Metodos de Analisis Microbiologicos de Alimentos - Corrie Allaert Vandevenne PDF

MTODOS DE ANLISIS
MICROBIOLGICOS
DE ALIMENTOS
Corric AUaert Vandevenne y M arta Escol Ribes, 2002
Ediciones Daz de Santos, S. A.

Juan Bravo, 3-A. 28006 MADRID
Espaa
E-mail: ediciones@diazdesantos.es
Intemet://http:www .diazdesantos.es
ISBN: 84-7978-524-1
Depsito legal: M. 23.431-2002
Fotocomposicin: Fernndez Ciudad, S. L.

Impresin: Fernndez Ciudad, S. L.
Encuademacin: Rstica-Hilo, S. L.
Impreso en Espaa
A utores
C o r rie A l l a e r t V andevenne, Tcnico en Microbiologa (Instituto Pasteur

de Lille), responsable del Laboratorio de M icrobiologa de Alimentos y
Aguas del Departamento de Tecnologa de Alimentos de la Universidad de
Lleida, Coordinadora del Programa EQUASE (Ejercicios de Verificacin Ex
terna de Calidad) en Espaa en colaboracin con el PHLS (Public Health La-
boratory Services) del UK, Representante de la Universidad de Lleida en los
ejercicios interlaboratorios de validacin de mtodos ISO para el CEN (Co
mit Europeo de Normalizacin).
e-mail: corrie@tecal.udl.es
M a r ta E s c o l Ribes, Ingeniero Agrnomo. Este libro es una versin mo

dificada y adaptada de su Proyecto de Fin de Carrera.
Agradecimientos
A Vicente Sanchis Almenar, catedrtico de Microbiologa de Alimentos, por su confianza y

por damos nimos para publicar este proyecto en forma de libro.
A Robert Garrof Forca, por su fiel y eficaz colaboracin tcnica para la puesta a punto de
los mtodos y la integracin de los mismos en los sistemas de calidad del laboratorio.
A Nuria Sala Mart, profesora de Microbiologa de Alimentos y Agraria, miembro de la co

misin ISO/CEN en Espaa, as como a Merc Torres Grifo, profesora de Microbiologa Gene
ral e Higiene, por su colaboracin en los ensayos interlaboratorios de validacin y sus criticas
constructivas.
Reflexiones
Qued muerto as como mineral y me convert en planta.

Qued muerto luego como planta y tom una forma sensible.
Qued muerto luego como animal, me puse atuendo humano.
Cundo me hice menos por la muerte?
RUMI
La vida... una profundidad viva de equilibrios, siempre en movimiento y fusin, de tensio

nes y desahogos, en la constante transformacin de creacin y destruccin.
Edward C. W hitmont
As microbiologists, dealing with living organisms, we should probably have leamed by now
to always expect the unexpected.
S h eila E aton, Responsable de la Organizacin de EQUAL del PHLS.
Es la conclusin de ms de 10 aos de ejercicios interlaboratorios para Verificacin Extema

de Calidad.
De luz y de sombra soy, quiero darme a las dos.

G abriel y G aln
V oor B oy en S or
NDICE
INTRODUCCIN ................................................................................................................... XIX
CAPTULO PRIMERO
PROCEDIM IENTO GENERAL DE REDACCIN DE MTODOS DE ANLISIS

DE ALIMENTOS (PNT - A L -001) ............................................................................. 1
CAPTULO SEGUNDO
PROCEDIM IENTO DE EXPRESIN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002) ......... 9
Tablas de resultados................................................................ 16
Anexo 1: Tablas de lmites de confianza ............................................................................... 42
Anexo 2: E jem plos ............................................................................................................. 46
Recuento en medio slido sin identificacin: Ejemplos 1 al 12 ......................................... 47
Recuento en medio slido despus de identificacin: Ejemplos 13 al 26 .............. 51
Recuento en medio lquido: Ejemplos 27 al 31 ........................... 58
CAPTULO TERCERO
PROCEDIMIENTOS DE M TODOS DE ANLISIS DE A L IM E N T O S .................... 61
PNT - AL - 003: Mtodo horizontal para el recuento de microorganismos a 30 C (mto

do de referencia) .................................................................................... 62
PNT - AL - 004: Mtodo horizontal para el recuento de microorganismos a 30 C (mto
do de rutina)........................................................................................................................... 64
PNT - AL - 005: Mtodo horizontal para el recuento de levaduras y mohos (mtodo de re
ferencia) .........................................................................
PNT - AL - 006: Mtodo horizontal para el recuento de levaduras y mohos (mtodo de ru
tina) .............................................................................
PNT - AL - 007.1: Mtodo horizontal para el recuento sin revivificacin de Enterobacte-
riaceae. Tcnica del NMP (mtodo de referencia) ............................................................ 70
PNT - AL - 007.2: Mtodo horizontal para el recuento sin revivificacin de Enterobacte-
riaceae. Tcnica por recuento de colonias (mtodo de referencia)................................... 72
PNT - AL - 008: Mtodo horizontal para la investigacin de Enterobacteriaceae con pre-
enriquecimiento (mtodo de referencia)............................................................................. 75
Xltl
XIV Indice
PNT - AL - 009: Mtodo horizontal para el recuento sin revivificacin de Enterobacte-

riaceae. Tcnica por recuento de colonias (mtodo de rutina) ...................... 77
PNT - AL - 010: Mtodo horizontal para el recuento de cliformes totales. Tcnica del
NMP (mtodo de referencia) ................................................................................................ 80
PNT - AL - 011: Mtodo horizontal para el recuento de coliformes totales. Tcnica por re-
cuento de colonias (mtodo de referencia) .......................................... 82
PNT - AL - 012: Mtodo horizontal para el recuento de coliformes totales (mtodo de ru
tina) ....................................................... 84
PNT - AL - 013: Mtodo horizontal para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Tc
nica del NMP (mtodo de referencia).................................................................................. 86
PNT - AL - 014: Mtodo horizontal para el recuento de Escherichia coli /Lgl ucuronidasa
positivos (mtodo de rutina) .................................................. 88
PNT - AL - 015.1: M todo horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa posi
tivos (CPS) con confirmacin. Tcnica por recuento de colonias (mtodo de refe
rencia) ........................................................................................... 90
PNT - AL - 015.2: M todo horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa posi
tivos (CPS) sin confirmacin. Tcnica por recuento de colonias (mtodo de refe
rencia) ..................................... 93
PNT - AL - 016.1: Mtodo horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positi
vos (CPS). Tcnica con confirmacin de colonias (mtodo de rutina) ......................... 95
PNT - AL - 016.2: Mtodo horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positi
vos (CPS). Tcnica sin confirmacin de colonias (mtodo de ru tin a )........................... 98
PNT - AL - 017: Mtodo.horizontal para el recuento de Bacillus cereus (mtodo de refe
rencia) ............................................................................................. 100
PNT - AL - 018: Mtodo horizontal para el recuento de Bacillus cereus (mtodo de rutina). 103
PNT - AL - 019: Mtodo horizontal para el recuento de Clostridium perfringens (mtodo
de referencia) ........................................................................................................................... 106
PNT - AL - 020: Mtodo horizontal para el recuento de Clostridium perfringens (mtodo
de ru tin a )............................................................................................... 109
PNT - AL - 021: Mtodo horizontal para la investigacin de Salmonella (mtodo de re
ferencia) .......... 112
PNT - AL - 022: Mtodo horizontal para la investigacin de Salmonella (mtodo de ru
tina) ........................................................... 118
PNT - AL - 023.1: Mtodo horizontal para la investigacin de histeria monocytogenes
(mtodo de referen cia) ..................... 123
PNT - AL - 023.2: Mtodo horizontal para el recuento de Listeria monocytogenes (m
todo de referencia) .................................................................................................................. 127
PNT - A L - 024: Mtodo horizontal para la investigacin de Listeria'monocytogenes (m
todo de ru tin a )......................................................................................................................... 131
PNT - AL - 025: Mtodo horizontal para la investigacin de Campylbacter termotole-
rantes (mtodo de rutina) ...................................................................................................... 135
CAPTULO CUARTO
PR O C ED IM IEN TO GEN ERA L DE PREPA R A C I N D E M EDIOS DE CULTIV O

(PNT - M E - 0 0 1 )................................................................................................................... 141
CAPTULO QUINTO
P R O C E D IM IE N T O G EN ERA L DE C O N T R O L DE CALIDAD D E M EDIO S DE

C U L T IV O (PNT - M E - 002) ............................................................................................ 147
INQief XV
CAPTULO SEXTO
PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO ............... 15 1
Relacin de medios de cultivo y PNT - AL en el que aparecen ......................................... 153

PNT - ME - 003: Procedimiento para la preparacin de la peptona salina (P S ) ....... 155
PNT - ME - 004: Procedimiento para la preparacin del agar para recuento (PCA) 156
PNT - ME - 005: Procedimiento para la preparacin del agar blanco (A B )...................... 157
PNT - ME - 006: Procedimiento para la preparacin del agar glucosa y cloranfenicol
(CGA) ................................................................................................................................. 158
PNT - ME - 007: Procedimiento para la preparacin del caldo tamponado con bilis, verde
brillante y glucosa (caldo E E )........................................................................................... 159
PNT - ME - 008: Procedimiento para la preparacin del agar bilis cristal violeta y gluco
sa (VRBG) ..................................................................................................... 160
PNT - ME - 009: Procedimiento para la preparacin del agar glucosado (A G )................ 161
PNT - ME - 010: Procedimiento para la preparacin del agar nutritivo (AN) .................. 162
PNT - ME -011: Procedimiento para la preparacin del caldo nutritivo (C N )................. 163
PNT - ME - 012: Procedimiento para la preparacin del agua de peptona tamponada
(APT) ............................................................................................................... 164
PNT - ME - 013: Procedimiento para la preparacin del caldo de triptona lauril sulfato
(TSL) - ................................................................................................................. 165
PNT - ME - 014: Procedimiento para la preparacin del caldo lactosado biliado verde bri
llante (BGBL) ..................................................................................................................... 166
PNT - ME - 015: Procedimiento para la preparacin del agar lactosado con bilis al cristal
violeta y rojo neutro (VRBL)......................................................................................... 167
PNT - ME - 016: Procedimiento para la preparacin del caldo Escherichia coli (caldo EC).. 168
PNT - ME - 017: Procedimiento para la preparacin del agua de triptona (A T )............... 169
PNT - ME - 018: Procedimiento para la preparacin del agar con tergitol-BCIG (PTX) 170
PNT - ME - 019: Procedimiento para la preparacin del medio de Baird-Parker (B P ) 171
PNT - ME - 020: Procedimiento para la preparacin del caldo de cerebro-corazn (BHI).... 172
PNT - ME - 021: Procedimiento para la preparacin del agar con plasma de conejo y fi-
bringeno (RPF) ................................................ :............ 173
PNT - ME - 022: Procedimiento para la preparacin del agar manitol yema de huevo con
polimixina (M Y PA )........................................ 174
PNT - ME - 023: Procedimiento para la preparacin del medio Voges-Proskauer (MR-
V P )......................................................................................................................... 175
PNT - ME - 024: Procedimiento para la preparacin del medio nitrato (M N ).................. 176
PNT - ME - 025: Procedimiento para la preparacin del agar sangre (AS) ...................... 177
PNT - ME - 026: Procedimiento para la preparacin del agar movilidad (AM) ............... 178
PNT - ME - 027: Procedimiento para la preparacin del agar triptona-sulfito con ciclose-
rina (TSC) ........................................................................................................................ 179
PNT - ME - 028: Procedimiento para la preparacin del tioglicolato (TIO) ..................... 180
PNT - ME - 029: Procedimiento para la preparacin del medio lactosa sulfito (L S ) 181
PNT - ME - 030: Procedimiento para la preparacin del caldo con verde de malaquita y
cloruro de magnesio (Rappaport-Vasiliadis modificado) (R V )................................... 182
PNT - ME - 031: Procedimiento para la preparacin del caldo selenito-cistina (SC) ...... 183
PNT - ME - 032: Procedimiento para la preparacin del agar rojo fenol y verde brillante
(BGA) .............................................................................................................................. 184
PNT - ME - 033: Procedimiento para la preparacin del medio Hektoen (H K )................ 185
PNT - ME - 034: Procedimiento para la preparacin del agar Kligler .............................. 187
PNT - ME - 035: Procedimiento para la preparacin del agar nutritivo semislido (ANS)... 188
PNT - ME - 036: Procedimiento para la preparacin del caldo Fraser semi (FS) ............. 189
PNT - ME - 037: Procedimiento para la preparacin del caldo Fraser completo (FC) .... 190
XVI N D IC E
PNT - ME - 038: Procedimiento para la preparacin del agar Oxford.............................. 191

PNT - ME - 039: Procedimiento para la preparacin del agar Palcam.............................. 192
PNT - ME - 040: Procedimiento para la preparacin del agar triptona de soja-extracto de
levadura (TSYEA) ......................................................................................................... 194
PNT - ME - 041: Procedimiento para la preparacin del caldo para la utilizacin de los
glcidos (ramnosa y xilosa)................. 195
PNT - ME - 042: Procedimiento para la preparacin del caldo de Parfc y Sanders ........... 196
PNT - ME - 043: Procedimiento para la preparacin del agar de Karmali (AK) .............. 197
PNT - ME - 044: Procedimiento para la preparacin del agar Butzler modificado 199
PNT - ME - 045: Procedimiento para la preparacin del caldo de Brucella (C B )............... 200
PNT - ME - 046: Procedimiento para la preparacin del agar de sangre Columbia 201
PNT - ME - 047: Procedimiento para la preparacin del agar de sangre Mueller-Hinton 202
PNT - ME - 048: Procedimiento para la preparacin del agar citrato de hierro tres azca
res (TSI) ............................................................................................................................ 203
PNT - ME - 049: Procedimiento para la preparacin delcaldo triptona de soja (TSB) .... 205
CAPTULO SPTIMO
PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIN DE REACTIVOS (PNT -

RE - 001) ........................................................................................................................ 207
CAPTULO OCTAVO
PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

(PNT - RE - 002) ............... 213
CAPTULO NOVENO
PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIN DE REACTIVOS.................................. 217
Relacin de reactivos y medio al que se aaden................................................................. 219

PNT - RE - 003: Procedimiento para la preparacin del suplemento antimicrobiano de
gentamicina ........................................................................................................... 220
PNT - RE - 004: Procedimiento para la preparacin de la solucin estril de yema de hue
vo .................................................................................................................................... 221
PNT - RE - 005: Procedimiento para la preparacin del telurito potsico al 1% .............. 222
PNT - RE - 006: Procedimiento para la preparacin de la sulfametacina al 0,2% ........... 223
PNT - RE - 007: Procedimiento para la preparacin del sulfato de polimixina B al 4% ... 224
PNT - RE - 008: Procedimiento para la preparacin del rojo de m etilo............................ 225
PNT - RE - 009: Procedimiento para la preparacin de la solucin de cc-nafto!............... 226
PNT - RE - 010: Procedimiento para la preparacin de la solucin de KOH al 40% ...... 227
PNT - RE -011: Procedimiento para la preparacin del reactivo de nitratos.................... 228
PNT - RE - 012: Procedimiento para la preparacin del metabisulfito sdico al 1,2% .... 229
PNT - RE - 013: Procedimiento para la preparacin del citrato frrico amoniacal al 1% .... 230
PNT - RE - 014: Procedimiento para la preparacin del suplemento selectivo para el cal
do Frasersem i ....................... 231
PNT - RE - 015: Procedimiento para la preparacin del suplemento selectivo para el cal
do Fraser completo ........................................................................................................ 232
PNT - RE - 016: Procedimiento para la preparacin del suplemento selectivo para el agar
Oxford.......................................................................... 233
NDICE XVII
P alcam ............................................ 234
PNT - RE -018: Procedimiento para la preparacin de la solucin de antibiticos A
para el caldo de Park y Sanders ................. 235
PNT - RE - 019: Procedimiento para la preparacin de la solucin de antibiticos B
para el caldo de Park y Sanders ........................................................................................ 236
de Karmali ................. *........ 237
B utzler................................................................................................................................. 238
PNT - RE - 022: Procedimiento para la preparacin del reactivo de K ovacs ........ 239
PNT - RE - 023: Procedimiento para la preparacin de la solucin salina (S S )................ 240
PNT - RE - 024: Procedimiento para la preparacin del reactivo para la investigacin de la
/-gaiactosidasa (O N PG ).................................................................................................... 241
PNT - RE - 025: Procedimiento para la preparacin de la solucin de fenilalanina al
0,5% (FA) ........................................................................................................................... 242
PNT - RE - 026: Procedimiento para la preparacin de la solucin de cloruro frrico al
10% ..................................................................................................................................... 243
BIBLIOGRAFA G E N E R A L .............................................................................................. 245
N O R M A TIV A ......................................................................................................................... 247

IN TRO D U CC IO N
1*1 presente libro va dirigido a los profesionales y estudiantes de M icrobiologa del sec
tor agro-alim entario en el control de las materias pom as y los productos terminados, a
los laboratorios de anlisis de alim entos, a los tcnicos de laboratorio, a las U niversi
dades que reali/an prcticas de m icrobiologa de alim entos y de control de calidad.
Para aplicar los m todos aqu descritos se requiere que el laboratorio disponga
del material y equipos corrientes en un laboratorio de m icrobiologa de alimentos.
Este material estar debidam ente calibrado, verificado y m antenido en ptim as condi
ciones de funcionam iento segn procedim ientos propios del sistem a de calidad de
cada laboratorio y adaptado a la norma ISO 7 2 IX (Reglas G enerales para los ensayos
microbioMgcos). A dem s, cada m todo puede precisar algn material o equipo espe
cifico.
La implantacin de las Buenas Prcticas de Laboratorio (B PL ) y Aseguramiento de
la Calidad obliga a norm alizar toda* la* operaciones que se realizan en el laboratorio.
Por ello se han redactado una serie de procedimientos e instrucciones de trabajo con el
fin de dar uniformidad y consistencia a los anlisis de alimentos que se reali/an en los
laboratorios d e microbiologa y reducir los riesgos de error por parte de las personas
que realizan el ensayo.
Dado que la finalidad de trabajar con BPL es la obtencin de resultados analticos
de calidad y conseguir la aceptacin mutua de estos resultados entre los diferentes pa
ses. tenem os que seguirlas escrupulosam ente.
La elaboracin de estos docum entos viene dada por la necesidad de tener un siste
ma unificado de funcionam iento y gestin de los laboratorios, ya que hace falla ase
gurar la calidad e integridad de los resultados y datos obtenidos en los anlisis, y esta
blecer esquem as de funcionam iento equivalentes entre laboratorios.
As. se ha realizado una hom ogenei/acin de los mtodos de anlisis de alimentos,
unificando sus caractersticas en base a las normas internacionales correspondientes
(ISO: International Standard Organisation: EN: Eum pcan Norme; NF: Norme Franâi-
se; AFNOR: Association Franâisc de Norma lisa tion). Junto con ellos se han redacta
do los procedim ientos de preparacin de los medios de cultivo y reactivos necesarios
para realizar los ensayos, de m anera que hay una explicacin de cada uno de los as
pectos de los procedim ientos de anlisis.
Los resultados d e los anlisis son el producto final del trabajo del laboratorio, de
m anera que se ha de obtener un resultado fiable, lo cual es el principal objetivo de to
dos los sistemas de calidad. A causa de la complejidad de la norma do expresin de re-
X IX
XX IN TR O D U C C IO N
mldtKv. cii e l a p a rta d o currcNpixKlicnic d e k n P N T A L (in cfo d o s) ucai)K antc \ c ex*

p o ix el c a s o g eneral y ve ha red actad o un pfOcedmenM> (P N T - A L - 0(12 1 q u e ex p lica
d e ta lla d a m e n te la m a n e ra d e e x p re sa r lo s resu ltad o * e n c a d a p o s ib le c a s o . E n e ste
P N T se e x p o n e e n u n as tabla* la fo rm a d e o b te n e r y e x p re sa r e l resultad d e l an lisis
p ara c a d a P N T - A L . A d e m s, e n e ste p ro c e d im ie n to h a y e je m p lo s d e c a so s p r c tico s
q u e a y u d a n a la a p lic a c i n d e las f rm u las.
Lo* m todo* IS O (2 placa* p o r d ilu c i n , c o n tin u a c i n d e 5 c o lu n ia s ) su elen u tili
zarse c o m o m to d c d e re fe re n cia y lo s m to d o s N F <I p la c a p o r d ilu c i n . c o n firm a
c i n d e 3 c o lo n ia s) s e suelen e m p le a r c o m o m cU xk d e rutina, sie n d o lo* d o s inetods
n o rm alizad o s.
C o n el <bjchvo d e u n ifo rm iz a r to d o s lo s p ro c e d im ie n to s d e l la b o ra to rio , se h a n re
d a c ta d o u n o s Prcvdtin ionios N ttrm alizad o s d e T ra b a jo (P N T ) q u e d a n la* in s tru c c io
nes p a ra la re d a c c i n d e to d o s e s to s d o c u m e n to s, ta n to d e m to d o s d e a n lisis d e a li
m e n to s (P N T - A L - 0 0 1 ) c o m o ls d e p re p a ra c i n y c o n tro l d e c a lid a d d e lo* m e d io s
d e c u ltiv o (PNT - M E - 001 y P N T - M E - 0 0 2 ) y re a c tiv o s ( P N T - R E - 001 y P N T -
R E - 0 0 2 ) n ecesario* p a ra ellos.
L o s P ro c e d im ie n to s S o r m a !iz a d o s d e T ra b a jo i P S T > son un c o n ju n to d e in stru c
c io n e s e sc rita s d e o b lig a d o y rig u ro so c u m p lim ie n to q u e d e sc rib e n c m o d e b e n re a li
zarse d eterm in ad o * m to d o s d e e n sa y o , c m o d e b e n m an ejarse lo s e q u ip o s d e an lisis
o c m o se d e b e p n x v d c r an te c u a lq u ie r o tra a c tiv id a d d e l lab o rato rio .
L a preparacin d e algunos m edio* d e c u ltiv o ( P N T - M E ) o reactive (P N T R E ) e s
e sp e c ific a d e una m arca c o m e rc ia l. A nte* d e a p lic arlo s h a b r q u e cxnnprobar la c o m
p o sici n d e l m e d io o re a ctiv o tesad e n e l la b o ra to rio y ad ap tarlo a la* ia s tm o c k in del
p ro v e e d o r o d e la n o rm a o rig in al.
L a n o rm a liz a c i n e s u n p ro c e so c o n tin u o d e m e jo ra e n lo s a n lisis, y a u n q u e los
cam bio* s e a n le n to s, d e b id o al pnces d e e la b o ra c i n d e norm a* in te rn a cio n ale s, p a
sad alg u n o s aikts e s acon se ja b le com probar q u e la n o rm a e n la q u e se ba*a e l P N T n o
h ay a s u frid o ni(di fie acio n es.
E n e l m o m e n to d e la re d a cc i n d e l lib ro , a lg n metdo y a h a b a valido c o n p e q u e
o* c am bio*, c o m o p o r e je m p lo el d e re c u e n to d e c n tcro h ac tc ria s. m to d o e n e l c u a l se
su p rim e la c o n firm a c i n tic colo n ia* . Per la e x p e rie n c ia d e m u e s tra q u e e sta c o n fir
m acin e s m uy til a la h o ra d e e v ita r falso s p o sitiv o s e n seg n q u p ro d u cto s. A s q u e
h em o s dejad la c o n firm aci n . va q u e siem p re e s m s fcil q u ita r p aso s q u e n o aadir.
I i \ ik w n iii l*U l EN . \ P AFXO R ( A w ia c v ^ n F\piWl.i l* \ n m n l i / j r i r o ) m- van
clabrand( y re v isa n d o d e m an era c o n tin u a C o m o e ste pro c e s o su e le s e r b a sta n te
larg o , c* a c o n se ja b le c o n su lta r las sig u ien te* p g in as w eb :
ISO: http:U ww w.iso.ch

E N : h ttp . w h w .e e n o tm be
AFN< )R : h ttp .7;w w a fn o r.fr
A E X O R : h rtp : w w w .a e n o r .e s
l l t i m a i n e n ie se e s t re a liz a n d o la v a lid a ci n d e le metode* IS O p a ra e l C E N

(C o m it Europe d e N o rm a liz ac i n ), y c o m o c o n se c u e n c ia se in c lu ir n e n las n o rm as
los d atos d e precisin (expresados e n repet b ilid ad y Yvproductbilidad) d efin id o s du ran te
U>5 c iim ) iw nkiiotK )catorio5. P o r cM m u liv o . h nonnw de recien te p u b lic a c i n in
c lu y en e n la e x p re si n d e re su ltad o s el apartad* P re c isi n . L as d e m s norm a* se re
m iten a u n a n o rm a g e n eral, la IS O 7 2 1K.
IN T R O D U C C IO N XXI
El ao 20()0 vio la aparicin de la norma ISO 17025 Prescripciones generales para

la com petencia de los laboratorios de calibracin v ensayos. Esta norm a es el resulta-
di de un intento de arm onizacin entre los diferentes docum entos existentes, com o la
G ua ISO 25. la norm a EN 45001 y las ISO 9000.
Los cam bios a destacar son los que hacen hincapi en la relacin laboratorio/clien
te. teniendo en cuenta la informacin que busca el cliente y para qu quiere esta infor
macin. En el caso de los ensayos, el m todo em pleado para dar esta inform acin es
fundamental, as com o caractersticas com o la precisin en trm inos de repetihilidad y
reproducibilidad. incertidum bres y validacin.
En una nota se explica que para validar m todos conviene em plear una com bina
cin de las siguientes tcnicas:
Utilizacin d e m aterial de referencia.

C om paracin de los resultados con los obtenidos con otros m todos.
C om paraciones interlaboratorios (ejercicios de verificacin extem a de calidad).
Evaluacin sistem tica de los factores que puedan afectar a los resultados.
Evaluacin de las incertidumbres en base a principios tericos y conocim iento
prctico del mtodo.
M ediante las incertidumbres (material de referencia em pleado, m todos y equipos,

condiciones am bientales, propiedades y condiciones del objeto som etido a anlisis, el
tcnico, etc.) y los lmites de confianza del m todo, se presenta ahora un resultado, no
com o un valor nico, pero com o un conjunto de valores num ricos, todos ellos proba
bles. I lav que destacar que la palabra nccrtidwnbrc sale 34 veces en esta nueva norma.
Con los m todos que presentam os en este libro se persigue obtener un sistem a de
trabajo cuyo objetivo es agilizar y facilitar las operaciones del laboratorio, al tener a
m ano y desglosadas por pxsos todas las operaciones a seguir para realizar el anlisis,
asegurando al m ism o tiem po que stas se realizan correctam ente.
Los esquem as: en color, son un fiel reflejo de los m edios de cultivo y de todas las
reacciones bioqum icas que en ellos se producen; de esta manera: ayudarn a las per
sonas que se inician en estos m todos; al reflejar las caractersticas del m edio y de las
colonias que crecen en l. As: se puede saber rpidamente si el medio que se ha de uti
lizar se necesita en fraseos, en lulns ( c u ii o sin cam pana) o en placas, conocer su color
original y observar los cam bios que sufre en el proceso. Respecto a las colonias, al e s
tar dibujadas con su color, textura y halo, se puede com probar si su crecim iento es el
correcto.
As. estos PN'T son unas guas de trabajo muy tiles a la hora de iniciar y seguir los
anlisis.
C A P TU LO PRIMERO
Procedimiento general de redaccin de mtodos

de anlisis de alimentos (PNT - AL - 001)
PRO CED IM IEN TO GENERAL DE REDACCION-
PNT - AL 001
DE MTODOS DE ANALISIS DE ALIMENTOS
I. O BJETO
FJ presente documento tiene como finalidad normalizar y homogcncizar la redaccin de los pro
ced menlos de anlisis de alimento*.
2. AMBITO DE APLICACION
Se aplica a todos los anlisis realizados segn loes PNT AL.
y REFERENCIAS
ISO 72IS <1W6): Microbiologa de Alimentos. Realas generales para los exmenes mi-
crobiolgkos.
Normas ISO. EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL
Manual de Calidad del Laboratorio de Microbiologa.
Procedimiento General de Redaccin de Documentos.
Guas ENAC y ISO 17025.
4. M ETODOLOGA
1. Recopilar la documentacin existente (normas internacionales ISO. EN. AFNOR.

CNAN. d e.. PNT del propio laboratorio, artculos en res islas especializadas...) y la do
cumentacin en proyecto sobre el procedimiento que queremos redactar.
2. Estudiar el modo operativo del laboratorio pura el cual se realiza el documento.
3. Adaptar el Procedimiento General de Redaccin de Documentad a este documento.
5. PROCEDIM IENTO
Los PNT realizados segn el presente documento son instrucciones de trabajo para facilitar y agi
lizar el anlisis en el laboratorio, de manera que presentan una fomvi esquematizada de realizar
los ensayos. Por consiguiente, en caso de necesitar m is detalles, se deber acudir a la docu
mentacin original (norma en la que se basan).
E s to s procedimientos de mtodos de anlisis de alimentos estn formados por dos parles bien
diferenciadas:
Instrucciones de trabajo
Esquema del proceso.
Estos procedimientos constan de los siguientes aportados:
0. Cartula.
1. Definicin.
2. Medios de cultivo.
4 M TOOOS 0 ANALISIS MKTKOBlOLGlCOS 0 ALIMENTOS
y. Reactivos.
4. Siembra.
5- Recuento (en caso que ve realice).
6. Confirmacin ten caso que ve realice).
7. Expresin tic resultado*.
X. Esquem a.
5.1. Cartula
U cartula debe encabezar cada uiu de las p ilm as del PNT y ha de incluir los siguientes apar
tados:
Ttulo del PNT.

Tipo y nmero del PNT.
Norma en la que ve bcusa.
Nmero de pagina.
5.1.1. Ttulo Jet PNT
En este apartado deber constar:
Tipo de anlisis que se realiza: recuento o investigacin, especificando si se utiliza alguna

tcnica en particular ( sin/con rcvivificacin/pcc--enriquecimiento, por recuento de colonias,
por nmero m is probable...).
El microorganismo o grupo de microorganismos que se estudia.
NOTA I: l.n* nombre* cientfico* de microorganismos, en latn, deben esc ribirse en cursi
v a con letras minsculas y la inicial en mayscula (por ejemplo Siilmonetfo), mientras que
los nombre* de U* familias, tambin en latn, se escribirn del mismo modo pero sin cursiva
(por ejemplo Enterobactcriaccac).
Para homogcncizar los distintos ttulos que aparecen en la documentacin (mtodo de refe
rencia. mtodo de rutina, directiva general...) se ha optado por nombrar como MTODO HO
RIZONTAL. que es la denominacin que se aplica como titulo en las nuevas normas interna
cionales. Con esta denominacin indicamos que los mtodo* se aplican a todo tipo de producto*,
salvo raras excepciones; estos caso* particulares estarn indicados en los PNT sobre preparacin
de la porcin analtica y diluciones decimales y son especfico* de cada laboratorio.
De esta manera lo* mtodos de referencia y de rutina se distinguen segn la norma en la cual
estn basados (los mtodos de referencia v: basan en normas ISO/EN y los de rutina en normas
Al-NOR)
Asimismo, tambin se Ka unificado el nombre del tipo de anlisis, sustituyendo ENUME-
RACIN por RECUENTO.
5.1.2. Tipo y nmero Jet PNT
En el caso que nos ocupa, el nmero del documento vendr precedido por las siglas PNT * AL,
en referencia a *u condicin de procedimiento normalizado de anlisis de alimento*, seguida* de
un nmero de tres cifras (por ejemplo, PNT * AL -011).
En determinados anlisis por ejemplo, cuando *c realiza un recuento del mismo microor
ganismo por dos tcnicas distinta*, el PNT se divide en do* parte*. Este hecho se indicar en la
f* O C O iU l N TO C E N * A l OE *COACCON 0 M ETODOS D ANLISIS DE ALIM ENTOS S
numeracin. de manera que junto al nmero de irc* cifran seguir un puni .* y el nmero I *
o 2. segn corresponda (por ejemplo. PNT * AL *017.1).
NOTA 2: liste desdoblamiento se suele manifestar tambin en la norma original.
5.1.3. Norma en la <tre re hasa
Dado que estos PNT $on una adaptacin de las normo* correspondiente*, segn el mtodo de tra
bajo del laboratorio y. por tanto, se Kan hecho ciertos cambios en ellas, no se puede decir que se
han resumido sino que. basndose en ellas. pura asegurar que los ensayos se realizan correcta
mente. se ha esquematizado el proceso en funcin de su uso en el lugar de trabajo, listos cam
bios. en ningn caso son sustanciales.
As pues, en la cartula debe figurar BASADO EN la norma ISO/EN (pura mtodos de re
ferencia) o AFNOR (para mtodos de rutina) correspondiente al ensayo, indicando su nmero y
la fecha de edicin (mes y ao).
5.2. Definicin
Fn este apartado incluiremos todas aquellas definiciones de trminos, acciones, etc . que apare
cen en el procedimiento cuya descripcin puede ser importante a la hora de realizar el anlisis y
adaptarlo a la peticin del cliente. Asi. encontraremos en todos los casos la definicin del mi
croorganismo ensayado y. opcionalmcntc. otras explicaciones de aspectos del anlisis que pue
dan ser de utilidad.
El trmino o trminos definidos se subrayarn, empezando la definicin con letra mayscula.
En la definicin se ha hecho una unificacin de las definiciones, de manera que. en todos los
casos, se termina con la frase -cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo, inde
pendientemente de que el documento est basado en una norma ISO/EN o en una AFNOR.
A continuacin se exponen dos definiciones cuya explicacin, para simplificar, se ha ex
cluido de los PNT (puc* se repiten de manera idntica en todas la* normas), pero que son de gran
importancia a la hora de realizar los ensayos.
Recuento Je mtcroorânhmo% : Nmero de microorganismos 1encontrado por gramo o

mililitro de muestra cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
Investigacin de mknfor$am.\m*M *: Determinacin de la presencia o ausencia de estos mi
croorganismos *en una cantidad determinada de muestra cuando el ensayo se realiza segn
el siguiente mtodo.
5JI. M edios d e cultivo
En esta seccin se da la relacin de lodos tos medios de cultivo que se utilizan en el ensayo, dis
puestos segn su orden de utilizacin, y acompasados, si se da el coso, de las siglas o abrevia
turas con las que se los conoce habitualmcntc. entre parntesis.
Dado que muchos de estos medios se denominan de distinta manera, segn la cav comercial
que los suministra, los nombres que se les ha dado son aqullos con los que se les conoce en el
laboratorio en el cual se han redactado estos PNT.
Par. cada uno de estos medios de cultivo se ha realizado un PNT. en el cual se indica, entre
otras cocas, su composicin, preparacin, conservacin y controles (ver PNT - ME correspon
diente).
1 Remplazar por el nombre del ittocroorgintsmo em ayado.

MTODOS 0 ANALISIS MC*O8K>t0G>CO$ 0 A U M EN TO S
5.4. K cuclitot
Este apartado estar formulo por una lista tic lo* reactivo* necesario* parj realizar el anlisis.
Como en alguno* mtodos no son necesario*. esta seccin puede no aparecer en el PNT.
Entendemos por reactivos:
Suplemento* de medio* de cultivo.

