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Practica Pruebas Bioquimicas 2012 Completa PDF
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PRUEBAS BIOQUMICAS:
PRODUCTOS QUMICOS Y BIOLGICOS PARA EL DIAGNSTICO.
INTRODUCCIN
La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin dada.
Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la
comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin
considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo
de bacteria y del fin que se persigue en la identificacin. Los pasos a seguir para una
perfecta identificacin bacteriana son:
1.- Obtener un cultivo puro
2.- Examen microscpico de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se
determina as la forma y el Gram del microorganismo en estudio. Tambin es
importante determinar la agrupacin y la presencia de esporas y otras caractersticas
morfolgicas de inters.
3.- Determinar las caractersticas nutricionales (en general se desprenden de los
mtodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoauttrofos,
fotohetertrofos, quimioauttrofos, quimiohetertrofos.
4.- Realizacin de pruebas primarias (Gram, morfologa, catalasa, oxidasa, OF,
fermentacin de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y
movilidad.
5.- Realizacin de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas
dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin de pigmentos,
produccin de indol a partir de triptofano, produccin de coagulasa, de fenilalanina
deaminasa, etc.).
Adems de los nutrientes bsicos y especficos, que le son proporcionados a las especies
de inters, para que puedan desarrollarse plenamente a nivel de laboratorio, en la frmula
de algunos medios de cultivo empleados al efecto, se incluyen determinados compuestos
con el objetivo de favorecer su desarrollo en detrimento de otras especies contaminantes o
no, o para distinguir y diferenciar las colonias producidas.
Una vez aisladas, las especies deben ser identificadas, para lo cual se emplean
indistintamente productos qumicos, principalmente carbohidratos, para conocer su
capacidad metablica frente a esos sustratos o se enfrentan a otros tipos de compuestos
para determinar su resistencia, as como a diversos productos biolgicos para evidenciar sus
reacciones.
COLOR
ACIDO
BASE
Amarillo
Amarillo
Rojo
Rojo
Incoloro
Amarillo
Amarillo
Rojo
Azul
Amarillo
Amarillo
Rojo
Rojo prpura
Rojo
RANGO DE pH
6.4 - 8.2
6.0 - 8.0
4.0 - 6.0
7.0 - 8.0
8.0 - 10.0
7.2 - 8.3
5.2 - 6.8
Los indicadores presentes en los medios de cultivo, cambian el color del medio o de las
colonias, en correspondencia con las variaciones del pH.
SANGRE Y HEMODERIVADOS
La sangre se emplea en la elaboracin de algunos medios de cultivo, no teniendo como
nica finalidad proporcionar un nutriente esencial para el desarrollo de determinadas
especies, sino adems, el permitir evidenciar y diferenciar la actividad hemoltica de
algunas de ellas. Por ejemplo, cuando se desarrollan en el medio "Agar sangre",
colonias correspondientes a especies productoras de hemolisinas, stas actan sobre
la sangre que se encuentra en sus inmediaciones, hemolizando a los hemates total o
parcialmente.
Si el tipo de hemolisina, destruye a los eritrocitos, el efecto se evidenciar por la
formacin de un halo incoloro alrededor de la colonia. Este tipo de hemlisis total se
clasifica como "betha".
En cambio, si el tipo de hemolisina no destruye a los hemates, pero acta sobre la
hemoglobina que porta, reducindola a biliverdina, el efecto se evidenciar por la
presencia de un halo de color verde alrededor de la colonia. Este tipo de hemlisis se
clasifica como "alpha". Tanto los eritrocitos de sangre humana, como los obtenidos de
diversas especies de animales, como por ejemplo: carneros, conejos, cabras, etc., son
utilizadas en diferentes pruebas de
hemaglutinacin o para detectar diversas
reacciones hemolticas.
El suero sanguneo se emplea comnmente para serodiagnsticos y el plasma (sin
preservo) es utilizado regularmente para poner en evidencia la capacidad enzimtica
de especies productoras de coagulosa, una enzima que utiliza como sustrato el plasma
sanguneo, provocando la formacin de cogulos.
