Está en la página 1de 26

Tipeo primera clase primeros 31 min.

Mecanismos REDOX en respuesta al ejercicio.

El ejercicio es un estimulo biolgico que ocurre a distintos niveles, que terminan siendo una seal
intracelular, lo que termina siendo un disturbio al equilibrio interno de la clula.

Cuando una clula esta en contraccin, se modifica el Ca intracelular, se modifica la tensin


muscular. Si uno tiene una contraccin excntrica va a ser censado por protenas especificas,
como la integrinas que censan el estiramiento muscular, entonces el estimulo puede ser mecanico,
metabolico, cambian las concentraciones de diferentes almacenamientos de energa, cambian las
concentraciones de glucgeno, de ATP, de AMP, etc. Cambian las concentraciones de especies
reactivas de oxigeno (REDOX), o las de Ca, y toda esa perturbacin de la homeostasis va a llevar
a una activacin de esos sensores. Por ej, las mapkinasas en el estiramiento muscular, si usted
toma un musculo y lo estira, p38 y la fosforilacion se vera activada. Si usted baja las
concentraciones de oxigeno, como en un musculo en hipoxia se va a activar factor de transcripcin
HIF-1 si usted aumenta las concentraciones de AMP va a producir un aumento de AMPK, si
usted aume8uuhmnta las concentraciones de ROSS NFKB Va a ver aumentado la transcripcin de
genes.

Todo estimulo provoca un cambio en la homeostasis, y eso activa a una protena sensora, y ah
esta el cros Talk , que provocar un cambio en la transcripcin de genes, o cambios
posttranduccionales, lo que terminara en una adaptacin.

Se entiende que el estimulo del ejercicio es daino para la celula, pero ese dao o perturbacin
lleva a la activacin de ciertas vas. Cuando uno estira un musculo las mapkinasas se activan y
llevan a los cambios de expresin de genes que finalmente informan un cambio en el tamao
muscular.

Las integrinas, el complejo atroglicano?, todas las protenas que le dan la estabilidad a la celula
muscular.

Si uno aumenta ROSS, aumentara la adaptacin antioxidante, para que haya una defensa
antioxidante mayor.

Someter al organismo a un estrs constante te llevara a una adaptacin en el tiempo.

Radicales libres, son molculas altamente reactivas que interaccionan con otras molculas. Tienen
un Electrn desapareado y eso hace que anden robando electrones para hacerse una molcula un
poco ms estable y daan muchas macromolculas de la clula, su vida media es muy pequea.

Las especies reactivas de oxigeno es un tipo de radical libre.

Uno de los ms conocidos es el ANION SUPEROXIDO AS PERIOXIDO DE HIDROGENO PDH


(no es un radical libre, pero es ms estable).

Radical libre es un tomo que contiene 1 o ms electrones desapareados en su orbital ms


externo.

Los ROS de Oxigeno O y Nitrgeno N, son ms conocidas y las que son ms prevalentes en las
clulas musculares durante el ejercicio:
Especie de oxigeno ANION SUPEROXIDO (AS): Produce Peroxidacin lipdica. Oxidacin de
protenas y dao en el DNA

Especie de Nitrgeno OXIDO NITRICO (ON): Potente radical y ms potente es el PEROXI


NITRITO (PN) ( Unin del ON AS) y forman una molecula altamente daina. Por lo tanto si hay
alta concentracin de ON y de AS se forma PN produciendo dao muy alto.

Desde hace muchos aos (en el 56) se propuso la teora que el envejecimiento se debe a un
constante acumulacin de radicales libres que producen un dao que se van sumando y producen
que las clulas envejezcan y se produzcan enfermedades asociadas a la edad y degenerativas y
desde ah se estudian los radicales libres

En el 74, Se recomendaba altas dosis de VITAMINA C y el propuso que 3gr de Vitamina C podan
prevenir el Resfriado, (ya se demostr que no hay efecto). Tambien se propuso que los radicales
libres favorecan el cncer y que la Vitamina C podra ayudarlo a combatir (Esto se desminti
posteriormente).

94 se hizo un estudio con moscas y se sobre expreso la enzima SOD Y LA CATALASA que es la
SUPEROXIDO DIMUTASA (SOD) y lo que hace es dismutar el AS a PERIOXIDO DE
HIDROGENO, y al sobre expresar esa enzima, las moscas tenan una mayor esperanza de vida

Finales de los 90 lo hacen en un ratn, Sobre expresan la Cu Zn (Cobre-Zinc) y no alarg la vida.

Estudio que hizo una Chilena en gusanos, que sobre expreso la SOD y vio que haba un aumento
en la esperanza de vida pero no por el efecto antioxidante si no por el efecto del estrs de retculo
(protenas mal plegadas), respuesta adaptativa que puede llevar a prolongar la vida o a la muerte
celular segn el estrs.

COMO SE FORMAN LOS ROS?

Se forman a partir del Oxigeno y a partir de:

NADPHoxidasa

XANTINAoxidasa

LIPOoxigenasa

CICLOoxigenasa

Candena Transportadora de Electrones

Son productores de AS.


El AS puede ser dimutado por la SOD, formando Peroxido de Hidrogeno (PH) (agua oxigenada), y
este es una potente molecula de sealizacin celular. Este Peroxido no se puede acumular porque
es daino para la clula y hay un mecanismo (Glutatin Peroxidasa Catalasa). Puede ocurrir la
reaccin de Fentn y formar un radical Hidroxilo.