Sustrato* bioqumico* pora investigacin de reaccione* en/imitca*.
Sustancia* pura poner en evidencia reaccione* bioqumica*.
Etctera.
La denominacin de esta* sustancias c* la que se le* da en el laboratorio, aunque en alguno*

caso* se acompaa del nombre qumico del componente principal.
NOTA 3: Los suplementos que se aaden a los medio* de cultivo slo se incluyen a la lista
de reactivo* cuando se incorporan al medio Klsc en el momento de realizar el anlisis.
Para cada uno de esto* reactivo* *c ha realizado un PNT. en el cual *e indica, entre otra* co
sa*. *u composicin, preparacin, conservacin y controles (ver PNT * RE correspondiente).
La* cantidades a aadir. a* como su presentacin, corresponden a la marca utilizada en el la
boratorio en el cual se han realizado los PNT. de manera que pueden variar en funcin del pro
veedor; en este caso se deber cumplir con sus instrucciones.
5.5. Siem bra
En este apartado *c explican, paso por paso, cada una de la* accione* a realizar en el ensayo, des
de la siembra hasta la incubacin, indicando:
M e d i o s de cultivo ncccvirio*. sealando si se encuentran en tubos o en placas; en este caso

se indicar si la siembra c* en superficie o por inclusin y si se realiza doble capa. Tamb*n
constar en este aportado *i lo* medio* han de tener caracterstica* particulares (tempera
tura. estar regenerado...>.
Temperatura y tiempo de incubacin. En general, la incubacin se realizar en estufas re
g u l a d a s a la temperatura indicada; en caso contrario, por ejemplo, cuando se realiza en
bao tcrmosttico. deber constar en el apunado.
En aquellos anlisis en lo* que el periodo de incubacin no tiene una duracin defini
da. pues depende de la velocidad de crecimiento de las colonias, se ha indicado el tiempo
mnimo de incubacin y. en caso que no se observe crecimiento, se da. entre parntesis, el
periodo mximo durante el cual se examinar si hay o no desarrollo de colonia*, con la fra
se a h si es necesario.
En el caso de reaccione* bioqumicas, *c indica de c*u manera el tiempo mximo de
tncuhocin para asegurar la ncgatividad.
Por ejemplo, si se indica que la incubacin debe ser a 30 *C I C durante 24 h ( 4$
si es necesario), significa que si despus de 24 h de incubacin no se observa un creci
miento caracterstico del microorganismo en vivado, se debern mantener las placas en la
estufa hasta el tiempo mximo indicado.
En lo* procedimiento*donde hay etapas muy diferenciadas, se ha dividido el *k\t\ja o en las

distinta* fa*cs: Prc-cnriquccimicnto. Enriquecimiento. Aislamiento. Seleccin (puede que no se
den toda*).
En lo* caso* en que se realice aislamiento y seleccin de colonia* para realizar la posterior
confirmacin. *e debern describir las caractersticas (color, tamao, si forman o no halo le lis**
P A O C E D iM lE N T O G E N E R A l DE K C O A C C lO N 0 M E T O D O S D A N U S IS DE A U M E N T O S 7
o de precipitado y. de ser asi. de qu color >de la* colonia* tpicas del microorganismo ensayado
en el medio correspondiente (denominadas en codo* lo* caso* como -COLONIAS CARAO-
TURISTICAS).
NOTA 4 En general, la dilucidn madre se prepara con 10 mililitros (si el producto es l

quido) 10 gramos (para el resto de productos) de muestra en 90 mL de pcplona salina <PS)
a T ambiente.
5.6. Recuento
En esta seccin se darn la* caracterstica* de los tubo* positivo* (ensayo en medio lquido) o de
la* colonia* que se Kan de contar de cada placa (ensato en medio slido) y. *i se da el caso, lo* re
quisito* de los tubos/placa* que se han de retener para realizar sobre *u* colonia* la* prueba* de
confirmacin bioqumica. En este caso, el aportado de RECUENTO puede aparecer despus del de
CONFIRMACIN BIOQUMICA incluido en el aportado ILXPRLSIN Dli RLSULTADOS.
5.7. Confirm acin
En caso de que el mtodo requiera la realizacin de pruebas bioqumicas y scrolgica* para con
firmar la* colonias, se espinar cada una de ella* en este apaado, indicando sobre qu colonia*
o tubos se realiza, los medios y reactivos necesarios, la temperatura y el tiempo. sciVatando tam
bin el resultado que debe considerarse como positivo.
NOTA 5: En este aportado no se explica el modo operatorio de la* prueba* de la oxtdavi y

la calalasa. ni la realizacin de la* tinciones Grain. ya que estas operaciones, al ser de uso ha
bitual en el laboratorio, han de ser conocida* por todo el personal.
Debido a su extensin c importancia sobre el resultado del anlisis, en algunos casos se ha

aadido como apartados independiente* la LECTURA * INTERPRETACION de las pruebas
bioqumicas y seto lgicas.
5.X. Expresin de resultado*
Este apartado c* un extracto del PNT - AL - (X>2 (Procedimiento de Expresin de Resillado*l para
cada mtodo de anlisis, de manera que se indica nicamente la manera de calcular el resultado
para el caso general y se remite al PNT - AL - 002 para el resto de caso*, as como para La con
sulta del significado de los smbolos que aparecen en las frmulas, y siempre en caso de duda.
As. en el t ato Je recuento en medio .ftrdo. se indicar qu placas se han de retener para cal
cular el resultado (en funcin del nmero de colonias, sealando si se trata de colonias en total,
colonias caractersticas o colonia* identificada*) > mediante qu e x p r e s i n se obtendr el nmero
de colonia*.
En el cato Je in m u ta c i n , se indicarn la* caracterstica* accesoria* pura considerar que en
la muestra hay presencia o no del microorganismo estudiado.
Para el CM> de ret uerto en medio flu id o , se indicar a purtir de qu tubos se ha de calcular
el NMP.
5.9. Esquem a
El esquema c* un resumen visual de todo el proceso, indicando con dibujo* el orden a seguir pora
realizar cada uno de lo* pasos del ensayo; este apartado estar en la hoja final del documento.
* M E T O D O S 06 A N A L IS IS M ftO B K > L G )C O S 0 A L IM E N T O S
En una columna situada a la izquierda de la h o j indicaremos el da de anlisis en el que no*

encontrando*, de manera que en el re*to de la hoja se muestren la* operaciones que *e deben
realizar durante el mismo. Ia% accione* a realizar en da* distinto* estn s e p a r a d a s por una barra
con una flecha.
Sealar que en lo* procedimiento* en lo* que en el texto se han diferenciado la* distinta* eta
pa* del anlisis, tambin se ha indicado cada paso en el esquema.
El esquema empieza con la preparacin de la dilucin madre y el banco de diluciones
{cuando c* necesario). Es importante destacar que c! nmero de diluciones que se ha dibujado c*
oriental iva. de n*ancra que se prepararn tantas diluciones como sea necesario, independiente
mente de la cantidad de tubos que se hayan dibujado.
La muestra lquida, s el ensayo se realiza con un producto lquido, o la dilucin madre. si se
realiza con otro* producto*, estn representada* por una bolsa de Slomacbcr-, s d resto de d i
luciones por un tubo con 9 raL de peptona salina (FS) (sah o en casos particulares, en los
cuales se indicar el medio utilizado para hacer la* diluciones). Debajo de cada elemento del
banco de diluciones *c indicar el orden de dilucin correspondiente, sin parntesis para ensayos
con producto* lquido* y entre parntesis cuando realiza dilucin madre. Este orden de dilu
cin *c escribir en todo* lo* paso* de la siembra.
A continuacin, mediante una* flecha* que salen de cada dilucin, se indica la cantidad de
muestra que se ha de sembrar en la placa o tubo. Cuando se siembran placa*, cuando se realiza
siembra superficial, el nombre del medio a sembrar estar encima de ella* mientras que *c co
locar debajo *i la siembra es por inclusin, indicando en este caso la cantidad y temperatura del
medio a aadir.
Cuando se siembra en placa*, en caso de que se deba extender el inoculo con asa de Dti-
galski. en el esquema aparecer dibujada el asa. mientras que si la siembra es por aislamiento, en
la* placas se pintarn estra* (este aislamiento por estra* puede realizarse de distinta* maneras).
Si Ka *icmbra es por picadura en un tubo con medio slido, se dibu jir una lnea vertical que ocu
pe el medio, desde la parte superior.
Asimismo, cuando se siembra en medio lquido con un asa de Kollc. *c dibujar este utensilio
junto a los tubo*.
Debajo de las placa* o tubo* *c indicar el tiempo y la temperatura de incubacin, sealando
tambin si hay caractcrstis'a* particulares que deban ser tcnidasen cuenta.
En los pasos de recuento y confirmacin se seguir el mi*n>o procedimiento, dibujando en las
placa* el crecimiento de Us colonia*.
El esquema finaliza con la frase lectura > expresin de resultados, si no se ha realizado
confirmacin: o bien, si se han efectuado pruebas bioqumicas y/o scroljjica*. se darn lo* rc-
sultadosdcl caso favorable. En los recuento* en medio lquido *c remitir al clculo del NMI*
C A P TU LO SEGUNDO
Procedimiento de expresin de resultados

(PNT - AL - 002)
PNT - AL - 001 PR O C E D IM IE N T O DE EX PR ESIO N DE RESU LTA D O S
1. O B JE T O
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la expresin de resul

tados de los anlisis de alimentos.
2. M B ITO DE A PL IC A C I N
Se aplica a todos los anlisis realizados segn los PNT - AL.
3. R E FE R E N C IA S
ISO 7218 (1996): Microbiologa de Alimentos. Reglas generales para los exmenes mi-
crobiolgicos.
AFNOR XP V 08-102 (1997): Microbiologa de Alimentos. Reglas generales para el re
cuento de colonias y expresin de resultados. Caso de recuento en medio slido.
Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.
Documentos del Laboratorio de Microbiologa: Manual de Calidad y Procedimiento Ge
neral de Redaccin de Documentos.
4. G EN ER A LID A D ES
El presente documento est formado por una serie de tablas que muestran la manera de reali
zar la expresin de resultados para cada mtodo horizontal de recuento o investigacin segn
la norma ISO, EN o AFNOR correspondiente. Estas tablas estn ordenadas segn su orden de
PNT - AL, y estn divididas segn los tres casos posibles:
Caso general.
Estimacin de pequeos nmeros.
Ninguna colonia.
Para completar este procedimiento, en el ANEJO 1 se adjuntan las tablas necesarias para el
clculo de los resultados y en el ANEJO 2 se incluyen ejemplos de clculo para cada uno de los
casos posibles, junto con un diagrama para facilitar su localizacin.
5. FO RM ULA S
En general, para obtener el resultado de los recuentos de microorganismos en medio slido, se

utiliza la media ponderada. En los mtodos de referencia, sta se obtiene con la expresin:
N= C
(! +0,1 -n2) d
Para los mtodos de rutina, la expresin utilizada es:
1,1 - d
11
12 M TO D O S DE A N LIS IS M IC R O B IO L G IC O S DE A U M E N T O S
L o s resultados obtenidos m ediante las frm ulas $e han de redondear a dos cifras significati
vas, utilizando las reglas habituales, tal com o se describe en el A partado 6 y retener com o re
sultado el nm ero de m icroorganism os por m ililitro (e n p roductos lquidos) o p o r gram o (en el
resto de productos), expresado com o un nm ero com prendido entre 1,0 y 9,9 m ultiplicado p o r la
p o ten cia de 10 adecuada.
Dado que en algunos casos los mismos conceptos se expresaban con letras distintas segn la
norma de la que estaban extrados, se ha hecho una recopilacin y homogeneizacin de trminos,
para que cada smbolo tenga el m ism o significado en todas las frmulas.
5.1. C aso general
Para que un resultado se considere vlido, se estim a que en general es necesario contar las co
lonias de al menos una placa que contenga un m nim o de 15 colonias.
En las frmulas que se utilizan en el caso general, aparecen unos smbolos cuyos significados
se explican a continuacin:
N: nm ero de m icroorganism os p o r m ililitro o p o r gram o.

XC: suma de las colonias contadas en todas las placas retenidas de dos diluciones sucesivas
y con al menos una placa con un m nimo de 15 colonias.
ILa: suma de las colonias del microorganism o 1 calculadas despus de la identificacin, en
todas las placas retenidas de dos diluciones sucesivas y con al menos una placa con un m
nimo de 15 colonias.
V: volumen de inoculo aplicado a cada placa, en mililitros.
n: nm ero de placas retenidas en la p rim era dilucin.
n2\ nmero de placas retenidas en la segunda dilucin.
d: nivel de dilucin correspondiente a la prim era dilucin retenida (d = 1 cuando la m ues
tra para anlisis se ha sembrado directam ente (productos lquidos)).
Para el caso de recuento despus de identificacin:
b : nm ero de colonias que responden a los criterios de identificacin.

C: nmero total de colonias por placa (antes de identificacin).
A: nmero de colonias caractersticas que se resiembran (en general A = 5 en mtodo de re
ferencia y A = 3 en mtodo de rutina).
Para estafilococos coagulosa positivos (CPS):
A c: nmero de colonias caractersticas resembradas.

A nc: nmero de colonias no caractersticas resembradas.
bc: nmero de colonias caractersticas que son coagulasa positivas.
bcn: nmero de colonias no caractersticas que son coagulasa positivas.
cf: nmero total de colonias caractersticas de estafilococos coagulasa positivos contados en
la placa.
cnc: nm ero total de colonias no caractersticas de estafilococos coagulasa positivos co n
tados en la placa.
1 R em plazar p o r el nom bre d el m icroorganism o ensayado.

P R O C E D IM IE N TO DE EXPRESIN DE R E S U L TA D O S (P N T - A L - 002) 13
5.2. E stim acin de pequeos nm eros
E n las frm ulas que se u tilizan en el caso de estim acin de pequeos nm eros, aparecen unos
sm bolos, cuyos sig n ificad o s se explican a continuacin:
N e: nm ero estim ad o de m icroorganism os p o r m ililitro o p o r gram o.

C : nm ero de co lo n ias contadas.
sum a de las colonias contadas despus de la identificacin en las dos placas (m todo de
referencia).
a: nm ero de co lo n ias contadas despus d e la identificacin.
V : volum en d e inoculo aplicado a cada placa, en m ililitros.
d : nivel de d ilu ci n correspondiente a la dilucin m adre o a la prim era dilucin sem brada
o retenida (d = 1 cuando la m uestra para anlisis se ha sem brado directam ente (productos
lquidos)).
5.3. C asos p a rtic u la re s
En las frm ulas que se utilizan en el caso de estim acin de pequeos nm eros, aparecen un sm
bolo, cuyo sig n ificad o se explica a continuacin.
d: nivel de d ilu ci n correspondiente a la dilucin retenida.
6. REDONDEO
Si la ltim a cifra es inferior a 5, la cifra precedente no se m odifica.

Si la ltim a cifra es superior o igual a 5, la cifra precedente ser aum entada una unidad.
P roceder de esta fo rm a secuencialm ente con todas las cifras del nm ero obtenido h asta que
se obtengan dos cifras significativas.
7. P R E C IS IO N Y L M IT E S D E C O N FIA N Z A
La precisin d e los m todos de ensayo corresponde, segn la ISO 17025, a la determ inacin de
la rep etibilidad y d e la reproducib ilidad de un m todo de ensayo norm alizado por ensayos in-
lerlaboratorios.
En la expresin de resultados hay un apartado de PREC ISI N , que slo se refleja en aquellos
procedim ientos basados en norm as que incluyen esta valoracin; sin em bargo, se supone que en
futuras m odificaciones de las norm as internacionales este apartado aparecer en todas ellas, ya que
la fiabilidad del m todo es m uy im portante a la hora de aceptar o rechazar el lote, producto, etc.
D e la m ism a m anera, en futuras m odificaciones de estas norm as se cam biarn los lm ites su
periores e inferiores para los recuentos de colonias, adaptndose a los lm ites de confianza; as,
el lm ite su p erio r p asa r d e 300 a 324, y el lm ite inferior de 15 a 10.
P ara estim ar la valid ez del resultado obtenido y evitar interpretaciones dem asiado estrictas,
es necesario determ inar el intervalo de confianza que caracterice el reparto estadstico de los m i
croorganism os en la m uestra.
A s, el lm ite de confianza 5 que caracteriza la dispersin m icrobiana en la m uestra, con una
probabilidad del 95% , se calcula m ediante la expresin siguiente;
SC 1,92 + 1,96V SC _1_

B B ~ B d
14 MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE A U M E N TO S
con:
= V-C/1, + 0,1 712)
siendo:
YJC: suma de las colonias contadas en todas las placas retenidas.

71j: nmero de placas retenidas en la primera dilucin.
n2: nmero de placas retenidas en la segunda dilucin.
V: volumen de inoculo sembrado en cada placa, en mililitros.
d: nivel de dilucin correspondiente a la primera dilucin retenida.
N O T A : En el caso de recuento despus de identificacin, sustituir 2 C por Ea.
C A S O P R C T IC O : El resultado del anlisis de un alimento es el siguiente:
Dilucin
o -1 io-2 io-3 10"4
>3 0 0 2
Nm ero de colonias > 300 3
Placas retenidas
Con N = 1,9 104 por gramo, para 422 colonias contadas en las placas retenidas. El interva
lo de confianza S es:
- _ [4 2 2 [ 1,92 + 1.96V4221 1
12,2 + 2,2 ~ 2,2 J lO-
8=(191,82 + 0,87 18,30) 102
As, los lmites de confianza son:
, = 1,7 1o4 y 4 = 2 ,1-104
Para las tcnicas de N M P y de estimacin de pequeos nmeros, estos lmites de confianza,

en la prctica, se suelen obtener mediante las tablas que se adjuntan en el A N E X O 1.
Sealar que las variaciones que se dan an pueden ser ms importantes en la prctica, en par
ticular entre los resultados obtenidos por distintos microbilogos.
8. C O M E N T A R IO S
En este apartado queremos recalcar algunos aspectos de la norma A F N O R X P V 08-102 que son
nuevos respecto a las normas publicadas anteriormente y que pueden ser tiles a la hora de re
solver dudas.
PROCEDIMIENTO DE EXPRESIN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002) 15
8.1. Casos particulares
Los casos particulares, aunque son bastante improbables, se pueden presentar (por ejemplo, n
meros muy diferentes de colonias entre las dos placas de una misma dilucin, o bien una pro
porcin muy alejada de la del factor de dilucin entre las placas de dos diluciones sucesivas). En
estos casos, un microbilogo competente deber examinar, interpretar y, si es necesario, recha
zar los resultados obtenidos.
8.1.1. Recuento de colonias en total. Mtodo de rutina
En el caso que nicamente la placa de la ltima dilucin sembrada tenga menos de 300 colonias
(o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica), calcular el nmero N ' de microorga
nismos 2presentes en la muestra de ensayo con ayuda de la ecuacin:
N'=
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siendo:
C: suma de las colonias contadas en la placa con un mnimo de 15 colonias.

V: volumen de inculo sembrado en cada placa, en mililitros.
d: nivel de dilucin correspondiente a la dilucin retenida.
8.2. Aplicacin de los lmites de confianza
En el caso que el nmero total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro nmero indicado
en la norma especfica) en las dos placas de una primera dilucin di9 con un nmero de colonias
menos que 15 en las dos placas de la dilucin d2siguiente:
si el nmero total de colonias en cada una de las placas de la dilucin dl est comprendido
entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a
300), utilizar el modo de clculo del caso general;
si el nmero total de colonias en cada una de las placas de la dilucin dx es superior a 324
(lmite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener
slo el resultado de los recuentos de la dilucin <2 y realizar una estimacin de pequeos
nmeros, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un nmero mximo fija
do en 300 colonias, si el ltimo resultado es menos que 10 (lmite inferior del intervalo de
confianza de una media ponderada igual a 15).
2 Remplazar por el nombre del microorganismo ensayado.

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42 MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIMENTOS
TABLA 1: Lmites de confianza para las estimaciones de pequeos

nmeros de colonias
En esta tabla se dan los lmites de confianza al nivel del 95% para la estimacin de pequeos
nmeros, cuando el nmero de colonias retenidas' sobre las placas es menor que 15 micro
organismos*.
Nitiero de Lmites de confianza al nivel 95%

microorgnismos * Inferior Superior
1 <1 2
2 <1 4
3 <1 5
4 1 6
5 2 9
6 2 10
7 2 12
8 3 13
9 4 14
10 4 16
11 5 18
12 6 19
13 7 20
14 7 21
15 8 23
* Reemplazar por el nombre del microorganismo ensayado.

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIN DE RESULTADOS (PNT - A L - 002) 43
T A B L A 2: Tabla de N M P para 3 x 1 g. (m L), 3 x 0,1 g. (m L ) y 3 x 0,01 g. (m L)
Nmero de Categora cuando el

Coef. nmero de ensayos es: Lmites de confianza
resultados
positivos NM P
1 2 3 5 10 >95% >95% >99% >99%
0 0 0 <0,30 0,00 0,94 0,00 1,40
0 0 0 0,30 3 2 2 2 1 0,01 0,95 0,00 1,40
0 1 0 0,30 2 1 1 1 1 0,01 1,00 0,00 1,60
0 1 1 0,61 0 3 3 3 3 0,12 1,70 0,05 2,50
0 2 0 0,62 3 2 2 2 1 0,12 1,70 0,05 2,50
0 3 0 0,94 0 0 0 0 3 0,35 3,50 0,18 4,60
1 0 0 0,36 1 1 1 1 1 0,02 1,70 0,01 2,50
1 0 1 0,72 2 2 1 1 1 0,12 1,70 0,05 2,50
1 0 2 1,1 0 0 0 3 3 0,4 3,5 0,2 4,6
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1 1 1 1,1 3 3 2 2 2 0,4 3,5 0,2 4,6
1 2 0 1,1 2 2 1 1 1 0,4 3,5 0,2 4,6
1 2 1 1,5 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,2
3 0 1,6 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,2
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2 0 2 2,0 0 3 3 3 3 0,5 3,8 0,2 5,2
2 1 0 1,5 1 1 1 1 1 0,4 3,8 0,2 5,2
2 1 1 2,0 2 2 1 1 1 0,5 3,8 0,2 5,2
2 1 2 2,7 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2
2 2 0 2,1 1 1 1 1 1 0,5 4,0 0,2 5,6
2 2 2 3,5 0 0 0 0 3 0,9 9,4 0,5 14,2
2 2 1 2,8 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,2
2 3 0 2,9 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,2
2 3 1 3,6 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2
3 0 0 2,3 1 1 1 1 1 0,5 9,4 0,3 14,2
3 0 1 3,8 1 1 1 1 0 0,9 10,4 0,5 15,7
3 0 2 6,4 3 3 2 2 2 1,6 18,1 1,0 25,0
3 1 0 4,3 1 1 1 1 1 0,9 18,1 0,5 25,0
3 1 1 7,5 1 1 1 1 1 1,7 19,9 1,1 27,0
3 1 2 12 3 2 2 2 1 3 36 2 44
3 1 3 16 0 0 0 3 3 3 38 2 52
3' 2 0 9,3 1 1 1 1 1 1,8 36,0 1,2 43,0
3 2 1 15 1 1 1 1 1 3 38 2 52
3 2 2 21 2 1 1 1 1 3 40 2 56
3 2 3 29 3 3 3 2 2 9 99 5 152
3 3 0 24 1 1 1 1 1 4 99 3 152
3 3 1 46 1 1 1 1 1 9 198 5 283
3 3 2 110 1 1 1 1 1 20 400 10 570
3 3 3 >110
Los lmites de confianza de esta tabla tienen como finalidad dar algunas nociones sobre la influencia de
las variaciones estadsticas en los resultados. Existirn siempre otras fuentes de variaciones que, en al
gunos casos, pueden ser importantes.
T A B LA 3: Tabla de N M P para 3 x 0,1 g. (m L), 3 x 0,01 g. (m L) y 3 x 0,001 g. (m L)
Nmero de resultados positivos Coeficiente Lmites de confianza del 95%

NMP/g*
0,1 g 0,01 g 0,001 g Inferior Superior
0 0 0 <3
0 1 0 3+ <1 17
1 0 0 4 <1 21
1 0 1 7+ 2 27
1 1 0 7 2 28
1 2 0 11+ 4 35
2 0 0 9 2 38
2 0 1 14+ 5 48
2 1 0 15 5 50
2 1 1 20+ 7 60
2 2 0 21 8 62
3 0 0 23 9 130
3 0 1 39 10 180
3 1 0 43 10 210
3 1 1 75 20 280
3 2 0 93 30 380
3 2 1 150 50 500
3 2 2 210+ 80 640
3 3 0 240 90 1.400
3 3 1 460 100 2.400
3 3 2 1.100 300 4.800
3 3 3 >1.100 .
Los resultados normales, obtenidos en el 95% de los ensayos, no estn seguidos por un ms. Re
sultados + improbables, obtenidos en un 4% de los casos, si que estn seguidos por un + .
Las combinaciones de tubos positivos que no se muestran en la tabla, aparecen en menos del
1% de los ensayos; si se observan a menudo, significa que la tcnica empleada es defectuosa
o que las suposiciones en las que se basa el NM P estimado no se han cumplido. Para estas
combinaciones que no se reflejan en la tabla se puede extrapolar un NM P a partir de la si
guiente combinacin ms elevada que aparece en la tabla (por ejemplo, un caso 2 0 2 tendra
un resultado aproximado de 20, que es el NM P correspondiente al caso 2 11.
* Todos los resultados de NMP/g se pueden expresar como NMP/100 g multiplicando por 100.
P R O C E D IM IE N TO DE EXPRESIN DE R E S U L T A D O S (P N T - A L - 002) 45
T A B LA 4: Explicacin de las categoras de los resultados
Antes de empezar los ensayos se ha de decidir qu categora ser aceptada, es decir:

slo la 1, la 1 y la 2 o bien la 1, la 2 y la 3.
Verificar, segn el nmero de muestras examinadas por lote en la tabla de N M P adecuada, si
las series de nmero de tubos positivos correspondientes a las diluciones seleccionadas son
aceptables desde el punto de vista estadstico. Esta aceptabilidad depende del nmero de
muestras examinadas y de la decisin de aceptar o de rechazar las categoras 2 y 3.
A s, por ejemplo, cuando se aceptan los resultados de la categora 1 de la tabla, la secuencia
2 2 1 slo se puede admitir cuando se analizan 10 muestras por lote. A l contrario, cuando los
resultados menos probables de la categora 2 se aceptan igualmente, la secuencia 2 2 1 ser
admitida en el caso de haber examinado 2, 3 5 muestras. En ningn caso esta secuencia
2 2 1 es vlida para una muestra nica.
Para cada secuencia considerada aceptable segn lo descrito, determinar el coeficiente N M P
mediante la correspondiente tabla 3.
Si la decisin es muy importante para ser tomada basndose en los resultados, se habrn de
aceptar nicamente los resultados de la categora 1 o, com o mucho, de las categoras 1 y 2.
Los resultados de la categora 0 se habrn de considerar con mucha prudencia.
C a tego ra D efin icin
1 Cuando el nmero de microorganismos en el producto es igual al N M P hallado,

el resultado es uno de los que tiene la posibilidad ms elevada de ser obtenido.
Existe com o mucho el 5% de posibilidades de obtener un resultado que es
menos probable que el menos probable de esta categora.

el resultado es uno de los que tiene menos posibilidades de ser obtenido, inclu
so el menos probable de la categora 1, pero existe com o mucho el 1% de po
sibilidades de obtener un resultado que es menos probable que el menos pro
bable de esta categora.

so menos posibilidades que el que menos posibilidades tiene de la categora 2,
pero existe com o mucho el 0,1 % de posibilidades de obtener un resultado que
es menos probable que el menos probable en esta categora.

so menos probable que el que menos posibilidades tiene de la categora 3. N o
existe ninguna posibilidad del 0,1% de obtener un resultado en esta categora sin
que sea falso.
Los lmites de confianza que se dan en las T A B L A S 2 y 3 estn destinados nicamente a su

gerir algunas nociones de la influencia de las variaciones estadsticas sobre los resultados.
Siempre habr otras fuentes de variaciones que puedan ser por s mismas, alguna vez, ms im
portantes.
46 M TO D O S DE A N LIS IS M ICROBIOLG ICOS DE A L IM E N T O S
ISSI S I
co

z
o
0 i
co
O
o

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O
o pq
Q
co
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C
pq -4 w
Q
O 1pq l 'g
fe Z y M
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2 .
H W
co co P
< pq c y
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o
u
o
P R O C E D IM IE N TO DE EXPRESIN DE R E S U L T A D O S (P N T - A L - 002) 47
M T O D O D E R E F E R E N C IA
EJEM PLO 1: Caso general

Un recuento de microorganismos da como resultado:
Primera dilucin retenida: Segunda dilucin retenida:

io-2 io-3
168 14
Nmero de colonias
215 25
Entonces:
XC = 168 + 215 -f 14 4- 25 = 422

V ( / i , + 0 , l n 2) d 1[2 = (0,1 + 2 )] * 102 0,022
Despus de redondear el nmero obtenido, consideramos que el resultado es 19.000

(o 1,9 x 104) microorganismos por mililitro o por gramo de producto.
EJEM PLO 2: Estimacin de pequeos nmeros
Si las dos placas, al nivel de la muestra de ensayo (para productos lquidos), de la dilucin
madre (para el resto de productos) o de la primera dilucin sembrada o retenida, contienen me
nos de 15 colonias (en total, caractersticas o identificadas).
Un recuento da como resultado:
Primera dilucin retenida:

io-2
12
Nmero de colonias
13
Entonces:
^ _ X C _ .J 2 .._ 2 5 _
* V n d 1 2 10 0,02
Despus de redondear el resultado obtenido, consideramos que el nmero estimado de mi

croorganismos por m ililitro o por gramo de producto es 1.300 (o 1,3 x 103).
EJEM PLO 3: Casos particulares
En el caso de que el nmero total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro nmero in
dicado en la norma especfica) en las dos placas de una primera dilucin dl9 con un nmero de
48 M TO D O S DE ANLISIS M ICROBIOLGICOS DE A LIM E N TO S
colonias menos que 15 en las dos placas de la dilucin d2 siguiente, si el nmero total de colonias
en cada una de las placas de la dilucin d1est comprendido entre 324 y 300 (parte superior del
intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300).
Prim era dilucin retenida: Segunda dilucin retenida:

io -2 10"3
310 8
Nmero de colonias
322 12
Utilizar el modo de clculo del caso general a partir de las placas de las dos diluciones rete
nidas.
E J E M P L O 4: Casos particulares
En el caso de que el nmero total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro nmero
indicado en la norma especfica), en las dos placas de una primera dilucin dx, con un nmero
de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilucin d2 siguiente, si el nmero total de co
lonias en cada una de las placas de la dilucin dx es superior a 324 (lmite superior del interva
lo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener slo el resultado de los recuentos
de la dilucin d2 y realizar una estimacin de pequeos nmeros, excepto en el caso de recuento
de colonias en total con un nmero mximo fijado en 300 colonias, si el ltimo resultado es me
nos que 10 (lmite inferior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 15) (ver
Ejemplo 5).

io-2 io-3
380 12
Nmero de colonias
350 14
Proceder a una estimacin de pequeos nmeros a partir de las colonias contadas en las dos
placas de la dilucin 10-3.

io-2 io-3
380 8
Nmero de colonias
350 6
El resultado de este recuento no es aceptable.

En el caso de que nicamente las dos placas de la ultima dilucin sembrada tengan menos de
300 colonias (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica).
ltima dilucin retenida:

io -2
120
Nmero de colonias
130
Entonces:
ZC 120 + 130 250

N' = 1.250.000
V n d * 1*2* 10" 0,0002
Despus de redondear el nmero obtenido, consideramos que el resultado es 1.300.000

M T O D O D E R U T IN A
EJEMPLO 7: Caso general

io -2 o -3
Nmero de colonias 83 13
Entonces:
ZC 83 + 13 96
N = 8,727
V (n, + 0,l*n2) * l*[l + (0 , l l ) ] * 1 0 z 0,011

EJEMPLO 8: Estimacin de pequeos nmeros

io -2
Nmero de colonias 12
Entonces:
Despus de redondear el resultado obtenido, consideramos que el nmero estimado Nede mi

croorganismos por mililitro o por gramo de producto es 1.200 (o 1,2 x 103).
Caso en el que el nmero total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro nmero in
dicado en la norma especfica) en la placa de una primera dilucin du con un nmero de colonias
menor que 15 en la placa de la dilucin d2siguiente, si el nmero total de colonias en la placa de
la dilucin dxest comprendido entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una
media ponderada igual a 300).

io-2 10-3
nidas.
E JE M P LO 10: Casos particulares
Caso en el que el nmero total de colonias sea mayor que' 300 (o cualquier otro nmero in
dicado en la norma especfica) en la placa de una primera dilucin con un nmero de colonias
menor que 15 en la placa de la dilucin d2siguiente, si el nmero total de colonias en la placa de
la dilucin dxes superior a 324 (lmite superior del intervalo de confianza de una media ponde
rada igual a 300), retener slo el resultado del recuento de la dilucin dl y realizar una estimacin
de pequeos nmeros, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un nmero mxi
mo fijado en 300 colonias, si el ltimo resultado es menos que 10 (lmite inferior del intervalo de
confianza de una media ponderada igual a 15) (ver Ejemplo 11).-

io-2 10-3
placas de la dilucin 10~3.
PROCED IM IEN TO DE EXPRESIN DE R E S U LTA D O S (P N T - A L - 002) 51

io-2 o -3
El resultado de este recuento no es aceptable.
Caso en el que nicamente la placa de la ltima dilucin sembrada tenga menos de 300 co
lonias (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica).
ltim a dilucin retenida:

10"*
Entonces:
C 125
N' = = --------r = 1.250.000
V d 110^
Despus de redondear el nmero, obtenido, consideramos que el resultado es 1.300.000

M T O D O D E R E F E R E N C IA
E J E M P L O 13: Caso general

103 10"*
66 4
Nmero de colonias
80 7
PROCEDIMIENTO DE EXPRESIN DE RESULTADOS (P N T - AL - 002) 55
M E T O D O D E R U T IN A
EJEM PLO 20: Caso general

io-3 10
Han sido resembradas:
De las 66 colonias de la dilucin 10-3: 5 colonias, de las cuales 4 han respondido a los cri
terios de identificacin; as: a = 53.
Las 4 colonias de la dilucin 10"4, de las cuales 3 han respondido a los criterios de identi
ficacin; as: a = 3.
Entonces:
Ta 53 + 3 56
N= = 50.909
V ( n x + 0,l*/i2)*d 1* [2+ (0,1*1)] 10 0,011

EJEM PLO 21: Estimacin de pequeos nmeros
Prim era dilucin sembrada:

io-2
identificadas
Entonces:
Nt = - = = 1.200
* d 0,01
Despus de redondear el resultado obtenido, consideramos que el nmero estimado Ne de mi

Si, para una primera dilucin dx, el nmero total de colonias caractersticas y no caracters
ticas es mayor que 150 (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica) con colonias
identificadas y si, en la dilucin siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier otro nmero
indicado en la norma especfica), no se puede contar ninguna colonia identificada.

io-2 1<H
con colonias identificadas sin colonias identificadas
presentes presentes
El resultado es menos de 1.000 y ms de 100 microorganismos por mililitro o por gramo de

producto.

Si, en una primera dilucin dl9 el nmero total de colonias caractersticas y no caractersticas
es mayor que 150 (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica) sin colonias iden
tificadas y si, en la dilucin d2 siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier otro nmero in
dicado en la norma especfica), no se puede contar ninguna colonia identificada.

10"2 1(H
sin colonias identificadas sin colonias identificadas
presentes presentes
El resultado es menos de 1.000 microorganismos por mililitro o por gramo de producto.

En caso de que el nmero total de colonias caractersticas y no caractersticas sea mayor que
150 (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica) en la placa de una primera dilu
cin dl9 con un nmero de colonias identificadas menor que 15 en la placa de la dilucin ^si
guiente, si el nmero total de colonias en la placa de la dilucin dx est comprendido entre 167y
150 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150).

io-2 10-3
colonias identificadas
nidas.
EJEMPLO 25: Casos particulares
Caso en el que el nmero total de colonias caractersticas y no caractersticas sea mayor que
150 (o cualquier otro nmero indicadp en la norma especfica) en la placa de una primera dilu
cin con un nmero de colonias identificadas menor que 15 en la placa de la dilucin d2 si
guiente, si el nmero total de colonias en la placa de la dilucin dl es superior a 167 (lmite su
perior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150), retener slo el resultado
del recuento de la dilucin d2 y realizar una estimacin de pequeos nmeros.

o-2 IQr3
Proceder a una estimacin de pequeos nmeros a partir de las colonias contadas en la pla
ca de la dilucin 10-3.
Caso en el que nicamente la placa de la ltima dilucin sembrada tenga menos de 150 co
lonias (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica) caractersticas y no caracters
ticas.
Primera dilucin sembrada:

10"4
Nmero de colonias
125
identificadas
Entonces:
AT = - = 125 = 125 = 1.250.000

Vn-d 110-4 0,0001

58 M TO D O S DE ANLISIS M ICROBIOLGICOS DE A LIM E N TO S
E JE M P L O 27: Al m enos una dilucin tiene los tres tubos positivos
Escoger la dilucin ms elevada (aqulla con menor concentracin de muestra) que presen
te tres tubos positivos, as como las dos diluciones siguientes que tengan tubos positivos (es de
cir, aqullas donde las concentraciones de muestra sean iguales a 1/10 y 1/100 de la primera di
lucin escogida). Ver CASO 1 en la TABLA 5.
Si se ha preparado un nmero insuficiente de diluciones por encima de la dilucin ms ele
vada con tres tubos positivos, escoger en su lugar las tres diluciones ms elevadas de la serie (es
decir, aqullas que tengan una concentracin ms baja de muestra). Ver CASO 2 en la TABLA 5.
TABLA 5: E jem plos de elecciones de resultados positivos p a ra el clculo

de los valores del N M P
N m ero de tubos positivos obtenidos a p a rtir de

tres tubos incubados p a ra las cantidades siguientes NM P**
de m uestra sem brada p o r tubo*
CASO
P roductos P roductos O tros

10 mL 1 mL 10-1 mL 10-2mL 10"3mL
lquidos lquidos productos
O tros mL-1
1g 10"1g 10^2g io-3g 10^g g-1
productos
1 3 3 2 1 0 1,5 O1 1,5 102
2 3 3 3 0 2,4 * 101 2,4 102
3 2 2 1 1 0 7,4 7,4 101
4 3 3 0 0 0 2,4 2,4 101
5 2 2 0 1 0 2,1 101 2,1
* Nmeros en negrita: combinacin elegida.
** Clculo a partir del coeficiente de NM P para los tres tipos (TABLA 1).
E JE M P L O 28: N inguna dilucin tiene los tres tubos positivos
Cuando el caso 1 no se puede aplicar, escoger las tres diluciones ms elevadas de la serie
(aqullas con menor concentracin de muestra) que contengan al menos una respuesta positiva.
Ver CASO 3 en la TABLA 5.
E JE M P L O 29: Casos p articulares
En todos los casos donde ms de una de las tres diluciones escogidas segn los dos casos an
teriores no tenga tubos positivos, retener la dilucin menos elevada que no presente ningn tubo
positivo (es decir, la que tiene una mayor concentracin de muestra) y las dos diluciones ms ba
jas precedentes (es decir, aqullas con las concentraciones de muestra iguales a 10 y 100 veces la
de la primera dilucin escogida, ver CASOS 4 y 5 en TABLA 5), excepto cuando slo se en
cuentran tubos positivos al nivel de la primera dilucin preparada a partir de la muestra.
En este caso, es necesario retener las tres primeras diluciones para el clculo el NMP, igual
que si esta serie tuviera dos diluciones sin ningn tubo positivo.
EJEM PLO 30: Determinacin del coeficiente NMP
Verificar, segn el nmero de muestras examinadas por lote en las TABLAS 2 y 3, si las se
ries de nmero de tubos positivos correspondientes a las diluciones seleccionadas son aceptables
desde el punto de vista estadstico. Esta aceptabilidad depende del nmero de muestras exami
nadas y de la decisin de aceptar o de rechazar las categoras 2 y 3 (ver TABLA 4).
As, por ejemplo, cuando se aceptan los resultados de la categora 1 de la TABLA 4, la se
cuencia 2 2 1 slo se puede admitir cuando se analizan 10 muestras por lote. Al contrario,
cuando los resultados menos probables de la categora 2 se aceptan igualmente, la secuencia 2 2
1 ser admitida en el caso de haber examinado 2, 3 5 muestras. En ningn caso esta secuencia
2 2 1 es vlida para una muestra nica.
Para cada secuencia considerada aceptable segn lo descrito, determinar el coeficiente NMP
mediante la TABLA 2.
EJEM PLO 31: Clculo del nm ero ms probable (NMP)
A partir del coeficiente de NMP obtenido de las TABLAS 2 y 3, determinar el nmero de

microorganismos ms probable por mililitro o por gramo de muestra con ayuda de la expresin:
C = M V
V0
siendo:
Cs: nmero ms probable de microorganismos en un volumen de referencia Vs.

