas adicionales:

7 Al mirar a lo manifestado en la pantalla VMD OpenGL

you debe ser capaz de identificar un residuo de cistena por monmero (Cys90).
1 CONSTRUIR un modelo estructural de KCSA 15

Seleccin Mtodo de dibujo Mtodo para

protenas y la cadena C NewCartoon colorear
ColorID 6
cadena C y resname CYS VDW Nombre
resNombre HIS y segname A y C de VDW Nombre
la cadena
cadena C y segname A y protena y Regaliz Nombre
dentro de 5 resname SU

Dado que estos residuos estn muy lejos unos de otros, podemos concluir que
no hay enlaces disulfuro presentes en la estructura KcsA (Fig. 4 A). Esto puede
no ser el caso para otras protenas.

Figura 4: La inspeccin de la estructura KcsA. (A) Las cistena e histidina residuos.

se pueden observaron enlaces disulfuro evidentes o estados de protonacin histidina.
(B) residuo cargado. Observe cmo los residuos de carga se distribuye en reas
cessible acciones de disolvente. (C) La interaccin entre los residuos de glutamato 71
(Glu71) y aspartato 80 (Glu80). Uno de estos residuos deben compartir un protn con
la otra.

Por lo general, la inspeccin visual permite a uno identificar si la cadena lateral de

un
residuo de histidina est involucrado en el enlace de hidrgeno con las molculas
circundantes. Si ese es el caso, se puede entonces decidir si el nitrgeno de la
histidina es protonado (nombre de residuo "HSD"), el nitrgeno es protonado
( "HSE"), o ambos nitrgenos estn protonado ( "HSP").

8 Identificar las histidinas presentes en el segmento

A.
La estructura KcsA proporcionado en 1K4C.pdb cuenta con dos histidinas (His25 y
His124). His124 carece de la cadena lateral, y ningn estado de protonacin puede ser
obvia
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL die
DE KCSA cis

visualizado por His25 de residuos (Fig. 4 A). Por lo tanto vamos a modelar tanto
como residuos de HSE.

pH y gating dependiente de voltaje de KcsA. La identificacin de la

rect estado de protonacin angular de histidinas podra ser esencial en
las protenas tales como KcsA. Este canal de potasio se ha demostrado
que se activa mediante la unin en el lado intracelular del canal de
protones. Adems, aunque carece de un dominio KcsA cannica de
deteccin de voltaje, KcsA gating est influenciado por el voltaje. La
tensin y los sensores de pH son probablemente diferentes entidades
fsicas (Julio F. Cordero-Morales, Luis G. Cuello, y Eduardo Perozo,
Nature Structural & Molecular Biologa 13, 319-322, 2006).

9 Cree la siguiente representacin grfica adicional en VMD:

Seleccin Mtodo de dibujo Mtodo para

cargada y la cadena C Regaliz colorear
ResType

10 Identificar todos los residuos cargados. Mira residuos Arg27, Arg52, Arg64,
Arg89, Arg117, Arg121, Arg122 y. Tenga en cuenta que Arg117 est faltando a
su cadena lateral. Todas las argininas se encuentran en regiones que
probablemente estn solvatados (Fig. 4 B). Por lo tanto vamos a modelarlos de
los cargos.
11 Mira residuos Glu51, Glu71, Asp80, Glu118 y Glu120. Usted nota
algo inusual?

Residuos Asp80 y Glu71 estn muy cerca entre s e interactan realidad

medianteuna molcula de agua. Probablemente, ambos residuos comparten un protn
y no estn cargadas negativamente al mismo tiempo (Fig. 4 C). simulaciones de
dinmica molecular clsica no pueden describir con precisin dicho estado. Por lo
tanto, vamos a modelar Glu71 como un aminocido neutro mediante la aplicacin del
parche Glup, como se indica a continuacin.

12 Salir VMD.

estados de protonacinresiduos de ionizables. Por lo general es

deseable usar clculos avanzados de pKa para asignar de forma fiable
los estados de protonacin. El estado de ionizacin de residuos tales
como glutamato, aspartato, lisina, arginina y puede ser extremadamente
relevante para la funcin de una protena. Por ejemplo, el estado de
protonacin Glu71 se ha demostrado que es relevante para la dinmica
y la estabilidad de KcsA (Simon Bern`eche y Benoit Roux, Biophysical
Journal 82, 772-780, 2002).
You debe tener por ahora diez (!) archivos (segA.pdb, segB.pdb, segC.pdb, segD.pdb,
pot.pdb, filtwat.pdb, y crystwatA.pdb, crystwatB.pdb, crystwatC.pdb,
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 17
DE KCSA

crystwatD.pdb. Vamos a utilizar todos estos archivos para generar la

correspondiente PSF
y PDB con VMD, psfgen y el guin buildpsf.tcl proporcionada en memtut-files / 01-
BUILD /. El guin ya tiene en cuenta la informacin que se renen sobre el estado de
protonacin de los residuos ionizables.
13 Abra la buildpsf.tcl archivo con un editor de texto. El contenido debe ser
me gusta:
Package requieren psfgen
topologa ../top all27 lipid.rtf prot
pdbalias el residuo SU HSE
pdbalias tomo de CD
pdbalias tomo de ILE CD1
pdbalias residuo HOH O
foreach S{AOH2B C HOH
D{} TIP3
segmento $ S{
AP seg $ S.pdb
}
coordpdb seg $ S $ S.pdb
parchear Glup $ S: 71
regenerar ngulos diedros
segmento de aseo $ S{
ninguno de auto
AP crystwat $ S.pdb
}
coordpdb crystwat $ S.pdb WC $ S
}
segmento I{
pot.pdb AP
}
coordpdb pot.pdb I
segmento de
WF{
ninguno de auto
filtwat.pdb AP
}
coordpdb filtwat.pdb WF
guesscoord
writepdb kcsav.pdb
salida writepsf
kcsav.psf

14 Lea el guin con cuidado y asegrese de que entiende cada comando

lnea. Comprobamos cmo se seleccion el estado de protonacin de histidinas
y cmo se utiliz un parche para protonar Glu71.
El guin se basa cada segmento de la protena junto con las molculas de agua
cristalogrficas que hemos seleccionado, las molculas de agua que colocan en la
selectividad
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 18
DE KCSA

filtro, y potasio iones.

15 Ejecutar el script escribiendo en un terminal de VMD -e texto -dispdev Unix

buildpsf.tcl> buildpsf.rep (si est utilizando Mac OS X o Windows, escriba
el buildpsf.tcl fuente ventana Tk consola en su lugar).

16 Analizar la salida estndar de la secuencia de comandos abriendo el archivo

buildpsf.rep
en un editor de texto.
La mayor parte de los problemas cuando se construye un modelo de protenas se
producen en el paso anterior. Los mensajes de advertencia en buildpsf.rep tienden a
ser ignorados, pero asegrese
you a entender el motivo por el aviso.

17 Uso de VMD visualizar y comprobar los archivos kcsav.psf y kcsav.pdb gnero

nerada en el paso anterior.