Cuando uno estimula a la clula con altas cantidades de los radicales libres, la clula entra en
apoptosis.

Se cree que los radicales libres se producen en la mitocondria porque es donde se utiliza el
oxgeno, eso hace que gane un electrn y si no est con un Hidrogeno, pueda transformarse en
AS. En realidad se producen en 3 sitios:

Mitocondra AS

NADPHoxidasa (principal)

XANTINAoxidasa

LIPOoxigenasa.

Enzimas Antioxidantes de distintos tipos en distintos lugares:

SUPEROXIDO DIMUTASA, dependiente de Manganeso (mitocondria)

SUPEROXIDO DIMUTASA citosolica (dependiente de Cu Zn)

GLUTATION PEROXIDASA CATALASA que est en el citoplasma

GLUTATION PEROXIDASA que est en la mitocondria

Sitios extracelulares donde se producen ROS por la XANTINAoxidasa.

El balance REDOX, se mantiene en equilibrio en condiciones saludables entre la produccin de


ROS y las defensas antioxidantes y las defensas antioxidantes est dada por dos componentes
principales:

Antioxidantes NO ENZIMATICOS (glutatin Vitamina C Vitamina E Reverseratrol


Los suplementos)

Defensa ENZIMATICA (Superoxido Dimutasa Catalasa Glutatin Peroxidasa. La


catalasa remueve el perxido de Hidrogeno y lo transforma en agua.

SOD: Existen 3 (nombradas anteriormente) Citosolica mitocondrial y extracelular (no se nombra


mucho). La Cu Zn Citosolica tiene una vida media ms corta que la mitocondrial.
Hay ms catalasas en el citoplasma que en la mitocondria y hay ms glutatin peroxidasa en la
mitocondria.

ENTRANDO AL MUSCULO:

En el 82 se haba demostrado desde hace mucho tiempo que el ejercicio produca ROS y lo ms
interesante que decan que esos ROS podran ser un estmulo para la biognesis mitocondrial. En
la mitocondria en el complejo 1 y en el complejo 3 son las fuentes principales de ROS en la
mitocondria pero la mitocondria no es la principal fuente de AS.

En las fuentes no mitocondriales de ROS (NADPHoxidasa).

Durante la contraccin muscular se producen formacin de radicales libres y esos radicales


dependen de la NADPHoxidasa y se encuentra muy cercana en el Tbulo T o en el Tbulo T, pero
esta formada por un complejo multi-proteico, y est compuesto por una protenas:

P40

P47

P66

Rag1

Otras protenas

Ests protenas estn separadas normalmente y cuando la clulas se despolariza, se empieza a


producir Anin Superoxido

Si uno hace un experimento y a clulas musculares se les tira una concentracin alta de Peroxido
(la clula se muere). Pero si uno le pone una concentracin ms baja y luego le pone una
concentracin alta de nuevo, la clula sobrevive. Se comenz a pensar que estimulo bajos de
ROS estimulaban las defensas Antioxidantes y despus tena un defensa antioxidante mucho ms
alta para enfrentar esa carga de ROS.

ORMESIS:

Forma de U invertida (si uno hace un grfico de la relacin dosis-respuesta) tenemos que hay una
cierta cantidad en la que se obtienen los resultados ptimos, si tenemos menos dosis o ms dosis
no tenemos resultados o tenemos resultados negativos.

El estrs oxidativo tiene esa forma de distribucin (ORMESIS) y los niveles de actividad fsica
tambin tienen esa forma.
Uno necesita unas dosis fisiolgicas de especies reactivas de oxigeno en las cuales se producen
cambios en la expresin de genes asociados a las defensas antioxidantes y a la respuesta del
ejercicio PERO si aumentan mucho las concentraciones y especialmente de manera crnica, lo
que vamos a tener es dao celular y muerte celular o problemas de funcionamiento celular.

En estudio (en el 98) en los que se aade perxido a clulas musculares aisladas y se ve que
aadiendo bajas concentraciones de Perxido, se logra incrementar la fuerza, PERO si le ponan
el doble de concentracin, la fuerza disminuye: Altas concentraciones disminuyen la fuerza,
pero bajas concentraciones parecen favorecer los niveles de fuerza. La fuerza muscular
asociada a la estado REDOX tena una forma de ORMESIS.

Un experimento realizado en ratas, muestra que ciertos tipos de ejercicio (55 65 -75 % VOSmax)
y examinan como cambia la actividad de las enzimas antioxidantes y muestran que el ejercicio de
alta intensidad la SUPEROXIDO DIMUTASA aumentaba la intensidad al menos al doble y la
GLUTATION PEROXIDASA tambin aumentaba. Las enzimas antioxidantes tienen una
concentracin distinta dependiendo del tipo de fibra. Otro estudio en el que muestra que solo con
un estimulo de ejercicio aumentaba la actividad de las enzimas antioxidantes por 3 das, el estimulo
agudo por lo menos la produccin de ROS, debera estar modulando algo que aumente la
produccin de defensas antioxidantes

Otro grupo hace algo similar en que hacen un protocolo de 5 semanas, se ve que aumenta la
SUPEROXIDO DIMUTASA CITOSOLICA y F2ISOPROSTANO (peroxidacin lipdica) disminuye,
por lo tanto, ya en los ltimos aos se empez a pensar que el ejercicio bajaba el estrs oxidativo,
curiosamente produciendo ROS.

