ANALISIS INSTRUMENTAL

Cromatografa
HPLC

2016-2017
 Espectroscopia Ultravioleta visible (UV-Vis)

Electrones implicados
1. Electrones p, s y n en molculas orgnicas
2. Electrones d y f en metales de transicin
3. Electrones de transferencia de carga en complejos
metlicos
 Absorcin: Ley de Lambert Beer
La ley de Lambert Beer establece una relacin entre la
transmisin de la luz y la concentracin de la sustancia

A: Absorbancia (adimensional)
l : longitud de la celda (cm)
https://www.youtube.com/
C : concentracin (M)
watch?v=ILeKva55dWY E: coeficiente de absorcin molar (M-1cm-1)
Componentes de un espectrofotmetro
 Cromatografa
La cromatografa se define como la separacin de una
mezcla de dos o mas compuestos por distribucin entre
dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una
fase mvil.

Todos los slidos finamente pulverizados tienen el

poder de adsorber en mayor o menor grado otras
sustancias sobre su superficie y similarmente, todas las
sustancias pueden ser adsorbidas, unas con ms
facilidad que otras. Este fenmeno de adsorcin
selectiva es el principio fundamental de la
cromatografa.
 Cromatografa
Eter Cromatografa

Colores
Clorofila

CaCO3

Tswett
 Fase Mvil Fase Estacionaria

La afinidad con la fase

mvil y la fase estacionaria
Fase vara con el soluto.
Mvil
Fuerte Dbil
La separacin ocurre
debido a la diferencia en la
Fase velocidad de movimiento
Estacionaria y esto depende de la
naturaleza qumica de la
FM y FE
 Cromatografa en capa fina (TLC)
La fase estacionaria es una placa de vidrio o aluminio
recubierta con material adsorbente, el mas comn la
silica gel.
La fase mvil puede ser: ter de petrleo, tolueno,
diclorometano, acetato de etilo, ciclohexano,etc

https://www.youtube.com/watch?v=4IyGp6tqFqA
Cromatografa en capa fina
 Cromatografa en columna

Columna
solvente solvente
(fase mvil) (fase mvil)
y muestra y muestra
separada

Empaque de silica gel

recubierto

https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8
&list=UUAi08vpGsxeDRb20qu2EnRw&index=21
Cromatografa en columna Cromatografa plana

Columna de separacin

Superficie
recubierta

Material de
empaque

Tres dimensiones Dos dimensiones

 Polaridad de las sustancias
La polaridad es una propiedad de las molculas de tener
polos positivos y negativos debido a la posicin de los
electrones

La miscibilidad de los solventes, depende de la polaridad.

Lo polar disuelve a lo polar
 Polaridad de las sustancias

Grupos funcionales Grupos funcionales

no polares polares
-(CH2)nCH3 -COOH
Grupos alquil Grupos carboxil
-NH2
-C6H5
Grupos amino
Grupos fenil
-OH
Grupos hidroxil

Hidrofbico Hidroflicos
 Tipos de cromatografa
Segn la naturaleza de la fase mvil y de la fase
estacionaria, la cromatografa puede ser normal o
inversa
 HPLC

H igh
Performance
L iquid
C hromatography
HPLC

Fase Mvil (FM)

Bomba

Inyector
Horno de la
columna (FE)
Detector
 Cromatografa lquida de fase reversa

Fase estacionara: Baja polaridad

Silica gel recubierta con grupos octadecil silanos
(ODS C18) u octil silanos (C8)

Fase mvil: Alta polaridad

Agua, metanol, acetonitrilo
Buffers para mantener el pH
 Fase estacionaria
Silica Gel Silica Gel Derivatizada

R = C18H37

Superficie Polar Superficie no polar

Fase normal Fase Reversa
 Fase estacionaria
3 mm

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

Si -O-Si
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

C18 (ODS)
 Fase mvil
Agua Solventes orgnicos
Agua ultrapura Solventes grado HPLC
Agua destilada para HPLC

Filtro membrane
0.45 m

Ultrasonic
cleaning unit
 HPLC
Injector
La separacin esta
basada en la diferencia
de migracin entre la
Pumps
fase mvil y la fase
estacionaria.
Columna

Detector

Residuo
Solventes
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

22
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

33
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Aplicaciones del HPLC
Protenas
Pptidos
Poliestirenos
Barbituricos
Corticoides
Antidepresivos
HC poliaromticos
Iones inorgnicos
Herbicidas
Lpidos
Antioxidantes
Azucares
Aminocidos
Vitaminas
 Cromatograma
to tiempo muerto
tR- tiempo de retencin

tR

tR Area o altura
proporcional a la
mAU cantidad de
analito
to

Injeccin tiempo
Relacin entre el tiempo de retencin y
la polaridad

C18 (ODS) OH

Dbil
Fuerte
CH3
 Parmetros Cromatogrficos
Mtodos para expresar el desempeo de la columna y
la separacin de los analitos
 Factor de retencin (k)

tR t R t0
k
t0
mAu

t0
tR: tiempo de retencin
t0: tiempo muerto

Tiempo
Nmero de platos tericos (N)

2
tR
N 16
W
2
tR
5.54
H W1/ 2
W1/2
tR H
2
H1/2 2p
Area
W
Nmero de platos tericos (N)

N: Grande
2
tR
N 16
N: Pequeo W
2
tR
5.54
W1/ 2
N: Pequeo
N: Grande
tR H
2
2p
Area
 Resolucin (Rs)

tR1 tR2

t R 2 t R1
RS
1
(W1 W2 )
2
t R 2 t R1
1.18
W1/ 2 h ,1 W1/ 2 h , 2
W1/2h,1 W1/2h,2 h1/2

W1 W2