COLORANTES
La edicin de determinados colorantes a la frmula del medio de cultivo, tiene como
objetivo, inhibir el desarrollo de las especies ms sensibles, que interfieren el estudio,
favoreciendo de esta manera el desarrollo de otras ms resistentes de inters en la
investigacin, como por ejemplo: el "Verde brillante" que forma parte de la composicin
del medio de cultivo del mismo nombre, utilizado para aislar algunas especies del
gnero Salmonella, al interferir total o parcialmente el desarrollo de otras especies
presentes en la muestra. Las colonias de Salmonella se observan adems en este
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METABOLISMO PROTEICO
LICUEFACCIN DE GELATINA (LENTA)
Detectar la produccin de una enzima proteoltica extracelular por parte de las
bacterias que es la GELATINASA. Permite diferenciar gneros productores de
Gelatinasa, que hidrolizan la Gelatina tales como:
Staphylococcus: (+ muy rpida)
Bacillus (+)
Micrococcus: (+ lenta)
Clostridium (+ lenta)
Streptococcus - (negativos)
Listeria
- (negativos)
FUNDAMENTO:
Gelatinasa(Proteasa) Gelatinasa (Peptidasa)
Polipeptidos
aa
(Proteina + agua)
PROCEDIMIENTO:
1) Siembra del m.o. en medio rico en Gelatina por puncin profunda
Ej. Agua Peptonada + 12% gelatina
Caldo nutritivo + 12% gelatina (esterilizados previamente)
2) Incubar por varios das (20 das) a 20-22C
3) Colocar en nevera 30 antes de la interpretacin
RESULTADOS
Medio se derrite (lquido) Gelatinasa + (bacteria hidroliz gelatina)
Medio est slido
Gelatinasa - (bacteria no hidroliz gelatina)
FENILALANINA DESAMINASA
FUNDAMENTO:
Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el
aminocido fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica de
fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad
enzimtica es caracterstica de todas las especies del gnero Proteus y del
grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos gneros de otras
enterobacterias
PROCEDIMIENTO
Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del
bisel con abundante inculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente
se aade 0,2ml de una solucin de cloruro frrico al 10% de manera que
inunde todo el crecimiento.
RESULTADO
La presencia de cido fenilpirvico (prueba positiva) se manifiesta por la
aparicin de un color caracterstico verde oscuro o verde-azulado.
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UREASA
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para
hidrolizar la rea, formando dos molculas de amonaco por la accin de la enzima
ureasa.
MEDIO DE CULTIVO
Caldo rea
Extracto de levadura 0,1 g
Fosfato monopotsico 9,1 g
Fosfato disdico 9,5 g
rea 20,0 g
Rojo fenol 0,01 g
Agua destilada 1000,00 mL
pH 6,7-6,9
Disuelva y esterilice por filtracin.
PROCEDIMIENTO
Con el asa de platino transfiera una porcin de cultivo puro proveniente de
un medio slido. Incube a 37C por 24 horas.
RESULTADOS
Una reaccin positiva (hidrlisis de la urea) es indicada por un cambio de color del
amarillo (pH 6,8) al rojo cereza (pH 8,1 o ms alcalino).
PRUEBA DE UREASA
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B resultado positivo
C resultado negativo
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Bilis de buey 40 g
Agar 15 g
Crecimiento
Hidrlisis de la
Esculina
Oscurecimiento
Enterococcus
faecalis
ATCC 29212
Bueno
+
Proteus
mirabilis
ATCC 43071
Bueno
-
Streptococcus
pyogenes
ATCC 19615
Inhibido
Inhibido
Inhibido
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METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
OXIDACIN FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS (GLUCOSA)
FUNDAMENTO:
Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su
falta de utilizacin. Se usa el medio OF de Hugh y Leifson que contiene peptonas e
hidratos de carbono en una relacin 1:5. Al ser menor la concentracin de peptonas,
hay menor produccin de productos de oxidacin a partir de los AA que tienden a
elevar el pH y pueden neutralizar los cidos dbiles producidos por los
microorganismos no fermentadores. El medio posee azul de bromotimol como
indicador de pH. El test es til en la diferenciacin de los Gneros incluidos en la
Familia Micrococcaceae como para diferenciar miembros de la Familia
Enterobacteriaceae de las Pseudomonas.