Si entreno slo el fin de semana probablemente no produzca adaptaciones antioxidantes y slo


estar aumentando el estrs oxidativo de manera aguda y puede que alguien se est oxidando si
hace ejercicio de manera espordica y no de manera continua.

Se demostr en otro estudio que la Hiperoxida hiperbrica no produca un mayor estrs oxidativo y
que las personas que entrenan en ests cmaras mejoran su VO2Max y al revs de producir
estrs oxidativo, mejora las respuestas al ejercicio y tal vez sea porque modula mejor esa
respuesta antoxiodante.

En Entrenamiento de fuerza y aerbico tienen mejoras en las enzimas antioxidantes (una


tendencia del entrenamiento aerbico a ser ms) Capacidad antioxidante del plasma tambin
mejora con entrenamiento de fuerza y aerbico.
RELACION DOSIS RESPUESTA:
Hay muy pocas respuestas que van hasta el infinito, pero hay otros tipos de respuesta,
por ejemplo oxidacin de carbohidratos frente al ejercicio, pero hay un tope mas o
menos de 1,1 gr/min que tiene que ver el ritmo que se absorben los carbohidratos a
nivel intestinal, trasportadores L1, glut5, bueno, hay un punto maximo que no va a
aumentar mas la oxidacin y se mantiene.
El umbral de lactato es la respuesta que hay un estimulo y no pasa nada hasta despus
de cierto tiempo del ejercicio. No todas las relaciones dosis respuestas son iguales. Y la
respuesta que se obtiene con el ejercicio es mas o menos la curva que parece una
montaa, en donde a bajas dosis incluso la respuesta es desfavorable, a medida que
aumento la dosis de ejercicio aumenta la respuesta positiva, pero si excedo la dosis
empieza a bajar la curva como por ejemplo ( horas de entrenamiento VS horas de
defensas inmunolgico). Muchas de las respuestas biolgicas tienen esa forma de u
invertida, y esa respuesta se llama Hormesis, ejemplo ejercicio Vs salud.
La HORMESIS se deriva de los conceptos de toxicologa y vendra siendo lo que no te
mata te hace ms fuerte cuando un organismo se expone a un agente citotxico en
bajas concentraciones, lo que tiene es un aumento de la defensa frente a ese agente
citotxico que lo afecta para preparse para una exposicin mayor como por ejemplo las
vacunas.

En el caso del ejemplo de la clula, tiene una respuesta hormetica, entonces la


exposicin de la clula a agentes cititoxicos llevo a que expresara genes antioxidantes y
luego cuando la expuse a mayor dosis le permiti sobrevivir.

Aumentando el estimulo voy a tener una respuesta, en donde hay una zona en la cual es
la mxima, y si sigo aumentando el estimulo ese beneficio se va a perder, incluso voy a
daar la clula o muerte celular, la respuesta puede ser en tiempo o en la intensidad de
la exposicin del estmulo. Entonces entender al ejercicio asi como un efecto hormetico
es decir que voy a dar daos controlados para tener una adaptacin en lo que sea, y si
se pasa en el dao, no vamos a tener el efecto que deseamos.
Entonces algo interesante que se ha estado estudiando es el efecto en la produccin de
ROS en el desarrollo de la fuerza, en este experimento lo que se hacia era medir la
fuerza y aca se media las concentraciones de calcio intracelular durante contraccin
tetnica y se media la fuerza como tambin el calcio, fjense que se muestran 2
controles y luego se un musculo esqueltico que fue expuesto a 150 micro molar de
perxido de hidrogeno, lo que paso fue que aument la fuerza. Este y otros estudios

demostraron que la interaccion de actina y miosina requieren un estado de oxidacin


optimo.
Aca (diapo de abajo) se muestra lo mismo pero ya no le doy 150 si no 300 micro molar y
la fuerza disminuye, ose aque tiene un efecto hormtico en dosis altas poco beneficioso,
y para demostrar que esto era por culpa del perxido, se puso un antioxidante y se
obtuvo respuesta en restablecimiento de la fuerza.
Ahora ya sabemos que hay un estado redox optimo en la clula muscular, sabemos que el
ejercicio produce especies reactivas de oxigeno, por lo tanto la pregunta es Qu pasa
entre la relacin del ejercicio y enzimas antioxidantes?...
En este estudio se hizo un entrenamiento aerbico en general al 90% del umbral del
lactato, y lo que se estudio fue los aumentos de algunas enzimas antioxidantes, y lo que
mostro el estudio es que 5 semanas con 4 dias por semana de entrenamiento llevaban a
la expresin de enzimas antioxidantes, si bien el ejercicio lleva a expresiones de
especies reactivas de oxigeno de manera aguda, el entrenamiento lleva a respuesta de
agentes antioxidantes, los F isoprostanos son marcadores de dao oxidativo y se ve que
se reduce, y eso va acompaado de la superoxido inmutasa 2 (SOD2) que aumenta.
Entonces si bien el ejercicio induce el aumento de ROS, tambin lleva a un aumento a la

expresin de genes antioxidantes.(dice que debemos conocer esta cascada


jajajajaja).
Este es uno de los artculos donde se muestra que el sndrome de sobreentrenamiento,
lleva al dao en el DNA mitocondrial y DNA nuclear por estrs oxidativo, entonces se
cumple el efecto de entrenamiento excesivo.
En este artculo, como es muy difcil estudiar el sobre entrenamiento, lo que hicieron
fue provocar un sndrome de sobre entrenamiento de manera artificial, aumentaron
carga y volumen durante 6 semanas y en cada una de las semanas se fue midiendo

marcadores de estress oxidativo.