M: coeficiente NMP obtenido en las TABLAS 2 y 3 por la dilucin base V0.
F: inversa de la tasa de dilucin correspondiente a la dilucin eventual considerada como
dilucin de base utilizada (generalmente F = 10,100, etc.).
Vs: volumen de dilucin elegido para expresar la concentracin en microorganismos.
V0: dilucin de base.
Expresar el resultado de microorganismos por mililitro (producto lquido) o por gramo (res
to de productos) como un nmero comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10*, siendo x el
orden de magnitud apropiado de 10.
Si el NMP es inferior a 0 3 microorganismos por mililitro (para productos lquidos) o por gra
mo (para el resto de productos) y si se ha utilizado un modo operatorio adecuado para un nmero
bajo de microorganismos, el resultado deber expresarse de la manera siguiente: menos de 1 mi
croorganismo en 1 mL (para productos lquidos) o en 1 gramo de producto (para el resto de pro
ductos).
CAPTULO TERCERO
Procedimientos de mtodos de anlisis

de alimentos
MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO
DE MICROORGANISMOS A 30C
PNT - AL - 003 Basado en la norma ISO 4833 (Julio 1991)
1. Definicin:
Microorganismos: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis, cuando el
ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
2. Medios de cultivo:
Agar para recuento (PCA).
Agar blanco (AB).
3. Siembra:
Sembrar por duplicado 1 mL de muestra lquida o 1 mL de dilucin madre en placas Petri
estriles.
Repetir la operacin con las siguientes diluciones decimales.
Verter en cada placa unos 15 mL de PCA a 45C 1C.
Mezclar el inculo con el medio y dejar que solidifique *.
Incubar a 30C 1C durante 72 h 3 h.
4. Recuento:
Contar las colonias de aquellas placas que contengan un mximo de 300.
5. Expresin de resultados 2:
Retener las placas que contengan un mximo de 300 colonias al nivel de dos diluciones
sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mnimo de 15 colonias.
Calcular el nmero N de microorganismos por mililitro o por gramo con la expresin:
JV= K -------
(u, + 0,1-ti2) d
1 Si sospechamos que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie del me
dio, despus d la solidificacin verter 4 mL de AB a 45C 1C y dejar reposar.
2 Consultar el PNT - AL - 002 de expresin de resultados.
PROCEDIMIENTOS DE MTODOS DE ANLISIS DE ALIMENTOS 63

PNT - AL - 003 Basado en la norm a ISO 4833 (Julio 1991)
fe-mL 1 mL 1 mL 1 mL
Vw/
10- 10-2 io-3 o-4
(10-2) <HH) ocn (10-5)
1 mL
yy
1 mL 1 mL
"O7
1 mL
Verter en cada placa 15 mL de PCA a 45C 1C

Mezclar e incubar a 30C 1C durante 72 h 3 h*
Retener las placas con menos de 300 colonias
Lectura y expresin de resultados
* Si es necesario, aadir 4 mL de AB a 45C 1C.

64 MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIM ENTOS

PNT - AL - 004 Basado en la norm a NF V 08-051 (Diciembre 1992)
1. Definicin:
Microorganismos: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis, cuando el
Agar para recuento (PCA).
Agar blanco (AB).
3. Siembra:
Sembrar 1 mL de muestra lquida o 1 mL de dilucin madre en una placa Petri estril.
Verter en cada placa unos 15 mL de PCA enfriado a 45C - 47C.
Mezclar el inoculo con el medio y dejar que solidifique3.
4. Recuento:
Contar las colonias de aquellas placas que contengan un mximo de 300.
5. Expresin de resultados4:
Retener las placas que contengan un mximo de 300 colonias al nivel de dos diluciones
sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mnimo de 15 colonias.
3 Si sospechamos que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie del me
dio, despus de la solidificacin verter 4 mL de AB a 45C - 47C y dejar reposar.
M TODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
0B0
Muestra lquida 10
Dilucin madre (IO-1)
io-1
(io-2)
IO"2
(io-3)
IO"3
(10-4)
1CH
(io-5)
o o
ooooo
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
10 io-1 io-2 10-3 10^

(io-1) (1(L2) (1(L3) (10-*) (io-5)
Verter en cada placa 15 mL de PCA a 450C-470C
Mezclar e incubar a 30C 1C durante 72 h 3 h*
10 io-1 10-2 io-3 io-1

(IO-1) (IO-2) (io-3) (1(^) (io-5)
* Si es necesario, aadir 4 mL de AB a 45C 47C.


DE LEVADURAS Y MOHOS
PNT - AL - #05 Basado en la norma ISO 7954 (Agosto 1988)
1. Definicin:
Levaduras y mohos: Microorganismos que a 25C forman colonias en un medio selectivo,
cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
2. Medio de cultivo:
Agar glucosa y cloranfenicol (CGA).
3. Siembra:
Sembrar por duplicado 1 mL de muestra lquida o 1 mL de dilucin madre en placas Petri
estriles.
' Repetir la operacin con las siguientes diluciones decimales.
Verter en cada placa unos 15 mL de CGA a 45C 1C.
Mezclar el inculo con el medio y dejar que solidifique.
Incubar a 25C 1C durante 5 das.
4. Recuento:
Contar las colonias de cada placa a los 3,4 y 5 das de incubacin.
Despus de 5 das de incubacin, retener las placas que contengan un mximo de 150 co
lonias, si es posible al nivel de dos diluciones sucesivas.
Calcular el nmero N de levaduras y mohos por mililitro o por gramo con la expresin:
* = s e -----------
(/i, + 0,1 /i2) d


PNT - AL - 005 Basado en la norma ISO 7954 (Agosto 1988)
DIA 1 I mL 1 mL 1 mL 1 mL
Vw/ v7 Nw/ v^7

Muestra lquida 10 10-' io-2 10-3 1(H
Dilucin madre (10-1) (io-2) (10-3) (10^) (10-=)
1 mL
0
1 mL 1 mL
0
1 mL
10-'
(HH)
Verter en cada placa 15 mL de CGA a 45C 1C
Mezclar e incubar a 25C 1C durante 5 das
DIA 6
10-'
(1(H)

68 M TO D O S DE AN LISIS M iC ROBIOLGICOS DE A LIM E N TO S
M T O D O H O R IZ O N T A L PARA E L R E C U E N T O
D E LEV ADURAS Y M O H O S
PN T - AL - 006 B asado en la n o rm a X F V 08-059 (N oviem bre 1995)
1. Definicin:
Levaduras: Microorganismos aerobios mesfilos que, en cinco das, a 25C, se desarrollan
en la superficie del medio slido, formando colonias mates o brillantes, presentando fre
cuentemente contomo regular y una superficie ms o menos convexa cuando el ensayo se re
aliza segn, el siguiente mtodo.
Mohos: Microorganismos aerobios mesfilos, filamentosos, que en la superficie de un me
dio slido a 25C, desarrollan colonias cuando el ensayo se realiza segn el siguiente m
todo; este desarrollo puede proceder de la germinacin de esporas o del crecimiento de frag
mentos micelares.
2. M edio de cultivo:
Agar glucosa y cloranfenicol (CGA) con gentamicina.
3. S iem bra:
Sembrar 0,1 mL de muestra lquida o 0,1 m L de dilucin madre en placas Petri con el me
dio CGA.
Extender con asa de Drigalski.
Incubar a 25C 1C durante 5 das.
4. R ecuento:
Contar las colonias de cada placa a los 3 ,4 y 5 das de incubacin.
5. E xpresin de re su lta d o s6:

Despus de 5 das de incubacin, retener las placas que contengan un mximo de 150 co
lonias, al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa conten
ga un mnimo de 15 colonias.
Calcular el nmero N de levaduras y mohos por mililitro o por gramo con la expresin:
0,11 d

PROCEDIMIENTOS DE M TODOS DE ANLISIS DE ALIMENTOS 69

PNT - AL - 006 Basado en la norm a XF V 08-059 (Noviembre 1995)
DIA 1 l mL 1 mL 1 mL 1 mL
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

CGA con gentamicina
lo o o o o 10
( 10- 1)
10-1
( 10-2)
10-2
(10-3)
10-3
( 10-4)
lO*
( 10-3)
Incubar a 25C1C durante 5 das

DA 6
- s : ; !o : > ; v
r*n"i
*ii * i *n m m t i
1 "^ !
L a T i > ." J f A
' $
1 0 1 0 -1 10-* 10-3 10-*

( 1 0 - 1) ( 1 0 - 2) ( 10-3) (1(H) ( 10-5)

70 M TODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE A U M E N TO S
M TO D O HORIZO NTA L PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIN

DE Enterobacteriaceae. TCNICA DEL NM P
PNT - AL - 007.1 Basado en la norm a ISO 7402 (Diciembre 1993)
1. Definicin:
Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reaccin oxidasa nega
tiva cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE) a doble y simple concen
tracin.
Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).
Agar glucosado (AG).
Agar nutritivo (AN).
3. Reactivo:
Reactivo para la prueba de la oxidasa.
4. Siem bra:
Enriquecimiento:
Sembrar 10 mL de muestra lquida o 10 mL de dilucin madre en tres tubos con 10 mL de
caldo EE a doble concentracin.
Sembrar 1 mL de la muestra lquida o 1 mL de dilucin madre en tres tubos de caldo EE
a simple concentracin.
Repetir esta operacin con las siguientes diluciones decimales.
Aislamiento:
Aislar en placas de VRBG a partir de cada tubo.
Seleccin:
Resembrar 5 colonias tpicas bien aisladas (de color rojo violeta y a veces rodeadas de una
halo de precipitacin del mismo color, o mucosas)7 en placas de AN.
5. Confirmacin bioqumica:
Prueba de la oxidasa: Se realiza con cada una de las colonias aisladas. La prueba es positiva
si al cabo de 10 sg aparece una coloracin violeta.
Prueba de fermentacin de la glucosa:
Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxidasa 0 .
Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo
aparece una coloracin amarilla.
Contar el nmero de tubos positivos para cada dilucin. Si al menos una de las colonias es
oxidasa 0 y glucosa 0 , consideraremos positivo el tubo a partir de cual se ha realizado el
subcultivo.
Determinar el nmero ms probable (NMP) con la ayuda de una tabla.
7 Algunas Enterobacteriaceae pueden provocar una decoloracin de sus colonias y del medio, de manera
que si no se encuentran colonias tpicas, sembrar las colonias blanquecinas.
P R O C E D IM IE N TO S DE M T O D O S DE A N L IS IS DE A L IM E N T O S 71
M T O D O H O R IZO N TA L PARA EL R ECU EN TO SIN R EV IV IFICA C I N

DE Enterobacteriaceae. T C N IC A D EL NMP
PN T - AL - 007.1 Basado en la norm a ISO 7402 (Diciembre 1993)
1 mL 1 mL
Dilucin madre (10-1) (io-2) (io-3) ( 10- )
y y
1 mL 1 mL
0
10 m L 1 mL 1 mL
caldo EE caldo EE
doble sim ple concentracin
BBS 10 io-1 io-2 10-3

(io-1) (io-2) (io-3) (10^)
Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h
L
A islam ien to
Sembrar una placa de VRBG a partir de cada tubo
Tomar 5 colonias tpicas de cada placa y sembrar en AN
oxidaxa 0 IH l> AG
Determinar el NMP
72 M TO D O S DE ANLISIS MICRO BIOLGICOS DE ALIM EN TO S
M T O D O H O RIZO N TA L PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIN

DE E nterobacteriaceae. TCNICA PO R RECUENTO DE COLONIAS
1. Definicin:
tiva, cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
2. M edios de cultivo:
3. Reactivo:
4. Siem bra:
Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra lquida o 1 mL de dilucin madre en sendas
placas Petri.
Verter unos 15 mL de VRBG a 45C 1C.
Una vez solidificado, cubrir con 10-15 mL del mismo medio.
Dejar solidificar e incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h.
Repetir esta operacin con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
5. Recuento:
En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar aquellas que tengan un di
metro mayor o igual que 0,5 mm, de color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de
precipitacin o mucosas. Consideraremos estas colonias como presuntas Enterobacteria
ceae9.
Tomar cinco colonias caractersticas de cada placa retenida y sembrarlas por separado en
placas de AN.
6. Confirm acin bioqum ica10:

Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxida
sa 0 .
9 Si la mitad de la superficie de la placa est invadida, la determinacin se considerar sin valor. Si la

zona invadida fuera inferior a la mitad de la superficie de la placa, se efecta el recuento de colonias sobre la
zona clara y se extrapola este valor a la superficie total.
10 Estas pruebas pueden realizarse simultneamente con la siembra en AN, segn criterio del laboratorio.
7. Expresin de resultados n :
Si al menos el 80% de las colonias caractersticas seleccionadas son confirmadas como En
terobacteriaceae (es decir, oxidasa y glucosa ), el nmero de bacterias presentes ser el
encontrado en el recuento (ver punto 5).
Si no es as, calcularemos el nmero a partir del porcentaje de colonias oxidasa 0 y gluco
sa sobre el nmero total de colonias seleccionadas.
La expresin que nos permite calcular el nmero N de Enterobacteriaceae por mililitro o por
gramo de producto es:
(/i, + 0,1-n2) - d

74 M T O D O S DE A N LIS IS M IC R O B IO L G IC O S DE A L IM E N TO S
M TO D O HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIN

DE Enterobacteriaceae. TCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS
1 mL 1 mL 1 mL
D IA 1
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
10 io-1 10-2 io-3

(io-) (io-2) (io-3) (io-4)
Verter 15 mL de VRBG a 45C 1C
Cubrir con 10-15 mL de VRBG
D IA 2 | [
10 10-1 10-2 io-3

(io-1) (io-2) (io-3) (IO-4)
Contar las colonias de presuntas Enterobacteriaceae
Tomar 5 colonias caractersticas de cada placa y sembrar en AN

D IA 3
oxidaxa AG
D IA 4 Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 Ii
Le ctu ra y expresin de resultados

MTODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIN

DE Enterobacteriaceae CON PRE-ENRIQUECIMIENTO
PNT - AL - 008 Basado en la norma ISO 8523 (Febrero 1992)
1. Definicin:
Agua de peptona tamponada (APT).
Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE).
3. Reactivo:
4. Siembra:
Pre-enriquecimiento:
Realizar una dilucin 1/10 en ATP.
Incubar a 37C 1C durante 16 h - 20 h.
Enriquecimiento:
Sembrar 1 mL del cultivo anterior en 10 mL de caldo EE.
Aislamiento:
Aislar en placas con VRBG.
Resembrar 5 colonias tpicas bien aisladas (de color rojo-violeta y a veces rodeadas de un
halo de precipitacin del mismo color)12en placas de AN.
Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxida
sa .
Consideramos la muestra positiva en la investigacin de Enterobacteriaceas si una de las co
lonias caractersticas es oxidasa 0 y glucosa 0 .
12 Algunas Enterobacteriaceae pueden provocar una decoloracin de sus colonias y del medio, de ma
nera que si no se encuentran colonias tpicas, tomar de las colonias blanquecinas y sembrar.
76 M T O D O S DE A N L IS IS M IC R O B IO L G IC O S DE A L IM E N T O S
M T O D O H O R IZ O N TA L PARA LA INVESTIGACI N
D E E nterobacteriaceae CO N PR E -EN R IQ U EC IM IEN TO
PN T - AL - 008 Basado en la norm a ISO 8523 (Febrero 1992)
P r a - a n r i n i i A / ' m i a n f n
DIA I 1 g de muestra
10 mL ATP
Incubar a 37C 1C durante 16 h-24 h
DIA 2 1 C
E n riq u ecim ien to
1 mL
10 mL caldo EE
DIA 3
V
VRBG

DIA 4
AN

DIA 5
-
o
B
Confirmacin
oxidaxa AG

DIA 6
Resultado
Glucosa (color amarillo)
MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIN

PNT - AL - 009 Basado en la norm a NF V 08-054 (Octubre 1993)
1. Definicin:
3. Reactivo:
4. Siembra:
Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra lquida o 1 mL de dilucin madre y verter
unos 15 mL de VRBG a 45C - 47C.
Una vez solidificado, cubrir con unos 5 mL del mismo medio.
Dejar solidificar en incubar a 30C 1C durante 24 h 2 h.
Repetir la operacin con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.
5. Recuento:
En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar aquellas con un dimetro ma
yor o igual que 0,5 mm, de color rojo violeta y a veces rodeadas de una halo de precipi
tacin del mismo color. Consideraremos estas colonias como presuntas Enterobacteria
ceae.
Tomar cinco colonias caractersticas de cada placa retenida y sembrarlas por separado en
placas de AN.
Prueba de la oxidasa:
Se realiza con cada una de les colonias aisladas. La prueba es positiva si al cabo de 10 sg
aparece una coloracin violeta.
Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las cepas oxidasa .
Incubar a 37C 1C durante 24 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo apa
rece una coloracin amarilla.
Se han resembrado:
De las 66 colonias de la dilucin 10~3: 8 colonias, de tas cuales 6 han respondidoa los cri
terios; as: a - 50.
De las 80 colonias de la dilucin 10-3: 9 colonias, dfe las cuales 6 han respondido a los cri
terios; as: a 53.
Las 4 colonias de la dilucin IO-4, de las cuales las 4 han respondido a los criterios; as:
a 4.
De las 7 colonias de la dilucin 10-4: 5 colonias, de las cuales 4 han respondido a los cri
terios de identicacin; as: a = 6.
Entonces:
tf- ___________50 + 53 + 6 + 4 _ 113

V-(n,+0,l-ih)-d 1 [2 + ( 0,1 2 )] 10-3 2.2 1 0 ' 3

EJEMPLO 14: Estimacin de pequeos nmeros

Si las dos placas, al nivel de la muestra de ensayo (para productos lquidos), de la dilucin
madre (para el resto de productos) o de la primera dilucin sembrada o retenida, contiene menos
de 15 colonias (en total, caractersticas o identificadas).

io -2
12
Nmero de colonias
13
Entonces:
12+13z - ^ = 1.250
* V-n-d 12 10 0,02
Despus de redondear el resultado obtenido, consideramos que el nmero estmalo de mi


Si para las dos placas de una primera dilucin dx, el nmero total de colonias caractersticas
y no caractersticas es mayor que 150 (o cualquier otro nmero indicado en la norma e>pecfica)
con colonias identificadas y si, en la dilucin siguiente hay menos de 150 colonias (ocualquier
otro nmero indicado en la norma especfica), no se puede contar ninguna colonia identificada.
PROCEDIMIENTO DE EXPRESIN DE RESULTADOS {PNT - AL - 002) 53

14H io-3
180 22
Nmero de colonias
210 25
con colonias identificadas sin colonias identificadas
presentes presentes
El resultado es menos de 1.000 y ms de 100 microorganismos por mililitro o por gramo de

producto.

Si, en las dos placas de una primera dilucin d, el nmero total de colonias caractersticas y
no caractersticas es mayor que 150 (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica) sin
colonias identificadas y si, en las dos placas de la dilucin d^ siguiente hay menos de 150 colo
nias (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica), no se puede contar ninguna co
lonia identificada.
io-2 io-3
180 22
Nmero de colonias
210 25
sin colonias identificadas sin colonias identificadas
presentes presentes
El resultado es menos de 1.000 microorganismos por mililitro o por gramo de producto.

En el caso de que el nmero total de colonias caractersticas y no caractersticas sea mayor
que 150 (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica) en las dos placas de una pri
mera dilucin du con un nmero de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilucin d2 si
guiente, si el nmero total de colonias en cada una de las dos placas de la dilucin dx est com
prendido entre 167 y 150 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual
a 150).

io-2 xa-3
155 8
Nmero de colonias
165 12
Utilizar el modo de clculo del caso general a partir de las placas de ls dos diluciones retenidas.
Caso en el que el nmero total de colonias caractersticas y no caractersticas sea mayor que
ISO (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica) en las dos placas de una prime
ra dilucin d, con un nmero de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilucin d2 si
guiente, si el nmero total de colonias en cada una de las dos placas de la dilucin dx es superior
a 167 (lmite superior del intervalo de conanza de una media ponderada igual a 150), retener
slo el resultado de los recuentos de la dilucin dj y realizar una estimacin de pequeos n
meros.

io-2 o-3
170 12
Nmero de colonias
190 8
placas de la dilucin 10-3.
Caso que nicamente las dos placas de la ltima dilucin sembrada tengan menos de 150 co
lonias (o cualquier otro nmero indicado en la norma especfica) caractersticas y no caracters
ticas.
ltima dilucin sembrada:

1(M
identificadas 130
Entonces:
N-. - g - . . - g 1.250.000
V nd 1-2-10 0,0002

MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES.

TCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS
1. Definicin:
Coliformes: Bacterias que a 30C son capaces de fermentar la lactosa cuando el ensayo se re
aliza segn el siguiente mtodo.
Agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL).
3. Siembra:
Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra lquida o 1 mL de dilucin madre en sendas
placas Petri estriles.
Verter 15 mL de VRBL a 45C 2C.
Mezclar y dejar solidificar.
Preparar de la misma m anera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.
Cubrir con 4 mL del mismo medio a 45C 2C.
Dejar solidificar e incubar a 30C 1C durante 24 h 2 h.
4. Recuento:
Contar las colonias caractersticas de coliformes (de dimetro mayor o igual de 0,5 mm, de
color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de precipitacin) en las placas que conten
gan menos de 150 colonias caractersticas y/o no caractersticas.
Retener las placas que contengan un mximo de 150 colonias caractersticas al nivel de
dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga ms de 15 colo
nias caractersticas.
Calcular el nmero N de coliformes por mililitro o por gramo de producto con la expre
sin:
(, + 0 ,l/2 2) r

PROCEDIM IENTOS DE M TODO S DE ANLISIS DE A LIM EN TO S 83

TCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS
PN T - AL - 011 Basado en la norm a ISO 4832 (Julio 1991)
1 rnL 1 mL 1 mL
01 mL
01 mL
Placa
testigo
10 o -1 lO"2
(10-1) (10-2) (IO"3)
Verter 15 mL de VRBL a 45C 2C
Mezclar y dejar solidificar
Cubrir con 4 mL de VRBL a 45C 2C

Incubar a 30C 1C o 37C 1C durante 24 h 2 h
Retener las placas con menos de 150 colonias caractersticas
10 10-1 10-2 10-3

(10-1) (10-2) (10-3) ( 10^ )

84 M TO D O S DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE A LIM E N TO S
M TO D O HORIZONTAL PARA EL RECUENTO

D E COLIFORM ES TOTALES.
PNT - A L - 012 Basado en la norm a N F V 08-050 (Diciem bre 1992)
1. Definicin:
C oliform es: Bacterias que a 30C form an colonias caractersticas en el agar lactosado con
bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL) cuando el ensayo se realiza segn el siguiente
mtodo.
2. M edio de cultivo:
A gar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL).
3. Siembra:
Sem brar en una placa Petri 1 m L de m uestra lquida o 1 m L de dilucin madre.
R epetir la operacin con 1 m L de cada una de las siguientes diluciones decimales.
V erter 15 m L de VRBL a 45C - 47C.
M ezclar y dejar solidificar.
Preparar de la m ism a m anera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.
C ubrir con unos 5 m L del mismo medio a 45C - 47C.
D ejar solidificar en incubar a 30C 1C durante 24 h 2 h.
4. Recuento:
Contar las colonias caractersticas de coliformes (de dimetro mayor o igual de 0,5 mm, de
color rojo-vipleta y a veces rodeadas de un halo de precipitacin) en las placas que con
tengan menos de 150 colonias caractersticas y/o no caractersticas.
R etener las placas que contengan un mximo de 150 colonias caractersticas y/o no ca
ractersticas al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa con
tenga ms de 15 colonias caractersticas.
Calcular el nm ero N de coliformes por mililitro o gramo de producto mediante la expre
sin:

PROCEDIMIENTOS DE MTODOS DE ANLISIS DE ALIM ENTOS 8

DE COLIFORMES TOTALES.
1 mL 1 mL 1 mL
Muestra lquida 10 10-' io-2 io-3

Dilucin madre (10~) (io-2) (I0-3) ( 10^ )
o1 mL 1 mL
o
1 mL
&
I mL
Placa 10 io-3
testigo (10-1) ( 10- )
Verter 15 mL de VRBL a 45C 47C

Cubrir con 5 mL de VRBL a 45C 47C


86 M TODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIMENTOS

DE E scherichia coli PRESUNTIVOS. TCNICA DEL NMP
PNT - AL - 013 Basado en la norma ISO 7251 (Septiembre 1994)
1. Definicin:
Escherichia coli: Bacterias que a 45C fermentan la lactosa con produccin de gas y que a
esta misma temperatura producen indol a partir del triptfano cuando el ensayo se realiza se
gn el siguiente mtodo.
Caldo de triptona lauril sulfato (TSL).
Caldo Escherichia coli (Caldo EC).
Agua de triptona (AT).
3. Reactivo:
Reactivo de Kovacs.
4. Siembra:
Sembrar 10 mL de muestra lquida o 10 mL de dilucin madre en tres tubos de TSL a do
ble concentracin.
Sembrar 1 mL de la muestra lquida o 1 mL de dilucin madre en tres tubos de TSL a sim
ple concentracin.
Repetir esta operacin con las siguientes diluciones decimales.
Preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.
Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h (+ 24 h si es necesario).
5. Confirmacin:
A partir de cada tubo con formacin de gas, sembrar con asa de Kolle en Caldo EC y en
AT, atemperados a 45C 2C.
Incubar en un bao a 45C 0,5C durante 48 h 2 h.
6. Recuento:
Prueba del Indol:
Aadir 0,5 mL de reactivo de Kovacs a los tubos de AT.
Mezclar y examinar al cabo de 1 min.
Una coloracin roja en la fase alcohlica indica reaccin .
Formacin de gas:
La formacin de gas en la campana de Durham indica reaccin .
7. Expresin de resultadosl9:
Retener 3 diluciones segn el caso:
a) Cuando al menos una dilucin presenta 3 tubos positivos, elegir la ms diluida que
presente los 3 tubos positivos y las dos diluciones siguientes con tubos positivos.
b) En caso contrario, elegir las tres diluciones ms diluidas que contengan al menos un
tubo positivo.
Determinar el NMP con la ayuda de una tabla.

PROCEDIMIENTOS DE M TODOS DE ANLISIS DE ALIM ENTOS 87

DE E scherichia coti PRESUNTIVOS. TCNICA DEL NMP
PNT - AL - 013 Basado en la norma ISO 7251 (Septiembre 1994)
1 mL 1 mL 1 mL
10 mL
TSL a doble
' 'O O O O
1 mL 1 mL 1 mL
TSL a sim ple concentracin
1 mL
concentracin
10
0 00 00i 000
10- ' 10-2 io-3
(10-1) ( 10-2) (lo-3) o<n
Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h (+24 h si es necesario)
Sem brar a partir de los tubos con gas en EC y A T a 45C 2 C
\ ii6 0@@ o 1L
Bh: BBB :; 0 : :JB
10 10-' 10-2
0 -
10-3

( lo - 1) (10-2) (10-3) (lO 4)

Incubar en bao a 45C 0,5 C durante 48 h + 2 h
000
Aadir 0,5 mL de reactivo de K ovacs a los tubos de AT
3 HB
M ezclar y examinar al cabo de 1 min
B
Contar el nm ero de tubos con coloracin roja y form acin de gas
EC
e
Determ inar el NM P
AT

DE Escherichia coU 0-GLUCURONIDASA POSITIVOS
PNT - AL - 014 Basado en la norma NF V 08-053 (Diciembre 1993)
1. D efinicin:
Escherichia coli 3-glucuronidasa positivos: Bacterias que a 44C forman colonias caracte
rsticas en el agar con tergitol (PTX), adicionado de un substrato cromognico (BCIG) que
revele la presencia de /3-glucuronidasa cuando el ensayo se realiza segn el siguiente m
todo.
Agar con tergitol - BCIG (PTX)
3. Siembra:
Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra lquida o 1 mL de dilucin madre.
Verter 15 mL de PTX a 45C - 47C.
Mezclar y dejar solidificar.
NOTA: En caso de sospechar la presencia de Escherichia coli estresados, es conveniente rea

lizar una primera incubacin a 37C 1C durante 4 h y luego la incubacin a 44C 1C
durante 18 h - 20 h.
4. Recuento:
Contar las colonias caractersticas de Escherichia coli /3-glucuronidasa positivos (de color
azul) en las placas que contengan menos de 150 colonias caractersticas y no caractersti
cas.

Retener las placas que contengan menos de 150 colonias al nivel de dos diluciones suce
sivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mnimo de 15 colonias caracte
rsticas.
Calcular el nmero N de Escherichia coli /3-glucuronidasa positivos mediante la expresin:
- Consultar el PNT - AL - 002 de expresin de resultados.


DE E scherichia co {3-GLUCURONIDASA POSITIVOS
PNT - AL - 0X4 Basado en la norma NF V 08-053 (Diciembre 1993)
1 mL 1 mL 1 mL
103
(l< n
Verter en 15 mL de PTX a 45C-47C
10 10-2
(10-*) ( 10-3)

90 MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE AUMENTOS
MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOS

COAGULASA POSITIVOS (CPS). TCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS
PNT - AL - 015.1 Basado en la norma ISO 6888-1 (Febrero 1999)
1. Denicin:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS)'. Bacterias que forman colonias caractersticas y/o
no caractersticas en la superficie de un medio de cultivo selectivo, y que dan una reaccin
positiva en la prueba de la coagulasa cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
Medio de Baird-Parker (BP).
Caldo de cerebro-corazn (BHI).
3. Reactivo:
Plasma de conejo.
4. Siembra:
Sembrar por duplicado 0,1 mL de la muestra lquida o 0,1 mL de dilucin madre en dos
placas Petri con medio BP.
Repetir esta operacin con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales21.
Extender con asa de Drigalsky.
Tapar y dejar absorber durante 15 min. a T ambiente.
Incubar durante 24 h - 48 h a 37C 1C.
5. Recuento:
Despus de 24 h 2 h de incubacin, marcar en la placa las colonias caractersticas (de 1
a 1,5 irnn de dimetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara).
Incubar durante 24 h 2 h ms.
Marcar las colonias caractersticas (de 1,5 a 2,5 mm de dimetro; parte de la zona clara
puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias), y tambin las colonias no ca
ractersticas (stas pueden no tener zona clara).
Retener las placas que tengan un mximo de 300 colonias, con 150 colonias caractersti
cas y no caractersticas al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una
placa contenga un mnimo de 15 colonias.
2! Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por
duplicado).
PROCEDIMIENTOS DE MTODOS DE ANUSIS DE ALIMENTOS 91
6. Confirmacin:
Elegir al azar de cada placa seleccionada:
5 colonias caractersticas si slo hay colonias caractersticas.
5 colonias no caractersticas si slo hay colonias no caractersticas.
5 colonias caractersticas y 5 colonias no caractersticas si estn presentes ambos tipos.
Si hay menos de 5 colonias, de cualquier tipo, elegirlas todas.
Sembrar en un tubo con BH1.
Aadir 0,1 mL de cada cultivo a tubos con 0,3 mL de plasma de conejo.
Incubar a 37C 1C.
Examinar la coagulacin del plasma al cabo de V2 h, 1 h, 4 h, 6 h y, si es negativo, hasta
las 24 h 2 h de incubacin. Consideramos la reaccin positiva cuando el cogulo ocupa
ms de V2 del volumen ocupado inicialmente por el lquido.
NOTA: Realizar un control negativo aadiendo 0,1 mL de BHI estril al plasma de conejo
e incubar sin sembrar y un control positivo con CPS.
7. Expresin de resultados**:
Calcular el nmero a de estafilococos coagulasa positivos identificados por placa retenida
mediante la expresin:
Calcular el nmero N de estafilococos coagulasa positivos identificados presentes en la

muestra problema mediante la expresin:
JA
N = --------------------
V -(/i,+ 0 ,l-/i2)-r

92 M TO D O S DE ANLISIS M ICROBIOLGICOS DE A LIM EN TO S

PNT - AL - 015.1 Basado en la norma ISO 6888-1 (Febrero 1999)
1 mL 1 mL 1 mL
D IA 1
^000
M u e stra lq u id a 10 o-1 io-2 10-3
0
D ilu c i n m a d re (1 0 -1) (10-*)
o
(o-2) ( 10~3)
I oo oo"oooo
10 m L 1 mL 1 mL 1 mL
10 10-* 10-2 10-3

(10-1) (10-2) (10-3) (10-*)
Tapar y dejar absorber durante 15 min
Incubar durante 24 h 2 h a 37C 1C
D IA 2
Marcar las colonias caractersticas
10 10- ' IO"2 10-3

(10-1) (10-2) (10-3) ( 10- )
D IA 3 C
Marcar las colonias caractersticas y no caractersticas

Retener las placas que tengan menos de 150 colonias
Sembrar en BHI (segn caso) CONTROL
\ 0 0 0 0 0 Incubar durante 24 h 2 h a 37C 1C

0
D IA 4
00000 0 U
CONTROL CONTROL
0,1 m L de cada cultivo 0,1 m L B H I estril
Incubar a 37C 1C
Examinar la coagulacin al cabo de Vi h, 1 h, 4 h, 6 h (hasta 24 h 2 h)


PNT - AL - 015.2 Basado en la norma ISO 6888-2 (Abril 1999)
1. Definicin:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias caractersticas en el
medio de agar selectivo de plasma de conejo y fibringeno cuando el ensayo se realiza segn
el siguiente mtodo.
Agar con plasma de conejo y fibringeno (RPF).
3. Siembra:
Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra lquida o 1 mL de dilucin madre en dos pla
cas Petri.
Verter en cada placa unos 3 mm de RPF a 47C 0,5C 23.
Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente.
Incubar durante 18 h - 24 h a 37C 1C (+ 18 h - 24 h si es necesario).
4. Recuento:
Retener las placas que contengan que contengan un mximo de 300 colonias, con 100 co
lonias caractersticas al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos
una placa contenga un mnimo de 15 colonias caractersticas.
Contar las colonias caractersticas de cada placa, que en RPF pequeas, negras o grises, o
incluso blancas, estn rodeadas de un halo de precipitacin que indica la presencia de
coagulasa.
Calcular el nmero N de estafilococos coagulasa positivos presentes por mililitro o por gra
mo de producto con la expresin:
YjC
N = --------- ----------
V (n, +0,1 n2) d
23 Aadir el suplemento a la base en el momento de preparar las placas.

94 M TO D O S DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIM ENTOS
M TODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOS

PNT - AL - 015.2 Basado en la norma ISO 6888-2 (Abril 1999)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Muestra lquida 10 10-* I(H 10- 10"*

Dilucin madre (10-1) (10-2) (10-3) (10 ( 10
1 mL
o oooo
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
o oooo
10
(10-1)
10-'
(10-2)
10-2
(10-3)
IO"3
(IO-)
10-3
(10-)
Verter unos 3 mm de RPF a 47C 0,5C
M ezclar y dejar absorber durante 15 min
Incubar durante 18 h-24 h a 37C 1C (+18 h-24 h si es necesario)
Retener las placas con m enos de 300 colonias
10 10-' io-2 10-3 1CH

(10-) (o-2) (io-3) (10-) (o-5)

COAGULASA POSITIVOS (CPS). TCNICA CON CONFIRMACIN DE COLONIAS
P N T -A L -016.1 Basado en la norma NF V 08-057-1 (Noviembre 1994)
1. Definicin:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias caractersticas y no
caractersticas en la superficie de un medio de cultivo selectivo, y que dan una reaccin po
sitiva a la coagulasa cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
Medio de Baird-Parker (BP).
Caldo cerebro-corazn (BHI).
3. Reactivo:
Plasma de conejo.
4. Siembra:
Sembrar 0,1 mL de muestra lquida o 0,1 mL de dilucin madre en una placa Petri con BP.
Repetir la operacin con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales25.
Incubar durante 24 h - 48 h a 37C 1C.
5. Recuento:
Despus de 24 h 2 h de incubacin, marcar en la placa las colonias caractersticas (de 1
a 1,5 mm de dimetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara).
Incubar durante 24 h 2 h ms.
Marcar las colonias caractersticas (de 1,5 a 2,5 mm de dimetro; parte de la zona clara
puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias), y tambin las colonias no ca
ractersticas (stas pueden no tener zona clara).
Retener las placas que tengan menos de 150 colonias caractersticas y n caractersticas al
nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una de las placas contenga un
mnimo de 15 colonias.
25 Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por
duplicado). En este caso, realizaremos las operaciones de recuento y confirmacin sobre el conjunto de estas
placas.
6. Confirmacin
Elegir al azar 3 colonias caractersticas de cada placa seleccionada (opcionalmente tambin
3 colonias no caractersticas) y sembrar en un tubo con BHI.
Aadir 0,1 mL de cada cultivo a tubos con 0,3 mL de plasma de conejo.
Incubar a 37C 1C.
Examinar la coagulacin del plasma al cabo de V2 h, 1 h, 4 h, 6 h y, si es negativo, hasta
las 24 h 2 h de incubacin. Consideramos la reaccin positiva cuando el cogulo ocupa
ms de 3A del volumen ocupado por el lquido.
NOTA: Realizar un control negativo aadiendo 0,1 mL de BHI estril al plasma de conejo
e incubar sin sembrar y un control positivo sembrando CPS.
Calcular el nmero a de estafilococos coagulasa positivos identificados por placa retenida
mediante la expresin:
Calcular el nmero N de estafilococos coagulasa positivos identificados presentes en la

muestra problema mediante la expresin:
La
N = ------------
V-U d
26 Realizar la prueba de la catalasa (facultativa), reteniendo las colonias catalasa .


