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ISSN: 1665-2738
amidiq@xanum.uam.mx
Universidad Autnoma Metropolitana Unidad
Iztapalapa
Mxico
O. Soto-Cruz * y J. Pez-Lerma
Departamento de Ingenieras Qumicas y Bioqumica, Instituto Tecnolgico de Durango Blvd. Felipe Pescador 1830
Ote. Col. Nueva Vizcaya, 34080, Durango, Dgo. Mxico
Recibido 22 Junio 2004; Aceptado 14 Marzo 2005
Resumen
Los balances estequiomtricos en procesos de fermentacin son esenciales para su entendimiento y/o aplicacin. El
clculo de flujos metablicos resulta fundamental en estudios cuantitativos de fisiologa celular. Una poderosa
herramienta para la determinacin de los flujos en la red de reacciones bioqumicas es el anlisis de flujos
metablicos, en el cual los flujos intracelulares son calculados usando un modelo estequiomtrico que describe la
bioqumica del microorganismo. El anlisis de flujos metablicos es particularmente til en conexin con estudios de
produccin de metabolitos, donde el objetivo es dirigir tanto carbono como sea posible desde un sustrato hacia un
producto metablico, adems de permitir el clculo de flujos extracelulares no medidos y rendimientos tericos
mximos, identificacin de vas metablicas alternas y puntos ramificados de control metablico En este trabajo se
presenta una revisin de las metodologas de anlisis de consistencia y anlisis de flujos metablicos y su aplicacin
a sistemas de fermentacin.
Abstract
Stoichiometric balances in fermentation processes are esential for their understanding and/or application. The
calculation of metabolic flows is fundamental in quantitative studies of cellular physiology. Metabolic flux analysis
is a powerful tool for the determination of the flows in the network of biochemical reactions. Intracellular fluxes are
calculated using a stoichiometric model that describes the biochemistry of the microorganism. Metabolic flux
analysis is particularly useful in connection with studies of metabolite production, where the objective is to direct as
much carbon as it is possible from a substrate towards a metabolic product, besides to allow the calculation of non-
measured extracellular fluxes and maximum theoretical yields, identification of alternating metabolic pathways and
branched nodes of metabolic control. This work presents a revision of methodologies of consistency and metabolic
flux analysis and their application to fermentation systems.
Nivel de confianza
Y
i =1
SPi + YSX + YSC = 1 (2)
Como el coeficiente estequiomtrico de
la biomasa es uno, la tasa de reaccin est
dada por la tasa especfica de crecimiento de Dnde:
la biomasa, la cual, junto con los coeficientes rPi
de rendimiento especifican completamente el Y SP i = = Coeficiente de rendimiento del
rS
sistema. En la aplicacin del modelo de caja
producto i con respecto al sustrato.
negra para el anlisis de consistencia, se
puede utilizar cualquiera de los siguientes rX
Y SX = = Coeficiente de rendimiento de
conjuntos de datos (Stephanopoulos y col., rS
1998): biomasa con respecto al sustrato.
M
biolgicos. De esta manera, las Ecs. 2 y 3
Y
i =1
SP i P + Y SX
i X = S
(3)
establecen que el carbono y el grado de
reduccin que se introduce a la caja negra,
debe ser recuperado en los productos que
Dnde: salen de ella. Es importante mencionar que la
composicin elemental de la biomasa,
S = grado de reduccin del sustrato
normalizada con respecto a su contenido de
p = grado de reduccin del producto i
i carbono, que tiene la forma CHaObNc,
X = grado de reduccin de la biomasa depende de su contenido macromolecular
(protenas, carbohidratos, lpidos, etc.) y, por
Este balance fue introducido por Roels lo tanto, de las condiciones de cultivo. Sin
(1983), como una generalizacin del trabajo embargo, excepto para situaciones extremas,
de Erickson y col. (1978), quienes definieron es razonable usar la composicin promedio
el grado de reduccin de un compuesto como (CH1.81O0.52N0.21, con un 6% p/p de cenizas),
el nmero de electrones disponible para cuando la composicin exacta de la biomasa
transferirse al oxgeno en la combustin del no es conocida (Stephanopoulos y col.,
compuesto. En el balance generalizado de 1998).