Miedieron el dolor muscular, y a medida que aumentaba la carga el dolor aumentaba, y


midieron muchos marcadroes pero los mas importantes son los isoprostanos y los TBARS,
y cuando aumentaba el volumen los Tbars tambin aumentaban. El estrs oxidativo
poria jugar un rol en el sndrome de sobreentrenamiento. Qu creen que se podra
hacer frente a esto?.... tomar antioxidantes podra ser una solucin???,,,,
A exceso de carga a exceso de dao muscular lleva un aumento de estrs oxidativo y
bueno los atletas toman antioxidantes, y si se empieza a buscar cual es el efecto de los
antioxidantes en los atletas, se va a encontrar que se le da a un grupo de nadadores
vitamina E y concluyen que no hay evidencia que la vitamina E tenga efecto positivo en
el entrenamiento de resistencia (ao 1971) incluso podra tener efectos negativos, y eso
se retomo hace casi una dcada, se uso N acetyl cisteina que es un antioxidante muy

potente..

Y se vio seales intracelulares mediadas por el ejercicio [PGC1 alfa, HSP70, JNK
fosforilada (una de las MAPKINASA), MnSOD (manganeso superoxido inmutasa)], y el
grupo que consumi antioxidantes que es el grupo blanco, y muchas de las respuestas
estaban disminuidas. Lo que nos muestra es que cuando se pone antioxidantes durante el
ejercicio, la respuesta adaptativa se reduce, lo que implica que los ROS son necesarios
para la sealizacin intracelular. Y en este otro articulo..
En donde entrenan 11 semanas a un grupo de sujetos y muestran que los cambios en

pgc1 alfa, cox 4, (ambos marcadores de adaptacin mitocondrial), estn reducidos en el


grupo que consuma vitamina c y vitamina E. va en la misma direccin que altas dosis de
antioxidante bloquean la sealizacin inducida por el ejercicio, y que a largo plazo
podran disminuir la adaptacin muscular al ejercicio. Despus hay unos artculos que
muestran lo mismo.

Que el ejercicio produce estrs oxidativo, y esas ROS median en varias vas como por
ejemplo en el aumento de la capacidad antioxidante, cuando los sujetos consumen
antioxidantes la expresin de la enzima antioxidante se bloquea. Tambin en la
biognesis mitocondrial hay evidencia que es un fenmenos a especies reactivas de
oxigeno. Y en el 2009 la sensibilidad a la insulina inducida por ejercicio muestra que se
reducia a altas dosis de vitamina C.

Entonces tenemos una disyuntiva, lo mas probable (segn el profe) cuando uno est
entrenando
Debera hacerlo con una baja dosis de antioxidantes exgena, pero en competencias
muy largas donde la produccin de ROS sobrepasa la defensa antioxidante ah si los
antioxidantes tengan un efecto positivo.
Fjense ah, la produccin de ROS aparece de 2 formas, una transitoria y otra forma
mantenida, por ejemplo en la resistencia a la insulina lo que se ha visto, es que la RI
tiene un estado oxidante importante, las personas con diabetes tienen un estado ms
oxidado pero eso es crnico, lo bueno es que el ejercicio aumenta transitoriamente las
concentraciones de ROS y saca transitoriamente de ese estado basal para que no se
prolongue en el tiempo, porque hay mucha evidencia que la insulina provoca ROS.
Michael Ristow ha dicho que esto es Mitohormesis, la hormesis especifica de la
mitocondria, donde esta produce ROS, se activan factores de transcripcin, se activa la
expresin de genes y eso lleva a una mejora en la salud. La pregunta es de dnde
vienen los ROS que promueve la adaptacin al ejercicio, vienen de la mitocondria o de
otras fuentes e ROS? ..bueno el antioxidante hace que disminuya la produccin de
ROS y todo lo que va hacia la derecha se bloquea.
si recordamos, habamos dicho que hay una gran variedad de especies reactivas de
oxgeno, y lo primero que se dice es que se asigna a la mitocondria al rol de la
produccin e ROS, la pregunta es si la mitocondria produce la sealizacin y si es ella
misma la que lleva a producir biognesis mitocondrial o son otras fuentes
mitocondriales?

Hay varios artculos que miden ROS en la mitocondria y en el citoplasma, entonces en


este artculo demuestran que la produccin de ROS durante la contraccin muscular es
principalmente citoslica, lo que ellos usan es una protena que se denomina Hiper, hau
un hiper citosolico y hay un mitohiper, son protenas que tienen destinacin mitocondrial
o destinacin citosolica, y lo que se hace es tranceptar esta celula para que expresen
este plasmidio que yo ingreso a la celula, y como esta protena va a tener destinacin
subcelular, el mitohiper se va ir a la mitocondria y el hiper al citoplasma, la gracia que
tiene la protena hiper es que tienen residuos-cisteina (altamente oxidable)
e 1hr 00 min 3 seg