COAGULASA POSITIVOS (CPS). TCNICA CON CONFIRMACIN DE COLONIAS
PNT - AL - 016.1 Basado en la norma NF V 08-057-1 (Noviembre 1994)
1 mL 1 mL 1 mL
Muestra lquida 10
Dilucin madre (10-)
0
10-
0
10-2
0
10-3
(10-2) (10-3)
o o
( 10- )
'O '
0,1 mL
10
( 10- )
O "O o
0,1 mL
10-'
(IO-2)
0,1 mL
10-2
(10-3)
0,1 mL
io
do-)
10
(10-*)
io
do-2)
O O
Marcar las colonias caractersticas
io
do-3)
IO-3
o o -)
Marcar las colonias caractersticas y no caractersticas

Retener las placas que tengan menos de 150 colonias
Elegir 3 colonias de cada placa y tipo y sembrar en BHI CONTROL 0
\ 0 0 0 0 0 0
000000 o
CONTROL CONTROL
0,1 mL de cada cultivo 0,1 mL BHI estril
0,3 mL
plasma de conejo
Incubar a 37C 1C
Examinar la coagulacin al cabo de V2 h, 1 h, 4 h, 6 h (hasta 24 h 2 h)
\7

COAGULASA POSITIVOS (CPS). TCNICA SIN CONFIRMACIN DE COLONIAL
1. Definicin:
Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias caractersticas e ri un
medio slido selectivo con plasma de conejo y fibringeno cuando el ensayo se realiza se.gn
el siguiente mtodo.
Agar con plasma de conejo y fibringeno (RPF).
3. Siembra:
Verter en cada placa unos 10 mL de RPF a 47C 0,5C28.
Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente.
Incubar a 37C 1C durante 18 h - 24 h (+ 18 h - 24 h si fuera necesario).
4. Recuento:
Contar las colonias caractersticas de cada placa, que son negras o grises, pequeas y es
tn rodeadas de una zona opaca o turbia, indicativa de la presencia de coagulasa.
Retener las placas que contengan menos de 100 colonias caractersticas al nivel de d o s d i
luciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mnimo de 15 co
lonias caractersticas.

Calcular el nmero N de estafilococos coagulasa positivos por mililitro o por gramo c o n la
expresin:
YT
N =
1, 1 d
28 Aadir el suplemento a la base en el momento de preparar las placas.

PROCEDIMIENTOS DE MTODOS DE ANUSIS DE AUM ENTOS 99

COAGULASA POSITIVOS (CPS). TCNICA SIN CONFIRMACIN DE COLONIAS
1 mL 1 mL 1 mL
O O O
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
10 10-3
(o-1) (io-2) (io-3) (o-1)
Verter en cada placa 10 mL de RPF
Mezclar e incubar a 37C 1C durante 18 h-24 h
(+18 h-24 h si es necesario)
(10-J) (10-3) (IO-)


DE Bacillus cereus
PNT - AL - 017 Basado en la norma ISO 7932 (Enero 1994)
1. Definicin:
Bacillus cereus: Microorganismos lecitinasa que no fermentan el manitol cuando el
anlisis se realiza segn el siguiente mtodo.
Agar manitol yema de huevo con polimixina (MYPA).
Medio Voges-Proskauer (MR-VP).
Medio nitrato (MN).
3. Reactivos:
Reactivos para la reaccin de Voges-Proskauer (VP):
solucin de a-naftol.
solucin de hidrxido potsico.
cristales de creatina.
Reactivos para la investigacin de nitritos:
solucin de 5-2 ANSA.
solucin de cido sulfanflico.
solucin de cido actico.
zinc en polvo.
4. Siembra:
Sembrar por duplicado 0,1 mL de muestra lquida o 0,1 mL de dilucin madre una placa
de MYPA.
Extender con asa de Drigalski.
Repetir la operacin con las siguientes diluciones decimales30.
Tapar y dejar absorber durante unos 15 min. a T ambiente.
Incubar a 30C 1C durante 18 h - 24 h (+ 24 h si es necesario).
5. Recuento:
Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 dilu
ciones sucesivas. Es necesario que una placa contenga un mnimo de 15 colonias carac
tersticas.
Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que no fermentan ma
nitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado).
NOTA: Si las placas contienen un gran nmero de microorganismos manitol , el color ro

sado caracterstico puede desaparecer.
30 Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por
duplicado).
PROCEDIMIENTOS DE MTODOS DE ANLISIS DE AUMENTOS 101
6. Confirmacin:
Elegir al azar 5 colonias de presuntos Bacillus cereus de cada placa seleccionada (si hay
menos de 5 elegirlas todas) y sembrar
Por picadura en los tubos de AG, regenerado (10 min en agua hirviendo).
Por emulsin en tubos de MR-VP.
Por emulsin en tubos de MN a 30C (1C.
Incubar a 30C (1C durante 24 h (+ 24 h para MR-VP).
7. Lectura:
AG:
Interpretacin: Positivo cuando aparece coloracin amarilla.
MR-VP:
Transferir de cada tubo 1 mL de cultivo a un tubo vaco.
Aadir 0,2 mL de solucin de hidrxido de potasio, 0,6 mL de solucin de (-naftol y al
gunos cristales de creatina.
Mezclar enrgicamente y dejar reposar durante 1 h.
Interpretacin: Una coloracin rosa eosina en la superficie del tubo indica reaccin posi
tiva.
MN:
Aadir a cada tubo de 0,2 a 0,5 mL de reactivo completo para la investigacin de nitritos.
Interpretacin: Consideramos nitritos (si aparece una coloracin roja. Generalmente la re
accin es instantnea; si no aparece coloracin roja en 15 minutos, aadir zinc en polvo, y si
a los 10 minutos no se colorea, consideramos la prueba positiva.
8. Interpretacin de las pruebas bioqumicas: Bacillus cereus es:
Manitol en MYPA
Lecitina en MYPA 0
Glucosa 0
Voges-Proskauer 0
Nitritos 0
Si al menos un 80% de las colonias seleccionadas son confirmadas, tomar como nmero
de Bacillus cereus el obtenido en el recuento (ver punto 5). En los dems casos, se calcu
la el porcentaje de los confirmados entre los seleccionados.
Ea
N = ----------------
(/i, + 0 ,l-/i2)-d

102 M TO D O S DE A NLISIS M ICRO BIO L GICOS DE A LIM E N TO S
M TO D O H O RIZO N TA L PARA EL RECUENTO

DE Bacillus cereus
PN T - AL - 017 B asado en la norm a ISO 7932 (Enero 1994)
1 mL 1 mL 1 mL
DIA 1
O
M uestra lquida 10 o-1 io-2 io-3
D ilu cin madre (1 0 _l) (io-2) (io-3) (o-*)
o
i
0 ,1 m L 0,1 m L 0,1 mL 0,1 mL
MYPA
10 10-' 10-2 10~3

(10-') (10-2) (10-3) (10-4)
Incubar a 30C 1C durante 18 h-24 h (+ 24 h si es necesario)
DIA 2
<>
f v v S I C*S5l
10 10- ' 10-2 10 -3
(10-) ( 10- 2) ( 10-3) (10-4)
Contar las colonias de presuntos B. cereus
r ~~ i
e
Elegir al azar 5 colonias presuntas de cada placa y sembrar en:
\MR-VP AG (regenerado) MN (a 308C 1C)

Incubar a 30C 1C durante 24 h (+ 24 h para MN-VP)
DIA 3
1 mL
VP 0 si aparece
+ reactivos
11
AG 0 si aparece
e + reactivos
Nitritos 0 si aparece
coloracin roja o si
coloracin rosa coloracin amarilla despus de aadir Zn
no se colorea
Retener las placas que contengan un mximo de 150 colonias caractersticas y no carac
tersticas al nivel de dos diluciones sucesivas (una placa debe contener un mnimo de 15
colonias caractersticas).
Calcular el nmero N de Enterobacteriaceae identificadas (oxidasa y glucosa ) me
diante la expresin:
Calcular el nmero N de Enterobacteriaceae identificados presentes en la muestra pro

blema, como media ponderada a partir de dos diluciones sucesivas, con la expresin:
Xa
N
1,1 d

PROCEDIMIENTOS DE M TODOS DE ANLISIS DE A U M E N TO S 79
MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIN

PN T - A L - 009 B asad o en la norm a N F V 08-054 (O ctu b re 1993)
1 mL 1 mL 1 mL
0 0 0
O O OO
1 mL 1 mL 1 mL I mL
10 10-1 10-2 10 3
(10-') (10-2) (10-3) (10-1)
Verter 15 mL de VRI5G a 45C-47C
Cubrir con unos 5 mL de VRBG
Recuento
m m
Ka& &)
10 10* io-2 103

(10-1) (102) (io-3) ( 10 4)
Contar las colonias de presuntas Enterobacteriaceae
I
Tomar 5 colonias caractersticasde cada placa y sem brar en AN

80 MTODOS DE ANLISIS MICRO BIOLGICOS DE AUMENTOS

TECNICA DEL NMP
PNT - AL - 010 Basado en la norma ISO 4831 (Jnlio 1991)
1. Definicin:
Coliformes: Bacterias que a 30C son capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas
cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
Caldo de triptona lauril sulfato (TSL).
Caldo lactosado biliado verde brillante (BGBL).
3. Siembra:
Sembrar 10 mL de muestra lquida o O mL de dilucin madre en tres tubos de TSL a do
ble concentracin.
Sembrar 1 mL de la muestra lquida o 1 mL de dilucin madre en tres tubos de TSL a sim
ple concentracin.
Repetir esta operacin con las siguientes diluciones decimalesI5.
Incubar a 30C 1C durante:
24 h 2 h en tubos de concentracin doble.
2 4 h 2 h 4 8 h 2 h e n tubos de concentracin simple.
Realizar lecturas al cabo de 24 h y 48 h .
4. Confirmacin:
Retener los tubos que presentan formacin de gas.
A partir de cada tubo con gas, sembrar con asa de Kolle en BGBL.
Incubar a 30C 1C, realizando lecturas al cabo de 24 h 2 h (+ 24 h si es necesario).
Consideramos la reaccin positiva si se produce desprendimiento de gas.
5. Expresin de resultados16z
Contar el nmero total de tubos con produccin de gas.
Retener 3 diluciones, segn el caso:
a) Cuando al menos una dilucin presenta 3 tubos positivos, elegir la ms diluida que
presente los 3 tubos positivos y las dos diluciones siguientes con tubos positivos.
b) En caso contrario, elegir las tres diluciones ms diluidas que contengan al menos un
tubo positivo.
Determinar el NMP con la ayuda de una tabla.
15 Realizar un nmero de diluciones suficiente para que todos los tubos de la ltima dilucin sean ne
gativos.
PROCEDIMIENTOS DE MTODOS DE ANLISIS DE ALIM ENTOS 81
M TO DO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES.

TCNICA DEL NMP
1 mL 1 mL 1 mL
Muestra lquida 10 10-' 10-2 io-3

Dilucin madre (10"')
1 mL 1 mL
(io-2)
1 mL
oo
(lo-3)
1 mL
TSL a simple concentracin
(l< n
1 mL
TSL a doble
concentracin
A 10J101 0 A
10
10) A
10- '
00 A IQJ
o-2
IQJIQJIJ
10-3
(o-1) (IO-2) (10-3) ( 10- )
Incubar a 30C 1C durante 2 4 h 2 h ( + 2 4 h s i e s necesario)
Sembrar a partir de los tubos con gas en BGBL
V 0
10
A. JIQJ I0JIQJI0J IJIJ
10-' 10-2 IO-3
(10-') (10-2) (10-3) (10-)
Incubar a 30C 1C durante 24 h 2 h (+ 24 h si es necesario)
Contar el nmero de tubos con produccin de gas

Determinar el NMP
* Introducir el asa dos veces, sin agitar.

MTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENCO

DE Bacillus cereus
PN T-A L-018 Basado en la nonnaXPV 08-058 (Nortembre 1995)
1. Definicin:
Bacillus cereus: Microorganismos lecidnasa que no fermenta*1 el manitol cuando el en
sayo se realiza segn el siguiente mtodo.
Agar manitol yema de huevo con polimixina (MYPA).
Agar sangre (AS).
Agar movilidad (AM ).
3. Siembra:
Sembrar 0,1 mL de muestra lquida o 0,1 mL de dilucin mad* en una placa de MYPA.
Extender con asa d e Drigalski.
Repetir la operacin con las siguientes diluciones decimales 3*~
Tapar y dejar absorber durante unos 15 min a T ambiente.
Incubar a 30C 1C durante 18 h - 24 h (+ 24 h si es necesa10)-
4. Recuento:
Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 dilu
ciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga m mnimo de 15 colonias
caractersticas.
Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosad38*<lue no fermentan ma
nitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado).
NOTA: Si las placas contienen un gran nmero de microorganismo * el color ro

sado caracterstico puede desaparecer.
5. Confirmacin:
Elegir al azar 3 colonias de presuntos Bacillus cereus de cada p*30seleccionada (si hay
menos de 3, elegirlas todas) y sembrar
Estras paralelas en AS (prueba de la hemlisis)
Por picadura en AM (prueba de la movilidad) ^
32 Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o e11tres placas d e^ m m .
33 La movilidad se pone en evidencia por el desarrollo bacteriano a lo largo tubo y 611punoiaad a
partir del punto de picadura.
104_______________ MTgBBB M ANALI8I9 MICROBIOLGICOS DE ALIMENTOS
6, Interpretacin:
Bacillus cereus presenta las siguientes caractersticas:
M edio Resultados confirmando

de cultivo Bacillus cereus
MYPA Formacin de colonias tpicas
Agar sangre Bacillus cereus es muy hemoltico
Agar movilidad Bacillus cereus es mvil
7. Expresin de resultados M:
Si al menos un 80% de las colonias seleccionadas son confirmadas, tomar como nmero de
Bacillus cereus el obtenido en el recuento (ver punto 5). En los dems casos, se calcula el
porcentaje de los confirmados entre los seleccionados.
Calcular el nmero a de Bacillus cereus presentes con la expresin:
* = A .C
A
De las placas con menos de 150 colonias, calcular el nmero N de colonias de Bacillus ce
reus por mililitro o por gramo con la expresin:
N --------
(n, + 0,1 */i2) d


DE Bacillus cereus
PNT - A L - 018 Basado en la norm a X P V 08-4158 (N oviem bre 1995)
1 mL 1 mL 1 mL
Muestra lquida 10 10"1 10"2 io-3

Dilucin madre (10-1) (102) (103) do-)
0,1 mL
&
0,1 mL
O
0,1 mL
'O
0,1 mL
MYJPA
10 10 10-2 10-3
(10-') (10-2) (10-3) (10-4)
Incubar a 30C 1C durante 18 h-24 h (+ 24 h si es necesario)
10 10- 10-2 10-J

(10 (10-3) (lo*)
Contar las colonias de presuntos B. cereus
Elegir al azar 3 colonias presuntas de cada placa y sembrar en:
v-/
T
AS AM

106 M TODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIM ENTOS
M TO DO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO

DE Clostridium perfringens.
PNT - A L - 019 Basado en la norm a E N 13401 (A bril 1999)
1. D efinicin:
Clostridiwn perfringens: Bacterias que forman colonias caractersticas (rodeadas de un
halo negro) en el m edio selectivo especificado, y que dan reacciones de confirmacin posi
tivas cuando el ensayo se realiza segn el siguiente m todo.
Agar triptona-sulfito con cicloserina (TSC).
M edio tioglicolato (TIO).
M edio lactosa sulto (LS).
3. R eactivos:
M etabisulfito sdico al 1,2%.
Citrato frrico amoniacal al 1%.
4. Siem bra:
Sembrar por duplicado 1 mL de muestra lquida o 1 mL dilucin madre en placas Petri es
triles.
Repetir la operacin con las siguientes diluciones decim ales.
Verter en cada placa unos 15 mL de TSC a 47C 0 ,5 C 35.
M ezclar el inculo con el m edio y dejar que solidifique.
Aadir 10 mL del m ism o m edio y dejar solidificar.
Incubar a 37C 1C durante 20 h 2 h en jarras para anaerobios.
5. R ecuento:
En las placas que contengan m enos de 150 colonias, contar las colonias negras de pre
suntos Clostridium perfringens, si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Es nece
sario que al menos una placa contenga un mnimo de 15 colonias.
6* C onfirm acin:
Elegir al azar 5 colonias caractersticas de cada placa seleccionada (si hay menos de 5 ele
girlas todas) y sembrar con pipeta Pasteur en m edio TIO regenerado (10 minutos en
agua hirviendo).
Incubar a 37C 1C durante 18 h - 24 h en jarras para anaerobios.
Transferir 5 gotas al medio LS regenerado (10 minutos en agua hirviendo).
Aadir 0,5 mL de cada uno de los reactivos (recin preparados).
Incubar en un bao de agua a 46C 0,5C durante 18 h - 24 h.
35 Entre la siembra y esta operacin no deben transcurrir ms de 15 minutos.

7. Lectura:
Considerar positivos los tubos que presentan ms de '/4 de gas en la campana Durham y que
tengan un precipitado negro.
NOTA: En caso de duda, transferir 5 gotas del cultivo en el medio LS a otro tubo con el
mismo medio. Incubar a 46C 0,5C durante 18 h - 24 h en un bao de agua e interpretar
segn lo descrito.
8. Interpretacin:
Consideramos que las bacterias que forman colonias negras caractersticas en el medio
TSC y que se confirman positivamente en el medio LS son Clostrdium perfringens.
9. Expresin de resultados
Calcular el nmero a de colonias de Clostrdium perfringens presentes con la expresin:
De las placas con menos de 150 colonias, calcular el nmero N de colonias de Clostrdium
perfringens por mililitro o por gramo con la expresin:
la
N
{n{ + 0 , l / i 2) d

108 MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIM ENTOS
M T O D O H O R IZO N T A L PA R A EL RECUENTO
D E Clostridium perfringens .
PN T - AL - 019 B asado en la norm a EN 13401 (A bril 1999)
1 mL 1 mL 1 mL
o o
Dilucin madre (10~!) (10-2) (10-3) ( 10^ )
1 mL
01 mL 1 mL
' O
1 mL
'
10 lo-' I0-2 10-3

(10-') (1(H) ( 10-3) (10-*)
En menos de 15 min, verter 15 mL de TSC a 47C 0,5oC
Cubrir con 10 mL de TSC
Incubar a 37C 1C durante 20 h 2 h enjarras para anaerobios
FF-
10 10-' 10-2 io-3

(10-') (10-2) (10-3) (o -1)
Contar las colonias negras
c
FF~
Elegir 5 colonias de cada placa y sembrar en medio TIO regenerado
\ BBBBB
Incubar a 37C 1C durante 18 h-24 h en jarras para anaerobios
FF7
Transferir con pipeta Pasteur 5 gotas al medio LS regenerado
reactivos
Incubar a 46C 0,5C durante 18 h-24 h en un bao de agua


D Clostrdium perfringens.
PNT - AL - 020 Basado en la norma NF V 08-056 (Abril 1994)
1. Definicin:
Clostrdium perfringens: Bacterias que forman colonias negras en el medio selectivo espe
cificado y .qu dan reacciones de confirmacin positivas cuando el ensayo se realiza segn el
siguiente mtodo.
Agar triptosa-sulfito con cicloserina (TSC).
Medio tioglicolato (TIO).
Medio lactosa sulfito (LS).
3. Reactivos:
Metabisulfito sdico al 1,2%.
Citrato frrico amoniacal al 1%.
4. Siembra:
Verter en cada placa unos 15 mL de TSC a 47C (0,5C)37.
Aadir unos 10 mL del mismo medio y dejar solidificar.
Incubar a 37C 1C durante 20 h 2 h en jarras para anaerobios.
5. Recuento:
En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar las colonias negras de pre
suntos Clostrdium perfrngenSi si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Es nece
sario que al menos una placa contenga un mnimo de 15 colonias.
6. Confirmacin:
Elegir al azar 3 colonias caractersticas de cada placa seleccionada y sembrar con pipeta
Pasteur en medio TIO regenerado (10 minutos en agua hirviendo)38.
Incubar a 37C 1C durante 20 h 2 h enjarras para anaerobios.
Transferir 5 gotas al medio LS regenerado (10 minutos en agua hirviendo).
Aadir 0,5 mL de cada uno de los reactivos (recin preparados).
Incubar en un bao de agua a 46C 0,5C durante 24 h 2 h.
37 Entre la siembra y esta operacin no deben transcurrir ms de 15 minutos.

38 Si no es posible seleccionar colonias caractersticas bien aisladas, sembrar 3 grupos de colonias en el
medio TIO. Incubar en anaerobiosis a 37C 1C durante 20 h 2 h y aislar en placas con TSC (ver punto
3). Escoger de cada placa al menos una colonia caracterstica aislada y confirmar.
7. Lectura:
Considerar positivos los tubos que presentan ms de 1/3 gas en la campana Duitiam y que
tengan un precipitado negro.
NOTA: En caso de duda, transferir 5 gotas del cultivo en el medio LS a otro tubo con el
mismo medio. Incubar a 46C 0,5C durante 18 h - 24 h en un bao de agua e interpretar
segn lo descrito.
8. Interpretacin:
Consideramos que las bacterias que forman colonias negras caractersticas en el medio
TSC y que se confirman positivamente en el medio LS son Clostridium perfringens.
Calcular el nmero a de colonias de Clostridium perfringens por mililitro o por gramo con
la expresin:
De las placas con menos de 150 colonias, calcular el nmero N de colonias de Clostridium
perfringens por mililitro o por gramo con la expresin:
N= *
1,1'd
30 Consultar el PNT - A L - 002 de expresin de resultados.


DE Clostridium perfringens .
PNT - AL - 020 Basado en la norma NF V 08-056 (Abril 1994)
1 mL 1 mL 1 mL
Dilucin madre (10-1) (10-2) (io-5) (10-*)

Qr
1 mL 1 mL
01 mL
O
1 mL
10 10- io-2 10-3

oo-1) (io-2) (io-3) (fr4)
En menos de 15 min, verter 15 mL de TSC a 47C 0,5C
Cubrir con 10 mL de TSC
Incubar a 37C 1C durante 20 h 2 h en jarras para anaerobios
10 10- ' 10-2 10

-
(10-1) ( 10-2) ( 10-3) ( 10^)

Contar las colonias negras
Elegir 3 colonias de cada placa y sembrar en medio TIO regenerado
Incubar a 37C 1C durante 20 h 2 h en jarras para anaerobios
Transferir con p peta Pasteur 5 gotas al medio LS regenerado
0 0 0 + reactivos
Incubar a 46C 0,5C durante 24 h 2 h en un bao de agua
\7
112 M TO D O S DE ANLISIS MICROBIOLG1COS DE ALIMENTOS
M T O D O H O R IZ O N T A L PA R A L A IN V ESTIG A C I N
D E Salm onella
P N T - A L - 021 B asado en la norm a ISO 6579 (D iciem bre 1993)
1. D efinicin:
Salmonella: M icroorganismos que forman colonias caractersticas en los m edios selectivos
especificados, y que tienen las caractersticas bioqumicas y serolgicas descritas cuando el
2. M edios de cu ltivo:
A gua de peptona tamponada (APT).
Caldo con verde de malaquita y cloruro de m agnesio o de Rappaport-Vassiliadis m odifi
cado (RV).
Caldo selenito-cistina (SC).
Agar rojo fenol y verde brillante (BG A).
M edio Hektoen (HK).
Agar nutritivo (A N ).
Agar K ligler.
Agar nutritivo sem islido (A N S).
3. R eactivos:
Solucin salina (SS).
R eactivo para la investigacin de la jS-galactoxidasa (ONPG).
Solucin de fenilalanina al 0,5% (FA).
Solucin de cloruro frrico al 10%.
Galeras miniaturizadas de orientacin e identificacin bioqum ica (API).
4. Sueros:
Antisueros polivalentes O , V y H.
5. Siem bra:
Pre-enriquecim iento:
Preparar la dilucin madre aadiendo 225 mL de APT a 25 mL o 25 g de muestra.
Enriquecimiento:
Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con 10 mL de RV.
Sembrar 10 mL del cultivo en un fiasco con 100 mL de SC.
Incubar el tubo de R V a 42C 1C durante 24 h 2 h.
Incubar e l fiasco de SC a 37C 1C durante 24 h 2 h (4-24 h si es necesario).
Aislam iento 40:
A islar en placas de BG A a partir de cada tubo de RV incubado durante 24 h 2 h.
Realizar la m ism a operacin en HK.
A islar en placas de BG A a partir de cada frasco de S C 4t incubado durante 24 h 2 h.
Realizar la mism a operacin en HK.
40 Si tras 20 h - 24 h de incubacin el crecimiento es dbil o no aparecen colonias tpicas de Salmonella,

incubar de nuevo las placas a 37C 1C durante 18 h - 24 h.
41 No agitar el frasco de SC.

Aislar en placas de BGA a partir de cada frasco de SC incubado durante 48 h 2 h.
Aislar en placas de HK a partir de cada irasco de SC incubado durante 48 h 2 h.
6. Confirmaciones:
Retener de cada aislamiento 5 colonias tpicas o sospechosas de Salmonella (si en algu
na placa hay menos de 5, elegirlas todas), que sobre BGA son incoloras o rosas, con un
halo rojo y sobre Hektoen son verde-azulado con un centro negro.
Sembrar en placas de AN.
Incubar a 37C 1C durante 18 h - 24 h42.
Pruebas bioqumicas:
KLIGLER
Sembrar las colonias seleccionadas en estra y por picadura.
Incubar a 37C IC durante 24 h 2 h. Consideraremos los siguientes resultados:
Base Amarillo Glucosa 0

Rojo o sin cambio de color Glucosa 0
Negro Formacin de HZS
Burbujas o fisuras Formacin de gas a partir de la glucosa
Pendiente Amarillo Lactosa 0
Rojo o sin cambio de color Lactosa 0
Interpretacin: Los cultivos tpicos de Salmonella responden a una pendiente roja

con o sin formacin de gas y base amarilla, con formacin de H2S en un 90% de los
casos43.
* INVESTIGACIN DE LA 0-GALACTOSIDASA
Emulsionar el cultivo en 0,25 mL de SS.
* Aadir 0,25 mL de ONFG.
Mezclar e incubar en a 37C 1C durante 24 h 2 h, haciendo lecturas al cabo de
'/2 h, 1 h, 2 h y 24 h.
Interpretacin: Cuando la reaccin es positiva aparece una coloracin amarilla.
NOTA 1: En caso de obtener un Kligler lactosa 0 o una /J-galactosidasa 0 que al mis
mo tiempo presente formacin de sufhdrico, sembrar en medio lisina-hierro para des
cartar as las salmonelas del grupo Illa y m b.
* INVESTIGACIN DE LA FENILALANINA DES AMINAS A
* Emulsionar el cultivo en 0,5 mL de APT.
* Aadir 0,5 mL de FA.
Mezclar e incubar en a 37C 1C durante 4 h.
Aadir una gota de cloruro frrico al 10%.
42 Si fuera necesario, volver a aislar en AN e incubar a 37C 1C durante 20 h - 24 h.

43 Existen algunas cepas de Salmonella lactosa . En este caso, una confirmacin preliminar de Sal
monella no debe basarse nicamente en los resultados obtenidos en el Kligler.
IR MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE A L I M EN TO S
Interpretacin: Cuando la reaccin es positiva aparece una coloracin verde espinaca,

mientras que cuando sta es negativa, el color que aparece es am arillo.
GALERA DE IDENTIFICACIN 44
Realizar una emulsin en SS.
Sembrar segn las indicaciones del fabricante.
Interpretacin: Comparar los resultados obtenidos con el p a tr n d colores y con
sultar el ndice analtico y/o el software APILAB PLUS.
Pruebas serolgicas:
* ELIMINACIN DE LAS CEPAS AUTO-AGLUTINABLES
Depositar una gota de SS sobre un portaobjetos.
Hacer una emulsin del cultivo sospechoso.
Remover durante 30 s - 60 s.
Interpretacin: La cepa es auto-aglutinable si se forman agrupam ientos irregulares, de
manera que no puede realizar la identificacin serolgica.
* ESTUDIO DE LOS ANTGENOS O y V
Hacer una emulsin del cultivo puro en una gota de cada uno d e los sueros polivalen
tes sobre un portaobjetos45.
En caso de no obtener un resultado positivo, hacer una em u lsin del cultivo puro en
una gota de antisuero V sobre un portaobjetos45.
Realizar las pruebas con los sueros monovalentes O correspondientes al suero po
livalente que ha dado positivo (segn tabla del proveedor).
Interpretacin: La reaccin se considera positiva si hay aglutinacin.
* ESTUDIO DE LOS ANTGENOS H
Sembrar una colonia pura no auto-aglutinable en ANS.
Hacer una emulsin del cultivo puro en una gota de antisuero H , sobre un portaob
jetos45.
7. Interpretacin de las pruebas bioqum icas:

Las colonias presuntivas de Salmonella presentan las siguientes caractersticas:
Kligler tpico.
FA .
/3-galatosidasa .
API segn perfil tpico.
NOTA 2: Salmonella Typhi no produce gas de glucosa. Las subespecies n a y IUb pueden
ser lactosa 0 o , pero son siempre )3-galatosidasa . Salm onella Paratyphi A da reac
cin negativa a la descarboxilacin de la L-lisina. A s que para e l estudio de estas cepas
puede ser til realizar pruebas bioqumicas complementaras.
44 La norma permite realizar todas las pruebas bioqumicas con una g alera miniatunzada (API).
45 Utilizar los sueros polivalentes y monovalentes uno despus del otro.
S. Interpretacin de las pruebas serolgicas:

Reacciones Auto-
Reacciones serolgicas Interpretacin
bioqumicas aglutinacin
Tpicas No Antgeno O, V o H positivo Salmonella
Tpicas No Negativo Posible Salmonella
Tpicas S No realizadas Posible Salmonella
No tpicas No Antgeno O, V^ o H positivo Posible Salmonella
No tpicas No Negativo No Salmonella
9- Confirmacin definitiva:
Las cepas consideradas como Salmonella o como posible Salmonella deben ser enviadas a
un centr especializado para la identificacin de este microorganismo y la determinacin
definitiva del serotipo.
19* Expresin de resultados:

Indicar la presencia/ausencia de Salmonella en 25 mL o 25 g de producto.
a 16 MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIMENTOS
M TODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIN

DE Salmonella
P N T - A L -021 Basado en la norma ISO 6579 (Diciembre 1993)
25 mL o 25 g de muestra
DA 1 225 mL de APT
DA 2
~ ^ y
0,1 mL 10 mL
10 mL de RV 100 mL de SC
Incubar a 42C 1C Incubar a 37C 1C
durante 24 h 2 h durante 24 h 2 h
(+24 h si es necesario)
DA 3
BGA HK BGA
ff HK
Incubar a 37C 1C durante 20 h-24 h (+24 h si es necesario)

DA 4
BGA HK

DA 5
FF
Elegir 5 colonias de cada placa
Sembrar en AN

DA 6
ff
PROCEDIMIENTOS DE M TODOS DE ANLISIS DE ALIM ENTOS 117

DE Salmonella
PNT - AL - 021 Basado en la norm a ISO 6579 (Diciembre 1993)
DIA 6 AGAR KLIGLER

DIA 7
INVESTIGACIN DE LA P-GALACTOSIDASA* INVESTIGACIN DE LA FENILALANINA

0,25 mL de ONPG 0,5 mL de FA
0,25 mL de SS 0,5 mL de SS
Incubar a 37C 1C, Incubar a 37C 1C

con lecturas al cabo de durante 4 h
'/2 h, 1 h, 2 h y 24 h
Aadir 1 gota de
cloruro frrico
DA 8
Si las pruebas de la p-galactosidasa y fenilalanina son , realizar un API
ELIMINACIN DE LAS ESTUDIO DE LOS ANTGENOS

CEPAS AUTOAGLUTINAB LES
o
durante 18 h-24 h
* Ver NOTA l,p g . 113

118 MTODOS D E ANLISIS MICROBIOLGICOS D E ALIM ENTOS
M TODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIN

DE Salmonella
PNT - AL - 022 Basado en la norma NF V 08-052 (Septiem bre 1993)
1. Definicin:
Salmonella: Microorganismos que forman colonias caractersticas en los m edios selectivos
especificados y que tienen las caractersticas bioqumicas y serolgicas descritas cuando el
Caldo con verde de malaquita y cloruro de magnesio o de Rappaport-Vassiliadis modifi
cado (RV).
Caldo selenito-cistina (SC).
Medio Hektoen (HK).
Agar Kligler.
3. Reactivos:
Solucin salina (SS).
Reactivo para la investigacin de la /3-galactoxidasa (ONPG).
Solucin de fenilalanina al 0,5% (FA).
Cloruro frrico al 10%.
Galeras miniaturizadas de orientacin e identificacin b i o q u m ic a (API).
4. Suero:
Antisuero O.
5. Siembra:
Pre-enriquecimiento:
Preparar la dilucin madre aadiendo 225 mL de APT a 25 mL o 25 g d e muestra (x mL
o x g de muestra + 9x mL de APT).
Enriquecimiento:
Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con 10 mL de RV.
Sembrar 2 mL del cultivo en un tubo con 20 mL de SC.
Incubar el tubo de RV a 42C 1C durante 18 h - 2 4 1.
Incubar el frasco de SC a 37C 1C 18 h - 24 h.
Aislamiento 46:
Aislar en placas de HK a partir de cada tubo de RV.
Aislar en placas de HK a partir de cada tubo de SC 47.
46 Si tras 20 h - 24 h de incubacin el crecimiento es dbil o no aparecen colonias tpicas de Salmonella,

incubar de nuevo las placas a 37C 1C durante 18 h - 24 h.
47 No agitar el frasco de SC.
6. Confirmaciones:
Retener de cada aislamiento 2 o ms colonias tpicas o sospechosas de Salmonella 48, que
en medio HK son de color verde-azulado, con o sin centro negro.
Pruebas bioqumicas:
* KLIGLER
Sembrar las colonias seleccionadas en estra y por picadura.
Incubar a 37C 1C durante 24 Jh 2 h. Consideraremos los siguientes resultados:

Rojo o sin cambio de color Glucosa
Negro Formacin de H2S
B urbujas o suras Formacin de gas a partir de la glucosa
Pendiente Amarillo Lactosa 0
Rojo o sin cambio de color Lactosa
Interpretacin: Los cultivos tpicos de Salmonella responden a una pendiente roja con
o sin formacin de gas y base amarilla, con formacin de H2S en un 90% de los casos49.
* INVESTIGACIN DE LA /3-GALACTOSIDASA
Emulsionar el cultivo en 0,25 mL de SS.
Aadir 0,25 mL de ONPG.
Mezclar e incubar en a 37C 1C durante 24 h 2 h, haciendo lecturas al cabo de
y2h, 1 h, 2 h y 24 h.
Interpretacin: Cuando la reaccin es positiva aparece una coloracin amarilla.
NOTA 1: En caso de obtener un Kligler lactosa 0 o una j3-galactosidasa 0 que al mis
mo tiempo presente formacin de sufhdrico, sembrar en medio lisina-hierro para des
cartar as las salmonelas del grupo Illa y Illb.
* INVESTIGACIN DE LA FENILALANINA DESAMINASA
Emulsionar el cultivo en 0,5 mL de APT.
Aadir 0,5 mL de FA.
Mezclar e incubaren a 37C 1C durante 4 h.
Aadir una gota de cloruro frrico al 10%.
Interpretacin: Cuando la reaccin es positiva aparece una coloracin verde espinaca,
mientras que cuando sta es negativa, el color que aparece es amarillo.
* GALERA DE IDENTTHCAaN50
Realizar una emulsin en SS.
Sembrar segn las indicaciones del fabricante.
Interpretacin: Comparar los resultados obtenidos con el patrn de colores y consultar
el ndice analtico y/o el software APILAB PLUS.
** Si fuera necesario, volver a aislaren AN e incubar a 37C 1C durante 20 h - 24 h.

49 Existen algunas cepas de Salmonella lactosa 0 . En este caso, una confirmacin preliminar de Sal-
monella no debe basarse nicamente en los resultados obtenidos en el agar Kligler.
50 La norma permite realizar todas las pruebas bioqumicas con una galera miniaturizada (API).
120 MTODOS DE ANLISIS MICRO BIOLGICOS DE ALIMENTOS
Pruebas serolgicas:
* ELIMINACIN DE LAS CEPAS AUTO-AGLUTINABLES
Depositar una gota de SS sobre un portaobjetos.
Hacer una emulsin del cultivo sospechoso.
Interpretacin: La cepa es auto-aglutinable si se forman agrupamientos irregulares, de
manera que no puede realizar la identificacin serolgica.
* ESTUDIO DEL ANTGENO O
Hacer una emulsin del cultivo puro en una gota/de antisuero O, sobre un portaob
jetos51.
7. Interpretacin de las pruebas bioqumicas:

Kligler tpico.
FA.
/3-galatosidasa .
API segn perfil tpico.
NOTA 2: Salmonella Typhi no produce gas a partir de glucosa. Las subespecies Da y HIb
pueden ser lactosa o , pero son siempre /3-galatosidasa . Salmonella Paratyphi A da
reaccin negativa a la descarboxilacin de la L-lisina. A s que para el estudio de estas ce
pas puede ser til realizar pruebas bioqumicas complementaras.
8. Interpretacin de las pruebas serolgicas:

Reacciones Auto-
Reacciones serolgicas Interpretacin
bioqumicas aglutinacin
Tpicas No Antgeno O positivo Salmonella
Tpicas No Negativo Posible Salmonella
Tpicas S No realizadas Posible Salmonella
No tpicas No Negativo No Salmonella
9. Confirmacin definitiva:
Las cepas consideradas como Salmonella o como posible Salmonella deben ser enviadas a
un centro especializado para la identificacin de este microorganismo y la determinacin
definitiva del serotipo.
10. Expresin de resultados:

Indicar la presencia/ausencia de Salmonella en 25 mL o 25 g de producto (x mL x g de
producto).
51 Utilizar los sueros poli y monovalentes uno despus del otro.