Ahora tiene archivos PSF y AP para el tetrmero KcsA con iones y algunos
water molculas.

Usando AutoPSF. VMD proporciona un plugin llamado AutoPSF que

automatiza los pasos descritos anteriormente para la generacin de
fibras discontinuas de polister y PDB. Aunque es bueno que se
familiarice con los detalles de cada paso en el proceso de construccin
de la estructura, AutoPSF le puede ahorrar un tiempo considerable.
AutoPSF se puede iniciar mediante la seleccin de la opcin de men
slo si usted
Extensiones entiende completamente
Modelado lo que
automtico PSFest
constructor. Utilizar
haciendo.

Reto.Utilizando un enfoque similar a la utilizada para la construccin

del tetrmero KcsA y su PSF y PDB, trate ahora de construir la celda
unidad cristalogrfica contiene 8 molculas relacionadas con la
cristalografa. Mira OBSERVACIN 290 en el archivo 1K4C.pdb.

1.5 Solvatacin la protena

(Opcional)
El siguiente paso es un solvato de la protena. Para ello, utilizamos Helmut
Grubmuller de
solvato programa. Este programa va a rellenar cualquier espacio vaco en el interior
del poro, como pozos como lo rodean con agua. A continuacin, debe eliminar la
mayor parte de ella, ya que debe haber agua entre la protena y la bicapa lipdica
vamos a incrustarlo en adelante (tenga en cuenta que solvato de Grubmuller es un
solo software independiente, diferente que el paquete de Solvato proporcionada
dentro VMD). Si bien se recomienda, en aras del tiempo, esta seccin es opcional.

1 En primer lugar, introduzca solvato en una ventana de terminal para acceder a

informacin acerca
el programa y comprobar que se ha instalado correctamente.
1 CONSTRUIR un modelo estructural de KCSA 19

Figura 5: Sinopsis del filtro de selectividad de KcsA obtiene utilizando archivos

kcsav.psf
y kcsav.pdb. Obsrvese la presencia de tomos de hidrgeno y los iones de potasio
seleccionados, as como las molculas de agua cristalogrficos.

2 Ahora vamos a ejecutar Solvato en el archivo PDB que se acaba de producir.

Escribe el
siguiente comando en una ventana de terminal:
solvato -t 3 -n 8 -w kcsav solkcsa
Las opciones proporcionadas tienen los siguientes significados:
Opcin Sentido
-t 3 Hacer que el agua de una capa gruesa 3
-n 8 Utilice 8 Gaussianas de lmite disolvente
-w SalidawSlo molculas ater

Tambin notamos que hay que dejar el sufijo .pdb fuera de los nombres de
archivo. Esta
programa puede tardar unos minutos en ejecutarse.
1 CONSTRUIR un modelo estructural de KCSA 20

3 Ahora vamos a combinar el archivo PDB solkcsa.pdb de salida con el resto de

el sistema. Esto se hace introduciendo:
VMD texto -dispdev -e hacer solv.tcl
(O escribe en la fuente Tk Consola hacer solv.tcl).

El contenido de la secuencia
decon
comandos es:
Sol archivoentrada
junt solkcsa.pdb
KCSA kcsav InBase
o outbase kcsav solv prima
set
Package requieren psfgen
resetpsf
topologa ../top all27 lipid.rtf prot
segmento SOLV{
Ninguno de
auto
primera
NINGUNO
} NINGUNO
coordpdb $ sol
archivoentrada
$ readpsf{InBaseSOLV
KCSA}.psf
$ coordpdb{InBase KCSA}.pdb
$ writepdb{outbase}.pdb
$
writepsf{outbase}salida
.psf
Esto crea el segmento correspondiente de las nuevas molculas de agua, com-
Bining con su anterior libras por pie cuadrado y PDB.

Ahora vamos a eliminar las molculas de agua no deseados, lo que bsicamente

significa hallazgo
buenos criterios de seleccin en VMD. Aqu, queremos eliminar las molculas de
agua situadas en la interfaz de la protena de la membrana hidrfoba (Fig. 6).

juego de membrana-protena.La colocacin de una protena en la

membrana puede ser guiado por la hidrofobicidad de sus residuos. En
casos como KcsA, con slo mirar la protena se puede obtener una idea
de dnde se encuentra la regin hidrofbica de la membrana. Las
"Orientaciones de las protenas en las membranas (OPM)" base de
datos(Http://opm.phar.umich.edu/)y el programa "Pro-protena de
membrana Explorer" (MPEX, http://blanco.biomol.uci.edu/mpex)
pagrovideuna forma ms rigurosa, sobre la base de la energtica y la
termodinmica piedades propie-, para determinar qu dominios de la
protena estn incrustadas en la membrana.

4 Para hacer la seleccin ms fcil, lo primero que vamos a centrar todo en el

origen. Abierto
VMD y asegrese de que est en el MEM-tutorial-files / 01-BUILD /
directorio.
1 CONSTRUIR un modelo estructural de KCSA 21

5 Introduzca los siguientes comandos en la ventana de la consola

Tk: mol nueva raw.psf kcsav solv
con AddFile kcsav solv raw.pdb
jun todos [atomselect encima de
to todo]
$ Todo moveBy [vecinvert [centro de medida $ todo]]
resetview pantalla
El centro de mando medida encuentra el centro geomtrico de la seleccin que
le des. Tambin se puede encontrar un centro ponderada, como centro de masa,
centro de carga, etc. El resultado del comando es un vector, que invertimos con
el comando vecinvert, y esto a su vez es dado a la opcin de la seleccin
moveBy . Por ltimo, restablecer la vista para que podamos ver la molcula
centrada de nuevo.
6 En VMD, cree las siguientes representaciones grficas:

Seleccin Mtodo de dibujo Mtodo para

protena VDW colorear
ResType
agua Lnea ColorID 0
agua y z <-20 agua s ColorID 1
y z> 10 Lnea ColorID 1
s

Protenaresiduos son ahora de color en funcin de su hidrofobicidad y acidez.

residuos cargados son de color azul y rojo, residuos verdes son hidrfilas y residuos
blancos son hidrfobos. La parte hidrfoba de la protena ser la interaccin con la
membrana. Puede adivinar entonces la ubicacin de la membrana? Vamos a eliminar
las molculas de agua situadas en la regin hidrfoba de la protena (Fig. 6).