grado de reduccin, el grado de reduccin de De una manera similar al balance de
un compuesto es un factor de clculo que se carbono que se presenta en la Ec. 2, pueden
elige por conveniencia, de manera arbitraria, escribirse balances para los otros elementos
de modo que los coeficientes que participan en la reaccin expresada en la
estequiomtricos para el dixido de carbono, Ec. 1. Estos balances pueden ser
el agua, la fuente de nitrgeno, la fuente de convenientemente escritos colocando la
azufre y la fuente de fsforo, desaparezcan composicin elemental de la biomasa,
del balance generalizado de grado de sustratos y productos en las columnas de una
reduccin (Nielsen y Villadsen, 1994). Es matriz E, cuyos renglones representan a cada
decir, no hay una definicin fsica del grado uno de los elementos involucrados. Para el
de reduccin; ste es nicamente un factor de caso de un proceso en el que, adems de la
clculo y el planteamiento de Erickson y col. biomasa, se tengan M productos y N
(1978) es un caso particular. Para obtener el sustratos, que incluyan I elementos
grado de reduccin de un compuesto dado, se (normalmente C, H, O y N) en su
debe tomar en cuenta lo siguiente. En primer composicin, se tendr una matriz E de I
lugar, se elige al tomo de hidrgeno como la renglones por M+N+1 columnas. Este es un
unidad de grado de reduccin. sistema con I restricciones (balances
En seguida se selecciona un compuesto elementales que se deben cumplir) y M+N+1
con grado de reduccin cero para cada tasas de reaccin (r), el cual puede ser
elemento: H2O para oxgeno, CO2 para el representado por:
carbono, NH3 para el nitrgeno, H2SO4 para
el azufre y H3PO4 para el fsforo. Estas dos Er = 0 (4)
elecciones permiten establecer que el grado
de reduccin de cada uno de los tomos
involucrados es -2 para el oxgeno, 4 para el Los grados de libertad (F) del sistema
carbono, -3 para el nitrgeno, 6 para el azufre son F = M+N+1-I. Si se tienen exactamente
y 5 para el fsforo. As, puede obtenerse el F tasas de reaccin medidas, es posible
grado de reduccin de los compuestos ms calcular las dems, pero no hay redundancias
comunes que intervienen en procesos para validar la consistencia de los datos.
O. Soto-Cruz y J. Pez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniera Qumica Vol. 4 (2005) 59-74
Balance de carbono:
rlactato + rbiomasa + racetato + rpropionato + rbutirato + rvalerato + rCO2 = 0 (5)
Balance de hidrgeno:
2rlactato + 1.81rbiomasa + 2racetato + 2rpropionato + 2rbutirato + 2rvalerato + 3rNH3 + 2rH2O = 0 (6)
Balance de oxgeno:
rlactato + 0.52rbiomasa + racetato + 2/3rpropionato + 1/2rbutirato + 2/5rvalerato + 2rCO2 + rH2O = 0 (7)
Balance de nitrgeno:
0.21rbiomasa + rNH3 = 0 (8)
Estas cuatro Ecs. constituyen un sistema lineal similar a la Ec. 4, que en este caso se escribe:
r Lactato
rBiomasa
r
0
Acetato
1 1 1 1 1 1 0 1 0
rPr opionato
2 1 . 81 2 2 2 2 3 0 2 0 (9)
1 rButirato =
0 . 52 1 2/3 1/ 2 2/5 0 2 1 0
rValerato
0 0 . 21 0 0 0 0 1 0 0 0
r NH 3
rCO
2
rH 2 O
O. Soto-Cruz y J. Pez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniera Qumica Vol. 4 (2005) 59-74