DE Salm onella
PNT - AL - 022 Basado en la norma NF V 08-052 (Septiembre 1993)
DIA 1 25 mL o 25 g de muestra
225 mL de APT

DA 2
~ ^ y
0,1 mL 2 mL
10 mL de RV
i
20 mL de SC
Incubar a 42C 1C Incubar a 37C 1C
durante 18 h-24 h durante 18 h-24 h
DIA 3
FFHK HK

DIA 4
Retener de cada medio 2 o ms colonias tpicas o sospechosas


DE Salmonella
PNT - AL - 022 Basado en la norma NF V 08-052 (Septiembre 1993)
AGAR KLIGLER
DAS Pruebas bioqumicas

DA 6
INVESTIGACIN DE LA -GALACTOSIDASA* INVESTIGACIN DE LA FENILALANINA

0,25 mL de ONPG 0^ mL de FA
0,25 mL de SS 0,5 mL de SS
Incubar a 37C 1C, con lecturas Incubar a 37C 1C durante 4 h

al cabo de lfi h, 1 h, 2 h y 24 h
Aadir 1 gota de cloruro frrico

DA 7
Si las pruebas de la p-galactosidasa y fenilalanina son 0 , realizar un API
DIA 8
Pruebas serolgicas
I ELIMINACIN DE LAS ESTUDIO DE LOS ANTGENOS

CEPAS AUTOAGLUTINABLES
* Ver NOTA 1, pg. 119


DE Listeria monocytogenes
PNT - AL - 023.1 Basado en la norma ISO 11290-1 (Diciembre 1997)
1. Definicin:
Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias caractersticas en los medios
selectivos especificados y que poseen las caractersticas bioqumicas, morfolgicas y fisio
lgicas descritas cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
Caldo Fraser semi (FS).
Caldo Fraser completo (FC).
Agar OXFORD.
Agar PALCAM.
Agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA).
Agar sangre (AS).
Caldo para la utilizacin de los glcidos (ramnosa y xilosa).
Agar movilidad (AM).
3. Reactivos:
Solucin de perxido de hidrgeno.
Suplemento para el medio Fraser semi.
Suplemento para el medio Fraser completo.
4. Cepas:
Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923).
Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939).
5. Siembra:
P re-enriquecimiento:
Preparar la dilucin madre aadiendo 225 mL de FS a 25 mL o 25 g de muestra (x mL x g
de muestra + 9x mL de medio).
Enriquecimiento:
Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con FC.
Aislamiento:
Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar OXFORD.
Sembrar'el cultivo de pre-enriquecimiento en agar PALCAM.
Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar OXFORD.
Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar PALCAM.
NOTA 1: En agar OXFORD, al cabo de 24 h de incubacin, las colonias de Listeria sp son

pequeas, de color grisceo, rodeadas de un halo negro. Despus de incubar 24 h ms, do
blan su tamao, se vuelven ms oscuras, a veces con reflejos verdosos, apareciendo un halo
negro y una depresin central.
124 MTODOS DE ANLISIS MICRO BIOLGICOS DE ALIMENTOS
En agar PALCAM, al cabo de 24 h de incubacin, las colonias de Listeria sp. son pequeas,
de color verde con reflejos grisceos, eventualmente con un centro negro y siempre rodeadas
de un halo negro. Despus de incubar 24 h ms, aparece una depresin central.
6. Confirm acin de Listeria sp:

A partir de cada placa incubada, tomar 5 colonias presuntivas de Listeria sp. (si una placa
tiene menos de 5 colonias, retenerlas todas).
Aislar en TSYEA.
Incubar a 37C 1C durante 18 h - 24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactorio)52.
NOTA 2: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeas, convexas, inco
loras, translcidas y con bordes regulares.
Prueba de la catalasa:
Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA.
Coloracin de Gram:
Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeos y finos bacilos Gram 0 .
Examen de movilidad53:
Sembrar por picadura una colonia en AM.
Incubar a 25C 1C durante 48 h (+ 3 das si es necesario).
Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son mviles y dan un cultivo
tpico en forma de sombrilla.
7. C onfirm acin de Listeria m onocytogenes:

Investigacin de la hemolisis:
Sembrar por picadura en AS una colonia aislada en TSYEA.
Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (Listeria inno
cua).
Examinar con luz blanca. Listeria monocytogenes presenta una estrecha zona de clara y li
gera /3-hemlisis.
Utilizacin de glcidos:
Sembrar en xilosa y ramnosa una colonia aislada en TSYEA.
Incubar a 37C 1C durante 5 das. La reaccin es positiva si aparece una coloracin
amarilla.
Test de CAMP:
Sembrar en paralelo en AS las cepas de Rhodococcus equi y de Staphylococcus aureus.
Sembrar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control (.Listeria mo
nocytogenes y Listeria innocua).
NOTA 3: La reaccin es positiva si hay un aumento de la zona de /3-hemlisis en la inter

seccin de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.
52 En caso necesario, realizar el test de iluminacin de Henry. Listeria sp. aparece de color azulado con
una superficie granulada.
53 Si se observa al microscopio, Listeria sp. aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en for
ma de voltereta.
8. Interpretacin:
Todas las Listeria sp. se presentan como pequeos bacilos Gram , mviles, catalasa 0 .
Listeria monocytogenes se diferencia de las dems especies por las caractersticas siguientes:
Produccin cido CAMP test

Especie Hemolisis
Ramnosa Xilosa S. aureus R. equi
L. monocytogenes + + - + -
L. innocua - V - - -
L. ivanovii + - + - +
L. seeligeri (+) - + (+) -
L. welshimeri - V + - -
L. grayi - - - - -
siendo:
* V: reaccin variable
* (+): reaccin dbil
* +: reaccin positiva en ms del 90%
* : ausencia de reaccin

Pre-enriquecimiento
25 mL o 25 g de muestra
225 mL de FS
/] DM + suplemento (x mL)
X
<F \7 Enriquecimiento
e
O Jm L
+0,1 mL de suplemento
Agar OXFORD A gar PALCAM FC

Incubar a 3 7C 1C Incubar a 37C 1C
durante 24 h 2 h (+24 h si nec.) durante 48 h 2 h
Aislamiento
Agar OXFORD Agar PALCAM

Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h (+24 h si es necesario)
Confirmacin del gnero

Sem brar 5 colonias de cada placa en TSYEA
PRUE LA CATALASA MOVILIDAD COLORACIN GRAM
0
AM
/V />
c
'O
AM: Incubar a 25C 1C durante 48 h (+3 das si es necesario)
[------7"~' == = = = = =..:...= = =
1 3
O
Confirmacin de la especie ^ <L>
-o
INVESTIGACIN HEMOLISIS UTILIZACIN GLCIDOS TEST CAMP
O.
T<D
D
<L)
W)
AS Ramnosa Xilosa AS
Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h (+4 h das para glcidos)
V
Lectura
METODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO

1. Definicin:
Listeria monocytogenes'. Microorganismos que forman colonias caractersticas en los me
dios selectivos especificados y que poseen las caractersticas bioqumicas, morfolgicas y
fisiolgicas descritas cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
Agar PALCAM.
Agar sangre (AS).
3. Reactivo:
4. Cepas:
Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923).
Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939).
5. Siembra:
Preparar la dilucin madre aadiendo 100 mL de APT a 10 mL o 10 g de muestra ( r mL
o x g de muestra + 9x mL de medio).
Dejar en reposo durante 1 h 5 min.
Sembrar por duplicado 0,1 mL de la dilucin madre en agar PALCAM.
Repetir esta operacin con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decim ales54.
Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h (+ 18 h - 24 h si es necesario).
6. Recuento:
Contar las colonias que, tras 24 h de incubacin, sean pequeas, de color grisceo y ro
deadas de un halo negro. Despus de incubar 24 h ms, las colonias son mayores, even
tualmente con reflejos verdosos y con una depresin central.
Retener las placas con menos de 150 colonias caractersticas, si es posible al nivel de dos
diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mnimo de 15 co
lonias.
54 Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 10 mm o en tres placas d 90 mm (por
duplicado).
128 M TO D O S DE A N LIS IS M IC RO BIO L G ICO S DE ALIM ENTOS
7. Confirmacin de Listeria sp.:

Tomar cinco colonias presuntivas de Listeria sp. de cada placa retenida y sem brar por se
parado en placas de TSYEA.
Incubar a 37C 1C durante 18 h - 24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactorio) 55.
N O TA : En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeas, convexas, inco
Coloracin de Gram:
Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeos y finos bacilos Gram 0 .
Examen de m ovilidad56:
Incubar a 25C 1C durante 48 h 3 das.
Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son mviles y dan un culti
vo tpico en forma de sombrilla.
8. Confirmacin de Listeria m onocytogenesi

Sem brar por picadura en AS una colonia aislada en TSYEA.
Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (,Listeria in
nocua).
Exam inar con luz blanca. Listeria mococytogenes presenta una estrecha zona de clara y
ligera /3-hemlisis.
amarilla.
Test de CAMP:
Sem brar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control (Listeria
monocyto genes y Listeria innocua). La reaccin es positiva si hay un aumento de la zona
de /Lhemlisis en la interseccin de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.
9. Interpretacin:
Todas las Listeria sp. se presentan como pequeos bacilos Gram 0 , mviles, catalasa 0 .
Listeria monocytogenes se diferencia de las dems especies por las caractersticas descritas
en la tabla del PNT-AL-023.1.
56 Si se observa al m icroscopio, Listeria sp aparece com o bacilos finos y cortos, con m ovilidad en for
ma de voltereta.
PROCEDIMIENTOS DE MTODOS DB ANALISIS DB ALIMBNTOS 1 ||
E xpresin de resultados57:
Calcular el nmero a de colonias de Listeria monocyto genes presentes con la expresin:
a = * C
A
D e las placas con menos de 150 colonias, calcular el nmero N de colonias de Listeria
monocytogenes por mililitro o por gramo con la expresin:
Xa
N = -------------------------------------
V (j + 0,1 n2) d
Consultar el PNT - AL - 002 de expresin de resultados.

M T O D O H O R IZO N TA L PARA EL RECUENTO

PNT - AL - 023.2 Basado en la norm a ISO 11290-2 (Diciembre 1998)
25 m L o 25 g de muestra
DIA 1 225 m L de FS
T!
DM
D ejar en reposo durante 1 h 5 min
io-2
0,1 m L 0,1 m L
Agar PALCAM
Tapar y dejar absorber durante 15 min a T am biente

$ Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h (+18 h-24 h si es necesario)
DIA 2 $
Retener las placas con m enos de 150 colonias caractersticas
Sem brar 5 colonias de cada placa en TSYEA

DIA 3
PRUEBA DE LA CA TA LA SA M O V ILID A D CO LO R A C IO N GRAM c
.'2
'o
3
JO
3
r
AM: Incubar a 25C 1C durante 48 h (+3 das si es necesario) <L>
'<eLn>
IN V ESTIG A CI N H EM O LISIS* U TILIZA CION G LU CID O S* TEST CAM P* 3
O.
O
en
-o
c
<
CuU)
AS Ram nosa Xilosa AS
Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h (+4 h das para glcidos)

PNT - AL - 024 Basado en la norma NF V 08-055 (Diciembre 1993)
1. Definicin:
Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias caractersticas en los medios
selectivos especificados y que poseen las caractersticas bioqumicas, morfolgicas y fisio
lgicas descritas cuando el ensayo se realiza segn el siguiente mtodo.
Caldo Fraser semi (FS).
Caldo Fraser completo (FC).
Agar OXFORD.
AgarPALCAM.
Agar sangre (AS).
3. Reactivos:
Suplemento para el medio Fraser semi.
Suplemento para el medio Fraser completo.
4. Cepas:
Cepa de Rhodococcus equi (CIP 5869).
Cepa de Staphylococcus aureus (CIP 5710).
5. Siembra:
P re-enriquecimiento:
Preparar a dilucin madre aadiendo 225 mL de FS a 25 mL o 25 g de muestra (x mL o
x g de muestra + 9x mL de medio).
Enriquecimiento:
Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con FC.
Aislamiento58:
Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar OXFORD.
Sembrar en agar OXFORD el cultivo de enriquecimiento incubado durante 24 h.
Sembrar en agar OXFORD el cultivo de enriquecimiento incubado durante 48 h.
NOTA 1: En agar OXFORD, al cabo de 24 h de incubacin, las colonias de Listeria sp. son
pequeas, de color grisceo, rodeadas de un halo negro. Despus de incubar 24 h ms, do
blan su tamao, se vuelven ms oscuras, a veces con reflejos verdosos, apareciendo un halo
negro y una depresin central.
58 Segn el tipo de flora acompaante de las muestras, podemos sustituir el agar Oxford por agar
PALCAM.
132 M TO DO S DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIM ENTO S
6. Identificacin de Listeria sp.:

A partir de cada placa incubada, tomar 5 colonias presuntivas de ser Listeria sp. (si una
placa tiene menos de 5 colonias, retenerlas todas).
Sembrar en TSYEA.
Icubar a 37C 1C durante 18 h - 24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactorio)59.
NOTA 2: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeas, convexas, inco
Coloracin de Gram:
Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeos y finos bacilos Gram .
Examen de movilidad60:
Incubar a 25C 1C durante 48 h (+ 3 das si es necesario).
Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son mviles y dan un cultivo
tpico en forma de sombrilla.
7. Confirmacin de Listeria m onocytogenes:

Sembrar por picadura en AS una colonia aislada en TSYEA.
Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (Listeria inno
cua).
Examinar con luz blanca. Listeria mococytogenes presenta una estrecha zona de clara y li
gera /3-hemlisis.
amarilla.
Test de CAMP :
Sembrar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control (Listeria mo
nocytogenes y Listeria innocua).
NOTA 3: Considerar la reaccin positiva si hay un aumento de la zona de /Lhemlisis en la
interseccin de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.
60 Si se observa al microscopio, Listeria sp. aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en for
ma de voltereta.
8. Interpretacin:
Todas la Listeria sp. se presentan como pequeos bacilos Gram 0 , mviles catalasa 0 . Lis
teria monocytogenes se diferencia de las dems especies por las caractersticas siguientes:
Produccin cido CAMP test

Especie Hemolisis
Ramnosa Xilosa S. aureus R. equi
L . monocytogenes + + +
L. innocua V
L. ivanovii + + +
L. seeligeri (+) + (+)
L. welshimeri V +
L. grayi
siendo:
* V: reaccin variable
* O): reaccin dbil
* +: reaccin positiva en ms del 90%
* -: ausencia de reaccin
134 M TO D O S DE A N LIS IS M ICRO BIO L G ICO S DE A LIM E N T O S
M T O D O H O R IZ O N T A L PA RA LA IN V E S T IG A C IO N
DE L iste ria m o n o c y to g e n e s
PN T - AL - 024 B asado en la n o rm a N F V 08-055 (D iciem bre 1993)
Pre-enriquecim iento 25 m L o 2 5 g de muestra

DIA 1 225 m L de FS
DM su p lem en to (x m L )
Incu b ar a 30C 1C d u ra n te 24 h 2 h
DIA 2
Enriquecim iento
0,1 mL
+0,1 m L de sup lem en to
A gar O X F O R D FC
OI Incu b ar a 37C 1C Incu b ar a 37C 1C
DIA 3 durante 24 h 2 h* d u ran te 24 h 2 h* d u ran te 48 h 2 h*
DA 4
Aislamiento
A gar O X F O R D
Incu b ar a 37C 1C d u rante 24 h 2 h (+24 h si es necesario)
DIA 5
Confirmacin del gnero
S em b rar 5 colon ias de cada p laca en T S Y E A
Incu b ar a 37C 1C d u ran te 18 h-24 h
DIA 6
PRUEBA DE LA C A TA LA SA M O V ILIDA D COLORACION GRAM
T
AM e
o
o
AM : Incu b ar a 25C 1C d u ran te 48 h (+3 das si es necesario) cd
JD
I . _ .. i 3
L6 Confirmacin de la especie* <D o
INVESTIGACIN HEMOLISIS UTILIZACIN G LCIDO S TEST CAM P VU
Ou 3
B # 
W) 5
AS R am nosa X ilosa AS
Incubar a 37C 1C durante 24 h 2 h (+ 4 h das para glcidos)

DIA 6
.... ...
L ectura
PROCEDIM IENTO S DE M TODOS DE AN LISIS DE ALIMENTOS 135
M TO DO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIN

DE Campylobacter TERMOTOLERANTES
1. Definiciones:
Campylobacter termotolerantes: Microorganismos que forman colonias tpicas en me
dios selectivos slidos cuando se incuban a 42C y que poseen una movilidad caractersti
ca y las propiedades bioqumicas descritas cuando el ensayo se realiza segn el siguiente
mtodo.
Caldo de Park y Sanders.
Agar de Karmali (AK).
Agar Butzler modificado.
Caldo de Brucella (CB).
Agar de sangre Columbia.
Agar citrato de hierro tres azcares (TSI).
Agar de sangre M ueller Hinton.
3. Reactivos:
Sangre de caballo desfibrinada.
Solucin de antibiticos A.
Solucin de antibiticos B.
Solucin H20 2 al 3%.
Reactivo para la deteccin de la hidrlisis del hipurato.
Solucin de hipurato sdico.
Solucin de nihidrina al 3,5%.
Discos de cido nalidxico.
Discos de cefalotina.
4. Siembra:
Preparar la dilucin madre aadiendo 9x mL de caldo Park y Sanders a .v (g o mg) de
muestra.
Sembrar con asa en AK.
Sembrar con asa en agar Butzler modificado.
Incubar a 42C 1C en atmsfera microaerfila, inspeccionando al cabo de 48 h y 72 h
(+ 2 das si es necesario).
Pre-enriquecimiento 61:
Incubar la dilucin madre de caldo Park y Sanders durante 4 h a 32C 1C en atmsfe
ra microaerfila.
61 En ciertos casos, se puede sustituir el caldo Park y Sanders por caldo Preston. Ver norma ISO
10272.
136 M TO DO S DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIM ENTO S
Enriquecimiento:
Aadir la solucin antibitica B al 5%.
Incubar a 37C 1C durante 2 h y luego 40 h 2 h a 42C 1C en atmsfera microae-
rfila.
Aislamiento:
Sembrar el cultivo enriquecido en AK.
Sembrar el cultivo enriquecido en agar Butzler modificado.
Incubar a 42C 1C en atmsfera microaerfila durante 24 h (+ 4 das si es necesario).
NO TA : En AK las colonias de Campylobacter termotolerantes son grises, planas y hme
das, con tendencia a extenderse. En agar Butzler las colonias caractersticas pueden virar a
marrn y pueden tener distintos tamaos.
5. C onfirm acin:
Retener de cada medio 5 colonias caractersticas o sospechosas.
M orfologa y movilidad:
Hacer una tincin Gram de una colonia de cada placa y examinar al microscopio.
Emulsionar cada colonia de bacilos Gram 0 curvados en 1 mL de CB y observar la m o
vilidad; Campylobacter se mueve en forma de sacacorchos.
Sembrar las colonias que posean estas caractersticas en agar Columbia sangre e incubar
en atmsfera microaerfila a 42C 1C durante 24 h 2 h.
6. Identificacin
Crecimiento a 25C:
Sembrar con asa las colonias anteriores en CB.
Incubar a 25 C 1C durante 2-5 das en atmsfera microaerfila.
Examinar si hay crecimiento.
Pruebas bioqumicas:
PRUEBA DE LA OXIDASA
A G A R T SI
Sembrar en TSI las colonias seleccionadas.
Incubar a 42C (1C durante 24 h (+ 5 das si es necesario) en atmsfera microaerfila.
In terp reta ci n : Consideraremos los siguientes resultados:

Rojo o sin cambio de color Glucosa 0
Negro Formacin de H2S
Burbujas o fisuras Formacin de gas a partir de la glucosa
Pendiente Amarillo Lactosa 0 / Sacarosa 0
Rojo o sin cambio de color Lactosa 0 / Sacarosa 0
* PRUEBA DE LA CATALASA
* SENSIBILIDAD AL CIDO NALIXDICO Y A LA CEFALOTINA
Realizar una suspensin en CB de densidad 0,5 en la escala McFarland.
Diluir la suspensin 1:10 con el mismo caldo.
PROCEDIMIENTOS DE MTODOS DE A NLISIS DE ALIMENTOS 137
Inundar la superficie de una placa de agar Mueller Hinton al 5% de sangre con la sus
pensin.
Dejar en contacto durante 5 minutos y eliminar el exceso.
Secar las placas en la estufa a 37C 1C durante 10 minutos.
Colocar en la superficie del agar un disco de cido nalidxico (30 pg) y un disco de ce-
falotina (30 pg).
Incubar a 37C 1C durante 24 h 2h en atmsfera microaerfila.
Interpretacin: Consideraremos resistente la bacteria si hay crecimiento hasta el lmite
del disco y sensible si hay zonas sin crecimiento (zonas de inhibicin).
* DETECCIN DE LA HIDRLISIS DEL HIPURATO
Sembrar las colonias de bacilos Gram aisladas en tubo de hemolisis con 0,4 mL de
solucin de hipurato sdico.
M ezclar e incubar a 37C 0,5C durante 2 h en un bao de agua.
Aadir, sin mezclar, 0,2 mL de solucin de nihidrina en la superficie de la solucin de
hipurato sdico.
Incubar durante 10 minutos ms.
Interpretacin: Consideramos la reaccin positiva si aparece coloracin violeta oscuro.
7. Interpretacin de resultados:
Las colonias de Campylobacter sp. son:
Bacilos pequeos y curvados.
Con movilidad caracterstica.
Gram .
Oxidasa 0 .
Glucosa .
Lactosa 0 .
Sacarosa 0 .
Produccin de gas 0 .
Consideramos presencia de Campylobacter sp. si al menos una colonia presenta estas ca
ractersticas.
Caractersticas C .je ju n i C. coli C. lari C. upsaliensis

Crecimiento de 25C
H2S (Agar TSI)* (+)
cido nalixdico S S R S
Hidrlisis del hipurato +
Catalasa + + + o dbil
Cefalotina R R R S
Leyenda: +: positivo; : negativo; (+): dbilmente positivo; S: sensible; R: resistente
* Dbil produccin de H2S en el agua de condensacin al cabo de 5 das.
62 Consultar el PNT - A L - 002 de expresin de resultados.

M T O D O H O R IZO N TA L PARA LA IN V ESTIG A CI N

DE C am ylo b a cter T E R M O T O L ER A N TE S
PN T - AL - 025 Basado en la n o rm a ISO 10272 (E nero 1996)
AgOA- m L de m uestra
DIA 1 9x m L de caldo de Park y Sanders DIA 1
+ suplem entos
l
\7
Pre-enriquecim iento
AK Agar B utzler m odificado
Incubar a 42C 1C en atm . Incubar a 32C 1C en atm
m icroaerfila durante 48 h y 72 h m icroaerfila durante 4h
(+ 2 das si es necesario)
DIA 3 O
FF E nriquecim iento 7^^
A adir solucin antibitica B al 5%

Incubar a 37C 1C durante 2 h
DIA 3
Aislam iento FF
AK A gar Butzler m odificado

Incubar a 42C IC durante 24 h (+4 das si es necesario)
en atm sfera m icroaerfila
DIA 4 DIA 4
Seleccionar 5 colonias tpicas o sospechosas de cada placa

T incin G ram de cada colonia. E xam inar al m icroscopio
FF
E m ulsionar las colonias Gram 0 curvadas en 1 m L de CB
O bservar la m ovilidad. D ebe ser en form a de sacacorchos
F>
Sem brar estas colonias en Agar C olum bia sangre
Incubar a 42C 1C durante 24 h 2 h en atm sfera m icroaerfila
DIA 5 DIA 5
FF
Identificacin
DE Campylobacter TERMOTOLERANTES
CRECIMIENTO A 25C PRUEBA DE LA OXIDASA AGARTSI SENSIBILIDAD CIDO NALDCDICO HIDRLISIS DEL HIPURATO
Y CEFALOT1NA
PROCEDIMIENTOS
/ \
CB
i CB de densidad 0,5 10"' 0,4 mL hipurato sdico
DE MTODOS
Incubar a 25C1C 0 si en 10 s aparece Incubar a 42C Incubar en un bao a

en atm, microaerfila coloracin malva en atm. microaerfila $ 37C 0,5C durante 2 h
durante 2-4 das durante 24 h
(+5 das si es necesario)
O o
0,2 mL de solucin de
DE ANLISIS
Agar Mueller-Hinton
al 5% de sangre nihidrina en superficie
PRUEBA DELA CATALASA Dejar en contacto durante
5 min y eliminar el exceso o
Secar en estufa a Incubar 10 min ms
37C 1C durante 10 min
DE ALIMENTOS
0 si al cabo de 30 s
aparecen burbujas 0 si aparece
coloracin violeta
Colocar un disco de cido nalixdico (30 |ig)

y otro de cafalotina (30 fig)
139
Incubar a 25C 1C en atm. microaerfila durante 24 h 2 h

CAPTULO CUARTO
Procedimiento general de preparacin

de medios de cultivo (PNT - ME - 001)
PR O C ED IM IEN TO GENERAL DE PREPA RA CI N
PNT - ME - 001
DE M EDIOS DE CULTIVO
1. O BJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la preparacin de los

medios de cultivo necesarios para realizar los anlisis de alimentos y aguas.
2. M BITO DE APLICA CIO N
Se aplica a todos los medios de cultivo que se preparan en Microbiologa y se utilizan en los en
sayos que se realizan en el laboratorio.
3. REFERENCIAS
crobiolgicos.
Catlogos de las casas comerciales suministradoras.
* Documentos del Laboratorio de Microbiologa: Manual de Calidad y Procedimiento Ge
4. PR O CED IM IEN TO
Se redactar un PNT para cada uno de los medios de cultivo necesarios para realizar los ensa
yos de el laboratorio; en l se darn instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar su prepa
racin.
Estos procedimientos se denominan PNT - ME y constan de los siguientes apartados:
0. Cartula.
1. Finalidad de uso.
2. Principios.
3. Preparacin.
4. Composicin en g/1.
5. Controles del medio preparado.
6. Conservacin.
4.1. C artula
En la cartula deberemos indicar:
Nombre completo del medio de cultivo que se va a preparar, segn su denominacin en el

mtodo o el PNT - AL en el que se utiliza y, entre parntesis, las siglas con las que se le
conoce en el laboratorio.
Tipo y numero del PNT: PNT - ME - seguido por un nmero de tres cifras. Los procedi
mientos se han numerado segn el orden en el que aparecen en los PNT - AL.
143
144 M TODOS DE A N LISIS MICROBIOLGICOS DE ALIM ENTOS
4.2. Finalidad de uso
La finalidad de uso explica la utilidad del medio de cultivo en el ensayo en el que se utiliza.
4.3. Principios
En este apartado se explica, de manera resumida, la actividad del medio o de alguno de sus com
ponentes en el anlisis.
4.4. Preparacin
Se seala, de forma clara y concisa, cada uno de los pasos a seguir para preparar el medio de cul
tivo, indicando:
la cantidad de medio deshidratado necesario (en caso de no disponer de medio preparado,

figurar la frase disolver los ingredientes e indicaremos el tipo y cantidad de compo
nentes en el apartado composicin en g/1);
el tipo, volumen y, en caso necesario, la calidad del diluyente utilizado;
el modo de disolucin;
la cantidad de medio a repartir, indicando el tipo y volumen del recipiente;
si se esteriliza en autoclave, sealar el tiempo y temperatura; en caso contrario, indicar el
tipo y caractersticas del proceso de esterilizacin empleado;
en caso de aadir algn reactivo, indicar el momento de adicin, nombre de la sustancia y
cantidad, indicando tambin el nmero de PNT - RE - correspondiente (en caso de tratar
se de reactivos compuestos por distintas sustancias) o la referencia comercial (en caso de
reactivos simples);
todas las operaciones prticulares de cada medio (atemperar, dejar los tubos en posicin in
clinada...).
4.5. Composicin en g/1
Este apartado es una lista de cada uno de los ingredientes, indicando su nombre, calidad(si es ne
cesario) y cantidad exacta.
NO TA 1: Esta lista est elaborada a partir de las instrucciones del fabricante del medio uti
lizado en el laboratorio en el que se han redactado los PNT, de manera que se tendr que
adaptar, en cada caso, a las instrucciones del proveedor.
4.6. Controles del medio preparado
Estos controles se realizan para confirmar la calidad del medio de cultivo y constan de cuatro
pruebas *:
Control macroscpico (examen visual).

Control de pH.
Control de esterilidad.
Control de eficacia.
1 Estos controles se explican en el PNT - ME - 002 sobre control de calidad de m edios de cultivo.
PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO 146
En este apartado se exponen las caractersticas fsicas y de pH que debe reunir el medio pre
parado, indicando asimismo las cepas a ensayar y los caracteres a estudiar en el control de efi
cacia, basados principalmente en la morfologa y el color de las colonias y en las reacciones de
diferenciacin y selectividad.
4.7. Conservacin
Indicar, para cada tipo de recipiente utilizado, las condiciones de tiempo y temperatura necesarias
para la conservacin del producto en condiciones ptimas, de manera que su eficacia no se vea
alterada.
En aquellos medios de cultivo que se puedan alterar con la luz o la humedad, debern indi
carse estas condiciones particulares de almacenamiento.
NOTA 2: Cuando se indica que el medio de cultivo debe utilizarse inmediatamente, se per
mite que el producto se pueda emplear durante un periodo de 5 horas despus de su prepa
racin.
CAPTULO QUINTO
Procedimiento general de control de calidad

de medios de cultivo (PNT - ME - 002)
PNT MP m? PR O C E D IM IE N T O GENERAL DE CON TRO L
DE CALIDAD DE M EDIOS DE CULTIVO
1. O B JET O
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la realizacin de los con
troles de medios de cultivo.
2. AM BITO DE APLICA CION
Se aplica a todos los medios de cultivo que se preparan en Microbiologa y se utilizan en los en
sayos que se realizan en el laboratorio.
3. REFEREN CIA S
crobiolgicos.
4. PR O C ED IM IEN TO
Los medios de cultivo utilizados en los ensayos del laboratorio deben pasar unos controles, que
se especifican en el apartado 5 de su PNT - ME correspondiente.
En general se realiza:
Un control macroscpico.
Un control de pH a 25C.
Un control de esterilidad.
Un control de eficacia.
Los controles del medio se deben realizar el mismo da o como mximo al siguiente de su
preparacin.
4.1. C ontrol m acroscpico
El control macroscpico es un examen visual que se realiza en todos los casos para poder des
cartar cualquier error importante en la preparacin del reactivo. Se observa si su consistencia (l
quida o slida), su color y su aspecto (transparente, opalescente, con o sin precipitado...) co
rresponden con los que se indican en el PNT.
4.2. C ontrol de pH
Se realiza con un pHmetro una medicin del pH del medio a una temperatura de 25C; el valor
obtenido ha de corresponder con el indicado en el PNT correspondiente, donde se da un intervalo
de aceptacin de 0,2.
1 A r>
4.3. Control de esterilidad
Este control se efecta para comprobar que el medio de cultivo no est contaminado, cosa que lo
hara inadecuado para su finalidad.
Despus de incubar el medio (un 10% del lote preparado) a 30C 1C durante 72 h 4 h,
se observa su aspecto, transparencia, si hay turbidez o cambio en el color, si hay gas en la
campana de Durham... Se desechar el medio que presente alteraciones en alguno de estos ca
racteres.
En el caso de los medios no transparentes, realizar un subcultivo en un medio de cultivo no
selectivo (AN, PCA, TSA). Los medios destinados a controles de esterilidad debern incubarse
en su totalidad.
4.4. Control de eficacia
Este control se realiza para comprobar la eficacia del medio de cultivo, observando determinados
caracteres que el crecimiento de determinadas cepas (que se especifican en el PNT - ME co
rrespondiente) produce en el medio que se est controlando.
Se siembran tantas placas o tubos con medio de cultivo como cepas distintas se requieran
para el control y se incuban en las mismas condiciones de tiempo y temperatura que se necesitan
para el anlisis de alimentos o de aguas en que interviene el medio.
Despus de la incubacin se evalan las caractersticas dadas en el PNT - ME, observando
aspectos como el crecimiento y color de las colonias, eljcolor del medio, la formacin de preci
pitado o de gas, si hay o no halo...
CAPTULO SEXTO
Procedimiento de preparacin
de medios de cultivo
Il R E L A C I N D E M E D IO S D E C U L T IV O Y PN T - AL EN E L Q U E A PA R E C E N ||
M EDIOS ...... _ -JjS L a s T

003 PEPTONA SALINA ps TODOS
004 AGAR PARA RECUENTO PC A 003

004
(K)5 AGAR BLANCO 003

AB
004
006 AGAR GLUCOSA Y CLORANFENICOL CGA 005

006
(X)7 CALDO TAMPONADO CON BILIS, VERDE BRILLANTE CALDO 007,1

Y GLUCOSA EE 008
007.1
(X)8 AGAR BILIS CRISTAL VIOLETA Y GLUCOSA VRBG 007.2
008
009
007.1
007.2
009 AGAR GLUCOSADO AG 008
009
017
007.1
007.2
010 AGAR NUTRITIVO AN 008
009
021
022
011 CALDO NUTRITIVO CN
008
012 021
AGUA DE PEPTONA TAMPONADA APT
022
023.2
010
013 CALDO DE TRIPTONA LAURIL SULFATO TSL
013
014 CALDO LACTOSADO BILIADO VERDE BRILLANTE BGBL 010
AGAR LACTOSADO BILIADO AL CRISTAL VIOLETA 011
015 VRBL
Y ROJO NEUTRO 012
016 CALDO EC EC 013
017 AGUA DE TRIPTONA AT 013
018 AGAR CON TERGITOL-BCIG PTX 014
BP 015.1
019 MEDIO DE BAIRD-PARKER
016.1
BH1 015.1
020 CALDO CEREBRO-CORAZN
016.1
RPF 015.2
02! AGAR CON PLASMA DE CONEJO Y FIBRGENO
16.2
017
022 AGAR MANITOL YEMA DE HUEVO CON POLIMIXINA MYPA
018
023 MEDIO VOGES-PROSKAUER MR-VP 017
024 MEDIO NITRATO MN 017
154 M TO D O S DE A N LIS IS M ICRO BIO L G ICO S DE A L IM E N TO S
PNT-M M EDIOS SIGLAS PNT-AL
018
025 AGAR SANGRE AS 023.1
023.2
024
018
AM 023.1
026 AGAR MOVILIDAD
023.2
024
TSC 019
027 AGAR TRIPTONA-SULFITO CON CICLOSERINA
020
019
028 MEDIO TIOGLICOLATO TIO
0020
019
029 MEDIO LACTOSA SULFITO LS
020
CALDO CON VERDE DE MALAQUITA Y CLORURO DE RV 021
030 MAGNESIO O DE RAPPAPORT-VASSILIADIS MODIFICADO 022
021
031 CALDO SELENTO-CISTINA VSC 022
032 AGAR ROJO FENOL Y VERDE BRILLANTE BGA 021
021
033 HEKTOEN
022
021
034 AGAR KLIGLER
022
035 AGAR NUTRITIVO SEMISLIDO 021
FS 023.1
036 CALDO FRASER SEMI
024
FC 023.1
037 CALDO FRASER COMPLETO
024
023.1
038 AGAR OXFORD 024
023.1
039 AGAR PALCAM 023.2
024
023.1
040 AGAR TRIPTONA DE SOJA-EXTRACTO DE LEVADURA TSYEA 023.2
024
023.1
04! CALDO PARA LA UTILIZACIN DE LOS GLCIDOS 023.2
024
042 CALDO DE PARK Y SANDERS 025
043 AGAR KARMALI AK 025
044 AGAR BUTZLER MODIFICADO 025
045 CALDO DE BRUCELLA CB 025
046 AGAR DE SANGRE COLUMBIA 025
047 AGAR DE SANGRE MUELLER-HINTON 025
048 AGAR CITRATO DE HIERRO TRES AZCARES TSI 025
049 CALDO TRIPTONA DE SOJA TSB RE-004
PROCEDIMIENTO DE PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO 155
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIN

PN T-M E-003
DE LA PEPTONA SALINA (PS)
1. Finalidad de uso:
PS (Peptona Salina) es un diluyente que se utiliza para realizar la dilucin madre y los ban
cos de diluciones.
2. Principios:
Se trata de un medio no inhibidor que facilita la recuperacin de microorganismos estre-
sados.
3. Preparacin:
Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.
Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolucin.
Repartir:
9 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm. o
el volumen necesario, segn uso, en frascos de capacidad adecuada (uno de los dos).
Esterilizaren autoclave a 120Cdurante 15 min.
4. Composicin en g/1:
Peptona.......................................................................................................................... 1
Cloruro sdico................................................................................................................ 8,5
5. Controles del medio preparado:

Control macroscpico: Caldo de color amarillo claro, sin precipitado.
pH a 25C: 7,0 0,2.
Control de eficacia:
Microorganismo Crecimiento
histeria monocytogenes Bueno
Escherichia coli Bueno
6. Conservacin:
Fraseos..................... 6 meses a 2C-8C.
Tubos con sero-tapn 1 mes a 2C-8C.
156 M TO DO S DE ANLISIS MICROBIO LGICOS DE ALIM ENTO S
P R O C E D IM IE N T O PARA LA P R E P A R A C I N
PNT - ME - 004
DEL A G A R PARA RECU EN TO (PCA)
PCA (Pate Count Agar) es un medio de cultivo utilizado para la multiplicacin y recuento
por inclusin de todos los microorganismos aerobios mesflos poco exigentes, en alimentos.
2. Principios:
La composicin del medio permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos.
3. P rep araci n :
Disolver 23,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
Llevar a ebullicin durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolucin.
Segn el uso:
Placas:
> Repartir 150 mL de medio en frascos de 250 mL.
t> Esterilizar en autoclave a 120C durante 15 min.
> Atemperar en un bao a 45C - 48C.
t> Repartir aspticamente en placas.
Tubos:
> Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 X 160 mm.
Esterilizar en autoclave a 120C durante 15 min.
> Dejar solidificar en posicin inclinada.
Triptona................................................................................................ 10
Extracto de levadura................................................................................................................. 2,5
Glucosa ............................................................................................................................. 1
Agar bacteriolgico.................................................................................................................. 15
Control macroscpico: Medio slido de color mbar, ligeramente opalescente.
pH a 25C: 7,0 + 0,2.
M icroorganism o C recim iento

Staphylococcus aureus Bueno
Listeria monocytogenes Bueno
6. C onservacin:
Frascos ................................................................................................... 6 meses a 2C-8C.
Tubos con tapn de rosca 3 meses a 2C-8C.
Tubos con sero-tapn ........................................................................ 1 mes a 2C-8C.
Placas ........ 1 mes a 2C-8C.
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION

PNT - ME - 005
DEL AGAR PARA BLANCO (AB)
AB (Agar Blanco) se utiliza n el mtodo ISO 4833 para el recuento en alimentos de mi
croorganismos aerobios mesfilos poco exigentes cuando se sospecha que el producto a ana
lizar contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie de los medios.
2. Principios:
El AB cubre el medio de cultivo, facilitando as el recuento de las colonias.
3. Preparacin:
Disolver 18 g de agar en 1 L de agua destilada.
Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.
Atemperar en un bao a 45C - 48C.
Agar bacteriolgico ......................................................................................................... 18

Control macroscpico: Medio de color blanquecino.
pH a 25C: 7,0 0,2.
6. Conservacin:
Frascos 6 meses a 2C-8C.
PR O C E D IM IE N T O PA R A LA PR EPA R A C I N
PNT - ME - 006
DEL AGAR GLUCOSA Y C L O R A N FE N IC O L (CGA)
CGA (Agar Glucosa y Cloranfenicol) es un medio de cultivo utilizado para el recuento de le
vaduras y mohos en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene extracto de levadura y glucosa, que favorecen el crecimiento de las le
vaduras y mohos.
La presencia del clorafenicol, que es un antibitico estable al calor, inhibe el crecimiento de
bacterias.
3. Preparacin:
NOTA: Cuando este medio se utiliza para el recuento de levaduras y mohos segn la
norma AFNOR (XF V 08-059), y en caso que se sospeche la presencia de contaminacin
importante por bacterias Gram negativas, aadimos al medio 2 mL de SUPLEMENTO
ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA (PNT-RE-003). Homogeneizar sin incorporar
aire. Repartir en placas Petri estriles y dejar solidificar.
Extracto de levadura.............................................................................................................. 5
G lucosa.................................................................................................................................... 20
C loranfenicol.......................................................................................................................... 0,1
Agar bacteriolgico............................................................................................................... 15

Control macroscpico: Medio slido de color mbar, ligeramente opalescente.
pH a 25C: 6,6 0,2.