7 Cambie la representacin que implica molculas de agua de manera que cubra

diferencia
entregiones a lo largo del eje z. Es la seleccin original de las molculas de
agua razonable? Deja espacio para la membrana?
8 Ahora vamos a "marcar" el agua no queremos mantener. Para ello, utilizaremos
el campo Beta, el marcado "agua mala" con un valor beta de 1. Dado que la
mayor parte del agua se eliminarn, que marcar toda el agua solvato, a
continuacin, cambiar los que queremos mantener. Escriba en la ventana de la
consola Tk:
establecer solv [top atomselect "segname SOLV"]
$ Conjunto solv beta 1
El campo B-factor de AP. El campo "B" de un archivo PDB tpicamente
almacena el "factor de temperatura" para una estructura cristalina y es
ledo en el campo "Beta" de VMD. Ya que no est interesado
actualmente en esta informacin, se puede reciclar este campo para
almacenar nuestros propios valores numricos y utilizarlos para
diferentes propsitos.
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 22
DE KCSA

Figura 6: solvatacin reas expuestas de una protena de membrana. Los espectculos

panel de la izquierda
KcsA coloreado por tipo de residuos. Una cinta hidrfobo puede ser identificado. El
panel central muestra el resultado de la solvatacin en bruto. El panel de la derecha
representa KcsA rodeada de agua en sus centros de disolvente expuestos (dejando un
espacio adecuado para la membrana).

9 Ahora ponemos nuestro texto de seleccin, y anular la marca de las aguas

que se selecciona:
SelText conjunto "segname SOLV y mismo residuo que\
((Z <-20) o (z> 10)) "
set sel [atomselect mayor de $ SelText]
$ Set sel beta 0
Notamos la facilidad con que podemos seleccionar tomos en funcin de su
localizacin espacial. Otras selecciones geomtricas son igualmente fciles.
Observe tambin el uso de mismo residuo que: si cualquier tomo de la
molcula de agua se ajusta a los criterios geomtricos, todos los tomos de la
molcula estn marcados.
10 We eliminar por segid y resid, ya que cada molcula de agua es su propia
residuo. Por lo tanto, ahora hacemos una lista de stos para las molculas
marcadas:
con badwater [atomselect superior "nombre OH2 y beta> 0"]
junt seglist [$ badwater obtener segid]
o reslist [$ badwater llegar resid]
set
Ya que est eliminando por los residuos, slo queremos una entrada por cada
molcula
en cada una de estas listas, y as, se recogieron todos los tomos de oxgeno del
agua que estn marcados.
11 Ahora usamos psfgen para leer los archivos PSF y AP, y eliminar los residuos
we acaba de marcado:
1 CONSTRUCCIN DE UN MODELO ESTRUCTURAL 23
DE KCSA

mol borrar todo

Package requieren resetpsf
psfgen
topologa ../top all27 lipid.rtf prot
readpsf kcsav solv raw.psf
coordpdb kcsav solv raw.pdb
foreach segid $ seglist resid $ reslist{
delatom $ segid $ resid
}
writepdb KCSA solv.pdb
writepsf KCSA solv.psf

12 Comprobar con el VMD solv.pdb archivos y KCSA KCSA solv.psf. Si algun-

Lo que sali mal, es posible que desee utilizar la secuencia de comandos wat.tcl
remove para
crear los archivos correspondientes de nuevo.
We ahora tienen una protena completa con las molculas de agua en los lugares
adecuados
(Fig. 6). La mayor parte del trabajo duro est hecho. En la siguiente seccin, vamos a
integrar el sistema de protena en una bicapa lipdica, a continuacin, solvato todo el
sistema y ajustar la concentracin de iones adecuado.
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 24

2 La colocacin de KcsA en una

membrana
En esta segunda unidad, aprender cmo tomar su canal KcsA solvatada y
colocarlo en una membrana. A continuacin, se le solvato e ionizar todo el sistema.

2.1 La construccin de un parche de

membrana
La primera etapa es para preparar una membrana completa. Esto se hace
generalmente mediante la replicacin de un parche pre-equilibrada de la membrana y
agua, despus de recorte, si es necesario. El plug-in VMD membrana constructor
automatiza este proceso. Los pasos de esta seccin y la siguiente (Alineacin de
membrana y Pro- tein) tambin estn cubiertos en el guin memprot-align.tcl.
NOTA:Si se ha saltado la seccin anterior, debes usar los archivos
solv.psf
instanciaKCSA KCSA
de estos solv.pdb
archivos y de la salida
con kcsav.psf de ejemplo,
y kcsav.pdb o reemplazar
en la siguiente cada
instruccin
cins.

1 Vaya al directorio mem-tutorial-files / 02-membrana, abierta VMD,

y seleccione la opcin de men Modeling membrana Generador de
extensiones en la ventana VMD principal.

2 En la ventana de membrana, seleccione la POPC de lpidos y cambiar el bro

segundoRane X Longitud y la longitud de la membrana 80. Y para establecer la
salida Prefijo para
<Su directorio principal> / mem-tutorial-files / 02-MEMBRANA / POPC. Haga
clic en el botn Generar membrana.

Un parche de membrana POPC debera aparecer en la pantalla VMD OpenGL, junto

con los dos archivos correspondientes en el directorio de 02-membrana.

3 Configure las siguientes

representaciones:
Seleccin Mtodo de dibujo Mtodo para
resname POPC Lneas colorear
segname
agua Lneas Nombre

Ntese cmo los diferentes parches de membranas se han combinado y cmo

cabeza-grupos de lpidos estn solvatados (Fig. 7 A).

Ms membranas. En algunos casos, ciertos tipos de lpidos juegan un

papel clave en la funcin de las protenas de membrana. Por lo tanto,
las protenas de membrana deben ser colocados en su medio ambiente
similar a la nativa, es decir, en bicapas hidratados hechas de diferentes
combinaciones de lpidos que se encuentran en condiciones in vivo.
VMD proporciona membranas POPC y el Papa, pero el campo de
fuerza CHARMM es compatible con varios otros tipos de lpidos.
Recuerda configurar la temperatura de su simulacin por encima de la
temperatura de fusin de los lpidos utilizados en su sistema.
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 25

Figura 7: La reproduccin KcsA en un parche de membrana. (A) POPC parche de

membrana.
(B) protena KcsA y la ubicacin de grupos de cabeza de membrana.
2.2 Alineacin de membrana y de protenas
Ahora que tenemos un parche de membrana adecuada y una protena parcialmente
solvatadas,
el siguiente paso es para alinearlos entre s correctamente.
1 Abra la ventana Tk consola. Asegrese de que su popc.psf / AP archivos se cargan
como la molcula de la parte superior y establecer el directorio actual a memtut-files /
02-membrana.
2 Crear una seleccin de la membrana y cargar el conjunto de archivos para KcsA
con
conlosPOPC
siguientes comandos:
[atomselect encima de todo]
jun kcsamol [mol nueva solv.psf ../01-BUILD/kcsa]
to AddFile ../01-BUILD/kcsa solv.pdb
set KCSA [atomselect $ kcsamol todos]
Sist
3 En primer lugar, vamos a alinear la membrana con su centro de masa:
$ POPC moveBy [vecinvert [medida de centro $ POPC masa peso]]
$ POPC writepdb POPC TEMP.pdb

4 Para el canal, vamos a utilizar el centro de masa del vestbulo principal y central,
es decir, los residuos 97-106. Esta eleccin se debe adaptar a la protena de
membrana especfico que se est simulando. Tambin vamos a girar el canal
sobre el eje z, para alinear el extremo superior ms o menos cuadrada con los
ejes x e y ejes:
chaleco conjunto [ "resid protenas y 97 a la de 106" atomselect $
kcsamol]
$ KCSA moveBy [vecinvert [medida de centro $ chaleco masa peso]]
resetview pantalla
$ KCSA movimiento [TransAxis z -25]
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 26

Observe el uso de la funcin TransAxis. Esta es una de las pocas funciones

que generan matrices de transformacin del tipo que hicimos desde el archivo
PDB ori- ginal. En este caso, la matriz gira alrededor del eje z por -25 grados.