rLactato
rBiomasa
r
0 0
Acetato
1 1 1 1 1 1 0 1
rPr opionato 0
2 2 3
2
=
1 . 81 2 2 2 0
rButirato
1 2 / 5 0 1 0
0 . 52 1 2 / 3 1/ 2 2
(10)
0 rValerato
0 . 21 0 0 0 0 1 0 0 0
rNH 3
r
CO 2
rH O
2
1 = FR rT P 1 R r rm (20)
h = TP (18)
Para el caso de la tasa global de cambio de cada metabolito en la red metablica propuesta, las
Ecs. 24 a 38, se expresan en forma matricial como:
x1
x2
x
0
3
1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x
0
0 1 1 0 0 0 3 / 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 4 0
x5
2 / 3 1 2 / 5 1 2 / 5 0.164 0 0
00 0 0 0
1/ 3 0 1 / 3 0 0 2 / 5 1 / 2
0
0
0
0
0 0 0 0
0 1 / 3 0 0
0
0 0
0 0
0
x
1 / 5 0.2652 0 6 0
0 0 0 1 1 0 0 0 3 / 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.094 0
x 7
0
0 x8
0 0 0 0 1 / 2 1/ 5 1/ 4 1/ 4 1/ 4 0 1 / 3 0 0 0 0 0 0 0.9752 1 0
0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 4 / 5 0.1063 0
x9
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 / 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0.039
x
0 10 = 0
(39)
x
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0.1128 0 11
0
x 12
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 3 /9 0 0.0097 0
0
x 13
00 0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1 1 0 3 /5 6 /9
0 1 1 0 0
0
0
0.0107 0
0.0308 0
0
x 14
0
0 x 15
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 / 6 1 5 / 9 0 0.1126 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 / 5 4 / 9 0 0.036
x
0 16 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0.0727 0
x 17
0
x 18
x
19
x 20
clula. Este sistema lineal es utilizado para donde las tasas ri corresponden a los flujos
validar la suposicin de estado extracelulares medidos, lo cual puede
pseudoestacionario y, posteriormente para la deducirse de la Fig. 1. Por lo tanto, el vector
determinacin de flujos metablicos, de xc contiene los restantes flujos metablicos
acuerdo a la metodologa detallada a desconocidos. La matriz Am contiene las
continuacin. La matriz A es equivalente a la columnas 1, 3, 6, 7, 8 y 19 de la matriz A,
matriz E, utilizada en el modelo de caja que corresponden a los flujos medidos,
negra, por lo que puede ser separada en dos mientras que la matriz Ac contiene las
matrices Am y Ac que contengan los restantes columnas de la matriz A. Una vez
coeficientes estequiomtricos validada la suposicin de estado
correspondientes a las tasas de reaccin pseudoestacionario, las Ecs. 13 y 19 podran
medidas y no medidas, respectivamente. De utilizarse para calcular los flujos metablicos
manera similar, el vector x (vector de flujos desconocidos, es decir, los elementos del
desconocidos de las reacciones = [x1, x2, vector xc (Stephanopoulos y col., 1998). Sin
.x20]T) puede separarse en dos vectores xm y embargo, un mtodo diferente descrito por
xc que contengan las tasas de reaccin Tsai y Lee (1988), proporciona los mejores
medidas y no medidas, respectivamente. As, estimados para los flujos metablicos
la Ec. 40 puede escribirse como: medidos y no medidos. En este mtodo la Ec.