Saccharomyces cerevisiae Bueno
Aspergillus niger Bueno
Escherichia coli Nulo
6. C onservacin:
F rasco s 6 meses a 2C-8C.
P la c a s.................... 1 mes a 2C-8C.
PR O C E D IM IE N T O PARA LA PR EPA RA CI N D EL
PNT - ME - 007 CA LD O TAM PONADO CON BILIS, VERDE BRILLA N TE
Y G LUCO SA (CALDO EE)
1. F inalidad de uso:
El CALDO EE (Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa) es un medio de cul
tivo selectivo utilizado para la deteccin de enterobacterias en alimentos.
2. Principios:
La presencia simultanea de bilis y verde brillante inhibe el crecimiento de la mayora de bac
terias Gram positivas y de las Gram negativas no enterobacterias.
Los fosfatos de sodio y potasio hacen que se mantenga el pH del medio, mejorando as su
capacidad de recuperacin.
3. P rep araci n :
Remover suavemente hasta conseguir una completa disolucin.
Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.
4. Com posicin en g/l:

Peptona ............................................................................................................................... 10
G lu c o sa .................................................................................................................... 5
Fosfato d is d ico ................................................................................................................. 6,45
Fosfato m onopotsico....................................................................................................... 2
Bilis de buey d esecad a...................................................................................................... 20
Verde brillante ................................. 0,015
5. C ontroles del m edio p rep a rad o :

Control macroscpico: Caldo de color verde, translcido y sin precipitado.
pH a 25C: 7,2 + 0,2.

Salmonella Enteritidis Bueno
Enterococcus faecalis Nulo
6. Conservacin:
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACI N

DEL AGAR BILIS CRISTAL VIOLETA Y GLUCOSA (VRBG)
VRBG (Agar Bilis Cristal Violeta y Glucosa) es un medio de cultivo selectivo utilizado para
el aislamiento y recuento de enterobacterias en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora
acompaante Gram positiva. La presencia del rojo neutro permite que se forme un halo vio
leta al borde de las colonias debido a la acidificacin de la glucosa y precipitacin de las sa
les biliares.
Las colonias de enterobacterias adquieren en este medio coloracin violcea.
3. Preparacin:
Harnear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.
Disolver 39,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estril.
Repartir 150 mL de medio en frascos estriles de 250 mL.
NO AUTOCLAVAR.
Peptona de c a rn e ............................................................................................................ 7
Extracto de levadura...................................... 3
G lu co sa........................................................... 10
Sales biliares ................................................... 1,5
Cloruro sdico ............................................... 5
Rojo neutro ..................................................... 0,03
Violeta cristal.................................................. 0,002
Agar bacteriolgico ....................................... 13

Control macroscpico: Medio slido de color granate claro.
pH a 25C: 7,3 0,2.
Color Color
M icroorganismo Crecimiento
colonias medio
Escherichia coli Bueno Rojo Rojo
Salmonella Enteritidis Bueno Rojo Rojo
Staphylococcus aureus Nulo
6. Conservacin:
Utilizar inmediatamente.
PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIN

PNT - ME - 009
DEL AGAR GLUCOSADO (AG)
AG (Agar Glucosado) es un medio de cultivo utilizado para observar si el microorganismo
estudiado es capaz de fermentar la glucosa.
2. Principios:
La fermentacin de la glucosa provoca la acidificacin del medio, de manera que el indica
dor (prpura de bromocresol) har que el color pase de prpura a amarillo al disminuir el
pH.
3. Preparacin:
Mantener los tubos en posicin vertical.
Justo antes del empleo, fundir, dejndolo hervir durante unos 10 minutos, y enfriar rpi
damente a la temperatura de incubacin (30C 1C).
4. Composicin en g/i:
Triptona .......................................................................................................................... 10
Extracto de levadura ............................................................................. 1,5
G lu co sa........................................................................................................................... 10
Cloruro sdico ............................................................................................................... 5
Prpura de brom ocresol................................................................................................ 0,015
Agar bacteriolgico .......... 15

Control macroscpico: Medio slido de color prpura, ligeramente opalescente.
pH a 25C: 7,0 0,2.
M icroorganism o Color medio
Staphylococcus aureus Amarillo

Bacillus cereus Amarillo
Pseudomonas aeruginosa Violeta
. Conservacin:
Tubos con tapn de ro sc a 3 meses a 2C-8C.
Tubos con sero-tapn......................................................................... 1 mes a 2C-8C.

PN T - M E - 010 DEL AGAR NUTRITIVO (AN)
1. F in alid ad de uso:
AN (Agar Nutritivo) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de mi
croorganismos poco exigentes.
2. Principios:
El medio suministra los elementos nutritivos necesarios pura el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos.
3. P rep araci n :
Disolver 35 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
Llevar a ebullicin y mantener durante 1-2 min, hasta conseguir una completa disolucin.
Segn el uso:
Placas:
> Repartir 150 mL de medio en frascos de 250 mL.
> Esterilizar en el autoclave a 120C durante 15 min.
> Atemperar en un bao a 45C - 48C.
> Repartir aspticamente en placas.
Tubos:
> Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.
> Esterilizar en el autoclave a 120C durante 15 min.
> Dejar solidificar en posicin inclinada.
Frascos: Almacenar segn indicaciones.
4. C om posicin en g/1:
T rip to n a ................................................................................................. 10
Extracto de carne ................................................... 5
Cloruro sdico ............................................................................. 5
A gar bacteriolgico ........................................................................................ 15
5. C ontroles del m edio p rep a rad o :
Control macroscpico: Medio slido de color mbur, ligeramente opalescente.
p H a 2 5 C :7 ,l 0 ,2 .
Microorganismo ( 'iw lm leulo

Staphylococcus aureus Dueo
Listeria monocytogenes Dueo
Escherichia coli Dueo
6. C onservacin:
Tubos con sero-tapn ............................................... I mes a 2C-8C.
F ra sc o s 6 meses a 2C-8C.
P la c a s ........................ 1 mes a 2C-8C.

PNT - ME - 011
DEL CALDO NUTRITIVO (CN)
CN (Caldo Nutitivo) es un medie de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de mi
croorganismos poco exigentes.
2. Principios:
El medio suministra los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de una amplia
3. Preparacin:
Esterilizar en el autoclave a 120C durante 15 min.
4. Composicin en g/I:
Triptona..................................................................................................................... 10
Extracto de carne ...................................................................................................... 5
Cloruro sdico ............................................................................................................. 5

Control macroscpico: Caldo de color mbar, ligeramente opalescente.
pHa25C:7,l 0,2.
6. Conservacin:
Tubos con sero-tapn .... 1 mes a 2C-8C.

P N T - M E - 012
DEL AGUA DE PEPTONA TAMPONADA (APT)
APT (Agua de Peptona Tamponada) es un medio de cultivo utilizado para realizar un pre-en-
riquecimiento de Salmonella en alimentos.
2. Principios:
El medio revitaliza las salmonelas que hayan podido sufrir daos en el tratamiento de los ali
mentos.
El cloruro sdico acta manteniendo la balanza osmtica y los dos fosfatos conservan tam-
ponado el medio.
3. Preparacin:
Repartir 225 mL de medio en frascos de 250 mL o segn uso.
Peptona pancretica de carne..................................................................................... 10
Cloruro sdico ................................................................................................. 5
Fosfato disdico........................................................................................................ 9
Fosfato monopotsico ............................................................................................... 1,5

Control macroscpico: Caldo de color amarillo claro sin precipitado.
pH a 25C: 7,2 0,2.
6. Conservacin
Frascos ...... 6 meses a 2C-8C.

P N T -M E -0 1 3
DEL CALDO DE TRIPTONA LAURIL SULFATO (TLS)
TLS (Caldo de Triptona Lauril Sulfato) es un medio de cultivo selectivo utilizado para la de
teccin y recuento de colifomflss totales y Escherichia coli en alimentos.
2. Principios:
Gracias a su excelente capacidad nutritiva y a la presencia de fosfatos, este medio permite un
rpido crecimiento de coliformes y la produccin de gran cantidad de gas a partir de la fer
mentacin de la lactosa, incluso con poco inoculo.
El medio contiene lauril sulfato sdico, que inhibe el crecimiento de la flora acompaante sin
interferir en el crecimiento de los coliformes.
3. Preparacin:
M edio de simple concentracin'.
Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm, provistos de campana de Durham.
Comprobar que la campana est llena de medio y sin gas.
Medio de doble concentracin:
Triptona ................................................................................................................................. 20
L ac to sa ................................................................................................................................... 5
Fosfato dipotsico ................................................................................................................ 2,75
Fosfato m onopotsico.......................................................................................................... 2,75
Cloruro sdico ...................................................................................................................... 5
Lauril sulfato sdico ............................................................................................................ 0,1
Control macroscpico: Caldo de color mbar, limpio y sin precipitado.
pH a 25C: 6,8 0,2.
M icroorganismo Crecimiento Formacin de gas

Escherichia coli Bueno Positiva
Enterococcus faecalis Nulo
6. Conservacin:
Tubos con sero-tapn..... 1 mes a 2C-8C.
P R O C E D IM IE N T O PA R A L A PR EPA R A C I N DOL CALDO

PNT - M E - 014
L A C T O SA D O B IL IA D O V E R D E B R IL L A N T E (BCJHL)
BGBL (Caldo Lactosado Biliado Verde Brillante) es un medio de cultive) Util tundo pftfi Itt
deteccin y recuento de coliformes totales y fecales en alimentos (pincha piONUHtlVM y
confirmativa).
2. Principios:
El medio contiene bilis al 2% y verde brillante, de manera que inhibe el crecimiento d# pr-
ticamente todas las bacterias Gram positivas.
El crecimiento se demuestra por la turbidez del medio, y la fermentacin de Itt IllCtOKtt por Itt
formacin de gas en la cam pana de Durham.
3. Preparacin:
M edio de simple concentracin:
Calentar gradualmente hasta conseguir una com pleta disolucin.
R epartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm, provistos de campana de Durham.
Com probar que la cam pana est llena de medio y sin gas.
M edio de doble concentracin:
Repartir 10 m L de m edio en tubos de 18 x 180 mm, provistos de campanil do Durham.
Com probar que la campana est llena de medio y sin gas.
T rip to n a ............................................................................................................................... 10
Bilis bacteriolgica de buey ............................................................................................. 20
Lactosa ................................................................................................................................. 10
Verde brillante 0,0133
Control macroscpico: Caldo de color verde brillante, campana sin gas.
pH a 25C: 7,2 0,2.
M icroorganismo Crecimiento Formacin de gas

Escherichia coli Bueno Positivo
Salmonella Enteritidis Bueno Negativo
6. Conservacin:
Tubos con sero-tapn ..... 1 mes a 2C-8C.
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIN DEL

P N T -M E -0 1 5 AGAR LACTOSADO CON BILIS AL CRISTAL VIOLETA
Y ROJO NEUTRO (VRBL)
VRBL (Agar Lactosado con Bilis al Cristal Violeta y Rojo Neutro) es un medio de cultivo
selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de coliformes.
2. Principios:
El medio contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora
acompaante Gram positiva.
La fermentacin de la lactosa provoca la acidificacin del medio, dando unas colonias de co
lor rojo debido al indicador (rojo neutro) y a veces con un halo de precipitacin de cidos bi
liares.
3. Preparacin:
Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.
NO AUTOCLAVAR.
Triptona ............................................................................................................................... 7
Extracto de levadura .......................................................................................................... 3
L a c to sa ................................................................................................................................. 10
Sales biliares ....................................................................................................................... 1,5
Cloruro sdico .................................................................................................................... 5
Rojo neutro ......................................................................................................................... 0,03
Violeta c rista l...................................................................................................................... 0,002
Agar bacteriolgico ........................................................................................................... 15

Control macroscpico: Medio slido de color granate claro, ligeramente opalescente.
pH a 25C: 7,3 0,2.
Color Color
colonias medio
Escherichia coli Bueno Rojo Rojo

Pseudomonas aeruginosa Bueno Naranja No cambia
6. Conservacin:
168 MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE AUM ENTOS
P R O C E D IM IE N T O P A R A LA PR E P A R A C I N
PNT - M E - 016 DEL CALDO E scherichia (CALDO E C )
El CALDO EC (Caldo Escherichia coli) es un m edio de cultivo utilizado para la confirma
cin y recuento (NMP) de coliformes fecales y Escherichia col,
2. Principios:
Las sales biliares inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivas, as como de los mi
croorganismos no adaptados al medio ambiente intestinal.
La tem peratura de incubacin (44C) hace que la tcnica sea ms selectiva.
El crecimiento se demuestra por la turbidez, mientras que la fermentacin de la lactosa se
observa por la formacin de gas dentro de la cam pana de Durham.
3. P re p ara ci n :
Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 m m provistos de campana de Durham.
Com probar que la cam pana est llena de medio y sin gas.
Peptona pancretica de carne .................................................................................................. 20
Lactosa ........................................................................................................................................... 5
M ezcla de sales b ilia re s............................................................................................................ 1,5
Cloruro s d ic o ........................................................................................................................... 5
Fosfato disdico ........................................................................................................................ 4
Fosfato monopotsico .............................................................................................................. 1,5
5. C ontroles del m edio p re p a ra d o :

Control macroscpico: Caldo de color m bar claro, campana sin gas.
pH a 25C: 6,9 0,2.
M icroorganism o C recim iento F orm acin de gas

Salmonella Enteritidis Escaso Negativo
6. C onservacin:
Tubos con sero-tapn ............................................................................ 1 mes a 2C-8C.
mOCIOIMIINTO M PMPARACIN DI MIDIO! DI OULTIVO 160

PN T-M E-017
DEL AGUA DE TRIPTONA (AT)
AT (Agua de Triptona) es un medio de cultivo utilizado para la observacin de la produccin
de indol por parte de algunos microorganismos, principalmente de la familia de las Entero-
bacterias.
2. Principios:
En condiciones de aerobiosis, algunos microorganismos degradan el triptfano y lo con
vierten en indol mediante la enzima triptofanasa. ste es detectado por el reactivo de Kovacs
o por una mezcla de cido ntrico y nitrato sdico, coloreando de rojo el medio.
3. Preparacin:
Calentar suavemente hasta conseguir una completa disolucin.
Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 x 100 mm con tapn de rosca.
Peptona de casena.................................................................................................. 10
Cloruro sdico ............................. 5

Control macroscpico: Caldo de color mbar claro.
pH a 25C: 7,3 0,2.
Microorganismo Crecimiento Color rojo

Salmonella Enteritidis Bueno Negativo
6. Conservacin:

PNT - M E - 018 DEL AGAR CON TERGITOL-BCIG (PTX)
PTX (Agar con Tergitol-BCIG) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el recuento
de Escherichia coli /3-D-glucuronidasa positivos en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene tergitol-7, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas, limita la
invasin de Proteus y favorece la recuperacin de Escherichia coli.
El BCIG es un substrato cromgeno; la m ayora de cepas de Escherichia coli tienen /3-D-
glucuronidasa, que hidroliza el BCIG, dndole una coloracin azul.
3. Preparacin:
Atem perar en un bao a 45C - 47C.
Peptona de c a rn e .................................................................................................................. 5
Extracto de le v a d u ra ........................................................................................................... 3
Fosfato d ip o tsico ............................................................................................................... 0,3
Tergitol-7 .............................................................................................................................. 0,095
B C IG ...................................................................................................................................... 0,05
Agar bacteriolgico ............................................................................................................ 12

Control macroscpico: M edio slido blanquecino, ligeramente opalescente.
pH a 25C: 7,2 0,2.
M icroorganismo Crecimiento Color colonias
Escherichia coli Bueno Azul

Citrobacter freundii Bueno Blanco
6. Conservacin:
Frascos ....... 1 mes a 2C-8C, resguardados de la luz.

P N T -M E -019
DEL MEDIO DE BAIRD-PARKER (BP)
1 . Finalidad de uso:
BP (Baird-Parker) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el recuento de estafiloco
cos, principalmente los CPS (Estafilococos Coagulasa Positivos) en alimentos.
2 . Principios:
El cloruro de litio y el telurito potsico inhiben la flora acompaante; el telurito tambin es
el responsable de la coloracin negra que adquieren las colonias capaces de reducirlo. La gli
cina y el piruvato sdico estimulan el crecimiento de los estafilococos.
La adicin de sulfametazina inhibe el crecimiento de Proteus, mientras que la yema de hue
vo deja patente la accin de la lecitinasa.
3. Preparacin:
Disolver 58 g de medio deshidratado en 950 mL de agua destilada.
En el momento de preparar las placas, aadir aspticamente a cada frasco:
10 mL de SOLUCIN ESTRIL DE YEMA DE HUEVO (PNT-RE-004).
2 mL de TELURITO POTSICO AL 1% (PNT-RE-005).
5 mL de SULFAMETAZINA AL 0,2%1(PNT-RE-006).
Homogeneizar sin incoiporar aire.
Repartir aspticamente en placas Petri estriles.
Dejar solidificar.
4 Composicin en g/950 mL:
Triptona.................................................................................. 10
Extracto de carne ................................................................................................................ 5
Extracto de levadura ........................................................................................................... 1
Piruvato sdico ............................................................................................................... 10
G licina............................. 12
Cloruro de litio .................................................................................................................... 5
Agar bacteriolgico ............................................................................................................ 15
Control macroscpico: Medio slido amarillo opaco.
pH a 25C: 6,8 0,2.
Microorganismo Crecimiento Color colonias Halo

Staphylococcus aureus Bueno Negro Positivo
Staphylococcus epidermidis Bueno Negro-grisceo Negativo
6. Conservacin:
Frascos con medio base ........................... 6 meses a 2C-8C,
Placas .................................................................................................. 15 das a 2C 8C.
En caso que se sospeche la presencia de Proteus.

171
M M BH i

PNT - ME - 020 DEL CALDO DE CEREBRO-CORAZN (BHI)
1. Finalidad do uso:
BHI (Caldo de Cerebro - Corazn) es un medio nutritivo tamponado utilizado para el culti
vo de una amplia variedad de microorganismos exigentes, tanto aerobios como anaerobios
facultativos, como Streptococcus sp., Meningococcus sp. y Staphylococcus sp.
2. Principios:
El elevado contenido de compuestos nutritivos de este medio favorece el rpido crecim ien
to de los microorganismos, manteniendo adems sus caractersticas de antigenidad, viru
lencia y toxicidad.
El medio permite realizar la prueba de la coaguiasa para los estafilococos.
3. Preparacin:
Extracto de cerebro .................................................................................................................. 7,8
Extracto de co ra z n .................................................................................................................. 9,7
Peptona de gelatina .................................................................................................................. 10
Cloruro s d ic o ........................................................................................................................... 5
Fosfato d is d ic o ........................................................................................................................ 2,5
G lu c o sa ....................................................................................................................................... 2

Control macroscpico: Caldo de color mbar.
pH a 25C: 7,4 0,2.
Estreptococcus pyogenes Bueno
6. Conservacin:
PR O C ED IM IEN TO PARA LA PREPARACIN DEL AGAR
PNT - ME - 021
CON PLASM A DE C O N EJO Y FIBRIN G EN O (RPF)
RPF (Agar base Baird-Parker con Plasma de Conejo y Fibringeno) es un medio de cultivo
utilizado para el recuento sin necesidad de confirmacin de los CPS (Estafilococos Coagu-
las Positivos) en alimentos.
2. Principios:
El suplemento RFP (Rabbit Plasma Fibrinogen) permite observar la accin de la coagulasa
de los estafilococos y contiene un inhibidor de la tripsina para evitar la fibrinlisis total o
parcial de los halos formados en tomo a las colonias coagulasa positivas.
3. Preparacin:
Fundir el medio base BP y atemperar en un bao a 45C - 48C.
Aadir 10 mL de agua destilada estril a un frasco de suplemento RPF.
Mezclar suavemente hasta la disolucin completa.
Aadir el suplemento RPF al medio base BP.
Dejar solidificar.
MEDIO BASE:
Triptona .......... 10
Extracto de c a rn e ......................................... 5
Extracto de levadura............................................................................. 1
Piruvato s d ico .............................................................................................. 10
G licin a ................................................................................... 12
Cloruro de litio ....................................................................................................... 5
Agar bacteriolgico .................................... 12,5
SUPLEMENTO RPF:
Fibringeno bovino ........................................................................................................ 3,75 g
Plasma de c o n ejo ............................................................................................. . 50 mL
Inhibidor de tripsina .......................... ............................................................................ 50 mg
Telurito potsico ............................................................................................................. 25 mg
Control macroscpico: Medio slido de color mbar, opalescente.
pH a 25C: 7,6 0,2.
M icroorganism o Crecim iento Halo
Staphylococcus aureus Bueno Positivo

Staphylococcus epidermidis Bueno Negativo
6. C onservacin:
P R O C E D IM IE N T O PA RA LA PR EPA RA CI N D E L A G A R
PNT - ME - 022 M A N IT O L YEM A DE H U EV O CON PO LIM IX IN A (M YPA)
MYPA (Agar Manitol Yema de Huevo con Polimixina) es un medio de cultivo utilizado
para la deteccin y recuento de Bacillus cereus en alimentos.
2. Principios:
El manitol contenido en el medio nos permite la diferenciacin de Bacillus cereus, que es un
microorganismo manitol negativo, frente a la flora acompaante manitol positiva, que hace
que el rojo fenol del medio vire de rojo a amarillo.
Asimismo, el crecimiento de la flora acompaante se ve inhibido por la polimixina, que no
afecta al crecimiento Bacillus cereus.
Bacillus cereus produce lecitinasa, de manera que degrada la lecitina de la yema de huevo
formando un halo de precipitado alrededor de sus colonias.
3. Preparacin:
Disolver 46 g de medio deshidratado en 0,9 L de agua destilada.
En el momento de preparar las placas, aadir aspticamente a cada frasco:
20 mL de SOLUCIN ESTRIL DE YEMA DE HUEVO (PNT-RE-004).
2 m L de SULFATO DE POLIMIXINA B AL 4% (PNT-RE-007).
Homogeneizar sin incorporar aire.
Dejar solidificar.
Peptona ............................................................................................................................... 10
M an ito l................................................................................................................................ 10
Cloruro sdico .................................................................................................................. 10
Extracto de carne ............................................................................................................... 1
Rojo fenol ........................................................................................................................... 0,025
Agar bacteriolgico .......................................................................................................... 15
5* C ontroles del m edio p rep a rad o :
Control macroscpico: Medio slido de color rojo-rosado.
pH a 25C: 7,0 0,2.
Color C olor
M icroorganism o C recim iento H alo
colonias m edio
Bacillus cereus Bueno Incoloro Rojo +
Staphylococccus aureus Bueno Amarillo Amarilo +/-
6. C onservacin:
Frascos con medio base ........................................................................ 6 meses a 2C-8C.
Placas 1semana a 2C-8C.
PNT - ME - 023 PR O C E D IM IE N T O PARA LA PREPA RA CI N

D EL M EDIO VOGES PROSKAUER (MR-VP)
MR-VP (Rojo de Metil-Voges Proskauer) es un medio utilizado como prueba bioqumica
para diferenciar los microorganismos (principalmente enterobacterias) segn la va que
utilicen para degradar la glucosa.
2. Principios:
Algunos microorganismos fermentan la glucosa por la va llamada cido-mixta, produ
ciendo una importante acidificacin del medio. As, al aadir el indicador rojo de metilo este
se mantendr de color rojo a pH < 4,4. En caso que pH >5,1 el medio se volver amarillo.
Otros microorganismos la fermentan por la va de degradacin del 2,3-butanodiol; este
metabolito se manifiesta con los reactivos para Voges-Proskauer (solucin de a-naftol y de
KOH), que en una reaccin positiva dan un color rosa violceo en la parte superior del tubo.
3. Preparacin:
Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 x 100 mm con tapn de rosca.
Peptona de carne ...................................................................................................................... 7
Glucosa ..................................................................................................................................... 5
Fosfato dipotsico.................................................................................................................... 5

Control macroscpico: Caldo de color mbar translcido.
pH a 25C: 6,9 0,1.
Control de ecacia:
M icroorganism o Rojo m etilo Voges P roskauer

Escherichia coli Positivo Negativo
Enterobacter cloacae Negativo Positivo
NOTA: La lectura se realiza con:

- ROJO DE METILO (PNT-RE-008)
SOLUCIN DE tt-NAFTOL + KOH AL 40% (PNT-RE-009)
SOLUCIN DE KOH AL 40% (PNT-RE-010)
6. Conservacin:
176 MTODOS DE AN USIS MICROBIOLGICOS DE ALIMENTOS
PR O C E D IM IE N T O PA RA LA PR EPA R A C I N
PNT - ME - 024
D E L M E D IO N IT R A T O (MN)
&, Finalidad de uso:

MN (Medio Nitrato) es un medio de cultivo que pone en evidencia la capacidad del micro
organismo de reducir los nitratos a nitritos.
2. Principios:
La presencia de nitritos se manifiesta mediante la adicin de reactivos, que hacen que el me
dio se vuelva rojo.
3. Preparacin:
Peptona ......................................................................................................................................... 5
Extracto de carne ........................................................................................................................ 3
Nitrato p o tsic o ........................................................................................................................... 1

Control macroscpico: Caldo de color mbar translcido.
pH a 25C: 7,0 0 ,1 .
M icroorganism o C recim iento Form acin de N 0 2

Pseudomonas aeruginosa Bueno Negativo
NOTA: La lectura se realiza con:

- REACTIVO DE NITRATOS (PNT-RE-019)
6. C onservacin:
Tubos con tapn de r o s c a 6 meses a 2C-8C.
Tubos con sero-tapn ........................................................................... 1 mes a 2C-8C.

PNT - ME - 025
DEL AGAR SANGRE (AS)
AS (Agar Sangre) es un medio de cultivo con elevado poder nutritivo utilizado para el re
cuento, aislamiento y conservacin de microorganismos delicados.
2. Principios:
La composicin nutritiva del medio permite la recuperacin de microorganismos sin inter
ferir en sus reacciones hemolticas.
3. Preparacin:
Esterilizar en autoclave a 121aC durante 15 min.
Aadir un 5% de SANGRE DE CORDERO ESTRIL.
Mezclar suavemente.
Repartir en placas Petri estriles.
Dejar solidificar.
NOTA: El medio se puede preparar en doble capa poniendo en el fondo de la placa una
capa sin sangre.
Peptona.................................................................................................................................. 15
Hgado hidrol izad o ............................................................................................................... 2,5
Extracto de levadura......................................................... 5
Cloruro s d ic o ....................................................................................................................... 5
A g a r........................................................................................................................................ 12

Control macroscpico: Medio slido de color rojo sangre.
pH a 25C: 7,4 0,2.
M icroorganism o Crecim iento Hemolisis

Staphylococcus aureus Bueno p +++
Streptococcus pyogenes Bueno p +++
6. Conservacin:
Frascos con medio b a s e 6 meses a 2C-8C.
P lacas..................................................................................................... 1 mes a 2C-8C.
178 MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGlCOS DE ALIMENTOS

PNT - ME - 026
DEL AGAR MOVILIDAD (AM)
AM (Agar Movilidad) es un medio de cultivo que permite diferenciar entre microorganismos
mviles o inmviles.
2. Principios:
El medio contiene una cantidad muy pequea de agar, permitiendo as visualizar el despla
zamiento de los microorganismos mviles y el estancamiento de los inmviles.
3. Preparacin:
Disolver los componentes en 1 L de agua destilada.
Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.
Esterilizaren autoclave a 121 C durante 15 min.
Enfriar en posicin vertical a temperatura ambiente.
Peptona de casena................................................................................................. 20
Peptona de carne .................................................................................................... 6,1
Agar bacteriolgico................................................................................................. 3,5

Control macroscpico: Medio translcido, ligeramente opalescente.
pH a 25C: 7,3 0,2.
Microorganismo Movilidad
Proteus hauseri Positivo
Klebsiella pneumoniae Negativo
6. Conservacin:
Tubos con sero-tapn . 1 mes a 2C-8C.

PNT - ME - 027
AGAR TRIPTONA-SULFITO CON CICLOSERINA (TSC)
1* Finalidad de uso:
TSC (Agar Triptona-Sulfito con Cicloserina) es un medio de cultivo selectivo utilizado para
el aislamiento y recuento de clostridios sulfito-reductores en alimentos.
2. Principios:
Los clostridios reducen el sulfito a sulfuro, que reacciona con el citrato de hierro formando
un halo negro alrededor de las colonias por la precipitacin del sulfuro de hierro.
La presencia de cicloserina da ms especificidad al medio.
3. Preparacin:
Repartir 20 mL en tubos de 18 x 180 mm o 150 mL en frascos de 250 mL de capacidad,
segn su uso.
Esterilizaren autoclave a 121C durante 15 min.
En el momento de preparar los tubos o frascos, aadir el SUPLEMENTO DE CICLO-
SERINA:
En tubos: 0,2 mL.
En frascos: 1,5 mL.
T rip to n a.................................................................................................................................... 15
Peptona de c a r n e .......................................................................... 5
Extracto de levadura ............................................................................................................... 5
Metbisulfito sdico ............................................................................................................... 1
Citrato frrico amoniacal ............................................................................................ 1
Agar bacteriolgico .............. 15

Control macroscpico: Medio slido de color mbar.
pH a 25C: 7,6 0,2.
Microorganismo Crecimiento Color colonias

Clostridium perfringens Bueno Negras
6. C onservacin:
Frascos con medio b a s e ............................................................................ 1 mes a 2C-8C.
Tubos con sero-tapn ............................................................................... 1 mes a 2C-8C.

PNT - M E - 028 DEL TIOGLICOLATO (TIO)
TIO (Tioglicolato) es un medio de cultivo utilizado para controles de esterilidad orientado a
bacterias anaerobias estrictas o facultativas.
2. Principios:
La reduccin de la cistena y del sulto sdico crea unas condiciones adecuadas para mi
croorganismos anaerobios, ayudando tambin a ello la presencia de agar.
La resazurina se utiliza como de indicador de xido reduccin.
La ausencia de agentes selectivos permite el crecimiento de la mayora de los microorga
nismos.
3. Preparacin:
Dejar atemperar a temperatura ambiente.
NOTA: En el momento de utilizar, regenerar el medio colocando los tubos durante 10 min
en un bao hirviendo y dejar atemperar.
Triptona ................................................................................................................................ 15
Extracto de levadura ........................................................................................................... 5
G lu c o sa ................................................................................................................................. 5,5
Cloruro sdico ..................................................................................................................... 2,5
Tioglicolato sdico ............................................................................................................. 0,5
Cistena ................................................................................................................................. 0,5
Resazurina ............................................................................................................................ 0,001
Agar bacteriolgico ............................................................................................................ 0,75
Control macroscpico:
Medio regenerado: Caldo de color mbar traslcido.
Medio no regenerado: Caldo ligeramente espeso de color mbar traslcido con la su
perficie rosada brillante.
pH a 25C: 7,1 0 ,2 .
M icroorganismo Crecimiento
Estreptococcus pyogenes Bueno
Clostridium perfringens Bueno
6. Conservacin:
Tubos con sero-tapn . 1 mes a T ambiente, resguardados de la luz.
PNT - ME - 029 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIN

DEL MEDIO LACTOSA SULFITO (LS)
LS (Lactosa Sulfito) es un nedio de cultivo selectivo utilizado para la identificacin de Clos-
tridium perfringens en alimentos.
2. Principios:
La presencia de campana de Durham permite observar la fermentacin de la lactosa.
El medio contiene metabisulfito y una sal de hierro, que reaccionan dando lugar a un preci
pitado negro de sulfuro de hierro.
La temperatura de incubacin (46C 1C) hace que el medio sea ms selectivo.
3. Preparacin:
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 20 min.
En el momento de utilizar, aadir aspticamente a cada tubo:
0,5 mL de METABISULFITO SDICO AL 1,2% (PNT-RE-12).
0,5 mL de CITRATO DE HIERRO AMONIACAL AL 1% (PNT-RE-13).
NOTA: En el momento de utilizar, regenerar el medio colocando los tubos durante 10 min
en un bao hirviendo y dejar atemperar (antes de incorporar los reactivos).
T rip to n a ............. 5
Extracto de levadura.............................................................................................................. 2,5
Lactosa ....... 10
Cloruro s d ic o ........................................ 2,5
Clorhidrato de cistena .......................................................................................................... 0,3

Control macroscpico (medio regenerado): Caldo de color mbar claro. Al regenerar el
medio, la campana puede tener un poco de aire que desaparece al enfriarse.
pH a 25C: 7,1 0,1.
Gas Precipitado
(V4 de la campana) negro
Clostridium perfringens Bueno Positivo Positivo
6. Conservacin:
1B2 MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIMENTOS
P R O C E D IM IE N T O PA RA L A P R E P A R A C I N D E L C A L D O
PNT - M E - 030 C O N V E R D E D E M A LA Q U IT A Y C L O R U R O D E M A G N E SIO
(R A P PA PO R T -V A SS IL IA D IS M O D IFIC A D O ) (RV)
RV (Caldo de Rappaport-Vassiliadis modificado) es un medio de cultivo selectivo utilizado
para el enriquecim iento de Salm onella en aguas y alimentos.
2. Principios:
El m edio est formulado basndose en cinco caractersticas diferenciales de Salmonella res
pecto a otras enterobacterias:
Capacidad de resistir altas presiones osmticas.
C apacidad de m ultiplicacin a pH relativam ente bajos.
Son relativam ente ms resistentes a la presencia del verde de m alaquita.
Tienen relativamente m enos requerim ientos nutricionales.
La tem peratura de incubacin es un factor selectivo.
3. Preparacin:
D isolver 26,75 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
C alentar suavemente hasta conseguir una com pleta disolucin.
R epartir 10 m L de m edio en tubos de 16 x 160 mm.
4. Com posicin en g/1:

Peptona de soja ...................................................................................................................... 4,5
Cloruro sdico ........................................................................................................................ 7,2
D ihidrogenofosfato de p o ta s io ............................................... 1,26
Fosfato d ip o t sico .................................................................................................................. 0,18
Cloruro de m agnesio anhidro .............................................................................................. 13,58
Verde de m a la q u ita ................................................................................................................ 0,036
f C o n tro les del m edio p re p a ra d o :

Control macroscpico: Caldo translcido de color azul-verdoso.
pH a 25C: 5,2 0,2.
M icro o rg an ism o C recim iento

Salmonella Typhim urium Bueno
6. C o n serv aci n :
Tubos con tapn de r o s c a ...................................................................... 6 m eses a 2C-8C.
Tubos con sero-tapn .............................................. 1 m es a 2C-8C.