5 Ahora simplemente combinamos los dos archivos temporales en un conjunto de

fibras discontinuas de polister y
archivos PDB:
mol borrar todo
Package requieren resetpsf
psfgen
readpsf popc.psf
coordpdb POPC
readpsf ../01-BUILD/kcsa solv.psf
coordpdb KCSA
writepdb TEMP.pdb
KCSA raw.psf POPC
writepsf KCSA raw.pdb
borrado dePOPC
archivos KCSA
TEMP.pdb
borrado de archivos POPC
TEMP.pdb
6 Cargar los archivos KCSA KCSA POPC raw.psf y POPC raw.pdb en VMD. Si
algo sali mal, es posible que desee para regenerar los archivos mediante la
secuencia de comandos memprot-align.tcl.

7 Antes de continuar, vamos a usar uno de los muchos mtodos de coloracin de

VMD a
asegurarse de que nuestra protena est alineada con la membrana de una
manera natural. Para ello, configure las siguientes representaciones:
Seleccin Mtodo de dibujo Mtodo para
protena VDW colorear
ResType
resname POPC y el nombre P1 VDW Nombre

Los residuos de la protena ahora estn coloreados en base a su hidrofobicidad

y acidez. Vemos que los fosfatos de grupo de cabeza (etiquetadas P1 para las
membranas POPC) se alinean bien con los residuos de tirosina, de color verde
en las esquinas superiores de la KcsA, as como los residuos de arginina en las
esquinas inferiores (Fig. 7 B). Los residuos blancos entre los grupos de cabeza
son hidrfobos, lo que significa que tenemos una buena alineacin con la
membrana. En algunos casos, puede que sea necesario para alinear la protena y
de la membrana de forma manual.
A continuacin, vamos a echar un vistazo a las lpidos se
superponen la KcsA.

2.3 Combinacinde membrana y de protenas

Ahora tenemos que hacer espacio para el KcsA en la capa de membrana, de modo
que la
la protena no est superpuesta en las molculas de lpidos. Al igual que en la seccin
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 27

GrubmuSolvato programa de ller, queremos encontrar buenos criterios de seleccin

en VMD,
y luego marcar las molculas que queremos eliminar. Todos los comandos de esta
seccin tambin se incluyen en el guin lipwat.tcl quitar.
We volver a utilizar el campo beta de los tomos para marcar los lpidos "malos".
Esta
tiempo, sin embargo, la seleccin ser un poco ms complicado.

1 Introduzca los siguientes comandos para establecer beta de todos los

tomos
mola eliminar
cero: todos
mol nueva raw.psf KCSA
mol POPC
AddFile KCSA POPC raw.pdb
SE POPC "POPC resname"
T todos [atomselect encima de
SE todo]
$ Todo el conjunto
beta 0
Tenga en cuenta que tambin establecer un acceso directo para la seleccin
POPC POPC resname.
2 Vamos a hacer tres selecciones diferentes, la primera marca de lpidos cuya fosfo
rus tomo se encuentre dentro de la regin de la KcsA, luego marcar restante
lpidos dentro de una cierta distancia de la protena:
establecer seltext1 "$ POPC y mismo como\
residuo abs (y) <15)
(Nombre P1 y z> 0 y abs (x) <15 y " como\ abs
establecer seltext2 "$ POPC y mismo (y) <10) "
conresiduo (nombre
seltext3 "$ POPCP1yymismo
z <0 y abs (x) <10 y como (a menos de 0,6 de
residuo
jun sel1 [atomselect part $ Seltext1] protena) "
to sel2 [atomselect e $ Seltext2]
Set SEL [atomselect sup $ Seltext3]
Est erio
$ sel13 con beta 1
$ sel2 junt beta 1
$ o beta 1
SEL3 set [atomselect
con badlipid superior "nombre P1 y beta> 0"]
junt seglistlipid [$ badlipid get segid]
o reslistlipid [$ badlipid obtener resid]
set
We elegir basado en el tomo de fsforo, porque slo hay una de
ellos por lpidos POPC.

Tenga en cuenta que para una protena cilndrica que podra haber utilizado un
criterio geomtricas como
x 2 + y 2> 225, pero debido a la forma cnica en lugar de KcsA, hemos utilizado
dos selecciones diferentes para las dos capas de lpidos. En el presente ejemplo,
la tercera seleccin (seltext3) puede alterar temporalmente las dos selecciones
anteriores, pero que puede no ser el caso en las protenas que ofrecen los
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 28

3 VMD utilizar para mirar las selecciones creadas y tratar de encontrar una mejor
seleccin
criterios con el fin de mantener la mayor cantidad de lpidos que no se solapan
posible alrededor
4 Como vimos anteriormente, la membrana tambin vino con algunas molculas
de agua
solvatar sus grupos de cabeza. Debemos eliminar las molculas de agua se
solapan
seltext4 con la protena:
conjunto "(agua y no segname WCA WCB CMI WCD SOLV) \
y mismo residuo que dentro de WF
((Mismo residuo que (nombre 3 de\ 0)) o protena) "
y beta>
P1
seltext5 conjunto "segname SOLV y mismo residuo que\
dentro 3 de los lpidos "
fij a [Top atomselect $ Seltext4]
SEL4 sel5 [Top atomselect $ Seltext5]
$ SEL4 conjunto
beta 1
$
conSel5badwater
conjunto[atomselect superior "OH2 nombre y > 0 "]
junt seglistwater [$ badwater obtener
beta segid]
o reslistwater [$ badwater obtener resid]
set
5 Ahora, eliminamos los tomos como lo hicimos
antes:
mol borrar todo
resetpsf
readpsf
coordpdb KCSA
KCSAPOPC
POPC raw.psf
raw.pdb
foreach segid $ seglistlipid resid $ reslistlipid {
delatom $ segid $ resid
}
foreach segid $ seglistwater resid $ reslistwater delatom $ {
segid $ resid
}
writepsf KCSA popc.psf
writepdb KCSA popc.pdb

6 Cargar el popc.psf archivos y KCSA KCSA popc.pdb en VMD y verificacin

eseno hay solapamiento entre el canal y la membrana (Fig. 8).
Como de costumbre, si detecta algo mal, es posible que desee para regenerar los
archivos utilizando la secuencia de comandos de eliminacin lipwat.tcl

We son casi all! Slo tenemos que solvato (con VMD esta vez) y se ionizan
el sistema, entonces podemos empezar a utilizar NAMD para llevar a cabo una
simulacin de realidad
KcsA en su ambiente nativo.
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 29

Figura 8: vistas superior y lateral de KcsA incrustados en un parche de membrana

(obtenida usando archivos popc.psf KCSA y popc.pdb KCSA). Tenga en cuenta la
falta de solapamiento
segundontre la protena y la membrana.