40 se reformula para expresarse como:
Am xm + Ac xc = 0 (41)
xm 1 0 x m (43)
Ya que se tienen 20 flujos intracelulares = = Tx
0 Am A c x c
desconocidos y 15 balances estequiomtricos,
los grados de libertad del sistema son 5, es
decir, se requiere medir al menos 5 flujos donde I es la matriz identidad de dimensin
para poder resolver el sistema. Sin embargo, igual al nmero de flujos medidos (en caso de
ya que se midieron 6 flujos, el sistema es estudio, de 6X6). En la matriz A las columnas
sobredeterminado. Por la similitud de la se intercambian para que al principio se
matriz A con la matriz E, las ecuaciones 14 a tengan juntas las columnas que corresponden
18 se utilizan para calcular la funcin h, a las reacciones cuyos flujos son medidos,
usando xm, Am y Ac en lugar de rm, Em y Ec, mientras que otro tanto se hace con el vector
para el modelo estequiomtrico, con lo que se x. El primer rengln de la Ec. 43
puede validar la suposicin de estado simplemente establece que xm es igual a xm,
pseudoestacionario (van der Heijden y col., mientras que el segundo rengln es idntico
1994a, van der Heijden y col 1994b, van der con la Ec. 41. La Ec. 43 se escribe, para el
Heijden y col., 1994c). Para el caso de caso de estudio, de manera extendida como
estudio, el vector xm est dado por: se muestra Ec. 44:
Para mayor claridad, en la Ec. 44 las lneas
x1 rLactato separan a cada una de las matrices y vectores
que componen el sistema. Las Ecs. 43 y 44
x3 rPr opionato introducen una separacin estricta entre los
x r vectores de flujos medidos y no medidos.
6 = Acetato Para resolver el sistema, se debe hacer una
x7 rValerato (42)
particin diferente de la matriz T, que se
x r muestra Ec. 45
8 Butirato
x r
19 Biomasa
O. Soto-Cruz y J. Pez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniera Qumica Vol. 4 (2005) 59-74
x1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x1
x3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x
x6 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3
x6
x7 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
x7
x8 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 8
x
x19 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
x
1 1 0 19
00 01 0
1
0
0
0
3 / 5
0
0
0
0 1 0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
x
0 2
0 0 0 1 2 / 5 1 0.164 0 0 2/3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 / 5
x
0 4
0 0 0 0 2 / 5 1/ 2 0.2652 1/ 3 1 / 3 0 0 0 0 1/ 3 0 0 0 0 0 1/ 5 0 5
x
0 = 0 0 0 0 0 0.094 0 1 1 3 / 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9
x
(44)
0 0 0 1/ 2 1/ 5 1/ 4 0.9752 0 0 0 1/ 4 1/ 4 0 1/ 3 0 0 0 0 0 0 1 10
x
x
0 0 0 0 0 0 0.1063 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 4 / 5 0 11
x
0 0 0 0 0 0 0.039 0 0 0 0 3/ 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 12
x
0 0 0 0 0 0 0.1128 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 13
0 14
x
0 0 0 0 0 0 0.0097 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 3/ 9 0
x15
0.0107 1
00 00 0
0
0
0
0
0
0
0 0.0308
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0 1
0
1
3/ 5
0
6/ 9
0
0
0
0
0 16
x
0 0 0 0 0 0 0.1126 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5/ 6 1 5 / 9 0
x
0 17
0 0 0 18
x
0 0 0 0 0.036 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 / 5 4 / 9 0
x20
0 0 0 0 0 0 0.0727 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
x m T11
=
T12 x 1
= Tx
(45) decir que su inversa exista. Por claridad se
0 T21 T22 x 2 presenta a continuacin la particin hecha
con el sistema utilizado en el caso de estudio