y hee y hay varios artculos que han hecho algo interesante midiendo la
produccin de ros en mitocondria y citoplasma y si se fijan en un grupo de
expertos de equilibrio redox y ejercicios, el ao pasado muestran que la
produccin de ros durante la contraccin muscular es principalmente citosolica y
es fcil lo que usan por que usan protenas sensibles, y eh y usan la cito hyper
citosolico y tambin mitocondria o mito hyper, entonces son protenas que tienen
destinacin mitocondrial o citosolica y por medio de distintas tcnicas para que
expresen este este plasmidio que ingreso a la clula y como esta protena va a
tener destinacin sub celular el mito hyper se va a la la mitocondria y el hyper
citosolico se queda en el citoplasma, la gracia que tiene esta proteina hyper es que
tiene residuo cisteina este aminocido que es altamente oxidable entonces cuando
esta protena se oxida emite fluorescencia ah va a brillar mas entonces se usa
como sensor de ros que cuando aumenta la oxidacin tb aumenta la oxidacin de
la mitocondria. Entonces en dos artculos se ha mencionado cuando la clula se
despolariza la produccin de ros es principalmente citosolica, entonces ha nacido
la idea que durante la contraccin muscular lo mas facil es que el aumento de ros
sea en el citoplasma y no tanto en la motocndria como se crea antes, la evidencia
antigua dice que el 3 a 5 % de oxigeno que consume la mitocondria pasa a ser
anin super oxido esa evidencia es de mitocondrias aisladas, que se hace a a
travs de centrifugaron diferencial y se rompe la dinmica mitocondria, las
mitocondria en general no son como uno las conoce tiene una forma distinta y
ademas se mueven o cambian segn la demanda metablica (estn unidas),

entonces esta dinmica cuando uno aparta la mitocondria o las saca de su lugar y
mide produccin de ros la mitocondria esta funcionando mal por que no esta en su
dinmica y en la unin con la dems masa mitocondrial (ya que las ac de su red
mitocondrial), se ha determinado que el 0.1 el 0.2 % del oxigeno que consume la
mitocondria llega a ser anin super oxido por lo tanto es muy bajo la produccin
de ros mitocondrial, llama la atencin si la mitocondria no produce los ros
derivada de las mitocondria aisladas han empezado a llamar la atencin otras
fuentes de ros, la mitocondria produce mucho menos ros pero mucho menos que
en citosol,

por lo tanto cuales serian los otros candidatos para producir ros y promover la
seal inducida por ejercicio, un grupo espaol ha estudiado la chantina oxidasa
esta extra celular y promueve la generacin de anin super oxido, y se han dado
cuenta que cuando los ratones son tratados con esta la adaptacin al ejercicio no
se pierde, por lo tanto esa no es una fuente importante de produccin de ros y

queda otro gran candidato que es la nox 2 y que principalemte esta en los tubulos t
de la clula muscular y esa enzima es la que estudiamos en nuestro laboratorio,
hace 10 aos la doctora Cecilia hidalgo describi que la nad ph oxidada estaba
principalmente en el tabulo t, si se fijan ac por centrifugacion diferencial se aslan
las triadas, (las cisternas terminal y el tabulo t ) y que es la nad ph oxidada que es
un complejo de protenas y que fjense que esta compuesta por diferentes sub
unidades entonces vamos a encontrar sub unidades citosolicas y sub unidades de
membrana entonces las de membrana va a ser nox 2 (gp 91 es lo mismo) y p 22
que es una sub unidad que esta en la membrana (protena andamio) y hay una
gran variedad de sub unidades citoplasmaticas principalmente rad one (esto no
entend que dijo y estoy sin internet) p67, p 47, p 40 y la gracias que tiene esta
enzima que cuando esta inactiva esta en el citoplasma pero cuando se activa el
complejo se ensambla y lo primero que pasa es que se fosforila la sub unidad p47
y todas las sub unidades del citoplasma se van a la membrana y el complejo se
acopla y las sub unidades catalticas que es la que genera ros que es nox 2 va a
producir anin supoer oxido y tb perxido de hidrgeno, la doctora a demostrado
que en las triadas y en los tubulos t se encuentra gp 91, y que tambin la mayora
de las subunidades citoplasmaticas estn cercanas a los tubulos t, sea que ya
tenemos una gran diferencia con la produccin de ros mitocondrial que es casi un
efecto secundario de la respiracin, en cambio esta enzima es regulable (gp91 o
nox 2 me imagino) por lo tanto su papel en la accin biolgica parece ser mas
relevante por su activacin o por su no activacinprofe pregunta.. quien la
activa? la insulina activa nox 2, entonces lo que hicimos es determinar la
fosforilacion de p 47 , la fosforilacion de p 47 es el primer paso para la activaci n
de nox 2 por lo tanto vimos si durante el ejercicio se fsforilaba p 47 vimos que el
ejercicio aumentaba la fosforilacion de p 47 luego hicimos cortes de la fibra
muscular y en verde arriba uds ven la condicin basal y la de ejercicio de gp 91
que es la sub unidad nox 2 que es la cataltica que esta en la membrana, y que
pasaba cuando la nox se activaba lo que se ve es que las sub unidades citosolicas
p 47 se van a membrana y se unen a gp 91 entonces fjense p 47 esta distribuida
en el citoplasma y en el ejercicio que hacia no se entiendeeso el amarillo
muestra el no se entiende que es un paso necesario para la activacin de
nox entonces eso es lo primero que deben aprender en su clase de cs
biologicas cuando algo es necesario y cuando algo es suficiente, necesario que
en su ausencia no sucede. entonces si yo quiero mostrar que mpk es necesaria
para biogenesis mitocondrial.. tomo un raton deficiente de mpk y entonces todo lo
que atribuyo a mpk no deberan pasar en ese ratn....
cuando algo es suficiente. que la activacin de solo esa proteina es suficiente
para que el fenmeno ocurra por ejemplo tengo un agonista de algo por ej mpk
con i car.