2.4 Solvatacin y de
ionizacin
We ahora solvato y ionizar el sistema. Plugin de Solvato de VMD es bastante
simple: se coloca el soluto en una caja de agua de un tamao especificado, a
continuacin, elimina el agua que est dentro de una cierta distancia de corte. Vamos
a eliminar el agua que se suma el interior de la bicapa lipdica tambin. Los pasos 2-6
se incluyen tambin en el guin remove.tcl solv.

1 En primer lugar, vamos a usar la opcin MinMax del comando de medicin para
ver qu tan grande
nuestra capa de agua
mol eliminar todoses:
con popc.psf KCSA newf
jun AddFile KCSA popc.pdb
to agua [atomselect aguas arriba]
$ medir el agua MinMax
mol

You debe obtener algo como lo siguiente:

{-37.5699996948 -37,6370010376 -39,4020004272} \
{38.3590011597 38.8470001221 49.1450004578}

El tamao de la caja de agua que hacemos debe ser de tamao similar en el

plano xy. De hecho, una caja de agua un poco ms pequeo en el plano xy es
deseable, ya que las membranas no-equilibrio tienden a encogerse. En la
direccin z, hay ms posibilidades de eleccin. El tamao depende a menudo de
la distancia al peridica
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 30

la imagen y el nmero total de tomos en su sistema: tener un menor

wcaja ater es una forma barata de hacer un sistema ms pequeo.
Tamao de la clula de simulacin. condiciones lmite peridicas se
utilizan generalmente para evitar efectos de superficie y porque su uso
permite el clculo eficiente de largo alcance interacciones
electrostticas. Sin embargo, si el tamao de la clula de simulacin es
demasiado pequeo, las imgenes peridicas interactan con ellos
mismos afectar el resultado de la simulacin. Al elegir el tamao de su
parche de membrana y caja de agua, asegrese de dejar al menos 15 A
de espacio entre la protena y los lmites de las celdas de simulacin en
cada direccin. protenas altamente cargados pueden requerir an ms
espaciado. Tambin se puede utilizar la longitud de Debye de la
solucin como un buen criterio para determinar la distancia entre las
imgenes peridicas. En cualquier caso, tener en cuenta que el ejemplo
dado aqu est diseado para usuarios con acceso limitado a los
recursos computacionales (un parche de membrana ms grande sera
deseable).
2 Haremos nuestro sistema un buen paraleleppedo, ~ 2 38 A en el plano de la
membrana. Escriba los siguientes comandos para hacer esto:
paquete de requerir solvato
solvato KCSA KCSA popc.psf popc.pdb -o KCSA POPC -b temperatura del 1.5 \
agua
-mnimo mximo{{-38 -38 -39{}39 39 50}}
La opcin -b 1.5 dice solvato eliminar los tomos dentro de 1,5 A del soluto.
Ahora vamos a echar un vistazo a lo que ha producido solvato.

3 Eliminar la molcula KCSA POPC y la carga, si no est ya cargado, los archivos

KCSA POPC TEMP.pdb agua y KCSA POPC TEMP.psf agua.
4 Mostrar solo segid WT1 a WT99. Por defecto, el segid del agua pro-
producida por solvato comienza con el WT prefijo.
You puede ver que solvato poner un poco de agua en el interior de la bicapa lipdica
y alrededor de la protena (Fig. 9). No queremos que esto, as que una vez ms
debemos eliminar algunos tomos.

5 Tipo de la ventana de la consola Tk:

establecer todos [atomselect encima de todo]
$ Todo el conjunto beta 0
SelText conjunto "segid WT1 a WT99 y el mismo residuo que abs (z) <25" set
sel [atomselect mayor de $ SelText]
$ Set sel beta 1
con badwater [atomselect superior "nombre OH2 y beta> 0"]
junt seglist [$ badwater obtener segid]
o reslist [$ badwater llegar resid]
set
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 31

Figura 9: Resultado de solvatacin. las molculas de agua de color rojo se encuentran

en el miembro de
regin de membrana y debe ser eliminado.
mol borrar todo
Package requieren resetpsf
psfgen
readpsf KCSA POPC TEMP.psf agua
coordpdb KCSA POPC TEMP.pdb agua
foreach segid $ seglist resid $ reslist{
delatom $ segid $ resid
}
writepdb KCSA popcw.pdb
writepsf KCSA popcw.psf
presentar eliminar KCSA POPC TEMP.psf
agua
presentar eliminar KCSA POPC TEMP.pdb
agua
6 cargar archivos popcw.psf KCSA KCSA y popcw.pdb. Compruebe que su ma
TEM est bien y, si es necesario, vuelva a generar los archivos mediante la
secuencia de comandos
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 32

solv remove.tcl.

Ahora vamos a utilizar el plugin Autoionize, lo que crea una concentracin inica
especificada
tracinde cualquiera de KCl o NaCl por transmutacin de las molculas de agua al
azar en iones. El plug-in tambin neutraliza el sistema, lo cual es importante para la
electrosttica de largo alcance de NAMD para que funcione correctamente. Tenga en
cuenta que la ionizacin de su sistema debe hacerse cuando todo lo dems (protenas,

7 Seleccione Extensiones Modeling Aadir iones en la ventana VMD

principal, a continuacin,
introducir los siguientes parmetros:
Opcin Ajuste
PSF de entrada popcw.psf KCSA
Entrada Salida KCSA KCSA
AP prefijo popcw.pdb
Concentracin popcwi
Neutralizar 0,4
Min. distancia de molcula YeS
Min. distancia entre ID iones 5
Segmento 5
Cambiar a KCl ION
YeS

A continuacin, haga clic en Autoionize y esperar un minuto o dos. Es as de

simple! Nota
esewe han utilizado 0,2 M KCl como la concentracin inica de nuestro sistema
(0,2 x 2).
8 Cargar
dentro VMD losy archivos
comprobarde que
salida
losdeiones
autoinize (popcwi.psf
son realmente all KCSA
y que elKCSA)
sistemay es
neutral(Fig. 10).

concentracin inica. Los organismos vivos ejercen un control riguroso

de la concentracin de iones dentro y fuera de las clulas. Por lo tanto,
debe configurar la concentracin de iones adecuado para su sistema
simulado guiado por las correspondientes condiciones fisiolgicas o
experimentales en los que trabaja su protena (por lo general entre 50 y
100 mM de iones monovalentes estndar).