PNT - ME - 031
DEL CALDO SELENITO-CISTINA (SC)
SC (Caldo Selenito-Cistina) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el enriqueci
miento de Salmonella en aguas y alimentos.
2. Principios:
El selenito sdico inhibe el crecimiento de bacterias intestinales, coliformes y enterococos,
principalmente en las primeras 6-12 h siguientes al inicio de la incubacin. Despus, el efec
to inhibidor disminuye lentamente. As, Salmonella, Proteus y Pseudomonas no son inhi
bidos.
La cistina mejora sensiblemete el crecimiento de Salmonella.
3. Preparacin:
Disolver 23 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estril.
Llevar a ebullicin durante 1-2 min.
Repartir 90 mL de medio en frascos estriles de 250 mL o 18 mL en tubos de 18 x 180 mm.
NO AUTOCLAVAR.
Enfriar rpidamente en un bao de agua.
NOTA: Al calentar el medio, evitar respirar los vapores, pues son altamente txicos.
Polipeptona..................................................................................................................... 5
L actosa............................................................................................................................. 4
Fosfato monosdico........................................................................................................ 10
Selenito sdico................................................................................................................ 4
C istina.............................................................................................................................. 0,01

Control macroscpico: Caldo de color mbar-anaranjado.
pH a 25C: 7,0 0,2.
Control de esterilidad
Escherichia coli Regular
Staphylococcus aureus Malo/Nulo
6. Conservacin:
Frascos................................................................. 1 semana a 4C, resguardados de la luz.
Tubos con sero-tapn......................................... 1 semana a 4C, resguardados de la luz.
MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE AUMENTOS
E
1.
PNT - ME - 032
Finalidad de uso:'
DEL AGAR ROJO FENOL Y VERDE BRILLANTE (BGA)
BGA (Agar Rojo Fenol y Verde Brillante) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el
aislamiento de Salmonella en aguas y alimentos.
2# Principios:
El medio de cultivo tiene una fuerte concentracin de verde brillante, de manera que inhibe
notablemente el crecimiento de la mayora de microorganismos, excepto Salmonella.
La presencia de lactosa y sacarosa permite una buena diferenciacin de Salmonella, que da
colonias rosadas con un anillo rojo, frente al resto de flora acompaante, que forma colonias
ms pequeas de color verde-amarillo, debido a la acidificacin producida por la fermenta
cin de la lactosa y/o de la sacarosa.
3. Preparacin:
Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utinû y dejar enfriar.
Llevar a ebullicin durante 1-2 min har* conseguir una completa disolucin.
NO AUTOCLAVAR.
Dejar solidificar.
Triptona ............................................................................................................................ 10
Extracto de carne ............................................................................................................ 5
Extracto de levadura ....................................................................................................... 3
L actosa ...................................................................................................................... 10
S acarosa............................................................................................................................ 10
Fosfato disdico............................................................................................................... 1
Fosfato m onosdico........................................................................................................ 0,6
Rojo fenol ........................................................................................................................ 0,09
Verde brillante ...................... 0,005
Agar bacteriolgico ........................................................................................................ 14
Control macroscpico: Medio slido de color rojo.
pH a 25C: 6,9 ( 0,2
Color Color
colonias anillo
Escherichia coli Moderado Amadlo Amarillo
Salmonella Enteritidis Bueno Rosa Rojo
6. Conservacin:
Placas ......... 1 mes a 2C-8C.
PR O C ED IM IEN TO PARA LA PREPARACIN

DEL M ED IO H E K TO EN (HK)
HK (HEKTOEN) es un medio d cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de entero-
bacterias patgenas, principalmente Shigella y Salmonella.
2. Principios:
El medio tiene un elevado valor nutritivo, y las sales biliares que contiene inhiben el creci
miento de la flora Gram positiva y algunos Gram negativos.
Los indicadores azul de bromotimol y fucsina cida permiten la diferenciacin de las bac
terias lactosa positivo (de color amarillo-naranja) de las lactosa negativo (de color azul-ver
doso).
La presencia de tiosulfato sdico permite la produccin de SH2, que al combinarse con ci-
trato frrico forma un compuesto negro en el centro de las colonias.
3. Preparacin:
NO AUTOCLAVAR.
Dejar secar la superficie del medio en cabina para evitar posteriores expansiones de
Proteus.
Hidrolizado de c a rn e ........................................................................................................ 12
Extracto de levadura ........................................................................................................ 3
Sales biliares ..................................................................................................................... 9
L acto sa............................................................................................................................... 12
S acaro sa............................................................................................................................. 12
Salicina .............................................................................................................................. 2
Cloruro sdico .................................................................................................................. 5
Tiosulfato sdico ................................ 5
Citrato frrico am oniacal................................................................................................ 1,5
Azul de brom otim ol........................................................................................................ 0,065
Fucsina cida .................................................................................................................... 0,040

Control macroscpico: Medio slido de color verde oscuro, opalescente.
pH a 25C: 7,6 0,2.
Microorganismo Crecimiento Color colonias Color anillo
Shigella flexne Muy bueno Verde No hay

Salmonella Enteritidis Muy bueno Verde con centro negro No hay
Escherichia coli Bueno Amarillo-naranja Salmn
6. Conservacin:
Placas ........ 1 semana a 2C-8C.
PNT - ME - 034 PR O C ED IM IEN TO PARA LA PR EPA RA CI N

DEL A G A R K L IG L ER
KLIGLER es un medio de cultivo diferencial utilizado principalmente para la identificacin
de Enterobacteriaceae mediante la deteccin de la fermentacin de la glucosa y de la lacto
sa, as como de la produccin de gas y cido sulfhdrico.
2. Principios:
La fermentacin de la glucosa se manifiesta por la produccin de cido, de manera que el in
dicador vira de rojo a amarillo, aunque en la superficie vuelve el color rojo debido a que,
como hay poco azcar, la produccin de cido es muy limitada y se produce una alcalini-
zacin por oxidacin.
En cambio, cuando fermenta la lactosa, la abundante produccin de cido impide la reoxi
dacin, y el medio permanece de color amarillo en la parte inclinada del tubo.
La produccin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato se manifiesta por el ennegreci-
miento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro en presencia de citrato frrico.
3. Preparacin:
Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.
Dejar solidificar en posicin inclinada con una pendiente corta y fondo abundante (ambos
de 3 cm).
Triptona ........................................................... 20
Extracto de carne .............................................................................................................. 3
Extracto de levadura ........................................ 3
G lu c o sa .............................. 1
L ac to sa ...................... 10
Cloruro sdico ................. 5
Tiosulfato sdico ............................................................... 0,5
Citrato frrico ................................................................................................................... 0,5
Rojo fenol ................ 0,025
Control macroscpico: Medio slido de color rojo-marrn.
pH a 25C: 7,4 0,2.
Microorganismo Crecimiento Pendiente Fondo Gas sh 2
Shigella flexneri Bueno Roja Amarillo

Citrobacter freundii Bueno Amarilla Amarillo + +
6. Conservacin:
E
1.
PNT - M E - 035
Finalidad de uso:
DEL AGAR NUTRITIVO SEMISLIDO (ANS)
ANS (Agar Nutritivo Semislido) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o
recuento de microorganismos poco exigentes.
2. Principios:
3. Preparacin:
Llevar a ebullicin y mantener durante 1-2 min, hasta conseguir una completa disolucin.
Esterilizar en el autoclave a 120C durante 15 min.
Repartir aspticamente en placas.
T rip to n a.......................................................................................................*........................... 10
Extracto de c a rn e ...................................................................................... 4............................ 5
Cloruro s d ic o .................................................. 5
Agar bacteriolgico............................................................................................................... 7,5

Control macroscpico: Medio semislido de color mbar, ligeramente opalescente.
pH a 25C: 7,1 0,2.

6. Conservacin:
F rasco s 6 meses a 2C-8C.
P la ca s..................................................................................................... 1 mes a 2C-8C.
PN T - ME - 036 PR O C E D IM IE N T O PA R A LA PR E PA R A C I N
D EL CA LD O FR A SE R SE M I (FS)
FS (Fraser Semi) es un medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Lis-
teria monocytogenes en alimentos.
2. Principios:
Listeria hidroliza la esculina del medio en glucosa y esculetina, que forma un complejo de
color negro con los iones frricos provenientes del citrato frrico.
La elevada concentracin de cloruro sdico del m edio incrementa su selectividad, mientras
que el cloruro de litio inhibe el crecimiento de la m ayora de cocos entricos que tambin
pueden hidrolizar la esculina. Asimismo, la acriflavina inhibe el crecimiento de otros m i
croorganismos Gram positivos.
El cido nalixdico bloquea la replicacin del AD N de las bacterias sensibles a este agente
antibacteriano.
3. P rep araci n :
Remover suavemente hasta conseguir una com pleta disolucin.
Repartir 225 m L de medio en frascos de 250 mL.
En el momento de utilizar, enfriar el medio a 25C 2C y aadir 2,25 m L de SUPLE
MENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI (PNT-RE-014).
Polipeptona ............................................................................................................................ 10
Extracto de levadura ............................................................................................................. 5
Extracto de carne .................................................................................................................. 5
Cloruro sdico........................................................................................................................ 20
Fosfato disdico anhidro ..................................................................................................... 9,6
Esculina .................................................................................................................................. 1
Cloruro de litio ....................................................................................................................... 3
5. C o n tro les del m edio p re p a ra d o :
Control macroscpico: Caldo de color mbar, homogneo.
pH a 25C: 7,2 0,2.

6. C onservacin:
Frascos con medio b a s e ....... 6 meses a 2C-8C.
Frascos con m edio completo 1 semana a 2C-8C,
resguardados de la luz.
P R O C E D IM IE N T O PARA LA PR EPA R A C I N
PNT - ME - 037 D E L CA LD O FR A SE R C O M PL E T O (FC )
1. F inalidad de uso:
FC (Fraser Completo) es un medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de
Listeria monocytogenes en alimentos.
2. Principios:
Listeria hidroliza la esculina del medio en glucosa y esculetina, que forma un complejo de
color negro con los iones frricos provenientes del citrato frrico.
La elevada concentracin de cloruro sdico del medio incrementa su selectividad, mientras
que el cloruro de litio inhibe el crecimiento de la mayora de cocos entricos que tambin
pueden hidrolizar la esculina. Asimismo, la acriflavina inhibe el crecimiento de otros m i
croorganismos Gram positivos.
El cido nalixdico bloquea la replicacin del ADN de las bacterias sensibles a este agente
antibacteriano.
3. P rep araci n :
En el momento de utilizar, enfriar el medio a 25C 2C y aadir a cada tubo 0,1 mL de
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER/COMPLETO (PNT-RE-015).
Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mL.
Polipeptona ............................................................................................................................ 10
Extracto de le v a d u ra ............................................................................................................ 5
Extracto de carne ................................................................................................................. 5
Cloruro sdico ...................................................................................................................... 20
Fosfato disdico anhidro .................................................................................................... 9,6
Esculina ................................................................................................................................. 1
Cloruro de litio ...................................................................................................................... 3
5. C ontroles del m edio p re p a ra d o :
Control macroscpico: Caldo de color mbar, homogneo.
pH a 25C: 7,2 0,2.
M icroorganism o Crecim iento

6. C onservacin:
Frascos con medio b a s e ....... 6 meses a 2C-8C.
Frascos con medio completo 1 semana a 2C-8C,
resguardados de la luz.

DEL AGAR OXFORD
OXFORD es un medio de cltivo selectivo utilizado para el aislamiento de Listeria mo
nocytogenes en alimentos.
2. Principios:
El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de Listeria, extracto de levadura,
que es una fuente de vitamina B y almidn, que es la fuente de energa para el desarrollo mi
crobiano.
La concentracin de cloruro sdico del medio mantiene su equilibrio osmtico.
Listeria es capaz de hidrolizar la esculina en glucosa y esculetina, que forma un compuesto
negro con los iones frricos provenientes del citrato frrico.
3. Preparacin:
En el momento de preparar las placas, aadir aspticamente a cada frasco 1 mL de SU
PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD (PNT-RE-016).
Dejar solidificar.
Polipeptona............................................................................................................................ 20
Extracto de levadura........................................ 3
Almidn ................................................................................................................................ 1
Cloruro s d ico ...................................................................................................................... 5
E sculina................................................................................................................................. 1
Citrato frrico amoniacal .................................................................................................... 0;5
Cloruro de litio ...................................................................................................................... 15
Agar bacteriolgico.............................................................................................................. 13
Control macroscpico: Medio slido de color amarillo verdoso, con reflejos azulados, li
geramente opalescente.
- pH a 25C: 7,2 0,2.
Listeria monocytogenes Bueno/Muy bueno Verde oliva, rodeadas de un halo negro
Enterococcus faecalis Dbil/Nulo
6. Conservacin:
Frascos con medio b a se .... 6 meses a 2C-8C.
Placas con medio completo 1 semana a 2C-8C,
resguardadas de la luz.
192 MTODOS DE ANLfSIS MICROBIOLGICOS DE ALIMENTOS
PR O C ED IM IEN TO PARA LA PREPARACIN

DEL AGAR PALCAM
PALCAM es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de Listeria mo
nocytogenes en alimentos.
2. Principios:
La accin combinada de la ceftazidima y el cloruro de litio hace que el medio sea muy se
lectivo.
La fermentacin del manitol por parte de las bacterias contaminantes hace que el rojo fenol
se vuelva amarillo.
El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de Listeria, extracto de levadura,
que es una fuente de vitamina B, glucosa y almidn, que son la fuente de energa para el de
sarrollo microbiano.
La concentracin de cloruro sdico del medio mantiene el equilibrio osmtico.
Listeria es capaz de hidrolizar la esculina en glucosa y esculetina, que forma un compuesto
negro con los iones frricos provenientes del citrato frrico.
3. Preparacin:
Llevar a ebullicin durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolucin^
Enfriar y mantener en un bao a 45C - 48C.
En el momento de preparar las placas, aadir aspticamente a cada frasco 1 mL de SU
PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM (PNT-RE-017).
Dejar solidificar.
4* Composicin en g/1:
Polipeptona ......................................................................................................................... 20
Extracto de levadura.......................................................................................................... 3
Glucosa .................... 0,5
A lm idn ........................................................... 1
Cloruro sdico ............................................................................................. 5
Esculina .............................................................................................................................. 0,8
Citrato frrico amoniacal ................................................ 0,5
Cloruro de litio .......................................................................................................... 15
M anitol.................................................................................................................... 10
Rojo fenol ........................................................................................................................... 0,08
Agar bacteriolgico .................................. 13
5, Controles del medio p reparado:

Control macroscpico: Medio slido de color rojo, ligeramente opalescente.
pH a 25C: 7,1 0,2.
Listeria monocytogenes Bueno/Muy bueno Verde oliva, rodeadas de un halo negro

Enterococcus faecalis Nulo .
6. Conservacin:
Frascos con medio b a se .................................................................... 6 meses a 2C-8C.
Placas con medio com pleto 1 semana a 2C-8C,
w - ------ -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
PR O C ED IM IEN TO PARA LA PREPARACI N DEL AGAR

| | p N T - ME - 040
TRIPTO N A DE SO JA -EX TRA CTO DE LEVADURA (TSYEA)
TS YEA (Agar Triptona de Soja-Extracto de Levadura) es un medio de cultivo utilizado para
el crecimiento y/o recuento de una gran variedad de microorganismos exigentes.
2. Principios:
3. Preparacin:
Disolver los componentes en 1 L de agua destilada.
Dejar solidificar.
T rip to n a.......................................................................................... 17
Peptona de s o ja ............................................................................. 3
G lucosa................................................................................................................................... 2,5
Cloruro s d ic o ....................................................................................................................... 5
Extracto de levadura.............................................................................................................. 6
Agar bacteriolgico.................................................................... 15
S, Controles del medio preparado:

Control macroscpico: Medio slido de color mbar.
pH a 25C: 7,3 0,2.

Streptococcus pyogenes Bueno
6. Conservacin:
Frascos 6 meses a 2C-8C.
Placas . 1 mes a 2C-8C.
PR O C ED IM IEN TO PARA LA PREPA RA CI N DEL

PNT - ME - 041 CALDO PARA LA UTILIZACIN DE LOS GLCIDOS
(RAMNOSA Y XILOSA)
El CALDO PARA LA UTILIZACIN DE LOS GLCIDOS (RAMNOSA Y XILOSA) es
un medio de cultivo utilizado para observar si el microorganismo estudiado es capaz de fer
mentar estos glcidos.
2. Principios:
La fermentacin de la ramnosa y la xilosa provoca la acidicacin del medio, de manera que
el indicador (prpura de bromocresol) har que el color pase de prpura a amarillo al dis
minuir el pH.
3. Preparacin:
Repartir 4,5 m L de medio en tubos de 16 x 160 mm.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min.
En el momento de utilizar, aadir aspticamente a cada tubo (segn la solucin que pre
paremos):
0,5 mL de SOLUCIN DE RAMNOSA, o
0,5 mL de SOLUCIN DE XILOSA.
NOTA: Las soluciones de glcidos se preparan disolviendo 5 g de L-ramnosa o 5 g de D-
xilosa en 100 m L de agua destilada. Esterilizar por filtracin.
Peptona ................................................................................................................................ 10
Extracto de carne ............................................................................................................... 1
Cloruro sdico .................................................................................................................... 5
Prpura de brom ocresol ........ 0,02
5. Controles del m edio preparado:
Control macroscpico: Medio slido de color prpura.
pH a 25C: 6,8 0,2.
Color medio Color medio

Microorganismo ramnosa xilosa
Listeria monocytogenes Amarillo Violeta
Listeria ivanovii Violeta Amarillo
6. Conservacin:
Tubos de medio base con tapn de ro s c a 6 meses a 2C-8C.
Tubos de medio base con sero-tapn ............................................... 1 mes a 2C-8C.
Tubos de medio completo con tapn de rosca 3 meses a 2C-8C.
Tubos de medio completo con sero-tapn........................................ 1 mes a 2C-8C.
P R O C E D IM IE N T O PA R A LA PR E P A R A C I N
| PNT - M E - 042 D E L C A L D O D E P A R K Y SA NDERS
El CALDO DE PARK Y SANDERS es un medio de cultivo utilizado para el enriqueci
miento selectivo de Campylobacter en alimentos.
2. Principios:
El elevado contenido de compuestos nutritivos de este medio favorece el rpido crecimien
to de los microorganismos, m anteniendo adems sus caractersticas de antigenidad, viru
lencia y toxicidad.
3. Preparacin:
Disolver los ingredientes en 945 m L de agua destilada.
En el momento de utilizar, aadir aspticamente a cada frasco:
50 m L de SANGRE DE CABALLO DESFIBRINADA.
5 mL de SOLUCIN DE ANTIBITICOS A (PNT-RE-018).
4. Composicin en g/945mL:
Triptona .................................................................................................................................... 10
Peptona de c a r n e ..................................................................... 10
Glucosa ................................................................................. 1
Extracto de levadura .............................................................................................................. 2
Citrato s d ic o ........................................................................................................................... 1
Cloruro sdico ........................................................................................................................ 5
Hidrogenosulfito sdico ........................................................................................................ 0,1
Piruvato sdico ....................................................................................................................... 0,25
5. C o n tro les del m edio p re p a ra d o :

Control macroscpico: Caldo de color mbar, ligeramente opalescente.
pH a 25C: 7,0 0,2.

Campylobacter sp. Bueno
6. C onservacin:

DEL AGAR KARMALI (AK)
AK (Agar de Karmali) es un medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Campylo-
bacter en alimentos, despus de un enriquecimiento previo.
2. Principios:
El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de colonias de Campylobacter,
extracto de levadura, que es una fuente de vitamina B y almidn, que es la fuente de energa
para el desarrollo microbiano.
La concentracin de cloruro sdico del medio mantiene su equilibrio osmtico, mientras que
la cicloheximida previene el desarrollo de levaduras.
El carbn activo, piruvato sdico y hematina favorecen el crecimiento y la aerotolerancia de
Campylobacter.
3. Preparacin:
En el momento de preparar las placas, aadir aspticamente a cada frasco 1mL de SU
PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI (PNT-RE-020).
Dejar solidificar.
Extracto de lev a d u ra......................................................................................................... 20
Polipeptona........................................................................................................................ 3
Almidn .............................................................................................................................. 1
Cloruro sdico ......................................................... 5
Piruvato sdico .................................................................................................................. 0,1
Carbn a c tiv o ..................................................................................................................... 4
H em atina....................... *..... 0,032
C iclohexim ida........................................................... ........................................................ 0,1
Agar bacteriolgico .......................................................................................................... 13,5

Control macroscpico: Medio slido de color negro.
pH a 25C: 7,4 0,2.
MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS DE ALIMENTOS
Campylobacter jejuni Bueno/Muy bueno
Campylobacter coli Bueno
. Conservacin:
Frascos con medio base .... 6 meses a 2C-8C.
Placas con medio completo 1 semana a 2C-8C,
PR O C ED IM IEN TO PARA LA PREPA RA CI N

PNT - ME - 044
DEL AGAR BU TZLER M O DIFICA DO
El AGAR BUTZER MODIFICADO es un medio de cultivo selectivo utilizado para el ais
lamiento de Campylobacter en alimentos, despus de un enriquecimiento previo.
2. Principios:
El medio contiene elementos adecuados para el crecimiento de colonias de Campylobacter.
3. Preparacin:
Fundir el medio base AGAR DE SANGRE COLUMBIA (PNT-ME-046) en un bao a
45C - 48C.
Aadir el SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER (PNT-RE-021).
Dejar solidificar.
En el momento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie est li
bre de humedad.
Ver PNT-ME-053.

Control macroscpico: Medio slido de color rojo.
pH a 25C: 7,3 0,2.
Campylobacter jejuni Bueno/Muy bueno

Campylobacter coli Bueno
6. Conservacin:
Frascos con medio b a s e ...................................................................... 6meses a 2C-8C.
Placas con medio completo, sin secar ......................................... 4 horas a T ambiente o
3 das a 2C-8C.
PR O C E D IM IE N T O PARA LA PR EPA R A C I N
PNT - ME - 045
D EL CALDO DE BRUCELLA (CB)
CB (Caldo de Brucella) es un medio de cultivo no selectivo para microorganismos exigen
tes.
2. Principios:
El medio tiene un elevado poder nutritivo.
El bisulfito sdico acta como agente reductor.
3. Preparacin:
Repartir en frascos o tubos, segn uso.
4* Composicin en g/l:
T rip to n a................................................................................................................................... 10
Peptona de carne .................................................................................................................... 10
Extracto de levadura............................................................................................................... 2
G lucosa.................................................................................................... 1
Cloruro s d ic o ........................................................................................................................ 5
Bisulfito sdico ...................................................................................................................... 0,1

Control macroscpico: Caldo transparente de color mbar, sin precipitado.
pH a 25C: 7,0 0,2.
Brucella abortus* Bueno/Muy bueno

Campylobacter jejuni Bueno
* Incubar en C 0 2.
6. Conservacin:
Frascos con medio b a s e ....................................................................... 6 meses a 2C-8C.
Tubos con tapn de r o s c a 3 meses a 2C-8C.

PNT - ME - 046
DEL AGAR DE SANGRE COLUM BIA
AGAR DE SANGRE COLUMBIA es un medio de cultivo altamente nutritivo utilizado para
el aislamiento de una gran variedad de microorganismos exigentes.
2. Principios:
El medio contiene peptona, que favorece el crecimiento de las colonias y extracto de leva
dura, que es una fuente de vitamina B.
El almidn, adems de proporcionar energa, acta como agente desintoxicante.
La adicin de sangre de cordero desfibrinada favorece la deteccin de reacciones hemolti-
cas y suministra el factor X necesario para el crecimiento de un gran nmero de bacterias.
3. Preparacin:
En el momento de utilizar, aadir aspticamente 5 mL de SANGRE DE CORDERO
ESTRIL.
Dejar solidificar.
En el momento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie est li
bre de humedad.
Polipetona............................................................................................... 17
Peptona pancretica....................................................... 3
Extracto de levadura........................................................................................................ 3
Almidn de maz ................................................................................ 1
Cloruro sdico .......................................................... 5
Agar bacteriolgico ................... 13,5
Control macroscpico: Medio slido opaco de color rojo.
pH a 25C: 7,3 0,2.
Microorganismo Crecimiento Tipo de hemolisis

Streptococcus pyogenes Bueno/Muy bueno Beta
Staphylococcus aureus Muy bueno Beta/Gamma
6. Conservacin:
Frascos con medio b a se ..................................................................... 6meses a 2C-8C.
Placas con medio completo, sin s e c a r........................................ 4 horas a T ambiente o
1 mes a 2C-8C.
P R O C E D IM IE N T O PA RA LA P R E P A R A C I N
PNT - M E - 047 D E L A G A R D E SA N G R E M U E L L E R -H IN T O N
AGAR DE SANGRE M UELLER-HINTON es un medio de cultivo utilizado para el estudio
de la susceptibilidad de las bacterias a los antibiticos y sulfamidas.
2. Principios:
Este medio se utiliza junto a unos discos d e papel impregnados con antibiticos. AI situar los
discos en el agar, estos absorben una cantidad de agua suficiente para disolver el antibitico,
que se difunde en el medio.
De esta form a de crea un gradiente de concentracin de antibitico alrededor del disco,
mientras que las bacterias inoculadas se v a n multiplicando hasta que encuentran una zona
con una cantidad inhibitoria de antibitico.
3. Preparacin:
Disolver 38 g de m edio deshidratado en 1 L de agua destilada.
Atem perar en un bao a 45C - 48C.
Aadir 5 m L de SANGRE DE CO RD ERO ESTRIL.
M ezclar suavemente.
Repartir aspticamente el medio en placas Petri estriles formando una capa de unos 4 m m
de grosor.
Dejar solidificar.
En el m omento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie est li
bre de humedad.
Hidrolizado de c a se n a ........................................................................................................... 17,5
Infusin de carne .................................................................................................................... 2
Almidn soluble ..................................................................................................................... 1,5
Agar bacteriolgico ................................................................................................................ 17

Control macroscpico: M edio slido de color rojo.
pH a 25C: 7,3 0,2.

Streptococcus pyogenes Bueno/M uy bueno
6. C onservacin:
Frascos con m edio base ......................................................................... 6 meses a 2C-8C.
Placas con medio completo, sin secar ........................................... 4 horas a T ambiente o
1 mes a 2C-8C.

PNT - ME - 048
AGAR CITRATO DE HIERRO TRES AZCARES (TSI)
TSI (Agar Citrato de Hierro Tres Azcares) es un medio de cultivo utilizado para la identi
ficacin de enterobacterias.
2. Principios:
La fermentacin de los azcares contenidos en el medio (glucosa, lactosa y sacarosa) pro
duce una acidificacin que hace que ste pase de rojo a amarillo.
Las bacterias que fermentan nicamente la glucosa se detectan al volver el medio rpida
mente a su coloracin inicial en la parte superior del tubo. Aqullas que no fermentan nin
guno de los tres azcares no harn cambiar el color del medio.
La produccin de cido sulfhdrico se observa por la presencia de deposiciones negras de
sulfuro de hierro en el fondo del tubo producidas por la reaccin del tiosulfato en presencia
del citrato frrico.
Asimismo, la produccin de gas en la fermentacin se detecta por la aparicin de burbujas o
la rotura del agar.
3. Preparacin:
Repartir 5-6 mL en tubos de 16 x 160 mm.
Inclinar los tubos para obtener un fondo y una pendiente de 3 cm de profundidad.
Extracto de carne .............................................................................................................. 3
Extracto de lev ad u ra......................................................................................................... 3
Peptona ............................................................................................................................... 14
Cloruro sdico ................................................................................................................... 5
L ac to sa................... 10
S ac aro sa .............................................................................................................................. 10
G lu c o sa ................................................................................... 1
Citrato frrico .......................................................................... ................... 0,3
Tiosulfato sdico ............................................................................................................... 0,3
Rojo fenol .......................................................................................................................... 0,024
Agar bacteriolgico .......................................................................................................... 13,5

Control macroscpico: Medio slido de color rojizo.
pH a 25C: 7,4 0,2.
Microorganismo Crecimiento Pendiente Fondo Gas sh 2
Shigella flexneri Bueno Roja Amarillo
Citrobacter freundii Bueno Amarilla Amarillo + +
( Conservacin:
Tubos sin inclinar 6 meses a 2C-8C.
Tubos inclinados. 1 semana a 2C-8C.
PR O C ED IM IEN TO PARA LA PREPA RA CI N

PNT - ME - 049
DEL CALDO TR IPTO N A DE SO JA (TSB)
TSB (Caldo Triptona de Soja) es un medio de cultivo nutritivo universal utilizado para el
crecimiento y recuperacin de microorganismos exigentes (aerobios o anaerobios).
2. Principios:
La composicin del medio permite el crecimiento satisfactorio de una amplia variedad de
microorganismos.
El cloruro sdico mantiene el equilibrio osmtico, mientras que el fosfato dipotsico man
tiene el pH.
3. P reparacin:
Disolver 30 gr de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.
T rip to n a ............................................................................................................................... 17
Peptona de s o ja ...................................................................................................................... 3
G lu cosa................................................................................................................................... 2,5
Cloruro s d ico ....................................................................................................................... 5
Fosfato dipotsico................................................................................................................. 2,5
5. C ontroles del medio preparado:

Control macroscpico: Caldo de color mbar, translcido.
pH a 25C: 7,3 0,2.
M icroorganism o Crecim iento

6. Conservacin:
Tubos con sero-tapn 6 meses a 2C-8C.
CAPTULO SPTIMO
Procedimiento general de preparacin

de reactivos (PNT - RE - 001)
PROCEDIM IENTO GENERAL DE PREPARACIN
P N T - R E -001 DE REACTIVOS
I. OBJETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la preparacin de los re

activos necesarios para realizar los anlisis de alimentos y aguas.
2. AMBITO DE APLICACION
Se aplica a todos los reactivos que se preparan en la Unidad de Microbiologa, y se utilizan en los
ensayos que se realizan en este laboratorio.
3. REFERENCIAS
ISO 7218 (1996): Microbiologa de alimentos. Reglas generales para los exmenes mi-
crobiolgicos.
4. PROCEDIM IENTO
Se redactar un PNT para cada uno de los reactivos necesarios para realizar los ensayos de este
laboratorio; en l se darn instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar su preparacin.
Estos procedimientos se denominan PNT - RE y constan de los siguientes apartados:
0. Cartula.
1. Finalidad de uso.
2. Principios.
3. Preparacin.
4. Composicin.
5. Controles del reactivo preparado.
6. Conservacin.
7. Medios utilizados.
4.1. C artula
En la cartula deberemos indicar:
Nombre del reactivo que se va a preparar, segn su denominacin en el mtodo o el

PNT - AL en el que se utiliza. Si el producto puede ser empleado con distinta concentra
cin, sta deber constar en el ttulo.
Tipo y nmero del PNT: PNT - RE - seguido por un nmero de tres cifras. Los procedi
mientos se han numerado segn el orden en el que aparecen en los PNT - ME.
110 M TO DO S DE A N LISIS MICROBIOLGICOS DE ALIM ENTOS
..
42 Finalidad de uso
kft finalidad de uso explica la utilidad del reactivo en el ensayo en el que se utiliza.
4.3. Principios
Bn este apartado se explica, de manera resumida, el modo de accin del reactivo.
4.4. Preparacin
Se indica, de forma clara y concisa, cada uno de los pasos a seguir para preparar el reactivo, in
dicando la cantidad de los ingredientes necesarios, el tipo, volumen y calidad del diluyente uti
lizado, el modo de disolverlos y, en caso necesario, el modo de esterilizacin (tiempo y tempe
ratura si se esteriliza con autoclave o tipo de membrana si la esterilizacin es por filtracin).
NOTA 1: Es frecuente que los ingredientes del reactivo se presenten en viales cuyo conte
nido es una mezcla de las cantidades necesarias de los componentes. En este caso, slo se in
dicar el volumen de diluyente necesario para reconstituirlo. Estas presentaciones y recons
tituciones dependen de las marcas comerciales. Siempre habr que cumplir las indicaciones
del proveedor.
4.5. Composicin
Bate apartado es una lista de cada uno de los ingredientes, indicando su nombre, calidad (si es ne
cesario) y cantidad exacta. Incluiremos tambin la cantidad y calidad de los diluyentes, excepto
Cuando la preparacin se realiza a partir de un vial a reconstituir.
NOTA 2: Esta lista est elaborada a partir de las instrucciones del fabricante del medio uti
lizado en el laboratorio en el que se han redactado los PNT, de manera que se tendr que
adaptar, en cada caso, a las instrucciones del proveedor.
4.6. Controles del reactivo preparado
Batos controles (detallados en el PNT-RE-002) se realizan para confirmar la calidad del reactivo
y constan de dos pruebas:
Control macroscpico (examen visual).

Control microscpico (examen analtico), formado por un control de esterilidad y otro de
eficacia. Estos controles no.se hacen en todos los productos y su realizacin depender del
tipo de reactivo.
Cuando son reactivos preparados por casas comerciales o suplementos de medios de cultivo,
ft asume que estos han sido controlados por el proveedor.
4.7. Conservacin
Indicar las condiciones de tiempo y temperatura necesarias para la conservacin del producto en
condiciones ptimas, de manera que su finalidad no se vea alterada.
PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIN DE REACTIVOS (PNT - RE - 001) 211
En aquellos reactivos que se puedan alterar con la luz o la humedad, debern indicarse estas
condiciones particulares de almacenamiento.
NOTA 3: Cuando se indica que el reactivo debe utilizarse inmediatamente, se permite que
el producto se pueda emplear durante un periodo de 5 horas despus de su preparacin.
4.8. Medios utilizados
En este apartado se sealan los medios o reacciones bioqumicas en los que se emplea el reacti
vo, indicando la cantidad y el momento en que se aade.
CAPTULO OCTAVO
Procedimiento general de control

de calidad de reactivos (PNT - RE - 002)
PNT - RE - 002
PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL
DE CALIDAD DE REACTIVOS
1. O B JETO
El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la realizacin de los con
troles de reactivos.
2. M BITO DE APLICACIN
Se aplica a todos los reactivos que se preparan en la Unidad de Microbiologa y se utilizan en los
ensayos que se realizan en este laboratorio.
3. REFER EN CIA S
ISO 7218 (1996): Microbiologa de alimentos. Reglas generales para los exmenes mi-
crobiolgitos.
4. PR O C ED IM IEN TO
Los reactivos utilizados en los ensayos del laboratorio deben pasar unos controles, que se espe
cifican en el apartado 5 de su PNT - RE correspondiente. Estos controles se adaptan segn el tipo
de reactivo y su finalidad de uso.
En general se realiza:
Un control macroscpico.
Un control de esterilidad.
Un control de eficacia.
En algunos reactivos se han de hacer controles peridicos, tal como se indica en su PNT - RE
correspondiente, para asegurar que no pierden calidad durante su almacenamiento.
4.1. C ontrol macroscpico
El control macroscpico es un examen visual que se realiza en todos los casos para poder des
cartar cualquier error importante en la preparacin del reactivo. Se observa si su consistencia (en
general lquida), su color y su aspecto (transparente, opalescente, con o sin precipitado...) co
rresponden con los que se indican en el PNT.
4.2. C ontrol de esterilidad
Este control se efecta en aquellos productos que, por su composicin, son susceptibles de
contaminarse, cosa que les hara inadecuados para su finalidad.
215
lia M i-1 0 1 to a b * ANAblilB M ie n o i iO L a ic o s o e a i.im i.n t o h
El control de esterilidad delw realizante en cabina de flujo laminar, utilizando un medio de

eultlvo puru microorganismos aerobios (en general TSB) y otro para anaerobios (en general TIO).
Ambos medios se especif ican en el PNT - RE correspondiente.
La operacin consiste en introducir en los medios correspondientes una pequea cantidad de
reactivo, en general I mL. En el medio TIO, sembrar en el fondo del tubo, evitando introducir
aire.
Despus de incubar a 30C 1C durante 72 h 2 h, se observa si hay turbidez o cambio en
el color.
NOTA 1: Antes de utilizar, el medio TIO se ha de regenerar, desoxigenndolo durante

10 minutos en un bao con agua hirviendo.
NOTA 2: En caso de duda, se realiza un subcultivo, sembrando con asa en TSYEA a

partir del medio TSB y en TSYEA y TSC sin cicloserina a partir del medio TIO. Incubar
a 30C 1C durante 48 h 2 h (cuando se siembra a partir del medio TIO, incubar en
anaerobiosis).
4.3. Control de eficacia

Ente control se realiza para comprobar la eficacia del reactivo. Sin embargo, el control se efecta
nicamente en aquellos productos que se elaboran en el mismo laboratorio, pues se supone
que las preparaciones comerciales garantizan su eficacia. As pues, en PNT - RE correspondiente
indicar si se debe realizar el control de eficacia, sealando, en este caso, las cepas y el medio
que se han de utilizar.
En ciertos reactivos, como el ONPG y la FA, se hace un control con cepas positivas, otro con
cepas que dan un resultado negativo y un control sin sembrar. En otros casos el control se reali
za despus de la inclusin del producto en el medio de cultivo, como sucede con la yema de hue
vo, los antibiticos y los suplementos, o se utilizan como reveladores de reacciones bioqumicas,
combinndose con los medios de cultivo u otros substratos.
CAPTULO NOVENO
Procedimientos de preparacin
de reactivos
RELA CI N DE REACTIVOS Y M ED IO AL QUE SE AADEN
MEDIO AL
PNT-RE REACTIVOS QUE SE PNT-ME
AADE
*003 SUPLEMENTO ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA CGA 006
004 SOLUCIN ESTRIL DE YEMA DE HUEVO BP/MYPA 019/022
005 TELURITO POTSICO AL 1% BP 019
006 SULFAMETAZINA AL 0,2% BP 019
007 SULFATO DE POLIMIXINA B AL 4% MYPA 022
008 ROJO DE METILO MR-VP 023
009 SOLUCIN DE a-NAFTOL MR-VP 023
010 SOLUCIN DE KOH AL 40% MR-VP 023
011 REACTIVO DE NITRATOS MN 024
012 METABISULFITO SDICO AL 1,2% LS 029
013 CITRATO FRRICO AMONIACAL AL 1% LS 029
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER FC 036
014
SEMI
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER FC
015 037
COMPLETO
016 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD OXFORD 038
017 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM PALCAM 039
SOLUCIN DE ANTIBITICOS A PARA EL CALDO PARK Y

018 042
DE PARK Y SANDERS SANDERS
SOLUCIN DE ANTIBITICOS B PARA EL CALDO PARK Y

019 042
DE PARK Y SANDERS SANDERS
020 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR KARMALI AK 043
021 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER BUTZLER 044
022 REACTIVO DE KOVACS 017
023 SOLUCIN SALINA SS
REACTIVO PARA LA INVESTIGACIN DE LA ONPG

024
j8-GALACTOSIDASA
025 SOLUCIN DE FENILALANINA AL 0,5% FA
026 CLORURO FRRICO AL 10%
91Q
no mUtodoi o A N A U |l|M ie n o iiO L a ic o 8 oe a lim e n to s

SUPLEMENTO ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA
GENTAMICINA es un suplemento antimicrobiano selectivo que se aade al medio CGA
para el recuento de levaduras y mohos en alimentos segn el mtodo AFNOR.
2. Principios:
Este antibitico inhibe el crecimiento de la mayora de bacterias, favoreciendo as el desa
rrollo de levaduras y mohos.
3. Preparacin:
Aadir aspticamente 5 mL de agua destilada estril al vial con el producto liofilizado.
Disolver cuidadosamente, evitando la formacin de espuma.
Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL ms de diluyente.
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re
constitucin y conservar segn lo indicado en el punto 6.
4. Composicin:
Sulfato de gentamicina...................................................................................................... 25 mg.
5. Controles del reactivo preparado:

Control macroscpico: Lquido incoloro.
Control de eficacia: En CGA con levaduras y mohos.
6. Conservacin:
Vial sin reconstituir .................................................... A 2C-8C, protegidos de la luz,
hasta la fecha de caducidad.
Vial reconstituido ................................................ 1 mes a 2C-8C, protegidos de la luz.
Placas preparadas................................................. Usar el mismo da de la preparacin.
7. Medios utilizados:
CGA (PNT-ME-006): Aadir 2 mL de suplemento a 100 mL de medio.
MOCIDIMIflNTOS DB FRBPARACION DB RBACTIVOB 221
P N T -R E -0 0 4
DE LA SOLUCIN ESTRIL DE YEMA DE HUEVO
La SOLUCIN ESTRIL DE YEMA DE HUEVO es un aditivo que se aade a algunos
medios para enriquecerlos y para facilitar la identificacin por la accin lecitinasa.
2. Principios:
La adicin de yema de huevo a medios slidos en placa permite visualizar una zona clara al
rededor de las colonias que poseen proteasas y a veces otro halo de precipitacin por lipo-
lisis.
3. Preparacin:
Limpiar los huevos con agua y jabn.
Aclarar, secar y rociar con alcohol, dejndolo evaporar.
Romper la cscara por un extremo y hacer un agujero con unas tijeras estriles.
Aspirar la clara con una pipeta estril de 5 mL con la punta rota.
Transferir la yema a un frasco estril de 250 mL.
Diluir con agua destilada estril en una proporcin 1:4.
Homogeneizar por agitacin.
Calentar en un bao a 45C 0,5C durante 2 h.
Dejar sedimentar en nevera durante 18 h - 24 h.
Separar el sobrenadante de forma asptica y trasvasarlo a un recipiente estril.
4 Composicin:
Yema de huevo 1 unidad (=20 mL).
Agua destilada 80 mL.