pregunta que no se entiende..,

Bueno lo nico que vemos ac es que con esto no podemos decir que se esta
activando nox 2 con seguridad, solo podemos decir que el primer paso que es
necesario ocurre y el segundo paso que es el acoplamiento se sugiere que tb
aunque no esta demostrado para demostrarlo bien (el primer paso es fosforilacion
y es segundo la migracin)
hicimos un par de experimentos un ensayo de co inmuno precipitacin, lo que uno
hace es imaginen si yo tengo mi protena A ac tengo mi protena de inters
en este caso p 47, y lo que hago es poner un anticuerpo contra p 47 que reconoce
de manera mas o menos especifica ciertos segmentos de la protena especifica
que se llaman eptotes (segmentos de la protena) y despus de poner el
anticuerpo pongo una bolita que se llama la bits? que es una bolita que se une al
anticuerpo y que le da peso y por lo tanto si centrifugo va a botar a la protena y
las otras protenas que no son p 47 que no se unieron a la bolita quedan vivas por
lo tanto en mi tubo voy a tener mis protenas unidas a la bolita abajo ( eso es),
entonces lo que hicimos fue una co inmuno precipitacin para ver si es que unida
p 47 estaba gp91 o nox 2, entonces es fcil, lo que uno hace es botar la protena
de inters y despus revela contra gp 91 con western blooot contra y contrario,
contra gp 91, lanlo por que se usa mucho as se descubrieron los trimeros de
ampk que estaban en el musculo esqueltico,

maripi la proteina es bits.. profe.. no la bits es la pelotita que hace precipitar

Entonces fjense lo que hice fue tomar todo lo que quedo en el fondo lo que cayo
con la bits, entonces tengo p 47, si hay gp 91 depende de si hay interacci n de
esa protena o no, por que en basal esperara que hubiese menos, yo bote p 47 y
luego revele con un anticuerpo especifico de gp 91 fjese en el control encontr un
poco de p 47 y gp 91 en el control, ahora fjense en ejercicio encontr mucho p 47
y gp 91 por que haba mucha interaccin entre ambas, si encuentro esta
interaccin yo voy a ver mucha marca de gp 91, es es co inmune precipitacin y
fjense el ejercicio aumenta la interaccin de p 47 y gp 91, hee la pocinica que es
un inhibidor de nox 2 que lo que hace es bloquear el acoplamiento del complejo
entre p 47 y gp 91 para que no se acoplen, por lo tanto inhibe la nox 2 (inhibidor
competitivo), entonces luego hicimos otro ensayo el pla un ensayo de
proximidad en forma general lo que hace es determinar la interaccin entre dos
protenas, ej p47 y gp 91 y lo que se ve es que la interaccin aumenta en el
ejercicio y con pocinica disminuye la interaccin en los ratones.

Tenemos dos grandes cosas ac


1.- El ejercicio activa nox 2 .
2.- La pocinina esta inhibiendo in vivo durante el ejercicio la activacin
Por lo tanto queremos ver si la nox 2 es necesaria para la sealizacin intracelular,
por lo tanto que debera hacer yo para saber si la nox 2 es necesaria para la
activacin y expresin de genes durante el ejercicio seria inhibir noxx 2 y ver si se
inhiben lo eventos que uno ya sabe que ocurren.

Hasta ahora sabemos que que el ejercicio hace activacin y acoplamiento de nox
2 la interaccin en tre las sub unidades citosolicas y las de membrana,

Como nos planteamos estas preguntas la primera es si es que existe la


activacion de nox en musculo esqueltica durante el ejercicio y la forma mas fcil
era ver la interaccin entre sub undades citosolicas y sub unidades de membrana
que normalmente no interactuar y en activacin si interactuar.

Fjense ah se muestran un inmuno fluorescencia para rad one que es una de las
sub unidades de la nox 2, entonces en rojo esta rad en condicin control en una
fibra muscular asilado estimulada elctricamente y al lado se muestra el receptor
dihidropiridina que es sensor de voltaje que esta donde? el dhpr en la triada
entonces el dhpr esta ac en el tubulo t entonces cuando una des polarizacin se
propaga el sensor de voltaje que es un canal de calcio tipo l que no funciona como
canal de calcio sino que como un sensor de voltaje por que los sub unidades
citosolicas del dhpr tienen carga por lo tanto puede pensar el voltaje y esta unido
mecanicamente al rin (recertor de rianoina) que es el rin??? no se entiende
(receprto de rianoina ) que por donde sale el calcio para la contraccin muscular
(en corazn calcio mediad por calcio<), el hdpr lo utilizamos para marcar el tabulo
miren rad y cuando estimulo elctricamente a una celular y fijesse como rada
cambia su estructura a un patron tubular lo que dice que otra de las sub unidades
que rada se esta yendo al tubulo y puede participar en la activacin del musculo
bueno necesitamos mas evidencia aun para eso, por que que se acople el
complejo no es necesariamente una activacin via ros, y lo que hicimos fue medir
ros hee estas son celular musculares que las cargamos con una sonda sensible a
ros y lo que veamos es que cuando yo estimulo elctricamente esta celular existe
un incremento de ros, la gracia que tiene esta sonda que cuando se oxida brilla
entonces uno puede detectar ros por fluorescencia, entonces la contraccin
muscular induce aumento de la produccin de ros, ahora cuando uno aplica
apocinina este inhibidor de nox 2 o gp 91 que es un inhibidor mas especifico ya no
tengo produccin de ros, entonces lo que nos dice que la contraccin induce a
ros y que ros depende de nox 2, por lo tanto nuestro modelo va as hay
acoplamiento del complejo y hay produccin de ros eso llevamos entonces esa fue
la primera pregunta se activa nox 2 en el ejercicio en vivo o en vitro si