Finalmente, despus de todo este trabajo, estamos listos para la minimizacin y el

equilibrio
con NAMD. Esto se describe en la siguiente unidad.
2 COLOCACIN KCSA en una membrana 33

Figura 10: sistema de simulacin final incluyendo el canal KcsA, un POPC bro
brana, agua e iones.
3 Ejecucin de una simulacin de KCSA 34

3 Ejecucin de una simulacinde

KcsA
En la unidad 3, que va a utilizar el modelo que contiene KcsA incrustado en una
membrana de
pagealice simulaciones de dinmica molecular y obtener un sistema equilibrado.
3.1 Derritiendoof Lipid
colas
Cuando se utiliza un parche de membrana que no ha sido equilibrada, como esos
pro-
provisto por el plugin de membrana de VMD, es muy recomendable realizar primero
una simulacin en la que todo (agua, iones, protenas, lpidos grupos de cabeza),
excepto las colas de lpidos, es fijo. De esta manera se induce el trastorno apropiado
de una bicapa de tipo fluido. Aqu vamos a preparar y ejecutar dicha simulacin.

1 Ajuste el directorio actual en mem-tutorial-files / 03-MINEQ /

2 Abra el archivo KCSA popcwimineq-01.conf en un editor de texto.

We asuma que usted est familiarizado con los archivos de configuracin NAMD
(de lo contrario tener una
mirar el tutorial NAMD). Sin embargo, vamos a discutir puntos especficos que son
importantes para las simulaciones de protenas de membrana y por esta simulacin
particular de KcsA.

3 Busque la seccin denominada #INPUT. Debe quedar

como:
# Input
paraTypeCharm en
m ../par_all27_prot_lipidNBFIX.prm
parmetros
Tenga en cuenta que no estamos utilizando el archivo de parmetros CHARMM
estndar. Estamos
el uso de un archivo de parmetros que contiene la llamada correccin "NBFIX" para
la interaccin entre los oxgenos carbonlicos y los iones de potasio, especialmente
importante para la descripcin de los iones en el filtro de selectividad KcsA.

4 Abra el archivo par all27 lipidNBFIX.prm prot en un editor de

texto.
5 Al final del archivo, usted debera ser capaz de encontrar una seccin con la
etiqueta
NBFIX:
NBFIX
! ----- Potasio Modificado ! Libre E relativa E interaccin
! la norma K + con aisladas NMA
O POT -0,1021763 3.600750! S.Noskov y B.Roux, 2004
O SOD -0,0750200 3.27450 ! -16.25
En esta seccin prevalece sobre las interacciones estndar de Lennard-Jones para el
oxgeno y
pagotassiumiones, y para los iones de oxgeno y de sodio.
3 RUnning una simulacin de KCSA 35

NBFIX. Los parmetros estndar de iones han sido optimizados para

reproducir las propiedades a granel de soluciones inicas, mientras que
el parme- NBFIX ciente fueron optimizados para el caso especfico de
los iones que interactan con los tomos de oxgeno carbonilo segn lo
determinado por Sergei Noskov, Si- mon Bern`eche y Benoit Roux ,
Naturaleza 431, 830 a 834 de 2004.

6 Cierre el editor de texto con el archivo de parmetros y volver al editor

con el archivo de configuracin NAMD.

7 Busque la seccin con la etiqueta # peridicas Condiciones de contorno. Debera

parece:

# Condiciones de contorno peridicas

# NOTA: No establezca la base de celda peridica si tambin tiene
# especificado un .xsc archivo de
Si {1} { reinicio!
cellBasisVector1 77. 0. 0.
cellBasisVector2 0. 77. 0.
cellBasisVector3 0. 0. 90.
cellOrigin 0,285711854696 0,299352765083 6,22171497345
}
WrapWate en
r wrapAll en

We comprobar con VMD que el tamao y el centro del sistema son correctos.

8 Abra VMD y cargar los archivos y ../02-MEMBRANE/kcsa popcwi.psf

popcwi.pdb ../02-MEMBRANE/kcsa. Asegrese de cargar el archivo PDB
dentro el archivo PSF.

9 Abra la ventana Tk consola y escriba:

establec [Atomselect encima de
er todos todo]
medida centro de
medida todo MinMax
La posicin del centro de la celda debe coincidir aproximadamente la posicin que se
encuentra en el archivo de configuracin NAMD. Sin embargo, la medida MinMax
comando
regresovalores equivalentes a las dimensiones de clulas que son ms grandes de lo
que en realidad tenemos en el archivo de configuracin ({84, 81, 90} en lugar de {77,
77, 90}). Esta aparente contradiccin es causada por fragmentos de molculas de
lpidos, que generalmente sobresalen desde el lmite de la clula de simulacin, pero
no se envuelven a menos que el centro de masa de todo el lpido cruza el lmite
peridico. Uno puede evitar este problema mediante el uso de una seleccin que no
3 Ejecucin de una simulacin de KCSA 36

10 Type en la consola de Tk:

conjunto wat [atomselect aguas arriba]
medir MinMax $ wat
La salida de medida MinMax ahora debe ser coherente con el tamao de celda
ulacin sim- especificado en el archivo de configuracin NAMD. Siempre es
conveniente dar un poco de extra (~ 1 A) el espacio entre los tomos de
contorno de su sistema y los lmites de la celda de simulacin.

11 Permite comprobar visualmente nuestras dimensiones de la celda peridicas.

Escriba en lapart
molinfo consola
con de
u Tk:
77
molinfo e junt n 77
molinfo sup o a 90
erio set n
12 Seleccionar los Grficos Representaciones ... del men y luego haga clic en
el
PAGeriodic pestaa de la ventana grfica Representaciones. Seleccionar
diferentes imgenes peridicas para elaborar y comprobar que la diferencia
entre las imgenes peridicas es pequeo o insignificante (uso tambin de las
dimensiones celulares obtenidas cuando se utiliza el "todo" seleccin y
comprobar los grandes huecos indeseables presentes entre las imgenes

Figura 11: Configuracin de las dimensiones de la celda adecuadas para las

condiciones de contorno peridicas.
Panel izquierdo muestra disposicin peridica con huecos (tamao sobrestimado del
sistema). el panel central muestra el mismo sistema pero utilizando una mejor
estimacin del tamao de la clula de simulacin. Panel derecho, arreglo peridico
despus de varias etapas de minimizacin y equilibrado.

13 Cerrar VMD y volver al editor de texto que contiene el archivo de configuracin

NAMD. Busque la seccin etiquetada #PME (para la electrosttica de todo el
sistema peridico). Debe quedar como:

#PME (Para la electrosttica de todo el sistema

peridico)
Si
PM {1} { s
E
3 Ejecucin de una simulacin de KCSA 37

PMEGridSize 80
X 80
PMEGridSize 90
Y
PMEGridSize
Nota cmo elegir cuidadosamente el tamao de la cuadrcula de partculas de malla
Ewald de manera que tenga al menos un punto de la cuadrcula por A en cada
direccin, y tambin de tal manera que el nmero de puntos de la cuadrcula es un
mltiplo de dos, tres, o cinco.