la seleccin de la particin debe ser tal que la
(46):
matriz T22 sea cuadrada y no singular, es
x1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x1
x3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 x
x6 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3
x6
x7 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
x7
x8 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 8
x
x19 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
x
1 1 0 19
00 10 0
1 0
0 0
3 / 5 0
0
0
0
1 0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0 0
0
x
0 2
0 0 0 1 2 / 5 1 0.164 0 0 2/3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 / 5
x
0 4
0 0 0 0 2 / 5 1 / 2 0.2652 1 / 3 1 / 3 0 0 0 0 1 / 3 0 0 0 0 0 1/ 5 0 5
x
0 = 0 0.094 1 3 / 4 0 9
x
0 0
0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 10
x (46)
0 1/ 2 1/ 5 1/ 4 0.9752 0 0 0 1 / 4 1/ 4 0 1 / 3 0 0 0 0 0 0
x
0 0 0 0 0 0 0.1063 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 4 / 5 0 11
x
0 0 0 0 0 0 0.039 0 0 0 0 3/ 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 12
x
0 0 0 0 0 0 0.1128 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 13
0 14
x
0 0 0 0 0 0 0.0097 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 3/ 9 0
x
0.0107 1 0 15
00 00 0
0
0
0
0
0
0
0 0.0308
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0 1
0
1
3/ 5
0
6/9
0
0
0
x
0 16
0 0 0 0 0 0 0.1126 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5/ 6 1 5 / 9 0
x
0 17
0 0 0 18
x
0 0 0 0 0.036 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 / 5 4 / 9 0
x
0 0 0 0 0 0 0.0727 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 20
1. L - Lactato Lactato
1
2. Lactato + 3 NADH2 PropionilCoA
3. PropionilCoA Propionato
1
4. Lactato Piruvato + 3 NADH 2
2 1 1
5. Piruvato 3
AcetilCoA + 3
NADH 2 + 3
CO2
1
6. AcetilCoA Acetato + 2
ATP
3 2 2 1
7.
5
PropionilCoA + 5
AcetilCoA + 5
NADH 2 Valerato + 5
ATP
1 1
8. AcetilCoA + 2
NADH 2 Butirato + 4
ATP
3 1 1
9.
4
Piruvato + 4
CO2 + 4
ATP Oxalacetato
1 3 1
10. Oxalacetato + 4 ATP 4 Fosfoenolpiruvato + 4 CO 2
11. Fosfoenolpiruvato 3Fosfoglicerato
1 1
12. 3Fosfoglicerato + 3 ATP + 3 NADH 2 Gliceraldehido3P
13. Gliceraldehido3P Fructosa6P
14. Fructosa6P Glucosa6P
Glucosa6P 6 Ribosa5P + 13 NADH 2 + 16 CO 2
5
15.
2 3
16. Ribosa5P 5
Eritrosa4P + 5
Fructosa6P
5 4 6 3
17.
9
Ribosa5P + 9
Eritrosa4P 9
Fructosa6P + 9
Gliceraldehido3P
4 2 1 1
18.
5
Oxalacetato + 5
AcetilCoA ( )cetogutarato +
NADH 2 + 5 CO 2 5
19. 0.0308Glucosa6P + 0.0107Fructosa6P + 0.1126Ribosa5P
+ 0.0362Eritrosa4P + 0.0097Gliceraldehido3P
+ 0.1128(3Fosfoglicerato) + 0.039Fosfoenolpiruvato Biomasa
+ 0.094Piruvato + 0.164AcetilCoA + 0.1073Oxalacetato
+ 0.0727( )cetoglutarato + 0.9752ATP + 0.2652NADH2
20. ATP Mantenimiento
3. Validacin del modelo estequiomtrico Por ejemplo, si se escoge eliminar una tasa
utilizado medida cualquiera (que pasa a formar parte
de las tasas no medidas) y se resuelve el
Al trabajar con un sistema sistema, la prediccin del modelo para esa
sobredeterminado, es posible eliminar de tasa debe presentar un error de estimacin
manera selectiva una de las tasas medidas del dentro del rango del error experimental. Lo
vector xm, para validar el modelo. Cuando se anterior contribuye a la validacin del
selecciona cualquiera de los compuestos modelo, ya que este es capaz de reproducir
medidos, el error de estimacin debe ser las observaciones con un error de estimacin
similar al correspondiente error de medicin. similar al error experimental.
O. Soto-Cruz y J. Pez-Lerma / Revista Mexicana de Ingeniera Qumica Vol. 4 (2005) 59-74