Pregunta la contraccin induce produccin de ros y es atreves de nox2 vamos


ahi que se activa el complejo y produece ros

La segunda pregunta es son estos ros responsables de la sealizacin inducida


por ejercicio QUE UNO SABE QUE SE BLOQUEAN CON ANTIOXIDANTES,,,1
hr 30 min 18 seg

Lo que vimos ac es que la apocinina Reduca la activacin de nfkb por lo tanto nfkb est
siendo activado por la produccin de ROS va NOX2 y cul es la caracterstica de nfkb. Es
un factor de transcripcin que normalmente est en el citoplasma esta inactiva en el
citoplasma unida a protenas chaperonas que son protenas que la tienen secuestrada, que
son las IKb?.
Cuando NFKB se activa normalmente se desfosforila NFKB se suelta de sus protenas
chaperonas y se va al ncleo, se une al DNA y promueve la transcripcin de genes.
Bueno nuestra pregunta es si la NOX produce ROS activa NFKB y la fosforilacin de P65
que es necesaria para que se active nfkb si ustedes se fijan la aposinina? reduce la
fosforilacin de p65 por lo tanto producia la activacin de nfkb por lo tanto lo que
llevamos, el ejercicio activa NOX2 la aposinina? Inhibe la activacin, ROS activa vas
que son sensibles a ros que son nfkb p38 y ERK son protenas clsicas sensibles a ROS.
Bueno, hasta ahora estamos viendo que el ejercicio activa NOX, activa vas que son
sensibles a ROS y la aposinina produce esta seal, ahora la pregunta era, estos ROS
modulan la expresin de genes?

Hay un par de protenas que dependen de la activacin de nfkp enzimas antioxidantes,


superoxidoinmutaza tiene sitio de unin con NFKB.

Entonces un estudio del 2009 dice los ROS y las miokinas, los pptidos liberados por el
musculo, promueven la adaptacin al ejercicio, durante el ejercicio la mitocondria produca
ROS activaba factores de transcripcin sensibles a ROS y promova la expresin de genes
antioxidantes y de miokinas, nosotros llevamos hasta ahora la produccin de ROS es via
NOX y activa factores sensible a ROS.
Lo que nosotros queramos ver es que esto era cierto pero no por va mitocondrial si no por
via de NOX.

Lo primero que vimos fue ver miokinas, y la ms clsica es la IL6 entonces medimos IL6
en plasma, entonces vimos que en el tratamiento con aposinina inhibiendo NOX 2 reduce la
liberacin de IL6.

Por lo tanto sugerimos que NOX2 juega un papel. Bueno eso era en el plasma por lo que lo
que se est viendo puede venir de cualquier lado, por lo que lo vimos en el msculo, vimos
el RNA mensajero de IL6 en el msculo esqueltico con ejercicio primero donde aumenta
la expresin de IL6, la aposinina inhibe la expresin y PTC es un inhibidor de NFKB y si
inhibo NFKB no hay expresin de IL6.

Por lo que veo que este aumento de IL6 es producto de NOX2 y de NFKB.
Bueno, despus aislamos fibras musculares, y dimos estimulos elctricos para simular el
ejercicio, entonces vimos que IL6 amentaba con este estimulo, similar al ejercicio y usamos
un antioxidante mitocondrial que es EUK, que es un antioxidante que va a la mitocondria,
por lo que eliminara los ROS mitocondriales y fjense que EUK no tiene ningn efecto en
la produccin de la IL6, entonces los ROS mitocondriales no son necesarios para la
expresin de IL6.

Pero si uno inhiba con GP91, Y aposinina, ambos inibhidores de NOX2, no se vea
expresin de IL6. Y si uno usaba SN50 que es un inhibidor de NFKB muy especfico,
tampoco vea expresin de IL6.

Entonces hasta ahora hemos visto que los ROS producidos por la mitocondria,y los nox2
activan factores de transcripcin como NFKB porque si uno usa NS50 esta IL6 no se
expresa.