14 Ahora busque la seccin # fijo tomos de restriccin. Debe tener un aspecto

me gusta:

# Los tomos fijos restriccin (AP establecer beta-columna

para 1)
Si {1} {
fixedAtoms en
fixedAtomsForces kcsa_popcwi.fix
fixedAtomsFile segundo
fixedAtomsCol en
}

En esta seccin se utiliza el archivo de popcwi.fix KCSA para determinar qu tomos

del
simuladose llevar a cabo sistema fijo en el espacio. Vamos a crear este archivo en
breve.

15 Ir hasta el final del archivo de configuracin. Usted debe encontrar el siguiente

mandos:

# Minimizacin
Si {1}
{minimizar 1000
reinitvels temperatura $
}
ejecutar ; # 0.5 ns
250000
que indican que NAMD 1000 se ejecutar medidas de minimizacin, a
continuacin,
reiniciarvelocities de acuerdo lo har
con la temperatura deseada, y luego se ejecutar
la dinmica de 0,5 ns (utilizando un paso de tiempo 2 fs).

16 Cierre el editor de texto.

Antes de realizar la simulacin, tenemos que generar un archivo que indica qu

tomos sern fijos.

17 Abrir VMD y el tipo de la consola de Tk:

3 Ejecucin de una simulacin de KCSA 38

mol nueva popcwi.psf ../02-

con MEMBRANE/kcsa
AddFile ../02-MEMBRANE/kcsa popcwi.pdb
jun todos [top atomselect "todos"]
$ Todo el conjunto beta 0
to
conjunto fijo [atomselect superior "olla de agua o el nombre de CLA o \
protena o
(Cadena L y el nombre de O2 O3 O4 P1 O1 C15 H52 H51 H11 H12 C11\
N C14 H42 H43 H41 H22 H23 H21 C12 C13 H33 H31 H32) "]
beta conjunto fijo $ 1
$ Todo writepdb KCSA popcwi.fix
salid
a
Los comandos que ingres anteriormente creado un archivo, popcwi.fix KCSA, que
contiene
ceros en el campo Beta de todos los tomos de colas de lpidos, y unos en el campo
Beta de todos
otros tomos.

Figura 12: Melting colas de

lpidos

18 Ejecutar la simulacin utilizando namd2. NAMD instalaciones habituales se ac-

CEPT ellnea de comando
namd2 KCSA popcwimineq-01.conf> KCSA popcwimineq-01.log
en una ventana de terminal. Compruebe su instalacin local de NAMD y
ejecutarlo
en consecuencia.

Corriendo. El sistema que contiene solvatada KcsA incrustado en una

membrana comprende ms de 40.000 tomos. A menos que tenga
acceso a una computadora en paralelo con 10 o ms nodos, sugerimos
que nos fijamos en las trayectorias previstas en el directorio de
ejemplo-salida.
3 Ejecucin de una simulacin de KCSA 39

Washingtonrning. Los archivos de configuracin proporcionados en

este tutorial estn diseados para usuarios con recursos
computacionales limitados. Por lo tanto, las simulaciones se realizaron
con un paso de tiempo 2 fs, el algoritmo SHAKE por tomos de
hidrgeno, y un tiempo de paso a paso mltiple algoritmo para el
clculo de largo alcance interacciones electrostticas. Idealmente, se
debe utilizar un 1 fs paso de tiempo uniforme sin que se mueva. Esto es
particularmente importante para las simulaciones realizadas en largas
energa constante. Sin embargo, es posible que desee seguir
manteniendo las molculas de agua rgida, ya que el campo de fuerza
19 Una vez que la simulacin se realiza, abierta VMD y cargar la
trayectoria
KCSA popcwimineq-01.dcd
popcwi.psf KCSA. en la parte superior del archivo

Si la simulacin se ha realizado correctamente, colas de lpidos debe parecerse

desordenada (Fig. 12).

3.2 Minimizacin y Equilibrado con Protena restringida

We no estn listos para el funcionamiento del sistema con dinmica completa.
Porque nosotros
han puesto nuestro sistema, junto con la mano, tiene muchas posiciones atmicas no
naturales. Si tratamos de hacer una dinmica corren ahora, sera un error de
inmediato, con muchos tomos en movimiento a una velocidad muy alta. Por lo tanto,
nuestra segunda carrera con NAMD ser un "minimizacin" ejecutar, que
simplemente gua el sistema al mnimo de energa local ms cercano en el espacio de
configuracin. Minimizacin ser entonces seguida por una equilibracin con la
protena restringida, a fin de permitir el medio ambiente para relajarse primero.

1 Ajuste el directorio actual en mem-tutorial-files / 03-MINEQ /

2 Abra el archivo KCSA popcwimineq-02.conf en un editor de texto.

3 Compruebe que el outputName se ha modificado de manera apropiada.

4 Vaya a la seccin # Continuando un trabajo a partir de los archivos de
reinicio:
# Continuando un trabajo a partir de los archivos
de reinicio Si {1} {
conjunto inputName kcsa_popcwimineq-01
binCoordinates $ inputname.restart.coor
binVelocities $ inputname.restart.vel
extendedSystem $ inputname.restart.xsc
}firsttimestep 251000
Observamos cmo hemos activado esta seccin ( "si {1} {" en lugar de "si {0} {")
por lo
NAMD puede leer los archivos de reinicio de la ejecucin anterior. El contador de
pasos de tiempo tambin se ha actualizado.
3 Ejecucin de una simulacin de KCSA 40

5 Compruebe que la lnea de "temperatura de temperatura $" se ha comentado

(con un #).

Ahora que las velocidades (que determinan la temperatura) se han ledo de la

ejecucin anterior, no es necesario ajustar la temperatura inicial aqu. Tenga en cuenta
tambin que la informacin sobre la celda peridica tambin se lee de un archivo de
reinicio, y por lo tanto la seccin # peridica las condiciones de frontera se encuentra
desactivado.

6 Debido a que ya no podremos solucionar los tomos en el sistema, compruebe

que el # fijo
seccin tomos de restriccin se encuentra desactivado tambin.
7 Busque la seccin con la etiqueta ## parmetros extra. Hay dos Adems
cionales conjuntos de parmetros de esta seccin:

restricciones en
consexp 2
consref kcsa_popcwi.pdb
conskfile kcsa_popcwin.cnst
conskcol B
margen de 3

tclforces en
con waterCheckFreq 100
junt lipidCheckFreq 100
o allatompdb ../02-
set
tclForcesScript MEMBRANE/kcsa_popcwi.pdb
keep_water_out.tcl
El primer conjunto de parmetros adicionales imponer limitaciones armnicas en la
pro-
tein. Armnicos restricciones se aplican utilizando un archivo PDB que las etiquetas
de los tomos estn restringidos. Este archivo se generar a continuacin. El uso de
tales limitaciones armnicas permite lpidos, agua y los iones de adaptarse a la
Adems, utilizamos el comando margen de 3 a permitir grandes fluctuaciones de
volumen
eseson tpicos durante los primeros dinmica de un nuevo sistema en una CNN ensem-
bles. De lo contrario, la simulacin es probable que terminar con el mensaje: Error
grave: Peridico de clulas se ha vuelto demasiado pequeo para rejilla programa
original! (En cuyo caso slo debe reiniciar la simulacin de los ltimos archivos
El segundo conjunto de parmetros adicionales llama a un script Tcl, llamado
mantener out.tcl agua, lo que evita la hidratacin de la membrana inter-protena
enfrentar durante la
adaptacin.
3 Ejecucin de una simulacin de KCSA 41