PROCEDIMIENTO:
Se utilizan 2 tubos con el medio O-F glucosa o lactosa o cualquier otro carbohidrato
por cada agente a estudiar. Se hace la siembra profunda con aguja de platino. Uno de
los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con parafina estril (1,5 a 2 cm de
alto) para crear condiciones anaerobias. Se incuba a 37C por 24 horas y hasta 14
das dependiendo del microorganismo.
Los organismos oxidativos y fermentativos utilizan el carbohidratos tanto el tubo
aerbico (sin parafina) como en el anaerbico, acidifican el medio y provocan el viraje
del color del indicador de verde a amarillo. Los microorganismos oxidativos slo
podrn utilizar el carbohidrato en el tubo aerbico. Como la produccin de cido en
algunas especies puede ser lenta, se recomienda incubar el medio por 7-14 das, a
menos que se observe cambio con anterioridad.
INTERPRETACIN:
Microorganismos oxidativo: producen cido solo en el tubo expuesto al O 2
atmosfrico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosfrico cambia su
color original a amarillo.
Microorganismos fermentadores: producen cido en los 2 tubos. O sea que los dos
tubos viran del verde al amarillo.
Bacterias sacarolticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino
despus de la incubacin, conservando su color original.
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POSITIVO
POSITIVO
NEGATIVO
POSITIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
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VOGES-PROSKAUER: ACETOINA
FUNDAMENTO:
La reaccin de VP se basa en la deteccin del acetilmetilcarbinol (acetona) a
partir de le fermentacin butanodilica de la glucosa. Las bases bioqumicas de la
prueba consideran que a partir del cido pirvico, una bacteria puede seguir vas
metablicas diferentes para la obtencin de energa, segn la composicin de sus
sistemas enzimticos. Una de estas vas es la fermentacin butanodilica, cuyo
producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetona es su precursor. La prueba
de VP se basa en la deteccin de este ltimo metabolito.
La acetona que se produce en la fermentacin cuando reacciona con el hidrxido
de potasio (al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los
grupos guanidnicos de la arginina, que est presente en las peptonas que
constituyen el medio, dando una coloracin rojiza.
PROCEDIMIENTO
Para esta prueba se utiliza el mismo medio que se usa para la prueba del rojo de
metilo. Se siembra el microorganismo problema y se incuba a 37C durante 48
horas. La lectura se realiza agregando el cultivo 6 a 8 gotas de una solucin de
KOH al 40% y luego 1 ml de solucin alcohlica del alfa naftol al 5% (p/v). Se
debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja
en la estufa, el cultivo con los reactivos agregados.
RESULTADOS (NTERPRETACIN)
La formacin de un anillo rosa fluorescente en la superficie del tubo indica que la
prueba es positiva.
Escherichia coli es VP Klebsiella sp es VP +
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Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y
colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el
microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).
Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua
oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
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A: oxidasa positivo
B: oxidasa negativo
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3g
Peptona
5g
KNO3
1g
Agua destilada
1L
Una vez preparado el medio se coloca en tubos que deben contener campanas Durham
para detectar produccin de gases. Luego se esteriliza el medio a 121C durante 20 minutos.
PROCEDIMIENTO:
Despus de inocular los tubos, estos deben ser incubados a 37C durante al menos 24
horas y hasta cinco das. Luego se procede a la lectura, observndose en primer lugar la
presencia o no de gases. Luego se adicionan los reactivos de nitratos, un ml de solucin A y
un ml de solucin B, a cada tubo. La aparicin de un color rojo intenso indica la presencia de
nitritos en el medio y por tanto la positividad de la reaccin.
A los casos que resulten negativos se les debe agregar granalla de zinc para determinar si
los nitratos han sido reducidos, si aparece una coloracin roja es debido a que en el medio
existen nitratos; una ausencia de color rojo indicara que no hay nitratos en el medio (estos
han sido reducidos inicialmente a nitritos, y despus a gas), siendo en este caso la prueba
considerada como positiva.
Reactivo A: Solucin al 0,8% de cido sulfanlico en cido actico 5N.
Reactivo B: Solucin al 0,5% de alfa-naftilamina en cido actico 5N.
Ambas soluciones se disuelven por calentamiento suave.
Esta prueba ayuda a la identificacin de Enterobacterias que por lo general reducen los
nitratos.
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