Control macroscpico: Solucin lquida de color amarillo anaranjado.
Control de esterilidad: En TSB y TIO.
Control de eficacia: En BP con Staphylococcus aureus o en MYPA con Bacillus cereus.
6. Conservacin:
A 4C, realizando controles de esterilidad peridicamente y antes de cada uso.
BP (PNT-ME-019): Aadir 10 mL de suplemento a 190 mL de medio, en el momento de
preparar las placas.
MYPA (PNT-ME-022): Aadir 20 mL de suplemento a 180 mL de medio, en el momento
de preparar las placas.
MI MTODO* 01 A N A L IIII MICROIIOLOlCOe DE ALIMENTOS

DEL TELURITO POTSICO AL 1 %
El TELURITO POTSICO AL 1% es un agente selectivo que se utiliza en algunos medios
para estafilococos como reactivo inhibidor y diferencial.
2. Principios:
Evita el crecimiento de la mayora de los microorganismos Gram negativos y de los Gram
positivos que no son capaces de reducirlo.
Hay una correlacin entre la capacidad de reduccin del telurito potsico a teluro y la pato-
genicidad de los estafilococos.
Los estafolococos que pueden reducir el telurito a teluro, formando colonias negras.
3. Preparacin:
Disolver 1 g de telurito potsico en 100 mL de agua destilada.
Esterilizar por filtracin con filtro de membranas de 0,45 jli de tamao de poro.
4. Composicin:
Telurito potsico ................................................................................................................. 1g.
Agua destilada................................................................................................................ 100 mL.

Control de eficacia: En BP con Staphylococcus aureus.
6. Conservacin:
A 4C, protegido de la luz.
BP (PNT-ME-019): Aadir 2 mL de suplemento a 190 mL de medio, en el momento de
PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIN DE REACTIVOS 223

PN T - RE - 006
DE LA SULFAMETAZINA AL 0,2%
L a SULFAM ETAZINA AL 0,2% es un suplemento antimicrobiano selectivo que se aade
al medio BP para facilitar el recuento de estafilococos en alimentos.
2. Principios:
Este antibitico lim ita el crecimiento de Proteus.
3. Preparacin:
Disolver cuidadosamente la sulfametazina en la disolucin de hidrxido sdico, evitando
la formacin de espuma.
Aadir 90 mL de agua destilada.
Esterilizar por filtracin con filtro de membranas de 0,22 |i de tamao de poro.
4. Composicin:
Sulfametazina ..................................................................................................................... 0,2 g.
Disolucin de hidrxido sdico (0,1 m o l/L )................................................................. 10 mL.
5. Controles del reactivo prparado:

6. Conservacin:
Disolucin preparada ............................................................................... 1 mes a 3C 2C.
BP (PNT-ME-019): A adir 10 mL de disolucin a 190 mL de medio, en el momento de
H4 M iT O P O I B l A N 4 U B H M IBW QIIO LOaiCOl DB ALIMENTOS

DEL SULFATO DE POLIMIXINA B AL
El SULFATO DE POLIMDQNA B AL 4% es un suplemento selectivo utilizado en los me
dios MYPA y PEMBA para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus.
2. Principios:
Inhibe el crecimiento de la flora acompaante.
3. Preparacin:
Aadir aspticamente 5 mL de agua destilada estril al vial con el producto lioflizado.
Disolver cuidadosamente.
Evitar la congelacin.
4. Composicin:
Polimixina B .............................................................................................................. 50.000 IU.
Si Controles del reactivo preparado:

6i Conservacin:
Vial sin reco n stitu ir.......................................... A 2C-8C, hasta la fecha de caducidad.
Vial reconstituido ............................................. 1 mes a 2C-8C.
7i Medios utilizados:
MYPA (PNT-ME-022): Aadir 2 mL de suplemento a 180 mL de medio, en el momento
de preparar las placas.
PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION DE REACTIVOS 226

P N T - R E -008
DEL ROJO DE METELO
El ROJO D E M ETILO se utiliza como indicador de pH en la prueba del Rojo de M etilo de
los tests IMVIC.
2. Principios:
Las enterobacterias pueden fermentar la glucosa mediante 2 vias: la cido-mixta y la 2,3,bu-
tanodilica.
As, despus de la incubacin en el medio predominan los productos cidos si la va es la
cido-mixta, m ientras que si es la 2,3,butanodilica predominan los productos neutros.
Al aadir el indicador al medio, ste virar a rojo si el medio es cido, mientras que cam
biar a amarillo si no ha habido acidificacin.
3. Preparacin:
Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 mL de etanol absoluto.
Aadir agua destilada hasta obtener un volumen de 500 mL.
4. Composicin:
Rojo de metilo 0,1 g.
Etanol ............. 300 mL.

Control macroscpico: Lquido de color naranja-rojo.
Control de eficacia: En RM-VP con Escherichia coli (positivo) y Enterobacter cloacae
(negativo).
6. Conservacin:
A T ambiente.
M R-VP (PNT-ME-023): Aadir 5 gotas de reactivo en un cultivo de unos 2-3 mL, que ha
estado incubado durante 24 h.
I M lT O D O I D I ANALIBI* MICHOHIOLQIC08 DE ALIMENTOS

PN T - RE - 0 0 9
DE LA SOLUCIN DE a-NAFTOL
La solucin de a-NAFTOL se utiliza junto con el KOH como indicador en la prueba de
Voges-Proskauer de la fermentacin de la glucosa en los tests IMVIC.
2. Principios:
Las enterobacterias pueden fermentar la glucosa mediante 2 vias: la cido-mixta y la 2,3, bu-
tanodilica.
El a-naftol detecta los metabolitos que se forman en la va 2,3, butanodilica, haciendo que
la superficie del medio cambie a rojo, en condiciones aerobias.
Este viraje se manifiesta si el medio se encuentra en condiciones alcalinas; ste es el motivo
por el que aadimos tambin KOH.
3. Preparacin:
Disolver 5 g de a-naftol en 100 mL de etanol absoluto.
4. Composicin:
a-naftol ........................................................................................................................... 5 g.
Etanol .....................................................................................

Control macroscpico: Lquido translcido de color rosado.
Control de eficacia: En RM-VP, junto con KOH, con Enterobacter cloacae (positivo) y
Escherichia coli (negativo).
6. Conservacin:
A 4C, resguardados de la luz, hasta que se vuelva de color marrn con precipitado.
MR-VP (PNT-ME-023): Aadir 10 gotas de solucin en un cultivo de unos 2-3 mL, que
ha estado incubado durante 24 h. Aadir el KOH y despus el a-naftol; agitar y dejar re
posar de 15 min a 2 h.
NOTA: Para acelerar el proceso, se puede:
Calentar suavemente el tubo con el medio.
Oxigenar el tubo.
Aadir cristales de creatina.

PNT * R E -010
DE LA SOLUCIN DE KOH AL 40%
La solucin de KOH AL 40% se utiliza junto con el a-naftol para alcalinizar el medio en la
prueba de Voges-Proskauer de la fermentacin de la glucosa en los tests IMVIC.
2. Principios:
El KOH se aade al medio con la finalidad de aumentar su pH.
3. Preparacin:
Disolver 40 g de KOH en 100 mL de agua destilada.
4. Composicin:
KOH .............. 40 g.

Control de eficacia: En RM-VP, junto con a-naftol, con Enterobacter cloacae (positivo)
y Escherichia coli (negativo).
6. Conservacin:
A T ambiente.
MR-VP (PNT-ME-023): Despus de aadir el a-naftol, aadir 6 gotas de solucin en un
cultivo de unos 2-3 mL, que ha estado incubado durante 24 h. Agitar y dejar reposar de 15
min a 2 h.
NOTA: Para acelerar el proceso, se puede:

Calentar suavemente el tubo con el medio.
Oxigenar el tubo.
Aadir cristales de creatina.

PNT - RE - 011
DEL REACTIVO DE NITRATOS
El REACTIVO DE NITRATOS se utiliza para identificar la enzima nitrato-reductasa.
2. Principios:
Los microorganismos que poseen el enzima reducen los nitratos a nitritos. Los nitritos, al
reaccionar con estos reactivos, producen un compuesto azoico de color rosa-rojo.
3. Preparacin:
Disolver 0,1 g de 5,2 ANSA en 100 mL de cido actico (15% v/v).
Disolver 0,4 g de cido sulfamnico en 100 mL de cido actico (15% v/v).
Filtrar separadamente las dos soluciones en papel de filtro.
4. Composicin:
Solucin A: 5,2, A N S A 0,1 g.
cido actico (2,6 mol/L) 100 mL.
Solucin B: cido sulfanlico 0,4 g.
cido actico (2,6 m o l/L ) 100 mL.
5 Controles del reactivo preparado:

Control macroscpico: Lquidos incoloros.
Control de eficacia: En MN con Escherichia coli (positivo) y Acinetobacter sp. (negativo).
6. Conservacin:
A 5C, resguardados de la luz, mientras se conserven incoloros o rosa plido.
MN (PNT-ME-024): Aadir 0,2 mL de cada solucin al cultivo incubado durante 24 h
2 h.
La reaccin acostumbra a ser instantnea; si no hay cambio de color en 15 minutos, aa
dir zinc en polvo. El zinc reduce los nitratos que quedan en el medio. Si la reaccin con
tinua siendo negativa significa que los nitratos se haban reducido directamente a N2. Una
reaccin positiva con zinc indica que no haba habido ningn tipo de reduccin previa.
NOTA: En caso de no disponer de ANSA, utilizar:

Solucin A: cido sulfanlico 0,8 g.
cido actico (5 mol/L) 100 mL.
Solucin B: a -n a fto l 0,5 g.
cido actico (5 mol/L) 100 mL.

PNT - RE - 012
DEL METABISULFITO SDICO AL 1,2%
El METABISULFITO SDICO AL 1,2% se utiliza como agente reductor e indicador.
2. Principios:
En el medio LS, la reduccin del sulfito por parte de los clostridios en presencia del citrato
frrico da lugar a la formacin de sulfuro de hierro, que forma un precipitado negro en el
fondo del tubo.
3. Preparacin:
Disolver 1,2 g de metabisulfito sdico en 100 mL de agua destilada.
Esterilizar por filtracin con filtro de membrana de 0,45 p de tamao de poro.
4. Composicin:
Metabisulfito s d ic o ..................................................................................................... 1,2 g.
Agua destilada .............................................................................................................. 100 mL.

Control de eficacia: En LS con Clostridium perfringens.
6. Conservacin:
A 4C durante 24 h.
LS (PNT-ME-029): Aadir 0,5 mL de reactivo en cada tubo con 10 mL de medio, en el
momento de utilizar.

P N T - R E -0 1 3
DEL CITRATO FRRICO AMONIACAL AL 1%
El CITRATO FRRICO AMONIACAL AL 1% se utiliza como componente diferencial y
indicador.
2. Principios:
En el medio LS, la reduccin del metabisulfito por parte de los clostridios en presencia del
citrato frrico da lugar a la formacin de sulfuro de hierro, que forma un precipitado negro
en el fondo del tubo.
3. Preparacin:
Disolver 1 g de citrato de hierro en 100 mL de agua destilada.
Esterilizar por filtracin con filtro de membrana de 0,45 p. de tamao de poro.
4. Composicin:
Citrato frrico amoniacal ................................................................................................... 1g.
Agua d estilad a................................................................................................................ 100 mL.

Control macroscpico: Lquido de color mbar.
Control de eficacia: En LS con Clostridium perfringers.
6. Conservacin:
A T ambiente durante 24 h.
LS (PNT-ME-029): Aadir 0,5 mL de reactivo en cada tubo con 8 mL de medio, en el
momento de utilizar.
NOTA: En caso de no disponer de citrato frrico amoniacal, utilizar SULFATO DE

HIERRO.
PNT - RE - 014 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIN DEL

SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI se utiliza con el
medio para el enriquecimiento primario para la deteccin de Listeria monocytogenes en ali
mentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de dos agentes antimicrobianos (el cido nalixdico y la acri-
flavina) y un reactivo (el citrato frrico). El cido nalixdico bloquea la replicacin del
ADN de las bacterias sensibles a l, mientras que la acriflavina impide el crecimiento de bac
terias Gram positivas.
Evita el crecimiento de la mayora de los microorganismos contaminantes, favoreciendo as
el crecimiento de Listeria.
El citrato de hierro se utiliza para visualizar la esculetina, que es producida por Listeria a
partir de la esculina. En presencia de iones frricos, la esculetina forma precipitados negros,
que aparecen progresivamente. Asimismo, el hierro favorece el crecimiento de Listeria.
3. Preparacin:
Aadir aspticamente 5 mL de solucin 1:1 de etanol y agua destilada estril al vial con el
producto lioflizado.
4. Composicin:
cido nalixdico 5 mg.
Clorhidrato de acriflavina 6,25 mg.
Citrato de hierro (III) am oniacal................................................................................ 250 mg.

Control macroscpico: Lquido oscuro, que puede contener precipitado.
6. Conservacin:
Vial sin reconstituir A 2C-8C, protegido de la luz,
Vial reconstituido ............ 1 mes a 2C-8C, protegido de la luz.
FRASER SEMI (PNT-ME-036): Aadir 2,25 mL de suplemento a 225 mL de medio, en
friado a 25C, en el momento de utilizar.

P N T - M E -0 15 DEL SUPLEMENTO SELECTIVO PARA
EL CALDO FRASER COMPLETO
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER COMPLETO se utiliza
con el medio para el enriquecimiento secundario para la deteccin de histeria monocytoge-
nes en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de dos agentes antimicrobianos (el cido nalixdico y la acri-
flavina), en una concentracin distinta a la del medio FRASER SEMI, y un reactivo (el ci
trato frrico). El cido nalixdico bloquea la replicacin del ADN de las bacterias sensibles
a l, mientras que la acriflavina impide el crecimiento de bacterias Gram positivas.
El citrato de hierro se utiliza para visualizar la esculetina, que es producida por Listeria a
partir de la esculina. En presencia de iones frricos, la esculetina forma precipitados negros,
que aparecen progresivamente. Asimismo, el hierro favorece el crecimiento de Listeria.
3. Preparacin:
producto liofilizado.
4. Composicin:
cido nalixdico ............................................................................................................ 10 mg.
Clorhidrato de acriflavina 12,5 mg.
Citrato de hierro (III) am oniacal.................................................................................. 250 mg.

Control macroscpico: Lquido oscuro, que puede contener precipitado.
6. Conservacin:
Vial sin reconstituir A 2C-8C, protegido de la luz,
Vial reconstituido .. 1 mes a 2C-8C, protegido de la luz.
FRASER COMPLETO (PNT-ME-037): Aadir 0,1 mL de suplemento en cada tubo con
10 mL de medio, enfriado a 25C, en el momento de utilizar.
PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIN DE REACTIVOS
m
PNT - RE - 016
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD se utiliza para la deteccin y
recuento de Listeria en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de tres antibiticos (la colistina, el cefotetn y la fosfomicinu),
un agente antifngico (la cicloheximida) y un tinte antisptico (la acriflavina).
Evita el crecimiento de la mayora de los microorganismos contaminantes, favoreciendo un
3. Preparacin:
NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re-
4. Composicin:
C iclohexim ida...... 200 mg.
Sulfato de colistina 10 mg.
C e fo te t n ............... 1 mg.
Fosfom icina.......... 5 mg.
Acriflavina ........... 2,5 g.

Control macroscpico: Solucin fluorescente de color amarillo-verdoso.
6. Conservacin:
Vial sin reconstituir ....................................................... A 2C-8C,protegido de la luz,
Vial reconstituido ................................................... 1 mes a 2C-8C, protegido de la luz.
AGAR OXFORD (PNT-ME-038): Aadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en el
momento de preparar las placas.
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DEL

PNT - RE - 017
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM
El SUPLEM ENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM se utiliza con el medio
para la deteccin y recuento de Listeria en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de antibiticos (la polimixina y la ceftazidima) y un tinte an
tisptico (la acriflavina).
3. Preparacin:
4. Composicin:
Sulfato de polimixina B .................................................................................................. 5 mg.
C eftazidim a.......................................................................................................................... 10mg.
A criflav in a............................................................................................................................ 2,5g.

Control macroscpico: Solucin transparente de color amarillo.
6* Conservacin:
Vial sin reco n stitu ir....................................................... A 2C-8C, protegido de la luz,
Vial reconstituido...................................................... 1mes a 2C-8C, protegido de la luz.
AGAR PALCAM (PNT-ME-039): Aadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en el
momento de preparar las placas.

PNT - M E - 018 DE LA SOLUCIN DE ANTIBITICOS A
PARA EL CALDO DE PARK Y SANDERS
La SOLUCIN DE ANTIBITICOS A se aade al caldo de Park y Sanders para la de
teccin de Campylobacter termotolerantes en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de antibiticos (la vancomicina y el lactato de trimetoprima).
el crecimiento de Campylobacter.
3. Preparacin:
Disolver los componentes en 10 mL de solucin 1:1 de etanol al 95% y agua destilada es
tril.
Esterilizar por filtracin con filtro de membrana de 0,45 jn de tamao de poro.
4. Composicin:
V ancom icina..................................................................................................................... 0,02 g.
Lactato de trim etoprim a.................................................................................................. 0,02 g.
E ta n o l................................................................................................................................. 5 mL.
Agua destilada .................................................................................................................. 5 mL.

Control macroscpico: Solucin transparente de color mbar.
Control de eficacia: En CALDO DE PARK Y SANDERS con Campylobacter sp.
6. Conservacin: Utilizar inmediatamente.
CALDO DE PARK Y SANDERS (PNT-ME-042): Aadir 10 mL de suplemento a 250 mL
de medio, en el momento de utilizar.
230 MI* 1ODON 01 A N A U IH MICROBIOLOGICOS DE ALIMENTOS

PNT - ME - 0J9 DE LA SOLUCIN DE ANTIBITICOS B
PARA EL CALDO DE PARK Y SANDERS
La SOLUCIN DE ANTIBITICOS B se aade al caldo de Park y Sanders en el enri
quecimiento para la deteccin de Campylobacter termotolerantes en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla de antibiticos (la vancomicina y la cicloheximida). Evita el
crecimiento de la mayora de los microorganismos contaminantes, favoreciendo as el cre
cimiento de Campylobacter.
3. Preparacin:
Disolver los componentes en 50 m L de solucin 1:1 de acetona y agua destilada estril.
Esterilizar por filtracin con filtro de membrana de 0,45 p, de tamao de poro.
4. Composicin:
Cefoperazona 0 ,0 3 2 g.
Cicloheximida 0,1 g.
Acetona ......... 25 mL.
Agua d e stilad a.................................................................................................................... 25mL.

Control macroscpico: Solucin transparente de color mbar.
Control de eficacia: En CALDO DE PARK Y SANDERS con Campylobacter sp.
6. Conservacin: Utilizar inmediatamente.
CALDO DE PARK Y SANDERS (PNT-M E-042): Aadir 12,5 m L de suplemento a
250 m L de medio, en el m om ento de utilizar.

P N T -R E -020
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA E L AGAR DE KARM ALI se utiliza con el medio
para el aislamiento selectivo de Campylobacter en alimentos.
2. Principios:
El suplemento es una mezcla inhibitoria compuesta por dos antibiticos (la vancomicina y la
cefoperazona). La cefoperazona ampla el espectro de accin de la vancomicina, de manera
que hay una m ayor inhibicin de las bacterias contaminantes.
3. Preparacin:
N O TA : En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re

4. Composicin:
V ancom icina........................................................................................................................... 10mg.
C efoperazona...........................................................................

Control macroscpico: Solucin de color blanco, ligeram ente opalescente.
Control de eficacia: En AGAR KARMALI con Campylobacter.
6. Conservacin:
Vial sin reconstituir.............. A 2C-8C, protegido de la luz,
hasta la fecha de caducidad
Vial reconstituido...................................................... 1 m es a 2C-8C, protegido de la luz
AGAR KARMALI (PNT-ME-043): Aadir 1 m L de suplemento a 100 mL de medio, en
el momento de preparar las placas.
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DEL

PNT - RE - 021
SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER
El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER se utiliza con el medio para
el aislamiento selectivo de Campylobacter en alimentos.
2. Principios:
El suplemento est formado por una mezcla de cinco agentes antimicrobianos. Esta combi
nacin permite el crecimiento de Campylobacter a 37C, especialmente el de las cepas que
no crecen a 43C.
La colistina del medio provoca la ruptura de las membranas celulares de las bacterias Gram
negativas, mientras que la cicloheximida inhibe el crecimiento de ciertos mohos.
3. Preparacin:
4. Composicin:
Bacitracina ........... 12.500 IU.
Sulfato de colistina 5.000 IU.
Cefazolina ............ 7.5 mg.
N ovobiocina......... 2.5 mg.
Cicloheximida ...... 25 mi.

Control macroscpico: Solucin amarillenta, sin precipitado.
Control de eficacia: En AGAR COLUMBIA SANGRE con Campylobacter.
6. Conservacin:
Vial sin reconstituir ...................................................... A2C-8C,protegido de la luz,
Vial reconstituido ................................................... 1 mes a 2C-8C, protegido de la luz.
AGAR BUTZLER (PNT-ME-044): Aadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio.
PNT - RE - 022
DEL REACTIVO DE KOVACS
El REACTIVO DE KOVCS se utiliza para la deteccin del indol, resultante de la degra
dacin del triptfano en el medio AT por parte de algunos microorganismos.
2. Principios:
Cuando el reactivo de Kovacs entra en contacto con el indol se desarrolla una coloracin
rojo cereza caracterstica, en forma de anillo, en la superficie del tubo (en la zona en contacto
con el oxgeno).
3. Preparacin:
Disolver 5 g de 4-dimetilamino-benzaidehdo en 75 mL de alcohol isoamlico a 50C -
55C.
M antener el recipiente en un bao con agua helada.
Aadir el cido clorhdrico concentrado mientras se agita.
4. Composicin:
cido 4-dimetilamino-benzaldehdo .................................................................................. 5g.
Alcohol isoam lico..........................................................................
cido clorhdrico 1,18 -1,19 d ........................................................................................... 25 mL.

Control macroscpico: Lquido amarillo.
Control de eficacia: Con Escherichia coli (positivo) y Salmonella Enteritidis (negativo).
La produccin de indol se inhibe por la presencia de nitritos.
6. Conservacin:
A 4C, resguardados de la luz.
AT (PNT-ME-017): Aadir 0,5 mL de cada reactivo en cada tubo. Agitar para que el in
dol entre en contacto con el reactivo y dejar actuar un mximo de 1 minuto.

PNT - RE - 023 DE LA SOLUCIN SALINA (SS)
La SOLUCIN SALINA (SS) se utiliza en pruebas bioqumicas y en la prueba de autoa-
glutinacin para la investigacin serolgica de Salmonella.
2. Principios:
La solucin salina es un diluyente no txico para los microorganismos.
3. Preparacin:
Disolver 8,5 g de cloruro sdico en 1 L de agua destilada.
Esterilizaren autoclave a 121C durante 15 min.
4. Composicin:
Cloruro sdico .................................................................................................................... 8,5 g.
Agua destilada 1 L.

Control de esterilidad: Incubar a 30C durante 3 das.
Control de eficacia: Sembrar Enterococcus y Salmonella. Si no se aprecia crecimiento
(turbidez), aislar en PCA.
6. Conservacin:
3 meses a 4C-6C, realizando controles de esterilidad peridicamente y antes de cada
uso.
7. Utilizacin:
Sero-aglutinacin.
Emulsin para API.

PNT - M E - 024 DEL REACTIVO PARA LA INVESTIGACIN
DE LA 0-GALACTOSIDASA (ONPG)
El REACTIVO PARA LA INVESTIGACIN DE LA 0-GALACTOSIDASA (ONPG) se
utiliza para detectar la presencia de la enzima /3-galactosidasa.
2. Principios:
La /2-galactosidasa es una enzima que desdobla la molcula de lactosa en galactosa y glu
cosa. Cuando el ONPG entra en contacto con la enzima, sta transforma el reactivo de o
tofenil a ortofenol, que es de color amarillo.
Los microorganismos que no poseen esta enzima no pueden fermentar la lactosa.
3. Preparacin:
Disolver 80 mg de ONPG en 15 mL de agua destilada a 50C - 55C.
Enfriar a T ambiente.
Aadir 5 mL de solucin tampn.
4. Composicin:
ONPG 80 mg.
Solucin tampn: Dihidrogenofosfato de sodio 6,9 g.
Hidrxido sdico al 30% .... 45 mL.
Agua destilada ...................... 3 mL.

pH a 25C (solucin tampn): 7,00 0,2.
Control de eficacia: Con Escherichia coli (positivo, color amarillo) y Salmonella Enteri-
tidis (negativo, incoloro).
6. Conservacin:
A 4C, hasta que el reactivo se observe turbidez, realizando un control de esterilidad antes de
cada uso.
SS (PNT-RE-23): Aadir 0,25 mL de cada reactivo en cada tubo. Realizar lecturas al cabo
de V2 h, 1 h, 2 h y 24 h.

PNT - RE - 025 DE LA SOLUCIN DE FENILALANINA AL 0,5% (FA)
La SOLUCIN DE FENILALANINA AL 0,5% (FA) se utiliza, junto con el cloruro frrico,
para detectar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.
2. Principios:
Los microorganismos que poseen la enzima fenilalanina desaminasa pueden transformar la
fenilalanina en cido fenilpirvico (es decir, convertir aminocidos en cidos cetnicos) en
condiciones de aerobiosis.
Esta facultad se utiliza principalmente para diferenciar los gneros Salmonella y Proteus.
3. Preparacin:
Disolver 0,5 g de L-fenilalanina en 100 mL de agua destilada estril.
Transferir a un recipiente estril.
4. Composicin:
L -fenilalanina................................................................................................................. 0,5 g.
Agua d estilad a.......................................... 100 mL.

Control de eficacia: Con Proteus (positivo, color verde oscuro) y Salmonella (negativo, in
coloro).
6. Conservacin:
A 2C-6C, realizando controles de esterilidad peridicamente y antes de cada uso.
SS (PNT-RE-23): Aadir 0,5 mL en cada tubo.
PNT - RE - 026 PR O C E D IM IE N T O PARA LA PR EPA R A C I N

DE LA SO LU C I N DE C LO R U R O F R R IC O AL 10%
La SOLUCIN DE CLORURO FRRICO AL 10% se utiliza, junto con la fenilalanina,
para detectar Ja presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.
2. Principios:
Los microorganismos que poseen la enzima fenilalanina desaminasa pueden transformar, en
condiciones de aerobiosis, la fenilalanina en cido fenilpiruvico. Este cido, en contacto con
iones frricos, produce una coloracin verde oscuro durante unos minutos.
3. P reparacin:
Disolver 10 g de cloruro frrico en 100 mL de agua destilada.
Transferir a un frasco de 250 mL.
4. Com posicin:
Cloruro frrico 10 g.
5. C ontroles del reactivo p rep arad o :

Control macroscpico: Lquido de color crema oscuro.
Control de eficacia: Con Proteus (positivo, color verde oscuro) y Salmonella (negativo, in-
coloro-amarillento).
6. C onservacin:
A T ambiente/resguardado de la luz, realizando controles de esterilidad peridicamente y
antes de cada uso.
7. M edios utilizados:
SS (PNT-RE-23): Aadir 1-2 gotas de reactivo a cada tubo con 0,5 mL de SS y 0,5 mL de
FA, incubado durante 4 h a 37C 1C.
BIBLIOGRAFA GENERAL
B e r g e y s (1994): Bergeys manual of detrminative bacteriology. Ninth edition.

manual
Williams & Wilkins. USA.
S. (1998): Redaccin e introduccin del Manual de Calidad y del Procedimiento Gene

C a l v s ,
ral de Redaccin y Gestin de la Documentacin en el laboratorio de Microbiologa de
aguas y Alimentos.
ENAC (1997): Gua para la acreditacin de laboratorios que realizan anlisis microbiolgicos.
G-ENAC-04. Rev. 2.
S abater, J.; V il u m a r a , A. (1989): Buenas prcticas de laboratorio (GLP) y garanta de calidad

(Quality Assurance): Principios bsicos. Ed. Daz de Santos. Madrid.
NORMATIVA
AFNOR NF V 08-050 (1992): Microbiologie alimentaire. Mthode de routine pour le d-

nombrement des coliformes. Mthode par comptage des colonies obtenues 30C.
AFNOR NF V 08-051 (1992): Microbiologie alimentaire. Mthode de routine pour le d-
nombrement des microorganismes. Mtode par comptage des colonies obtenues 30C.
AFNOR NF V 08-052 (1993): Microbiologie alimentaire. Mthode de routine pour la recher-
che des Samonella.
AFNOR NF V 08-053 (1993): Microbiologie alimentaire. Dnombrement des Escherichia coli
/3-gIucuronidase positive par comptage des colonies obtenues. Mthode de routine.
AFNOR NF V 08-054 (1993): Microbiologie alimentaire. Dnombrement des Enterobacte-
riaceae par comptage des colonies. Mthode de routine.
AFNOR NF V 08-055 (1993): Microbiologie alimentaire. Recherche de Listeria monocyto-
genes. Mthode de routine.
AFNOR NF V 08-056 (1994): Microbiologie alimentaire. Dnombrement des Clostridium per-
fringens par comptage des colonies 37C.
AFNOR NF V 08-057-1 (1994): Microbiologie alimentaire. Mthode de routine pour le d
nombrement des St^phylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37C.
Partie 1. Technique avec confirmation des colonies.
AFNOR NF V 08-057-2 (1994): Microbiologie alimentaire. Mthode de routine pour le d
nombrement des Staphylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37C.
Partie 2. Technique sans confirmation des colonies.
AFNOR XP V 08-058 (1995): Microbiologie alimentaire. Dnombrement de Bacillus cereus
par comptage des colonies 30C. Mthode de routine.
AFNOR XP V 08-059 (1995): Microbiologie des aliments. Dnombrement des levures et moi-
sissures par comptage des colonies 25C. Mthode de routine.
AFNOR XP V 08-102 (1997): Microbiologie des aliments. Regles gnrales pour le compta
ge des colonies et pour lexpression des rsultats. Cas du dnombrement sur milieu solide.
EN 13401 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for enu-
meration of Clostridium perfringens. Colony-count techinique (ISO 7937:1997 modified).
ISO 7954 (1988): Microbiologie. Directives gnrales pour le dnombrement des levures et
moisissures. Technique par comptage des colonies 25C.
ISO 4831 (1991): Microbiologie. Directives gnrales pour le dnombrement des colifor
mes. Technique du nombre le plus probable.
ISO 4832 (1991): Microbiologie. Directives gnrales pour le dnombrement des colifor
mes. Mthode par comptage des colonies.
ISO 4833 (1991): Microbiologie. Directives gnrales pour le dnombrement des micro-or-
ganismes. Mthode par comptage des colonies obtenues 30C.
247
248 NORMATIVA
ISO 8523 (1992): Microbiologie. Directives gnrales pour la recherche des Enterobacteria-
ceae avec pr-enriquissement.
ISO 6579 (1993): Microbiologie. Directives gnrales concemant les mthodes de recherche
des Salmonella.
ISO 7402 (1993): Microbiologie. Directives gnrales pour le dnombrement sans revivfica-
tion des Enterobacteriaceae. Techinque NPP el mthode par comptage des colonies.
ISO 7251 (1994): Microbiologie. Directives gnrales pour le dnombrement d Escherichia
coli prsums. Thecnique du nombre le plus probable.
ISO 7932 (1994): Microbiologie. Directives gnrales pour le dnombrement de Bacillus ce-
reus. Mthode par comptage des colonies 30C.
ISO 7218 (1996): Microbiologie des aliments. Regles gnrales pour les examens microbio-
logiques.
ISO 10272 (1996): Microbiology o f food and animal feeding stuffs. Horizontal method for de-
tection of thermotolerant Campylobacter.
ISO 11290-1 (1997): Microbiologie des aliments. Mthode horizontale pour la recherche et le
dnombrement de Listeria monocytogenes. Partie 1: Mthode de rcherche.
ISO 11290-2 (1998): Microbiologie des aliments. Mthode horizontale pour la recherche et le
dnombrement de Listeria monocytogenes. Partie 2: Mthode de dnombrement.
ISO 6888-1 (1999): Microbiology o f food and animal feeding stuffs. Horizontal mehtod for
enumeration of coagulase positive staphylococci {Staphylococcus aureus and other species).
Part 1: Technique using Baird-Parker agar mdium.
ISO 6888-2 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for
enumeration of coagulase positive staphylococci {Staphylococcus aureus and other species).
Part 1: Technique using Rabbit Plasma Fibrinogen agar mdium.

Metodos de Analisis Microbiologicos de Alimentos - Corrie Allaert Vandevenne PDF

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MTODOS DE ANLISIS

Ediciones Daz de Santos, S. A.

Fotocomposicin: Fernndez Ciudad, S. L.

C o r rie A l l a e r t V andevenne, Tcnico en Microbiologa (Instituto Pasteur

M a r ta E s c o l Ribes, Ingeniero Agrnomo. Este libro es una versin mo

A Vicente Sanchis Almenar, catedrtico de Microbiologa de Alimentos, por su confianza y

A Nuria Sala Mart, profesora de Microbiologa de Alimentos y Agraria, miembro de la co

Qued muerto as como mineral y me convert en planta.

La vida... una profundidad viva de equilibrios, siempre en movimiento y fusin, de tensio

Es la conclusin de ms de 10 aos de ejercicios interlaboratorios para Verificacin Extema

De luz y de sombra soy, quiero darme a las dos.

INTRODUCCIN ................................................................................................................... XIX

PROCEDIM IENTO GENERAL DE REDACCIN DE MTODOS DE ANLISIS

PROCEDIM IENTO DE EXPRESIN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002) ......... 9

PROCEDIMIENTOS DE M TODOS DE ANLISIS DE A L IM E N T O S .................... 61

PNT - AL - 003: Mtodo horizontal para el recuento de microorganismos a 30 C (mto

PNT - AL - 009: Mtodo horizontal para el recuento sin revivificacin de Enterobacte-

PR O C ED IM IEN TO GEN ERA L DE PREPA R A C I N D E M EDIOS DE CULTIV O

P R O C E D IM IE N T O G EN ERA L DE C O N T R O L DE CALIDAD D E M EDIO S DE

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO ............... 15 1

Relacin de medios de cultivo y PNT - AL en el que aparecen ......................................... 153

PNT - ME - 038: Procedimiento para la preparacin del agar Oxford.............................. 191

PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIN DE REACTIVOS (PNT -

PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIN DE REACTIVOS.................................. 217

Relacin de reactivos y medio al que se aaden................................................................. 219

BIBLIOGRAFA G E N E R A L .............................................................................................. 245

N O R M A TIV A ......................................................................................................................... 247

mldtKv. cii e l a p a rta d o currcNpixKlicnic d e k n P N T A L (in cfo d o s) ucai)K antc \ c ex*

ISO: http:U ww w.iso.ch

l l t i m a i n e n ie se e s t re a liz a n d o la v a lid a ci n d e le metode* IS O p a ra e l C E N

El ao 20()0 vio la aparicin de la norma ISO 17025 Prescripciones generales para

Utilizacin d e m aterial de referencia.

M ediante las incertidumbres (material de referencia em pleado, m todos y equipos,

Procedimiento general de redaccin de mtodos

Se aplica a todos los anlisis realizados segn loes PNT AL.

1. Recopilar la documentacin existente (normas internacionales ISO. EN. AFNOR.

Estos procedimientos constan de los siguientes aportados:

Ttulo del PNT.

5.1.1. Ttulo Jet PNT

En este apartado deber constar:

Tipo de anlisis que se realiza: recuento o investigacin, especificando si se utiliza alguna

5.1.2. Tipo y nmero Jet PNT

NOTA 2: liste desdoblamiento se suele manifestar tambin en la norma original.

5.1.3. Norma en la <tre re hasa

Recuento Je mtcroor^anhmo% : Nmero de microorganismos 1encontrado por gramo o

5JI. M edios d e cultivo

1 Remplazar por el nombre del ittocroorgintsmo em ayado.

Suplemento* de medio* de cultivo.

La denominacin de esta* sustancias c* la que se le* da en el laboratorio, aunque en alguno*

5.5. Siem bra

M e d i o s de cultivo ncccvirio*. sealando si se encuentran en tubos o en placas; en este caso

En lo* procedimiento*donde hay etapas muy diferenciadas, se ha dividido el *k\t\ja o en las

NOTA 4 En general, la dilucidn madre se prepara con 10 mililitros (si el producto es l

5.7. Confirm acin

NOTA 5: En este aportado no se explica el modo operatorio de la* prueba* de la oxtdavi y

Debido a su extensin c importancia sobre el resultado del anlisis, en algunos casos se ha

5.X. Expresin de resultado*

En una columna situada a la izquierda de la h o j indicaremos el da de anlisis en el que no*

Procedimiento de expresin de resultados

El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la expresin de resul

Se aplica a todos los anlisis realizados segn los PNT - AL.

En general, para obtener el resultado de los recuentos de microorganismos en medio slido, se

En lo* procedimientodonde hay etapas muy diferenciadas, se ha dividido el k\t\ja o en las