NOX 2 produce ROS, activa NFKB y este es un factor de transcripcin necesario para
producir IL6, entonces si uno inhibe NFKB no ve expresin de IL6.
Entonces los ROS mitocondriales no son necesarios pero si los ROS de NOX y la actividad
de NFKB por lo tanto estos dos llevan a la expresin de IL6.
Bueno se deca que no solo las miokinas dependan de ROS si no tambin los genes
antioxidantes,

Los efectos beneficiosos del ejercicios en la IL6, se libera a la sangre y va al hgado,


provocando glucogenolisis, por lo tanto se libera glucosa a la sangre, adems va al
adipocito y genera lipolisis y adems tiene un efecto paracrino, se cree que IL6 es capaz de
modular la captacin de glucosa y se cree que es capaz de activar AMPK.
Otro efecto importante es el efecto antioxidante del ejercicio. Sabemos que el ejercicio
promueve una mejora en la capacidad antioxidante, no se sabe muy bien el mecanismo,
sabemos que la manganesosuperoxidoinmutaza, y la glutatonperoxidasa dependen de
NFKB, por lo tanto la pregunta era obvia, si NFKB est modulando la IL6 por va NOX 2
probablemente tambin a estas otras enzimas.

ROS activaba NFKB producan expresin de genes antioxidantes y estos mismos son los
que preparan este efecto hermtico para una prxima oxidacin.

Y este ao salieron 2 revisiones de la biognesis mitocondrial como puede ser modulada


por estimulo REDOX y los focos estn en la produccin de ROS mitocondrial y nosotros
dijimos veamos si alguna enzima mitocondrial podra estar modulada por ROS que derivan
de la NOX2 y vimos la citratosintaza, primera enzima del ciclo de Krebs, y TFAM que es
un factor de transcripcin mitrocondrial que es necesario y suficiente para la biognesis
mitocondrial.

El ejercicio promueve aumento de enzimas mitocondriales, pero la aposinina disminuye ese


efecto, por lo tanto los ROS que derivan de la NOX2 son dependientes para la la
biognesis mitocondrial.

La siguiente pregunta es, participara AMPK en esta seal? Y lo que hicimos fue hacer un
modelo ex vivo de contraccin utilizando GP91 y STAP? que es un inhibidor muy
parecido a la aposinina pero muy especfico para NOX2 y lo que veamos es que
inhibiendo NOX2 no haba cambios en la activacin de AMPK en la treonina 172 de la
subunidad alfa, por lo que NOX2 no es necesaria para la activacin de AMPK.

Entonces lo que hicimos fue ver la fosforilacin de la subunidad alfa de AMPK. Cules
son las subunidades de AMPK? Alfa, beta, y gama Que hace cada una de las subunidades
La gama es esencial en la AMPK porque es la que une AMP, y eso lleva a una activacin de
aproximadamente 5 veces??
La subunidad B une glucgeno, tiene sitios de unin al glucgeno, y sitios de unin
inhibitorios, cuando yo reduzco el glucgeno muscular esos sitios inhibitorios se van
reduciendo, por eso la reduccin de glucgeno activa AMPK
La subunidad alfa es la ms importante, es la subunidad cataltica, es fosforilada en treonina
172 y adems tiene la actividad kinasa, es decir, la actividad cataltico, por ejemplo, si yo
quiero ver un target de AMPK como lo es la Acetyl CoA carboxilasa o ACC que es
fosforilada por AMPK como yo podra determinar si AMPK es necesaria para la
fosforilacion de la ACC, para esto disminuira la la actividad de la subunidad alfa, entonces
hay un raton que es el KD que tiene la kinasa muerta o dead kinasa y ese raton no tiene
fosforilacion de la ACC.

Adems en el musculo hay una alfa 1 y 2, una beta 1 y 2 y una gama 1,2 y 3. Y en el
musculo esqueltico hay 3 trmeros est el a2 b2 g1, est el a2 b2 g3 y el a1 b2 g1, esos hay
en el cudriceps, y lo curioso es que no todos se activan, por ejemplo el a2, b2, g1 se reduce
durante el ejercicio. Por lo que decir que AMPK se reduce en ejercicio no sera tan errneo,
normalmente el a2, b2, g3 es el que se activa en ejercicio.
Cuando yo veo la activacin de AMPK por fosforilacin, yo no se cual estoy viendo,
entonces lo ideal es mostrar la actividad de AMPK ms que la fosforilacin.

Hay un paper que es clsico que Sali este ao que lo que se hizo fue comparar 2 estmulos
de ejercicio 30 min al 70% del vo2 max. y 6x90 seg al 95 % del vo2 max y tomo biopsias
del vasto lateral y separ las fibras tipo 1 de las tipo 2 y muestra que si uno compara
glucgeno muscular, entre el ejercicio continuo vs intervalado, uno vera principales
diferencias en fibras tipo 2, en el continuo el glucgeno llega al mismo nivel en ambos
tipos de fibras, la disminucin del glucgeno fue similar entre ambas fibras, pero en
ejercicio intervalado la disminucin fue principalmente en fibras tipo 2, adems se mostr
que la fosforilacin de la treonina 172 se activaba mucho ms en fibras tipo 2 que en fibras
tipo 1, AMPK se fosforila de la misma manera en ejercicio continuo entre ambas fibras,
pero con ejercicio intervalado AMPK se activa mucho ms en fibras tipo 2, por lo que
muestra que distintos ejercicios muestran distintas seales en distintos tipos de fibra.
Y lo mismo con la Acetyl CoA carboxilasa, y ac ven la actividad de a2, b2, g3 y la
relacin con la ACC indicando que ese es el trmero que se activa.
Bueno y el modelo que nosotros tenemos es este que dice que se activa NOX2, esto
produce ROS, activa vas de sealizacin sensibles a ROS, promueve factores de
transcripcin como NFKB y otros que an no sabemos, promueve la activacin de genes
antioxidantes, genes mitocondriales y miokinas importantes para el ejercicio.