Bombeo de agua.El mantener el agua out.tcl script Tcl

automticamente aplica fuerzas a las molculas de agua que entra en la
regin hidrofbica de la membrana. El script hace uso del mdulo
Fuerzas Tcl NAMD. Le animamos a mirar en el guin, utilizarlo y
modificarlo para adaptarlo a sus necesidades. Una descripcin detallada
de la secuencia de comandos se puede encontrar en el tutorial "Fuerzas
definidos por el usuario en NAMD". Observamos cmo la
modificamos para excluir molculas de agua presentes en las cavidades
Antes de realizar la simulacin, tenemos que generar un archivo para el armnico
restriccionesen la protena.

8 Abra VMD y el tipo de la consola de Tk:

mol nueva popcwi.psf ../02-
con MEMBRANE/kcsa
AddFile ../02-MEMBRANE/kcsa popcwi.pdb
jun todos [top atomselect "todos"]
$ Todo el conjunto beta 0
to
establecer prot [ "protena" top
atomselect]
$ Prot conjunto beta 1
$ Todo writepdb KCSA popcwi.cnst
salid
a
Aqu hemos utilizado las coordenadas almacenadas en popcwi.pdb KCSA
porque
ejecucinen anterior
el se fijaron todos los tomos de la protena. De lo contrario, se
habra utilizado el archivo de reinicio KCSA popcwimineq-01.restart.coor
lugar.
Los comandos que ingres anteriormente creado un archivo, popcwi.cnst KCSA, que
con- en el campo contiene Beta de todos los tomos excepto aquellos que pertenecen
ceros
a la protena,
que contienen un 1. Este ltimo valor corresponde a la constante de resorte "k" de la
restriccin armnica aplicada en kcal / mol / A2. Tenga en cuenta que se puede
calcular fcilmente la cantidad de tomos se mover en torno a su situacin forzosa
mediante el teorema de equiparticin y una constante elstica dada:
r
kx2 kBT kBT
~ ? X ~ (1)
2 2 k
9 Ejecutar la simulacin utilizando namd2. NAMD instalaciones habituales se ac-
CEPT ellnea de comando
namd2 KCSA popcwimineq-02.conf> KCSA popcwimineq-02.log
en una ventana de
terminal.

3.3 El equilibrado con protena liberada

Despus de la reduccin al mnimo y el equilibrio con la protena limitados, que es de
esperar
tener un sistema en el que los lpidos se embalan bien alrededor de la protena,
mientras que el agua no ha entrado en regiones prohibidas (Fig. 11 y Fig. 13). Ahora
3 Ejecucin de una simulacin de KCSA 42

Figura 13: El logro de un buen embalaje de los lpidos en los alrededores de la

protena. Nota la
vacos en la interfaz de membrana de la protena (panel izquierdo) antes de
equilibrado apropiado

para liberar las limitaciones armnicas y equilibrar ms todo el sistema.

1 Abra el archivo KCSA popcwieq-03.conf en un editor de

texto.
2 Busque la seccin con la etiqueta # Continuando un trabajo a partir de los
archivos de reinicio
y observamos cmo usamos los archivos de salida de nuestra ejecucin previa
para establecer coordenadas de inicio, velocidades y tamao de celda de
3 Vaya a la seccin ## parmetros extra y comprobar que las restricciones
son en realidad no existe. Tambin el script Tcl mantener el agua no es out.tcl
llamado a este tiempo. El margen de comandos se elimina tambin, porque
grandes fluctuaciones de volumen no se espera despus de que el primer
equilibrado.
4 Mira al final del archivo de configuracin. Hemos eliminado la mini-
mizacin paso en el presente simulacin.

5 Ejecutar la simulacin como se ha indicado anteriormente, utilizando ahora el

archivo de configuracin NAMD KCSA popcwieq-03.conf.

Despus de la simulacin se lleva a cabo, el sistema debe equilibrarse bastante bien.

T
puede controlar la estabilidad de la protena a travs de la computacin de RMSDs y
mirando a la trayectoria resultante con VMD.
3 Ejecucin de una simulacin de KCSA 43

3.4 series de
produccin
Ahora que la protena se ha equilibrado, estamos listos para llevar a cabo la
produccin
carreras. Habr una diferencia principal con las simulaciones anteriores ya ha
realizado.
1 Abra el archivo KCSA popcwieq-04.conf en un editor de
texto.
2 Busque la seccin # Control de Presin Constante. Tenga en cuenta que tenemos
establecer el comando useConstantArea para s.
Simulacin de bicapas de membrana han demostrado que los parmetros de campo
de fuerza-CHARMM actuales no reproducen la zona observada experimentalmente
por lpidos sobre trayectorias MD largos. Durante las etapas de simulacin anteriores,
dejamos que la estn en el plano xy fluctan para permitir el embalaje de los lpidos
frente a la protena. Sin embargo, despus de haber observado el buen embalaje, se
debe mantener el rea en el plano xy constante. Idealmente, tambin hay que calcular
el rea efectiva por lpidos en el sistema mediante el clculo de la zona de la clula de
simulaciones y restando de l el rea de protena.

3 Ejecutar la simulacin como se ha indicado anteriormente.

4 Observa la trayectoria con VMD mediante la carga de fibras discontinuas de
polister y archivos DCD correspondiente.
Produccincarreras pueden disponer de parmetros adicionales o emplear diferentes
tcnicas computacionales que se adapten a los fines de la investigacin que se lleva a
cabo. El resultado de la serie de produccin sencillo que aqu se presenta ya se puede
analizar en un nmero de diferentes maneras. Por ejemplo, es posible que desee
probar herramientas VMD diferentes que le permiten calcular la densidad de las
molculas de agua, iones o lpidos, as como los potenciales electrostticos, RMSD, el
movimiento del centro de masa y difusin de las molculas.

La tarea final. Configurar una simulacin de la sintasa de sodio Fo-ATP

sintetasa en POPC. El cdigo pdb de la protena es 1YCE. Utilice slo
un anillo C11 (hay cuatro en la base de datos PDB), utilice zahor, y
coloque cuatro molculas de lpidos en el interior del anillo (dos en
cada lado).
Esto termina el tutorial protenas de membrana. Esperamos que hayas aprendido
mucho
con ella, y que va a hacer un buen uso de todas las capacidades y VMD
NAMD tiene que ofrecer para simulaciones de sistemas de protenas de membrana.

Expresiones de gratitud
Desarrollo de este tutorial fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud
(P41-RR005969 - Recurso para Macromolculas Modelado y Bioinformtica).